II. Budowa komórki bakteryjnej, metody barwienia, zasady

II. Budowa komórki bakteryjnej, metody barwienia, zasady
mikroskopowania i morfologia bakterii
Ćwiczenie 1. Wykonanie preparatu barwionego metodą Grama
Zasada metody: Technika barwienia Grama składa się z następujących czynności:
1. Barwienie podstawowe roztworem fioletu krystalicznego. Wszystkie bakterie zostają
wybarwione na fioletowo pod wpływem tego barwnika zasadowego.
2. Utrwalenie płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu). Jod w połączeniu z fioletem
krystalicznym tworzy w komórkach kompleksy krystaliczne fiolet-jod.
3. Odbarwienie (alkohol etylowy lub mieszanina alkohol etylowy-aceton). Kompleksy fioletu
krystalicznego zostają wymyte u niektórych bakterii, inne pozostają zabarwione.
4. Dobarwienie barwnikiem kontrastowym (fuksyna karbolowa, safranina). Ten barwnik
zasadowy powoduje ponowne wybarwienie na czerwono (safranina) lub na różowo (fuksyna)
bakterii pozbawionych koloru podczas odbarwiania.
Wykonanie preparatu z hodowli stałej i płynnej
1. Przygotować szkiełko podstawowe do barwienia poprzez odtłuszczenie kawałkiem
mydła na sucho (odtłuszczanie). Opalić w płomieniu palnika.
2. Na powierzchnię szkiełka podstawowego nanieść kroplę soli fizjologicznej.
Następnie jałową ezą wykonać rozmaz na szkiełku podstawowym zawieszając
pobraną kolonię bakterii w kropli soli fizjologicznej. W przypadku wykonywania
preparatu z materiału płynnego, wystarczy nanieść na szkiełko kroplę płynu,
pobranego ezą i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka.
3. Wysuszyć preparat w temperaturze pokojowej, a następnie utrwalić termicznie
przeprowadzając trzykrotnie przez płomień palnika, rozmazem do góry. Nie
trzymać szkiełka w płomieniu!
4. Po ostygnięciu preparatu wykonany preparat użyć do barwienia.
5. Na utrwalony preparat nanieść fiolet krystaliczny, tak, aby całkowicie pokrył
powierzchnię z bakteriami. Barwnik pozostawić na 2 minuty lub 30
sek.(w zależności od stężenia barwnika).
6. Zmyć fiolet krystaliczny wodą destylowaną.
7. Nanieść płyn Lugola i pozostawić przez 1-2 minuty. Spłukać wodą destylowaną.
8. Spłukać obficie alkoholem etylowym (odbarwianie), a następnie wodą
destylowaną.
9. Nanieść roztwór fuksyny/safraniny i pozostawić na 30 sekund. Spłukać wodą
i pozostawić preparat do wyschnięcia.
Ćwiczenie 2. Wykonanie barwienia prostego błękitem metylenowym wg Lőfflera
Wykonanie: Przygotować preparat z hodowli stałej wg opisu z ćwiczenia 1.
1. Barwienie. Na utrwalony preparat nanieść błękit metylenowy, tak, aby całkowicie
pokrył powierzchnię z bakteriami. Barwnik pozostawić na 10 minut.
2. Spłukać wodą i pozostawić preparat do wyschnięcia.
Ćwiczenie 3. Wykonanie preparatu przyżyciowego w kropli wiszącej
Wykonanie:
Technika kropli wiszącej
- na rogi szkiełka nakrywkowego namieść małe ilości wazeliny
- na środku szkiełka umieścić 2 oczka zawiesiny hodowli płynnej badanego szczepu.
- na szkiełko nakrywkowe nałożyć szkiełko podstawowe z wgłębieniem tak, aby kropla
znalazła się we wgłębieniu
- oglądać w mikroskopie świetlnym.
Ćwiczenie 4. Oglądanie preparatów mikroskopowych
Zasada metody: Barwione preparaty bakterii oglądamy pod dużym powiększeniem, stosując
obiektyw immersyjny (100x) i olejek immersyjny. Olejek, wypełniający przestrzeń pomiędzy
preparatem a obiektywem mikroskopu, zwiększa zdolność rozdzielczą mikroskopu, gdyż jego
współczynnik załamania światła jest zbliżony do współczynnika szkła, z którego wykonana
jest soczewka.
Wykonanie:
1. Na szkiełko podstawowe nanieść kroplę olejku immersyjnego.
2. Preparat umieścić na stoliku i zanurzyć obiektyw immersyjny mikroskopu w olejku do
uzyskania oporu.
3. Ustawić ostrość, najpierw przy użyciu śruby makrometrycznej (oburącz), a następnie
mikrometrycznej.
4. Po zakończeniu pracy, obiektyw mikroskopu należy przetrzeć watą, nasączoną
ksylolem (mieszaniną ksylenu i alkoholu etylowego), w celu oczyszczenia z olejku
immersyjnego!
Bakterie Gram-dodatnie są zabarwione na fioletowo
Bakterie Gram-ujemne są zabarwione na różowo
I. Preparaty własne wykonane w ramach ćwiczenia nr 1 i 2.
a. preparat bawiony metodą Grama
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
b. Preparat barwiony błękitem metylenowym
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
II. Preparaty trwałe
a. Preparat barwiony metodą pozytywno–negatywną – obserwacja obecności
otoczek
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
b. Ziarenkowce Gram-dodatnie układające się w dwoinki
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
c. Laseczki – preparat ze śledziony barwiony metodą Lőfflera
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
d. Krwinki i bakterie
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
e. Drożdże w plwocinie
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………