Biochemia stresu oksydacyjnego

Biochemia
stresu oksydacyjnego
Wykład 2
Powstawanie reaktywnych form tlenu w komórkach
Źródła ROS w komórce
- Enzymy generujące H2O2:
np.
* oksydaza aldehydowa
* oksydaza D-aminokwasowa
* okydaza -hydroksykwasowa
* oksydaza ksantynowa
* oksydaza acetylokoenzymu A
* oksydaza glutarylokoenzymu A
* oksydaza galaktozowa
* oksydaza glikolanowa
.
- Enzymy generujące O
2
np.
* oksydaza ksantynowa
* oksydaza aldehydowa
* oksydaza diaminowa
* reduktaza cytochromu P450
* reduktaza glutationowa
* oksydaza galaktozowa
* mieloperoksydaza
* oksydoreduktaza NADPH
* hydroperoksydaza prostaglandynowa
* tyrozynaza
* syntaza tlenku azotu
* reduktaza cytochromu b5
* lipooksygenaza
* dioksygenaza tryptofanowa
Źródła ROS w komórce
- Cykle redoks i utleniania ksenobiotyków
- Utlenianie białek oddechowych (hemoglobiny, mioglobiny)
- Samoutlenianie związków niskocząsteczkowych (np. związków tiolowych)
- Łańcuch oddechowy w mitochondriach
Mitochondrium
- Zewnętrzna błona mitochondrialna:
* stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~1:1
* duża zawartość poryn
- Cząsteczki o masie do ~6 kDa mogą swobodnie dyfundować do przestrzeni
międzybłonowej. Większe muszą mieć sekwencję sygnałową na N-końcu, pozwalającą
na wiązanie do translokaz.
- Przestrzeń międzykomórkowa:
* stężenie małych cząsteczek podobne jak w cytozolu
* skład białek jest odmienny niż w cytozolu
- Wewnętrzna błona mitochondrialna:
* stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~3:1
* duża zawartość kardiolipiny (zmniejszenie przepuszczalności błony)
* brak poryn
* transport wszystkich substancji wymaga transporterów
* obecność białek odpowiedzialnych za fosforylację oksydacyjną, syntezę i
hydrolizę ATP, transport białek regulatorowych.
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.
Mitochondrium
Reakcje w matriks mitochondrialnej
- Pirogronian produkowany podczas glikolizy jest transportowany do matriks,
dekarboksylowany oksydacyjnie i przyłączany do Co-A (powstaje CO2, acetylo-CoA i NADH).
- Grupa acetylowa przyłączana jest do szczawiooctanu (C4), tworząc cytrynian (C6). Izomer
cytrynianu jest następnie dekarbokylowany oksydacyjnie do -ketoglutaranu (C5) i
bursztynianu (C4), z którego regenerowany jest szczawiooctan. Przy tym 3 jony wodorowe (6
e-) są przenoszone na NAD+, a para atomów wodoru (2 e-) na FAD.
6C
- Elektrony z NADH mogą być
GDP+Pi
transportowane z cytoplazmy
GTP
przez czółenko jabłczanowoasparaginowe lub czółenko
glicerolo-3-fosforanowe
- W cyklu Krebsa powstają 2
cząsteczki CO2, czemu towarzyszy produkcja 3 cząsteczek
NADH i 1 cząsteczki FADH2.
Powstaje też 1 wysokoenergetyczne wiązanie fosforanowe,
a 9 kolejnych ATP może
powstawać podczas utleniania
NADH i FADH2 za pośrednictwem łańcucha oddechowego.
L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.
Łańcuch oddechowy
- Przyjmuje elektrony z NADH, i przenosi je przez liczne kofaktory do pierwszego ruchliwego
nośnika elektronów, utlenionego koenzymu Q. Uzyskana w ten sposób energia jest
wykorzystywana do przeniesienia czterech protonów z macierzy mitochondrialnej do
przestrzeni międzybłonowej.
- Koenzym Q otrzymuje elektrony także z kompleksu II (dehydrogenazy bursztynianowej) oraz
dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerolu.
- Zredukowany koenzym Q przekazuje elektrony na kompleks III, skąd trafiają na cytochrom c,
ulokowany w przestrzeni międzybłonowej. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana
jest do przeniesienia czterech protonów do przestrzeni międzybłonowej.
- Z cytochromu c elektrony przenoszone są na kompleks IV (oksydazy cytochromu c), gdzie
cząsteczkowy tlen redukowany jest do wody. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana
jest do przeniesienia dwóch elektronów do przestrzeni międzybłonowej.
Łańcuch oddechowy
- Przepływ elektronów z NADH lub FADH2 do O2 poprzez łańcuch oddechowy
powoduje
wypompowywanie
protonów
z
macierzy.
Wytworzona
siła
protonomotoryczna obejmuje dwie składowe: gradient pH (gradient protonowy) i
transbłonowy potencjał elektryczny.
- W łańcuchu oddechowym powstaje anionorodnik ponadtlenkowy w wyniku
jednoelektronowej redukcji tlenu. Generowany jest w kompleksie I i III.
L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.
Łańcuch oddechowy
Łańcuch oddechowy z zaznaczonymi
potencjału redukcyjnego.
wartościami
standardowego
- standardowy potencjał redukcyjny O2/O2'- wynosi -0.16 V, więc przeniesienie
elektronu może być mediowane przez wiele związków).
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.
Związki ułatwiające identyfikację miejsc tworzenia
reaktywnych form tlenu
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Produkcja O2'- w kompleksie I łańcucha oddechowego
Kompleks I (oksydoreduktaza NADH:ubichinon)
- Jest transbłonowym kompleksem enzymatycznym, który:
* utlenia NADH, przekazując elektrony na ubichinon
* jest połączony z pompą protonową, a jego aktywność przyczynia się do powstania
gradientu protonów
* stanowi jedno z dwóch głównych miejsc pobierania równoważników redukcyjnych
(drugie miejsce to kompleks II)
* jest głównym źródłem ROS w komórce w warunkach fizjologicznych
Flawina
Centra Fe-S
semichinon/
rodnik semichinonowy
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Koenzym Q (ubichinon)
- Ubichinon jest kluczowym transporterem elektronów w łańcuchu oddechowym i
ważnym antyoksydantem
- Niedobór lub dysfunkcja ubichinonu
klinicznych:
* encefalomiopatii
* niemowlęcej choroby wieloukładowej
* ataksji móżdżkowej
* izolowanej miopatii mitochondrialnej
* zespół nerczycowy
prowadzi
do
różnorodnych
efektów
Quinzee & Hirano. Dev Disabil Res Rev 2010.
Dehydrogenaza bursztynianowa
- Dehydrogenaza bursztynianowa (SDH) jest zarówno częścią łańcucha oddechowego
jak i cyklu Krebsa, w którym utlenia bursztynian do fumaranu
- SDH zbudowana jest z czterech jednostek, wszystkie kodowane są przez geny
jądrowe
- Jest jedynym kompleksem łańcucha oddechowego, który nie pompuje protonów
przez wewnętrzną błonę mitochondrialną
- Zaburzenia funkcji SDH są bardzo
rzadkie (2-4% zaburzeń łańcucha
oddechowego) i prowadzą do:
* zespołu Leigha (choroba neurodegeneracyjna rozwijająca się u
niemowląt)
* rodzinnej paragangliomy (przyzwojaka, nowotworu układu współczulnego lub przywspółczulnego)
Rutter et al. Mitochondrion 2010.
Odwrotny transport elektronów
Odwrotny transport elektronów
- Kiedy mitochondria utleniają pirogronian, elektrony są
przekazywane z NADH do chinonu (Q) poprzez FMN i centra
Fe-S. Powstający QH' jest redukowany do chinolu (QH2).
utlenianie
pirogronianu
- Kiedy mitochondria utleniają jedynie bursztynian (przy
braku innych substratów) elektron przenoszony jest wbrew
potencjałowi redoks ze zredukowanego chinonu (chinol,
QH2) na NAD+, zamiast w stronę O2.
O2
NAD
utlenianie
samego
bursztynianu
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Produkcja O2'- w kompleksie III łańcucha oddechowego
Kompleks III (oksydoreduktaza
koenzym Q:cytochrom c)
- Budowa kompleksu III:
* zewnętrzne miejsce chinonowe (Qo)
* wewnętrzne miejsce chinonowe (Qi)
* cytochrom b566 (cyt b566)
* cytochrom b562 (cyt 562)
* białko Rieske (z kompleksami Fe-S)
* cytochrom c1
* cytochrom c
- Działanie kompleksu III:
* Ubichinon jest redukowany do QH2 po
stronie wewnętrznej (Qi) i migruje do strony
zewnętrznej (Qo) uwalniając 2H+ i przenosząc 1
e- na cyt c1 za pośrednictwem białka Rieske.
Powstaje przy tym QH' i Q.
* Drugi e- redukuje cytochrom b, dzięki czemu
elektrony są przenoszone na wewnętrzną stronę
błony, gdzie redukują chinon do QH2.
* cyt c i cyt c1 przyjmują tylko pojedynczy e-,
dlatego pełna redukcja Q wymaga utlenienia
dwóch cząsteczek QH2 w dwóch kolejnych
cyklach.
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Produkcja O2'- w kompleksie III łańcucha oddechowego
- Inhibitory kompleksu III:
* Myxothiazol: blokuje miejsce Qo
uniemożliwiając przeniesienie elektronu
z QH2 do centrów Fe-S i cytochromu b.
* Stigmatellin: blokuje przeniesienie
pierwszego elektronu na centrum Fe-S.
* Antimycin A: wiąże się do miejsca Qi
i
blokuje
przeniesienie
drugiego
elektronu do miejsca Qi. Dzięki temu
hamuje powstawanie QH2 i nasila
tworzenie O2'-.
- Wydaje się, że O2'- tworzony na
kompleksie III jest uwalniany do
przestrzeni międzybłonowej (czyli jest
dysmutowany głównie przez CuZnSOD).
To wciąż jednak nie jest jasne.
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Uwalnianie cytochromu c
- Cyt-c jest zakotwiczony w wewnętrznej błonie mitochondrialnej za pośrednictwem
kardiolipiny.
- W obecności ROS kompleks cyt-c/kardiolipina działa jak peroksydaza kardiolipiny,
tworząc wodoronadtlenki kardiolipiny, o zmniejszonym powinowactwie do cyt-c.
Uwalnianie cyt-c jest jednym ważnych etapów wczesnej apoptozy.
- Uwalnianie cyt-c jest procesem dwuetapowym:
* utrata kontaktu z wewnętrzną błoną mitochondrialną (hamowane przez NO)
* uwalnianie do cytozolu przez uszkodzoną zewnętrzną błonę mitochondrialną
(nasilane przez Bid, Bax, lub Bak – dezintegrujące błonę).
Łańcuch oddechowy
Detekcja reaktywnych form tlenu
Widmo EPR uzyskane z mitoplastów po zastosowaniu DMPO (pułapki spinowej) wykrywanie anionorodnika ponadtlenkowego
Wykorzystanie fluorescencji DCF
(dichlorofluoresceiny) do wykrywania
H2O2 w mikronaczyniach siatkówki
DMPO
DMPO
+ antymycyna A
DMPO +
+ antymycyna A
+ SOD
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009; Ishizaki et al. J Physiol 2009
Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego
- Wykorzystanie Amplex Red do wykrywania H2O2 w
mitochondriach izolowanych z kardiomiocytów świnki
morskiej. Aktywność łańcucha oddechowego stymulowana
bursztynianem.
- Wykorzystanie Amplex Red do
wykrywania H2O2 w komórkach
hodowanych in vitro.
kontrola
stymulacja
- CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone): czynnik rozprzęgający
- rotenon: inhibitor kompleksu I
- AA (antymycyna A): inhibitor kompleksu III
- bursztynian: substrat oddechowy
- pirogronian: substrat oddechowy
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Rozwój blaszki miażdżycowej
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.
Rozwój blaszki miażdżycowej
LDL Readily Enter the Artery Wall Where They May be Modified
LDL
Vessel Lumen
Endothelium
Oxidation of Lipids
and ApoB
Aggregation
LDL
Hydrolysis of Phosphatidylcholine
to Lysophosphatidylcholine
Other Chemical Modifications
Modified LDL
Modified LDL are Proinflammatory
Intima
Ross R. N Engl J Med 1999
Rozwój blaszki miażdżycowej
Monocyte
Vessel Lumen
LDL
MCP-1 LDL
Endothelium
Modified LDL
Intima
Ross R. N Engl J Med 1999
Rozwój blaszki miażdżycowej
Vessel Lumen
Monocyte
LDL
MCP-1
Endothelium
LDL
Intima
Modified LDL
Macrophage
Modified LDL Promote
Differentiation of
Monocytes into
Macrophages
Ross R. N Engl J Med 1999
Rozwój blaszki miażdżycowej
Vessel Lumen
Monocyte
LDL
Adhesion
Molecules
MCP-1
Endothelium
LDL
Modified
LDL Taken
up by
Macrophage
Foam Cell
Macrophage
Intima
Ross R. N Engl J Med 1999
Rozwój blaszki miażdżycowej
Vessel Lumen
Monocyte
LDL
Adhesion
Molecules
MCP-1
Cytokines
Endothelium
LDL
Modified LDL
Macrophage
Intima
Ross R. N Engl J Med 1999
Ischemia i reperfuzja - ultrastruktura mitochondriów
Ischemia-reperfuzja w
mięśniu przywodzącym
łydki królika
rozjaśnienie macierzy,
utrata granul
kontrola - zdrowy
mięsień
puchnięcie mitochondriów, fragmentacja
grzebieni
Korn et al. J Thor Cardiovasc Sur 2002
Wpływ hipoksji na produkcję ROS w izolowanym sercu
- Produkcja ROS zwiększa się w niedotlenieniu.
* komórki w zasadzie nigdy nie są anoksyjne - tlen jest zawsze dostępny
* mitochondria oddychają normalnie w bardzo niskim pO2. Gdy pO2
spadnie poniżej wartości progowej, oddychanie zaczyna się obniżać, a produkcja
ROS spada.
-
MnTbap: SOD mimetic
CG: katalaza + glutation
MCG: MnTbap + CG
L-NAME: inhibitor NOS
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego
- Pomiar produkcji O2'- za pomocą DHE
(dihydroethidium), przekształcanej do 2-OHE+ (2-hydroksyethidium) w izolowanym sercu
świnki morskiej.
- Pomiar produkcji ONOO- za pomocą diTyr
(dityrosine), przekształcanej z tyrozyny w
izolowanym sercu świnki morskiej.
BDM (butanedione monoxime):
inhibitor skurczów kardiomiocytów
MnTBAP: mimetyk SOD
L-NAME (N-nitro-L-arginine
methyl ester): inhibitor NOS
manadione: inhibitor transportu
elektronów
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Regulacja produkcji O2'- w mitochondriach
- Cykliczne lub ciągłe chłodzenie
izolowanego narządu (tu: serce świnki
morskiej) prowadzi do wzrostu poziomu
ROS. Jest to spowodowane:
* zwiększoną produkcją ROS
* zmniejszoną aktywnością enzymów
antyoksydacyjnych, przede wszystkim
MnSOD.
Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009
Ischemia i reperfuzja
- Uszkodzenie tkanek po ischemii i reperfuzji jest
powodowane przez wzrost produkcji ROS
(szczególnie istotne przy transplantacji narządów):
* Podawanie zmiataczy O2'- i H2O2 (ale nie
jedynie O2'-) zmniejsza uszkodzenia
* Nadekspresja enzymów antyoksydacyjnych
(CuZnSOD, MnSOD, HO-1) zmniejsza uszkodzenia
* Po reperfuzji dochodzi do zwiększonej
produkcji O2'- i ONOO-.
kontrola
- Większość ROS w ischemii i reperfuzji jest
produkowana w łańcuchu oddechowym, zwłaszcza
przez kompleks III.
- Bardzo istotna
ksantynowej.
jest
rola
oksydoreduktazy
- Schłodzenie narządu przed przeszczepem nasila
produkcję ROS.
I/R
nabłonek jelitowy
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/stomach/salmonella.jpg
Białka rozsprzęgające (UCP)
- Białko UCP (UCP1) zostało po raz pierwszy opisane
w brunatnych adipocytach, odpowiedzialnych za
termogenezę bezdrżeniową.
- UCP pozwala na powrót elektronów do matriks
mitochondrialnej bez produkcji ATP (może więc
zachodzić przy niedoborze ADP, zmniejszając ryzyko
nadmiernej akumulacji H+ w przestrzeni międzybłonowej). Towarzyszy temu produkcja ciepła.
- UCP2 odgrywa rolę w regulacji wydzielania insuliny.
- UCP3 ulega ekspresji głównie w mięśniach i ma
działanie antyoksydacyjne.
- UCP4 i UCP5 produkowane są głównie w układzie
nerwowym i mają działanie antyoksydacyjne.
G. Valacchi and P.A. Davis (eds). Oxidants in Biology. 2008
UCP w łańcuchu oddechowym
Wolkow & Isner. Aging Res Rev. 2006.
Mechanizmy termogenezy
Termogeneza zwiększa się w
odpowiedzi na stymulację 
adrenergiczną, prowadzącą do
wzrostu cAMP i aktywację PKA.
Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.
Termogeneza bezdrżeniowa
- Termogeneza bezdrżeniowa:
* produkcja ciepła w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT)
* głównie u zwierząt hibernujących i u noworodków (wyjątek: świniowate)
* u szczurów: 3 g BAT zużywa 2 x więcej tlenu niż podstawowy metabolizm (BMR)
reszty ciała (czyli 350-400 g)
* u ludzi jest ok. 50 g BAT, które mogą zużywać ok. 20% tlenu niż BMR
Buffy et al. Br J Canc 2011.
BAT
- BAT u gryzoni:
* odpowiada za termogenezę
bezdrżeniową
* zwiększa wydatki energetyczne
* zmniejsza otyłość
* zmniejsza tworzenie białych
adipocytów
- BAT u ludzi:
* jest obecny przez całe życie,
ale w niewielkich ilościach
(wykrywalny w PET/CT), głównie między łopatkami (u noworodków) lub nad obojczykami (u
dorosłych
Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.
Białka rozprzęgające (UCP)
- Homologi UCP u roślin odgrywają rolę w dojrzewaniu owoców i w termogenezie
roślin
Philodendron selloum
Chan et al. Diabetes 2004.
UCP-1
- Kluczowym białkiem w termogenezie bezdrżeniowej jest UCP-1. Funkcja innych
białek UCP jest mniej istotna.
- Transport protonów przez UCP-1 zależy od pary histydyn, których nie ma w innych
UCP.
- Jest eksprymowany w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT)
- Ekspresja UCP-1 jest indukowana przez kwasy tłuszczowej (prawdopodobnie
poprzez aktywację czynnika PPAR)
Buffy et al. Br J Canc 2011.
UCP-2
Chan et al. Diabetes 2004.
UCP-2
- Jest eksprymowane w różnych tkankach, w tym w komórkach -trzustki
- Ekspresja UCP-2 koreluje odwrotnie z poziomem ATP, głównego regulatora
produkcji insuliny w komórkach .
- Ekspresja UCP-2 jest indukowana przez kwasy tłuszczowe (poprzez PPAR), co może
chronić komórki przed lipotoksycznością.
- Ekspresja UCP-2 jest indukowana przez ROS (np. w makrofagach).
Chan et al. Diabetes 2004.
Funkcje UCP2
Zdrowe komórki
Buffy et al. Br J Canc 2011.
Funkcje UCP2
Komórki dysplastyczne i nowotworowe
Buffy et al. Br J Canc 2011.
Produkcja insuliny w komórkach 
Fajans SS. Nat Med. 2004
UCP w łańcuchu oddechowym
- Niedobór UCP może zwiększać produkcję ATP w mitochondriach.
- W komórkach  trzustki:
* pobieranie glukozy przyczynia się do wzrostu aktywności łańcucha oddechowego
i zwiększenia produkcji ATP z ADP. To stymuluje fuzję pęcherzyków zawierających
insulinę i prowadzi do wydzielania insuliny.
* Wysoki stosunek ATP/ADP aktywuje UCP2, co zmniejsza gradient protonów i
obniża produkcję ATP, obniżając tym samym wydzielanie insuliny.
- Czynnikiem aktywującym UCP2 jest prawdopodobnie anionorodnik ponadtlenkowy.
Stres oksydacyjny w cukrzycy
- Zmiany w metaboliźmie
komórek  prowadzą do zmian w
wydzielaniu insuliny:
* Wzrost poziomu glukozy
zwiększa poziom metabolizmu
komórek  i podnosi poziom
komórkowego ATP.
* To prowadzi do zamknięcia
kanałów KATP, depolaryzacji
błony, aktywacji zależnych od
potencjału
kanałów
Ca2+,
napływu Ca2+ do cytoplazmy.
* Wzrost poziomu Ca2+ jest
bezpośrednim sygnałem uwalniania insuliny.
Freeman & COX: Hum Mol Genet 2006.
Regulacja produkcji insuliny przez ROS
Newsholme et al. J Physiol 2007
UCP3
- Ulega ekspresji głównie w mięśniach szkieletowych
- UCP-3 może nasilać utlenianie kwasów tłuszczowych.
* współdziała tioesterazą mitochondrialną (MTE), nasilając transport kwasów
tłuszczowych (produkowanych przez MTE) z macierzy mitochondrialnej, dzięki
czemu uwalnia CoA.
* uwolnienie CoA pozwala na utrzymanie wysokiego tempa utleniania kwasów
tłuszczowych
Argyropoulos & Harper. J Appl Physiol 2002.
Białka rozprzęgające (UCP)
- Homologi UCP znane są również u Drosophila melanogaster i Caenorhabditis
elegans
- Ewolucyjnie najstarszą formą UCP jest prawdopodobnie UCP-4 (u ssaków – obecny
w mózgu)
- Funkcje białek UCP:
* regulacja termogenezy (UCP-1)
* regulacja metabolizmu kwasów tłuszczowych (UCP-2 i UCP-3)
* zmniejszenie produkcji ROS (UCP-1, UCP-2, UCP-3, UCP-4, UCP-5)
* zahamowanie wydzielania insuliny (UCP-2)
* regulacja apoptozy (UCP-4)
- Myszy UCP KO mają normalny fenotyp, ale:
* UCP-1 KO – wrażliwe na zimno, podatne na tycie
* UCP-2 KO – zwiększona produkcja ROS
* UCP-3 KO – zwiększona produkcja ROS, zmniejszone utlenianie kwasów
tłuszczowych
Chan et al. Diabetes 2004.
Dziękuję
Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej