Korelacja pomiędzy badaniem anty
advertisement
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostic 2010 • Volume 46 • Number 4 • 371-378 Praca oryginalna • Original Article Korelacja pomiędzy badaniem anty-HCV a HCV – RNA. Problemy interpretacyjne wynikające z występowania wyników fałszywie dodatnich bądź fałszywie ujemnych w teście przesiewowym Correlation between anty-HCV and HCV-RNA tests. Interpretative problems arising from the occurrence of false positive or false negative results in screening tests Agnieszka Wierzbicka Pracownia Biologii Molekularnej, Laboratorium Centralne, Samodzielny Publiczny Wojewódzki Szpital Zespolony w Szczecinie Streszczenie Cel: Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest ważnym patogenem człowieka, gdyż zakażonych jest nim już ponad 17 mln ludzi na świecie. Diagnostyka obejmuje testy laboratoryjne, testy serologiczne, testy potwierdzenia – RIBA HCV, oraz testy metodami biologii molekularnej: oznaczanie HCV-RNA (Real-Time PCR). Wiele problemów interpretacyjnych wynika z występowania wyników fałszywie dodatnich bądź fałszywie ujemnych w testach przesiewowych. Metody: W pracy przedstawiono metody badawcze wykorzystywane w diagnostyce WZW C, oraz wyniki badań własnych na grupie 300 osób, porównując wyniki testów serologicznych anty-HCV metodą immunoenzymatyczną (MEIA) w systemie AxSYM z wykrywaniem HCV-RNA, metodą Real-Time PCR, w teście jakościowym firmy Roche Diagnostics. U 90 (30%) badanych pacjentów z wyselekcjonowanych grup obserwowano wyniki fałszywie dodatnie bądź fałszywie ujemne wyniki badań przesiewowych. Wnioski: Stwierdzenie bądź wykluczenie WZW C powinno opierać się na szerokim panelu badawczym oraz obrazie klinicznym pacjenta, gdyż diagnostyka jest często trudna a wyniki badań niejednoznaczne, co wiąże się między innymi z występowaniem wyników fałszywie dodatnich bądź ujemnych w testach przesiewowych, w szczególnych grupach pacjentów: dializowanych, po przeszczepach, i na leczeniu immunosupresyjnym, u kobiet w ciąży, oraz osób zakażonych innymi wirusami, np. wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV). Summary Aim: Hepatitis C virus (HCV) is an important human pathogen, since it concerns 170 mln people worldwide. Its diagnostics involves lab tests, serological tests, confirmation tests – RIBA HCV, and molecular assays for HCV-RNA (Real-Time PCR). Numerous interpretative problems arise from the occurrence of false positive or false negative results in screening tests. Methods: I have compared test methods used in the diagnostics of WZW C, and have included the results of my own research, that compared serological anti-HCV tests by the microparticle enzyme immunoassay (MEIA) in the AxSYM system with HCV-RNA detection, from Abbott, with the qualitative real-time PCR assay, from Roche Diagnostics. In 90 (30%) of examined patients from the selected groups, screen testing gave false positive or false negative results (n=300). Conclusions: Confirmation or exclusion of WZW C should be based on all the available test methods and on patient’s clinical symptoms, because the diagnostics is often difficult and findings ambiguous. This arises, among others, from the occurrence of false positive or false negative results in screening tests, especially in atypical groups of patients: dialyzed, after transplants, immunosuppressive, women in pregnancy, and patients with Hepatitis B virus. Słowa kluczowe: Wirusowe zapalenie wątroby typu C, diagnostyka serologiczna, anty HCV, badania przesiewowe, RIBA test, HCV – RNA Key words: Viral Hepatitis C, serological diagnostics, screen testing, anti-HCV, RIBA-test, HCV-RNA. 371 Korelacja pomiędzy badaniem anty-HCV a HCV – RNA. Problemy interpretacyjne Wstęp Wykrywalność zakażeń jest bardzo niska, gdyż poziom Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest przyczyną wiru- świadomości społecznej jest niski. Ponadto nadal dla wielu sowego zapalenia wątroby typu C (WZW C). W 1989 r. po osób nieznane są drogi zakażenia, a jednocześnie nie raz pierwszy zidentyfikowano i opisano hepatitis C virus jako udało się dotychczas uzyskać skutecznej szczepionki prze- główny czynnik etiologiczny zapaleń wątroby non-A/non-B ciwko WZW C. Działania profilaktyczne nacelowane na (Choo i wsp. 1989) oraz raka i marskości wątroby [1]. Wirus poprawę świadomości społecznej oraz prowadzenie badań HCV może przebiegać bezobjawowo jako zakażenie utajo- przesiewowych mogłoby poprawić sytuację epidemiolo- ne. Wykazuje dużą wrażliwość na środki chemiczne i meto- giczną w kraju. Według szacunków Światowej Organizacji dy dezynfekcji, większą niż HBV, lecz mniejszą niż HIV. Zdrowia (WHO) na całym świecie jest już ponad 170 mln Osoby przewlekle zakażone wykazują podwyższone ryzyko osób zakażonych HCV [19]. Przenoszenie parenteralne powikłań odległych zakażenia, w tym przewlekłego zapale- HCV znajduje odzwierciedlenie w dużej częstości zakażeń nia, marskości oraz pierwotnego raka wątrobowokomórko- wśród znanych grup ryzyka (np. uzależnieni od narkotyków) wego (HCC). jednak niepokojąco wzrasta odsetek zakażonych wśród Większość (96%) zakażonych nie jest świadoma swojego pacjentów ośrodków szpitalnych, opiekuńczych, pacjentów stanu, ponieważ zazwyczaj przewlekła infekcja jest skąpo- dializowanych, osób korzystających z dostępnych zabiegów objawowa lub bezobjawowa i trwa latami. Eliminacja wirusa pielęgnacyjnych, co przy dużej liczbie nosicieli może powo- następuje u 15-30% chorych, głownie w przypadku objawo- dować, iż na ryzyko zachorowania na wirusowe zapalenie wego przebiegu ostrego WZW C. U pozostałych chorych wątroby typu C narażony jest każdy, bez względu na płeć, rozwija się zapalenie przewlekłe, a u 5-20% z nich może wiek, status społeczny i materialny. Dzięki skutecznym kam- dojść do marskości wątroby w ciągu 20-25 lat, związaną paniom systematycznie wzrasta jednak liczba osób badają- z poważnymi powikłaniami (wodobrzusze, żylaki przełyku, cych się w kierunku WZW C. żółtaczka, encefalopatia, zaburzenia krzepnięcia). Zapaleniu wątroby, wywołanemu przez HCV, często towarzyszą cho- Diagnostyka WZW C roby autoimmunologiczne w tym autoimmunologiczne zapa- WZW C najczęściej przebiega bezobjawowo, choć mogą lenie wątroby (AIH), które znacznie pogarszają rokowanie pojawiać się niespecyficzne objawy: i czas przeżycia, oraz krioglobulinemia, występująca u po- • osłabienie i zmęczenie, ucisk w nadbrzuszu, utrata łak- • • • objawy depresji; choroby nerek – rozplemowe zapalenie kłębuszków ner- • znacznie rzadziej żółtaczka [6]. nad 26% pacjentów przewlekle zakażonych HCV [2,3,6]. Źródłem zakażenia HCV jest człowiek a do transmisji może dojść w czasie używania niedostatecznie wysterylizowanego sprzętu wielokrotnego użytku, powtórnego wykorzystywania narzędzi pierwotnie przeznaczonych do jednorazowego użytku, zakłuć, ekspozycji materiału zakaźnego na nienia, zmęczenie, senność, apatia; zespół suchości, objawy skórno-śluzówkowe; kowych (MPGN); błony śluzowe, podania zainfekowanych preparatów krwio- U zakażonych HCV dość często występuje także nieznacz- pochodnych itp. a także nieprzestrzegania standardów nie powiększona śledziona (ok. 50%) i/lub wątroba (w obra- higieny podczas procesów diagnostycznych i leczniczych. zie USG). Ocenia się, że około 55-60% do zakażenia mogło dość Objawy te często są niecharakterystyczne i trudne do przy- w ramach procedur związanych ze służbą zdrowia [1,4]. porządkowania konkretnej jednostce chorobowej, co przy Innymi źródłami zakażeń może być wykonywanie zabiegów wspomnianej niskiej świadomości społecznej, oraz niekiedy pielęgnacyjnych i upiększających takich jak manikiur, pedi- utrudnionym dostępie do specjalisty i szerokiej wielotorowej kiur, tatuaże, kolczykowanie, akupunktura, oraz przeniesie- diagnostyki może powodować bagatelizowanie objawów nie zakażenia w populacji narkomanów poprzez stosowanie chorobowych, lub też mylną ich interpretację. Należy pod- środków odurzających drogą dożylną lub donosową. Do kreślić, iż aktualnie dysponujemy szerokim wachlarzem ba- połowy lat dziewięćdziesiątych XX wieku grupie ryzyka były dań opierających się na badaniach pomocniczych, serolo- także osoby, którym wykonywano transfuzje krwi, lub prze- gicznych badaniach przesiewowych, testach potwierdzenia, taczano preparaty krwiopochodne; jednak wprowadzone po oraz technikach biologii molekularnej. Badania pomocnicze 2000 r. obowiązkowe badania materiału od dawcy prawie obejmują najczęściej badania biochemiczne, mierzące po- całkowicie zminimalizowało tę drogę infekcji [5]. Ważne jest ziom aktywności enzymów wątrobowych takich jak amino- także, iż obecnie zakażenie HCV jest zaliczane do chorób transferaza alaninowa (ALT), aminotransferaza asparaginia- przenoszonych drogą płciową – ryzyko zakażenia przez nowa (AST), gamma-glutamyl transpeptydaza (GGTP), kontakty seksualne wynosi od 1,5%/rok, dla porównania fosfataza zasadowa (ALP), dehydrogenaza mleczanowa HIV 0,5% [2]. (LDH) oraz stężenie bilirubiny. Z uwagi na fakt, iż przewlekłe W Polsce – wg danych Polskiej grupy Ekspertów HCV – zapalenie wątroby typu C charakteryzuje się wahaniami szacunkowa liczba zakażonych może wynosić nawet aktywności transaminaz a około jedna trzecia pacjentów 730 000 osób, czyli 1,9% Polaków może być zakażonych (20-40%) wykazuje prawidłowe ich wartości [1], należy wirusem HCV (dane z października 2010 r.). ostrożnie podchodzić do interpretacji szczególnie podczas 372 A. Wierzbicka w surowicy znajdują się przeciwciała anty-HCV, to reagują one z antygenowymi białkami wirusa znajdującymi się na błonie. Zmiana koloru (reakcja barwna dzięki dodanemu enzymowi) wskazuje na to, że przeciwciała zareagowały z białkami. Rekombinowane testy immunoblot (RIBA) Są to testy uzupełniające do oznaczania przeciwciał antyHCV (RIBA) przeznaczone jako dodatkowe bardziej swoiste testy do badania próbek ludzkiej surowiec lub osocza. Rekombinowane testy immunoblot (RIBA) zawierają te same antygeny HCV co testy EIA, a także dysmutazę nadtlenkową (SOD). Dodatni wynik testu RIBA definiowany jest Rycina 1. Związek pomiędzy rekombinowanymi białkami HCV w teście AxSYM HCV version 3.0, a strukturalnymi i niestrukturalnymi białkami genomu HCV (wg firmy Abbott). HCr43 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Escherischa coli, zawiera sekwencje białek strukturalnych rdzenia wirusa oraz białek niestrukturalnych NS3 (biorących udział w replikacji) c200 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Saccharomyces cerevisiae zawiera aminokwasy 1192-1931, które prawdopodobnie powodują kodowanie regionów NS3 i NS4 genomu HCV. c100-3 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Saccharomyces cerevisiae zawiera sekwencje niestrukturalnych białek NS3 i NS4. NS5 Rekombinowane białko HCV wykazujące ekspresję u Saccharomyces cerevisiae zawiera sekwencje niestrukturalnego białka NS5. jako reaktywność na dwa lub więcej antygeny HCV, przy braku reaktywności na SOD. Reaktywność na pojedynczy antygen wirusa HCV lub reaktywność w szerokim zakresie antygenów wraz z reakcją na SOD uznawane są za wyniki nieokreślone („CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA – paskowy test immunoblot do oznaczania przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C” firmy Ortho Diagnostic – na podstawie ulotki producenta). Badania mikroskopowe – Hybrydyzacja in situ Wirus HCV rozprzestrzenia się w organizmie ludzkim za pomocą kompleksów immunologicznych/krioglobulin i jest diagnozowania fazy przewlekłej oraz u pacjentów bez klinicz- znajdowany w wielu miejscach, m.in. w komórkach mózgu, nej manifestacji objawów chorobowych. K Madaliński i wsp. w tym w komórkach glejowych, w płynie mózgowo-rdzenio- [16] w badaniach i poziomu anty-HCV i HCV-RNA u chorych wym, w komórkach krwi obwodowej – makrofagach, limfocy- z pierwotnym zespołem Sjögrena wykazali, iż u siedmiu pa- tach T i B oraz w komórkach szpiku kostnego [5]. Najczulsze cjentów, od których uzyskano dane badań biochemicznych (na 20 chorych posiadających przeciwciała anty-HCV) wartość aktywności ALT przekroczona została tylko u 3 chorych przy wartości prawidłowej < 30 IU/L, a średnia wartość ALT u 7 chorych wynosiła 34.3 IU/L, czyli tylko nieznacznie przewyższała górną granice wartości referencyjnej. Metody serologiczne Dzisiejsza diagnostyka serologiczna wykorzystuje testy, oparte na wykrywaniu przeciwciał anty-HCV. Są to testy EIA (enzyme immunosorbent assay) – immunoenzymatyczne drugiej i trzeciej generacji – pozwalają one wykrywać przeciwciała skierowane przeciwko antygenom wirusa typu C, Rycina 2. Obraz biopsji wątroby w mikroskopie świetlnym pokazujący pozytywnie oznakowane hepatocyty z infekcją HCV, przy użyciu hybrydyzacji in situ, powiększenie 20x [8]. (Majerowicz S i wsp., 2004) które zwykle pojawiają się średnio po 80 dniach od zakażenia (zakres od 33 do 129 dni). Testy EIA-2 wprowadzono już w 1990 r, jednak okazały się mało czułe [14]. Testy EIA-3 (testy trzeciej generacji) zostały zaakceptowane przez FDA jako testy o większej czułości i specyficzności niż uprzednio stosowane. Obecnie umożliwiają wykrywanie przeciwciał anty-HCV przy czułości diagnostycznej od 99,4% do 99,9%. Metoda immunoblottingu „Western blot” Metodę immunoblottingu „Western blot" stosuje się jako tzw. test potwierdzenia. Surowica inkubowana jest na nitrocelulozowych błonach, na których umieszczone są rozdzielone białka wirusowe – c33c, NS5, C100p, c22p i 5-1-1p. Jeżeli Rycina 3. Obraz hepatocytów w mikroskopie elektronowym z ukazanymi wtrętami koloidowymi wewnątrz rER, przy użyciu hybrydyzacji in situ, powiększenie 60000x [8] (Majerowicz S i wsp., 2004) 373 Korelacja pomiędzy badaniem anty-HCV a HCV – RNA. Problemy interpretacyjne oznaczenie HCV RNA odnosi się do komórek jednojądrza- komplementarnego DNA (cDNA), amplifikację docelowego stch krwi obwodowej (badania PBMC), czy tkanek, które cDNA na drodze PCR, oraz hybrydyzację kwasu nukleino- mogą być miejscem replikacji czulszym niż surowica czy wego do detekcji HCV-RNA w surowicy lub osoczu ludzkim. osocze. Szczegółowe badania morfologiczne przeprowa- Izolacja wirusa, oraz odwrotna transkrypcja, ampfllikacja dzone przez Aldonę Kasprzak i wsp. [7] wykazały w biopun- i detekcja odbywa się automatycznie w analizatorach ktatach od chorych z przewlekłym zapaleniem wątroby typu COBAS AmpliPrep oraz Cobas Amplicor firmy Roche Diag- C przede wszystkim zmiany w strukturze jąder hepatocytów, nostics. Test umożliwia wykrycie RNA wirusa zapalenia opisane po raz pierwszy: zmiany kształtu, obrzęk, hyper- wątroby typu C (HCV) w ludzkim osoczu, już od 10 IU/ml chromazję, zaburzenia struktury chromatynowej, zwiększe- osocza. nie liczby jąderek oraz uszkodzenia błony jądrowej. Z każdą serią próbek przebadane zostały dostarczone Amplifikacja, czyli namnożenie materiału genetycznego wi- przez producenta kontrole ujemne i dodatnie, co weryfikuje rusa umożliwia wykrycie już bardzo małej ilości cząsteczek poprawność przebiegu reakcji. Badania wykonywano wirusa w surowicy bądź osoczu. Reakcja łańcuchowa poli- w jednym powtórzeniu. merazy (PCR) w trakcie kilkugodzinnego pojedynczego pro- Badania serologiczne i molekularne wykonywano z poje- cesu enzymatycznego pozwala na powielenie (amplifikację) dynczego pobrania (badania molekularne z kolejnej próbki do 106-109 razy wyjściowej kopii odpowiedniego fragmentu pobranej od tego samego pacjenta). DNA (po odwrotnej transkrypcji RNA) o długości od kilkunastu Prowadzone badania nie obejmowały testów immunoblot, do kilkudziesięciu tysięcy par zasad. Każdy cykl w przybli- gdyż w Szczecinie nie wykonuje się testów potwierdzenia: żeniu podwaja liczbę segmentów docelowych DNA [20]. RIBA anty-HCV. Przebadano 300 osób. W badaniach skoncentrowano się Grupa badana i metody na pacjentach z grup szczególnych – pacjenci z obniżoną Porównano wyniki testów serologicznych anty-HCV z bada- odpornością (n=26), po przeszczepach narządowych, diali- niami HCV-RNA (metodą Real-Time PCR) wykonanych dla zowani (n=150), z towarzyszącymi chorobami przewlekłymi pacjentów Samodzielnego Publicznego Wojewódzkiego (n= 21). wzięto także pod uwagę pacjentów z oddziałów Szpitala Zespolonego w Szczecinie, w latach 2009-2010. dziecięcych (n=86), oraz kandydatów do zawodowej służby Badania molekularne były poprzedzone przez badania sero- wojskowej, którą stanowili młodzi mężczyźni, ze średnią logiczne, tj. jakościowe oznaczanie obecności przeciwciał wieku 28 lat (n=17). U dzieci rozpiętość wieku wynosiła od anty-HCV w osoczu, bądź surowicy metodą immunoenzy- 4 m-cy do 17 lat. matyczną (MEIA) w systemie AxSYM, firmy Abbott. Wynik Jednocześnie porównano wielkość współczynników odcię- każdego testu obliczany jest ze stosunku współczynnika cia S/CO między pacjentami. próbki do współczynnika odcięcia S/CO = Sample rate/ Cutoff rate, czyli ze stosunku wartości natężenia fluorescen- Wyniki cji badanej próbki do wartości natężenia fluorescencji punktu Spośród przebadanych 300 osób zidentyfikowano 86 pa- odcięcia (CO) dla każdej próbki badanej oraz próbki kontro- cjentów, u których wykryto przeciwciała anty-HCV w teście lnej (wg metodyki producenta). Obecność lub brak przeciw- skriningowym a nie wykryto HCV-RNA w teście jakościo- ciał anty-HCV w próbce określana jest poprzez porównanie wym metodą Real-Time PCR, oraz 4 osoby, u których nie wartości sygnału badanej próbki do sygnału dla wartości wykryto przeciwciał anty-HCV a wykryto RNA wirusa w ba- odcięcia (cutoff), określonej podczas uprzedniego przepro- daniach molekularnych. wadzania kalibracji. Próbki o wartościach S/CO<1 są uważa- Wśród 23 z przebadanych 86 pacjentów oddziałów dziecię- ne jako ujemne. Jeżeli wartość sygnału badanej próbki jest cych, oraz poradni hepatologicznych dziecięcych SPWSZ większa lub równa wartości odcięcia, próbka taka uważana Szczecin nie wykryto HCV-RNA pomimo wykrycia przeciw- jest za anty-HCV dodatnią – reaktywną (wg metodyki produ- ciał anty-HCV o wartości współczynnika S/CO między 1,15 centa). Materiał do badań serologicznych stanowiła suro- aż do 85,90 (wynik interpretowany jako dodatni). U 14 z tych wica, uzyskana poprzez odwirowanie krwi żylnej pobranej do 23 pacjentów stwierdzono przebyte WZW C (u siedmiorga probówki bez antykoagulantu. Krew pełną przechowywano dzieci matek z przebytym lub czynnym WZW C), u 4 pacjen- do czasu wykonania analizy w temp. 2-8°C. Badania wyko- tów – współistniejącą chorobą nowotworową (białaczka), u 2 nano w jednym powtórzeniu. pacjentów – niedoczynność tarczycy, u 2 pacjentów – cho- Materiał do badań HCV-RNA stanowiło osocze, uzyskane roby autoimmunologiczne (alergia,astma), oraz pojedynczo: poprzez odwirowanie krwi pełnej pobranej na antykoagulant histiocytoza X, zakażenie HSV, zakażenia CMV, zakażenie EDTA. Osocze do czasu przeprowadzenia analizy przecho- HBV, Toxoplazmoza, brak nerki, plastyka pęcherza, przepu- wywano w sterylnych probówkach polipropylenowych klina rdzeniowa, AIH, inne choroby wielonarządowe. Nie- w temp. -20°C (wg zaleceń producenta). Badania wykonano które z tych jednostek chorobowych współistniały ze sobą. za pomocą testu „Cobas AmpliPrep/Cobas Amplicor HCV Wśród 150 badanych pacjentów oddziałów Dializ, Nefrologii v 2.0” firmy Roche Diagnostics. W teście tym wykorzystuje i Transplantologii SPWSZ Szczecin i innych ośrodków diali- się odwrotną transkrypcję docelowego RNA do generacji zacyjnych u 26 nie wykryto HCV-RNA pomimo wystąpienia 374 A. Wierzbicka przeciwciał anty-HCV o wartości współczynnika S/CO wowe, oraz rzadziej testy metodami biologii molekularnej między 1,01 aż do 70,12 (wynik interpretowany jako do- w jednostkach posiadających wyspecjalizowane pracownie datni), gdzie u dwóch z nich stwierdzono przebyte WZW C, oraz sprzęt badawczy. Tymczasem obie metody mają ogra- a u pięciu – koinfekcję z WZW B. U pozostałych 19 pacjen- niczenia, wynikające z metodyki badań. Producenci testów tów nie stwierdzono objawów klinicznych odpowiadających przesiewowych podają w metodykach, iż żadna z obecnie WZW C. U dwóch pacjentów wykryto natomiast HCV-RNA dostępnych metod detekcji przeciwciał przeciw HCV nie daje pomimo braku wykrycia przeciwciał anty-HCV (współczyn- 100% gwarancji wykrycia wszystkich potencjalnie zakaźnych nik S/CO: 0,20 i 0,34). jednostek we krwi lub zakażonych osobników. Negatywny Wśród 26 pacjentów oddziału Nabytych Niedoborów Immu- wynik testu nie wyklucza możliwości ekspozycji na HCV lub nologicznych u dwóch pacjentów nie wykryto HCV-RNA samej infekcji. Z danych polskiej fundacji „Pod prąd żółtej pomimo wystąpienia przeciwciał anty-HCV o wartości rzeki”, skupiającej osoby zakażone WZW C wynika, iż jeden współczynnika S/CO 3,03 i 3,02 (wynik interpretowany jako wynik ujemny oznaczenia HCV-RNA nie uprawnia do wyklu- dodatni), gdzie u pacjenta nr 1 stwierdzono koinfekcję czenia rozpoznania zakażenia lub potwierdzenia eliminacji z WZW B u pacjenta nr 2 – przebyte WZW B oraz prawdo- wirusa u chorego na zapalenie wątroby typu C, zwłaszcza podobnie przebyte WZW C. U dwóch pacjentów wykryto przy stwierdzonych przeciwciałach anty-HCV oraz pod- HCV – RNA pomimo niewykrycia przeciwciał anty-HCV lub wyższonych aminotransferazach. W takim przypadku trzeba wykrycia przeciwciał anty-HCV o niskim współczynniku okresowo kontrolować aktywność ALT i powtarzać RT-PCR. S/CO (współczynnik S/CO odpowiednio: 0,62 i 1,27), gdzie Wiele źródeł podaje szereg czynników powodujących fał- u pacjenta nr 1 (koinfekcja HIV), współistniał głęboki niedo- szywie dodatnie wyniki badań przesiewowych w kierunku bór odporności z liczbą limfocytów CD4<200 kom/µl, wykrycia HCV: a u pacjenta nr 2 rzadki genotyp HIV 1 D (+), oraz CD • 4<250 kom/µl. U trzech pacjentów Hepatologicznej Poradni Konsultacyjnej nie wykryto HCV-RNA pomimo wystąpienia przeciwciał anty-HCV o wartości współczynnika S/CO od 1,11 do 16,01 (wynik interpretowany jako dodatni): • • pacjent nr 2 (S/CO 2,20) – łuszczyca, choroba autoim- • pacjent nr 3 (S/CO 1,11) – fałszywie dodatni wynik WR, pacjent nr 1 (S/CO 16,01) – po leczeniu WZW C, munologiczna (pacjent przyjmował Prograf), toczeń (w trakcie diagnozy), Zespół Stevensa-Johnsona, rumień, nadwrażliwość w wywiadzie. W innych przypadkach: • u 7 pacjentów z oddziału Hematologii i Onkologii nie wykryto HCV-RNA pomimo wystąpienia przeciwciał anty – HCV o wartości współczynnika S/CO od 1,17 do 1,73 (wynik interpretowany jako dodatni) • • u 1 pacjentki – nie wykryto HCV-RNA pomimo wykrycia przeciwciał anty-HCV (współczynnik S/CO 1,12) – nie- u pacjentów z obniżoną odpornością np. u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek, krioglobulinemią, w przebiegu szpiczaka mnogiego; • • • • w koinfekcji HIV, HBV; w przewlekłej białaczce limfatycznej i innych chorobach nowotworowych; w reumatoidalnym zapaleniu stawów; w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby (AIH), oraz innych chorobach autoimmunologicznych (np. lupus erythematosus systemicus); • w innych schorzeniach wątroby (hemosyderoza, hemo- • • • • w następstwie szczepienia przeciwko grypie; w innych chorobach towarzyszących (wymaga dalszych • obserwuje się ponadto wiele reakcji krzyżowych chromatoza); w przewlekłej sterydoterapii; u ciężarnych; badań); z innymi antygenami. powodzenia naturalnego rozrodu (udane zapłodnienie Ujemny wynik w teście przesiewowym anty-HCV w zależ- in vitro). ności od wyniku testu na obecność wirusowego RNA może u 10 pacjentów – nie wykryto HCV-RNA pomimo wykry- wykluczać infekcję HCV, jeśli HCV-RNA jest ujemny, co ma cia przeciwciał anty-HCV (współczynniki S/CO od 1,11 miejsce przede wszystkim u osób zdrowych, bez zaburzeń do 9,0) – wywiad w kierunku WZW C ujemny, dodat- układu odpornościowego. Natomiast ujemny anty-HCV oraz kowe badania laboratoryjne w kierunku chorób wątroby dodatni HCV-RNA świadczą o czynnej infekcji wirusowej, – w normie. prawdopodobnie u osoby z obniżoną odpornością. Dodatni wynik w teście skriningowym może potwierdzić Wśród 17 badanych mężczyzn (kandydatów do służby woj- czynną infekcję w zależności od wyników testów potwier- skowej) u 14 w badaniu przesiewowym wykryto przeciw- dzenia czy oznaczenia HCV-RNA niemniej obserwuje się ciała anty-HCV (S/CO od 1,3-4,0) natomiast nie wykryto fałszywie dodatnie wynik testu ELISA z ujemnym HCV-RNA HCV-RNA. (tab. I) [5]. Duża grupa pacjentów posiada przeciwciała przeciwko Dyskusja HCV, jeszcze kilka lat po leczeniu/samowyleczeniu W diagnostyce WZW typu C z wyżej wymienionych metod i ustąpieniu objawów, wyjątkowo mogą się one utrzymywać rutynowo stosuje się testy serologiczne – badania przesie- przez całe życie. 375 Korelacja pomiędzy badaniem anty-HCV a HCV – RNA. Problemy interpretacyjne Tabela I Interpretacja testów skriningowych anty-HCV i HCV-RNA w diagnostyce infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C. Wyniki badań ujemny ujemny anty-HCV HCV-RNA Interpretacja Wykluczenie zakażenie HCV misji Lekarskiej), u których pomimo wystąpienia przeciwciał anty-HCV nie stwierdzono cech ostrego, przewlekłego lub przebytego WZW C, obecnie lub w wywiadzie, a wyniki badań laboratoryjnych i przedmiotowych nie odbiegały od normy (u jednego pacjenta stwierdzono alergię w testach skórnych). Po wykonaniu badań HCV-RNA oraz pełnej diag- dodatni Potwierdzenie czynnej infekcji HCV nostyki w kierunku chorób wątroby wszyscy zostali sklasyfi- HCV-RNA (prawdopodobnie u osoby z zaburze- kowani przez lekarza orzekającego jako w pełni zdolni do niami układu odpornościowego) zawodowej służby wojskowej z adnotacją w dokumentacji Wykluczenie zakażenia HCV medycznej o nosicielstwie nieswoistych przeciwciał. Brak dodatni ujemny anty-HCV HCV-RNA dodatni (prawdopodobnie fałszywie dodatni prawidłowo przeprowadzonej pełnej diagnostyki w takich wynik testu anty-HCV), lub możliwość przypadkach może skutkować uznaniem kandydata jako przebycia infekcji HCV niezdolnego do służby wg § 44 pkt. 9 (Dz. Ust. Nr 146 z dnia Potwierdzenie czynnej infekcji HCV 16.12.1995 r.). W przypadku kandydata do ubezpieczenia na HCV-RNA życie prawidłowa interpretacja badań serologicznych w kierunku wirusowego zapalenia wątroby typu C może przesądzać o warunkach ubezpieczenia lub odrzuceniu wniosku. Powyższe wnioski znajdują odzwierciedlenie w badaniach Powyższa wiedza może pozwolić na uniknięcie niepotrzeb- własnych i dotyczą one ozdrowieńców oraz pacjentów diali- nej „stygmatyzacji” pacjentów jeszcze przed postawieniem zowanych, po przeszczepach narządowych, gdzie występu- ostatecznej diagnozy a co za tym idzie daje możliwość nie je nieprawidłowe działanie układu odpornościowego. wdrażania pochopnie niepotrzebnego leczenia, czy kosz- U niektórych chorych pomimo stwierdzenia obecności townych procedur medycznych. wirusa we krwi nie obserwuje się wytworzenia przeciwciał, Ponieważ u części pacjentów brak jest świadomości, co do co skutkuje fałszywie ujemnymi wynikami badań przesiewo- możliwości bycia nosicielem WZW C (zasada „mnie to nie wych w kierunku wykrycia HCV. Powodem może być pozos- dotyczy”), oraz objawy są niespecyficzne i trudne do przypi- tawanie pacjenta w tzw. „okienku serologicznym”, czyli sania WZW C, pacjent nie trafia do specjalisty, którego w okresie pomiędzy zainfekowaniem a wytworzeniem się wiedza, doświadczenie i możliwości pozwolą na zdiagnozo- przeciwciał – trwa ono przeciętnie kilka miesięcy (najczęściej wanie choroby. W wielu przypadkach testy laboratoryjne między 10 a 14 tygodniem od zakażenia), a poszczególni dają sprzeczne wyniki, a diagnostyka jest niepełna pacjenci wykazują dość znaczne różnice w szybkości lub/i oparta często tylko na badaniach przesiewowych, lub wytworzenia się tych przeciwciał. U części osób zakażonych innych niespecyficznych dla WZW C testach laboratoryj- zachodzi zjawisko serokonwersji, tj. poziom przeciwciał nych (np. ALT, AST, GGTP, ALP, LDH, BIL). Ponadto wielu spada poniżej progu wykrywalności [5]. U pewnej grupy cho- pacjentów nie reaguje na obecnie stosowane leczenie rych nigdy nie dochodzi do wytworzenia się anty-HCV, (w zależności od stanu pacjenta, przewlekłości choroby, np. u pacjentów immunosupresyjnych, części dializowanych, genotypu wirusa itp.) albo nie kończy leczenia z powodu z agammaglobulinemią. Problem diagnostyczny stanowią zbytniego nasilenia skutków ubocznych. więc chorzy, u których nie są wytwarzane przeciwciała anty- W Polsce i na świecie prowadzono wiele badań dotyczących HCV np. z powodu nieprawidłowej czynności układu odpor- korelacji pomiędzy badaniami serologicznymi a molekular- nościowego. Osoby takie, choć faktycznie zakażone, nie są nymi u różnych grup osób, przy czym skupiono się w nich „wyłapywane” w badaniach epidemiologicznych [9]. W bada- także na wielkości współczynnika S/CO testu przesiewo- niach własnych brak wykrycia przeciwciał anty-HCV zaob- wego. Oszacowanie wyniku ilościowego anty-HCV wyra- serwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV, z uwagi żonego jako proporcja S/CO daje dodatkowe istotne infor- jednak na małą ilość badanych pacjentów nie są to wartości macje, np. wszystkie wyniki wysoko dodatnie (S/CO>8) istotnie statystycznie. znajdują potwierdzenie w teście RIBA [5]. Przykładami takich W badaniach autorów bydgoskich u dzieci z zakażeniami badań są badania Instytutu Hematologii i Transfuzjologii mieszanymi HBV i HCV wykazano, iż częstość serokon- w Warszawie z 2005 r. [11]. HCV-RNA wykryto u 18% wersji w układzie HBeAg/anty-Hbe (utrata antygenu HBe dawców krwi z przeciwciałami anty-HCV. Częstość wykrywa- i pojawienie się we krwi przeciwciał Anty-HBe) występowała nia HCV-RNA zależała od wartości S/CO testu przesiewo- istotnie statystycznie częściej po nadkażeniu HCV, niż u nie wego. Przy wartości współczynnika S/CO>4,0 HCV-RNA leczonych dzieci z WZW B. Można przypuszczać, że nad- wykryto u 65% osób. Niskie wartości S/CO w teście EIA każenie HCV mobilizuje układ immunologiczny na drodze szczególnie w populacji o niskim ryzyku zakażenia, jaką jest uruchomienia kaskady cytokin [10]. grupa dawców krwi, z dużym prawdopodobieństwem Ciekawą grupę stanowią także przytoczeni w artykule młodzi reprezentują tzw. wyniki fałszywie dodatnie (tzw. BFP). mężczyźni (roczniki 1968-1985) żołnierze lub kandydaci do Wśród przyczyn wymienia się szczepienia przeciwko grypie służby wojskowej (skierowani z Terenowej Wojskowej Ko- czy obecność autoprzeciwciał. Do podobnych wniosków 376 A. Wierzbicka doszli Zofia Moraczewska i wsp. [12] badając HCV-RNA wśród ujemnych w testach przesiewowych, gdzie powyższe wyniki polskich dawców krwi oraz preparatach osoczopochodnych. nie zostają potwierdzone w metodach Western Blot lub diag- W badaniach poza krajem na uwagę zasługują badania nostyką molekularną. Współczynnik S/CO testu przesiewo- indyjskie. W badaniach tych ustalony został algorytm postę- wego anty-HCV może być pomocny w oszacowaniu ryzyka powania z dawcami krwi w bankach krwi w bankach krwi. infekcji. Jeśli dawcy mieli dodatni wynik testu przesiewowego wg autorów powinni być oni poinformowani w banku krwi o wysokim odsetku wyników fałszywie dodatnich, oraz o znaczeniu alternatywnych badań w wyspecjalizowanym laboratorium. W przypadku pozytywnego badania dawcy w drugim ośrodku powinien on być skierowany do hepatologa celem dalszej diagnostyki, w tym na dodatkowe testy anty-HCV i HCV-RNA. Negatywne lub niejasne wyniki badań testów immunoblot wymagałyby badania RNA. Badania indyjskie ujawniły wysoki poziom fałszywie dodatnich wyników badań przesiewowych wśród dawców krwi. Spośród 57 próbek pozytywnych z banku 23 próbki (45%) dały wynik badania negatywny krwi zarówno w teście MEIA AxSYM HCV (Abbott) jak i w teście potwierdzenia LIA (INNO-LIA HCV Ab III, Innogenetics) [13]. Także w badaniach amerykańskich Robert Dufour i wsp. [14] w programie badawczym przebadali 17418 pacjentów. 2986 (17,1%) próbek było anty-HCV pozytywnych a 490 (16,4%) miało współczynnik S/CO <3,7 (tzw. „nisko pozytywny”). Wykorzystano testy przesiewowe III generacji anty-HCV (Ortho Clinical Diagnostics). Test RIBA wykonano u 263 pacjentów z wynikiem nisko pozytywnym. Wyniki: 86% – ujemne, 12% – nieokreślony, a tylko 2% – pozytywny. Zwrócono uwagę, iż współczynnik S/CO jest ważny w oszacowaniu ryzyka infekcji. Laboratorium powinno raportować współczynnik S/CO wraz z rezultatami testu anty-HCV EIA i zlecać uzupełniające testy RIBA w przypadku uzyskania nisko pozytywnej wartości testu przesiewowego, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie. W badaniach meksykańskich analizując wyniki badań dawców krwi autorzy doszli do wniosków, iż bardzo niski poziom przeciwciał anty-HCV jest czynnikiem predykcyjnym fałszywie dodatnich rezultatów badań [15]. Do podobnych wniosków doszli badacze z Turcji i Chin [17,18]. Wnioski Diagnostyka WZW C jest często trudna a wyniki badań niejednoznaczne. Wiąże się to z występowaniem nietypowych grup pacjentów, np. dializowanych, po przeszczepach, z wrodzonymi/nabytymi niedoborami odporności, lub z towarzyszącymi innymi jednostkami chorobowymi. W celu stwierdzenie bądź wykluczenia WZW C u nietypowych grup pacjentów: dializowanych, po przeszczepach, z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami odporności, bądź towarzyszącymi innymi chorobami należy stosować pełen panel badawczy, tj. testy przesiewowe (poziom przeciwciał anty-HCV), testy potwierdzenia (metody immunoblot), testy molekularne (oznaczenie HCV-RNA), oraz testy biochemiczne mierzące poziom enzymów wątrobowych. Należy zawsze pamiętać o możliwości wystąpienia wyników fałszywie dodatnich bądź Piśmiennictwo 1. Stefan Mauss, Jurgen K. Rockstroh, Hans Jager: Zapalenie wątroby a zakażenie HIV; Urban & Partner, Wydanie I polskie, Wrocław 2004:1- 6 2. Szczeklik A, Gajewski P. rozdz. Choroby wątroby; Choroby wewnętrzne. Medycyna Praktyczna, Kraków, Wydanie I; 2009: 514-523 3. Jabłońska J, Ząbek J, Loch T i wsp. Krioglobulinemia u chorych zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C. Część I – wybrane aspekty kliniczne. Hepatol Pol 1999; 6: 165-170. 4. Magdzik W. Epidemiologia wirusowych zapaleń wątroby typu B i C w Polsce, z uwzględnieniem dzieci. Hepatol Pol 1997; 4 (supl.1): 5-9 5. Madaliński K. Badania przeglądowe zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu C; Abbott Voice 2009; 2: 3-6 6. Jabłońska J, Ząbek J, Madaliński K i wsp. Pozawątrobowe objawy zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C, Reumatologia 2009; 47: 364-367 7. Kasprzak A, Biczysko W, Adamek A i wsp. Morphological lesions detected by light and electron microscopes in chronic type B hepatitis. Pol J Pathol 2003; 54: 129-142. 8. Majerowicz S, Grief C, Ferguson D i wsp. In situ hybridization of hepatitis C virus RNA in liver cells of an experimentally infected rhesus macaque. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2004; 99: 629-631. 9. Wawrzynowicz-Syczewska M. Diagnostyka Serologiczna Zakażeń Wirusami Hepatotropowymi. Abbott Voice 2005; 3(12): 3-9 10. Pawłowska M, Halota W. Zakażenia mieszane HBV i HCV u dzieci z uwzględnieniem badań własnych. Przeg Epidemiol. 2003; 57: 459-464. 11. Brojer E. Badania serologicznych i molekularnych markerów HCV u dawców krwi w Polsce. Przeg Epidemiol. 2005; 59: 511-517. 12. Moraczewska Z i wsp. Wykrywanie RNA HCV wśród polskich dawców krwi oraz preparatach osoczopochodnych. Acta Haematologica Polonica 2000; 31: 391-397. 13. Raghuraman S, Subramaniam T, Daniel D i wsp. Occurrence of False Positives during Testing for Antibodies to Hepatitis C Virus among Volunteer Blood Donors in India. Journal of Clinical Microbiologyl 2003; 4: 1788-1790. 14. Dufour R D, Talastas M, Fernandez M i wsp. Low-Positive AntiHepatitis C Virus Enzyme Immunoassay Results: An Important Predictor of Low Likelihood of Hepatitis C Infection. Clinical Chemistry 2003; 49: 479-486. 15. Contreras AM, Mendez C i wsp. Very low hepatitis C antibody levels predict false-positive results and avoid supplemental testing. Transfusion 2008 Dec; 48: 2540-2548. 16. Madaliński K, Godzi P, Zimmermann-Górska I i wsp. Anty-HCV oraz HCV-RNA u chorych z pierwotnym zespołem Sjögrena. Przegl Epidemiol 2009; 63: 299-304. 17. Klesi R, Ozdemir M, Kurtoglu MG i wsp. Evaluation and comparison of three different anti-hepatitis C virus antibody test based on chemiluminescence and enzyme-linked immunosorbent assay methods used in the diagnosis of hepatitis C infections in Turkey. J Int Med Res 2009 sep-oct; 37: 1420-1429. 18. Rao HY, Ren FR, Guan WL i wsp. Evaluation of the performance of the Eiagen HCV test for detection of hepatitis C virus infection. J Virol Methods 2009; 162: 203-207. 19. Patel K i wsp. Diagnosis and treatment of chronic hepatitis C infection. BMJ 2006, 332: 1013-1017. 20. Bartkowiak J. Badania Molekularne w rozpoznawaniu i różnicowaniu chorób zakaźnych. Przegl Epidemiol 2003; 57:381-389. 377 Korelacja pomiędzy badaniem anty-HCV a HCV – RNA. Problemy interpretacyjne Adres do korespondencji: Laboratorium Centralne Samodzielny Publiczny Szpital Zespolony Ul. Arkońska 4, 71-455 Szczecin Tel. (91) 813 95 85 e-mail: [email protected] (Praca wpłynęła do Redakcji: 2011-01-10) (Praca przekazana do opublikowania: 2011-02-06) 378
