Streszczenie rozprawy lek. J. Sałkowska

Lekarz Joanna Sałkowska-Wanat
Tytuł pracy doktorskiej: Epidermodysplasia verruciformis związana z mutacjami genów
EVER2: obserwacje kliniczno-wirusologiczne
Promotor: Prof. dr hab. n. med. Sławomir Majewski
Streszczenie pracy doktorskiej
Wprowadzenie: Epidermodysplasia verruciformis (EV) jest rzadką chorobą o podłożu
genetycznym, w przebiegu której występuje predyspozycja do zakażeń różnymi, normalnie
niepatogennymi typami wirusa HPV, tzw. EV HPV. Choroba ta charakteryzuje się
pojawianiem się we wczesnym dzieciństwie zmian skórnych o charakterze brodawek
płaskich. W miarę upływu lat u chorych rozwijają się zmiany EV- łagodne,
przednowotworowe (rogowacenie słoneczne - AK, choroba Bowena) oraz inwazyjne raki
skóry. Czynnikiem odpowiedzialnym za rozwój zmian nowotworowych u chorych z EV są
onkogenne wirusy EV HPV należące do βHPV. Najczęstszymi typami o potencjale
onkogennym są przede wszystkim HPV5 i 8. W ostatnich latach wykryto dwa nowe geny
EVER1 i EVER2, których mutacje odpowiedzialne są za wystąpienie EV. Badania nad funkcją
genu EVER2 wykazały, że białka kodowane przez ten gen mają zdolność wiązania się z
głównym transporterem cynku ZnT1 formując kompleksy ZnT1/EVER, uczestnicząc tym
samym w utrzymaniu równowagi cynkowej w komórce. U chorych z EV występują
różnorodne nieprawidłowości związane z odpowiedzią immunologiczną m.in. upośledzenie
komórkowej odpowiedzi immunologicznej w stosunku do keratynocytów zakażonych EV
HPV. Charakterystyczną cechą jest to, że chorzy z EV mają zachowaną prawidłową
komórkową odpowiedź immunologiczną w stosunku do innych niż HPV patogenów. Innym
czynnikiem patogenetycznym u chorych z EV jest również promieniowanie słoneczne. Jest to
związane z mutagennym działaniem UVR (ang. ultrafiolet radiation) oraz miejscową
immunosupresją powstającą pod wpływem tego promieniowania.
Cele: Celem pracy było zbadanie mutacji genów EVER2 w polskiej populacji chorych z EV,
zarówno w przypadkach rodzinnej jak i sporadycznej postaci tej choroby. Zbadano związek
pomiędzy mutacjami EVER2 a typami wirusów EV HPV, oraz związek mutacji tego genu
z przebiegiem klinicznym choroby. Badania chorych opierały się w głównej mierze na
wieloletniej obserwacji przebiegu klinicznego choroby, w tym czasu do pojawienia się zmian
skórnych, rodzajów zmian skórnych, występowania zmian przednowotworowych i raków
skóry, oraz przewlekłej ekspozycji na UVR.
Materiał i metody: Badania przeprowadzono na grupie 11 pacjentów z EV w wieku od 30 do
83 lat, w tym 8 kobiet i 3 mężczyzn obserwowanych i leczonych w Klinice Dermatologicznej
oraz w Klinice Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, oraz
w grupie kontrolnej zebranej w sposób losowy z projektu WOBASZ. U wszystkich chorych
wykonano genotypowanie wirusów HPV metodą QPCR (quantitative polymerase chain
reaction, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy DNA Real Time PCR, PCR w czasie
rzeczywistym) z dwiema konkurencyjnymi sondami TaqMan komplementarnymi do
sekwencji prawidłowej i do wariantu w aparacie LifeScience QuantStudio. W celu
potwierdzenia obecności mutacji EVER2 użyto klasycznego sekwencjonowania metodą
Sangera, stosując elektroforezę kapilarną do rozdziału DNA. Analizę bioinformatyczna
potencjalnego efektu wariantu EVER2_c.449-1G>T przeprowadzono z wykorzystaniem
programów NetGene2. W celu weryfikacji rozkładu wariantu w rodzinach użyto materiału
pochodzącego z krwi obwodowej (z krwinek białych) oraz z wymazów ze śluzówki policzka,
z wykorzystaniem aparatu Maxwell do półautomatycznej ekstrakcji DNA. Izolację mRNA z
komórek jednojądrowych krwi obwodowej przeprowadzono za pomocą odczynnika TRIzol,
pomiar ilości i czystości RNA za pomocą aparatu NanoDrop®, a ocenę jakości RNA za
pomocą elektroforezy w systemie Lab-on-a-chip. W celu retranskrypcji mRNA na DNA
użyto RT MasterMIX (RT-MM), który umożliwił zajście reakcji polegającej na przepisaniu
mRNA na DNA. Ocenę częstości wariantu dokonywano poprzez przegląd baz
ogólnodostępnych w bazie sekwencji Zakładu Genetyki Medycznej Warszawskiego
Uniwersytetu Medycznego (ok. 400 pacjentów zbadanych metodą WES lub metodą panelową
obejmującą EVER1 i EVER2).
Wyniki: U wszystkich badanych pacjentów wystąpiła taka sama mutacja genu EVER2 c.4491G>T (T150fsX3). Obecność takiego wariantu, dotyczącego pojedynczego nukleotydu c.
449-1G>T, lokalizującego się w obrębie miejsca akceptorowego dla składania RNA na
granicy intron4/ekson5 zaburza splicing, a tym samym przyczynia się do zmiany kodowanego
białka. U 6 pacjentów choroba miała postać rodzinną, z czego u 3 pacjentów wystąpiła
łącznie u 6 członków rodziny. U pozostałych chorych (5 osób) choroba miała postać
sporadyczną. U wszystkich chorych pierwsze objawy choroby, w postaci zmian
o
charakterze brodawek płaskich pojawiły się w dzieciństwie, średnio w 6 rż, najmłodszy
pacjent miał lat 4, a najstarszy 11 lat. Pierwsze zmiany skórne o charakterze łagodnych zmian
typu EV pojawiły się średnio w 26 rż., najmłodszy pacjent miał lat 10, najstarszy lat 50.
Zmiany przednowotworowe typu AK i typu choroby Bowena pojawiły się u 9 chorych,
średnia wieku w momencie ich wystąpienia wynosiła 31 lat, najmłodszy chory miał lat 17,
najstarszy 64. Zmiany typu inwazyjnego raka kolczystokomórkowego skóry wystąpiły
u 7 pacjentów, średnia wieku wynosiła 38 lat, najmłodszy pacjent miał 20 lat, najstarszy 64
lata. U wszystkich pacjentów wykazano obecność onkogennego wirusa EV HPV5.
U 5 chorych stwierdzono także obecność onkogennego wirusa EV HPV8. U jednej z
pacjentek stwierdzono obecność wirusa EV HPV5 w nietypowej lokalizacji, a mianowicie na
błonie śluzowej szczytu pochwy, a także obecność genitalnego wirusa HPV51, który
najprawdopodobniej był odpowiedzialny za ciężki przebieg choroby nowotworowej narządów
rodnych. Obserwacje pacjentów pod kątem pojawiania się różnych zmian skórnych w
przebiegu EV zwróciły szczególną uwagę na wpływ promieniowania ultrafioletowego na
przebieg kliniczny choroby. 7 chorych zgłaszało przewlekłą ekspozycję na działanie promieni
słonecznych w warunkach zawodowych. U 6 z w/w chorych raki skóry rozwinęły się w
młodym wieku odpowiednio w 20 rż., 28 rż., 32 rż., 34 rż., 36 rż. oraz 55 rż., co wskazuje na
pierwszoplanową rolę przewlekłej ekspozycji na działanie promieni ultrafioletowych. Wśród
pacjentów, u których wystąpiły inwazyjne raki skóry, u jednej z chorych, która negowała
eksponowanie się na działanie UVR rak skóry wystąpił w późniejszym wieku (64 lata).
Wnioski: Obecność identycznej mutacji genu EVER2 (innej niż dotychczas opisane)
u wszystkich badanych pacjentów z EV świadczy o możliwości zaistnienia tzw. „founder
mutation” w populacji polskiej. Pomimo obecności u wszystkich chorych tej samej mutacji,
przebieg kliniczny choroby u badanych pacjentów z EV jest bardzo zróżnicowany m.in. co do
wieku, w którym wystąpiły zmiany przednowotworowe i nowotworowe, a także nasilenia
procesu nowotworowego. O ile mutacje genu EVER2 mogą być odpowiedzialne za
szczególną podatność chorych z EV na masywne zakażenia wirusami EV HPV, w tym
onkogennymi typami HPV5 i HPV8, to głównym czynnikiem wpływającym na proces
skórnej onkogenezy u tych chorych jest przewlekła ekspozycja na promieniowanie UV.
W przypadku rozpoznania EV wskazane jest przeprowadzenie badań genetycznych
w kierunku mutacji EVER u członków rodziny, zwłaszcza u dzieci, co umożliwiłoby wczesne
wdrożenie metod profilaktycznych, w tym skutecznej ochrony przed promieniowaniem
ultrafioletowym.
Summary
TITLE: Epidermodysplasia verruciformis related to EVER2 gene mutations: the clinical
and virological observations
Introduction: Epidermodysplasia verruciformis (EV) is a rare inherited disease, in the course
of which there is a predisposition to a massive infection, by normally non-pathogenic types of
HPV (human papillomavirus), called EV HPV. The disease is characterized by the appearance
of flat warts in early childhood. Over the years, patients develop typical EV-benign,
premalignant (AK-actinic keratosis, Bowen's disease) skin lesions as well as invasive cancers
of the skin. The factor responsible for the development of tumor lesions in patients with EV
are oncogenic EV HPV belonging to βHPV. The most common oncogenic types are HPV5
and 8. In recent years, two new genes were detected (EVER1 and EVER2), which mutations
are responsible for majority of EV cases. Studies on the EVER2 gene function showed that the
protein encoded by this gene has the ability to bind to the zinc main transporter ZnT1,
forming complexes ZnT1/EVER, thereby participating in maintaining the balance of zinc in
the cell. In patients with EV, there are various abnormalities of the immune response
including impairment of the cellular immunity against keratinocytes infected with EV HPV.
Characteristically EV patients have preserved cellular immune response against non-HPV
pathogens. Another pathogenic factor in patients with EV is also solar radiation (UVR). This
is related to the mutagenic effects of UVR and UV-induced local immunosuppression.
Aims: The aim of the study was to examine mutations of EVER2 gene in the Polish patients
with EV, both in cases of family and sporadic forms of the disease. We examined the
relationship between mutations of EVER2 gene and types of EV HPV and the link between
mutations of this gene with the clinical course of the disease. The study was based mainly on
long-term observation of the clinical course of the disease, including the time to the
appearance of skin lesions, types of skin lesions, the prevalence of premalignant and skin
cancers, and chronic exposure to UVR.
Material and method: The study was conducted in a group of 11 patients with EV aged 30 to
83 years, including 8 women and 3 men, observed and treated in the Department of
Dermatology and Department of Dermatology and Venereology Medical University of
Warsaw, and in the control group collected at random in the project WOBASZ. All patients
underwent genotyping of HPV viruses by QPCR (quantitative polymerase chain reaction,
Real Time PCR) with two competing TaqMan probes complementary to the normal and
variant sequence in LifeScience QuantStudio. In order to confirm the presence of EVER2
mutations the classic method of Sanger sequencing with capillary electrophoresis to the
separation of DNA was used. Bioinformatic analysis of the potential effect of the variant
EVER2_c.449-1G> T was carried out using programs NetGene2. In order to verify the
distribution of variants in the families, material derived from peripheral blood (white blood
cells) and a cheek swabs was used. The isolation of mRNA from peripheral blood
mononuclear cells was performed using TRIZOL reagent, measuring the quantity and purity
of the RNA using the camera NanoDrop® and evaluation of the quality of the RNA by
electrophoresis on a system of Lab-on-a-chip. In order to retranscription mRNA into DNA,
Mastermix RT (RT-MM) was used which enabled the reaction to occur, involving the
rewriting of the mRNA to DNA. The evaluation of the frequency of the variant was made by
reviewing public databases in the base sequence of the Department of Medical Genetics,
Medical University of Warsaw in Warsaw (approx. 400 patients surveyed by WES or by
a panel including EVER1 and EVER2).
Results: All examined patients had the same EVER2 mutation c.449-1G> T (T150fsX3). The
presence of such variant for single nucleotide, c. 449-1G> T localizing within the acceptor
site for RNA splicing, bordered: intron4 / ekson5, disturbs splicing, and leads to change in the
encoded protein. In 6 patients the disease had a family character. In the remaining 5 patients,
the disease had a sporadic form. In all patients the first symptoms of the disease appeared in
childhood, on average 6 years of age, the youngest patient was 4 years old and the oldest 11
years old. The first benign skin lesions of EV type emerged on average 26 years of age, the
youngest patient was 10 years old, the oldest 50 years. Premalignant changes (AK-type and
Bowen disease-type) appeared in 9 patients, the mean age at the time of occurrence was 31
years, the youngest patient was 17 years, the oldest 64 years old. Invasive squamous cell
carcinoma of the skin occurred in 7 patients, the median age was 38 years, the youngest
patient was 20 years old, the oldest 64 years. All patients showed the presence of oncogenic
EV HPV5. In five patients oncogenic EV HPV8 infection was confirmed. One of the patients
revealed the presence of EV HPV5 on an unusual location, the top of the vaginal mucosa, and
the long-lasting presence of genital HPV51, which was probably responsible for severe
malignancies of reproductive genital organs. Analysis of patients for the appearance of
various lesions in the course of EV pays particular attention to the effects of ultraviolet
radiation on the clinical course of the disease. Seven patients reported chronic occupational
exposure to sunlight. In 6 patients the skin cancers developed at a young age, respectively at
20, 28, 32, 34, 36, and 55 years of age, which points to the leading role of chronic exposure to
UVR. In one of the patients, who denied exposing himself to the UVR, skin cancer occurred
at a later age (64 years).
Conclusions: The presence of the same EVER2 gene mutation (other than previously
described) in all EV patients studied indicates the possibility of the so-called "founder
mutation" in the Polish population. The clinical course of the disease in the patients with EV
was very diverse. The differences include the age at which premalignant lesions and cancers
occurred, as well as the severity of the cancers. While EVER2 gene mutations may be
responsible for the particular susceptibility of EV patients to a massive infection with EV
HPV, including cancer-causing types HPV5 and HPV8, the main factor influencing the
process of cutaneous oncogenesis in these patients is chronic exposure to UV radiation. In the
case of diagnosis of EV it is desirable to carry out genetic testing for mutations of EVER
gene in family members, especially in children, what would allow early implementation of the
methods of prevention, including the effective UVR protection.