Dr Anna Góra

Rolnictwo molekularne
Dr Anna Góra-Sochacka
Patrycja Redkiewicz
Prof. dr hab. Agnieszka Sirko
• Żywe – zawierają żywe atenuowane
(pozbawione zjadliwości) drobnoustroje
Tradycyjne • Inaktywowane - zawierają zabite
drobnoustroje (całe lub ich fragmenty)
Nowej
generacji
• Rekombinowane (żywy rekombinowany
patogen)
• Rekombinowane podjednostkowe
(białka, peptydy)
• DNA
€
Szczepienia są najbardziej korzystną z
ekonomicznego punktu widzenia metodą
ograniczenia zakażeń powodowanych przez choroby
infekcyjne
€
Bardzo duże zapotrzebowanie, ponad 30 mln dzieci
nie jest szczepionych
€
Tradycyjne szczepionki
y produkcja skomplikowana, kosztowna
y przechowywanie i transport w niskiej temperaturze
ƒ
Idea wykorzystania roślin do produkcji antygenów
szczepionkowych zrodziła się na początku lat
dziewięćdziesiątych. Uzyskanie powierzchniowego antygenu
wirusa zapalenia wątroby typu B w transgenicznym tytoniu
pokazało, że organizmy roślinne są zdolne do produkcji
antygenów. Pojawił się pomysł jadalnych szczepionek.
™ 1997 rok (Goldstein) „Getting vaccinated
against diseases could soon be as easy as
eating a banana”
™ Pierwotna koncepcja, ale
ƒ brak kontroli dawki
ƒ konieczność oddzielenia warzyw i owoców
przeznaczonych do konsumpcji od tych dla celów
terapeutycznych
ƒ kontaminacje
Wybór antygenu, promotora, rośliny
€ Łatwość transformacji
€ Produkcja rekombinowanego białka w jadalnej (na surowo) części rośliny
€ Wysoka zawartość białka w tkance, bo białko rekombinowane stanowi tylko
mały procent
€ Brak toksycznych produktów/metabolitów
€ Zapewnienie odpowiedniej struktury antygenu i modyfikacji
potranslacyjnych
€ Rośliny: tytoń, jabłka, banany, pomidory, orzeszki, kukurydza, soja, sałata,
kapusta, ziemniaki, szpinak
Wybór antgenu, promotora, rośliny
1. Transformacja roślin (stabilna lub przejściowa)
2. Wybór linii transgenicznej
Namnożenie i uprawa w warunkach polowych lub
przeskalowanie hodowli komórkowej
Zebranie materiału, oczyszczenie
rekombinowanego białka , standaryzacja dawki
antygenu, forma podania i sposób (wstrzyknięcie
lub doustnie). TESTY
ƒ Vibrio cholerae (bakteria Gram-ujemna)
¾ Antygen - podjednostka B toksyny (CTB)
ƒ Tytoń
▪ chloroplasty 4,1% TSP
▪ Promotor CaMV35S, KDEL: 0,02%TSP
ƒ Pomidor (Jiang et al., (2007) Transgenic res. 16: 169-75
▪ promotor E8; 0,081%TSP, (uzyskano wysoki poziom IgG i IgA
u karmionych myszy)
ƒ Ryż (Nochi et al., (2007) Proc Natl Acad Sci 104:10986-91
▪ Ziarna , promotor GluB-1: 30ug/ziarno (uzyskano przeciwciała
po immunizacji doustnej myszy). CTB było stabilne w ziarnach
przez 1,5 roku w temp. pokojowej
ƒ
Antygen - podjednostka B termolabilnej
enterotoksyny (LTB)
ƒ Ziemniak, promotor 35S CaMV
ƒ Karmione myszy
ƒ
LTB używany jako adiuwant
ƒ LTB w fuzji z innymi antygenami
▪ Tytoń, ziemniak, kukurydza, pomidor, soja, marchewka,
Arabidopsis thaliana
System ekspresji stałej
ƒ
Dostępne szczepionki rekombinowane
ƒ np. Engerix - rekombinowa szczepionka przeciwko
wirusowemu zapaleniu wątroby typu B w postaci zawiesiny
do wstrzykiwań zawierająca:
- 10µg oczyszczonego białkowego antygenu HBs / 0,5ml
(dawka dla dzieci) lub
- 20µg oczyszczonego białkowego antygenu HBs / 1ml
(dawka dla dorosłych).
ƒ
Antygen powierzchniowy (HBsAg) wirusa zapalenia
wątroby typu B
ƒ Uzyskano w bardzo wielu roślinach: tytoń, ziemniaki,
sałata i inne, zawiesinach komórkowych.
ƒ Wykazano odp. Immunologiczna po podaniu doustnym
u myszy i ludzi.
VLP – virus-like particle
Fig. Anti-HBs secretory IgAs(S-IgAs) in feces extract
(a) And total serum antibody response (b) to oral
immunization with 100 ng/dose of VLP-assembled
S-HBsAg. Mice were immunized with lyophilized
plant tissue (ca. 9 mg dry weight/dose) or purified
antigen,and delivered at 30- or 60-day timings.
Non-transgenic lyophilized tissue or PBS were
delivered to control mice at a 60-day timing.
Anti-HBs antibody level (mIU/ml) responses are
expressed as arithmetic means with standard
deviations (SD) from results for 10 BALB/c mice at
pre-immune (5 days before prime) and
10 days after each immunization, determined twice
by a Hepanostika® kit (Organon Teknika, Boxtel).
Statistically homogenous or significantly distinct
responses for S-IgAs Or total serum antibodies
aremarked by identical or different letter indexes,
respectively (Tukey and Duncan tests, p<0.05,
Statistica 6®)
Fig. a, b Plant-based
prototype of anti-HBV vaccine
specimens. a Preparation of
plant-derived materials. Panels:
left lettuce plants expressing
≥10 μg S-HBsAg/g FW; middle
powdered lyophilized plant
tissue as a semi-finished product
for the preparation of various
formulas of an oral vaccine;
right tablets of 10×3 mm in size
and 500 mg in weight, containing
a specific dose of S-HBsAg.
b The level of total and
VLP-assembled S-HBsAg in
powdered lyophilized tissue and
1 g and 1 unit of tablets, freshly
prepared and stored for one
year. S-HBsAg content was
calculated in μg/g of dry weight
(DW) as an arithmetic mean and
standard deviation (SD) from
ten polyclonal ELISA or
monoclonal Auszyme® assays
System ekspresji przejściowej
ƒ
Są dwa rodzaje dopuszczonych szczepionek do
stosowania u ludzi
ƒ Inaktywowana składająca się z rozszczepionych
wirionów grypy. Po namnożeniu odpowiedniego
wirusa ulega on inaktywacji chemicznej lub fizycznej
ƒ Żywa atenuowana, reasortanty wirusów
szczepionkowych z wirusem o fenotypie cold adopted
namnażające się wyłącznie w temp. do 33oC, przy
zablokowanej replikacji w 37oC
ƒ
ƒ
ƒ
Są trójwalentne (H3N2, H1N1, wirus typu B)
Są kosztowne i czasochłonne (≈6 miesięcy)
Potrzebna jest szczepionka nowej generacji
NEURAMINIDAZA NA
OTOCZKA
LIPIDOWA
BIAŁKO
M1
M2
vRNA
HEMAGLUTYNINA HA
NUKLEOKAPSYD
Antygen
system
wydajność
immunizacja
challange
źródło
HA 17-532, PS: PR1a tobacco, ER,
His-tag
H5N1 A/Barheaded
Goose/Qinghai &
A/Anhui/1/05
Transient;
pGreen, N.
benthamiana,
Agroinfiltracja
(vacuum),
Cross-protection
pomiędzy nimi, ale z 1
lub 2.1 brak
Myszy Balb/c (dzień 0, 14,
28, Quil A, SC), dawki: 130µg; 2,5 - 5µg i 1 booster
OK),
HI +, VN +
-
Shoji Y, (grupa V.
Yusibov z
Fraunnhofer USA
Center for Molecular
BiotechnologyVaccin
e 27 (2009)
Jw., ale H5N1
A/Indonesia/05/05
jw
60mg/kg FW
Jw., dawka 90 lub 45µg
10 dni po ostatniej
immunizacji,
+
Jw.
HA0 H5N1
NIBRG-14
MagnIcon
provector
system
Kierowanie do cyt.,
chloroplasty, apo.
Oczyszczone 2030mg/kg FW
Tabela 1
IM
Kurczaki, Szczepienie,
wirusem 96%
podobieństwa, 3 tyg.
Booster, 3 tyg.
Challange
+
Kalthoff (ICON
Genetics), J. of Vir. 84
(2010)
HA H5N1
A/Indonesia/05/05
HA H1N1 A/New
Calzedonia/20/99
H1+M1 A/Puerto
Rico/8/34
N. benthamiana,
transient,
vacuum
Plasto promoter
VLP
50mg/kg
Myszy, IM, 0 i 21 dzien,
H5VLP: 0,1, 1, 5 i 12µg zw
2%Alhydrogel K+
rekombinowana HA 5µg
(oczyszczone z linii 293)
HI +, wyższe niż K+
0,5, 2,5, 7,5µg HA;
Dzień 0 i 14, challange
(A/Vietnam/1194/04,
75 dni po bosterze,
100% przeżywalności
D’Aoust (Medicago);
PBJ6 (2008)