Tytuł projektu: “Funkcjonalna analiza wybranych genów

“Analiza odpowiedzi roślin na stres suszy: wyciszanie
ekspresji genów kinaz kaskady MAPK”
Mitogen-Activated
Protein Kinase
Cascade
Stimuli
MAPKK subfamilies (classification according to Kazuya Ichimura et al.)
with phylogenetic tree
A1
MAPKKKs
A2
MAPKKs
B
MAPKs
Transcription factors
C
D
Target genes
At, Arabidopsis thaliana; Le, Lycopersicon esculentum; Ms, Medicago
sativa; Nt, Nicotiana tabacum; Os, Oryza sativa; Zm, Zea mays
Uzyskanie transgenicznych roślin A. thaliana z wyciszoną ekspresją
genu kodującego kinazę AtMKK1.
promotor
terminator
LONG
SHORT
Inverted repeats
shRNA
Pol RNA II
Pol RNA III
Hairpin RNA
P
P
> 1 siRNA
siRNA
1 siRNA
CDS
3' region
siRNA
siRNA
5' region
AtMEK1
1419 bp
1
2
3
Schemat sekwencji mRNA genu AtMEK1.
Za pomocą skrótów oznaczono:
CDS – sekwencja kodująca kinazę AtMEK1,
5’ i 3’ region – odcinki DNA wybrane do konstrukcji
odwrotnych powtórzeń,
siRNA – krótkie sekwencje DNA wybrane do
konstrukcji shRNA
Mapa wektora pHannibal. za pomocą skrótów
oznaczono: amp - gen oporności na ampicylinę,
promoter 35S CaMV – promotor 35S wirusa
mozaiki kalafiora,, pdk – intron, terminator OCS
– terminator genu syntazy oktopinowej Do
wprowadzenia fragmentów genu AtMEK1
wykorzystano miejsca restrykcyjne dla enzymów
XhoI i KpnI oraz ClaI i XbaI
Mapa plazmidu pART27 za pomocą skrótów
oznaczono: LB - lewa sekwencja graniczna
T-DNA, RB - prawa sekwencja graniczna TDNA, nptII - gen fosfotransferazy
neomycynowej, promoter NOS- promotor
genu syntazy nopalinowej, terminator NOS terminator genu syntazy nopalinowej, spec –
gen oporności na spektinomycynę
Not I (5819)
terminator OCS
Not I (1)
Xba I (5041)
RB
promoter NOS
Bam HI (5035)
nptII
HindIII (5029)
terminator NOS
Cla I (5024)
intron pdk
KpnI (4228)
Eco RI (4218)
amp
pHannibal
5824 bp
LB
spec
pART27
11667 bp
XhoI (4212)
promoter 35S CaMV
Not I (2859)
M KK1-3'
intron pdk
M KK1-3'
p35S CaM V
tOCS
RB
pNOS
nptII
tNOS
LB
Schemat konstruktu T-DNA zawierającego
odwrócone powtórzenia regionu 3’ genu
konstrukt
AtMEK1 (MKK1-3’). Za pomocą skrótów7 oznaczono:
LB - lewa sekwencja graniczna T1 9 3 bp
DNA, RB - prawa sekwencja graniczna T-DNA, nptII - gen fosfotransferazy
neomycynowej, pNOS- promotor genu syntazy nopalinowej, tNOS - terminator genu
syntazy nopalinowej, p35S CMV – promotor 35S CaMV, tOCS – terminator genu syntazy
oktopinowej, intron pdk – intron genu kinazy pdk
Konstrukcja płytek mikromacierzy cDNA
Źródła klonów cDNA:
Biological Resource Center, The Ohio State University - USA
Riken Bioresource Center –Japan
Wektory
•
pZL1
•
pBluSKM
•
pBluSK2P
•
pCMV_SPORT6
•
pFLC1 i pochodne
•
pSHlox1
PCR (startery T7 i T3) lub (startery T7 i Sp6)
Dr Patricka Gallois - School of Biological Sciences, University of Manchester
Płytki 96 dołkowe
Stoki glicerolowe
Stoki główne
Kultury bakteryjne
Izolacja plazmidów
Stoki robocze
Ocena poprzez rozdział
elektroforetyczny
50 µl PCR
Płytki 384 dołkowe
Oczyszczanie produktów PCR,
Millipore
Nadruk
»
Tracking - Rozlokowanie prób na płytce
»
Duplikacja prób - reproduktywność wyników
»
Próby kontrolne
> próby negatywne
• ORF_o567 [Escherichia coli] - 178C16
• aconitate hydrase 1 [Escherichia coli] - 239E4
> próby konstytutywne:
• 18S rRNA
• HMG1 (3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase)
• Plastocyanin
• EF1 (elongation factor 1-alpha)
• Phosphoglycerate kinase
• FPS1 (farnesyl pyrophosphase synthase)
• beta tubulin
• ubiquitin
• TUFA (elongation factor Tu)
• CAB (photosystem II type I chlorophyll a b binding
protein) 3
• RUBISCO (ribulose bisphosphate carboxylase)
o
geny uczestniczące w biosyntezie i degradacji kluczowego fitohormonu stresu suszy - ABAkwasu abscysynowego (m.in.. geny: epoksydazy neoksantynowej – ZEP, dioksygenazy 9-cisepoksykroteinowej – NCED, oksydazy ksantoksyny – ABA2, lipoksygenazy – LOX2)
o
geny uczestniczące w transdukcji sygnałów (m.in. kinazy MAP i MAPK, fosfatazy PP2C, CDPK)
o
geny czynników transkrypcyjnych (m.in. MYB/MYC, bZIP, WRYK)
o
geny obronne (m.in. enzymy stresu oksydacyjnego, enzymy zaangażowane w procesy degradacji
makromolekuł)
o
geny biorące udział w akumulacji i degradacji osmolitów
o
geny kodujące transportery błonowe (transportery jonów, metabolitów)
o
inne geny A. thaliana o nieznanej funkcji, które zostały wybrane na podstawie homologii
sekwencji do znanych funkcjonalnie genów innych gatunków roślin; są to geny przypuszczalnie
indukowane w warunkach stresu suszy.