Szczerbakowa - IHAR

Ziemniak Polski 2008 nr 1
1
Genetyka i hodowla
MIĘDZYGATUNKOWE
MIĘDZYGATUNK WE
MIESZAŃCE SOMATYCZNE ZIEMNIAKA
ZIE NIAKA
dr Anna Szczerbakowa
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa
e-mail: [email protected]
W
spółczesne odmiany ziemniaka
uprawnego powstawały w ciągu
dziesięcioleci w procesach hodowlanych w wyniku krzyżowań generatywnych,
w tym również z gatunkami dzikimi. Jednakże odrębność gatunków zawęża możliwości
krzyżowań międzygatunkowych do gatunków
spokrewnionych i nie pozwala na szerokie
wykorzystanie puli genowej Solanum do
ulepszania np. cech odporności ziemniaka
na choroby. Barierę krzyżowalności można
ominąć, stosując metodę somatycznej hybrydyzacji, która polega na połączeniu (fuzji)
protoplastów izolowanych z komórek somatycznych i wyprowadzeniu z nich mieszańców.
Protoplasty poddane fuzji tworzą heterokariony (komórki powstałe z połączenia protoplastów dwóch różnych gatunków) o różnej
proporcji DNA: symetryczne – o jednakowej
ilości DNA z protoplastów obu rodziców, asymetryczne – o różnej ilości DNA z protoplastów obu rodziców lub cybrydy, zawierające
DNA jądrowe z protoplastu jednego z rodziców, a chloroplasty i mitochondria z obu.
Hybrydyzacja somatyczna daje możliwości przeprowadzenia bardzo dużej liczby
kombinacji międzygatunkowych niezależnie
od stopnia pokrewieństwa, ploidalności i
płodności łączonych gatunków. Doskonalenie metod regeneracji i selekcji mieszańców
somatycznych o pożądanych cechach pozwala otrzymywać mieszańce w ciągu pół
roku od momentu przeprowadzenia fuzji protoplastów. Metoda hybrydyzacji somatycznej
jest jednak obarczona niedogodnościami,
które zostaną omówione poniżej.
Głównymi etapami hybrydyzacji somatycznej są: (1) izolacja protoplastów z form
rodzicielskich, (2) fuzja protoplastów i selekcja mieszańców, (3) kultura i regeneracja
mieszańców, (4) weryfikacja mieszańców i
analiza dziedziczenia cech (Wielgat, Wasilewska 2001). Protoplasty otrzymuje się najczęściej z miękiszu liści po strawieniu ścian
komórkowych odpowiednimi enzymami. Maceracja enzymatyczna jest możliwa jedynie
w przypadku roślin z hodowli in vitro na odpowiednich pożywkach. U roślin polowych
lub szklarniowych ściany komórkowe nie są
podatne na trawienie przy użyciu enzymów
w stężeniu nie uszkadzającym samej komórki.
Podstawą uzyskiwania regenerantów z
pojedynczych komórek somatycznych jest
właściwość totipotencji roślin, tzn. możliwość
regeneracji całej rośliny z dowolnej, wyodrębnionej komórki. Stopień totipotencji roślin
odmian ziemniaka jest na ogół wyższy w porównaniu z totipotencją roślin dzikich gatunków, np. S. bulbocastanum i S. pinnatisectum, przy zastosowaniu tych samych warun-
2
Ziemniak Polski 2008 nr 1
ków izolacji i regeneracji. W przypadku fuzji
międzygatunkowych połączone protoplasty
różnych gatunków wytwarzają merystemy,
nawet gdy protoplasty jednego z gatunków
rodzicielskich nie są do tego zdolne. Brak totipotencji ułatwia selekcję mieszańców międzygatunkowych, wykluczając obecność roślin dzikiego gatunku wśród regenerantów.
Względna łatwość otrzymywania i fuzji
protoplastów roślinnych nie oznacza automatycznie sukcesu w regeneracji roślin mieszańcowych w warunkach in vitro. Szybkość
i skuteczność regeneracji zależy m. in. od
ilości i jakości użytych protoplastów, o czym
decydują wiek i morfologia roślin rodzicielskich, oraz od totipotencji ich komórek. Za
pośrednictwem fuzji chemicznej lub fuzji w
polu elektrycznym (elektrofuzji) można łą-
czyć protoplasty dowolnych, nie spokrewnionych gatunków, omijając bariery krzyżowalności międzygatunkowej. Jednakże w wielu
wypadkach proces regeneracji zatrzymuje
się na etapie kilku podziałów heterokarionu
lub na etapie nie różnicującego się kalusa
(tzn. zespołu komórek powstałych z kolejnych podziałów heterokarionu). Etap kalusa
zwykle decyduje o powodzeniu regeneracji,
ponieważ wtedy powstają (lub nie) merystemy zarodkowe, dające początek pędom, po
odcięciu i ukorzenieniu których otrzymujemy
regeneranty mieszańcowe, zawierające genomy obydwóch rodziców (fot. 1). Z każdego
różnicującego się kalusa zwykle odcina się
jeden pęd, z którego po ukorzenieniu i namnożeniu powstaje jeden klon.
Fot. 1. Otrzymywanie mieszańców somatycznych. A: heterokarion (strzałka) w 1. dniu po fuzji protoplastów, powiększenie 500×; B: powstawanie pędu (strzałka) na kalusie w 8. tygodniu po fuzji, powiększenie 4×; C: mieszaniec somatyczny pomiędzy psianką czarną (nie wytwarza bulw) a ziemniakiem uprawnym, klon NT-98-119
Wstępnej identyfikacji mieszańców dokonuje się na podstawie mieszanej morfologii
uzyskanych regenerantów (Szczerbakowa i
in. 2003b). Udowodnienie mieszańcowości
odbywa się na podstawie analizy DNA mieszańców w porównaniu z DNA form rodzicielskich. Opisując pochodzenie zweryfikowanych mieszańców somatycznych, stosujemy symbol „+” pomiędzy formami rodzicielskimi (P1 + P2), zamiast symbolu „×” (P1 ×
P2) używanego do oznaczania pochodzenia
mieszańców generatywnych. Względna łatwość oraz szybkość metody hybrydyzacji
somatycznej (regeneranty można otrzymać
w ciągu dwóch miesięcy od dnia przeprowadzenia fuzji) decydują o jej atrakcyjności w
otrzymywaniu mieszańców pomiędzy różnymi, nawet oddalonymi gatunkami. Atutem
mieszańców somatycznych, w porównaniu z
generatywnymi, jest posiadanie cytoplazmy
pochodzącej od obydwóch rodziców, co
może być ważne w przekazywaniu cech ko-
Ziemniak Polski 2008 nr 1
dowanych przez DNA chloroplastowe i mitochondrialne. Mankamentem zaś jest częściowa lub pełna sterylność mieszańców somatycznych, wynikająca z odległego pokrewieństwa form rodzicielskich. Trudności w otrzymywaniu generatywnego potomstwa mieszańców somatycznych ziemniaka są częściowo rekompensowane wegetatywnym
rozmnażaniem ziemniaka i możliwością namnożenia wartościowego materiału mieszańcowego poprzez bulwy.
Hybrydyzacja somatyczna dwóch różnych
diploidalnych (2x) gatunków ziemniaka zwykle prowadzi do powstania mieszańców o
różnej ploidalności, zarówno spodziewanych
tetraploidów (4x), jak i heksaploidów (6x)
oraz rozmaitych aneuploidów, które utraciły
od kilku do kilkunastu chromosomów w ciągu
wieloetapowego procesu regeneracji protoplastów. Wśród regenerantów znajdują się
również chimery – rośliny odznaczające się
mozaikowatością tkanek o różnym pochodzeniu i różnej ploidalności.
Selekcja stabilnych mieszańców symetrycznych i mniej stabilnych, ale wartościowych mieszańców asymetrycznych na podstawie cytologicznego obrazu chromosomów
jest trudna, gdyż chromosomy ziemniaka i
spokrewnionych z nim gatunków są bardzo
małe i słabo zróżnicowane. Dlatego mieszańce identyfikuje się za pomocą techniki
cytometrii przepływowej, pozwalającej ocenić ploidalność na podstawie zawartości jądrowego DNA.
Metoda hybrydyzacji somatycznej zyskiwała coraz większą popularność od końca
lat 70. XX wieku. Synteza mieszańców somatycznych pomiędzy oddalonymi, nie krzyżującymi się w środowisku naturalnym gatunkami wydawała się niezmiernie atrakcyjnym sposobem korzystania z zasobów genowych roślin dzikich dla tworzenia nowych odmian roślin uprawnych. Metoda ta, operując
komórkami somatycznymi, rozszerza granice
krzyżowań międzygatunkowych możliwych
do przeprowadzenia metodami genetyki klasycznej, wzbogaca germplazmę roślin
uprawnych, wykorzystuje zmienność pierwotną odległych gatunków, nie potrzebuje
genów markerowych do selekcji mieszańców, nie budzi oporu społecznego i zastrzeżeń etycznych jak w przypadku roślin genetycznie modyfikowanych (GMO). Jest szcze-
3
gólnie przydatna w przekazywaniu do roślin
uprawnych, w tym ziemniaka, cech determinowanych zarówno przez geny główne, jak i
tzw. geny mniejsze, warunkujące cechy ilościowe, np. odporności na niektóre choroby
(zaraza ziemniaka) lub czynniki abiotyczne
(mróz czy susza). Przykładem może być
wprowadzenie do ziemniaka uprawnego
trwałej niespecyficznej (horyzontalnej) odporności na zarazę z meksykańskiego dzikiego diploidalnego gatunku S. bulbocastanum poprzez syntezę płodnego odpornego
mieszańca somatycznego, a następnie serię
krzyżowań z ziemniakiem uprawnym (Helgeson i in. 1998).
W pracy przeglądowej Wielgat i Wasilewskiej (2001) zostały podsumowane dane dotyczące prób międzygatunkowej hybrydyzacji
somatycznej ziemniaka wykonanych od końca lat 70. do końca lat 90. XX wieku. W cytowanych pracach jako źródła odporności na
choroby oraz czynniki abiotyczne występują
zarówno dzikie gatunki wytwarzające bulwy
(S. acaule, S. berthaultii, S. bulbocastanum,
S. chacoense, S. circaeifolium, S. commersonii, S. papita, S. phureja, S. pinnatisectum, S. torvum), jak i gatunki nie wytwarzające bulw (S. brevidens, S. etuberosum, S. nigrum).
W pierwszych latach XXI wieku ukazały
się nowe doniesienia dotyczące syntezy odpornych na różne choroby międzygatunkowych mieszańców somatycznych ziemniaka
z dzikimi gatunkami. Na przykład odporność
na alternariozę z dzikiego diploidalnego gatunku S. brevidens wprowadzono do ziemniaka uprawnego poprzez krzyżowania generatywne pomiędzy wcześniej wyselekcjonowanym mieszańcem somatycznym S. tuberosum (+) S. brevidens (Austin i in. 1986) i
odmianami Katahdin oraz Atlantic użytymi
jako zapylacze (Tek i in. 2004). Wykorzystywanie techniki hybrydyzacji somatycznej w
badaniach genetycznych oraz w hodowli
ziemniaka uprawnego zostało omówione w
pracy przeglądowej Orczyka i innych (2003).
Na podstawie obszernie cytowanej literatury
światowej autorzy odnotowali szczególne
osiągnięcia zastosowania tej metody, m. in.
w przypadku introgresji kompleksowej odporności na choroby z dzikiego gatunku S. brevidens (odporność na wirusy A, X, Y i liściozwoju ziemniaka, na mokrą zgniliznę bulw i
4
Ziemniak Polski 2008 nr 1
zarazę ziemniaka) oraz tolerancji na mróz i
zdolności adaptacji do niskiej temperatury z
S. commersonii do pokoleń generatywnych
międzygatunkowych mieszańców somatycznych. Autorzy podkreślili ważność tej metody
dla syntezy tetraploidalnych linii ziemniaka
hodowlanego z nowymi kombinacjami cech
właściwych dla wyjściowych linii di(ha)ploidalnych.
Niestabilność genetyczna oraz sterylność
są głównymi przyczynami ograniczonego
wykorzystania mieszańców somatycznych
pomiędzy taksonomicznie odległymi gatunkami Solanum jako źródła nowej zmienności
genetycznej w programach hodowlanych
ziemniaka. Na przykład w wypadku mieszańców S. nigrum (+) S. tuberosum, skrajnie odpornych na różne szczepy Phytophthora infestans o szerokim spektrum wirulencji
(Zimnoch-Guzowska i in. 2003), krzyżowania
generatywne z ziemniakiem uprawnym dotychczas nie doprowadziły do uzyskania dojrzałych nasion.
W mieszańcach somatycznych ziemniaka
diploidalnego ze spokrewnionymi diploidalnymi dzikimi gatunkami wytwarzającymi bulwy (Szczerbakowa i in. 2003a) często jest
obserwowane obniżenie odporności na czynnik chorobotwórczy w porównaniu z odpornością dzikiego gatunku rodzicielskiego. W
takich wypadkach krzyżowania generatywne
z odpowiednio dobranymi zapylaczami powinny prowadzić do uzyskania dojrzałych nasion i otrzymania w potomstwie form o podwyższonej odporności.
Podobnie jak krzyżowania generatywne
pomiędzy różnymi gatunkami/odmianami roślin powszechne w praktyce hodowlanej
krzyżówki somatyczne pozwalają rozszerzyć
pulę genową roślin uprawnych, korzystając z
naturalnych zasobów genowych mniej lub
bardziej spokrewnionych roślin dzikich o cechach pożądanych przez hodowców, przede
wszystkim ich naturalnej odporności na choroby. Szybkie zmiany w populacjach czynników chorobotwórczych w następstwie zmian
klimatycznych i cywilizacyjnych, globalny
wzrost produkcji żywności i jednoczesny
wzrost kosztów ochrony roślin uprawnych
przed chorobami, dążenie konsumentów do
spożywania zdrowej i bezpiecznej żywności
oraz próby ograniczania użycia chemicznych
środków ochrony roślin dyktują potrzebę ko-
rzystania z mechanizmów obronnych wykształconych przez poszczególne dzikie gatunki roślin. Oczywiście, niektóre z tych mechanizmów prowadzą do wytwarzania związków niekorzystnych w roślinach uprawnych.
Jednak zróżnicowany charakter mechanizmów obronnych pozwala mieć nadzieję na
wyodrębnienie bezpiecznych ich składników,
które po wprowadzeniu do mieszańców roślin uprawnych będą je skutecznie chronić
przed chorobami lub szkodnikami. Synteza i
badanie właściwości oddalonych mieszańców roślin uprawnych z wykorzystaniem
techniki hybrydyzacji somatycznej, przyspieszającej i upraszczającej tworzenie mieszańców, jest jednym z ważnych etapów w poznawaniu i gromadzeniu wiedzy na temat
funkcjonowania i praktycznego wykorzystywania naturalnych mechanizmów obronnych
roślin.
Literatura
1. Austin S., Ehlenfeldt M. K., Baer M. A., Helgeson
J. P. 1986. Somatic hybrids produced by protoplast fusion between Solanum tuberosum and Solanum
brevidens: phenotypic variation under field conditions.
– Theor. Appl. Genet. 71: 682-690; 2. Helgeson J. P.,
Pohlman J. D., Austin S., Haberlach G. T., Wielgus
S. M., Ronis D., Zambolim L., Tooley P., McGrath J.
M., James R. V., Stevenson W. R. 1998. Somatic hybrids between Solanum bulbocastanum and potato: a
new source of resistance to late blight. – Theor. Appl.
Genet. 96: 738-742; 3. Orczyk W., Przetakiewicz J.,
Nadolska-Orczyk A. 2003. Somatic hybrids of Solanum tuberosum – application to genetics and breeding.
– Plant Cell Tissue Organ Cult. 74: 1-13;
4. Szczerbakowa A., Bołtowicz D., Lebecka R., Radomski P., Wielgat B. 2003a. Characteristics of the
interspecific somatic hybrids Solanum pinnatisectum
(+) S. tuberosum H-8105. – Acta Physiol. Plant. 27:
317-325; 5. Szczerbakowa A., Borkowska M., Wielgat B. 2000. Plant regeneration from the protoplasts of
Solanum tuberosum, S. nigrum and S. bulbocastanum.
– Acta. Physiol. Plant. 22: 3-10; 6. Szczerbakowa A.,
Maciejewska U., Zimnoch-Guzowska E., Wielgat B.
2003b. Somatic hybrids Solanum nigrum (+) S.
tuberosum: morphological assessment and verification
of hybridity. – Plant Cell Rep. 21: 577-584; 7. Tek A.
L., Stevenson W. R., Helgeson J. P., Jiang J. 2004.
Transfer of tuber soft rot and early blight resistances
from Solanum brevidens into cultivated potato. – Theor. Appl. Genet. 109: 249-254; 8. Zimnoch-Guzowska E., Lebecka R., Kryszczuk A., Maciejew-
Ziemniak Polski 2008 nr 1
ska U., Szczerbakowa A., Wielgat B. 2003. Resistance to Phytophthora infestans in somatic hybrids of
Solanum nigrum L. and diploid potato. – Theor. Appl.
Genet. 107: 43-48; 9. Wielgat B., Wasilewska D.
5
2001. Hybrydyzacja somatyczna pomiędzy dzikimi i
uprawnymi gatunkami ziemniaka. – Biotechnologia 2:
9-15