Mgr Joanna Bednarczyk • Dziedzina: nauki

advertisement
Mgr Joanna Bednarczyk
•
•
•
•
•
•
Dziedzina: nauki biologiczne
Dyscyplina: biologia
Wszczęcie: 11.04.2014 r.
Temat: Białko MBD3 w modelu padaczki skroniowej u szczura
Promotor: dr hab. Katarzyna Łukasiuk, prof. nadzw.
Recenzenci: dr hab. Lidia Strużyńska, prof. nadzw.,
prof. dr hab. Małgorzata Maria Filip
STRESZCZENIE
Białko MBD3 (z ang. methyl-CpG-binding domain protein 3) należy do konserwowanej
ewolucyjnie rodziny białek, które charakteryzują się obecnością w swojej sekwencji
peptydowej domeny MBD (z ang. methyl-CpG-binding domain) (Nan i wsp., 1993; Hendrich i
Bird, 1998). Domena ta umożliwia wiązanie białek do metylowanych dinukleotydów CpG w
nici DNA (Bestor, 1990; Bird i Wolffe, 1999). Podstawową funkcją białek MBD jest
odczytywanie wzoru metylacji DNA (Nakao, 2001).
MBD3 ulega ekspresji w mózgu w czasie rozwoju oraz u osobnika dorosłego (Jung i wsp.,
2003). Natomiast istnieje niewiele danych na temat ekspresji MBD3 w patologii mózgu.
Celem doświadczeń przeprowadzonych w niniejszej rozprawie było zbadanie lokalizacji
mRNA i białka MBD3 w mózgu oraz poziomu ekspresji MBD3 w strukturach płata
skroniowego szczurów kontrolnych i epileptycznych. Ponadto postanowiono zbadać, czy
istnieją różnice w okupowaniu rejonów DNA przez białko MBD3 między zwierzętami
kontrolnymi i stymulowanymi. W doświadczeniach wykorzystano model padaczki skroniowej
wywołanej elektryczną stymulacją ciała migdałowatego u szczura.
Z zastosowaniem techniki hybrydyzacji in situ wykazano powszechną ekspresję mRNA MBD3
w mózgu. Stwierdzono występowanie transkryptu MBD3 w neuronach, oligodendrocytach i
astrocytach
zarówno
w
mózgach
zwierząt
kontrolnych,
jak
i stymulowanych. Nie zaobserwowano zmian poziomu ekspresji mRNA MBD3 w płacie
skroniowym na skutek stanu padaczkowego.
Wykryto obecność białka MBD3 w różnych strukturach mózgu. Dzięki zastosowaniu barwień
immunohistochemicznych wykazano, że białko MBD3 występuje w jądrach komórkowych
neuronów, dojrzałych oligodendrocytów, astrocytów zarówno spoczynkowych, jak i
aktywowanych, ale nie jest obecne w mikrogleju w mózgach zwierząt kontrolnych i 14 dni po
stanie
padaczkowym.
W
prawidłowym
mózgu
98,0-99,7% neuronów zawiera białko MBD3 w strukturach płata skroniowego. Procent
neuronów,
w
komórkach
których
wykryto
obecność
białka
MBD3
wzrastała
w konsekwencji stanu padaczkowego w korze gruszkowatej i jądrze bocznym ciała
migdałowatego. W pozostałych strukturach płata skroniowego nie zaobserwowano wpływu
stanu padaczkowego na procent neuronów zawierających białko MBD3. Wykazano wzrost
poziomu immunofluorescencji MBD3 w neuronach zwierząt epileptycznych w porównaniu
do kontroli.
W niniejszej pracy po raz pierwszy dowiedziono, że MBD3 tworzy w mózgu szczura kompleks
z białkami MTA, HDAC czy RBBP, wchodzącymi z skład kompleku NuRD.
Wykorzystując
technikę
immunoprecypitacji
chromatyny
połączonej
z sekwencjonowaniem, wykryto zmiany w poziomach wiązania białka MBD3 do DNA
różnicujące zwierzęta kontrolne od stymulowanych. Scharakteryzowano, wywołane stanem
padaczkowym, zmiany w częstości wiązania MBD3 do róznych obszarów funkcjonalnych w
genomie.
Wyniki te wskazują na znaczącą rolę kompleksu NuRD zawierającego białko MBD3
w patologii mózgu.
SUMMARY
MBD3 protein (methyl-CpG-binding domain protein 3) belongs to evolutionarily conserved
family of proteins which are characterized by the presence of a methyl-CpG-binding domain
(MBD) (Nan et al., 1993; Hendrich and Bird, 1998). MBD domain is responsible for selective
recognition of methylated CpG dinucleotides (Bestor, 1990; Bird and Wolffe, 1999). The DNA
methylation pattern is believed to be read by MBD proteins (Nakao, 2001).
MBD3 is expressed in the brain during development (Jung et al., 2003). There is little data on
expression of MBD3 in brain pathology.
The aim of this study was to examine the localization of MBD3 mRNA and protein in the
brain and MBD3 expression level in the temporal lobe structures in control and epileptic
animals. Furthermore, we asked if there are differences in binding of MBD3 protein to DNA
regions between control and epileptic brains. All experiments were performed using rat
model of temporal lobe epilepsy evoked by electrical stimulation of the amygdala.
Using in situ hybridization technique we demonstrated that MBD3 mRNA is widely expressed
in the brain. MBD3 transcript was present in neurons, oligodendrocytes and astrocytes both
in control and epileptic animals. No differences in MBD3 expression level following status
epilepticus were observed.
We detected the MBD3 protein expression in different brain structures using
immunohistochemical stainings. We demonstrated nuclear localization of MBD3 in neurons,
mature oligodendrocytes, resting and activated astrocytes, but was not in microglia in
control brains and 14 days after stimulation. In normal brain 98,0-99,7% neurons contain
MBD3 protein in the temporal lobe structures. Following status epilepticus the percentage of
MBD3 positive neurons increased in the piriform cortex and in the lateral nucleus of the
amygdala. We also observed a significant increase in MBD3 immunofluorescence level in
neurons in epileptic rats compared to control animals.
In present study, for the first time, we showed that in the adult brain MBD3 assembles the
NuRD complex containing also MTA, HDAC and RBBP.
Using chromatin immunoprecipitation combined with deep sequencing, we demonstrated
differences in occupancy of DNA regions by MBD3 protein between control and stimulated
animals.
Obtained results indicate that complex NuRD, containing MBD3 protein, plays an important
role in brain pathology.
Download
Random flashcards
ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Create flashcards