Serologiczne i molekularne metody stosowane w diagnostyce
advertisement
Serologiczne i molekularne metody stosowane w diagnostyce chorób zakaźnych Dr hab. Tomasz Dzieciątkowski mgr Paulina Machura Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawski Uniwersytet Medyczny Identyfikacja patogenów • Bezpośrednia Wykrycie antygenu Wykrycie kwasu nukleinowego • Pośrednia Wykrycie i badanie poziomu przeciwciał Badanie aktywności mechanizmów odporności komórkowej Odpowiedź immunologiczna • Nieswoista: Obejmuje fizjologiczne właściwości ustroju, które utrudniają wniknięcie drobnoustrojów do organizmu i ich namnożenie w początkowej fazie zakażenia • Swoista: U jej podstaw leżą specyficzne reakcje antygenów z przeciwciałami lub odpowiednimi komórkami układu immunologicznego Mechanizmy odporności nieswoistej Miejscowe: kwaśne pH soku żołądkowego ciągłość powłok skórnych lizozym we łzach, ślinie, pocie i innych wydzielinach uszkadza ścianę komórkową głównie bakterii Gram(+) odruchy obronne: kaszel, kichanie, ruch rzęsek nabłonka, wymioty, skurcze jelit laktoferyna występująca we łzach, mleku, ślinie wiążąca żelazo, które potrzebne jest do wzrostu bakteriom itd. Uogólnione: produkcja cytokin, w tym i interferonów: cytokiny wydzielane są głównie przez komórki układu immunologicznego i powodują aktywację tych komórek. Interferony hamują replikację, czyli namnażanie się wirusów Działanie układu dopełniacza Metody serologiczne Testy serologiczne • Oparte na reakcjach antygen-przeciwciało • Wykrywają przeciwciała w surowicy/ płynie mózgowo-rdzeniowym • Wykrywają antygeny (bakterie, wirusy, grzyby, pierwotniaki) przy użyciu znanych surowic odpornościowych Odpowiedni materiał do badań serologicznych • Surowica: do badania serologicznego pobiera się krew żylną na czczo, najczęściej z żyły łokciowej z zachowaniem wszelkich zasad aseptyki przy użyciu jałowej suchej strzykawki. Od dorosłych pobiera się 5-10 ml, od dzieci 2-5 ml, aby można było uzyskać 1-2 ml surowicy. Krew należy przelać do jałowej suchej probówki i zamknąć jałowym gumowym korkiem. W celu uzyskania surowicy próbki z krwią należy wstawić do cieplarki w temp. 37°C na 30-45 minut do czasu powstania skrzepu. Surowicę najłatwiej oddzielić od skrzepu zlewając ją ostrożnie do nowej jałowej probówki lub odciągając jałową pipetą. Jeżeli przy zlewaniu surowicy lub odciąganiu dostanie się do niej nawet niewielka ilość czerwonych krwinek, surowicę należy odwirować i ponownie odciągnąć. • Płyn mózgowo-rdzeniowy: Przy neuroinfekcji do badań w kierunku ściśle określonego zakażenia wystarczy 0,5-1 ml pmr pobranego z nakłucia lędźwiowego. Materiał powinien być pobrany jałowo do wyjałowionych probówek. Miano Ig w pmr nie spada, jeżeli próbka ulega zamrożeniu. Wykrywanie Ig w pmr dotyczy przede wszystkim przypadków o etiologii wirusowej. Odpowiedni materiał do wykrywania antygenów Zależnie od klinicznego obrazu choroby do badań pobiera się różne materiały. Enterowirusy, takie jak poliowirus, znacznie łatwiej jest izolować z kału (wrotami zakażenia enterowirusów jest układ pokarmowy) niż płyn m-r. Materiał musi być pobrany do jałowych naczyń. Do próbek nie wolno dodawać żadnych środków konserwujących. Do tych próbek, w których wirus narażony jest na wysychanie, a ponadto występuje flora bakteryjna (np. wymazy z gardła, nosa, odbytu, kał) dodaje się zbuforowany roztwór soli fizjologicznej z antybiotykami hamującymi wzrost innych niepożądanych drobnoustrojów. Każda próbka musi być wyraźnie i trwale oznakowana: data i godzina pobrania, imię i nazwisko itd. Czym są antygeny? • To złożone cząsteczki (substancje) rozpoznawane przez organizm immunologicznie kompetentny jako obce • Antygenami mogą być: białka, węglowodany, kwasy nukleinowe, związki chemiczne (formaldehyd), antybiotyki (penicylina) • 2 podstawowe cechy antygenów: Immunogennośćzdolność do wywoływania odpowiedzi immunologicznej Swoistość - właściwość swoistego reagowania z przeciwciałami lub uczulonymi komórkami Czym są przeciwciała? • To cząsteczki białkowe syntezowane po pobudzeniu przez antygen i wytwarzane przez komórki plazmatyczne (aktywowane limfocyty B), które są skierowane swoiście przeciwko temu antygenowi • IgG> IgA> IgM> IgD> IgE IgM • Powstają jako pierwsze w odpowiedzi na zakażenie • Występują w surowicy, nie mają możliwości przenikania przez naczynie krwionośne, nie przechodzą przez łożysko (ich obecność u płodu świadczy o zakażeniu) • Szczególnie aktywne w procesie opsonizacji, aglutynacji i wiązania dopełniacza IgG • Główne immunoglobuliny powstające we wtórnej odpowiedzi immunologicznej na antygen czy po szczepieniu • Przenikają przez łożysko • Biorą udział w opsonizacji antygenów, ułatwiając fagocytozę • Mają zdolność aglutynacji, precypitacji, wiązania dopełniacza i neutralizacji Testy do wykrywania przeciwciał • ELISA: • RIA: metody immunoenzymatyczne służące do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych, skoniugowanych z odpowiednim enzymem. metody immunochemiczne, wykrywające reakcję antygenu ze swoistym dla niego przeciwciałem w oparciu o pomiar radioaktywności izotopu promieniotwórczego, którym wyznakowany jest jeden ze składników reakcji (antygen lub przeciwciało). Służą do oznaczeń ilościowych, charakteryzują się wysoką czułością i specyficznością. Test ELISA Wykrywanie swoistych przeciwciał Wykrywanie specyficznych przeciwciał w klasach IgM i IgG testami ELISA: Jest użyteczne do monitorowania statusu immunologicznego pacjenta oraz do stwierdzenia typu zakażenia (infekcja pierwotna/reaktywacja) Czas wykonania: ok. 180 min Charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością • UWAGA: Przeciwciała klasy IgG stanowią marker przebytego zakażenia – pojedyncze badanie IgG jest mało przydatne w diagnozowaniu ostrych postaci zakażeń Badanie surowic parzystych • Surowice pobrane w dwóch różnych momentach zakażenia • Obserwacja zmian w poziomach przeciwciał w klasach IgM i IgG Badanie mechanizmów odporności komórkowej 1. 2. Ocena subpopulacji leukocytów krwi obwodowej i/lub szpiku Ocena ekspresji antygenów powierzchniowych leukocytów Limfocyty T (CD2, CD4, CD8) Limfocyty B (CD19, CD 21) Monocyty (CD14, CD64) Granulocyty (CD33, CD65) 3. 4. 5. Ocena apoptozy leukocytów Badanie odsetków komórek dziewiczych i komórek pamięci (CD45RO/CD45RA) Ocena ekspresji cząstek adhezyjnych (CD11a, CD11b) W badaniach tych wykorzystuje się cytometrię przepływową Cytometria przepływowa • To technika analityczna pozwalająca na szybki pomiar rozproszonego światła lub sygnałów fluorescencji emitowanych przez odpowiednio naświetlone komórki. Pozwala na jakościową oraz ilościową ocenę właściwości fizycznych i biologicznych komórek oraz niektórych ich komponentów: jąder, kwasów nukleinowych, mitochondriów Wykrywanie antygenów • Odczyn aglutynacji: Reakcja, w której antygen jest wiązany przez przeciwciała, co prowadzi do powstania widocznych kompleksów Aglutynacja bezpośrednia (czynna) – antygen łączy się bezpośrednio z przeciwciałem pośrednia (bierna)antygen osadza się na nośniku i dopiero wtedy łączy się z przeciwciałem Wykrywanie antygenów ODCZYNY AGLUTYNACYJNE W MIKROBIOLOGII Bezpośrednie: Pośrednie: odczyn Widala (dur brzuszny) odczyn WeilaWeila-Felixa (dur plamisty) odczyn Wrighta (bruceloza) odczyn aglutynacji lateksowej (rotawirusy) odczyn hemaglutynacji (TPHA – kił kiła) odczyn zahamowania hemaglutynacji (grypa) odczyn antyglobulinowy Coombsa (listerioza) Wykrywanie antygenów • Odczyn precypitacji: Reakcja zachodząca pomiędzy rozpuszczalnym antygenem i rozpuszczalnym przeciwciałem, polegająca na tworzeniu swoistych nierozpuszczalnych kompleksów, których efektem jest precypitat Metody precypitacyjne w mikrobiologii: 1) Test Eleka (diagnostyka błonicy)- pozwala na wykrycie zjadliwoś zjadliwości Corynebacterium diphtheriae poprzez sprawdzenie obecnoś obecności toksyny bakteryjnej 2) testy kłaczkujące VDRL oraz USR (nieswoiste odczyny kiłowe) Wykrywanie antygenów • Odczyn wiązania dopełniacza: Stosowany w wykrywaniu chorób o różnej etiologii wirusowej (np. w zakażeniach wirusami: parainfluenzy, HSV, CMV, adenowirusami, RSV, odry, różyczki, enterowirusami i innymi). Badaną surowicę inkubuje się z wzorcowym antygenem i określoną ilością dopełniacza. Swoiste Ig, jeśli występują w badanej próbce tworzą kompleks z antygenem i dopełniaczem. Wolny (nie związany dopełniacz) wykrywany jest przez dodanie erytrocytów uczulonych przeciwciałami. Jeżeli dopełniacz nie jest związany dochodzi do lizy erytrocytów (wynik ujemny). Jeżeli dopełniacz został związany przez kompleks antygen wirusowy i przeciwciało pacjenta erytrocyty nie ulegają lizie (wynik dodatni) • OWD wykorzystywany w diagnostyce: chorób bakteryjnych- kiła, bruceloza, tularemia, listerioza chorób wirusowych- grypa, polio, KZM chorób grzybiczych- kandydoza Wykrywanie antygenów • Odczyn immunofluorescencji (IF): Immunofluorescencja bezpośrednia (DIF) – Swoiste przeciwciało mono- lub poliklonalne wykrywające określony antygen znakowane jest fluorochromem pośrednia (IIF)Swoiste przeciwciało jest nieznakowane. Do wykrycia wiązania antygenu z przeciwciałem stosuje się znakowane przeciwciało „drugorzędowe”, skierowane przeciwko pierwszemu przeciwciału Wykrywanie antygenów Odczyn immunofluorescencji (IF): metoda badania reakcji antygen - przeciwciało stosowana najczęściej w testach immunohistochemicznych, z wykorzystaniem przeciwciał znakowanych fluorochromami. wynik reakcji w postaci świecących kompleksów odczytuje się w świetle ultrafioletowym w mikroskopie fluorescencyjnym, konfokalnym lub za pomocą cytometru przepływowego. Immunofluorescencja pałeczek Haemophilus Influenzae Wykrywanie antygenów Test ELISA do wykrywania antygenów (ELISA pośrednia, sandwich) Wykrywanie antygenów Western blotting: metoda służąca do wykrywania określonych białek Rozdziela białka według ich mas oraz ich struktury 3-D, za pomocą elektroforezy w żelu. Rozdzielone białka są przenoszone na membranę, a ich obecność jest sprawdzana za pomocą barwników lub za pomocą przeciwciał. Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem, izotopowo lub fluorochromem. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję. W przypadku stosowania wizualizacji przez luminescencję lub stosowanie izotopów, obraz otrzymuje się przez przyłożenie membrany do kliszy fotograficznej. Metody serologiczne ZALETY • • • szczególnie przydatne w diagnostyce zakażeń wywoływanych przez drobnoustroje trudne lub niemożliwe do izolowania i hodowli w laboratorium diagnostycznym, np. wirusy (np. HBV, HIV), pałeczki tularemii, mykoplazmy, legionelle, riketsje Rozpoznanie klasy przeciwciał (IgM/ IgG) oraz awidności IgG pomaga w ocenie fazy zakażenia Możliwość oceny ochrony poszczepiennej WADY • Trudności interpretacyjne u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, w stanie immunosupresji, biorców krwi • Najczęściej nieprzydatne w diagnostyce chorób bardzo powszechnych w populacji (np. opryszczka wargowa) • Możliwość zachodzenia reakcji krzyżowych Metody genetyczne Analiza restrykcyjna Metoda polegająca na cięciu DNA na mniejsze fragmenty, by poddawać je określonym badaniom i manipulacjom. Stosowana z użyciem enzymów restrykcyjnych (endonukleaz, restryktaz- rozpoznają określoną sekwencję nukleotydów, następnie tną nić kwasu nukleinowego) Zastosowanie analizy restrykcyjnej w mikrobiologii: Porównywanie szczepów (typowanie) Techniki rekombinacyjne Cele analizy restrykcyjnej: rRNA genomowe DNA mobilne fragmenty DNA (plazmidy, transpozony) Analiza restrykcyjna Porównywanie szczepów: rRNA Rybotypowanie PCR-REA (np. ARDRA) RFLP Elektroforeza pulsacyjna produktów restrykcji (PFGE) Typowanie mikroorganizmów w oparciu o sekwencje kwasów nukleinowych • Metody typowania oparte na analizie sekwencji kwasów nukleinowych umożliwiają wyznaczenie pokrewieństwa filogenetycznego mikroorganizmów oraz analizę epidemiologiczną • Najczęściej stosowne metody genotypowania: rybotypowanie, analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA z elektroforezą pulsacyjną (RFLP-PFGE), analiza restrykcyjna powielonego rybosomalnego DNA (ARDRA),różne odmiany techniki PCR (fingerprinting) Rybotypowanie Cięcie restrykcyjne całogenomowego DNA Hybrydyzacja z sondami dla genów rDNA znakowanymi radioaktywnie Rozdział elektroforetyczny i autoradiografia Dyskryminacja do poziomu gatunku Sondy wspólne dla wielu gatunków Problem: liczba kopii rDNA/komórkę Analiza restrykcyjna powielonego rybosomalnego DNA (ARDRA) Metoda oparta na powieleniu genu (lub genów) rDNA metodą PCR i późniejszej analizie restrykcyjnej produktu Dyskryminacja: identyfikacja gatunku Niezbyt pracochłonna Zaadaptowana do identyfikacji pałeczek niefermentujących (Acinetobacter spp., Pseudomonas spp.) Schemat wykonania ARDRA Wynik ARDRA dla szczepów Pseudomonas aeruginosa RFLP- restriction fragment lenght polymorphism Trawienie restrykcyjne całogenomowego DNA Użycie enzymu rozpoznającego miejsce mutacji punktowej w obrębie badanego genu Hybrydyzacja z sondami dla badanego genu Schemat wykonania oznaczenia metodą RFLP PFGE- pulsed-field gel electrophoresis Trawienie w żelu całogenomowego DNA enzymami rzadko tnącymi (np. SmaI) Długotrwały rozdział elektroforetyczny produktów restrykcji w zmiennym polu elektrycznym Najbardziej miarodajna metoda typowania wewnątrzgatunkowego szczepów Pracochłonna i wymagająca stosownej aparatury Wynik PFGE- porównanie szczepów Enterococcus faecium Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) • Wynaleziona w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa (Nagroda Nobla w 1993) • Polega na powielaniu określonych fragmentów DNA • Etapy PCR: 1) przygotowanie próbki (izolacja i ewentualne 2) oczyszczenie DNA, ew. przepisanie RNA na cDNA) 3) amplifikacja DNA 4) wizualizacja produktu (np. za pomocą elektroforezy żelowej lub hybrydyzacji ze znakowanymi sondami) Przebieg PCR Zasada metody: cykliczna polimeryzacja określonego, swoistego fragmentu DNA. Wymagania: matryca, termostabilna polimeraza, para swoistych starterów, trójfosforany deoksynukleotydów, odpowiedni cykler, bufor reakcyjny zawierający jony magnezowe i potasowe Zastosowanie PCR w mikrobiologii • Wykrycie oraz identyfikacja patogenu w dowolnym materiale klinicznym • Identyfikacja patogenów trudnych w hodowli, niemożliwych do hodowania, wolnorosnących • Wykrywanie genów oporności na leki • Wykrywanie genów czynników zjadliwości Modyfikacje PCR • Multiplex PCR: użycie więcej niż jednej pary starterów. Umożliwia amplifikację kilku swoistych fragmentów DNA jednocześnie • Nested PCR (PCR zagnieżdżony): dwie reakcje PCR następujące jedna po drugiej (reamplifikacja produktu) -> stosowana do amplifikacji niskokopijnych patogenów w materiale klinicznym (krew/PMR) • Real-time PCR: obserwacja przyrostu produktu w czasie rzeczywistym, dzięki wykorzystaniu zjawiska fluorescencji Nested PCR- zasada Real-time PCR • Umożliwia oznaczenia zarówno jakościowe, jak i ilościowe • Ilość produktu reakcji oznaczana po każdym cyklu amplifikacji, a nie-jak w klasycznym PCR- jedynie po zakończeniu wszystkich cykli • Wskaźnikiem przyrostu produktu jest intensywność fluorescencji emitowanej przez próbkę Zalety real-time PCR • • • • • Możliwość monitorowania przebiegu reakcji Znacznie skrócony czas oznaczenia (30 minut do 2 godzin) Reakcja przebiega w małej objętości Wysoka czułość Analiza temperatury topnienia produktów pomocna w ocenie specyficzności reakcji • Wysoka powtarzalność • Możliwość stosowania gotowych zestawów odczynnikowych • UWAGA! Wady: spadek wydajności reakcji w czasie związany z wyczerpywaniem się składników mieszaniny reakcyjnej, konkurencją pomiędzy starterami a produktem oraz spadkiem aktywności enzymatycznej polimerazy ; wysoki koszt aparatury i odczynników Detekcja produktu reakcji w real-time PCR • Użycie niespecyficznych fluorochromów (np. SYBR green, bromek etydyny): emitują światło po związaniu z dwuniciową cząsteczką DNA. Najprostsza i najtańsza metoda, jednak podatna na błędy. Wymaga analizy krzywej topnienia, by zwiększyć specyficzność reakcji. • Użycie specyficznych sond fluorescencyjnych (np. TaqMan, Scorpions): Najczęściej sondy wykorzystują zjawisko transferu energii tzw. FRET: W mieszaninie reakcyjnej startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie. Podczas reakcji dochodzi do przeniesienia energii zaabsorbowanej przez jeden fluorochrom (reporter) na drugi lub do wygaszenia emisji przez zwązek wygaszający (quencher) NASBA- nucleic acid sequence based amplification Metoda oparta na amplifikacji izotermicznej, gdzie preferowaną matrycą jest RNA Naśladuje naturalny cykl replikacyjny HIV Stosowana do wykrywania HIV, wirusów grypy oraz mRNA wirusów brodawczaka TMA- transcription-mediated amplification Wykorzystuje enzymy: odwrotną transkryptazę oraz polimerazę T7 RNA do syntezy amplikonów RNA Odczyt luminescencyjny produktów hybrydyzacji Stosowana głównie w krwiodawstwie do wykrywania HCV/HBV/HIV podczas pojedynczego oznaczenia Hybrydyzacja kwasów nukleinowych 1. To spontaniczne łączenie się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA). 2. Komplementarne nici kwasów nukleinowych rozdzielają się (denaturują) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. 3. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie (renaturacja). 4. Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji Hybrydyzacja kwasów nukleinowych 1. Hybrydyzacji z sondami molekularnymi można poddawać całkowity DNA lub RNA wyizolowany z badanego materiału, unieruchamiany na nylonowych lub nitrocelulozowych błonach w formie kropek (ang. dot blotting). 2. Detekcja sygnału świadczy o rozpoznaniu przez sondę komplementarnej sekwencji nukleotydowej, dowodząc istnienia w badanym materiale obcego gatunkowo, patogennego kwasu nukleinowego. 3. W tym typie hybrydyzacji możliwa jest sytuacja odwrotna, kiedy to sonda jest unieruchomiona na trwałym podłożu, a badany materiał dodawany jest w roztworze hybrydyzacyjny 4. Hybrydyzacja typu „dot blot" znajduje ograniczone zastosowanie, gdyż jej czułość może być niewystarczająca Zasada metody i wynik hybrydyzacji typu dot blot Hybrydyzacja SouthernaSouthern blotting • Metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do wykrywania określonych fragmentów DNA • Hybrydyzację Southern można stosować m.in. po cięciu DNA enzymami restrykcyjnymi, po reakcji PCR z użyciem mało specyficznych starterów lub też w celu wykrycia obcego DNA w badanym organizmie Hybrydyzacja metodą Southerna Zastosowanie Southern blot w mikrobiologii • Diagnostyka gruźlicy (M. tuberculosis) • Diagnostyka zakażeń C. trachomatis i/lub N. gonorhhoeae • Diagnostyka zakażeń Gardnerella i Trichomonas vaginalis • Diagnostyka zakażeń paciorkowcami grupy A (S. pyogenes) • Diagnostyka zakażeń grzybów z rodzaju Candida spp. • Typowanie w badaniach taksonomicznych Hybrydyzacja kwasów nukleinowychNorthern Blotting • Metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do detekcji RNA • Najczęściej stosowana do detekcji mRNA genów ulegających transkrypcji w komórce • Metodyka podobna do Southern blottingu Hybrydyzacja metodą Northern Hybrydyzacja kwasów nukleinowychFISH • FISH- fluorescence in situ hybridization • Technika cytochemiczna, polegająca na hybrydyzacji sekwencji DNA lub RNA ze specyficznymi sondami znakowanymi barwnikami fluorescencyjnymi • Określenie in situ wskazuje na miejsce przeprowadzania reakcji hybrydyzacji, którym jest naturalne środowisko występowania DNA (chromosomy, komórki) • Do analizy badanego materiału wymagany jest mikroskop fluorescencyjny Wynik hybrydyzacji FISH widziany w mikroskopie fluorescencyjnym Mikromacierze • Mikromacierze to szkiełka mikroskopowe, na których znajdują się tysiące sond molekularnychmożliwość przeprowadzenia wielu reakcji hybrydyzacji jednocześnie Zastosowanie mikromacierzy w mikrobiologii • Identyfikacja drobnoustrojów chorobotwórczych (np. Listeria sp., E. coli, H. pylori, Mycobacterium sp.) • Detekcja bakterii jelitowych w próbkach kału • Identyfikacja genów kodujących różnorodne czynniki wirulencji • Badanie lekowrażliwości (oporność na rifampicynę Mycobacterium sp., oporność na chinolony - E. coli) • Badania epidemiologiczne (prowadzenie dochodzenia epidemiologicznego oraz opracowywanie ognisk chorób zakaźnych) Sekwencjonowanie i analiza sekwencji • Analiza sekwencji kwasów nukleinowych jest pomocna w badaniach zmienności genetycznej • Metoda wg Maxama i Gilberta: znakowanie matrycy DNA izotopem na końcu 3’ lub 5’, metylacja określonego typu zasad (A lub T lub G lub C) z ograniczoną wydajnością, degradacja metylowanych zasad i cięcie matrycy w miejscu zdegradowanym, elektroforeza produktów • Metoda wg Sangera: znakowanie matrycy za pomocą ddNTP, usunięcie wolnych dNTP i ddNTP oraz starterów i polimerazy, elektroforeza i odczyt Zasada sekwencjonowanie z użyciem znakowanych ddNTP Zastosowanie sekwencjonowania Uzyskana sekwencja jest punktem wyjścia do: •Analizy pojedynczej sekwencji -> modelowanie białek, przewidywanie struktury przestrzennej DNA/RNA •Porównania dwóch sekwencji -> identyfikacja gatunku lub szczepu (porównanie z bazami danych), identyfikacja sekwencji odpowiedzialnych za oporność na leki przeciwdrobnoustrojowe •Porównanie wielu sekwencji -> analiza ewolucyjna, identyfikacja mechanizmów oporności na leki Praktyczne zastosowanie omówionych metod w mikrobiologii Cele diagnostyki mikrobiologicznej • Profilaktyka- badania kobiet w ciąży, dawców narządów i tkanek • Diagnostyka poekspozycyjna- zakażenia nabyte, wrodzone • Ustalenie fazy zakażenia- pierwotne/ nawracające, ostre/ przewlekłe • Ocena postępów i wyników leczenia Przykład 1: diagnostyka kiły 1. Wykrywanie krętków: mikroskopia, PCR 2. Odczyny nieswoiste (niekrętkowe): VDRL, RPR, TRUST, USR 3. Odczyny swoiste (krętkowe): FTA FTA-ABS, IgM FTA-ABS, 19S-IgM FTA-ABS, TPHA, EIA, ELISA, Western Blot, immunochromatografia Hodowla krętków-PROBLEMY!: brak wzrostu na sztucznym podłożu, utrzymywanie wirulentnych drobnoustrojów dla celów diagnostycznych wymaga użycia próby biologicznej- hodowane w jądrach króliczych, Diagnostyka bezpośrednia: krętki widoczne w mikroskopie o ciemnym polu widzenia Materiał badany: płyn ze zmian w przebiegu kiły (Zmiany w przebiegu kiły I i II rzędowej, płyn owodniowy w kile wrodzonej, PMR w kile OUN, płyn wysiękowy ze zmian skórnych, rzadko aspirat węzłów) Mikroskopia jest niezalecana dla diagnostyki zmian w jamie ustnej i okolicy anogenitalnej Wynik dodatni: obecność co najmniej jednego krętka, zaobserwowanie charakterystycznego ruchu Wynik ujemny (3 badania w ciągu 3 dni): nie wyklucza kiły Diagnostyka bezpośrednia kiły- inne metody • PCR: w Europie rekomendowana w kile wczesnej (jama ustna, okolica anogenitalna), wrodzonej i trzeciorzędowej • Immunofluorescencja: wykrywanie antygenów • Barwienie immunohistochemiczne Pośrednia diagnostyka kiły Wykrywanie przeciwciał • Niekrętkowychprzeciwkardiolipinowych: • Krętkowych: wynik dodatni w 5-6 tygodniu zakażenia, miano wzrasta bardzo szybko, badanie wykorzystuje podobieństwo struktury kardiolipiny wołu do antygenów krętkowych IgM pojawiają się w końcu 2 tygodnia zakażenia IgG pojawiają się w 4 tygodniu i utrzymują przez długi czas UWAGA: Miano przeciwciał niekrętkowych i IgM szybko spada w skutek leczenia. W kile nieleczonej utrzymują się długotrwale Odczyny niekrętkowe • Inaczej zwane kłączkującymi Stadium Kiła I-rzędowa • Wykrywają przeciwciała przeciwlipidowe IgM i IgG, tworzące się w odpowiedzi na lipidy krętka i lipidy uszkodzonych błon komórkowych gospodarza • Najważniejsze: VDRL, USR Czułość Swoistość 80% 74-87% Kiła II-rzędowa 100% Kiła utajona 100% Kiła objawowa późna 71% 37-94% UWAGA: każdy dodatni wynik badania testem nieswoistym MUSI być potwierdzony za pomocą badania swoistego! Algorytm diagnostyki kiły Odczyn nieswoisty (VDRL, USR) Ujemny Dodatni Test potwierdzenia (TPHA, FDA itp.) Dodatni Kiła + Brak zakażenia lub wczesna faza zakażeniapowtórzyć badanie Ujemny Kiła - VDRL (ang. Veneral Diseases Reserarch Laboratory) • Test przesiewowy w diagnostyce kiły • Antygen - Alkoholowy roztwór zawierający 0.03% kardiolipiny, 0.21% lecytyny 0.9% cholesterolu (czułość) • antygen kardiolipidowy w zetknięciu z surowicą zawierającą przeciwciała strąca się w postaci widocznych „kłaczków” (flokulacja) • Uwaga: Przed wykonaniem testu należy inaktywować układ dopełniacza poprzez ogrzewanie Swoista diagnostyka kiły: TPHA- Treponema pallidum hemagglutination assay • aglutynacja krwinek (baranich) opłaszczonych ultrasonatem patogennych krętków bladych (szczep Nicholsa) • surowica uprzednio rozcieńczona w płynie absorpcyjnym • przeciwciała IgM i IgG, przeciwko antygenowi białkowemu krętka • jakościowy i ilościowy (diagnostyka kiły układu nerwowego) • czuły! (mniej czuły w kile pierwszorzędowej) Przykład 2: identyfikacja MRSA • MRSA: methycilin resistant Staphylococcus Aureus -> oporność na metycylinę jest równoznaczna z opornością na wszystkie antybiotyki betalaktamowe, często także na makrolidy i fluorochinolony. • Ok. 30% populacji jest nosicielem S. aureus na błonach śluzowych i wcale nie choruje. Największym zagrożeniem takie nosicielstwo jest dla osób chorych, u których ciężka choroba warunkuje niepodjęcie walki z rozwijającym się zakażeniem gronkowcowym Badanie w kierunku MRSA metodami biologii molekularnej Metody biologii molekularnej- szybka detekcja patogenu ułatwia diagnozę i wcześniejsze rozpoczęcie leczenia, zmniejszając nadużywanie antybiotyków o szerokim spektrum Przykład 3: Diagnostyka HIV 1. Izolacja i identyfikacja wirusa w hodowlach komórkowych jest utrudniona 2. Wykrywanie przeciwciał ELISA Western blot 2. Badanie obecności antygenu p24 ELISA Western blot 3. Wykrywanie i/lub oznaczanie ilości kopii wirusowego RNA RT-PCR/RT-qPCR NASBA TMA Diagnostyka HIV- pojawienie się we krwi markerów zakażenia Laboratoryjna diagnostyka HIV • Test przesiewowy: ELISA wykrywająca przeciwciała anty-HIV i antygen p24. Wynik ujemny uznajemy za miarodajny. Wynik dodatni wymaga testu potwierdzenia • Test potwierdzenia: Western Blot/ detekcja wirusowego materiału genetycznego za pomocą PCR Przykład 4: Diagnostyka wirusowych zapaleń wątroby typu B i C • HBV Pozajelitowa droga szerzenia dsDNA-RT szczepionka dostępna Mogą powodować przewlekłe zapalenia wątroby Mogą wywoływać pierwotnego raka wątroby •HCV ssRNA (+) brak szczepionki Wirus zapalenia wątroby typu B Markery serologiczne w WZW B Wirus zapalenia wątroby typu Cdiagnostyka • Markery serologiczne: anty HCV IgM/ IgG • Markery biochemiczne: ALAT, ASPAT, bilirubina • Wykrywanie RNA HCV za pomocą metod molekularnych Schemat diagnostyczny WZW C Testy biologii molekularnej w diagnostyce HCV HCV RNA - metoda jakościowa potwierdzenie zakażenia HCV ocena skuteczności leczenia po zakończeniu terapii Genotypowanie HCV Prognoza skuteczności leczenia Determinuje długość terapii HCV RNA - metoda ilościowa Określenie wiremii wyjściowej Znaczenie prognostyczne w przewidywaniu skuteczności leczenia Monitorowanie leczenia Dziękuję za uwagę ☺
