Lekowrażliwość a zdolność tworzenia biofilmu przez Candida sp.

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 171 - 187
Emilia Ciok-Pater, Agata Białucha, Eugenia Gospodarek, Agnieszka Ostafin
Lekowrażliwość a zdolność tworzenia biofilmu przez Candida sp.
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy
Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK
Ocenę lekowrażliwości przeprowadzono u 50 szczepów Candida sp. izolowanych z krwi i moczu od chorych hospitalizowanych, wykorzystując testy
ATB FUNGUS 2 INT (bioMérieux) oraz E-testy z worikonazolem, posakonazolem, kaspofunginą i anidulafunginą (AB BIODISK). Zdolność tworzenia
biofilmu oceniano metodą redukcji TTC na powierzchni 5 biomateriałów:
lateksie silikonowanym, silikonie, polichlorku winylu, nylonu i polipropylenu.
Stwierdzono, że szczepy oporne na antymikotyki częściej tworzyły biofilm
na powierzchni badanych biomateriałów.
W ostatnich latach notuje się wzrost częstości występowania zakażeń szpitalnych
o etiologii Candida sp. Zakażenia te są poważnym problemem terapeutycznym doprowadzającym często do zgonu chorego oraz selekcji i rozprzestrzeniania się w środowisku
szpitalnym szczepów opornych na leki przeciwgrzybicze. Grzyby posiadające zdolność
tworzenia biofilmu wykazują zwiększoną zjadliwość i oporność na antymikotyki (2, 7, 9).
Wśród antymikotyków stosowanych w profilaktyce i leczeniu zakażeń o etiologii
grzybiczej wymienia się: polieny, azole, antymetabolity, alyllaminy oraz echinokandyny (1,
4, 11). Każda z tych grup, zgodnie z właściwościami farmakokinetycznymi oraz zakresem
działania, jest stosowana w leczeniu określonych klinicznych postaci grzybic (4). Leki
przeciwgrzybicze stosowane w medycynie przynoszą okresową poprawę stanu klinicznego chorych, eliminując uwalniane drobnoustroje planktoniczne, ale nie niszczą struktury
biofilmu (14, 15).
Celem pracy była ocena wpływu lekowrażliwości Candida sp. na zdolność tworzenia
biofilmu na powierzchni wybranych biomateriałów.
MATERIAŁ I METODY
Badaniem objęto 50 szczepów Candida sp. izolowanych w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy Collegium Medicum
im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy UMK w Toruniu. Szczepy izolowano: z krwi - 23
(46,0%), z krwi pobranej z cewnika typu Broviac - dwa (4,0%), z moczu - 20 (40,0%) oraz
172
Nr 2
E. Ciok-Pater i inni
z moczu pobranego przez cewnik urologiczny - 5 (10,0%) od chorych hospitalizowanych.
Pochodzenie szczepów przedstawiono w tabeli I.
Tabela I. Pochodzenie szczepów Candida sp. (n=50) objętych badaniem
Szpital Uniwersytecki nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy
Szpital
Ogółem
Klinika
Gatunek
Klinika Anestezjologii
i Intensywnej Terapii
C. albicans
C. glabrata
C. tropicalis
C. famata
C. lipolytica
C. krusei
n
15
7
3
2
1
1
C. albicans
1
2,0
C. albicans
C. glabrata
C. albicans
C. albicans
C. parapsilosis
C. glabrata
2
1
1
2
2
1
4,0
2,0
2,0
4,0
4,0
2,0
C. tropicalis
1
2,0
C. albicans
C. parapsilosis
C. albicans
C. parapsilosis
C. tropicalis
1
1
1
1
1
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
C. albicans
1
2,0
C. famata
C. albicans
C. tropicalis
2
1
1
4,0
2,0
2,0
Klinika Anestezjologii
i Intensywnej Terapii
Dziecięcej
Klinika Urologii
Klinika Kardiologii
Klinika Rehabilitacji
Ośrodek Transplantacji
Szpiku Kostnego
Klinika Pediatrii
Hematologii i Onkologii
Klinika Pediatrii
Hematologii
Klinika Chirurgii Ogólnej
i Endokrynologii
Klinika Neurologii
%
30,0
14,0
6,0
4,0
2,0
2,0
W celu oceny przynależności gatunkowej drożdże wysiewano na agar Sabouraud (bioMérieux) i inkubowano 24 godziny w temperaturze 37°C. Identyfikację szczepów Candida
sp. przeprowadzano na podstawie wyników reakcji biochemicznych ujętych w testach API
Candida (bioMérieux). Przynależność gatunkową badanych szczepów zawiera rycina 1.
Lekowrażliwość badanych szczepów Candida sp. oceniano przy użyciu testów ATB
FUNGUS 2 INT (bioMérieux). W celu oceny najmniejszego stężenia hamującego (Minimal
Inhibitory Concentration, MIC) leków przeciwgrzybiczych stosowano E-testy (AB BIODISK) z worikonazolem, posakonazolem, kaspofunginą i anidulafunginą w zakresie
stężeń 0,002-32 µg/ml. Wzrost grzybów przy wartości MIC < 2 µg/ml dla anidulafunginy
i kaspofunginy oraz MIC < 1 µg/ml dla posakonazolu i worikonazolu interpretowano jako
szczepy wrażliwe. Przykłady szczepów wrażliwych oraz szczepów opornych na badane leki
przeciwgrzybicze przedstawiono na rycinach 1 i 2.
Ocenę tworzenie biofilmu przez badane szczepy prowadzono stosując własną modyfikację metody opisanej przez Richardsa i wsp. (wg 14), wobec 5 biomateriałów: lateksu
Nr 2
173
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
2,0%
8,0%
2,0%
8,0%
12,0%
50,0%
18,0%
C. albicans (n=25)
C. glabrata (n=9)
C. tropicalis (n=6)
C. famata (n=4)
C. parapsilosis (n=4)
C. lipolytica (n=1)
C. krusei (n=1)
Ryc. 1.
Przynależność gatunkowa izolowanych szczepów Candida sp. (n=50)
MIC 0,025 μg/ml
MIC 0,006 μg/ml
Ryc. 2. Wyniki oznaczania wrażliwości szczepu C. albicans nr 13 na posakonazol i anidulafunginę
Ryc. 2. Wyniki oznaczania wrażliwości szczepu C. albicans nr 13 na posakonazol
silikonowanegoi anidulafunginę
(AMSINO), silikonu (Rochester Medical), polichlorku winylu (Unomedical), nylonu (DAMEN) oraz polipropylenu (Premilene). Próbki biomateriałów umieszczano w probówkach zawierających 5 ml hodowli badanych grzybów o gęstości 2 według
skali McFarlanda w TSB (bulion tryptozowo–sojowy, Trypcase–Soy Broth, bioMérieux).
Hodowle delikatnie wytrząsano przez dwie pierwsze z 72 godzin inkubacji w temperaturze
37°C, wymieniając podłoże TSB na jałowe, co 24 godziny. Następnie próbki biomateriałów
przemywano PBS o pH 7,2, umieszczano w 5 ml jałowego podłoża TSB i dodawano 1%
chlorek 2,3,5-trójfenylotetrazoliowy (TTC, Sigma). Powstawanie czerwonego formazanu
na powierzchni badanych biomateriałów podczas prowadzonej hodowli badanych szczepów
drożdży oceniano jako wynik dodatni, świadczący o tworzeniu biofilmu.
174
Ryc. 3.
E. Ciok-Pater i inni
Nr 2
Obraz oporności szczepów C. albicans nr 40 i nr 16 na posakonazol i anidulafunginę
Ryc. 3. Obraz oporności szczepówWYNIKI
C. albicans nr 40 i nr 16 na
posakonazol i anidulafunginę
Ze względu na zróżnicowaną lekowrażliwość izolowanych gatunków Candida sp. (Tabela II), analizę wyników lekowrażliwości i zdolności tworzenia biofilmu przeprowadzono
oddzielnie dla szczepów C. albicans i gatunków innych niż C. albicans.
Ocena lekowrażliwości 25 szczepów C. albicans i zdolności tworzenia
biofilmu na powierzchni wybranych biomateriałów. Wyniki oznaczania lekowrażliwości szczepów C. albicans i zdolności tworzenia biofilmu na powierzchni różnych
biomateriałów przedstawiono w tabeli II.
Wszystkie szczepy C. albicans były wrażliwe na amfoterycynę B i 5-fluorocytozynę.
Na powierzchni polichlorku winylu biofilm tworzyły 23 (92,0%) szczepy tego gatunku,
silikonu 22 (88,0%), polipropylenu i lateksu po 21 (84,0%) szczepów oraz na powierzchni
nylonu 12 (48,0%) szczepów.
Na itrakonazol wrażliwych było 9 (36,0%) szczepów C. albicans. Wszystkie te szczepy
tworzyły biofilm na powierzchni polichlorku winylu i silikonu, po 8 (32,0%) na polipropylenie i lateksie oraz 5 (20,0%) na powierzchni nylonu.
Wśród szczepów C. albicans stwierdzono 9 (36,0%) wrażliwych na flukonazol.
Wszystkie one tworzyły strukturę biofilmu na powierzchni polichlorku winylu i silikonu, po
8 (32,0%) szczepów na powierzchni polipropylenu i lateksu oraz 5 (20,0%) na powierzchni
nylonu.
Spośród 25 badanych szczepów C. albicans 19 (76,0%) było wrażliwych na worikonazol. Wszystkie one tworzyły biofilm na powierzchni polichlorku winylu i silikonu, a 18
(72,0%) na powierzchni lateksu, 16 (64,0%) na powierzchni polipropylenu oraz 11 (44,0%)
na powierzchni nylonu.
Antymikotyk
C. famata
(n=4)
C. krusei
(n=1)
C. parapsilosis
(n=4)
C. lipolytica
(n=1)
C. tropicalis
(n=6)
C. glabrata
(n=9)
C. albicans
(n=25)
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Gatunek
n
22
0
0
8
0
0
6
0
0
1
0
0
4
0
0
1
0
0
3
0
0
%
88,0
0,0
0,0
32,0
0,0
0,0
24,0
0,0
0,0
4,0
0,0
0,0
16,0
0,0
0,0
4,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Silikon
Lateks
silikonowany
n
%
21
84,0
0
0,0
0
0,0
9
36,0
0
0,0
0
0,0
5
20,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
4
16,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
0
0,0
0
0,0
Polichlorek
winylu
n
%
23
92,0
0
0,0
0
0,0
9
36,0
0
0,0
0
0,0
6
24,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
4
16,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
0
0,0
0
0,0
n
21
0
0
7
0
0
5
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
3
0
0
%
84,0
0,0
0,0
28,0
0,0
0,0
20,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
16,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Polipropylen
Tabela II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
AMFOTERYCYNA B
n
12
0
0
3
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
%
48,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Nylon
Nr 2
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
175
Antymikotyk
C. famata
(n=4)
C. krusei
(n=1)
C.
parapsilosis
(n=4)
C. lipolytica
(n=1)
C. tropicalis
(n=6)
C. glabrata
(n=9)
C. albicans
(n=25)
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Gatunek
n
22
0
0
8
0
0
5
0
1
1
0
0
3
1
0
1
0
0
3
0
0
%
88,0
0,0
0,0
32,0
0,0
0,0
20,0
0,0
4,0
4,0
0,0
0,0
12,0
4,0
0,0
4,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Silikon
Lateks
silikonowany
n
%
21
84,0
0
0,0
0
0,0
9
36,0
0
0,0
0
0,0
4
16,0
0
0,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
1
4,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
0
0,0
0
0,0
Polichlorek
winylu
n
%
23
92,0
0
0,0
0
0,0
9
36,0
0
0,0
0
0,0
5
20,0
0
0,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
1
4,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
0
0,0
0
0,0
n
21
0
0
7
0
0
4
0
1
0
0
0
3
1
0
0
0
0
3
0
0
%
84,0
0,0
0,0
28,0
0,0
0,0
16,0
0,0
4,0
0,0
0,0
0,0
12,0
4,0
0,0
0,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Polipropylen
c.d. Tabeli II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
FLUCYTOZYNA
n
12
0
0
3
0
0
2
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
%
48,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
8,0
0,0
4,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Nylon
176
E. Ciok-Pater i inni
Nr 2
c.d. Tabeli II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
Lateks
Polichlorek
Silikon
Polipropylen
Nylon
silikonowany
winylu
Antymikotyk
Gatunek
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
Wrażliwe
9
36,0
8
32,0
9
36,0
8
32,0
5
20,0
C. albicans
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=25)
Oporne
13
52,0
13
52,0
14
56,0
13
52,0
7
28,0
Wrażliwe
5
20,0
6
24,0
6
24,0
5
20,0
1
4,0
C. glabrata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=9)
Oporne
3
12,0
3
12,0
3
12,0
2
8,0
2
8,0
Wrażliwe
3
12,0
2
8,0
3
12,0
2
8,0
1
4,0
C. tropicalis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=6)
Oporne
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
2
8,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
C. lipolytica
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
4
16,0
4
16,0
4
16,0
4
16,0
0
0,0
C.
parapsilosis Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
C. krusei
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
C. famata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
2
8,0
2
8,0
2
8,0
2
8,0
2
8,0
FLUKONAZOL
Nr 2
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
177
c.d. Tabeli II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
Polichlorek
Lateks
Polipropylen
Silikon
silikonowany
winylu
Antymikotyk
Gatunek
n
%
n
%
n
%
n
%
Wrażliwe
9
36,0
8
32,0
9
36,0
8
32,0
C. albicans
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=25)
Oporne
13
52,0
13
52,0
14
56,0
13
52,0
Wrażliwe
2
8,0
3
12,0
3
12,0
2
8,0
C. glabrata
Średniowrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
(n=9)
Oporne
5
20,0
5
20,0
5
20,0
4
16,0
Wrażliwe
3
12,0
2
8,0
3
12,0
2
8,0
C. tropicalis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=6)
Oporne
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
C. lipolytica
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
4
16,0
4
16,0
4
16,0
4
16,0
C. parapsilosis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
C. krusei
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
C. famata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
2
8,0
2
8,0
2
8,0
2
8,0
ITRAKONAZOL
n
5
0
7
1
0
2
1
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
2
%
20,0
0,0
28,0
4,0
0,0
8,0
4,0
0,0
8,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
4,0
0,0
8,0
Nylon
178
E. Ciok-Pater i inni
Nr 2
c.d. Tabeli II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
Lateks
Polichlorek
Silikon
Polipropylen
silikonowany
winylu
Antymikotyk
Gatunek
n
%
n
%
n
%
n
%
Wrażliwe
19
76,0
18
72,0
19
76,0
16
64,0
C. albicans
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=25)
Oporne
3
12,0
3
12,0
4
16,0
5
20,0
Wrażliwe
8
32,0
9
36,0
9
36,0
7
28,0
C. glabrata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=9)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
5
20,0
4
16,0
5
20,0
4
16,0
C. tropicalis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=6)
Oporne
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
C. lipolytica
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
4
16,0
4
16,0
4
16,0
4
16,0
C. parapsilosis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
C. krusei
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
C. famata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
2
8,0
2
8,0
2
8,0
2
8,0
WORIKONAZOL
n
11
0
1
3
0
0
2
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
2
%
44,0
0,0
4,0
12,0
0,0
0,0
8,0
0,0
4,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
4,0
0,0
8,0
Nylon
Nr 2
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
179
c.d. Tabeli II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
Polichlorek
Lateks
Polipropylen
Silikon
silikonowany
winylu
Antymikotyk
Gatunek
n
%
n
%
n
%
n
%
Wrażliwe
21
84,0
20
80,0
21
84,0
19
72,0
C. albicans
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=25)
Oporne
1
4,0
1
4,0
2
8,0
2
8,0
Wrażliwe
7
24,0
8
32,0
8
32,0
7
28,0
C. glabrata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=9)
Oporne
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
Wrażliwe
5
20,0
4
16,0
5
20,0
4
16,0
C. tropicalis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=6)
Oporne
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
C. lipolytica
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
C. parapsilosis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
C. krusei
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
C. famata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
POSAKONAZOL
n
12
0
0
3
0
0
2
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
%
48,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
8,0
0,0
4,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Nylon
180
E. Ciok-Pater i inni
Nr 2
Antymikotyk
C. famata
(n=4)
C. krusei
(n=1)
C. parapsilosis
(n=4)
C. lipolytica
(n=1)
C. tropicalis
(n=6)
C. glabrata
(n=9)
C. albicans
(n=25)
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Wrażliwe
Średniowrażliwe
Oporne
Gatunek
n
22
0
0
8
0
0
6
0
0
1
0
0
4
0
0
1
0
0
3
0
0
%
88,0
0,0
0,0
32,0
0,0
0,0
24,0
0,0
0,0
4,0
0,0
0,0
16,0
0,0
0,0
4,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Silikon
Lateks
silikonowany
n
%
21
84,0
0
0,0
0
0,0
9
36,0
0
0,0
0
0,0
5
20,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
4
16,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
0
0,0
0
0,0
Polichlorek
winylu
n
%
23
92,0
0
0,0
0
0,0
9
36,0
0
0,0
0
0,0
6
24,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
4
16,0
0
0,0
0
0,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
3
12,0
0
0,0
0
0,0
n
21
0
0
7
0
0
5
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
3
0
0
%
84,0
0,0
0,0
28,0
0,0
0,0
20,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
16,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Polipropylen
c.d. Tabeli II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
KASPOFUNGINA
n
12
0
0
3
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
%
48,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
12,0
0,0
0,0
Nylon
Nr 2
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
181
c.d. Tabeli II. Lekowrażliwość szczepów Candida sp. (n=50) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni różnych biomateriałów
Polichlorek
Lateks
Polipropylen
Nylon
Silikon
silikonowany
winylu
Antymikotyk
Gatunek
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
Wrażliwe
19
72,0
18
72,0
20
80,0
19
72,0
10
40,0
C. albicans
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=25)
Oporne
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
2
8,0
Wrażliwe
8
32,0
9
36,0
9
36,0
7
28,0
3
12,0
C. glabrata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=9)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
6
24,0
5
20,0
6
24,0
5
20,0
3
12,0
C. tropicalis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=6)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
C. lipolytica
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
0
0,0
C. parapsilosis
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
1
4,0
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
Wrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
C. krusei
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=1)
Oporne
1
4,0
1
4,0
1
4,0
0
0,0
0
0,0
Wrażliwe
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
3
12,0
C. famata
Średniowrażliwe
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
(n=4)
Oporne
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
ANIDULAFUNGINA
182
E. Ciok-Pater i inni
Nr 2
Nr 2
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
183
Wśród badanych szczepów C. albicans stwierdzono 23 (92,0%) wrażliwe na posakonazol. Spośród nich 21 (84,0%) tworzyło biofilm na powierzchni polichlorku winylu i silikonu,
20 (80,0%) na powierzchni lateksu, 19 (76,0%) – polipropylenu, a 11 (44,0%) szczepów
na powierzchni nylonu.
Wszystkie szczepy C. albicans były wrażliwe na kaspofunginę. Wśród tych szczepów,
na powierzchni polichlorku winylu biofilm tworzyły 23 (92,0%) szczepy, na silikonie 22
(88,0%), na polipropylenie i lateksie po 21 (84,0%) szczepów oraz na nylonie 12 (48,0%)
szczepów.
Wśród badanych szczepów C. albicans stwierdzono 22 (88,0%) wrażliwe na anidulafunginę. Spośród nich 20 (80,0%) tworzyło biofilm na powierzchni polichlorku winylu, po
19 (76,0%) na polipropylenie i silikonie, 18 (72,0%) - na lateksie oraz 10 (40,0%) szczepów
na powierzchni nylonu.
Spośród szczepów opornych na itrakonazol, 14 (56,0%) posiadało zdolność tworzenia
biofilmu na powierzchni polichlorku winylu, po 13 (52,0%) na powierzchni polipropylenu,
lateksu i silikonu, a 7 (28,0%) szczepów na powierzchni nylonu.
Wśród 16 szczepów opornych na flukonazol, 14 (56,0%) tworzyło biofilm na polichlorku
winylu, po 13 (52,0%) na powierzchni lateksu, silikonu i polipropylenu oraz 7 (28,0%) na
nylonie.
Spośród szczepów opornych na worikonazol, 5 (20,0%) utworzyło biofilm na powierzchni polipropylenu, cztery (16,0%) na polichlorku winylu, po trzy szczepy na powierzchni
lateksowej i silikonowej oraz jeden na powierzchni nylonu.
Dwa szczepy C. albicans oporne na posakonazol tworzyły biofilm na powierzchni polipropylenu i polichlorku winylu, po jednym szczepie – na powierzchni lateksu i silikonu. Trzy
szczepy oporne na anidulafunginę posiadały zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni:
polipropylenu, polichlorku winylu, lateksu oraz silikonu, dwa na powierzchni nylonu.
Ocena lekowrażliwości innych niż C. albicans szczepów (n=25) a zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni wybranych biomateriałów. Wyniki
dotyczące lekowrażliwości gatunków innych niż C. albicans oraz zdolności tworzenia przez
nie biofilmu na powierzchni wybranych biomateriałów przedstawiono w tabeli II.
Wszystkie badane szczepy gatunków innych niż C. albicans były wrażliwe na amfoterycynę B. Wśród nich na powierzchni polichlorku winylu biofilm tworzyły 24 (96,0%), na
lateksie i silikonie po 23 (92,0%), na polipropylenie 22 (88,0%) oraz 9 (36,0%) szczepów
na powierzchni nylonu.
Stwierdzono 23 (92,0%) szczepy wrażliwe na 5-fluorocytozynę, spośród których 22
(88,0%) tworzyły biofilm na powierzchni polichlorku winylu, 21 (84,0%) na silikonie, 20
(80,0%) na lateksie, 17 (68,0%) na polipropylenie oraz 8 (32,0%) szczepów na powierzchni
nylonu.
Wśród 25 badanych szczepów gatunków innych niż C. albicans, 15 (60,0%) szczepów
było wrażliwych na flukonazol. Wszystkie one tworzyły biofilm na powierzchni polichlorku
winylu, po 14 (56,0%) szczepów na powierzchni lateksu i silikonu, 12 (48,0%) na polipropylenie oraz trzy na powierzchni nylonu.
Wszystkie 12 (48,0%) szczepów wrażliwych na itrakonazol posiadało zdolność tworzenia biofilmu na polichlorku winylu, po 11 (44,0%) na lateksie i silikonie, 9 (36,0%) na
polipropylenie oraz trzy szczepy na powierzchni nylonu. Spośród 22 (88,0%) szczepów wrażliwych na worikonazol, 21 (84,0%) posiadało zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni
184
E. Ciok-Pater i inni
Nr 2
polichlorku winylu, po 20 (80,0%) na lateksie i silikonie, 16 (64,0%) na polipropylenie oraz
6 (24,0%) szczepów na powierzchni nylonu.
Stwierdzono 23 (92,0%) szczepy gatunków innych niż C. albicans wrażliwe na posakonazol. Spośród nich 22 (88,0%) posiadały zdolność tworzenia biofilmu na powierzchni
polichlorku winylu, po 21 (84,0%) na lateksie i silikonie, 18 (72,0%) na polipropylenie oraz
8 (32,0%) szczepów na powierzchni nylonu.
Wszystkie szczepy innych gatunków niż C. albicans były wrażliwe na kaspofunginę. Wśród badanych szczepów 24 (96,0%) tworzyły biofilm na polichlorku winylu, 23
(92,0%) na lateksie i silikonie, 19 (76,0%) na polipropylenie oraz 9 (36,0%) szczepów na
powierzchni nylonu.
Spośród 23 (92,0%) szczepów wrażliwych na anidulafunginę, 22 (88,0%) tworzyły
biofilm na polichlorku winylu, po 21 (84,0%) na silikonie i lateksie, 18 (72,0%) na polipropylenie oraz 9 (36,0%) na powierzchni nylonu.
Wśród grzybów tej grupy opornych na flukonazol, po 9 (36,0%) szczepów tworzyło
biofilm na polichlorku winylu, lateksie i silikonie, 7 (28,0%) na polipropylenie oraz 6
(24,0%) szczepów na powierzchni nylonu.
Spośród drożdży opornych na itrakonazol po 11 (44,0%) szczepów tworzyło biofilm
na powierzchni polichlorku winylu, lateksu i silikonu, 9 (36,0%) na polipropylenie oraz 6
(24,0%) na powierzchni nylonu.
Wszystkie szczepy oporne na worikonazol tworzyły biofilm na każdym z badanych
biomateriałów. Szczepy oporne na posakonazol posiadały zdolność tworzenia biofilmu na
polichlorku winylu, lateksie i silikonie.
DYSKUSJA
Biofilm to heterogenna, przestrzennie zorganizowana struktura stanowiąca poważny
problem współczesnej medycyny. Zakażenia z jego udziałem sprawiają trudności terapeutyczne (3). Antymikotyki stosowane w praktyce klinicznej przynoszą okresową poprawę
stanu pacjentów, eliminując uwalniane drobnoustroje planktoniczne, ale nie niszczą struktury
biofilmu (15).
Kuhn i wsp. (8) badali wrażliwość szczepów Candida sp. wytwarzających biofilm na
antymikotyki. Aktywne wobec grzybów twarzących biofilm pozostały wyłącznie lipidowa
postać amfoterycyny B i echinokandyny (kaspofungina i mikafungina). Autorzy stwierdzili
również brak wrażliwości szczepów C. albicans i C. parapsilosis na dwa triazole: worikonazol i rawukonazol. Jacobson i wsp. (5) potwierdzili aktywność anidulafunginy wobec
biofilmu tworzonego przez C. albicans. Mukherjee i wsp. (10) zwrócili uwagę na aktywność
echinokandyn wobec dojrzałego biofilmu. Wykazali również, że zastosowanie lipidowej
formy amfoterycyny B może eliminować biofilm powstały na powierzchni cewników wykonanych z polichlorku winylu.
W niniejszej pracy potwierdzono aktywność amfoterycyny B oraz echinokandyn wobec
badanych drożdży. Wszystkie szczepy były wrażliwe na amfoterycynę B i kaspofunginę,
a w 90,0% na anidulafunginę.
Katragkou i wsp. (6) oceniali aktywność worikonazolu, posakonazolu, kaspofunginy
i anidulafunginy wobec szczepów C. albicans i C. parapsilosis tworzących biofilm oraz
Nr 2
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
185
komórek planktonowych. Szczepy nie tworzące biofilmu wykazywały wrażliwość na badane
leki. Autorzy ci stwierdzili wysokie wartości MIC worikonazolu (≥ 256 μg/ml) i posakonazolu (> 64 μg/ml), ale stosunkowo niskie dla echinokandyn: kaspofunginy i anidulafunginy
(odpowiednio: ≤ 1 i ≤ 2 μg/ml) wobec drożdży tworzących biofilm.
Paugam (12) podkreśliła, że mimo występowania u szczepów C. albicans i C. glabrata
wzrostu wartości MIC dla posakonazolu i innych nowych triazoli, takich wyników nie wykazano u C. krusei. W niniejszej pracy stwierdzono, że szczepy C. krusei były wrażliwe na
posakonazol. Najwyższy odsetek szczepów opornych stwierdzono wobec azoli: 56,0% na
itrakonazol, 52,0% na flukonazol, 18,0% na worikonazol i 8,0% na posakonazol. Częściej
oporne na tę grupę leków były szczepy C. albicans niż szczepy gatunków innych niż C.
albicans (C. famata oraz C. tropicalis). Mimo niskiego odsetka szczepów opornych na posakonazol, zjawisko to jest niepokojące, gdyż antymikotyk należy do leków nowej generacji
aktywnych wobec szczepów opornych na azole.
W przedstawionej pracy oceniano wrażliwość grzybów Candida sp. na wybrane antymikotyki przed wytworzeniem struktury biofilmu. Stąd, aby porównać otrzymane wyniki
z wynikami innych autorów (6, 8, 12, 13) należy w przyszłości ocenić wrażliwość badanych
drożdży po wytworzeniu biofilmu.
Wykazano porównywalny odsetek wrażliwych na 5-fluorocytozynę szczepów C. albicans tworzących biofilm na powierzchni badanych biomateriałów oraz szczepów gatunków
innych niż C. albicans – odpowiednio, 79,2% i 76,5%. Wrażliwe na azole szczepy C. albicans
częściej tworzyły biofilm niż szczepy oporne. W przypadku gatunków innych niż C. albicans
stwierdzono taką samą zależność. Zarówno wśród szczepów wrażliwych na kaspofunginę
i anidulafunginę oraz opornych na anidulafunginę stwierdzono taki sam odsetek szczepów
tworzących biofilm. Otrzymano porównywalny odsetek szczepów posiadających zdolność
tworzenia biofilmu wśród szczepów C. albicans i gatunków innych niż C. albicans.
Zapewne zbadanie większej liczby szczepów poszczególnych gatunków innych niż C.
albicans mogłoby doprowadzić do lepszego poznania wpływu lekowrażliwości na zdolność
tworzenia biofilmu Candida sp. zwłaszcza u pacjentów z grup wysokiego ryzyka rozwoju
kandydoz. Zwiększenie skuteczności leczenia przeciwgrzybiczego oraz opracowanie standardów leczenia kandydoz u chorych, u których stosowane są biomateriały, w znacznym
stopniu zmniejszyłoby śmiertelność i koszty hospitalizacji.
PODSUMOWANIE
1) Wszystkie badane szczepy były wrażliwe na amfoterycynę B i kaspofunginę. Wśród
grzybów z gatunku C. albicans stwierdzono wyższy odsetek szczepów opornych na
azole, w porównaniu ze szczepami innych gatunków.
2) Wykazano zdolność tworzenia biofilmu przez Candida sp. na powierzchni badanych
biomateriałów. Najwięcej szczepów tworzyło biofilm na powierzchni polichlorku winylu 92,0% szczepów C. albicans i 96,0% szczepów gatunków innych niż C. albicans,
najmniej na powierzchni nylonu 12 (48,0%) szczepów C. albicans i 36,0% szczepów
gatunków innych niż C. albicans.
3) Wśród szczepów Candida sp. stwierdzono zależność między lekowrażliwością, a tworzeniem biofilmu. Jednak szczepy oporne na azole i anidulafunginę częściej tworzyły
186
E. Ciok-Pater i inni
Nr 2
biofilm w porównaniu ze szczepami wrażliwymi na badane antymikotyki.
4) Wrażliwość drożdży na antymikotyki wydaje się istotną cechą szczepów Candida sp.
wywołujących zakażenia związane ze stosowaniem biomateriałów, gdyż może mieć
wpływ na tworzenie biofilmu.
E. Ciok-Pater, A. Białucha, E. Gospodarek, A. Ostafin
Susceptibility to antifungal agents of Candida sp. and biofilm formation
SUMMARY
In recent years the increase in frequency of fungal infections with Candida sp. was noticed. These
infections are connected with ability of Candida sp. to form biofilm on surfaces of biomaterials used in
medicine. Furthermore fungal infections make serious therapeutic problems because of biofilm resistance to antifungal agents actually. The aim of the study was to evaluate the susceptibility to antifungal
agents of Candida sp. and their ability to form biofilm on different biomaterials. 50 strains of Candida
sp. isolated from patients of University Hospital No. 1 of dr A. Jurasz in Bydgoszcz were examined.
API Candida (bioMérieux) tests were used to identify Candida sp. strains. The susceptibility of the
yeast strains to antifungal agents was evaluated by ATB FUNGUS 2 INT (bioMérieux) tests. The
susceptibility of examined strains to voriconazole, posaconazole, caspofungin and anidulafungin was
assessed by means of Etests (AB BIODISK) method employing drug concentrations from 0,002 to 32
µg/ml. All analysed strains were susceptible to amphotericin B and caspofungin. Biofilm formation on
different biomaterials (silicon, latex, polychloride vinyl, polypropylene, nylon) was measured after 72
hour incubation at 37˚C. All examined yeasts formed biofilm on all analysed biomaterials. The highest
number of strains formed biofilm on surface of polychloride vinyl: 23 (92,0%) by C. albicans strains
and 24 (96,0%) Candida non-albicans strains. The lowest number of the strains formed biofilm on the
surface of nylon: 12 (48,0%) of C. albicans strains and 9 (36,0%) of Candida non-albicans strains.
The studied strains resistant to azoles and anidulafungin display stronger ability to form biofilm on
surfaces of all analysed biomaterials.
PIŚMIENNICTWO
1. Adamski Z., Deja M.: Nowości i przyszłość w terapii przeciwgrzybiczej. Mikol Lek, 2005, 12:
115-21
2. Chandra J. i wsp.: Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development,
architecture, and drug resistance. J Bact, 2001, 9: 5385- 94
3. Donlan R.M., Costerton J.W.: Reviews. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant
microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002, 15: 167-93
4. Dzierżanowska D., Dzierżanowska – Fangrat K.: Nowoczesne leczenie inwazyjnych zakażeń
grzybami z rodzaju Candida – wytyczne IDSA 2009. Zakażenia, 2009, 5: 53-62
5. Jacobson M. i wsp.: In vitro activity of anidulafungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemiother, 2008, 6: 2242–3
6. Katragkou A. i wsp.: Differental activities of newer antifungal agents aganist Candida albicans
and Candida parapsilosis biofilms. Antimicrob Agents Chemiother, 2008, 1: 357-60
7. Kojic E.M., Darouiche R.O.: Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev, 2004,
4: 255-67
Nr 2
Tworzenie biofilmu przez Candida sp.
187
8. Kuhn D.M. i wsp.: Antifungal susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin
B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother, 2002, 6: 1773-80
9. Mnichowska-Polanowska M., Kaczała M., Giedrys-Kalemba S.: Charakterystyka biofilmu Candida. Mikol Lek, 2009, 16: 159-64
10. Mukherjee P.K., Long L., Gun Kin H., Ghannoum M.A.: Amphotericin B lipid complex is efficacious in the treatment of Candida albicans biofilms using a model of catheter – associated
Candida biofilms. Int J Antimicrob Agents, 2009, 33: 149-53
11. Passowicz-Muszyńska E., Jankowska R., Weryńska B.: Nowe leki przeciwgrzybicze stosowane
w terapii grzybic głębokich. Mikol Lek, 2007, 14: 137-41
12. Paugam A.: Actualité sur le posaconazole. Méd Mal Infect, 2007, 37: 71-6
13. Pfaller M.A. i wsp.: Correlation of MIC with outcome for Candida species tested against caspofungin, anidulafungin, and micafungin: Analysis and Proposal for Interpretive MIC Breakpoints.
J Clin Microbiol, 2008, 8: 2620–9
14. Różalska B., Sadowska B., Walencka E. Wykrywanie biofilmów stanowiących problemy medyczne
i perspektywy ich eradykacji. Zakażenia, 2010, 1: 13-22
15. Różalska B., Walencka E.: Alternatywne do antybiotykoterapii sposoby eradykacji biofilmów.
Post Mikrobiol, 2008, 47: 371-8
Otrzymano: 18 IV 2011 r.
Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii,
Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika
w Toruniu