Cukrzyca typu 2 upośledza funkcjonowanie komórek
advertisement
Cukrzyca typu 2 upośledza funkcjonowanie komórek progenitorowych śródbłonka Streszczenie C ukrzyca typu 2 (T2DM, ang. type 2 diabetes mellitus) jest chorobą związaną z defektem działania insuliny prowadzącym do szeregu zmian w metabolizmie komórek. Połączenie insulinooporności i hiperglikemii, obecne u pacjentów z T2DM, jest przyczyną zaburzeń w funkcjonowaniu zarówno dojrzałych, jak i progenitorowych komórek śródbłonka (EPC, ang. endothelial progenitor cells). EPC charakteryzowane są jako jednojądrzaste komórki eksprymujące równocześnie markery śródbłonkowe oraz progenitorowe. Do opisu EPC wykorzystuje się też ich właściwości angiogenne: tworzenie kapilar in vitro, tworzenie wtórnych kolonii komórek śródbłonka, produkcję czynników proangiogennych czy udział w naprawie naczyń in vivo. Komórki progenitorowe pochodzące ze szpiku kostnego biorą udział w regeneracji naczyń krwionośnych. Wykazano jednak, że ich funkcjonowanie jest upośledzone u osób chorych na cukrzycę. W artykule scharakteryzowano wpływ T2DM na funkcjonowanie EPC, uwzględniając ponadto powikłania cukrzycowe i wpływ stosowanych powszechnie leków regulujących poziom glukozy. Zmniejszona liczba i pogorszone funkcjonowanie EPC u osób chorych na cukrzycę może być jednym z czynników prowadzących do zwiększenia ryzyka chorób sercowo-naczyniowych oraz powstawania mikro- i makroangiopatii. Wprowadzenie Cukrzyca (DM, łac. Diabetes mellitus) jest schorzeniem towarzyszącym ludzkości od pokoleń. Pierwsze informacje o tej chorobie pochodzą z XVI wieku p.n.e. i dotyczą klasycznych objawów, czyli nadmiernego wydzielania moczu i jego słodkiego smaku. W starożytnej Grecji Areteusz z Kapadocji — jak się współcześnie uważa, po raz pierwszy — wprowadził termin diabetes, opisujący poliurię. Drugi człon łacińskiej nazwy — mellitus, oznaczający po łacinie miód — został wprowadzony dopiero w 1675 roku przez angielskiego lekarza Thomasa Willisa [1]. Jerzy Kotlinowski Józef Dulak Alicja Józkowicz Zakład Biotechnologii Medycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, Kraków Zakład Biotechnologii Medycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Kraków; tel.: (12) 66 46 411, e-mail alicja. [email protected] Artykuł otrzymano 2 lutego 2013 r. Artykuł zaakceptowano 9 kwietnia 2013 r. Słowa kluczowe: cukrzyca, komórki progenitorowe śródbłonka, powikłania cukrzycowe Wykaz skrótów: T2DM (ang. type 2 diabetes mellitus) — cukrzyca typu 2; EPC (ang. endothelial progenitor cells) — komórki progenitorowe śródbłonka Przez wiele lat nie wiedziano ani jak leczyć cukrzycę, ani jaka jest jej patogeneza. Stosowane terapie nie przynosiły zamierzonych rezultatów, choć pojawiały się również właściwe przesłanki wiążące otyłość z rozwojem cukrzycy i zalecające pacjentom aktywność fizyczną [1]. Duży wkład w odkrycie patologii cukrzycy mieli Joseph von Mering i Oskar Minkowski. W 1889 roku wywołali oni cukrzycę u psów, którym usunęli operacyjnie trzustkę [2]. O krok dalej posunęli się w swoim eksperymencie Frederick Banting i Charles Best w 1921 roku, którzy podobnie jak poprzednicy poddali psy pankreatektomii prowadzącej do cukrzycy, następnie jednak podawali im ekstrakt z trzustek zdrowych zwierząt, co spowodowało ustąpienie symptomów choroby. Jak przypuszczano, ekstrakt ten zawierał czynną substancję, której nazwę — insulina — (łac. insula, wyspa) zaproponowano kilka lat wcześniej [3]. Dalsze badania insuliny potoczyły się dużo szybciej i doprowadziły do jej oczyszczenia z trzustek bydlęcych oraz terapeutycznego zastosowania hormonu w formie iniekcji u osób chorych na cukrzycę już w 1922 roku [1]. Współczesna definicja cukrzycy przyjęta przez Światową Organizację Zdrowia (WHO, ang. World Health Organization) podaje, że jest to choroba metaboliczna związana z defektem wydzielania lub działania insuliny. W wyniku tych zmian, dochodzi do przewlekłej hiperglikemii odpowiedzialnej za zaburzenia czynności oraz uszkodzenie nerek, oczu, nerwów czy naczyń krwionośnych. Należy podkreślić, że hiperglikemia jest zjawiskiem pierwotnym, prowadzącym do rozwoju powikłań w cukrzycy, które u osób nieleczonych mogą doprowadzić do śmierci [4]. W ustanowionej przez WHO klasyfikacji tej choroby wyróżnia się 4 typy cukrzycy: cukrzycę typu 1 (T1DM, ang. type 1 diabetes mellitus), cukrzycę typu 2 (T2DM, ang. type 2 diabetes mellitus), cukrzycę o znanej etiologii i cukrzycę ciężarnych [1,4]. Przyczyną występowania T1DM jest niszczenie komórek β trzustki w procesie autoimmunologicznym, prowadzącym do braku Postępy Biochemii 59 (3) 2013 257 endogennej insuliny. Natomiast do rozwoju T2DM dochodzi na skutek insulinooporności, mimo produkowania tego hormonu przez komórki β. Do grupy cukrzyc o znanej etiologii należy najwięcej form tej choroby. Zalicza się do niej m. in. cukrzycę spowodowaną chorobami genetycznymi, zakażeniami oraz wpływem substancji chemicznych. Jako przyczynę rozwoju tej choroby podaje się również endokrynopatie i choroby wydzielniczej części trzustki. Ostatni, 4 typ cukrzycy opisuje się w przypadku każdego stanu hiperglikemicznego pojawiającego się u zdrowych dotąd kobiet będących w ciąży. Należy podkreślić, że T2DM jest najczęstszą postacią schorzenia, diagnozowaną u 90-95% wszystkich pacjentów cukrzycowych [1,4]. Ze względu na duży wzrost liczby zachorowań oraz skomplikowaną terapię, eksperci WHO uznali cukrzycę za epidemię XXI wieku. Szacują oni, że obecnie na świecie choruje ponad 220 milionów osób, a liczba ta ma się podwoić przed rokiem 2030 [4]. Podobne wyniki otrzymali Shaw i wsp., którzy liczbę chorych na świecie w 2010 roku ocenili na 285 milionów [5]. Tylko w 2004 roku bezpośrednio z powodu hiperglikemii lub w związku z rozwojem powikłań cukrzycowych zmarło około 3,4 miliona osób. Pacjenci chorzy na cukrzycę są również bardziej podatni na rozwój przewlekłych powikłań, takich jak trudno gojące się rany, uszkodzenia nerek czy neuropatie, które znacząco obniżają jakość życia [5]. Objawy i diagnostyka cukrzycy Prawidłowe rozpoznanie cukrzycy i wczesne rozpoczęcie terapii jest utrudnione przez brak swoistych i jednoznacznych objawów. Ocenia się, że nawet 50% chorych na cukrzycę jest nieświadomych choroby [1]. Sytuację dodatkowo utrudnia fakt, że wiele przypadków T2DM przebiega praktycznie bezobjawowo, dlatego w rozpoznaniu tej choroby bardzo istotne znacznie ma wykrycie czynników ryzyka i badanie przesiewowe. Występowanie nadciśnienia tętniczego, otyłości czy cukrzycy w rodzinie chorego powinno być wskazaniem do badań w kierunku cukrzycy. Jak wskazują statystyki, np. otyłość, zwłaszcza typu brzusznego, występuje aż u 85% pacjentów z T2DM [1]. Standardowym badaniem wykorzystywanym w diagnostyce cukrzycy jest pomiar glikemii [1,6]. Oznaczenia stężenia glukozy wykonuje się w osoczu krwi żylnej metodami enzymatycznymi zarówno na czczo jak i po obciążeniu glukozą (tzw. test tolerancji glukozy). Z kolei doustny test tolerancji glukozy (OGTT, ang. oral glucose tolerance test) jest najczęściej wykonywanym testem czynnościowym. Polega na oznaczeniu glikemii na czczo oraz na sprawdzeniu jak szybko glukoza jest pobierana z krwi przez komórki docelowe. Standardowo w teście tym określa się glikemię przed i dwie godziny po wypiciu przez pacjenta szklanki wody zawierającej 75 g glukozy [6]. Natomiast w przypadku osób cierpiących na cukrzycę, do oceny skuteczności zastosowanej terapii wykorzystuje się pomiar stężenia glikowanej hemoglobiny (HbA1c) w krwi [6]. Ze względu na średni czas życia erytrocytów wynoszący 120 dni, HbA1c odzwierciedla trzymiesięczną historię choroby. Opisane testy pozwalają na przeprowadzenie diagnozy cukrzycy, zgodnie z algorytmem przedstawionym na rycinie 1. 258 Rycina 1. Algorytm rozpoznawania cukrzycy, na podstawie [1], zmienione. Warto pamiętać, że do opisu stanów hiperglikemicznych stosuje się kilka terminów: stan przedcukrzycowy (ang. prediabetes), który rozpoznaje się na podstawie wykrycia nieprawidłowej glikemii na czczo (IFG, ang. impaired fasting glucose) i/lub upośledzonej tolerancji glukozy (IGT, ang. impaired glucose tolerance). Diagnozuje się go na podstawie wartości IFG i IGT wynoszących odpowiednio 100–125 mg/ dL i 140–199 mg/dL. U osób z rozpoznanym stanem przedcukrzycowym zaleca się powtarzanie badań co 2 lata [6]. Z kolei cukrzycę stwierdza się w przypadku spełnienia przez pacjentów jednego z poniższych kryteriów: 1. występowania typowych objawów klinicznych w połączeniu z wartością glikemii o dowolnej porze dnia ≥ 200 mg/dL, 2. dwukrotnego pomiaru glikemii na czczo ≥ 126 mg/dL, 3. glikemii ≥ 200 mg/dL 120 minut po doustnym obciążeniu 75 g glukozy (test OGTT). Etiologia i rozwój cukrzycy typu 2 Czynnikami ryzyka zwiększającymi prawdopodobieństwo rozwoju T2DM są zarówno uwarunkowania genetyczne, jak i czynniki środowiskowe. Do najważniejszych czynników środowiskowych zalicza się otyłość typu brzusznego i małą aktywność fizyczną, jednak do rozwoju choroby dochodzi tylko u części osób. U pozostałych, sprawność wydzielnicza komórek β jest wystarczająco duża, by utrzymująca się przez długi czas hiperinsulinemia kompensowała hiperglikemię. Osoby te charakteryzuje również zbliżony do prawidłowego poziom glukozy w krwi, brak insulinooporności oraz rozrost podskórnej tkanki tłuszczowej, dzięki czemu nie dochodzi do magazynowania tłuszczów w wątrobie, sercu, mięśniach i trzustce [7,8]. Wydaje się jednak, że wpływ czynników środowiskowych promujących rozwój cukrzycy zaczyna się już w trakcie życia płodowego. Badania populacyjne wykazały, że u www.postepybiochemii.pl dzieci, których matka w trakcie ciąży miała cukrzycę, wcześniej dochodzi do rozwoju T2DM [9]. Przykładem może być też analiza częstości zachorowań w rodzinach, w których matki rodziły dzieci zarówno przed, jak i po zachorowaniu na T2DM. Stwierdzono, że dzieci urodzone zanim doszło do rozwoju T2DM u matki rzadziej zapadały na tą chorobę [10]. Mimo istotnego wpływu historii rodzinnej na rozwój cukrzycy stwierdzono, że tylko u około 10% pacjentów rozwój choroby można wytłumaczyć znanymi dziś mutacjami. Jedno z ostatnich badań populacyjnych przeprowadzonych w Szwecji w 2010 roku wykazało zwiększone ryzyko wystąpienia cukrzycy u dzieci, których rodzeństwo również chorowało na cukrzycę. Ryzyko nie było natomiast związane ze stanem zdrowia rodziców. Wynik ten sugeruje recesywny wzór dziedziczenia u osób narażonych na podobne czynniki środowiskowe [11]. Badania porównawcze genomów pacjentów cukrzycowych pozwoliły na wykrycie wielu potencjalnie istotnych genów, których mutacje mogą wpływać na rozwój choroby. Są to przede wszystkim geny związane z upośledzeniem funkcjonowania komórek β, insulinoopornością oraz otyłością [12]. Najważniejsza znana mutacja promująca rozwój T2DM zlokalizowana jest w intronie 3 genu kodującego czynnik transkrypcyjny TCF7L2 (ang. transcription factor 7-like 2) [13]. TCF7L2 jest składnikiem kompleksu transkrypcyjnego β-katenina/TCF i reguluje przekaz sygnału w szlaku Wnt. Jego funkcja w cukrzycy polega na stymulacji proliferacji komórek β trzustki oraz zwiększaniu produkcji glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1, ang. glucagon-like peptide-1) [13]. Rozwój T2DM przebiega wieloetapowo. Zbyt wysokie, toksyczne dla organów wewnętrznych stężenie glukozy w krwi upośledza szereg procesów m. in. działanie insuliny [14]. Pojawiająca się w pierwszej fazie T2DM insulinooporność prowadzi do zaburzeń we wchłanianiu i metabolizmie glukozy przez komórki mięśniowe, adipocyty i hepatocyty. W odpowiedzi na gorsze działanie insuliny, organizm zwiększa jej produkcję, kompensując w ten sposób przez pewien czas hiperglikemię. Jest to jednak działanie krótkotrwałe, ponieważ nadmierna eksploatacja komórek β trzustki prowadzi do zmniejszenia ich masy i stopniowego spadku wydzielania insuliny, aż do całkowitego zaprzestania funkcji wydzielniczych. Występująca w końcowej fazie cukrzycy apoptoza komórek β prowadzi do całkowitego braku endogennej insuliny, nasilenia hiperglikemii i konieczności podawania egzogenngo hormonu [14]. Wpływ hiperglikemii na komórki śródbłonka Podwyższony poziom glukozy w krwi zaburza funkcjonowanie hepatocytów, adipocytów, komórek mięśniowych oraz komórek śródbłonka, zarówno dojrzałych (EC, ang. endothelial cells), jak i progenitorowych (EPC, ang. endothelial progenitor cells) [14,15]. Wpływ na komórki śródbłonka wydaje się najistotniejszy, ponieważ związany jest z uszkodzeniami naczyń krwionośnych. Glukoza jest podstawowym źródłem energii wszystkich komórek organizmu człowieka. W warunkach prawidłowych jest przekształcana do acetylo-CoA, który bierze następnie udział w wytwarzaniu i magazynowaniu energii w postaci ATP. Produktem ubocznym tych przemian jest zawsze powstawanie niewielkiej ilości reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species). W hiperglikemii, oprócz prawidłowej syntezy ATP dochodzi do zwiększonej produkcji ROS, niespecyficznej glikacji białek (AGE, ang. advanced glycation endproducts), aktywacji kinazy białkowej C oraz indukcji szlaku poliolowego i heksozoaminowego [16]. Produkcja ROS i AGE uważana jest za kluczowy czynnik uszkadzający naczynia krwionośne i przyczyniający się do rozwoju mikro- i makroangiopatii, głównych powikłań cukrzycy. Wykazano, że wiązanie AGE z receptorem wywołuje indukcję oksydaz NADPH, wzrost produkcji ROS, a w konsekwencji prowadzi do uszkodzeń w DNA [17]. Stwierdzono również, że wywołana przez hiperglikemię i ROS apoptoza EC zależy od szlaku NFκB, c-Jun i aktywacji kaspaz [18]. Upośledzenie funkcji śródbłonka w warunkach hiperglikemii wynika też z hamowania szlaku kinazy fosfatydyloinozytolu-3 (PI3K, ang. phosphoinositide-3-OH kinase) przez AGE. W prawidłowych warunkach aktywacja PI3K poprawia żywotność EC oraz zwiększa ich zdolność do migracji i produkcji tlenku azotu (NO, ang. nitric oxide) przez śródbłonkową syntazę NO (eNOS, ang. endothelial nitric oxide synthase) [19]. W hiperglikemii dochodzi do rozprzęgnięcia eNOS, czego efektem jest zmniejszenie syntezy NO, nasilenie produkcji anionorodnika ponadtlenkowego (O2-∙) i w konsekwencji powstawanie bardzo toksycznego nadtlenoazotynu (ONOO-) [19]. Rycina 2. Prawidłowy śródbłonek naczyń krwionośnych i mechanizmy odpowiedzialne za jego uszkodzenie w hiperglikemii, na podstawie [40], zmienione. Postępy Biochemii 59 (3) 2013 U chorych na cukrzycę dysfunkcja śródbłonka związana jest ponadto z nasiloną syntezą cytokin prozapalnych, adhezyn i czynników wzrostowych. Prowadzi to do nadmiernej adhezji limfocytów, płytek krwi i monocytów, co indukuje reakcję zapalną i może zwiększać ryzyko rozwoju miażdżycy [16]. Dodatkowym czynnikiem ułatwiającym 259 infiltrację monocytów jest zwiększona przepuszczalność śródbłonka w warunkach hiperglikemii, spowodowana osłabieniem połączeń międzykomórkowych [20]. Wykazano też, że AGE wywołując agregację białek macierzy są przyczyną spadku elastyczności naczyń i hamowania aktywacji metaloproteinaz (Ryc. 2) [21]. Wywołane przez hiperglikemię i ROS zmiany w funkcjonowaniu EC oraz zaburzony skład i struktura macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzą do dysfunkcji naczyń krwionośnych, zmniejszenia ich światła i upośledzenia przepływu krwi. Wszystkie te zmiany wywołują powikłania cukrzycowe, które u osób nieleczonych mogą doprowadzić nawet do śmierci [21]. Dlatego kluczowym zagadnieniem jest możliwość poprawy funkcjonowania naczyń krwionośnych u osób z cukrzycą, a jedną z możliwych strategii terapeutycznych jest wykorzystanie komórek progenitorowych. Odkrycie komórek progenitorowych śródbłonka Przez wiele lat uważano, że tworzenie de novo naczyń krwionośnych z niezróżnicowanych komórek prekursorowych zachodzi jedynie w trakcie rozwoju płodowego. Sądzono, że u osób dorosłych proces ten nie występuje, a regeneracja i tworzenie nowych naczyń przebiega na drodze migracji i różnicowania in situ dojrzałych komórek śródbłonka. Ten powszechnie zaakceptowany pogląd uległ zmianie po odkryciu przez Asaharę i współpracowników z zespołu prof. Jeffrey’a Isnera, w krwi dorosłych osób komórek progenitorowych śródbłonka zdolnych do proliferacji, migracji i inkorporowania do istniejących naczyń [22]. Praca opublikowana w 1997 roku w Science, po raz pierwszy udokumentowała obecność w ludzkiej krwi obwodowej komórek frakcji leukocytarnej, zdolnej do różnicowania in vitro do komórek śródbłonka. Do izolacji EPC wykorzystano antygeny CD34 i VEGFR-2 (KDR) ulegające ekspresji zarówno w komórkach śródbłonkowych jak i w hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC, ang. hematopoietic stem cells). Pozyskane od dorosłych ochotników komórki CD34(+)/VEGFR-2(+) hodowano in vitro i już po kilku dniach stwierdzono syntezę charakterystycznych markerów śródbłonka, takich jak: CD31, E-selektyna, Tie-2 czy eNOS [22]. W tej samej pracy opisano też doświadczenie, polegające na izolacji EPC z transgenicznych myszy wykazujących ekspresję genu reporterowego β-galaktozydazy i podaniu ich zwierzętom z niedotlenioną kończyną. Wykazano obecność komórek β-gal(+)/CD31(+) w regenerujących naczyniach krwionośnych, wskazując tym samym na ich udział w waskulogenezie [22]. Kolejne doświadczenia wykonywane przez ten sam zespół potwierdzały udział komórek EPC uwalnianych ze szpiku kostnego w tworzeniu naczyń krwionośnych zarówno w stanach fizjologicznych (przerost błony śluzowej macicy, ukrwienie ciałka żółtego, gojenie ran) jak i patologicznych (wzrost nowotworu, zawał serca czy niedokrwienie kończyny tylnej). W badaniach przeprowadzano rekonstytucję szpiku kostnego u napromieniowanych myszy, przeszczepiając im komórki wykazujące ekspresję β-galaktozydazy pod kontrolą promotorów charakterystycznych dla komórek śródbłonka, czyli Tie-2 lub VEGFR-2. Po wykonaniu rekonstytucji szpiku kostnego 260 badacze stwierdzali obecność znakowanych komórek w nowopowstałych naczyniach [23,24]. Eksperymenty wykonane przez Asaharę i wsp. dały początek wielu pracom, które pozwoliły na lepsze poznanie funkcjonowania EPC. Mianem EPC określa się dziś jednojądrzaste komórki eksprymujące równocześnie markery śródbłonkowe i progenitorowe [25]. EPC wykazują ponadto zdolność wiązania lektyny, białek macierzy zewnątrzkomórkowej (np. fibronektyny) oraz pochłaniania acetylowanych lipoprotein o niskiej gęstości (AcLDL, ang. acetylated low density lipoprotein). Mimo wielu lat badań nie udało się jednak do dzisiaj zidentyfikować antygenu ulegającego ekspresji jedynie na EPC, który jednoznacznie definiowałby tylko tę populację komórek. Wśród markerów obecnych na powierzchni ludzkich EPC wyróżnia się CD31, CD34, VE-kadherynę, CD146, CXCR4, VEGFR-2, Tie-2 czy vWF. Synteza CD133 i c-kit, markerów progenitorowych, zanika na powierzchni ludzkich EPC w trakcie ich różnicowania do EC [25]. Charakterystyka mysich EPC w dużej mierze jest podobna. Warto jednak pamiętać, że komórki mysie wiążą lektynę BS1 Griffonia simplicifolia (ludzkie — Ulex europaeus) i eksprymują Sca-1. Podobnie jak w przypadku komórek ludzkich, różnicowanie mysich EPC wiąże się z utratą Sca-1 i c-kit [25]. Do analizy EPC wykorzystuje się również właściwości angiogenne tych komórek, takie jak zdolność do tworzenia kapilar in vitro, tworzenie wtórnych kolonii EC, produkcję czynników proangiogennych czy udział w naprawie naczyń in vivo. Należy podkreślić, że analiza testów funkcjonalnych jest bardzo istotna, ponieważ pozwala na ocenę rzeczywistej funkcji EPC i ich ewentualnej przydatności w terapii. Fenotypowa charakterystyka EPC jest natomiast wciąż tematem ożywionych dyskusji i licznych kontrowersji. Nie ma również powszechnie uznawanej, wystandaryzowanej metody ich izolacji i hodowli co dodatkowo utrudnia interpretację uzyskanych wyników [26]. Dokładne porównanie i podsumowanie stosowanych metod przedstawili ostatnio Richardson i Yoder, potwierdzając jednocześnie, że używany obecnie termin EPC nie definiuje ściśle jednej populacji komórek [26]. Dodatkowo, charakterystykę EPC utrudnia ekspresja niektórych antygenów zarówno na powierzchni EPC, EC jak i HSC. Wykorzystanie różnych protokołów izolacji, odmiennych warunków hodowli, czy wreszcie charakteryzowanie EPC w oparciu o niejednakowe markery i testy funkcjonalne, utrudnia porównywanie wyników uzyskanych przez różne grupy badawcze. Jednak, co wydaje się dziś bezsporne, komórki progenitorowe biorą udział w regeneracji naczyń krwionośnych [25,27]. EPC i kondycja naczyń krwionośnych Komórki progenitorowe śródbłonka rezydują w niszach szpiku kostnego, skąd w odpowiedzi na uszkodzenie lub niedotlenienie tkanek są mobilizowane i włączane w procesy regeneracyjne [24]. Mobilizacja wiąże się z całą kaskadą zdarzeń obejmujących uwolnienie EPC do krwi, dotarcie do uszkodzonej tkanki oraz stymulację powstawania nowych i naprawę już istniejących naczyń [28]. Jednymi z najważniejszych mediatorów odpowiedzialnych za mobilizację EPC są czynniki VEGF-A i czynnik-1α pochodzenia stromalnewww.postepybiochemii.pl go (SDF-1α, ang. stromal cell-derived factor-1α). Wiążą się one do receptorów VEGFR-2 (VEGF-A) i CXCR4 (SDF-1α) na powierzchni komórek podścieliska, indukując fosforylację kinaz PI3K/AKT i aktywując syntazę tlenku azotu. Wzrost produkcji NO aktywuje metaloproteinazę 9 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-9, ang. matrix metalloproteinase 9), która uwalnia czynnik komórek macierzystych (KitL, ang. kit ligand) obecny w błonie komórek podścieliska. Rozpuszczalna forma KitL (sKitL), po związaniu z receptorem na powierzchni EPC, indukuje ich mobilizację. W kolejnym etapie, naprowadzane przez gradient chemokin EPC docierają do uszkodzonych naczyń i biorą udział w ich naprawie (Ryc. 3) [28]. Po wniknięciu do uszkodzonych lub ischemicznych tkanek EPC stymulują powstawanie naczyń krwionośnych. Uważa się, że biorą udział w waskulogenezie (tworzeniu de novo nowych naczyń), różnicując w dojrzałe komórki śródbłonkowe. Mogą też bezpośrednio inkorporować do uszkodzonych, ale już istniejących struktur, wypełniając luki w warstwie śródbłonka [22]. Z powodu rozbieżnych wyników dotyczących udziału EPC w utworzonych naczyniach (od 0% do 80% komórek śródbłonkowych) trudno jednak jednoznacznie stwierdzić, jakie jest nasilenie i znaczenie tego procesu [29-31]. Coraz częściej zwraca się natomiast uwagę na istotną rolę działania parakrynnego. EPC po dotarciu do uszkodzonej tkanki wydzielają czynniki wzrostowe, aktywując zarówno EC jak i pericyty. Do proangiogennych cytokin produkowanych w wysokich stężeniach przez EPC zalicza się IL-8, czynnik wzrostu hepatocytów (HGF, ang. hepatocyte growth factor), VEGF-A, płytkowy czynnik wzrostu-BB (PDGF-BB, ang. platelet-derived growth factor-BB), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, ang. basic fibroblast growth factor) oraz białko chemotaktyczne-1 dla monocytów (MCP1, ang. monocyte chemoactractant protein-1) [32]. Znaczenie produkowanych przez EPC czynników wzrostowych wykazali Di Santo i wsp. analizując pożywki kondycjonowane zebrane znad EPC (EPC CM). Media te indukowały in vitro wzrost kapilar w teście krążków aortalnych na matrigelu oraz hamowały apoptozę EC [33]. Co najważniejsze, domięśniowe podanie EPC CM do niedotlenionej kończyny szczura przyśpieszało regenerację przepływu, poprzez zwiększenie liczby dojrzałych kapilar. Autorzy pracy zaobserwowali taki sam efekt terapeutyczny po podaniu komórek i kondycjonowanych mediów, co potwierdza kluczowe znaczenie parakrynnej aktywności EPC [33]. Rycina 3. Schemat mobilizacji komórek progenitorowych śródbłonka ze szpiku kostnego. Postępy Biochemii 59 (3) 2013 Proangiogenny potencjał komórek progenitorowych śródbłonka i ich duże znaczenie dla prawidłowej kondycji naczyń krwionośnych nie budzi dziś wątpliwości, mimo trudności z jednoznacznym wskazaniem najważniejszego mechanizmu ich działania oraz braku ścisłej definicji tych komórek. Wykazano, że funkcjonowanie EPC jest zaburzone w stanach patologicznych. Stwierdzono m. in. odwrotną korelację pomiędzy liczbą i zdolnością EPC do migracji, a czynnikami ryzyka choroby niedokrwiennej serca [34]. Wykazano też istnienie zależności pomiędzy liczebnością EPC w krwi i skalą Framingham, oceniającą ryzyko wystąpienia zawału serca lub śmierci spowodowanej chorobą niedokrwienną serca w perspektywie 10 lat [34]. U pacjentów z cukrzycą wydaje się natomiast, że nasilenie niekorzystnych zmian w naczyniach krwionośnych wiąże się ze zmniejszoną liczbą oraz osłabionym potencjałem klonogennym EPC [34]. Kondycja komórek EPC u pacjentów chorych na cukrzycę Pacjenci chorzy na cukrzycę 3–4 razy częściej zapadają na choroby układu krążenia niż osoby z prawidłową glikemią. Stwierdzono, że najważniejszą przyczyną tych komplikacji jest dysfunkcja śródbłonka. Wydaje się, że nasilenie niekorzystnych zmian w naczyniach wynika również ze zmniejszonej liczby i osłabionego potencjału klonogennego EPC [35]. Analizy laboratoryjne przeprowadzone na materiale pobranym od ludzi wykazały niekorzystny wpływ hiperglikemii na aktywność EPC. Hodowanie komórek jednojądrzastych (MNC, ang. mononuclear cells) izolowanych z krwi zdrowych osób w warunkach podwyższonego stężenia glukozy zmniejszało liczbę uzyskanych EPC. Komórki wykazywały też wolniejszą migrację, zmniejszoną produkcję NO oraz spadek aktywności MMP-9 [36]. Wpływ hiperglikemii na EPC uzyskane od zdrowych ochotników i hodowane in vitro był porównywany z wpływem stymulacji czynnikiem-α martwicy nowotworów (TNF-α, ang. tumor necrosis factor-α). Stwierdzono, że w obu przypadkach dochodzi do aktywacji kinazy p38 [37]. Wydaje się, że zarówno indukcja p38 wynikająca z fosforylacji reszt treoniny 180 i tyrozyny 182 jak i upośledzenie aktywności szlaku kinazy Akt ogrywają istotną rolę w hamowaniu proliferacji i starzeniu się EPC u pacjentów z cukrzycą [38]. Komórki EPC izolowane z krwi chorych i hodowane in vitro wykazują obniżoną o prawie 50% proliferację i znacznie mniej wydajnie inkorporują do kapilar. Mimo prawidłowej adhezji do kolagenu, fibrynogenu i spoczynkowych EC, ich zdolność do wiązania się z aktywowanym śródbłonkiem jest zaburzona [39]. Tymczasem wiązanie EPC z uszkodzonym śródbłonkiem ma kluczowe znaczenie, gdyż warunkuje możliwość naprawy naczyń [39]. Cukrzyca wpływa też na działanie parakrynne ludzkich EPC. Kondycjonowane pożywki znad takich komórek mniej wydajnie stymulują tworzenie kapilar przez dojrzałe komórki śródbłonkowe. Osłabienie aktywności cukrzycowych EPC utrzymuje się nawet po kilkudniowej hodowli w warunkach normoglikemii [40]. 261 Badania in vivo potwierdziły niekorzystny wpływ hiperglikemii na liczbę i funkcjonowanie EPC u ludzi, sugerowany przez doświadczenia in vitro. Wykazano między innymi odwrotną korelację pomiędzy stężeniem glukozy a liczbą EPC (komórek o fenotypie CD34(+)/KDR(+)) w krwi obwodowej pacjentów z T2DM. Spadek u osób chorych wynosił około 40%, co znaczyło, że liczba EPC zmniejszała się z około 70 do około 40 na milion komórek [41]. Wykazano też, że liczba EPC w krwi osób zdrowych i z cukrzycą zdiagnozowaną po raz pierwszy (charakteryzującą się poziomem HbA1c poniżej 7,5%) nie różni się. Kluczową rolę hiperglikemii w pogorszeniu funkcjonowania EPC dokumentują również prace opisujące zwiększoną zdolność jednojądrzastych komórek krwi obwodowej do różnicowania in vitro w kierunku EPC u pacjentów z lepszą kontrolą poziomu glukozy [42,43]. Trudno dziś jednak jednoznacznie stwierdzić, czy występowanie mikro- i makroangiopatii w cukrzycy spowodowane jest zaburzeniem funkcji EPC, czy też na skutek rozwoju powikłań, dochodzi do zmian w biologii EPC. Analizy kliniczne sugerują jedynie, że występowanie angiopatii u osób chorych na cukrzycę, zmniejsza liczbę EPC w krwi obwodowej, a stopień zaawansowania choroby naczyń obwodowych jest odwrotnie proporcjonalny do liczby tych komórek [41]. Zaburzone funkcjonowanie komórek EPC a powikłania cukrzycowe Powikłania przewlekłe powstają na skutek wieloletniej ekspozycji komórek na podwyższone stężenie glukozy i niemożności uniknięcia silnych wahań glikemii w trakcie długotrwałej choroby. Stopniowe nagromadzanie uszkodzeń w układzie krwionośnym prowadzi bardzo często, nawet u osób leczonych, do rozwoju dysfunkcji śródbłonka. Rozwój powikłań przewlekłych jest największym zagrożeniem dla pacjentów cukrzycowych. Oszacowano, że w 2000 roku przyczyniły się one do śmierci 2,9 miliona osób na całym świecie [4,5]. Najczęściej diagnozowanym przewlekłym powikłaniem jest neuropatia cukrzycowa, występująca aż u 50% chorych. Jest ona bezpośrednim skutkiem hiperglikemii, która w połączeniu ze stresem oksydacyjnym i zaburzeniami produkcji czynników wzrostowych prowadzi nie tylko do demielinizacji, ale również do zaniku nerwów [1]. Badania wpływu neuropatii cukrzycowej na właściwości EPC w modelu szczurzym wykazały, że upośledzona mobilizacja tych komórek związana jest z mniejszą liczbą zakończeń nerwowych w szpiku kostnym. Obok zaniku nerwów autorzy pracy wykazali wzrost liczby EPC w szpiku, przy jednoczesnym spadku ich liczebności w krwi obwodowej [43]. Podobne wyniki uzyskano analizując nerwy kulszowe u myszy z cukrzycą wywołaną iniekcją streptozotocyny. Wykazano u nich pogorszony przepływ krwi, mniejszą liczbę kapilar oraz słabsze przewodzenie w nerwach czuciowych i ruchowych. Obserwowane zmiany ustąpiły po domięśniowym podaniu EPC, które preferencyjnie lokowały się w naczyniach odżywiających nerwy i w okolicy dojrzałych komórek śródbłonka. Proangiogenne i proneurogenne wła- 262 ściwości EPC przyczyniły się do nasilenia proliferacji komórek Schwanna i EC [44]. Neuropatia, wraz ze zmniejszonym przepływem krwi w naczyniach obwodowych, dysfunkcją śródbłonka oraz upośledzoną angio- i arteriogenezą stanowi najważniejszy czynnik prowadzący do powstawania trudno gojących się ran, czyli takich, które goją się dłużej niż 8 tygodni, nie goją się wcale, lub po wygojeniu pojawiają się powtórnie [45]. Skrajnym przypadkiem są owrzodzenia stóp występujące u kilku procent pacjentów, które u około 1% chorych kończą się amputacją [46]. W 2004 roku w USA 60% amputacji kończyn dolnych niezwiązanych z urazem mechanicznym było spowodowanych występowaniem cukrzycy z powikłaniami [47]. Przedłużenie gojenia ran lub całkowite zahamowanie tego procesu w cukrzycy wynika z rozwijającej się neuropatii i waskulopatii lub może być spowodowane zakażeniami. Wydaje się, że zmniejszenie liczebności i upośledzenie funkcji EPC w cukrzycy, może przyczyniać się do zaburzeń gojenia ran, gdyż hiperglikemia wpływa zarówno na zdolności EPC do bezpośredniej naprawy naczyń, jak również na wydzielanie czynników wzrostowych [48]. Jak wykazali Barcelos i wsp., podanie pożywek zebranych znad komórek CD133(+) (CD133(+) CM) przyśpiesza gojenie owrzodzeń u myszy cukrzycowych. Proangiogenny potencjał CD133(+) CM potwierdzono również in vitro: media te stymulowały migrację i tworzenie tubul przez dojrzałe komórki śródbłonka, a efekt był hamowany w obecności przeciwciał wiążących VEGF-A lub IL-8 [48]. Zaangażowanie EPC w gojenie ran przebiega wieloetapowo, obejmując przekaz sygnału do szpiku, uwalnianie EPC do krwi, migrację komórek do miejsca zranienia i aktywne włączanie się w proces odbudowy. Zakłócenie któregokolwiek z tych etapów może opóźnić lub całkowicie zaburzyć regenerację tkanek [28]. Wykazano, że upośledzone uwalnianie komórek progenitorowych ze szpiku kostnego w cukrzycy w odpowiedzi na m. in. VEGF-A i SDF-1α spowodowane jest przede wszystkim zmniejszoną aktywnością eNOS i wynikającym z tego osłabieniem przekazu sygnału od sKitL [39,40]. SDF-1α jest jedną z najważniejszych chemokin odpowiedzialnych za mobilizację komórek progenitorowych. EPC migrują zgodnie z gradientem tego białka, którego stężenie w prawidłowych warunkach powinno być najwyższe w miejscu uszkodzenia naczyń [28]. U myszy cukrzycowych stwierdzono jednak niższą ekspresję SDF-1α w zranionej tkance. Dopiero odtworzenie naturalnie występującego gradientu poprzez lokalne podanie rekombinowanego białka indukowało mobilizację EPC i przyśpieszało gojenie ran [28]. Podobne wyniki otrzymano analizując trzy odmienne modele myszy cukrzycowych (db/db, NOD i myszy nastrzyknięte streptozotocyną). We wszystkich modelach zaobserwowano spowolnienie gojenia ran, co wiązało się z mniejszą liczebnością EPC w miejscu zranienia. Tak jak w przypadku SDF-1α, miejscowe podanie PDGF-BB przyspieszało gojenie i stymulowało powstawanie nowych naczyń [49]. Wyniki te sugerują, że stymulacja komórek EPC może pomóc w terapii przewlekłych ran oraz owrzodzeń. Terapia komórkowa z wykorzystaniem EPC może być bardzo obiecująca, choć nie można wykluczyć niepożądanych skutków ubocznych tej metody. Potencjalnie EPC www.postepybiochemii.pl mogą bowiem przyczyniać się do wzrostu unaczynienia nowotworów czy rozwoju proliferacyjnej formy retinopatii cukrzycowej. Badania potwierdziły, że EPC mogą uczestniczyć w patologicznej neowaskularyzacji [50], przy czym wydaje się, że proces ten zależy od mobilizacji EPC indukowanej przez SDF-1. Wykazano, że w ciele szklistym myszy będących modelem proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej, stężenie SDF-1 jest wysokie, a blokowanie aktywności tego białka in vivo zapobiega neowaskularyzacji [51]. Niekontrolowany wzrost naczyń krwionośnych w przypadku retinopatii cukrzycowej jest przeciwieństwem upośledzonej angiogenezy opisywanej zarówno u pacjentów T1DM jak i T2DM [38,39]. Jedna z hipotez tłumaczących ten paradoks zakłada, że w odpowiedzi na lokalną mobilizację EPC w niedotlenionej siatkówce dochodzi do wzrostu kapilar, ale ich dalsze funkcjonowanie jest upośledzone. Hipoteza ta została sformułowana na podstawie wyników, które otrzymali Asnaghi i wsp., analizując EPC krążące w krwi obwodowej osób zdrowych, cierpiących na T1DM bez powikłań oraz T1DM współistniejącą z retinopatią cukrzycową. Potencjał klonogenny EPC u pacjentów z cukrzycą i retinopatią był większy niż u pozostałych grup. Autorzy potwierdzili również osłabienie potencjału klonogennego cukrzycowych EPC (od pacjentów z T1DM bez retinopatii) w porównaniu do komórek osób zdrowych [52]. Także Fadini i wsp. analizując komórki CD34(+)/KDR(+) w krwi obwodowej pacjentów z T2DM stwierdzili, że występowanie powikłań koreluje z liczebnością EPC. W porównaniu do osób z cukrzycą bez komplikacji, pacjenci z cukrzycą i z chorobą naczyń obwodowych mieli mniej EPC. Współistnienie cukrzycy i retinopatii było natomiast związane ze zwiększoną liczbą tych komórek [53]. Możliwości poprawy funkcjonowania EPC Ze względu na potencjalne znaczenie terapeutyczne EPC, podejmowane są liczne próby poprawy ich właściwości. Badania przeprowadzone u zdrowych ochotników sugerują, że nawet jednorazowy wysiłek fizyczny stymuluje uwalnianie EPC. Rehman i wsp. opisali prawie czterokrotny wzrost ich liczby w krwi osób poddanych ćwiczeniom w stosunku do grupy kontrolnej [54]. Podobny efekt zaobserwowano w przypadku regularnych ćwiczeń trwających 3 miesiące. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że długotrwała gimnastyka zwiększa zarówno potencjał klonogenny EPC, jak i ich zdolność do migracji. Autorzy udokumentowali również pogorszenie funkcjonowania EPC u osób starszych, przy czym trend ten został częściowo odwrócony w wyniku fizykoterapii [55]. Ćwiczenia fizyczne wpływają korzystnie na komórki EPC nie tylko u osób zdrowych, ale także u cierpiących na choroby układu krążenia. Poprawę liczebności, potencjału migracyjnego i klonogennego EPC wykazano np. u pacjentów z chorobą tętnic obwodowych poddanych regularnemu treningowi. Efektem treningu było zwiększenie dystansu, jaki chorzy mogli przejść bez wystąpienia dolegliwości bólowych [56]. Ćwiczenia fizyczne miały również korzystny wpływ na EPC u chorych z przewlekłą niewydolnością serca, chorobą niedokrwienną serca i cukrzycą typu 2 [57,58]. Również nasze badania wykazały wzrost liczby krążących Postępy Biochemii 59 (3) 2013 EPC u pacjentów z miażdżycą tętnic obwodowych już w trzy godziny po jednorazowym wysiłku na bieżni, choć efekt taki nie był obserwowany po jednorazowym wysiłku u pacjentów trenujących regularnie przez trzy miesiące [59]. Poprawę funkcjonowania EPC obserwuje się również po zastosowaniu odpowiednio dobranej farmakoterapii. Badania in vitro pokazały, że insulina stymuluje tworzenie kapilar oraz zwiększa potencjał klonogenny EPC. Związane jest to z aktywacją szlaku receptora dla insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (IGF-1, ang. insulin-like growth factor) i kinaz MAP (Erk1/2 i p38) [60]. Insulina wpływa także na mobilizację komórek CD34(+)/CD133(+) u pacjentów z cukrzycą. Wykazano, że kilkutygodniowa insulinoterapia doprowadziła do obniżenia poziomu glikowanej hemoglobiny oraz do znaczącego wzrostu liczby komórek EPC w krwi. Wyniki opublikowane ostatnio przez Fadini i wsp. potwierdzają, że normalizacja glikemii u pacjentów z T2DM i makroangiopatią poddanych insulinoterapii związana jest z poprawą kondycji naczyń krwionośnych. Towarzyszy temu obniżenie produkcji prozapalnych białek adhezyjnych: międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (ICAM-1, ang. intercellular adhesion molecule-1), naczyniowej cząsteczki adhezyjnej-1 (VCAM-1, ang. vascular cell adhesion molecule-1), E-selektyny oraz zwiększenie liczby krążących EPC [61]. U chorych na cukrzycę wykazano także korzystny wpływ na EPC agonistów receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów-gamma (PPARγ, ang. peroxisome proliferator-activated receptor gamma). PPARγ to czynnik transkrypcyjny z nadrodziny receptorów jądrowych, który w wyniku aktywacji tworzy heterodimer i wiąże się do sekwencji PPRE (PPAR, ang. responsive element) na promotorach genów, bezpośrednio aktywując ich transkrypcję. Działa głównie na geny zaangażowane w regulację metabolizmu lipidów i glukozy. Jego ekspresja jest najwyższa w białej tkance tłuszczowej, a indukcja PPARγ jest warunkiem dojrzewania adipocytów [62]. Wzrost aktywności PPARγ zwiększa także liczbę EPC w krwi oraz poprawia ich właściwości in vitro [42,63,64]. Syntetycznymi agonistami PPARγ, które stosowano u pacjentów z insulinoopornością są związki z grupy tiazolidinedionów (TZD, ang. thiazolidinediones) takie jak rosiglitazon i pioglitazon. Pierwsze wyniki dotyczące wpływu TZD na funkcjonowanie EPC u pacjentów z T2DM opublikowali Pistrosch i wsp. w 2005 roku. W pracy opisano wyniki trzymiesięcznej terapii rosiglitazonem u osób z cukrzycą, w wyniku której zaobserwowano normalizację upośledzonej migracji EPC oraz wzrost ich liczby. Korzystne efekty utrzymywały się nawet przez 9 tygodni od zakończenia terapii [42]. Podobne wyniki uzyskano w przypadku dodatkowego podawania pioglitazonu pacjentom leczonym metforminą, przy czym w grupie leczonej dodatkowo TZD obserwowano normalizację parametrów biochemicznych, takich jak poziom triglicerydów, lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL, ang. very low density lipoproteins) i białka C-reaktywnego. Zarówno bezpośrednie jak i pośrednie działanie pioglitazonu na EPC doprowadziło do zwiększenia ich liczby, poprawy migracji oraz nasilenia adhezji do fibronektyny i kolagenu. Zaobserwowano również normalizację proliferacji i potencjału klonogenennego EPC u osób poddanych terapii [65]. 263 Efekty aktywatorów PPARγ nie zależą wyłącznie od wpływu na insulinooporność, gdyż korzystne działanie pioglitazonu na EPC wykazano również u pacjentów z prawidłową tolerancją glukozy cierpiących na chorobę niedokrwienną serca. Trwająca 30 dni terapia zwiększała liczbę komórek CD34(+)/KDR(+), nasilała migrację zależną od SDF-1 i wzmacniała potencjał klonogenny in vitro [64]. Aktywacja PPARγ znosiła również negatywny wpływ AGE – stymulacja EPC rosiglitazonem zmniejszała zahamowanie proliferacji, migracji, aktywacji Akt i fosforylacji eNOS wywoływane przez AGE [64]. Szczegółowe badania analizujące wpływ TZD na funkcjonowanie EPC pozwoliły na poznanie niektórych mechanizmów odpowiedzialnych za ten proces. Do szlaków związanych z aktywacją PPARγ przez TZD i mających korzystny wpływ na cukrzycowe EPC zalicza się m. in. aktywację telomerazy w komórkach śródbłonka. Krótkotrwałe, kilkudniowe podawanie myszom pioglitazonu nie tylko zwiększało liczbę EPC, ale przede wszystkim indukowało wzrost zawartości czynnika wiążącego telomer, typ 2 (TERF-2, ang telomer repeat-binding factor 2) oraz obniżało apoptozę tych komórek [63]. Z kolei u myszy, którym podawano pioglitazon przez miesiąc stwierdzono w komórkach aortalnych in vivo indukcję aktywności telomerazy, wzrost syntezy TERF-2 oraz spadek zawartości białek będących markerami starzenia się komórek: p16 i p53. Analogiczne wyniki uzyskano stymulując in vitro ludzkie komórki EPC, a efekty były zależne od aktywacji kinazy Akt [66]. Wykazano również, że inkubacja in vitro ludzkich EPC w obecności pioglitazonu, podobnie jak w modelach zwierzęcych, nasila aktywność telomerazy [67]. Nie jest natomiast jasne, na ile aktywatory PPARγ działają bezpośrednio poprzez aktywację PPARγ, a na ile ich aktywność jest plejotropowa i wynika z wpływu na inne ścieżki sygnałowe. Dokładne poznanie mechanizmów działania jest utrudnione przez brak odpowiedniego modelu zwierzęcego, myszy pozbawionych PPARγ. Brak PPARγ jest bowiem letalny, przy czym jednym z obserwowanych zaburzeń jest upośledzenie unaczynienia łożyska [68], co sugeruje bezpośrednie znaczenie PPARγ dla angiogenezy. Nie ma również żadnych danych wskazujących na ile zmniejszenie zawartości lub aktywności PPARγ np. u pacjentów z zespołem niewrażliwości na ligandy PPARγ, u pacjentów z hiperhomocysteinemią lub w niektórych modelach cukrzycy może wpływać na właściwości angiogenne dojrzałych i progenitorowych komórek śródbłonka. Podsumowanie Zmniejszona liczba i upośledzenie funkcji EPC u osób chorych na cukrzycę może być jednym z czynników prowadzących do zwiększenia ryzyka chorób sercowo-naczyniowych oraz powstawania mikro- i makroangiopatii. Wiadomo obecnie, że stosowanie leków regulujących poziom glukozy poprawia funkcjonowanie EPC, przy czym molekularne mechanizmy tego działania są różnorodne i odmienne dla poszczególnych grup leków. Ich zrozumienie jest niezbędne, aby w przyszłości można było skuteczniej 264 wykorzystać prowaskulogenne właściwości leków przeciwcukrzycowych w praktyce klinicznej. PIŚMIENNICTWO 1. Sieradzki J (2005) Cukrzyca i zespół metaboliczny, W: Szczeklik A (red) Choroby wewnętrzne. Medycyna Praktyczna. Kraków, str. 11791215 2. Luft R (1989) Oskar Minkowski: discovery of the pancreatic origin of diabetes, 1889. Diabetologia 32: 399-401 3. Banting FG, Best CH, Collip JB, Campbell WR, Fletcher AA (1922) Pancreatic Extracts in the Treatment of Diabetes Mellitus. Can Med Assoc J 12: 141-146 4. Jagielski AK, Piesiewicz A (2011) Diabetes as the challenge to 21 century medicine-insights from clinical and biochemical investigations. Postepy Biochem 57: 191-199 5. Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ (2010) Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract 87: 4-14 6. Grzeszczak W (2011) Zalecenia kliniczne dotyczące postępowania u chorych na cukrzycę. Diabetologia Praktyczna A1-A46 7. Prentki M, Nolan CJ (2006) Islet beta cell failure in type 2 diabetes. J Clin Invest 116: 1802-1812 8. Defronzo RA (2009) Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes 58: 773-795 9. Pettitt DJ, Lawrence JM, Beyer J, Hillier TA, Liese AD, Mayer-Davis B, Loots B, Imperatore G, Liu L, Dolan LM, Linder B, Dabelea D (2008) Association between maternal diabetes in utero and age at offspring’s diagnosis of type 2 diabetes. Diabetes Care 31: 2126-2130 10.Dabelea D, Hanson RL, Lindsay RS, Pettitt DJ, Imperatore G, Gabir MM, Roumain J, Bennett PH, Knowler WC (2000) Intrauterine exposure to diabetes conveys risks for type 2 diabetes and obesity: a study of discordant sibships. Diabetes 49: 2208-2211 11.Hemminki K, Li X, Sundquist K, Sundquist J (2009) Familial risks for type 2 diabetes in Sweden. Diabetes Care 33: 293-297 12.Voight BF, Scott LJ, Steinthorsdottir V, Morris AP, Dina C, Welch RP, Zeggini E, Huth C, Aulchenko YS, Thorleifsson G et al. (2010) Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale association analysis. Nat Genet 42: 579-589 13.Jin T, Liu L (2008) The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 and type 2 diabetes mellitus. Mol Endocrinol 22: 2383-2392 14.Pawlak J, Derlacz RA (2011) The mechanism of insulin resistance in peripheral tissues Postepy Biochem 57: 200-206 15.Fadini GP, Avogaro A (2010) Potential manipulation of endothelial progenitor cells in diabetes and its complications. Diabetes Obes Metab 12: 570-583 16.Schleicher E, Friess U (2007) Oxidative stress, AGE, and atherosclerosis. Kidney Int Suppl S17-26 17.Inoguchi T, Li P, Umeda F, Yu HY, Kakimoto M, Imamura M, Aoki T, Etoh T, Hashimoto T, Naruse M, Sano H, Utsumi H, Nawata H (2000) High glucose level and free fatty acid stimulate reactive oxygen species production through protein kinase C-dependent activation of NAD(P)H oxidase in cultured vascular cells. Diabetes 49: 1939-1945 18.Ho FM, Lin WW, Chen BC, Chao CM, Yang CR, Lin LY, Lai CC, Liu SH, Liau CS (2006) High glucose-induced apoptosis in human vascular endothelial cells is mediated through NF-kappaB and c-Jun NH2-terminal kinase pathway and prevented by PI3K/Akt/eNOS pathway. Cell Signal 18: 391-399 19.Sessa WC (2005) Regulation of endothelial derived nitric oxide in health and disease. Mem Inst Oswaldo Cruz Suppl 1: 15-18 20.Scalia R, Gong Y, Berzins B, Zhao LJ, Sharma K (2007) Hyperglycemia is a major determinant of albumin permeability in diabetic microcirculation: the role of mu-calpain. Diabetes 56: 1842-1849 21.Spinetti G, Kraenkel N, Emanueli C, Madeddu P (2008) Diabetes and vessel wall remodelling: from mechanistic insights to regenerative therapies. Cardiovasc Res 78: 265-273 www.postepybiochemii.pl 22.Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM (1997) Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-967 23.Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, Silver M, Kearne M, Magner M, Isner JM (1999) Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res 85: 221-228 24.Takahashi T, Kalka C, Masuda H, Chen D, Silver M, Kearney M, Magner M, Isner JM, Asahara T (1999) Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 5: 434-438 25.Rafii S, Lyden D (2003) Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med 9: 702-712 26.Richardson MR, Yoder MC (2011) Endothelial progenitor cells: quo vadis? J Mol Cell Cardiol 50: 266-272 27.Yoder MC, Mead LE, Prater D, Krier TR, Mroueh KN, Li F, Krasich R, Temm CJ, Prchal JT, Ingram DA (2007) Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood 109: 1801-1809 28.Liu ZJ, Velazquez OC (2008) Hyperoxia, endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxid Redox Signal 10: 1869-1882 29.Kopp HG, Ramos CA, Rafii S (2006) Contribution of endothelial progenitors and proangiogenic hematopoietic cells to vascularization of tumor and ischemic tissue. Curr Opin Hematol 13: 175-181 30.Garcia-Barros M, Paris F, Cordon-Cardo C, Lyden D, Rafii S, Haimovitz-Friedman A, Fuks Z, Kolesnick R (2003) Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 300: 1155-1159 31.Urbich C, Dimmeler S (2004) Endothelial progenitor cells functional characterization. Trends Cardiovasc Med 14: 318-322 32.Urbich C, Aicher A, Heeschen C, Dernbach E, Hofmann WK, Zeiher AM, Dimmeler S (2005) Soluble factors released by endothelial progenitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells. J Mol Cell Cardiol 39: 733-742 33.Di Santo S, Yang Z, Wyler von Ballmoos M, Voelzmann J, Diehm N, Baumgartner I, Kalka C (2009) Novel cell-free strategy for therapeutic angiogenesis: in vitro generated conditioned medium can replace progenitor cell transplantation. PLoS One 4: e5643 34.Hill JM, Zalos G, Halcox JP, Schenke WH, Waclawiw MA, Quyyumi AA, Finkel T (2003) Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med 348: 593-600 35.Loomans CJ, van Haperen R, Duijs JM, Verseyden C, de Crom R, Leenen PJ, Drexhage HA, de Boer HC, de Koning EJ, Rabelink TJ, Staal FJ, van Zonneveld AJ (2009) Differentiation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells is shifted into a proinflammatory phenotype by hyperglycemia. Mol Med 15: 152-159 36.Seeger FH, Haendeler J, Walter DH, Rochwalsky U, Reinhold J, Urbich C, Rössig L, Corbaz A, Chvatchko Y, Zeiher AM, Dimmeler S (2005) p38 mitogen-activated protein kinase downregulates endothelial progenitor cells. Circulation 111: 1184-1191 37.Kuki S, Imanishi T, Kobayashi K, Matsuo Y, Obana M, Akasaka T (2006) Hyperglycemia accelerated endothelial progenitor cell senescence via the activation of p38 mitogen-activated protein kinase. Circ J 70: 1076-1081 38.Tepper OM, Galiano RD, Capla JM, Kalka C, Gagne PJ, Jacobowitz GR, Levine JP, Gurtner GC (2002) Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation, adhesion, and incorporation into vascular structures. Circulation 106: 2781-2786 39.Loomans CJ, de Koning EJ, Staal FJ, Rookmaaker MB, Verseyden C, de Boer HC, Verhaar MC, Braam B, Rabelink TJ, van Zonneveld AJ (2004) Endothelial progenitor cell dysfunction: a novel concept in the pathogenesis of vascular complications of type 1 diabetes. Diabetes 53: 195-199 40.Fadini GP, Miorin M, Facco M, Bonamico S, Baesso I, Grego F, Menegolo M, de Kreutzenberg SV, Tiengo A, Agostini C, Avogaro A (2005) Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral vaPostępy Biochemii 59 (3) 2013 scular complications of type 2 diabetes mellitus. J Am Coll Cardiol 45: 1449-1457 41.Kusuyama, T, Omura T, Nishiya D, Enomoto S, Matsumoto R, Takeuchi K, Yoshikawa J, Yoshiyama M (2006) Effects of treatment for diabetes mellitus on circulating vascular progenitor cells. J Pharmacol Sci 102: 96-102 42.Pistrosch F, Herbrig K, Oelschlaegel U, Richter S, Passauer J, Fischer S, Gross P (2005) PPARgamma-agonist rosiglitazone increases number and migratory activity of cultured endothelial progenitor cells. Atherosclerosis 183: 163-167 43.Busik JV, Tikhonenko M, Bhatwadekar A, Opreanu M, Yakubova N, Caballero S, Player D, Nakagawa T, Afzal A, Kielczewski J, Sochacki A, Hasty S, Li Calzi S, Kim S, Duclas SK, Segal MS, Guberski DL, Esselman WJ, Boulton ME, Grant MB (2009) Diabetic retinopathy is associated with bone marrow neuropathy and a depressed peripheral clock. J Exp Med 206: 2897-2906 44.Jeong JO, Kim MO, Kim H, Lee MY, Kim SW, Ii M, Lee JU, Lee J, Choi YJ, Cho HJ, Lee N, Silver M, Wecker A, Kim DW, Yoon YS (2009) Dual angiogenic and neurotrophic effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells on diabetic neuropathy. Circulation 119: 699-708 45.Baum CL, Arpey CJ (2005) Normal cutaneous wound healing: clinical correlation with cellular and molecular events. Dermatol Surg 31: 674686 46.Wu SC, Driver VR, Wrobel JS, Armstrong DG (2007) Foot ulcers in the diabetic patient, prevention and treatment. Vasc Health Risk Manag 3: 65-76 47.National diabetes fact sheet: national estimates and general information on diabetes and prediabetes in the United States, 2011., Centers for Disease Control and Prevention. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, 2011. Atlanta, GA: U.S. 48.Barcelos LS, Duplaa C, Kränkel N, Graiani G, Invernici G, Katare R, Siragusa M, Meloni M, Campesi I, Monica M, Simm A, Campagnolo P, Mangialardi G, Stevanato L, Alessandri G, Emanueli C, Madeddu P (2009) Human CD133+ progenitor cells promote the healing of diabetic ischemic ulcers by paracrine stimulation of angiogenesis and activation of Wnt signaling. Circ Res 104: 1095-1102 49.Keswani SG, Katz AB, Lim FY, Zoltick P, Radu A, Alaee D, Herlyn M, Crombleholme TM (2004) Adenoviral mediated gene transfer of PDGF-B enhances wound healing in type I and type II diabetic wounds. Wound Repair Regen 12: 497-504 50.Grant MB, May WS, Caballero S, Brown GA, Guthrie SM, Mames RN, Byrne BJ, Vaught T, Spoerri PE, Peck AB, Scott EW (2002) Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization. Nat Med 8: 607-612 51.Butler JM, Guthrie SM, Koc M, Afzal A, Caballero S, Brooks HL, Mames RN, Segal MS, Grant MB, Scott EW l (2005) SDF-1 is both necessary and sufficient to promote proliferative retinopathy. J Clin Invest 115: 86-93 52.Asnaghi V, Lattanzio R, Mazzolari G, Pastore MR, Ramoni A, Maestroni A, Ruggieri D, Luzi L, Brancato R, Zerbini G (2006) Increased clonogenic potential of circulating endothelial progenitor cells in patients with type 1 diabetes and proliferative retinopathy. Diabetologia 49: 1109-1111 53.Fadini GP, Sartore S, Baesso I, Lenzi M, Agostini C, Tiengo A, Avogaro A (2006) Endothelial progenitor cells and the diabetic paradox. Diabetes Care 29: 714-716 54.Rehman J, Li J, Parvathaneni L, Karlsson G, Panchal VR, Temm CJ, Mahenthiran J, March KL (2004) Exercise acutely increases circulating endothelial progenitor cells and monocyte-/macrophage-derived angiogenic cells. J Am Coll Cardiol 43: 2314-2318 55.Hoetzer GL, Van Guilder GP, Irmiger HM, Keith RS, Stauffer BL, DeSouza CA (2007) Aging, exercise, and endothelial progenitor cell clonogenic and migratory capacity in men. J Appl Physiol 102: 847-852 56.Schlager O, Giurgea A, Schuhfried O, Seidinger D, Hammer A, Gröger M, Fialka-Moser V, Gschwandtner M, Koppensteiner R, Steiner S (2011) Exercise training increases endothelial progenitor cells and de- 265 creases asymmetric dimethylarginine in peripheral arterial disease: A randomized controlled trial. Atherosclerosis 217: 240-248 62.Koppen A, Kalkhoven E (2010) Brown vs white adipocytes: the PPARgamma coregulator story. FEBS Lett 584: 3250-3259 57.Sarto P, Balducci E, Balconi G, Fiordaliso F, Merlo L, Tuzzato G, Pappagallo GL, Frigato N, Zanocco A, Forestieri C, Azzarello G, Mazzucco A, Valenti MT, Alborino F, Noventa D, Vinante O, Pascotto P, Sartore S, Dejana E, Latini R (2007) Effects of exercise training on endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure. J Card Fail 13: 701-708 63.Gensch C, Clever YP, Werner C, Hanhoun M, Böhm M, Laufs U (2007) The PPAR-gamma agonist pioglitazone increases neoangiogenesis and prevents apoptosis of endothelial progenitor cells. Atherosclerosis 192: 67-74 58.Reinhard H, Jacobsen PK, Lajer M, Pedersen N, Billestrup N, Mandrup-Poulsen T, Parving HH, Rossing P (2010) Multifactorial treatment increases endothelial progenitor cells in patients with type 2 diabetes. Diabetologia 53: 2129-2133 59.Nowak WN, Mika P, Nowobilski R, Kusinska K, Bukowska-Strakova K, Nizankowski R, Józkowicz A, Szczeklik A, Dulak J (2012) Exercise training in intermittent claudication: effects on antioxidant genes, inflammatory mediators and proangiogenic progenitor cells. Thromb Haemost 108: 824-831 60.Humpert PM, Djuric Z, Zeuge U, Oikonomou D, Seregin Y, Laine K, Eckstein V, Nawroth PP, Bierhaus A (2008) Insulin stimulates the clonogenic potential of angiogenic endothelial progenitor cells by IGF-1 receptor-dependent signaling. Mol Med 14: 301-308 61.Fadini GP, de Kreutzenberg SV, Mariano V, Boscaro E, Bertolini F, Mancuso P, Quarna J, Marescotti M, Agostini C, Tiengo A, Avogaro A (2011) Optimized glycaemic control achieved with add-on basal insulin therapy improves indexes of endothelial damage and regeneration in type 2 diabetic patients with macroangiopathy: a randomized crossover trial comparing detemir versus glargine. Diabetes Obes Metab 13: 718-725 64.Werner C, Kamani CH, Gensch C, Böhm M, Laufs U (2007) The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist pioglitazone increases number and function of endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease and normal glucose tolerance. Diabetes 56: 2609-2615 65.Wang CH, Ting MK, Verma S, Kuo LT, Yang NI, Hsieh IC, Wang SY, Hung A, Cherng WJ (2006) Pioglitazone increases the numbers and improves the functional capacity of endothelial progenitor cells in patients with diabetes mellitus. Am Heart J 152: 1051 e1-8 66.Werner C, Gensch C, Pöss J, Haendeler J, Böhm M, Laufs U (2011) Pioglitazone activates aortic telomerase and prevents stress-induced endothelial apoptosis. Atherosclerosis 216: 23-34 67.Imanishi T, Kobayashi K, Kuroi A, Ikejima H, Akasaka T (2008) Pioglitazone inhibits angiotensin II-induced senescence of endothelial progenitor cell. Hypertens Res 31: 757-765 68.Nadra K, Quignodon L, Sardella C, Joye E, Mucciolo A, Chrast R, Desvergne B (2010) PPARgamma in placental angiogenesis. Endocrinology 151: 4969-4981 Type 2 Diabetes Mellitus impairs endothelial progenitor cells functions Jerzy Kotlinowski, Józef Dulak, Alicja Józkowicz Department of Medical Biotechnology, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 7 Gronostajowa St., 30-387 Krakow, Poland e-mail: [email protected] Key words: diabetes, endothelial progenitor cells, diabetic complications Abstract Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a metabolic disease caused by insulin resistance that leads to changes in glucose metabolism. Importantly, both insulin resistance and hyperglycemia are present in T2DM patients as a hallmarks of metabolic syndrome. They negatively affect functions of many cells, for example endothelial cells. Endothelial progenitor cells (EPC) is a population of mononuclear cells that expresses endothelial and progenitor markers. EPC are also characterized by ability to form tubes on matrigel, outgrowth into mature endothelial cells, produce proangiogenic factors or take part in the blood vessels formation. Upon injury endothelial progenitor cells are mobilized from bone marrow, home to injured site and take part in vessels formation. It was shown however, that functions of EPC in T2DM patients are impaired. In this review we focused on the T2DM and its detrimental effects on EPC biology. taking also into account the beneficiary role of anti-diabetic drugs. Decreased number and impaired functions of EPC in T2DM patients might lead to increased frequency of cardiovascular incidents and development of micro- or macroangiopathies. 266 www.postepybiochemii.pl
