ROLNICTWO MOLEKULARNE

ROLNICTWO MOLEKULARNE
Produkcja cytokin w roślinach.
Patrycja Redkiewicz
Dr Anna Góra-Sochacka
Prof. dr hab. Agnieszka Sirko
1
CYTOKINY
są to małe cząsteczki (gliko)proteinowe
regulujące bardzo różnorodne procesy takie jak
proliferacja, różnicowanie czy ruchliwość
komórek biorących udział w odpowiedzi
odpornościowej oraz komórek hemopoetycznych
Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94
PODZIAŁ CYTOKIN
• Interleukiny
• Hematopoetyny
• Chemokiny
• Interferony
• Nadrodzina cząsteczek TNF
• Inne cytokiny
Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94
FUNKCJE CYTOKIN
Ann. N.Y. Acad. Sci. 1056: 16–29 (2005).
CYTOKINY STOSOWANE JAKO LEKI
Cytokiny
Preparaty dostępne
jako leki
Interferon-α
(INF-α)
Interferon-β
(INF-β)
Intron A (Schering Plough)
Chronic hepatitis B
Roferon A (Hoffman La Roche) Chronic hepatitis C
Hairy cell leukemia
Chronic myeloloid leukemia, Condyloma
acuminate, AIDS-related Kaposi’s sarcoma
Betaseron (Bayer)
Relapsing multiple sclerosis
Avonex (Biogen Idec)
Interferon-γ
(INF-γ)
Actimmune (Intermune
Pharma)
Malignant osteopetrosis
Chronic granulomatous disease
Erytropoetyna-α
(EPO-α)
Eprex (Cilag Jansen)
Epogen (Amgen)
Procrit (Ortho Biotech)
Anemia due to chronic renal failure, HIV
infected patients, chemotherapy, primary
bone marrow disorders
Aldesleukin (Novartis)
Metastatic renal cell cancer, metastatic
melanoma
Neutropenia
IL-2
G-CSF
GM-CSF
Neupogen
(Hoffman La Roche)
Leukine /Sargramostin (Bayer) Leukemia, Bone marrow /stem cell
transplants
Int. J. Mol. Sci. 2011, 12, 3536-3552
PRZEGLĄD LITERATURY
(1995-2011)
Cytokina
Materiał roślinny
Erytropoety zawiesina
na
komórkowa
Nicotiana tabacum
G-CSF zawiesina
komórkowa
N. tabacum
GM-CSF zawiesina
komórkowa
N. tabacum
GM-CSF zawiesina
komórkowa
N. tabacum
GM-CSF zawiesina
komórkowa
Oryza sativa
GM-CSF zawiesina
komórkowa O. sativa
Elementy kasety ekspresyjnej
Metoda
Poziom produkcji
promotor 35S CaMV, terminator 35S CaMV
transformacja 0.0026% TSP; 25
A. tumefaciens pg/l
promotor 35S CaMV z podwójnym
wzmacniaczem transkrypcji, Ω-wzmacniacz
translancji; terminator genu nos
promotor 35S CaMV, sekwencja
wzmacniająca translację z wirusa TEV,
etykieta His, terminator T7
promotor 35S CaMV z podwójnym
wzmacniaczem transkrypcji, terminator nos
transformacja 105 μg/l
A. tumefaciens
promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny
amylazy ryżu
mikrowstrzeli
wanie
129 mg/l
(25% wydzielanych
białek)
promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny
amylazy ryżu, wyciszenie genu kodującego
α-amylazę za pomocą RNAi do poziomu
8.2%
mikrowstrzeli
wanie
do 280 mg/l
GM-CSF zawiesina
promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny
komórkowa O. sativa amylazy ryżu, wyciszenie genu kodującego
cysteinową proteinazę za pomocą RNAi
mikrowstrzeli
wanie
do 290 mg/l
GM-CSF zawiesina
promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny
komórkowa O. sativa amylazy ryżu; współekspresja genu
kodującego syntetyczny inhibitor proteaz
(sPI-II)
mikrowstrzeli
wanie
do 250 mg/l
transformacja 150 µg/l (wewnątrz
A. tumefaciens kom.); 250 µg/l
(wydzielane)
transformacja 180 – 780 µg/l
A. tumefaciens
GM-CSF liście
Saccharum
promotor MUbi-1 z kukurydzy i
SCubi-9 z trzciny cukrowej
mikrowstrzeli
wanie
0,02% TSP
GM-CSF nasiona
N. tabacum
promotor gluteiny Gt1, Gt3,
peptyd sygnalny gluteiny,
terminator nos
transformacja 0,005-0,03%
A. tumefaciens TSP
GM-CSF nasiona
O. sativa
transformacja 1.3% TSP
promotor gluteiny Gt1, peptyd
sygnalny gluteiny, terminator nos A. tumefaciens
GM-CSF nasiona
O. sativa
transformacja 0,5-14 μg/
Promotor gluteiny Gt13a
A. tumefaciens nasiono
(specyficzny dla endospermy
nasion), peptyd sygnalny gluteiny,
terminator nos, optymalizacja
kodonów
wektor pochodna PVX: promotor wektor
GM-CSF liście
0,2-2% TSP
35S CaMV, etykieta His
Nicotiana
wirusowy PVX
benthamiana
IL-2;
IL-4
zawiesina
komórkowa
N. tabacum
promotor 35S CaMV, terminator
T7
Transformacja 0,09 mg/l
A. tumefaciens 0,45 mg/l
IL-10;
IL-4
liście
N. tabacum
IL-18
liście
N. tabacum
IL-2
bulwy
S. tuberosum
liście
N. tabacum
IL-10
IL-4
TNF-α
liście
N. tabacum,
bulwy
S. tuberosum
Solanum
tuberosum
promotor 35S CaMV z podwójnym
wzmacniaczem transkrypcji, t-CUPwzmacniacz translacji, ELP, KDEL,
terminator nos
promotor 35S CaMV z podwójnym
wzmacniaczem transkrypcji,
Ω-wzmacniacz translancji, terminator
nos
promotor patatyny; terminator nos
transformacja 0,27% TSP (IL-10);
A. tumefaciens 0,086% TSP (IL-4)
transformacja 0,004 –0,051% TSP;
A. tumefaciens 351 ng/g
transformacja 115 U/mg TSP
A. tumefaciens
1. promotor 35S CaMV, etykieta His, transformacja 1. 7 ng/mg TSP (bez
peptyd kierujący do chloroplastów
A. tumefaciens His); 43 ng/mg TSP
oraz kaseta bez etykiety His
(z His)
2. promotor 35S CaMV, etykieta His;
2. brak akumulacji
peptyd kierujący do mitochondriów
promotor 35S CaMV, sekwencja
transformacja 0,1% TSP w tytoniu;
KDEL kierująca białka na szlak
A. tumefaciens 0,08% TSP w
sekrecyjny
ziemniaku
promotor 35S CaMV, Ω–wzmacniacz transformacja 15 µg/g tkanki
translancji, sekwencja SEKDEL
A. tumefaciens
kierująca białka na szlak sekrecyjny
IL-12
liście N. tabacum
promotor 35S CaMV, terminator 35S transformacja 40ng/g
CaMV
A. tumefaciens
IL-12
liście i owoce
Lycopersicon
esculentum
zawiesina
komórkowa
N. tabacum
promotor 35S CaMV z podwójnym
wzmacniaczem, terminator 35S
CaMV
promotor 35S CaMV z podwójnym
wzmacniaczem transkrypcji,
Ω-wzmacniacz translancji
promotor 35S CaMV z podwójnym
wzmacniaczem transkrypcji;
wzmacniacz translacji z wirusa
AMV, KDEL, terminator nos
IL-12
IL-13
liście N. tabacum
Kardiotrof liście N. tabacum, 1. promotor rrn (promotor 16S RNA)
ina-1 transformacja
i wzmacniacz translacji (5’UTR genu
chloroplastów
10 faga T7)
2. promotor psbA i wzmacniacz
translacji (5’UTR psbA)
IFN-α2b liście N. tabacum, Kaseta ekspresyjna:
transformacja
5’UTR/HIS/THR/IFNα2b
chloroplastów
sklonowana w wektorze
chloroplastowym pLD-CtV
transformacja 7,3μg/g liści
A. tumefaciens 4,3μg/g owoców
transformacja 175μg/l
A. tumefaciens
transformacja 0,15% TSP
A. tumefaciens
mikrowstrzeliw 1. 0,14 mg/g
anie
2. do 1,14 mg/g
mikrowstrzeliw 3mg/g, 20% TSP
anie
Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94
ROŚLINY TRANSGENICZNE:
PBJ (2008) 6, 504-515
Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant
human granulocyte-macrophage colony stimulating factor
production in transgenic rice cell suspension culture
Protein Expr. Purif. (2008) 61, 117-121
Improvement of recombinant hGM-CSF production by
suppression of cysteine proteinase gene expression using
RNA interference in a transgenic rice culture
Plant Mol Biol (2008) 68, 263-275
ROŚLINY
TRANSGENICZNE
1. Konstrukcja kasety
ekspresyjnej (wybór
promotora)
2. Wprowadzenie kasety
do wektora binarnego
(np.pBINPLUS)
3. Transformacja
Agrobacterium
4. Transformacja tkanki
roślinnej
Figlerowicz i wsp. 2006 , Biotechnologia 3, 53-66
12
Konstrukcja kasety ekspresyjnej (optymalizacja transkrypcji
i translacji)
¾ Promotory konstytutywne: CaMV35S (x2)
¾ Promotory specyficzne-tkankowo: gluteiny Gt1,Gt3, patatyny
¾ Promotory indukowane:
• W tytoniu ekspresja po zerwaniu liści przy ich cięciu (CropTech
Corp., USA (promotor MeGATM )
• Promotor genu peroksydazy z wilca ziemniaczanego, po ekspozycji
na zranienie lub UV, 30x silniejszy od promotora 35S CaMV
¾ wzmacniacze translancji: z wirusa AMV, Ω, t-CUP
¾ produkcja w liściach: kierowanie do ER (KDEL)
PBJ(2008),6,504-515
A novel platform for biologically active recombinant
human interleukin-13 production
Funkcje: może być stosowana w leczeniu cukrzycy I typu
Roślina: N.tabacum
Ekspresja: stabilna, promotor CaMV35S z podwójnym wzmacniaczem
transkrypcji, wzmacniacz translancji z wirusa AMV,6xhistag, KDEL
Poziom produkcji: 0,15%TSP
Analiza Western blot
transgenicznych roślin
Deglikozylacja
trawienie trypsyną, pH 8
pepsyna,
pH 1.2
pankreatyna,
pH 6.8
Badanie aktywności
komórki TF-1
oczyszczona IL-13
Co-expression of proteinase inhibitor enhances
recombinant human granulocyte-macrophage colony
stimulating factor production in transgenic rice cell
suspension culture
Protein Expr. Purif. (2008) 61, 117-121
Roślina: zawiesina komórkowa O.sativa
Ekspresja: stabilna, promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu;
współekspresja genu kodującego syntetyczny inhibitor proteaz (sPI-II)
Poziom produkcji: do 250mg/l
Fig.4 Protease activity in
suspension culture medium derived
from transgenic callus
Fig. 5 Measurement of
hGM-CSF accumulation in
suspension culture medium