RNA jako marker molekularny
advertisement
Białko jako marker molekularny Markery białkowe: - obecność lub brak (lub zmiana ilości) określonego białka wskazuje na istnienie określonej zmiany fizjologicznej lub chorobowej (np. pojawienie się we krwi/moczu gonadotropiny kosmówkowej wskazuje na ciążę). - o zmianie chorobowej świadczy obecność nieprawidłowego białka (np. zmutowane wersje białek w komórkach nowotworowych). - obecność określonego wariantu białka świadczy o określonym stanie fizjologicznym lub chorobowym (np. obecność przeciwciał rozpoznających białka obecne u patogenu oznacza, że badany organizm (człowiek) miał lub ma styczność z danym patogenem). Markery białkowe – nierozerwalny związek dwóch parterów: Białko (antygen) ↔ Przeciwciało Przeciwciała jako specjalna klasa białek – w głównej mierze służą do detekcji markerów białkowych, ale również same mogą być markerami białkowymi wykrywanymi przy użyciu białek, które rozpoznają. Metody wykrywania markerów białkowych i przykłady ich zastosowania. Technika Western blot • • • • Rozdział białek w żelu akrylamidowym Transfer na błonę nitrocelulozową lub PVDF Inkubacja z przeciwciałami (I- i II-rzędowymi) Detekcja Technika Western blot Wady: • Bardzo pracochłonna i kosztowna; • Trudna do seryjnego stosowania i standardyzacji; • Niemożliwa do wprowadzenia do masowego użytku. Zalety: • Umożliwia ocenę jakościową badanego białka; • Szczególnie przydatna w przypadku białek błonowych i białek o charakterze hydrofobowym. Dziedziczna paraplegia spastyczna • zanik aksonów w neuronach motorycznych kory mózgowej; • sztywność i osłabienie mięśni kończyn dolnych; • choroba jest autosomalna recesywna; • mutacje w genie parapleginy, kodującym mitochondrialną proteazę typu m-AAA. • mutacje prowadzą do destabilizacji białka i jego szybkiej degradacji. Bagnetowe testy immunosorpcyjne • badaną próbkę miesza się z roztworem przeciwciał I rozpoznających białko markerowe. Przeciwciała I są sprzężone z enzymem przeprowadzającym reakcję barwną. • w próbce umieszcza się bagnet, na którego powierzchni są przeciwciała II rozpoznające białko markerowe. • po inkubacji bagnet przepłukuje się wodą, umieszcza się w roztworze substratu dla enzymu i obserwuje powstanie reakcji barwnej. • na jednym bagnecie może być wiele pól, które zawierają przeciwciała rozpoznające inne białka markerowe. Bagnetowe testy immunosorpcyjne • intensywność zabarwienia jest proporcjonalna ze stężeniem białka markerowego. • Odczyt „na oko” – poprzez porównywanie ze wzorcem Bagnetowe testy immunosorpcyjne • intensywność zabarwienia jest proporcjonalna ze stężeniem białka markerowego. • Odczyt w odpowiednim urządzeniu. Test immunoenzymatyczny (ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay) 1) Unieruchomienie antygenu na podłożu (płytce z dołkami); 2) Dodanie przeciwciała specyficznie rozpoznającego antygen. Przeciwciało posiada przyłączony enzym mogący przeprowadzać reakcję barwną; 3) Usunięcie nadmiaru przeciwciał i dodanie substratu dla enzymu; 4) Odczytanie ilości powstałego produktu. Test kanapkowy ELISA W teście kanapkowym antygen jest unieruchomiony do podłoża przy pomocy innego przeciwciała. Wiązanie antygenu Detekcja antygenu Test kanapkowy ELISA W teście kanapkowym pośrednim do detekcji antygenu stosuje się dwa rodzaje przeciwciał: I-rzędowe rozpoznające antygen i II-rzędowe sprzężone z enzymem, które rozpoznają przeciwciała I-rzędowe. Test bezpośredni Test pośredni Test kanapkowy ELISA Test ELISA wykrywający przeciwciała Test ten ma na celu wykrycie w próbce (np. krwi) obecność określonego rodzaju przeciwciał, które wiązane są do podłoża pokrytego odpowiednim antygenem. Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Wirus zapalenia wątroby typu B, HBV (ang. Hepatitis B Virus), to otoczkowy wirus DNA, hepatotropowy i limfotropowy, z rodziny hepadnawirusów, powodujący wirusowe zapalenie wątroby, zwane kiedyś żółtaczką wszczepienną. • Z wirusem HBV miało styczność 2 mld ludzi, 350 mln to chroniczni nosiciele; • W Polsce 15-20% ludzi przeszło zakażenie wirusem HBV; • Zakażenie w ostrej postaci występujące u kilku procent zakażonych powoduje zapalenie wątroby, wymioty, żółtaczkę, ale rzadko prowadzi do śmierci; • W 90-95% przypadków zakażenie kończy się samoistnym wyleczeniem. • Część zakażeń HBV (5-10%) przechodzi następnie w fazę przewlekłą; • Chroniczne zapalenie wątroby B może prowadzić do marskości wątroby i raka wątroby, który jest nieuleczalny wobec małej skuteczności obecnej chemioterapii; • Średni czas trwania zakażenia HBV od momentu zakażenia do pojawienia się poważnych problemów zdrowotnych u osoby dorosłej wynosi 15 do 20 lat. Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Diagnostyka opiera się o badanie markerów serologicznych. Wykrywane są zarówno białka kodowane przez genom wirusa, jak i przeciwciała przeciwko tym przeciwciałom, które wytworzyła zakażona osoba. HBs Ag - antygen powierzchniowy (hepatits B surface antigen). Pojawia się w okresie 1 do 10 tygodni od ekspozycji na zakażenie. Przetrwanie HBsAg ponad 6 miesięcy jest klasyfikowane jako nosicielstwo. HBe Ag - wydzielnicza postać antygenu rdzeniowego (hepatitis B e antigen). Pojawia się zaraz po ujawnieniu HBsAg lub około tygodnia później w surowicy. Najszybciej zanika w okresie zdrowienia. Obecność tego antygenu u osób zakażonych HBV wskazuje na wysoką zakaźność. Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Anty-Hbe - przeciwciała skierowane w przeciwko wydzielniczemu antygenowi HBe (HBe Ag). Ich pojawienie po zaniku HBeAg jest dobrą oznaką prognostyczną. Anty-HBc IgM - przeciwciała przeciw antygenowi rdzeniowemu. HBc-Ag (hepatitis B core antigen). Wykrywane w fazie wczesnej i późnej ostrego WZW B. Zazwyczaj stwierdza się ich zanik po upływie kilku tygodni. Anty-HBc IgG - przeciwciała przeciw antygenowi rdzeniowemu świadczące o przebytym zakażeniu HBV, mogą utrzymywać się w surowicy przez wiele lat po przebytym zakażeniu HBV. Anty-HBs - przeciwciała świadczące o uodpornieniu (szczepienie lub przebyte WZW B). Pojawiają się w okresie 3-4 miesięcy po ustąpieniu objawów chorobowych i po zaniknięciu HBsAg - w okresie rekonwalescencji. Zanik może nastąpić w okresie do 6 lat od zakażenia. U osób przewlekle zakażonych HBV nie wytwarzają się te przeciwciała. Wykrywanie zakażenia wirusem HBV Typowe serotypy • HBsAg+ HBeAg+ AntyHBcIgM+ : Ostre WZW B. Okres wczesny. • HBsAg+ HBeAg- AntyHBcIgM+ : Ostre WZW B. Okres późny. • HBsAg- AntyHBcIgM- AntyHBc+ AntyHBs- : Przebyte WZW B. Odporność. • HBsAg+ HBeAg+ AntyHBcIgM- : Nosiciel. Wysoka zakaźność. • HBsAg+ HBeAg- AntyHBcIgM- : Nosiciel. Mała zakaźność. • HBSAg- AntyHBcIgM- AntyHBc- AntyHBs+ : Osoba szczepiona antyHBV. Testy typu immunochromatograficznego Wynik: dodatni ujemny błędny Testy płytkowe/przepływu poprzecznego (lateral flow device) Testy paskowe/bagnetowe (dipstick) Wyniki testów immunochromatograficznych mogą być odczytywane w sposób ilościowy w specjalnych czytnikach. Wykrywanie obecności gonadotropiny kosmówkowej w moczu. Gonadotropina kosmówkowa (hCG, human chorionic gonadotropin) • produkowana w trakcie ciąży przez zarodek, a potem przez łożysko (syncytiotrofoblast). • jej zadaniem jest utrzymywanie funkcji ciałka żółtego, struktury, która powstaje w jajniku, w miejscu uwolnienia komórki jajowej, a potem podtrzymywanie produkcji progesteronu. • hCG daje się wykrywać standardowymi testami od 6–12 dnia po zapłodnieniu. • hCG może być również wytwarzana przez komórki niektórych nowotworów złośliwych, np. ciążowej choroby trofoblastycznej i nowotworu zarodkowego. • oznaczanie obecności hCG w moczu lub krwi kobiety jest metodą wykorzystywaną w testach ciążowych. Testy ciążowe dostępne w aptece. Testy ciążowe różnią się czułością w stosunku do ilości wykrywanej hCG. Testy dostępne w aptece są mogą mieć następującą czułość: • czułość mniejsza od 500 IU/l - wyniku dodatniego (czyli wykazania hCG) można się spodziewać 10 dni po zapłodnieniu, czyli 4 dni przed spodziewaną miesiączką. • czułość 500-800 IU/l - wynik dodatni 14 dni od momentu zapłodnienia, czyli w momencie spodziewanej miesiączki. • czułość powyżej 800 IU/l wynik dodatni występuje po 3 tygodniach, a więc 7 dni po planowanej miesiączce. Dodatni wynik testu ciążowego w ok. 90% świadczy o ciąży. Testy ciążowe dostępne w aptece. Od góry: test typu flamastra, test płytkowy (o przepływie poprzecznym) i test paskowy/bagnetowy. Laboratoryjne testy ciążowe. Testy ultraczułe – wykrywają hCG w 7 dniu po zapłodnieniu. Skuteczność dochodzi do 100%. • laboratoryjny test moczu; • laboratoryjny test krwi. Oznaczanie stadium menopauzy u kobiet – test płytkowy MediSmart. • w okresie menopauzy spada produkcja estrogenów potrzebnych do obniżenia wysokiego poziomu FSH i zakończenia owulacji; • jeśli produkcja estrogenów jest za niska, wartości FSH utrzymują się na wysokim poziomie; • oznaczenie wartości FSH oraz właściwe rozpoznanie objawów dostarcza kobiecie informacji o stadium menopauzy, w którym się znajduje; • test na menopauzę MediSmart pozwala kobietom na diagnozowanie, czy weszły już w okres menopauzy; • test wykrywa hormon folikulotropowy (FSH) o stężeniu 25 mlU/ml; • dokładność testu wynosi ponad 99%. Wykrywanie zarodźca malarii we krwi • w obszarach malarycznych żyje 3 mld ludzi, co stanowi połowę ludności na Ziemi; • co roku na malarię choruje 200 mln ludzi, 2mln osób umiera; • w Polsce co roku stwierdza się kilkadziesiąt zachorowań i kilka zgonów związanych z zachorowaniem na malarię; • malaria jest powodowana zakażeniem 4 gatunkami pierwotniaków (zarodźca malarii) Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale i P. malaria. Dwa pierwsze gatunki odpowiadają za 95% zachorowań. • chwili obecnej opracowano dwa testy na wykrywanie niektórych gatunków zarodźca malarii. Wykrywanie zarodźca malarii we krwi (testy paskowe) test OptiMAL • rozpoznaje P. vivax i P. falciparum; • rozpoznaje specyficzną dla pasożyta dehydrogenazę mleczanową, która jest uwalniana do krwi podczas zakażenia; test ICT Malaria P.f./P.v. • rozpoznaje P. vivax i P. falciparum; • rozpoznaje białko 2 bogate w histydynę (HRP-2)
