Streszczenie Profil transkryptomiczny komórek jądrzastych krwi

Streszczenie
Profil transkryptomiczny komórek jądrzastych krwi obwodowej psów z niewydolnością
mięśnia sercowego
W ostatnich latach nastąpił rozwój metod umożliwiających prowadzenie badań nad
molekularnym podłożem chorób serca. Przeprowadzono wiele doświadczeń obejmujących
identyfikację genów, których patologiczna ekspresja może prowadzić do niewydolności serca.
W niniejszej pracy doktorskiej dokonano po raz pierwszy profilowania ekspresji genów
w komórkach jądrzastych krwi obwodowej psów z niewydolnością mięśnia sercowego. Psy z
rozpoznaną chorobą serca klasyfikowano do grup na podstawie klasyfikacji ISACHC (ang.
International Small Animal Cardiac Health Council), jako: klasa ISACHC 1 (pacjenci bez
objawów klinicznych) – 13 psów, klasa ISACHC 2 (pacjenci z objawami od łagodnej do
umiarkowanej niewydolności serca) – 13 psów oraz klasa ISACHC 3 (pacjenci z
zaawansowaną niewydolnością serca) – 12 psów. Grupę kontrolną stanowiło 14 psów
zdrowych.
Spośród ponad 4,5 tysiąca transkryptów, których ekspresja różniła między sobą badane
grupy, wyodrębniono następujące zbiory genów: geny zależne od niewydolności serca – 71
genów, których ekspresja zmieniła się w każdej z badanych grup, niezależnie od stopnia
zaawansowania choroby; 83 geny zależne od klasy ISACHC 1; 1247 genów zależnych od klasy
ISACHC 2 oraz 200 genów zależnych od klasy ISACHC 3. Stwierdzono, że geny zależne od
niewydolności serca zaangażowane są w dwa receptorowe szlaki sygnałowe: angiotensinR - >
CREB/ELK-SRF/TP53 signalling oraz ephrinR - > actin signalling. Wśród genów zależnych
od niewydolności serca zidentyfikowano geny kodujące α-SMA, które mogą być potencjalnymi
biomarkerami tej choroby. W oparciu o przeprowadzone badania stwierdzono, że profil
transkryptomiczny komórek jądrzastych krwi obwodowej jest prawdopodobnie
odzwierciedleniem stanu klinicznego pacjenta, ponieważ największa liczba genów o
zmienionej ekspresji została zidentyfikowana w klasie ISACHC 2.
W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie miRNA krążącymi w osoczu, ponieważ
cząsteczki te regulują ekspresję genów oraz typowane są jako potencjalne biomarkery wielu
chorób. Z tego powodu w dalszej części pracy doktorskiej zbadano ekspresję dziewięciu
miRNA w osoczu krwi obwodowej jamników z niewydolnością mięśnia sercowego. Badane
miRNA zostały wybrane na podstawie danych literaturowych pochodzących z medycyny
ludzkiej.
Analiza ekspresji genów za pomocą metody Real-time PCR wykazała, że ekspresja
dwóch miRNA była istotnie obniżona: ekspresja miR-30b różniła klasę ACVIM B
(odpowiednik klasy ISACHC1) od psów zdrowych; natomiast ekspresja miR-133b różniła
klasę ACVIM C (odpowiednik klasy ISACHC 2) od psów zdrowych.
Za pomocą internetowej bazy danych TargetScan zidentyfikowano geny docelowe dla
cfa-miR-30b oraz cfa-miR-133b i stwierdzono, iż miR-30b, reguluje ekspresję 7 spośród 71
genów zależnych od niewydolności serca oraz 10 spośród 83 genów zależnych od klasy
ISACHC 1; natomiast miR-133b reguluje ekspresję 1 spośród 71 genów zależnych od
niewydolności serca oraz 38 spośród 1247 genów zależnych od klasy ISACHC 2. Na podstawie
przeprowadzonych badań można wnioskować, iż cfa-miR-30b oraz cfa-miR-133b regulują
ekspresję genów w komórkach jądrzastych krwi obwodowej psów z niewydolnością mięśnia
sercowego.
Abstract
The transcriptomic profile of peripheral blood nuclear cells in dogs with heart failure
In recent years advances have been made in the investigative methods of molecular
background of canine heart disease. Studies have been conducted to identify specific genes
which, when pathologically expressed, could lead to the dysfunction of the canine heart.
In the present Ph.D. thesis a whole genome microarray analysis was used for the first
time to describe the transcription profile of peripheral blood nuclear cells in dogs with heart
failure. Dogs with recognized heart disease were classified according the ISACHC
(International Small Animal Cardiac Health Council) classification scheme as class 1
(asymptomatic) - 13 dogs, class 2 (mild to moderate heart failure) - 13 dogs and class 3 (severe
heart failure) - 12 dogs. The control group consisted of 14 healthy dogs.
Four sets of differentially expressed genes were identified, namely heart-failure-specific
genes and ISACHC1-specific genes, ISACHC2-sepcific genes and ISACHC-3 specific genes.
The most important set consisted of genes differentially expressed in all dogs with heart failure,
despite the ISACHC stage. There were 71 heart-failure-specific genes identified which were
involved in two statistically significant receptor signalling pathways, namely angiotensinR - >
CREB/ELK-SRF/TP53 signalling and ephrinR - > actin signalling. The number of ISACHC1specific genes was 83; ISACHC2-specific genes - 1247 and ISACHC3-specific - 200. Among
heart-failure-specific genes were α-SMA, which can be a potential biomarker of heart failure
in dogs. The transcriptomic profile of peripheral blood nuclear cells in dogs with heart failure
seems to reflect the presence of clinical signs of the disease in patients based on the observation
that the largest number of differentially expressed genes was identified in ISACHC 2 group of
patients.
Discovery of miRNAs circulating in biofluids such as plasma or serum encouraged
researchers to use them as potential biomarkers. Moreover, the transcription profile of many
genes can be influenced by miRNAs. That is why the aim of the second part of the study was
to analyse the expression of 9 miRNAs described in literature as being involved in
cardiovascular pathology in the plasma of dogs suffering from heart failure.
Expression analysis using the Real-time PCR method revealed that two miRNAs were
significantly downregulated: the expression of miR-30b differed between ACVIM stage B
(ISACHC1) and stage A (healthy) dogs; the expression of mi-133b differed ACVIM stage C
(ISACHC 2) and stage A (healthy) dogs.
Using an online database – TargetScan predicted targets of canine miR-30b and miR133b were found: 7 out of 71 heart-failure-specific genes and 10 out of 83 ISACHC1-specific
genes are predicted targets of canine miR-30b; 1 out of 71 heart-failure-specific genes and 38
out of 1247 ISACHC2-specific genes are predicted targets of canine miR-133b. Undertaken
experiments allowed to conclude that cfa-miR-30b and cfa-miR-133b can regulate the
expression of genes in the peripheral blood nuclear cells of dogs suffering from heart failure.