Ćwiczenie 11

Ćwiczenie 7
T: Zasady doboru badań laboratoryjnych w diagnostyce chorób tarczycy i nadnerczy
Zagadnienia teoretyczne:
Profile badań diagnostycznych w chorobach tarczycy. Profil podstawowych badań
diagnostycznych w rozpoznawaniu schorzeń tarczycy (TSH, FT4, FT3, anty-TPO
(wg
ważności; wolne formy T4 i T3. Profil badań diagnostycznych w pierwotnej niedoczynności
tarczycy (TSH, FT4, anty-TPO (podstawa rozpoznania; morfologia krwi (makrocytoza),
lipidy (hipercholesterolemia). Profil badań diagnostycznych w pierwotnej nadczynności
tarczycy (TSH, FT4, FT3 (przy wątpliwym FT4)). Profile badań diagnostycznych w
chorobach nadnerczy. Badania diagnostyczne w zakresie nadmiernego wydzielania
glikokortykoidów. Profil badań podstawowych w diagnostyce hiperkortyzolizmu (Cushing)
(stężenie kortyzolu w osoczu (wzrost, rytm dobowy - zniesiony). Badania diagnostyczne w
zakresie nadmiernego wydzielania mieneralokortykoidów. Profil badań w diagnostyce
pierwotnego hiperaldosteronizmu (zespół Conna).
Ćwiczenie praktyczne:
Oznaczenie TSH.
A. Oznaczanie stężenia TSH w surowicy metodą ELISA
Aparatura i sprzęt laboratoryjny:
 analizator biochemiczny, probówki Eppendorf, pipety automatyczne
Materiał badany i odczynniki (HUMAN):
 surowica badana
 dołki opłaszczone przeciwciałami
 wzorce TSH (5 stężeń) (Standards) o stężeniach: 0 mlU/L (A); 0,5 mlU/L (B); 3,0
mlU/L (C); 6,0 mlU/L (D); 15 mlU/L (E); 30 mlU/L (F)
 surowica kontrolna (Control)
 przeciwciała znakowane enzymem (Enzyme Conjugate)
 substrat (TMB-Substrate)
 roztwór hamujący (Stop Solution)
 bufor myjący (Wash Solution)
 minutnik
Wykonanie:
1
 odmierzyć po 50 L wszystkich wzorców, kontroli i prób badanych według
załączonego schematu
 dodać po 100 L Enzyme Conjugate do każdego dołka
 wymieszać przez poruszanie płytką na stole (10 sekund)
 inkubować 60 minut w temperaturze pokojowej
 opróżnić dołki na bibułę odwracając płytkę
 5-krotnie płukać dołki buforem myjącym = napełnić dołki 300 L Wash Solution;
wymieszać, opróżnić na bibułę odwracając płytkę
 odmierzyć po 100 L TMB-Substrate do wszystkich dołków
 inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej
 odmierzyć po 100 L Stop Solution do wszystkich dołków i delikatnie zamieszać
 odczytać absorbancję za pomocą analizatora (=450 nm)
Obliczenia:
 obliczyć średnią absorbancję dla każdej próbki
 odjąć absorbancję próby zerowej od średnich absorbancji wszystkich próbek
 narysować krzywą kalibracyjną = krzywą zależności absorbancji od stężenia wzorców
 wyznaczyć z krzywej kalibracyjnej stężenie TSH w próbach badanych i kontrolnej
Materiał badany i odczynniki (DIMA):
 surowica badana
 dołki opłaszczone przeciwciałami – 2 paski
 wzorce TSH (5 stężeń) (Standards) o stężeniach: 0 mU/L (A); 0,25 mU/L (B); 0,75
mU/L (C); 2 mU/L (D); 5 mU/L (E); 15 mU/L (F)
 surowica kontrolna (Control)
 przeciwciała znakowane enzymem (Enzyme Conjugate)
 substrat (TMB-Substrate)
 roztwór hamujący (Stop Solution)
 bufor myjący
 minutnik
Wykonanie:
2
 odmierzyć po 25 L wszystkich wzorców, kontroli i prób badanych według
załączonego schematu
 inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej
 dodać po 100 L Enzyme Conjugate do każdego dołka
 wymieszać przez poruszanie płytką na stole (10 sekund)
 inkubować 90 minut w temperaturze pokojowej
 opróżnić dołki na bibułę odwracając płytkę
 5-krotnie płukać dołki buforem myjącym = napełnić dołki 0,30 mL wody
destylowanej; wymieszać, opróżnić na bibułę odwracając płytkę
 odmierzyć po 100 L TMB-Substrate do wszystkich dołków
 inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej
 odmierzyć po 100 L Stop Solution do wszystkich dołków
 odczytać absorbancję za pomocą analizatora (=450 nm)
Obliczenia:
 obliczyć średnią absorbancję dla każdej próbki
 odjąć absorbancję próby zerowej od średnich absorbancji wszystkich próbek
 narysować krzywą kalibracyjną = krzywą zależności absorbancji od stężenia wzorców
 wyznaczyć z krzywej kalibracyjnej stężenie TSH w próbach badanych i kontrolnej
3