Opracowanie profili transkrypcyjnych transgenicznych

OPRACOWANIE PROFILI
TRANSKRYPCYJNYCH
TRANSGENICZNYCH ROŚLIN POMIDORA
PRZY UŻYCIU MICROARRAY cDNA
SPRAWOZDANIE Z POBYTU
W
MAX-PLANCK INSTITUT
FÜR MOLEKULARE PFLANZENPHYSIOLOGIE
dr MAGDALENA EWA KOWALCZYK
KGHiBR, SGGW
październik 2004
Max-Planck-Institut
für Molekulare Pflanzenphysiologie
CEL WYJAZDU
POZNANIE TECHNIK ARRAY:
- NYLON
- GLASS SLIDE
PROGRAM DO WIZUALIZACJI
OBRAZU OTRZYMANEGO PO
ANALIZIE ARRAY - MapMan
ANALIZA TRANSKRYPTOMU -nylon
Haruspex
TWORZENIE REPLIK FILTRÓW
ANALIZA
OBRAZU
HYBRYDYZACJA
Z SONDĄ
ZNAKOWANĄ
AIS
IZOTOPEM
7
3
6
D
1
4
5
2
2
LB
1
3
4
6
7
5
7
1
2
4
3
4
LB
6
6
5
1
7
D
2
3
5
CloneID
184A18T7
187D14T7
184A23T7
187E2T7
184B9T7
187E3T7
184B14T7
187E8T7
184B22T7
187E14T7
184C4T7
187F1T7
184C10T7
187F2T7
Intensity
197.82
122.04
83.44
148.16
327.56
363.54
206.29
393.01
59.61
47
14.85
80.94
166.29
123.33
INTENSYWNOŚĆ SYGNAŁU
ANALIZA TRANSKRYPTOMU -glass slide
2-KANAŁOWY POMIAR FLUORESCENCJI
PRÓBY WYZNAKOWANE
FLUORESCENCYJNIE
red/green
POMIAR ILOŚCIOWY
KONTROLA
TEST
HYBRYDYZACJA
I ODMYCIE
IDENTYFIKACJI GENÓW
ULEGAJĄCYCH ROŻNICOWEJ
EKSPRESJI
WAGA (g)
WIELKOŚĆ (cm)
PROJEKT DOTYCZĄCY AKTYWNOŚCI ENZYMÓW
UCZESTNICZĄCYCH W CYKLU KREBSA
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
70
60
50
40
30
20
10
0
15
25
35
45
55
DNI PO ZAPYLENIU
•TRANSKRYPTOMIKA
•PROTEOMIKA
•METABOLOMIKA
65
75
CYKL KWASÓW TRIKARBOKSYLOWYCH
PYR
PDC
ACCoA
CitSyn
MdH
Fum
SdH
OAA
MAL
CIT
isoCIT
FUM
SUCC
SCoALig
Aco
SUCCCoA
Isod
2-OG
2-OGdH
CELE DOŚWIADCZEŃ
ANALIZA PROFILI
EKSPRESYJNYCH
ROŚLIN POMIDORA O
ZMIENIONEJ FOTOSYNTEZIE
W PORÓWNANIU
DO TYPU DZIKIEGO
Carari F. Plant Physiol. 2003;133:1322-35
Lycopersicon Penelli - Aco1
L.p.
Aco1
•PRÓCZ REDUKCJI CYKLU KREBSA
•ZMIANA W NATĘŻENIU FOTOSYNTEZY - WYŻSZE
•WPŁYW NA PLONOWANIE
Carari F. Plant Physiol. 2003;133:1322-35
AKTYWNOŚĆ ENZYMU BYŁA NIŻSZA
W ROŚLINACH TRANSGENICZNYCH
Carari F. Plant Physiol. 2003;133:1322-35
PARAMETRY FOTOSYNTEZY
B
A (µmol m-2s-1)
14
Lp
Aco
12
*
*
*
10
- ASYMILACJA
*
8
6
4
2
0
*
C
E (mmol m-2s-1)
1,6
*
1,4
- TRANSPIRACJA
1,2
*
1 ,0
*
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
200
400
600
800
PFD(µmol m-2s-1)
1000
1200
Lycopersicon Penelli - Fum
WT
t 41
t 11
t 63
t 56
•ZNACZNIE OBNIŻONY POZIOM FOTOSYNTEZY
•APARATY SZPARKOWE ZAMKNIĘTE
•SPADEK SUCHEJ MASY
t64
t42
t58
t68
t34
t63
t56
t11
0
t41
WT
Fumarase Activyity
(µmol min-1 g FW-1)
AKTYWNOŚĆ ENZYMU BYŁA NIŻSZA
W ROŚLINACH TRANSGENICZNYCH
5
4
3
2
*
1
*
PARAMETRY FOTOSYNTEZY
B
A (µmol m-2s-1)
8
6
14
12
*
10
*
*
*
*
*
*
*
4
- ASYMILACJA
2
*
0
0 200 400 600 800 1000 1200
WT
t11
t41
C
E (mmol m-2s-1)
1,6
1,4
2,0
1,2
1 ,0
0,8
0,6
0,4
*
*
*
*
*
*
*
- TRANSPIRACJA
1,5
1,0
0,5
0,2
0,0
0 200 400 600 800 1000 1200
PFD(µmol m-2s-1)
1200
METODYKA
ILOŚĆ WYJŚCIOWA MATERIAŁU OK.150 mg TKANKI
cDNA - SYNTEZA NA DYNABEADS Oligo dT(25)
KONTROLA:
• PIERWSZA NIĆ - qPCR - STARTERY ZAPROJEKTOWANE
DO FRAGMENTU 1,3 kpz - DO KOŃCA 3’ I 5’
GAPDH 5' End:
upper: 5'-AAGGACAAGGCTGCTGCTCAC
lower: 5'-AACTCTGGCTTGTATTCATTCTCG
GAPDH 3' End:
upper: 5'-TTCAACATCATCCCTAGCAGCACT
lower: 5'-TAAGGTCGACAACAGAAACATCAG
Program :
15 min 95oC ,40 Cykli: 15 s 94oC, 30 s 53oC ,30 s 72oC
STOSUNEK 1:1 (3’ : 5’) właściwy
•SYNTEZA DRUGIEJ NICI - OCENA ILOŚCI I CZYSTOŚCI
ZASTOSOWANE POWIÓRZENIA:
I eksperyment Aco
Wt - Ulysis Alexa Fluor 532 dye red
Aco1a - Ulysis Alexa Fluor 647 dye green
Wt -Ulysis Alexa Fluor 647 dye 647green
Aco1b- Ulysis Alexa Fluor 532 dye red
II eksperyment Fum
Wt - Ulysis Alexa Fluor 532 dye red
Fum1a- Ulysis Alexa Fluor 647 dye 647 green
Wt -Ulysis Alexa Fluor 647 dye 647green
Fum 1b - Ulysis Alexa Fluor 532 dye red
Hybrydyzacja
- ciemność 420C 12 godz.
Bufor
0,1% SDS
25% Formamid
5x SSC
10 mg/ ml BSA V
40 mM Na PP
100 ml
1 ml 10% SDS
25 ml Formamid
25 ml 20x SSC
1g BSA fraction V
4 ml 1 M Na PP pH 6,8
Skanowanie i analiza obrazu
• microarray scanner (ScanArray5000; GSI Lumonics,
MA) i ScanArray software (v3.1, Packard BioChip
Technologies, MA).
• 2 kanały 543 um/570 um i 633 um/670 um
• Analiza obrazu - GenSpotter 2.3.9
METODYKA
Hybrydyzacja glass- slide TOM1
• http://ted.bti.cornell.edu/microarray.html
• 12 860 EST - 8,500 niezależnych loci
• LB+Amp 24-48 hrs at 37 oC: PCR - 95 oC for 2 min, 39 cykli
(94 oC for 20 sec, then 52 oC for 20 sec, then 72 oC for 1.5 min),72 oC for 10 min.
• 2x 15 uL PCR oczyszczanie Genesis RSP 200 Liquid Handler (TECAN Inc., NC)
nanoszenie na szkiełko g-amino-propyl-silane (25.3 X 75.5 mm, UltraGAPS;
Corning Inc., NY) za pomocą MicroGrid Pro arrayer (BioRobotics Inc., MA)
ilość kropel (spot) - 27 spots, mycie - 7 seonds, suszenie - 10 seconds,
• Warunki spotingu:Temperatura i wilgotność 18-21 oC and 35-45% RH,
• cDNA - UV i zapiekanie w 85oC.
• 2 minuty - 0.2% SDS, 3x Milli-Q® woda, 1x 90% EtOH (2 min at 500 rpm).
• Warunki przechowywania (~21oC, 0% RH).
KATEGORIE FUNKCJONALNE GENÓW - 12 860
ARRAY TOM1
Primary
Metabolism
Hormons
Stress
Cell and
Development
Signaling
Miscellaneous
Protein
Secondary
Metabolism RNA/DNA
Transport
PODSUMOWANIE WYNIKÓW
ANALIZY TRANSKRYPCYJNEJ MICROARRAY cDNA
Aco1 FUM
FOTOSYNTEZA
26
13
METABOLIZM C i N
34
11
METABOLIZM AMINOKWASÓW
19
8
ŚCIANA KOMÓRKOWA
19
11
WTÓRNE METABOLITY
18
4
RÓŻNE
16
36
PODSUMOWANIE
W OBU ANALIZOWANYCH PRZYPADKACH
ROŚLIN ZE ZMIENIONA FOTOSYNTEZA
EKSPRESJA GENÓW ZAANGAŻOWANYCH
W PROCESY FOTOSYNTEZY ULEGŁA ZMIANIE
KIERUNEK ZMIAN EKSPRESJI TYCH GENÓW
BYŁ PROPORCJONALNY DO ZMIAN NATĘŻENIA
FOTOSYNTRZY
PARĘ SŁÓW O ................
Thimm O. Plant Journal (2004) 37, 914-939
MapMan
- PROGRAM DO WIZUALIZACJI WYNIKÓW
PO ANALIZIE ARRAY
http://gabi.rzpd.de/projects/MapMan/
• OPRACOWANY DLA ARABIDOPSIS
• W SPOSÓB SCHEMATYCZNY PRZEDSTAWIA
EKSPRESJĘ GENÓW DZIELĄC JE
W GRUPY FUNKCJONALNE
• KAŻDY GEN O ZMIENIONYM POZIOMIE EKSPRESJI
JEST OZNACZONY NA SCHEMACIE
ODPOWIEDNI KOLOREM I NATĘZENIAM
OBRAZUJĄC NATĘŻENIE EKSPRESJI
Thimm O. Plant Journal (2004) 37, 914-939
Thimm O. Plant Journal (2004) 37, 914-939
Thimm O. Plant Journal (2004) 37, 914-939
Thimm O. Plant Journal (2004) 37, 914-939
PODZIĘKOWANIA
Ilse Balbo
Fernando Carrari
Björn Junker
Anna Lytovchenko
Adriano Nunes-Nesi
Nicolas Schauer
Claudia Stuart-Guimaraes
Björn Hegemann
Ewa Urbańczyk-Wochniak
Alisdair Fernie &
Lothar Willmitzer
Max-Planck-Institut
für Molekulare Pflanzenphysiologie
PODZIĘKOWANIA DLA
CZŁONKÓW SIECI
A SZCZEGÓLNE DLA KOORDYNATORA
PROF. JERZEGO CHEŁKOWSKIEGO
Two Channel Microarray
Hybridization