Sposób zabezpieczenia pierwotnych hodowli komórek, zwłaszcza

POLSKU
OPIS PATENTOWY
RZECZPOSPOLITA
94725
LODOWA
Int.Cl2. C12K9/00
Patent dodatkowy
do patentu wmmmm
Zgłoszono:
25.01.75
MKPC12k9/00
(P. 177561)
Pierwszeństwo:
URZĄD
PATENTOWr
POI
Zgłoszenie ogłoszono:
05.06.76
Opis patentowy opublikowano: 31.12.1978
Twórca wynalazku: Czesława Górska
Uprawniony z patentu: Puławskie Zakłady Przemysłu Bioweterynaryjnego,
Puławy (Polska)
Sposób zabezpieczenia pierwotnych hodowli komórek, zwłaszcza fibroblastów zarodka kurzego,
przed zakażeniami drobnoustrojami Mykoplazma
Przedmiotem wynalazku jest sposób zabezpieczenia pierwotnych hodowli komórek, stanowiących podłoże
do 'produkcji szczepionek i innych preparatów immunobiologicznych przed zakażeniami drobnoustrojami My¬
koplazma. Najczęściej jako podłoże do namnaźania wirusów stosuje się pierwotne lub ciągłe hodowle komórek
in vitro, a zwłaszcza pierwotne hodowle fibroblastów zarodka kurzego. Pierwotne hodowle komórek, używane
do namnaźania wirusów, winny być wolne od zakażeń ubocznych innymi drobnoustrojami.
Znany sposób zakładania pierwotnych hodowli komórek, zwłaszcza komórek fibroblastów zarodka kurze¬
go, polega na aseptycznym pobraniu tkanki, narządu lub embrionu, jej rozdrobnieniu, płukaniu płynem Hanksa,
trawieniu trypsyną do wydzielenia pojedynczych komórek, ich zawieszeniu w płynie wzrostowym i wyhodowa¬
niu komórek, na których namnaża się wirus po uprzednim usunięciu płynu wzrostowego i zastąpieniu go płynem
utrzymującym.
Znany sposób przeprowadza się następująco. Po odkażeniu skorupek i wyjęciu zarodków z jaj, inkubowanych przez około 10 dni w temperaturze około 37°C, odcina się od zarodka główkę, skrzydełka i nóżki. Po¬
zostałe tkanki rozdrabnia się na skrawki o wymiarach około 3X3 mm. Po przygotowaniu potrzebnej ilości
masy tkankowej (np. z 50 zarodków) do naczynia ze skrawkami tkanki wlewa się płyn Hanksa w celu przepłu¬
kania i usunięcia komórek, zniszczonych w czasie rozdrabniania. Po zdekantowaniu masy tkankowej płyn
Hanksa wylew* się. Czynność tą wykonuje się dwukrotnie. Następnie do kolby z tkankami zarodka nalewa
się 0,25% roztworu trypsyny w przybliżonym stosunku 1 ml/l g tkanki. Kolbę z tkanką, poddawaną trypsynizacji, umieszcza się na mieszadle magnetycznym w temperaturze około 25°C. Co 5-7 minut płyn z komórkami
zlewa się do oziębionego naczynia. Do kolby, w której znajdują się niestrawione tkanki, dolewa się świeżego
roztworu trypsyny. Czynności te powtarza się 5-10 krotnie. Po zakończeniu trypsynizacji komórki w roztworze
trypsyny zagęszcza się przez wirowanie. Uzyskany osad komórek przepłukuje się płynem Hanksa, powtórnie
wiruje i zawiesza w płynie wzrostowym. Zawiesinę komórek rozlewa się do odpowiednich naczyń, to jest do
butelek typu Roux lub probówek. Szczelnie zakorkowane naczynia umieszcza się w temperaturze około 36°C.
94 725
2
Po uzyskaniu wzrostu komórek w postaci warstwy, przylegającej do dna butelki lub probówki, płyn wzrostowy
wylewa się, a do butelek z hodowlą komórek wlewa się płyn utrzymujący. W czasie tej czynności lub po jej
zakończeniu wykonuje się zakażenie, które polega na wpiowadzeniu do płynu utrzymującego niewielkiej ilości
płynu wirusowego. Po około 72 godzinach inkubacji w temperaturze około 36°C i po wystąpieniu charakte¬
rystycznych'zmian cytopatycznych, towarzyszących namnażaniu wirusa w komórkach, następuje zbiór. Namno¬
żone w wyżej podany sposób wirusy, zebrane jako płyn wirusowy łączy się z odpowiednim zawieszalnikiem
i liofilizuje, uzyskując gotowe szczepionki. Wszystkie użyte w znanym sposobie płyny zawierają dodatek anty¬
biotyków: penicylinę w ilości 100 000 jednostek międzynarodowych i streptomycynę 0,1 g w 1 litrze. (Skład
płynów i sposób ich sporządzania jest podany przez I. Polną w książce „Zarys wirusologii praktycznej" pod
redakcją F. Przesmyckiego, wyd. PZWL. Warszawa 1963 r, str. 55-90).
Sposób ten nie zabezpiecza pierwotnych hodowli komórek przed zakażeniami drobnoustrojami Mykoplazma, na które penicylina i streptomycyna działa w stopniu niedostatecznym. Przy zakażeniu tkanek zarodka
kurzego .tymi drobnoustrojami często wogóle nie można uzyskać wzrostu komórek, a tym samym prowadzić
prawidłowej hodowli i produkcji szczepionki. Obecność Mykoplazm w pierwotnych komórkach hodowli po¬
woduje niekorzystne oddziaływanie na metabolizm komórki i w efekcie na namnażanie się wirusa w komórce.
Pierwotne hodowle komórek, założone z tkanek pobranych od zakażonych zwierząt lub ich embrionów, są
zakażone Mykoplazmami. Zakażone Mykoplazmami pierwotne hodowle komórek nie nadają się do produkcji
szczepionki.
Znane jest w piśmiennictwie (m.in. Friend C. i wsp. Proc. Soc. Expl. Biol. Med. NY. 121, 1009, 1966,
Perlman D. i wsp. Appl. Mikrob. 15, 82, 1967, Zgórniak - Nowosielska J.: Med. DosV Mikrob. 22,195,1970)
uwalnianie hodowli komórek linii ciągłych od zakażeń Mykoplazmami przez stosowanie dodatku tylozyny
lub innych antybiotyków do podłoża wzrostowego dla komórek. Leczenie komórek pasażowanych tzw. linii
ciągłej przez hodowanie ich w płynie wzrostowym, zawierającym tylozynę, należy powtarzać kilka lub kilku¬
nastokrotnie w odstępach kilkudniowych (nt przykład co 4 dni). Sposób ten jest nieprzydatny do zastosowania
dla pierwotnej hodowli komórek fibroblastów zarodka kurzego, które zakaża się wirusem zwykle już po 18—24
godzinach inkubacji. Dłuższy okres wzrostu komórek powoduje najczęściej zmniejszenie ich wrażliwości na
wprowadzony wirus.
Pierwotne hodowle komórek, zwłaszcza fibroblastów zarodka kurzego, można skutecznie zabezpieczyć
przed zakażeniami drobnoustrojami Mykoplazma przez działanie tylozyny, jeżeli zastosuje się sposób według
wynalazku. Sposób według wynalazku polega na tym, że tylozynę wprowadza się już do roztworu płuczącego
płynu Hanksa oraz do roztworu trypsyny. Natomiast w opisanych sposobach tylozynę wprowadzono do płynu
wzrostowego.
Według wynalazku tkankę, przeznaczoną do zakładania pierwotnej hodowli komórek, najpierw płucze
się płynem Hanksa z dodatkiem tylozyny, następnie w celu wydzielenia pojedynczych komórek trypsynizuje
się za pomocą 0,25% roztworu trypsyny z dodatkiem tylozyny i z kolei wydzielone komórki płucze, korzystnie
dwukrotnie płynem Hanksa z dodatkiem tylozyny i jeden raz płucze płynem Hanksa bez dodatku tylozyny,
po czym pojedyncze komórki, uwolnione od Mykoplazm i tylozyny, poddaje dalszej hodowli przez zawieszenie
ich w znanym płynie wzrostowym. Wyhodowane żywe komórki służą do namnażania wirusa po uprzednim
usunięciu płynu wzrostowego i zastąpieniu go płynem utrzymującym.
Pierwotne hodowle komórek według wynalazku przeprowadza się następująco. Do płynu Hanksa oraz do
0,25% roztworu trypsyny dodaje się w warunkach aseptycznych od 0,1 g do 0,5 g najkorzystniej 0,1 g tylozyny
na 1 litr. Zarodki, wyjęte z zalężonych jaj, umieszcza się w płynie Hanksa z dodatkiem tylozyny na okres
5-10 minut. W tym okresie dla działania antybiotyku są dostępne Mykoplazmy, które znajdują się zewnątrzkomórkowo - między innymi w woreczku żółtkowym. Następnie odcina się od zarodków główki, łapki i skrzy¬
dełka. Z pozostałych tkanek przygotowuje się skrawki o wielkości 3X3 mm. Skrawki przepłukuje się dwukrot¬
nie płynem Hanksa z dodatkiem tylozyny, w ilości najkorzystniej 0,1 g na 1 litr. Następnie prowadzi się trypsynizację z użyciem 0,25% roztworu trypsyny, zawierającego dodatkowo najkorzystniej 0,1 g tylozyny w 1 litrze.
Ilość używanego roztworu trypsyny, czas i temperatura trawienia oraz inne szczegóły technologiczne nie odbie¬
gają od metody dotychczas stosowanej.
Dodatek tylozyny do roztworu trypsyny powoduje, że antybiotyk uzyskuje możliwość przenikania przez
rozpulchnione błony komórkowe do wnętrza pojedynczych komórek. Ponadto skojarzone działanie tylozyny
i trypsyny wywiera znacznie skuteczniejsze działanie na Mykoplazmy, niż to zapewnia sam antybiotyk. Po ze¬
braniu potrzebnej ilości komórek zagęszcza się je przez wirowanie. Uzyskany osad zawiesza się w płynie Hanksa
z dodatkiem tylozyny, a następnie zagęszcza przez wirowanie. Tylożyna, zawarta w płynie Hanksa, zostaje
usunięta wraz z supernatantem. Następnie,zagęszczone komórki przepłukuje się płynem Hanksa bez dodatku
tylozyny i po odwirowaniu odrzuca supernatant. Zawieszone komórki rozlewa się do odpowiednich naczyń
94 725
3
i inkubuje w temperatuize około 36—37°C. Po uzyskaniu wzrostu komórek hodowli płyn wzrostowy zastępuje
się płynem utrzymującym i zakaża wirusem. W przypadku niebezpieczeństwa zakażenia hodowli komórek
w okresie późniejszym, to jest już po trypsynizacji, na przykład od personelu laboratorium, wówczas wskazane
jest, aby do płynu utrzymującego dodać również tylozynę w ilości do 0,03 g na 1 litr płyfiu utrzymującego.
Wyższe stężenie tylozyny oddziaływuje toksycznie w warunkach wielogodzinnego przetrzymywania hodowli
w temperaturze około 36°C. Po uzyskaniu namnożenia wirusa w hodowli komórek, co stwierdza się na
podstawie występowania charakterystycznych zmian cytopatycznych, zbiera się płyn wirusowy, dodaje za-
wieszalnik i liofilizuje, uzyskując gotowe szczepionki.
Sposób według wynalazku skutecznie zabezpiecza pierwotne hodowle komórek przed zakażeniami drobno¬
ustrojami Mykoplazma, eliminując wpływ tych drobnoustrojów na namnaźanie i zbiór wirusów, przeznaczonych
do sporządzania szczepionek oraz innych preparatów immunobiologicznych. Sposób ten może być stosowany
przy zakładaniu pierwotnych hodowli komórek z zarodków ptaków na przykład: kur, kaczek, perliczek, indy¬
ków, gęsi oraz przy zakładaniu hodowli komórek z różnych tkanek ssaków - na przykład nerki psa, nerki
cielęcia, nerki świni, jąder świni, jąder psa i innych. Ponadto sposobem według wynalazku można wykonywać
trypsynizację różnych linii ciągłych komórek. Sposób jest szczególnie przydatny przy produkcji szczepionki
przeciwko nosówce zwierząt mięsożernych i przy produkcji szczepionki skojarzonej przeciwko nosówce i zaka¬
źnemu zapaleniu wątroby psów.
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób zabezpieczenia pierwotnych hodowli komórek, zwłaszcza fibroblastów zarodka kurzego, przed
zakażeniami ubocznymi drobnoustrojami Mykoplazma, prowadzonych na drodze rozdrobnienia mechanicznego
tkanki i płukania tkanki za pomocą płynu Hanksa i jej trypsynizacji za pomocą roztworu trypsyny, i wydzielenia
pojedynczych komórek oraz zawieszenia ich w pożywce wzrostowej i wyhodowania żywych komórek, służą¬
cych do namnaźania wirusa po uprzednim dodaniu płynu utrzymującego, znamienny tym, że tkankę,
przeznaczoną do hodowli, najpierw płucze się płynem Hanksa z dodatkiem tylozyny, następnie trypsynuje się
za pomocą roztworu trypsyny z dodatkiem tylozyny, po czym płucze, korzystnie dwukrotnie, płynem Hanksa
z dodatkiem tylozyny i jeden raz płynem Hanksa bez dodatku tylozyny, po czym pojedyncze komórki,
uwolnione od Mykoplazm i tylozyny, poddaje się dalszej hodowli w znany sposób.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tyin, że tylozynę dodaje się do używanego do płukania
tkanki i komórek płynu Hanksa w ilości 0,1-0,5 g na 1 litr, najkorzystniej 0,1 g na 1 litr.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że tylozynę dodaje się do roztworu trypsyny w ilości
0,1-0,5 g na 1 litr, najkorzystniej 0,1 g na 1 litr.