Sposób oznaczania autoprzeciwciał reagujących z antygenami

POLSKA
OPIS PATENTOWY
144 464
RZECZPOSPOLITA
LUDOWA
Patent dodatkowy
do patentu nr
Int. Cl.4 G01N 33/538
Zgłoszono:
85 02 27
(P. 252145)
C12N 1/06
Pierwszeństwo
C *, f ^LhlA
URZĄD
PATENTOWY
PRL
Zgłoszenie ogłoszono:
86 09 09
Opis patentowy opublikowano: 89 01 31
Twórcawynalazku: Andrzej Gardas
Uprawniony zpatentu: Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego,
Warszawa (Polska)
Sposób oznaczania autoprzeciwciał
reagujących z antygenami błony plazmatycznej
komórek tarczycy
Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania autoprzeciwciał reagujących z antygenami
błony plazmatycznej komórek tarczycy w surowicach chorych z autoimmunologicznymi schorze¬
niami gruczołu tarczowego, choroba Gravesa-Basedowa i choroba Hashimoto.
Znane są metody oznaczania przeciwciał antytyreoglobulinowych, antymikrosomalnych,
przeciwciał hamujących wiązanie hormonu tyreotropowego do błon plazmatycznych tarczycy i
metod oznaczania przeciwciał stymulujących aktywność cyklazy adenylowej. Opisane są również
ogólne zasady metod immunoenzymatycznych, np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ame¬
ryki nr 3 654 090. Brak natomiast do tej pory było prostej metody pozwalającej na pomiar całej
grupy autoprzeciwciał reagujących z antygenami błony plazmatycznej komórek tarczycy łącznie,
głównie z powodu trudności opłaszczania solubilizowanych detergentami antygenów błon komór¬
kowych. Obecność w roztworze detergentów hamuje i uniemożliwia ich opłaszczanie na fazie stałej.
Celem wynalazku jest opracowanie sposobu oznaczania całej różnorodnej rodziny autoprze¬
ciwciał towarzyszących chorobom autoimmunologicznym tarczycy, reagujących z antygenami
błon plazmatycznych komórek tarczycy. Metoda taka nie powinna jednak oznaczać przeciwciał
antytyreoglobulinowych i przeciwciał antymikrosomalnych. Metoda ta pozwala na laboratoryjną
diagnostykę chorób tarczycy, jak również może mieć znaczenie prognostyczne.
Według wynalazku sposób oznaczania autoprzeciwciał reagujących z antygenami błony
plazmatycznej komórek tarczycy, polega na przygotowaniu rozpuszczalnego preparatu antygenów
błon plazmatycznych tarczycy przez ich solubilizację w obecności detergentów w buforze o pH od 8
do 11, rozbiciu ultradźwiękami, chromatografię na sitach molekularnych i opłaszczeniu na fazie
stałej. Do solubilizacji używa się w stężeniu od 0,1 do 1% detergentów o wysokiej wartości
krytycznego stężenia tworzenia miceli, takich jak dezoksycholan, oktylo-/3-glukozyd, różne etery
polioksyetylenu np. TritonX-100 lub amfoteryczne deteregenty typu sulfabetain, nazwy handlowe
Zwittergent 3-14,3-12,3-10 lub 3-08 i dodatkowo obniża jego stężenie po solubilizacji do 0,05% w
procesie chromatograficznego oczyszczania solubilizatu, a następnie opłaszcza rozpuszczalny
144 464
2
i oczyszczony preparat antygenów błon plazmatycznych tarczycy, na fazie stałej i wykonuje
oznaczenie poziomu przeciwciał jednym ze znanych sposobów. Mogą to być metody immunoen-
zymatyczne jak w opisanym przykładzie, bądź też metody radioimmunologiczne.
Przykład I. Oznaczenie poziomu autoprzeciwciał antybłonowych w surowicach krwi
pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi tarczycy:
a) Przygotowanie antygenu do opłaszczania płytek. Z tkanki tarczycy ludzkiej otrzymanej po
operacji wola obojętnego lub choroby Gravesa-Basedowa otrzymuje się błony komórkowe tar¬
czycy metodą opisaną przez Fenżi i wsp. J. Endocrinol. Invest. 1/1978/17-24. Błony otrzymane z
co najmniej 5 tarczyc łączymy razem i doprowadza się stężenie białka do 5 mg/ml, dodając 0,1
molowego roztworu buforu Na2CC>3-NaHC03 o pH 9,6. Roztworem 1 molowym w/w buforu
uzupełnia się stężenie buforu w roztworze tak, byjego końcowe stężenie wynosiło 0,1 mola na litr.
Do zawiesiny błon dodaje się 10% roztwór wodny Tritonu X-100, by jego końcowe stężenie
wynosiło 0,5%. Po wymieszaniu zawiesinę błon poddaje się działaniom ultradźwięków przez 120
sekund. W trakcie homogenizacji ultradźwiękami mieszaninę chłodzi się w łaźni z lodem. Po
homogenizacji mieszaninę wiruje się przez 30 minut przy 20 000 X g, osad odrzuca, a supernatant
oczyszcza poprzez chromatografię na kolumnie wypełnionej Sepharosą 48 (Pharmacia, Szwecja).
Kolumna o wymiarach 60 X 2,5 cm, zrównoważona buforem 0,1 M węglanowym o pH 9,6 zawiera¬
jącym 0,05% Tritonu X-100. Frakcje części wstępującej pierwszego i zarazem głównego piku
białkowego łączy się i traktuje jako częściowo oczyszczony preparat antygenu błon komórkowych
tarczycy.
b) Opłaszczanie płytek polistyrenowych. Częściowo oczyszczony antygen błon komórkowych
tarczycy rozcieńcza się buforem Na2C03-NaHCC>3,0,1 M do stężenia białka 3/ig/ml i tak rozcień¬
czony preparat błon komórkowych pipetuje po 200/yl do każdej studzienki płytki polistyrenowej i
pozostawia na noc w lodówce (temp. 4°C). Następnego dnia płytki płucze się trzykrotnie roztwo¬
rem buforowanej soli fizjologicznej zawierającej 0,05% detergentu Tween 20 i dwukrotnie wodą
destylowaną. Następnie do każdej studzienki płytki pipetuje się po 200//l roztworu soli fizjologi¬
cznej zawierającej 2 mg/ml albuminyjaja kurzego i 2 mmole azydku sodu. Płytki przechowuje się w
temp. 4°C. W tych warunkach ich trwałość wynosi około dwa tygodnie.
c) Wykonanie oznaczenia. Surowice badane rozcieńcza się 125 razy w roztworze soli fizjologi¬
cznej zawierającej 2 mg/ml albuminy jaja, 20/ig/ml ludzkiej tyreoglobuliny i 0,05% Tween 20. Do
każdej studzienki płytki opłaszczonej antygenemjak w punkcie b, dodaje się po 150/ii tego samego
buforu jak do rozcieńczania surowicy. Do pierwszej studzienki dodaje się 50/A rozcieńczonej
surowicy i kolejno po wymieszaniu przenosi 50//1 do następnej studzienki i tak wykonuje sześć
kolejnych rozcieńczeń, uzyskując rozcieńczenia surowicy od 1:500 do 1:512000. Taksamo postę¬
puje się z wszystkimi badanymi surowicami i surowicami kontrolnymi. Surowicą kontrolną nega¬
tywną jest połączona surowica od 50 zdrowych dawców krwi, surowicą kontrolną pozytywną jest
połączona surowica od 10 nieleczonych chorych z chorobą Gravesa-Basedowa. Po wykonaniu
wszystkich kolejnych rozcieńczeń, płytkę pozostawia się na jedną godzinę w temp. pokojowej
(20°C), a następnie płuczemy trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej zawierającym 0,05% Twenn
20.
Do wszystkich studzienek płytki dodaje się teraz 200//l 1000 krotnie rozcieńczonego roztworu
drugiego przeciwciała, królicze antyludzkie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową w soli fizjolo¬
gicznej zawierającej 2 mg/ml albuminy jaja i 0,05% Tween 20. Inkubuje się w temperaturze
pokojowej przez godzinę i ponownie płucze trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej z dodatkiem
0,05% Tween 20. Do wypłukanych płytek dodaje się po 200 //l do każdej studzienki roztworu ABTS
(kwas 2,2' azyno-di-3-etylobenzotiazolino-sulfonowy) 1 mg/ml w 0,1 M buforze kwas cytrynowy
— Na2HP04 pH 4,0, zawierającym wodę utlenioną o stężeniu 2 mmole/dm3. Po 90 minutach
odczytujemy ekstynkcję na kolorymetrze przy długości fali 407 nm. Wyniki porównuje się z
kontrolną surowicą negatywną i każdy wynik surowicy badanej powyżej 0,1 jednostki ekstyncji
uznaje za pozytywny. Za miano surowicy badanej uznaje się takie największe rozcieńczenie
surowicy, przy którym ekstyncja jest większa od próby kontrolnej negatywnej o 0,1 jednostki
ekstyncji.
144 464
3
Zastrzeżenie patentowe
Sposób oznaczania autoprzeciwciał reagujących z antygenami błony plazmatycznej komórek
tarczycy, polegający na przygotowaniu rozpuszczalnego preparatu antygenów błon plazmatycznych tarczycy przez ich solubilizację w obecności detergentów w buforze o pH od 8 do 11,
rozbiciu ultradźwiękowymi, chromatografię na sitach molekularnych i opłaszczeniu na fazie stałej,
znamienny tym, że do solubilizacji używa się w stężeniu od 0,1 do 1% detergentów o wysokiej
wartości krytycznego stężenia tworzenia miceli, takichjak dezoksycholan, oktyl-/J-glukozyd, etery
polioksyetylenu lub detergenty amfoteryczne typu sulfobetain i dodatkowo obniża jego stężenie po
solubilizacji do 0,05% w procesie chromatograficznego oczyszczania solubilizatu, a następnie
opłaszcza rozpuszczalny i oczyszczony preparat antygenów błon plazmatycznych tarczycy na fazie
stałej i wykonuje oznaczenie poziomu przeciwciał jednym ze znanych sposobów.