cytokiny - Wydział Biologii UW

CYTOKINY
Maja Machcińska
Cytokiny – „hormony” układu
odpornościowego




„białkowe przekaźniki”
„rozpuszczalni pośrednicy” komunikowania
się międzykomórkowego.
działają w złożonej sieci, w której produkcja
jednej cytokiny będzie wpływać na produkcję
kilku cytokin lub odpowiadać na nie.
ponad 100 opisanych cytokin i wciąż
odkrywane nowe
Sieć cytokin
http://www.sabiosciences.com/pathway.php?sn=Cytokine_Network
Cechy cytokin:

Proteiny lub glikoproteiny

Niskocząsteczkowe (przeważnie <30kDa)

Wysoka aktywność biologiczna, działają w stężeniach pikomolarnych

Brak właściwości enzymatycznych

Produkowane przez wszystkie tkanki, ale głównie przez komórki układu
immunologicznego (najwięcej DC, Makrofagi i limfocyty Th)

Produkcja nie jest konstytutywna, a wynika ze stymulacji
(zaburzenie homeostazy)

Działają głównie lokalnie

Produkcja cytokin jest ściśle kontrolowana na wielu poziomach
Właściwości cytokin:
Plejotropowość – zdolność do
wielokierunkowego działania
Redundancja – różne cytokiny
wpływają jednakowo na daną
populację komórek
Synergizm – dodatni wpływ obu
cytokin na dane zjawisko
Antagonizm – przeciwstawne
działanie dwóch (lub więcej) cytokin
Właściwości cytokin:

Pętle sprzężeń
zwrotnych
Th1
(+)
IL-12
IFNγ
(-)
IL-10
Makrofag
(+)
IFNγ
IL-12
(+)
Th1
(+)
TNF
http://www.nature.com/nri/journal/v2/n1/images/nri702-f2.gif
http://www.nature.com/nri/journal/v2/n1/fig_tab/nri702_F3.html
Wielopoziomowa rola cytokin:




Indukują w komórkach:
 proliferację
 różnicowanie
 chemotaksję (przemieszczania się)
 cytotoksyczność
 produkcję przeciwciał
 przeżycie/apoptozę
Regulują:
 interakcje międzykomórkowe
 intensywność i czas trwania odpowiedzi immunologicznej
Kontrolują:
 działanie i dojrzewanie komórek ukł. odpornościowego
 procesy zapalne
Kluczowa rola podczas odpowiedzi immunologicznej oraz
podczas naprawy tkanek
Kontrola produkcji cytokin:

Regulacja przez czynniki transkrypcyjne (np. NFκB)

wewnątrzkomórkowa regulacja produkcji cytokin – występowanie
sekwencji destabilizującej na 3’ końcu mRNA cytokin, powodują, że
to mRNA jest niestabilne

„Specyfikacja komórkowa”
(niektóre cytokiny produkowane są tylko przez określony rodzaj
komórek)

Produkcja cytokin zależy nie tylko od rodzaju komórki, ale i od stopnia
jej zróżnicowania, dojrzałości
Kontrola produkcji cytokin:

Regulacja ekspresji receptorów dla cytokin na powierzchni
komórek docelowych

Konieczność kontaktu między komórkami - powstawanie synapsy
immunologicznej zapewniającej odpowiednie stężenie cytokin

Okres półtrwania cytokin w krążeniu oraz zewnątrzkomórkowych
płynach jest zazwyczaj bardzo krótki

Antagoniści cytokin – szereg białek blokujących biologiczną
aktywność cytokin. Białka te mogą wiązać się z:
 receptorem dla cytokin np. antagonista dla IL-1: IL-1Ra
(antagoniści nie są w stanie aktywować komórek, tylko blokują receptor)

bezpośrednio z cytokiną hamując jej aktywność i uniemożliwiają
jej połączenie z receptorem na powierzchni komórki
Działanie cytokin:
Receptory dla cytokin:
Przekazywanie sygnału
To, że różne cytokiny
wywołują ten sam efekt
w danej komórce jest
związane z podobieństwem
w domenach receptorów
http://www.cellsignal.com/reference/pathway/images/Jak_Stat_IL_6.jpg
udział receptorów wykorzystujących
kinazy tyrozynowe i białka STAT
Podział cytokin
Chemokiny
Interleukiny
TNF
CYTOKINY
Cytokiny
krwiotwórcze
… i inne np. TGF-β, MIF
Interferony
Interleukiny



Umożliwiają komunikację leukocytów między sobą
i pozwalają na wpływ jednych populacji leukocytów na inne.
Duża grupa cytokin, produkowane głównie przez komórki T
Różnorakie funkcje, większość zaangażowana w kierowanie innych
komórek do podziału i różnicowania
IL-2
IL-4
IL-6
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/87/IL2_Crystal_Structure.png/180px-IL2_Crystal_Structure.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1c/IL4_Crystal_Structure_recombinant.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e7/IL6_Crystal_Structure.rsh.png/180px-IL6_Crystal_Structure.rsh.png
Czynniki krwiotwórcze

G-CSF (czynnik stymulujący powstawanie kolonii granulocytów) pobudza tworzenie granulocytów w szpiku

M-CSF (czynnik stymulujący powstawanie kolonii makrofagów) pobudza szlak tworzenia monocytów i wpływa na dojrzałe monocyty
i makrofagi

GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i
makrofagów) - pobudza powstawanie granulocytów i makrofagów
oraz wpływa na limfocyty

erytropoetyna - pobudza rozwój erytrocytów

SCF (czynnik komórek macierzystych) - wpływa na młode,
multipotencjalne komórki macierzyste krwiotworzenia

Ligand Flt3 – działa na bardzo wczesne komórki krwiotwórcze,
czynnik dojrzewania komórek dendrytycznych
Chemokiny
„chemoattractant





cytokines”
Ponad 50 zidentyfikowanych chemokin
Działanie chemotaktyczne - tworzą one gradient
chemotaktyczny, śladem którego wędrują komórki.
Udział w aktywacji, proliferacji i różnicowaniu różnych
leukocytów
Regulacja angiogenezy, tworzenie przerzutów nowotworowych
Określane dwiema nazwami:
1. Budowa
2. Właściwości fizjologiczne
Chemokiny
Podział ze względu na budowę
Chemokiny
Podział ze względu na właściwości fizjologiczne
1. Chemokiny prozapalne (indukowane)


Reakcja zapalna
Przyciąganie do miejsc objętych procesem zapalnym komórek
efektorowych odpowiedzi immunologicznej:
2. Chemokiny limfoidalne (konstytutywne lub


homeostatyczne)
Wytwarzane stale
Regulują krążenie różnych populacji limfocytów, sterują migracją komórek
dendrytycznych, uczestniczą w przemieszczaniu się dojrzewających
tymocytów do odpowiednich rejonów grasicy
Interferony




Grupa cytokin wytwarzana i uwalniana przez komórki w
odpowiedzi na zakażenie wirusowe
Wiodąca rola w odpowiedzi przeciwwirusowej – brak
bezpośredniego działania przeciwirusowego 
oddziałują na komórki indukując w nich powstanie
czynników przeciwirusowych
Mogą pobudzić komórki ukł. odpornościowego do
zabicia komórek zakażonych przez wirusy
Hamują proliferację i indukują różnicowanie wielu
komórek
Interferony

Trzy typy:
- TYP I – Interferon α, β, ε, ω, κ
- TYP II – Interferon γ
- TYP III – Interferony λ (IL-28A, IL-28B, IL-29)
Nadrodzina cząsteczek TNF

Ponad 20 cząsteczek białkowych o podobnej budowie.

Nie wszystkie są cytokinami (mogą to być też białka błonowe).

TNF (Tumor Necrosis Factor) - czynnik martwicy
nowotworu
FasL
TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand)


Nadrodzina cząsteczek TNF

TNF-α






cytotoksyczny względem wielu linii komórek nowotworowych (stąd
nazwa)
cytokina prozapalna produkowana głównie przez makrofagi i
monocyty
poprzez swoje receptory (o ile są one obecne na komórce
nowotworowej) uruchamia kaskadę prowadzącego do apoptozy
(kwas arachidonowy; wolne rodniki)
analogicznie wobec komórek zakażonych patogenami
pobudza wątrobę do produkcji białek ostrej fazy w tym CRP
przyciąga neutrofile
TNF

Niskie stężenie 
wynaczynienie leukocytów

Średnie stężenie 
produkcja białek ostrej fazy
przez hepatocyty; gorączka,
zwiększona produkcja
leukocytów w szpiku

Wysokie stężenie  szok
septyczny (serce, układ
krwionośny, hiperglikemia,
śmierć)
http://www.nature.com/nri/journal/v2/n1/fig_tab/nri702_F3.html
Inne cytokiny

TGF-β – transformujący czynnik wzrostu
- występuje w trzech odmianach: β1, β2, β3
- wytwarzamy m.in. przez makrofagi, neutrofile, płytki krwi i limfocyty
- działa hamująco na proliferację limfocytów T i B oraz komórek NK
- zmniejsza wydzielanie wielu cytokin
- hamuje ekspresję MHC II i powstawanie limfocytów Tc
- bierze udział w gojeniu się ran i stymuluje powstawanie naczyń

MIF – czynnik zahamowania migracji makrofagów
- Wytwarzany głównie przez monocyty i makrofagi np. pod wpływem
endotoksyny i niektórych cytokin
- Pobudza makrofagi do zabijania mikroorganizmów i komórek
nowotworowych
- Bierze istotny udział w rozwoju nadwrażliwości typu drugiego
Cytokiny produkowane przez limfocyty Th:

Limfocyty Th CD4+ można podzielić na subpopulacje
w oparciu o produkowane cytokiny:

limfocyty Th1 – indukcja odpowiedzi komórkowej:
obrona organizmu przed wirusami i patogenami wewnątrzkomórkowymi,
eliminacja komórek nowotworowych, rekrutacja komórek fagocytujących w
miejsce infekcji

limfocyty Th2 – indukcja odpowiedzi humoralnej:
eliminacji patogenów zewnątrzkomórkowych i zwiększenie produkcji
przeciwciał (gł. IgE)

limfocyty Th3 – cytokiny o właściwościach supresorowych TGF-β
Polaryzacja immunologiczna
http://www.nature.com/nri/journal/v3/n12/fig_tab/nri1246_F1.html
Polaryzacja immunologiczna
IL-12, INF-γ
Th1
IFN-γ
IL-2
Odpowiedź komórkowa
Th0
IL-4
Th2
IL-4
IL-5
IL-10
IL-13
Odpowiedź humoralna
http://www.nature.com/nri/journal/v2/n1/images/nri702-f4.gif
Metody wykrywania cytokin
Wykrywanie cytokin



Poziom cytokin ulega gwałtownym i znaczącym
zmianom w wielu chorobach (głównie podczas
infekcji i stanów zapalnych).
Cytokiny są bezpośrednio zaangażowane w proces
rozwoju wielu patofizjologicznych procesów u ludzi
Stosowanie cytokin oraz inhibitorów cytokin w
próbach klinicznych i w leczeniu wymuszają
powstawanie coraz dokładniejszych metod pomiaru
cytokin.
Metody wykrywania cytokin na różnych
poziomach
1. mRNA dla cytokin




PCR
FISH
Northern-blot
RPA
2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny

Metoda wewnątrzkomórkowego barwienia + FACS
3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki



ELISA
ELISPOT
RIA
4. Cytokiny w homogenatach tkankowych, płynach surowiczych,
supernatantach zebranych znad hodowli



Western blot
Testy immunologiczne
Testy biologiczne
Metody wykrywania cytokin
1. Ocena ekspresji cytokinowego mRNA



Obecne komórki odpornościowe wykazują
słabą ekspresję cytokinowego mRNA lub
nawet jej całkowity brak
Po stymulacji komórek obserwuje się
zauważalny wzrost poziomu mRNA
wykrywany metodami biologii molekularnej
Wykrycie mRNA typowych cytokin zapalnych
(TNF-α, IL-6, IL-8)
Metody wykrywania cytokin
1. Ocena ekspresji cytokinowego mRNA




PCR
FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ)
Northern-blot
RPA (RNA-se protection assay)
Metody wykrywania cytokin
1. Ocena ekspresji cytokinowego mRNA

PCR
- Metoda jakościowa i ilościowa ekspresji genu
- Ograniczenia:

musimy znać sekwencję badanego genu
(projektowanie starterów)
 zmiany posttranslacyjne, którym podlegają
transkrypty niektórych cytokin
Metody wykrywania cytokin
1. Ocena ekspresji cytokinowego mRNA
PCR – zastosowania w praktyce klinicznej




szacowanie ekspresji cytokinowego mRNA w węzłach
chłonnych oraz w komórkach osób cierpiących na chłoniaka
Hodgkina (Metoda umożliwia detekcję zmian wywołanych
uszkodzeniem prawidłowego genu)
diagnostyka molekularna przy wykrywaniu licznych
patogenów: grzybów, wirusów i bakterii w tkankach
onkologia kliniczna
określanie kinetyki ekspresji genów docelowych w odpowiedzi
na enzymy, warunkujące dystrybucję i funkcjonowanie leku
Metody wykrywania cytokin
1. Ocena ekspresji cytokinowego mRNA
FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ)
skrawki tkankowe, zawiesiny
komórek
 identyfikacja komórek
bezpośrednio odpowiedzialnych za
syntezę cytokiny w heterogennej
populacji komórkowej
 metoda czuła, czasochłonna, droga
wymaga prowadzenia ścisłej
kontroli wewnętrznej

van de Corput MP i wsp. Sensitive mRNA detection by fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled
oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification.J Histochem Cytochem. 1998 Nov;46(11):1249-59.
Metody wykrywania cytokin
1. Ocena ekspresji cytokinowego mRNA
RPA (RNA-se protection assay) i Northern-blot
 Metody ilościowe
 RPA – czuła metoda wykorzystywana do detekcji i
ilościowej oceny swoistych transkryptów mRNA w
mieszaninie całkowitego RNA. Pozwala na wykrycie
wielu transkryptów w pojedynczej próbce RNA.
 Metoda Northern-blot - detekcja kilku transkrytpów,
jednak działanie takie wymaga przeprowadzenia
przynajmniej kilku cykli reakcji. Metoda około 10krotnie mniej swoista od RPA.
Metody wykrywania cytokin
2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny
Metoda wewnątrzkomórkowego barwienia


szybka analiza dużej liczby komórek
zastosowanie kilku różnych fluorochromów jednocześnie 
można ocenić koprodukcję kilku cytokin w obrębie
pojedynczej komórki
FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting)


analiza pojedynczej komórki (kilka parametrów
jednocześnie)
dodatkowo umożliwia sortowanie
Barwienie wewnątrzkomórkowe
cytokin.
Eliza Turlej. Współczesne metody detekcji cytokin – real time PCR, ELISPOT oraz technika
wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2009; 63: 213-224
Metody wykrywania cytokin
2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny
Parametry od których zależy prawidłowe
znakowanie cytokin metodą cytometru
przepływowego:




Rodzaj komórek i sposób ich aktywacji (wybór
odpowiedniego stymulatora)
Czas w jakim prowadzi się hodowlę komórek po ich
aktywacji (cytokiny nie są produkowane
konstytutywanie)
Blokowanie transportu białek w komórkach (wybór
inhibitora transportu białek)
Wybór przeciwciała przeciw badanej cytokinie
Metody wykrywania cytokin
2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny
PRZYKŁADY ZASTOSOWANIA BADANIA
WEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH CYTOKIN W KLINICE
•
•
•
•
•
Wykrywanie wewnątrzkomórkowych cytokin w zakażeniach
bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych.
Ekspresja wewnątrzkomórkowych cytokin w chorobach
nowotworowych, autoimmunizacyjnych, alergicznych i
niedoborach odporności.
Analiza ekspresji cytokin w chorobach o podłożu
neurologicznym oraz w badaniach oddziaływania hormonów
na funkcjonowanie układu immunologicznego.
Badanie udziału cytokin w procesie starzenia, w przebiegu
ciąży i patologii ciąży.
Zaburzenie funkcjonowania sieci cytokinowej przez czynniki
zanieczyszczające środowisko.
Metody wykrywania cytokin
3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki

ELISA
- ELISA bezpośrednia
- ELISA pośrednia
- Sandwich ELISA
- ELISA kompetycyjna

ELISPOT

RIA – test radioimmunologiczny
Metody wykrywania cytokin
3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

test immunoenzymatyczny oparty o fazę stałą,

oznaczanie przeciwciał lub antygenów (hormony, enzymy,
cytokiny, antygeny bakteryjne, leki), z wykorzystaniem
odczynników znakowanych enzymami,

test ilościowy,

metoda czuła, prosta,

duża ilość oznaczeń w krótkim czasie,

jeden z najpowszechniej stosowanych
testów w badaniach biomedycznych
(naukowych i diagnostycznych).
http://www.drgmedtek.pl/cms/sites/default/files3image/elisa%20zdj%C4%99cie.jpg
ELISA


Antygen związany w fazą stałą
Przeciwciało skoniugowane z enzymem
http://dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostyka/labowe-%E2%80%9Eknow-how%E2%80%9D-elisa/
ELISA
http://www.leinco.com/indirect_elisa
ELISA – odczyt wyników

Spektrofotometr – pomiar absorbancji światła
o określonej długości fali
http://www.biogenet.com.pl/oferta/pomiary-absorbancji-fluorescencji-luminescencji/czytniki-absorbancji-elisa/czytnik-absorbancji-elisa-spectrostar--nano.html
http://www.poultry-health.com/library/serodiss/elisa.htm
Metody wykrywania cytokin
Produkcja cytokin na zewnątrz komórki
Sandwich ELISA – „test podwójnego wiązania”



Przeciwciało wychwytujące i detekcyjne
Zwiększona czułość i specyficzność testu
Ogranicza wpływ możliwych reakcji krzyżowych z
antygenami o podobnej strukturze
Sandwich ELISA
http://www.google.pl/imgres?imgurl=http://www.epitomics.com/images/products/sandwich_dual.jpg&imgrefurl=http://www.epitomics.com/products/product_info/1433/MIP-1--61181.html&usg=__5I_Q7YNBfvjreWwGzLo27RLLIkQ=&h=236&w=630&sz=52&hl=pl&start=3&zoom=1&tbnid=52k8gfYZ8ZDdYM:&tbnh=51&tbnw=137&ei=PmSSTeSLA8eg8QOvuPzpAw&prev=/images%3Fq%3Ds
andwich%2BELISa%26hl%3Dpl%26client%3Dfirefox-a%26hs%3DDP3%26sa%3DX%26rls%3Dorg.mozilla:pl:official%26tbs%3Disch:1%26prmd%3Divnsb&itbs=1
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Płytka jest pokrywana przeciwciałami specyficznymi;
Dodawana jest próbka, i jeśli jest obecny antygen, wiąże się on do
specyficznych przeciwciał;
Dodanie przeciwciała wykrywającego;
oraz drugorzędowego przeciwciała wyznakowanego enzymem i
wiążącego przeciwciała wykrywające;
Dodanie substratu, który jest przekształcany do wykrywalnej formy
przez enzym na przeciwciałach drugorzędowych.
Metody wykrywania cytokin
3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki
ELISPOT (ENZYME-LINKED IMMUNOSPOT ASSAY)




Zmodyfikowana ELISA
Połączenie techniki immunoenzymatycznej fazy stałej z
krótkoterminową hodowlą komórkową trwającą od kilku
godzin do kilku dni.
Wysoka czułość
Można wykryć pojedynczą komórkę wydzielającą dane
białko (cytokinę, białko efektorowe, receptor, marker
powierzchniowy, przeciwciało) wśród 1 000 000 komórek w
hodowli.
ELISPOT
a) Płytka opłaszczona
przeciwciałem
wiążącym (swoiste dla
danej cytokiny).
b) Związanie
wydzielanej cytokiny z
przeciwciałem
c) Płukanie
d) Dodanie znakowanego
biotyną przeciwciała
wtórnego
e) Dodanie enzymu
sprzężonego ze
straptawidyną
ELISPOT
f) Dodanie substratu: w
obecności enzymu
przekształca się w
barwnik
g) Zatrzymanie reakcji
h) W miejscu reakcji
immunoenzymatycznej
powstaje plamka barwna
i) Liczenie plamek –
skaner z systemem
analizy obrazu
Metody wykrywania cytokin
3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki
ELISPOT – zastosowania w praktyce klinicznej
 analiza limfocytów T swoistych dla antygenów związanych z komórkami
czerniaka
 w badaniach nad limfocytami T swoistymi dla cytomegalowirusa u
pacjentów, u których wykazano reaktywację tego wirusa,
 detekcja limfocytów B swoistych idiotypowo u osób cierpiących na
szpiczaka mnogiego,
 oznaczanie poziomu INF-γ u osób chorujących na gruźlicę
 stosowana do monitorowania odpowiedzi immunologicznej u pacjentów
- cierpiących na nowotwory,
- poddawanych immunoterapii,
- podczas infekcji i chorób autoimmunologicznych,
 monitorowania skuteczności szczepionek przeciwko HIV, wirusowemu
zapaleniu wątroby, cholerze, półpaścowi, grypie i malarii
 niezastąpiona metoda w immunologii onkologicznej, diagnostyce
reumatologicznej i diabetologii
 zastosowanie w alergologii
Metody wykrywania cytokin
Produkcja cytokin na zewnątrz komórki
RIA (Radioimmunoassay) - test radioimmunologiczny



Odmiana ELISA
Przeciwciała monoklonalne wyznakowane izotopami (np. Cr, I, P, C)
Analiza za pomocą licznika promieniowania
RIA – test radioimmunologiczny

Oznaczenia ilościowe hormonów, antygenów nowotworowych, przeciwciał,
niektórych leków, witamin

Wysoka czułość i specyficzność

znaczniki radioizotopowe: 125I (składniki białkowe), 131I, 14C, 3H (związki
drobnocząsteczkowe)

Podczas przeprowadzania testu jeden ze składników reakcji jest związany
z fazą stałą (nośnikiem), a drugi składnik znajduje się w fazie płynnej, albo oba
składniki reakcji (antygen i przeciwciało) znajdują się w fazie płynnej.

Metody RIA zostały stworzone przez Rosalyn Sussman Yalow i Solomona Bersona. W
1977 r. Yalow otrzymała za swoje odkrycie Nagrodę Nobla.
RIA – test radioimmunologiczny
1. Inkubacja wyznakowanego
antygenu z surowicą zawierającą
przeciwciała.
2. Dodanie niewyznakowanego
antygenu (jako standard lub jako
próbkę).
3. Wyznakowany i niewyznakowany
antygen konkurują o wiązanie się z
przeciwciałami. Im więcej
nieznakowanego antygenu, tym mniej
znakowanego antygenu ma szansę
związać się z przeciwciałami.
4. Rozdzielenie niezwiązanego
antygenu od kompleksów antygenprzeciwciało i
5. Pomiar radioaktywność wybranej
frakcji.
Cytokiny w homogenatach tkankowych,
płynach surowiczych, supernatantach
zebranych znad hodowli

Western blot

Testy immunologiczne


techniki badawcze wykorzystujące przeciwciała
monoklonalne
Testy biologiczne

linie komórkowe będące bioindykatorami obecności cytokin
(cytokiny wywołują w nich określony efekt)
Testy biologiczne






testy proliferacyjne i antyproliferacyjne mierzą
wzrost/spadek liczby komórek
testy cytotoksyczne – gł. w odniesieniu do
TNF
właściwości przeciwwirusowe- gł. interferony,
inhibicja replikacji wirusowej
indukcja ekspresji molekuł powierzchniowych
właściwości chemotaktyczne
inhibicja sekrecji cytokin