Antywirulentny potencjał białek fagowych
advertisement
2017-01-25 Antywirulentny potencjał białek fagowych Grażyna Majkowska-Skrobek Zakład Biologii Patogenów i Immunologii Instytut Genetyki i Mikrobiologii UWr IMMUNOGENNOŚĆ BAKTERII PATOGENNOŚĆ BAKTERII BAKTERIOFAGI BIAŁKA FAGOWE 1 2017-01-25 Bakteriofagi fagoterapia Gruzja 1920-1940 1915-1917 F. Twort (1877-1950) antybiotykoterapia A. Fleming (1881-1955) F. d’Herelle (1873-1949) terapia oparta na fagach i ich białkach Bakteriofag (gr. phagein-jeść) 1031 108 LIZA 2 2017-01-25 rząd Caudivirales • • • • 96% znanych fagów gospodarze: Eubacteria i Archaea ikozaedralna główka + ogonek, brak osłonki (płytka podstawna, włókna, haczyki) liniowe dsDNA rodzina Myoviridae 8 rodzajów [25% fagów ogonkowych, opisanych1300] rodzinaSiphoviridae 9 rodzajów [61% fagów ogonkowych, opisanych ponad 3200] rodzinaPodoviridae podrodzina Autographivirinae (3 rodz.) podrodzina Picovirinae (2 rodz.) 6 rodzajów [14% fagów ogonkowych, opisanych 750] DEPOLIMERAZY 1. Rozpoznanie i adsorbcja faga do komórki Cykl lityczny 2. Wprowadzenie DNA fagowego do komórki i degradacja DNA gospodarza 3. Synteza wczesnych białek wirusowych ENDOLIZYNY 4. Replikacja genomu i synteza późnych białek wirusowych 5. Składanie i dojrzewanie 6. Uwalnianie 3 2017-01-25 Bariery na powierzchni bakterii GRAM + GRAM -- Adsorbcja – degradacja polisacharydów otoczkowych liazy alginatowe hialuronidazy endosialidazy depolimerazy alginat hialuronian kwas polisialowy amyloworan polisacharydy Klebsiella (K-antygen) 4 2017-01-25 Adsorbcja – degradacja LPSu endoramnozydazy Adsorbcja – degradacja peptydoglikanu VAPGHs – virion-associated peptidoglycan hydrolases Exoliziny = lizyny strukturalne 1. lizozym (gp5 fagaT4) 2. transglikozylazy (gp16 fagaT7; białko P7 faga PRD1) 3. N-acetyl-muramoylamidases 4. Glukozaminidazy 5. endopeptydazy (białko P5 faga phi6 ; Tal2009 fagaTuc2009) 5 2017-01-25 Klebsiella pneumoniae Jeden z najczęstszych czynników zakażeń • w szpitalu • poza szpitalem • Zakażenia dróg moczowych • Ropnie wątroby • Zakażenia łożyska krwi (urosepsis, odcewnikowe) • Zapalenie płuc • Zakażenia skory i tkanki podskórnej • Zapalenie otrzewnej • Zapalenie dróg żółciowych • Zapalenie opon m-rdz ANTYBIOTYKI – penicyliny, wczesne cefalosporyny, fluorochinolony – leki I rzutu – cefalosporyny III generacji – „cudowne” leki lat 1980-90 – aminoglikozydy– „rezerwa” – karbapenemy – leki „ostatniej szansy” – szczepy wielooporne, szpitale, ciężkie zakażenia Klebsiella pneumoniae Paczosa et al. 2016 6 2017-01-25 a) b) c) d) e) f) KP15 Myoviridae family KP27 Myoviridae family KP16 Siphoviridae family KP36 Siphoviridae family KP32 Podoviridae family KP34 Podoviridae family Kęsik-Szeloch et al. Virology Journal 2013 łysinka halo murawa Plaque morphology of KP36 on K. pneumoniae 486 7 2017-01-25 Produkcja rekombinowanych depolimeraz Dodanie Adeniny (wektor zakończony Tyminą) Oczyszczanie produktów PCR PCR Polimeraza Dream Taq Produkt PCR LIGACJA 8 2017-01-25 SEKWENCJA DEPOLIMERAZY atggcactatacagagaaggcaaagcggctatggccgcagacggaaccgttaccgggactggcacaaaatggcaatcttcgctttcgctgattcgcccaggcgcgacgattatgtttttgtcgtc accaattcaaatggccgtcgtaaacaaggtg gttagcgatactgaaattaaagccatcaccacaaacggcgctgtcgtagcgtctagcgattacgcgatcctgttaagtgactcacttaccgttgacggtctggcgcaagatgttgctgaaactct gcgctactatcagtcacaggaaaccgtgatcgc ggatgcagtcgagttcttcaagaactttgatttcgattccctgcaagatcttgctaaccaaattaatgcagactctgaatctgcacaatcaagcgctgcggctgctgctgcgtctgaaaatgcggccaaaacttcagagaataacgccaagtcttcaga ggtggctgcggagaatgcaagagaccaagttcagcagatcattaatgacgctggagacgcatcaacactggttgtgctggcgaatcctgatggatttaggcacatagggcgttgcaaagatattgccactctgaggacaattgagccagtagaa agccggcaggttattgaggttctaagctactacaacggcttggcacaaggaggcggaacattctggtacgatcctaacgattcagtaactgaggacaatggcgggagttgtattgtcacaaatggcggaaagcgctggaagcgaatcattgacg gagcggtagatgttttgagctttggagccaagccagacgatataagttttgatagcgcccctcacattcaagccgcacttgacaaccatgacgcagtatcattgtacggacgcagctattatatc ggaagcccgatctatatgccgtcaaggactgtgt tcgatggtatgggaggaaagctaacctccatagctccaagcacggctggcttcatggctgggtcaatcttcgcgcctggaaactaccacccagacttttgggaagaggttccgaaggtagcggcc accacgacgcttgggagtgccaacatcac gctggcagatccgaatatagtgaacgttggagacatcatccggctttcgtcaaccactggtgtcctgagcgccgggttcttcgtttccgagtatctacagatggcccgcgtcttgagtaagacag gcaatgtcatcacgattgatggcccggttgaatc gcagcttacgttggtggcagctaatgccaaccagccagggtatcttgcgcgcttcaataaaccgttgttctgctgtgtcgattcaataattcagaatatcgaaatcgatacctgggattactggactgccgactcagcaacttataacgtaaaattctcga atatatggggttcagcaaaggcagtggcctatggcaacaccttctgccgttcacttttcgaggatatacggattgttttctccgggcgtgtatcggagttggcttttgggtcgcatgacacgaac ctagttcgcatcacggctattgccagccctaaaggct tatctgcatcagttgtctttggttgggctgaatctggcaggcgctgcacgattgataccttttctatcatgttgaacgctaatgctaatcccagcacggtaattcgtgtatctggtcatcgggat agcttgatcaagaacggaagcatatatgtccataacaa caccaataatatccttagcgtcgagaactatggcactaccgctgatggtgttagaccagattgcgacaacataacgttcgagaacgtgagcatcttcgtaactggatcatctgctgtagtgtgtg atgtatataaatccgccgacaactcggttattaaa aatgttgcgtttaaaaacataaaatatttcgggcctacaccaagcgtcgcattataccgcgctcgcggaacgttggcgaatttcgtgaagggagttcaggcgaacatatcttccgatactggcgg agccattgttctcagcaattcggaaaataacgtt ctgacatttaccggcccggtgagcgttacatcgctcgtctctgctgccgcaaaaaatacgttgtccatcagaaactatgccagatctagcgcgaaggcgaacaatttcacgcaagagtctacctt gaacgtgactgatactacggcaaacgctgtca gcaaagaatttacatatcctgctggctctctcagaattaacgataagatcaagctgtcgttgggtggtagtacggctgggactgtcggtaaaaagaccgtacaggtgggtttcattgggtctgac ggtgcgttcaagtacgttgagttggcagctttggc aaccgatcaagtatattggacgatggaggttgaaatatcgttcctcaggacgacgaatagccagacaaatgagcttgagacctcggctattatcacttccttcctttcgaagggtgcggctaccggcgcggcattatctggctcaagggcgctggcg gttgtgtcggatttagcgctctcgaattttgtcgtccaagttcgcgcctggaaggaaaatgcggcagatggattgtcactgtcaagaatgaatcttcagttagaagatttgacggca taa Produkcja rekombinowanych depolimeraz cd. indukcja ekspresji IPTG zebranie komórek bakteryjnych przez wirowanie E.coli 9 2017-01-25 Produkcja rekombinowanych depolimeraz cd. 1. lizat (przed nałożeniem na kolumnę) 2. 3. oczyszczone białko Majkowska-Skrobek et al. Viruses 2016 Charakterystyka depolimeraz 10 2017-01-25 120 Relative activity [%] Charakterystyka depolimeraz 100 80 60 40 20 0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 62 70 80 Relative activity [%] pH 120 100 80 60 40 20 0 20 Tm=65OC 37 45 56 temperature [°C] Majkowska-Skrobek et al. Viruses 2016 Anty-wirulentny potencjał depolimeraz in vivo Galleria mellonella 100 24h po infekcji % survival PBS 107 CFU 80 107 CFU + depoKP36 60 107 CFU after depoKP36 treatment * 40 n = 30 p < 0.003 * 20 0 0 24 48 72 time post infection (h) Majkowska-Skrobek et al. Viruses 2016 11 2017-01-25 Anty-wirulentny potencjał depolimeraz in vitro 300 control depoKP32 (10 μg/ml) depoKP32 (50 μg/ml) depoKP32 (100 μg/ml) survivial rate (%) 250 200 150 100 50 0 0 1 2 3 time (h) ENDOLIZYNY TERAPIA FAGOWA LIZA BAKTERII IDENTYFIKACJA I DETEKCJA BAKTERII DEPOLIMERAZY UWRAŻLIWIENIE BAKTERII NA CZYNNIKI ANTYBAKTERYJNE I MECHANIZMY UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO 12 2017-01-25 BIOLOGIA MOLEKULARNA klonowanie ekspresja oczyszczanie interakcje BIOINFORMATYKA identyfikacja przewidywanie struktury dokowanie modelowanie homologii BIOLOGIA STRUKTURALNA krystalizacja określenie struktury przestrzennej Kryształy depoKP36 Institute of Biostructures and Bioimaging, National Research Council, Naples 13