sprawozdanie
advertisement
Imię i nazwisko:………………………………………….. Grupa i Sekcja:…………… Wersja:…… Data: ………….. r. ĆWICZENIE VI TEMAT: qPCR i RT-qPCR w czasie rzeczywistym. Analiza wyników reakcji ilościowej. Ocena specyficzności reakcji. Cel ćwiczenia: Zapoznanie studenta z zasadami interpretacji specyficzności reakcji RT-Qpcr na podstawie elektroforezy poliakrylamidowej oraz krzywej topnienia produktu. Określanie aktywności transkrypcyjnej genu w oparciu o metodę bezwzględną i relatywną. Zadanie 1. Produkty reakcji RT-qPCR rozdzielono elektroforetycznie w celu potwierdzenia specyficzności reakcji. Mając do dyspozycji marker długości produktów - plazmid pBR322/BsuRI (ryc. 1) wyznacz długości (liczba pz) poszczególnych produktów reakcji widocznych na elektroforegramie (ryc. 2) i wpisz do tabeli 1. Tabela. 1. Długości produktów reakcji RT-PCR widocznych na elektroforegramie (ryc. 1B) Długość produktu (pz) Dodatkowe uwagi 1 Liczba widocznych produktów ……………… ………………… …………………………………………. 2 ……………… ………………... …………………………………………. 3 ……….......... ………………… …………………………………………. 4 ……….......... ……….............. …………………………………………. 5 ……….......... ….............……. …………………………………………. 6 ……….......... ….............……. …………………………………………. 7 ……….......... ….............……. …………………………………………. 8 ……….......... ….............……. …………………………………………. 9 ……….......... ….............……. …………………………………………. 10 ……….......... ….............……. …………………………………………. Nr toru rozdziału Zadanie 2. Znając długość produktu, który powstanie podczas amplifikacji z zastosowaniem zaprojektowanej pary starterów komplementarnych do sekwencji mRNA genu ........ (ćwiczenie IV) narysuj oczekiwany wynik rozdziału elektroforetycznego potwierdzający specyficzność reakcji według poniższego wzoru. Oczekiwana długość produktu (pz)…………………pz Zadanie 3. Temperatura meltingu (Tm) uzyskanego produktu reakcji RTqPCR dla mRNA genu ........ wynosi …….C. Która z przedstawionych na rycinie krzywych meltingu (A, B, C) potwierdza specyficzność reakcji dla badanego genu? Zinterpretuj pozostałe wykresy krzywych meltingu. Na co wskazują przedstawione wyniki krzywej topnienia A ……………………………………………………………………………………… B ……………………………………………………………………………………… C ……………………………………………………………………………………… Zadanie 4. Na podstawie Ct wzorcowego DNA β-aktyny skonstruuj krzywą wzorcową i wylicz ilość kopii genu ........, a także genu kontroli endogennej. NTC – (ang. no template control ) kontrola ujemna Tabela 2. Liczby kopii oraz wartości ct serii rozcieńczeń roztworu wzorcowego. wzorce Liczba kopii Ct 8000 19,9 4000 20,85 2000 21,94 800 23,04 400 25,81 Równanie krzywej wzorcowej y =…………………………………………………….. a) Znormalizuj uzyskane wyniki liczby kopii względem ilości RNA dodanej na reakcję (0,1 µg/µl). Dane wpisz w tabelę nr 3. Tabela.3 mRNA genu Liczba kopii mRNA Liczba kopii mRNA/µg całkowitego RNA Lp próbka 1 1B …… …….. ……………… 2 2B ……. …….. ……………… 3 3B …… …….. ……………… 4 4B …….. …….. ……………… 5 5B …….. …….. ……………… ........ ct Zad. 5. Na podstawie otrzymanych wyników Ct wylicz ekspresję w oparciu o metodę względną genu ......... Jedną z najpopularniejszych metod względnych jest R = 2-Ct gdzie Ct = Ct (próba nieznana) – Ct (kalibrator), gdzie Ct (próba nieznana) = Ct genu badanego – Ct genu referencyjnego, Ct (kalibrator) = Ct genu badanego – Ct genu referencyjnego. Tabela 4. Wartość ct otrzymana metodą RT-qPCR w celu wyznaczenia aktywności transkrypcyjnej mRNA genów kontroli endogennej (AKT) i ......... Kalibrator Grupa kontrolna gen referencyjny AKT ………… K1 ………… K2 ………… K3 ………… K4 ………… K5 gen badany ........ ………… ………… ………… ………… ………… Grupa badana gen referencyjny AKT ………… B1 ………… B2 ………… B3 ………… B4 ………… B5 gen badany ........ ………… ………… ………… ………… ………… średnia próba nieznana średnia Wynik ekspresji względnej =1 – ekspresja równa kontroli >1 – nadekspresja <1 – obniżona ekspresja Grupa badana Grupa kontrolna Średnie ct genu badanego Średnie ct genu ref Średnie ct genu badanego Średnie ct genu ref ……… ……… ……… ……… Obliczenia Ct Ct (próba (kalibrator) nieznana) ……… ……… Ct 2-Ct ……… ……… Wynik ……… Wniosek: Gen ........ ulega …………………………………………………………………….. PODSUMOWANIE Jakie wnioski możesz wyciągnąć z ćwiczenia? …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………….. Pytania sprawdzające: 1. Podaj metody określenia specyficzności reakcji qPCR i RT-qPCR …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… 2. Wskaż różnice między metodą absolutną a relatywną oceny ekspresji genów. …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… 3. Co to jest kontrola endogenna – cel jej użycia, rodzaje, kryteria doboru …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………..