Kwasy nukleinowe DNA
advertisement
PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA Nukleotydy i kwasy nukleinowe Nukleotydy zasada O reszta kwasu ortofosforowego - O 5’ P - O PURYNA adenina guanina O 4’ cukier 3’ H OH H H OH H 5 6 1 N 3 2 N N CH2 HOCH2 O 4 PIRYMIDYNA cytozyna tymina uracyl H 2-deoksyryboza 1’ 2’ HOCH2 O H OH H H OH OH ryboza H N 6 7 5 9 4 8 N 1 3 N N 2 Nukleotydy O - O O P CH2 - - O 5’ P N CH2 - O O O 4’ 1’ monofoforan nukleozydu O O - O O P O P CH2 nukleotyd O difoforan nukleozydu O - O O - O 5’ P - O O N CH2OH O O P wiązanie N-glikozydowe - - 2’ 3’ wiązanie estrowe O P CH2 - 4’ 1’ O 3’ 2’ trifoforan nukleozydu nukleozyd Fragment łańcucha kwasu nukleinowego koniec 5’ łańcucha zasada fosforan 5’ N O 4’ cukier 1’ 2’ 3’ zasada fosforan 5’ N O wiązanie fosfodiestrowe 4’ cukier 3’ 1’ zasada 2’ N fosforan 5’ O 4’ cukier wiązanie fosfodiestrowe 3’ koniec 3’ łańcucha OH 2’ 1’ Kwasy nukleinowe DNA kwas deoksyrybonukleinowy koduje informację o budowie i działaniu całego organizmu RNA kwas rybonukleinowy bierze udział w rozkodowywaniu informacji zawartej w DNA O - O P CH2 - O monofoforan nukleozydu O - O O O P - O O P - O O P CH2 - O trifoforan nukleozydu DNA dATP, dGTP, dCTP, dTTP RNA ATP, GTP, CTP, UTP Podwójna helisa DNA komplementarne parowanie zasad G C A T Enzymy restrykcyjne 5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’ 3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’ Alu I AGCT TCGA 5’ GGTACCAATTCAAAG 3’ 3’ CCATGGTTAAGTTTC 5’ Hind III 5’ GGTACCAATTCAA 3’ AAGCTT 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ TTCGAA Kpn I GGTACC CCATGG 5’ CTTATG 3’ 3’ GAATAC 5’ 5’AGCTTATG 3’ 3’ATAC 5’ 5’ GGTAC 3’ 5’CAATTCAAAGCTTATG 3’ 3’ C 5’ 3’ CATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAA AGCTTATG 3’ |||||||||||||||||||| | 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA ATAC 5’ Hind III 5’ GGTACCAATTCAA AGCTTATG 3’ |||||||||||||||||||| | 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA ATAC 5’ AAGCTT TTCGAA 5’ GGTACCAATTCAA 3’ 5’AGCTTATG 3’ ||||||||||||| ||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ 3’ATAC 5’ Hind III 5’ GGTACCAATTCAA 3’ 5’AGCTTATG 3’ ||||||||||||| ||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ 3’ATAC 5’ ligaza 5’ GGTACCAATTCAA AGCTTATG 3’ |||||||||||||||||||| | 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA ATAC 5’ Klonowanie DNA DNA zawierający wstawkę, którą chcemy przeklonować trawienie enzymem restrykcyjnym wstawka wektor trawienie enzymem restrykcyjnym ligacja wektora ze wstawką plazmid ze wstawką gotowy do wprowadzenia do bakterii Hybrydyzacja jednoniciowa wyznakowana sonda komplementarna do cząsteczki A mieszanina jednoniciowych cząsteczek DNA hybrydyzacja w warunkach ostrych tylko cząsteczka A tworzy stabilną dwuniciową cząsteczkę hybrydyzacja w warunkach łagodnych cząsteczki A, C i E tworzą stabilne dwuniciowe cząsteczki Hybrydyzacja denaturacja DNA w celu uzyskania jednoniciowych cząsteczek inkubacja błony z jednoniciową wyznakowaną radioaktywnie sondą DNA Sekwencjonowanie DNA 5’ GCATATGTCAGTCCAG 3’ CGTATACAGTCAGGTC 3’ 5’ dwuniciowy DNA denaturacja 5’ GCATATGTCAGTCCAG 3’ 3’ CGTATACAGTCAGGTC 5’ przyłączenie znakowanego startera 5’ GCAT 3’ 3’ CGTATACAGTCAGGTC jednoniciowy DNA (matryca do sekwencjonowania) 5’ GCAT 3’ 5’ Sekwencjonowanie DNA 5’ GCAT 3’ 3’ CGTATACAGTCAGGTC 5’ ddATP ddTTP polimeraza DNA polimeraza DNA + dATP, dTTP, dCTP, dGTP ddCTP polimeraza DNA ddGTP polimeraza DNA GCAT A GCAT AT GCAT ATGTC GCAT ATG GCAT ATGTCA GCAT ATGT GCAT ATGTCAGTC GCAT ATGTCAG GCAT ATGTCAGTCCA GCAT ATGTCAGT GCAT ATGTCAGTCC GCAT ATGTCAGTCCG elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Sekwencjonowanie DNA ddATP ddTTP ddCTP ddGTP G A C C T G A C T G T A A T C G 3’ 5’ Reakcja PCR mieszanina reakcyjna sekwencja docelowa dwuniciowa matryca DNA bufor starter1 starter2 dNTP polimeraza Taq Cykl syntezy DNA w reakcji PCR etap 1 - denaturacja matrycy etap 2 - przyłączenie starterów etap 3 - wydłużanie starterów CYKL 1 denaturacja 94C jednoniciowa matryca DNA CYKL 1 przyłączenie startera do matrycy 40-65C starter 1 starter 2 CYKL 1 wydłużanie startera 72C starter 1 starter 2 powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej CYKL 2 denaturacja matrycy 94C matryca DNA, który powstał w cyklu 1 CYKL 2 przyłączenie startera do matrycy 40-65C CYKL 2 wydłużanie starterów 72C powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej powstają cząsteczki o długości sekwencji docelowej temperatura Profil termiczny reakcji PCR 94°C 3 min 1x 15x 1x 94°C 15s 65°C 15s 72°C 30s 72°C 30s 4°C czas cykl podstawowy cykle dodatkowe Część praktyczna 0,35 kb B2 B1 0,6 kb A1 A2 mieszanina A: startery A1 i A2 mieszanina B: startery B1 i B2 plazmid pUC18/cDNAPPRas2 ze wstawką 0,8 kp A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1,35 kb 1,08 kb 0,87 kb 0,6 kb 0,35 kb 0,6 kb 0,31kb 0,28 kb 0,23 kb 0,19 kb 1 - wzorce wielkości 2, 3, 4 - produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii) 5 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu 6 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji A, do której nie dodano żadnej matrycy 7 - produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii) 8 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu 9 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji B, do której nie dodano żadnej matrycy 10 - wzorce wielkości