SHOTGUN:BAC-to-BAC BAC-to-BAC SHOTGUN

PODSTAWY BIOINFORMATYKI
3 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW I
PROJEKTY POZNANIA INNYCH GENOMÓW
1 400
1 200
2009
2010
2011
2012
1 000
800
1285
600
1153
986
400
954 889
914
759
717
251
757
254
200
23
0
ukończone
w trakcie scalania
w trakcie realizacji
Copyright ©2013 Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW
1. Automatyzacja sekwencjonowania
2. Sekwencjonowanie całych genomów
•
Metoda tradycyjna „BAC-to-BAC”
•
Metoda "shotgun"
•
Sekwencjonowanie nowej generacji
Copyright ©2011, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE
• Fred Sanger
• 2 nagrody Nobla
• Laboratory of Molecular Biology,
Cambridge UK
• 1970-te metoda sekwencjonowania
• metoda terminacji łańcucha DNA
SEKWENCJONOWANIE AUTOMATYCZNE
• Analiza całych genomów → automatyzacja procesu
sekwencjonowania
• Sekwenatory DNA → 384 próbki DNA, 24 analizy / doba
Copyright ©2010, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE AUTOMATYCZNE
1. Substraty do sekwencjonowania
•
?
2. Denaturacja DNA
3. Przyłączenie primera
4. Przyłączenie polimerazy
5. Replikacja
6. Zakończenie
7. Łańcuchy DNA o różnych długościach
8. Sekwenator → elektroforeza
9. Sekwenator → odczytanie fluorescencji A, C, T lub G
10. Program → plik wynikowy
Copyright ©2010, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE CAŁYCH GENOMÓW
1. Metoda tradycyjna „BAC-to-BAC”
1980
Map based sequencing
2. Metoda „shotgun”
1997
Whole genome shotgun sequencing
3. Metoda nowej generacji
~2007
Next generation sequencing
Copyright ©2010, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN
DEFRAGMENTACJA DNA
fragmenty
oczyszczonego
DNA
150-200 kb
losowo pocięte
fragmenty DNA
2-4 kb
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN
SEKWENCJONOWANIE FRAGMENTÓW 1 000 bp
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN
OSTATECZNY WYNIK - SEKWENCJA KONSENSUSOWA
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – SHOTGUN:BAC-to-BAC
BAC-to-BAC
SHOTGUN
• Fragmentacja DNA: 150 kbp
• Fragmentacja DNA: 2 kbp
• Konstrukcja bibliotek BAC
• Konstrukcja bibliotek
plazmidowych
• Konstrukcja ramowej mapy –
kolejność fragmentów BAC
Copyright ©2010, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – SHOTGUN:BAC-to-BAC
BAC-to-BAC
SHOTGUN
• Fragmentacja BAC DNA –
konstrukcja bibliotek M13
• Sekwencjonowanie bibliotek
M13
• Sekwencjonowanie bibliotek
plazmidowych
• Łączenie sekwencji
• Łączenie sekwencji
Copyright ©2010, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
METODA NOWEJ GENERACJI
•
Sekwencjonowanie bardzo krótkich fragmentów
•
50-700 bp
•
DNA unieruchomione na płytce
•
Szybkie
•
Tanie
•
Platformy: Roche 454, SOLiD, Illumina Solexa
Copyright ©2013, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
PORÓWNANIE METOD
dł.
szybkość
koszt
łańcucha DNA
dni/1Gbp
1000 bp
500
0.100 $
• Tradycyjna, 1970 r.
1000 bp
• 454, 2004/2005 r.
400-700 bp 2
0.020 $
• Solexa, 2006 r.
100-150 bp 0.5
0.001 $
• Solid, 2007 r.
50 bp
0.001 $
0.5
Copyright ©2012, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
KOSZT/CZAS ZSEKWENCJONOWANIA CAŁEGO GENOMU
CZŁOWIEKA
• Projekt poznania genomu człowieka
• NGS
~ 15 000 000 $
6-9 lat
~2014 r.
~ 4 000 $
~ 2004 r.
~ 2 dni
•
Copyright ©2014, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
Source: NHGRI
Copyright ©2015, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
NHGRI Current Topics in Genome Analysis 2012
Copyright ©2013, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
454
Copyright ©2013, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
Illumina
Copyright ©2013, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
2011 Nature special issue of nature on sequencing
Copyright ©2013, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
1000 GENOMES PROJECT (www.1000genomes.org)
•
technologie nowej generacji - obniżenie kosztów i
duża szybkość sekwencjonowania
•
zsekwencjonowanie wielu genomów ludzkich
•
scharakteryzowanie zmienności genetycznej
człowieka na podstawie sekwencji DNA
Copyright ©2013, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
1000 GENOMES PROJECT (www.1000genomes.org)
•
•
•
dane ogólnodostępne do badań
2535 osób, 26 populacji
ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/
Copyright ©2015, Joanna Szyda
SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW – NEXT GENERATION
1000 GENOMES PROJECT (www.1000genomes.org)
Copyright ©2010, Joanna Szyda
PODSTAWY
BIOINFORMATYKI