Mgr Joanna Bednarczyk • Dziedzina: nauki
advertisement
Mgr Joanna Bednarczyk • • • • • • Dziedzina: nauki biologiczne Dyscyplina: biologia Wszczęcie: 11.04.2014 r. Temat: Białko MBD3 w modelu padaczki skroniowej u szczura Promotor: dr hab. Katarzyna Łukasiuk, prof. nadzw. Recenzenci: dr hab. Lidia Strużyńska, prof. nadzw., prof. dr hab. Małgorzata Maria Filip STRESZCZENIE Białko MBD3 (z ang. methyl-CpG-binding domain protein 3) należy do konserwowanej ewolucyjnie rodziny białek, które charakteryzują się obecnością w swojej sekwencji peptydowej domeny MBD (z ang. methyl-CpG-binding domain) (Nan i wsp., 1993; Hendrich i Bird, 1998). Domena ta umożliwia wiązanie białek do metylowanych dinukleotydów CpG w nici DNA (Bestor, 1990; Bird i Wolffe, 1999). Podstawową funkcją białek MBD jest odczytywanie wzoru metylacji DNA (Nakao, 2001). MBD3 ulega ekspresji w mózgu w czasie rozwoju oraz u osobnika dorosłego (Jung i wsp., 2003). Natomiast istnieje niewiele danych na temat ekspresji MBD3 w patologii mózgu. Celem doświadczeń przeprowadzonych w niniejszej rozprawie było zbadanie lokalizacji mRNA i białka MBD3 w mózgu oraz poziomu ekspresji MBD3 w strukturach płata skroniowego szczurów kontrolnych i epileptycznych. Ponadto postanowiono zbadać, czy istnieją różnice w okupowaniu rejonów DNA przez białko MBD3 między zwierzętami kontrolnymi i stymulowanymi. W doświadczeniach wykorzystano model padaczki skroniowej wywołanej elektryczną stymulacją ciała migdałowatego u szczura. Z zastosowaniem techniki hybrydyzacji in situ wykazano powszechną ekspresję mRNA MBD3 w mózgu. Stwierdzono występowanie transkryptu MBD3 w neuronach, oligodendrocytach i astrocytach zarówno w mózgach zwierząt kontrolnych, jak i stymulowanych. Nie zaobserwowano zmian poziomu ekspresji mRNA MBD3 w płacie skroniowym na skutek stanu padaczkowego. Wykryto obecność białka MBD3 w różnych strukturach mózgu. Dzięki zastosowaniu barwień immunohistochemicznych wykazano, że białko MBD3 występuje w jądrach komórkowych neuronów, dojrzałych oligodendrocytów, astrocytów zarówno spoczynkowych, jak i aktywowanych, ale nie jest obecne w mikrogleju w mózgach zwierząt kontrolnych i 14 dni po stanie padaczkowym. W prawidłowym mózgu 98,0-99,7% neuronów zawiera białko MBD3 w strukturach płata skroniowego. Procent neuronów, w komórkach których wykryto obecność białka MBD3 wzrastała w konsekwencji stanu padaczkowego w korze gruszkowatej i jądrze bocznym ciała migdałowatego. W pozostałych strukturach płata skroniowego nie zaobserwowano wpływu stanu padaczkowego na procent neuronów zawierających białko MBD3. Wykazano wzrost poziomu immunofluorescencji MBD3 w neuronach zwierząt epileptycznych w porównaniu do kontroli. W niniejszej pracy po raz pierwszy dowiedziono, że MBD3 tworzy w mózgu szczura kompleks z białkami MTA, HDAC czy RBBP, wchodzącymi z skład kompleku NuRD. Wykorzystując technikę immunoprecypitacji chromatyny połączonej z sekwencjonowaniem, wykryto zmiany w poziomach wiązania białka MBD3 do DNA różnicujące zwierzęta kontrolne od stymulowanych. Scharakteryzowano, wywołane stanem padaczkowym, zmiany w częstości wiązania MBD3 do róznych obszarów funkcjonalnych w genomie. Wyniki te wskazują na znaczącą rolę kompleksu NuRD zawierającego białko MBD3 w patologii mózgu. SUMMARY MBD3 protein (methyl-CpG-binding domain protein 3) belongs to evolutionarily conserved family of proteins which are characterized by the presence of a methyl-CpG-binding domain (MBD) (Nan et al., 1993; Hendrich and Bird, 1998). MBD domain is responsible for selective recognition of methylated CpG dinucleotides (Bestor, 1990; Bird and Wolffe, 1999). The DNA methylation pattern is believed to be read by MBD proteins (Nakao, 2001). MBD3 is expressed in the brain during development (Jung et al., 2003). There is little data on expression of MBD3 in brain pathology. The aim of this study was to examine the localization of MBD3 mRNA and protein in the brain and MBD3 expression level in the temporal lobe structures in control and epileptic animals. Furthermore, we asked if there are differences in binding of MBD3 protein to DNA regions between control and epileptic brains. All experiments were performed using rat model of temporal lobe epilepsy evoked by electrical stimulation of the amygdala. Using in situ hybridization technique we demonstrated that MBD3 mRNA is widely expressed in the brain. MBD3 transcript was present in neurons, oligodendrocytes and astrocytes both in control and epileptic animals. No differences in MBD3 expression level following status epilepticus were observed. We detected the MBD3 protein expression in different brain structures using immunohistochemical stainings. We demonstrated nuclear localization of MBD3 in neurons, mature oligodendrocytes, resting and activated astrocytes, but was not in microglia in control brains and 14 days after stimulation. In normal brain 98,0-99,7% neurons contain MBD3 protein in the temporal lobe structures. Following status epilepticus the percentage of MBD3 positive neurons increased in the piriform cortex and in the lateral nucleus of the amygdala. We also observed a significant increase in MBD3 immunofluorescence level in neurons in epileptic rats compared to control animals. In present study, for the first time, we showed that in the adult brain MBD3 assembles the NuRD complex containing also MTA, HDAC and RBBP. Using chromatin immunoprecipitation combined with deep sequencing, we demonstrated differences in occupancy of DNA regions by MBD3 protein between control and stimulated animals. Obtained results indicate that complex NuRD, containing MBD3 protein, plays an important role in brain pathology.
