1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…) 324 geny WT TNF

Współdziałanie szlaków
sygnałowych zależnych od
czynników transkrypcyjnych HSF1
i NFκB
Patryk Janus
Opiekun pracy: Prof. Dr hab. Piotr Widłak
Przebieg pracy:
I.
Identyfikacja genów zależnych od NFκB, których ekspresja ulega zmianie w obecności
aktywnej formy HSF1:
1.
Całogenomowe profilowanie ekspresyjne w komórkach U2-OS w warunkach hipertermii i/lub stymulacji
cytokiną TNFα:
a) przeprowadzenie eksperymentu – stymulacja komórek HS i/lub TNFα,
b) analiza mikromacierzowa – Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix),
c) normalizacja i analiza otrzymanych danych mikromacierzowych.
2.
Analiza funkcjonalna:
a) wybór genów up- i down-regulowanych w różnych wariantach traktowania HS i/lub cytokiną
TNFα,
b) wykorzystanie internetowych baz danych umożliwiających klasyfikację wybranych genów do
określonych ścieżek sygnałowych i procesów biologicznych – Gene Ontology, KEEG Pathway,
PANTHER.
II.
Identyfikacja genów zależnych od NFκB, z których promotorami wiąże się HSF1:
1.
ChIP - sequencing
2. ChIP – real-time PCR  kinetyka wiązania się aktywnego czynnika HSF1 do promotorów wybranych
genów zależnych od NFκB:
a) bioinformatyczna analiza promotorów genów zależnych od NFκB, których ekspresja ulega
zmianie w obecności aktywnego HSF1 (wg danych mikromacierzowych, wg danych ChIP-seq)
b) przeprowadzenie eksperymentu – stymulacja komórek HS i immunoprecypitacja chromatyny
z przeciwciałem anty-HSF1
c) przeprowadzenie reakcji real-time PCR dla wybranych genów
1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)
a) przeprowadzenie eksperymentu
U2OS WT
WT K
WT TNF
WT HS/TNF
-1,5h
-0,5h
-1,5h
-0,5h
U2OS TG
0h
1,5h
0h
1,5h
0h
1,5h
TNFα
HS
-1,5h
TG K
-1,5h
-0,5h
-1,5h
-0,5h
0h
1,5h
0h
1,5h
TNFα
TG TNF
TNFα
-0,5h
TNFα 10 ng/ml
WT HS
HS
-1,5h
-0,5h
0h
1,5h
b) analiza mikromacierzowa
c) normalizacja i analiza otrzymanych danych mikromacierzowych
HS
43°C
1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)
Liczba genów posiadająca w obszarze promotorowym motyw dla czynnika NFκB
lub/i czynnika HSF1 (wg bazy GO)
NFκB consensus
4542
343
1189
HSF1 consensus
18 966 genów poddanych analizie
metodą mikromacierzy
1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)
Wpływ szoku termicznego (HS) lub obecności aktywnego czynnika HSF1 (aHSF1) na zmianę
profilu ekspresji genów potencjalnie zależnych od NFκB lub HSF1
1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)
Zmiana profilu ekspresji genów aktywowanych cytokiną TNFα (TNF) w komórkach
typu „dzikiego” (WT) stymulowanych HS lub w komórkach z ekspresją
konstytutywnie aktywnego czynnika HSF1 (TG)
WT TNF (WT TNF vs WT K)
324 geny
218
(WT HS/TNF vs WT K)
(wzrost lub spadek ekspresji)
24
114
(TG TNF vs TG K)
250
1748 genów
274 geny
(wzrost lub spadek ekspresji)
(wzrost lub spadek ekspresji)
141 genów
(wzrost lub spadek ekspresji)
(WT HS/TNF vs WT HS)
1170 genów
(wzrost lub spadek ekspresji)
(TG TNF vs WT K)
1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)
WT TNF (WT TNF vs WT K)
324 geny
218
(WT HS/TNF vs WT K)
(wzrost lub spadek ekspresji)
24
114
(TG TNF vs TG K)
250
1748 genów
274 geny
(wzrost lub spadek ekspresji)
(wzrost lub spadek ekspresji)
141 genów
(wzrost lub spadek ekspresji)
(WT HS/TNF vs WT HS)
1170 genów
(wzrost lub spadek ekspresji)
(TG TNF vs WT K)
2. Analiza funkcjonalna
WT TNF (WT TNF vs WT K)
324 geny
(wzrost lub spadek ekspresji)
% genów o zmienionej ekspresji
Gene Ontology
12
8
10
„X” - liczba genów o zmienionej ekspresji
8
6
4
2
0
4
8
6
4
3
10
7
15
3
8
23
8
4
4
3
1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)
WT TNF (WT TNF vs WT K)
324 geny
(wzrost lub spadek ekspresji)
Z motywem dla
NFκB
Z motywem dla
HSF1
INNE
182
113
29
1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)
WT TNF (WT TNF vs WT K)
324 geny
(wzrost lub spadek ekspresji)
Z motywem dla
NFκB
113
Z motywem dla
HSF1
29
INNE
182
Geny z motywem dla NFκB:
ADAMTS6 ARAP2 ARL14 ATF3 AZIN1 BCL2A1 BDKRB1 BDNF BIRC2 BIRC3 BTG2 C14orf43 C19orf21 C3orf52 CCL2 CCL20 CCNL1 CD83 CEP135 CHRND
CHST3 COL12A1 CYP27B1 CYR61 DCAF12 DNAJC30 DNASE2 DUSP2 EDN1 EGR1 EGR2 EGR4 EHD1 EPB41L2 ETS1 ETS2 FAM179A FAM46C FAM82B
FEM1C FOSB FOSL1 FRMD6 GADD45B GEM GJB3 HIST1H1A HMGCS1 HOXA3 IFNGR2 IKBKB IL17RD IL8 INHBA IRF1 IRF2BPL ITPRIPL2 KBTBD2
KCTD11 LAMB3 LIF MAP2K3 MED26 MSX1 NACC2 NFKB1 NFKBIA NFKBIE NR2F2 NR4A1 NR4A2 PCDH7 PMEPA1 PPP1R15A PSG2 PTX3 REL RELB
RHOB RPS19BP1 RRAD S1PR1 SAT1 SDC4 SLC12A7 SMAD7 SQSTM1 TBC1D1 TGIF1 TIPARP TMEM126B TMEM170A TNFAIP3 TNFRSF9 TNIP1 TRAF5
TRAK1 TRIM47 UPF2 USP37 USP46 WDR1 WDR24 ZC3H10 ZCCHC9 ZFP36 ZFP90 ZNF133 ZNF140 ZNF398 ZNF441 ZNF805 ZNF827
+
aHSF1
GeneSymbol WT TNF vs WT K TG TNF vs TG K
ADAMTS6
ARAP2
ARL14
ATF3
AZIN1
BCL2A1
BDKRB1
BDNF
BIRC2
BIRC3
BTG2
C14orf43
C19orf21
C3orf52
CCL2
CCL20
CCNL1
CD83
CEP135
CHRND
CHST3
COL12A1
CYP27B1
CYR61
DCAF12
DNAJC30
DNASE2
DUSP2
EDN1
EGR1
EGR2
EGR4
EHD1
EPB41L2
ETS1
ETS2
FAM179A
FAM46C
1,37
0,70
2,90
2,19
1,22
3,24
2,39
0,64
1,33
7,27
1,67
1,57
0,86
1,70
8,26
10,24
1,57
4,73
1,26
1,04
0,85
1,19
2,00
1,30
0,95
0,90
1,18
2,10
1,80
2,23
3,39
2,37
1,30
1,25
1,43
1,85
0,92
1,51
1,30
1,12
2,64
1,17
1,12
4,49
3,34
0,72
1,38
5,81
1,62
1,41
0,98
1,99
6,14
6,01
1,10
4,39
1,22
1,00
0,97
1,11
1,24
1,06
1,00
1,06
1,00
1,25
1,55
0,91
0,96
0,91
1,44
1,11
1,49
1,97
1,00
1,38
GeneSymbol WT TNF vs WT K TG TNF vs TG K
FAM82B
FEM1C
FOSB
FOSL1
FRMD6
GADD45B
GEM
GJB3
HIST1H1A
HMGCS1
HOXA3
IFNGR2
IKBKB
IL17RD
IL8
INHBA
IRF1
IRF2BPL
ITPRIPL2
KBTBD2
KCTD11
LAMB3
LIF
MAP2K3
MED26
MSX1
NACC2
NFKB1
NFKBIA
NFKBIE
NR2F2
NR4A1
NR4A2
PCDH7
PMEPA1
PPP1R15A
PSG2
PTX3
0,88
1,45
4,05
1,55
1,09
1,52
1,68
0,74
0,74
1,30
0,80
1,32
1,12
0,83
8,81
1,63
3,37
0,81
0,84
1,25
1,46
1,61
1,44
1,12
1,19
1,32
0,79
3,21
2,87
2,26
0,80
1,55
1,64
0,79
0,81
1,56
0,99
10,10
0,91
1,08
1,61
1,22
1,20
1,03
1,56
0,89
0,94
1,25
0,93
1,20
1,01
1,00
4,18
1,74
2,39
0,91
0,99
1,07
1,50
1,58
1,49
1,16
1,04
1,16
0,89
3,11
1,38
1,90
0,82
0,94
0,91
1,01
0,95
1,30
1,00
11,06
GeneSymbol
REL
RELB
RHOB
RPS19BP1
RRAD
S1PR1
SAT1
SDC4
SLC12A7
SMAD7
SQSTM1
TBC1D1
TGIF1
TIPARP
TMEM126B
TMEM170A
TNFAIP3
TNFRSF9
TNIP1
TRAF5
TRAK1
TRIM47
UPF2
USP37
USP46
WDR1
WDR24
ZC3H10
ZCCHC9
ZFP36
ZFP90
ZNF133
ZNF140
ZNF398
ZNF441
ZNF805
ZNF827
WT TNF vs WT K TG TNF vs TG K
2,72
3,44
1,37
0,90
1,43
0,91
1,44
1,46
2,03
1,33
1,29
0,94
0,84
1,61
0,93
1,16
9,12
1,78
1,21
0,75
0,89
1,34
0,92
0,85
0,90
1,14
0,97
0,78
0,88
1,85
0,87
0,72
1,23
0,97
0,97
1,20
0,75
2,42
2,78
1,01
0,88
1,23
1,02
1,12
1,27
1,69
1,19
1,12
1,01
1,02
0,96
0,95
0,88
3,40
2,46
1,25
0,93
0,99
1,43
0,95
0,95
0,99
1,08
1,00
0,90
0,92
1,11
1,01
0,85
1,12
1,00
1,00
0,98
0,90
Geny ze zmienionym poziomem ekspresji pod wpływem tgHSF1 >= 20%:
GeneSymbol
WT TNF vs WT K
TG TNF vs TG K
Różnica w %
EGR2
TNFAIP3
EGR4
FOSB
EGR1
IL8
NFKBIA
ATF3
NR4A2
CCL20
DUSP2
TIPARP
ZFP36
NR4A1
CYP27B1
ARAP2
GADD45B
CCNL1
IRF1
BDKRB1
BCL2A1
TNFRSF9
RHOB
CCL2
FEM1C
TMEM170A
SAT1
HIST1H1A
PCDH7
FOSL1
BIRC3
3,39
9,12
2,37
4,05
2,23
8,81
2,87
2,19
1,64
10,24
2,10
1,61
1,85
1,55
2,00
0,70
1,52
1,57
3,37
2,39
3,24
1,78
1,37
8,26
1,45
1,16
1,44
0,74
0,79
1,55
7,27
0,96
3,40
0,91
1,61
0,91
4,18
1,38
1,17
0,91
6,01
1,25
0,96
1,11
0,94
1,24
1,12
1,03
1,10
2,39
3,34
4,49
2,46
1,01
6,14
1,08
0,88
1,12
0,94
1,01
1,22
5,81
71,7
62,7
61,4
60,2
59,1
52,6
52,1
46,8
44,4
41,3
40,3
40,2
40,1
39,0
37,9
37,3
32,4
29,6
29,2
28,5
27,9
27,6
26,2
25,7
25,1
24,2
22,1
21,6
21,4
21,2
20,0
II. Identyfikacja potencjalnych sekwencji HSE
1. Bioinformatyczna analiza promotorów genów zależnych od NFκB
ze zmienionym profilem ekspresji pod wpływem tgHSF1 >=20%
Konsensus dla HSF1
EGR2
tctcccgcaaccccaggagcaagcctactaaagggtttctctgcatcgttgttattttactttctggctctggaatctggacaaagcaaattggaatctggcatgagtttgctactcttttaatagccctgatacatcttggagtgccccatttagtcgggcatttttacaggtctattttaaaga
aagttgtttctttgttggatttttaatcaaaacaaaaaagttcaaatgcttaatagtagggaccatggtacatgtttgtattcaactctcacattctccatccccacacccctccacctccagcacagtatcttgctcagtaaaccctttggagtttttacttgtccgcacttctttcttttctcacct
cttcttgtctccaggaaggatactgtggggctagcttctcttatgacagcgcctattagtatgctggctttgtgccagcctggctattccatccacagtctaggtctggagagcccaagaactcaaattctccctttacagtgggcagggggcgtgtccatgacagtcccttcctccttgcctgt
agaaagccctgacctcagctttgctctcctcagaaatggcaaagaaaggagatgaaattggcggaggcggcctgattcttccctagtgggctgagtcaggctcccaatcctcaaagaagtgttcacttttcagacctgggttttcctgagggcacgatgtagcgaccactgtgcgctgtact
tggattcagaagacccagctgcaagtttggacacgaccacttaccagctacgtgactttaggcaagccactttagctttctgagcttatccacagggtggctggcttgaaagggtgcgccttgattctgttccattatctgcactacccatatttaagggttggtacttcaagagacactcaa
aaaaacaaaggttacgagagttatctactgacttgtttcagcggaggttcaataaaggcctcccaggactggccccaggcattccctggcctccccgcagctgccgcccgtccccgcccccactccattccctgcgcaccccaggct(…….4210………) ATG
EGR4
ttctcaaaagaagcccaattatttcaagtactgattccagggagatatttcccacggattccctgtgtgttgctgggatcaacatccttagagcgaaagccatttgtatgaaggcagaaaaaatgttctgcagaagcatctcataccctgtgggtgagggaggagtgagcaggaattggcc
ctacttttctggaagacaatttgccagttgtctatcaaaattttacatatactttggcacacaattacactcgttggaatttatctcacagacacattcacatttatatagtcaaggatgttgactccaacaacattggtataagtaaaaagttggaaactgcctacatgctcatggatagggg
acaaatcgactaactcaaggtcctcccttacaatggagtactatacagccttgaaaaagaatgacaagatctttatgtcaggacatggcacaatctctaagttatttcaagtgaaaaaataataataataataatattgcagaacaatgtgtatggttggatatacataaaattcttctga
aagaatacccaagaaacttaaatgtggctacctcaggagctaggaatgaaggtaggtggagaggagggacttttacttttcaatttagaatataccctgttgtgctagttgactttcctcctactgttaacaagtattacagtcctttttaatttaaattatttttcctagcacaaatttaaaaa
aaaaaaacttaaaatggaaaaacacacaggcgtgagcaaaagaaatgaatggcaataatctctgtggtttactgagtgcgcctggacatttatgtgctctcagtttctctccacaggaaatgcacaggtgagaaactgacgttaagggggactgagtgtcaagctagttagtggcaga
gggcagattcaaacccaacacggtcctcccctgctgcccctcggcctctgcctccaggtgggaagcgcatctaccggacggtcggcccggtgaggcgcagcgccccagactggcgcatccgcggccccagcgctccacgcctggggagcgcgcgcgcacgcagcggcgcgagcctggc
ggcggcggcgacaacaacaacgtcacagctcgagctttccttttcgggagtccccggcacacatcctgtgtccatgtttgggcatttacgtcacggcggcagggccggggcctcccaaaATG
EGR1
cgggcaatcagcttccccacttcggtcccccaaaggtgggctctttgccggcggggactagggaacagcctttcggttccgggggagcacaggggaccccaggcaccagcagccccatcccaccgacaggtggcagaggcaaggcagctcactgctatacagtgtcccaagaaccaa
gtggccgtgacttcctatcctcaatttcccagcgacacccggaaagacaccgtgccatagatcgaggcccggggtcaaggccccgcctctcctgggcggcccctgcccaggcgggcccagccgctcctcccccgcactcccggttcgctctcacggtccctgaggtgggcgggcgggccct
ggatgacagcgatagaaccccggcccgactcgccctcgcccccgctctgggtctgggcttccccagcctagttcacgcctaggagccgcctgagcagccgcgcgcccagcgccacacgccacgagccctccccgcctgggcgtccccggatcccgcgagcgctcgggctcccggcttgg
aaccagggaggagggagggagcgagggagcaaccagctgcgacccggaaatgccatataaggagcaggaaggatcccccgccggaacaacccttatttgggcagcaccttatttggagtggcccgatatggcccggccgcttccggctctgggaggagggaagaaggcggaggga
ggggcaacgcgggaactccggagctgcgcgggtcccggaggccccggcggcggctagagctctaggcttccccgaagcctgggcgcctgggatgcgggcgcgggcgcgggccctagggtgcaggatggaggtgccgggcgctgtcggatggggggcttcacgtcactccgggtcctc
ccggccggtcctgccatattagggcttcctgcttcccatatatggccatgtacgtcacgacggaggcggacccgtgccgttccagacccttcaaatagaggcggatccggggagtcgcgagagatcccagcgcgcagaacttggggagccgccgccgccatccgccgccgcagccagct
tccgccgccgcaggaccggcccctgccccagcctccgcagccgcggcgcgtccacgcccgcccgcgcccagggcgagtcggggtcgccgcctgcacgcttctcagtgttccccgcgccccgcatgtaacccggccaggcccccgcaactgtgtcccctgcagctccagccccgggctgca
cccccccgccccgacaccagctctccagcctgctcgtccaggATGgccgcggc…
II. Identyfikacja potencjalnych sekwencji HSE
2. Przeprowadzenie eksperymentu
3. Analiza