Post. Mikrob. 1-2016.indb - Postępy Mikrobiologii
advertisement
PO L SK IE TOWA R Z YST WO MIK RO B IO LOGÓW Kwartalnik Tom 55 Zeszyt 1•2016 STYCZE¡ – MARZEC CODEN: PMKMAV 55 (1) 2016 Advances in Microbiology Index Copernicus ICV = 98,38 (2014) Impact Factor ISI = 0,286 (2014) Punktacja MNiSW = 15,00 (2014) http://www.pm.microbiology.pl http://www.pm.microbiology.pl RADA REDAKCYJNA JACEK BARDOWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), DARIUSZ BARTOSIK (Uniwersytet Warszawski), JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), NADZIEJA DRELA (Uniwersytet Warszawski), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), JACEK MIĘDZOBRODZKI (Uniwersytet Jagielloński), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), RADOSŁAW STACHOWIAK (Uniwersytet Warszawski), BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański), ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowa Akademia Techniczna), STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Państwowy Zakład Higieny), GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JACEK BIELECKI (redaktor naczelny), BOHDAN STAROŚCIAK (zastępca), RADOSŁAW STACHOWIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich) ADRES REDAKCJI Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 554 13 12; fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] Redaktorzy: Redaktor naczelny: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 554 13 04; fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] Zastępca: Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa; tel.: (22) 628 08 22, (22) 621 13 51 e-mail: [email protected] Sekretarz: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 554 13 12; fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie) Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardy ul. Malinowa 11, 72-003 Wołczkowo tel. 605031324; fax (91) 3113186; e-mail: [email protected] lub [email protected] STALI RECENZENCI: JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), JÓZEF KUR (Politechnika Gdańska), EUGENIUSZ MAŁAFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wrocławiu) ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1 Informacja o zdjęciu na okładce: Komórki Neisseria gonorrhoeae, mutant szczepu FA1090. Preparatyka: dr Agnieszka Kwiatek, Zakład Wirusologii, Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski. Zdjęcie: mgr Paweł Bącal, Pracownia Teorii i Zastosowań Elektrod, Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski. Obraz SEM uzyskano przy użyciu aparatury zakupionej w ramach projektu CePT POIG.02.02.00-14-024/08-00. P O L S K I E T O WA R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W Nakład 1150, Objętość 16 ark. wyd., Papier offset 90 g Skład i druk: Zakład Wydawniczy Letter Quality, tel.: 22 115 38 10, 607 217 879 e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 3–11 http://www.pm.microbiology.pl Magdalena Maciejewska1, 2, Marta Bauer2, Małgorzata Dawgul2* 1 Laboratorium Farmaceutyczne AVENA Sp.j., Osielsko Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej, Wydział Farmaceutyczny, Gdański Uniwersytet Medyczny 2 Wpłynęło w lipcu 2014 r. Zaakceptowano w listopadzie 2015 r. 1. Wstęp. 2. Etapy powstawania biofilmu, a oporność na antybiotyki. 3. Strategie zapobiegania tworzenia się biofilmu. 3.1. Celowanie w początkową fazę rozwoju biofilmu. 3.1.1. Związki niskocząsteczkowe (Small Molecules). 3.1.2. Ingerencja w quorum sensing. 3.1.3. Przeciwciała. 3.1.4. Biofilm drobnoustrojów niepatogennych. 3.2. Modyfikacja biomateriałów w celu zwiększenia ich odporności na adhezję drobnoustrojów. 3.2.1. Materiały antyadhezyjne. 3.2.2. Powłoki bakteriobójcze/bakteriostatyczne. 4. Metody eradykacji biofilmu. 4.1. Fizyczne metody eradykacji biofilmu. 4.2. Biologiczne metody eradykacji biofilmu. 4.3. Chemiczne metody eradykacji biofilmu. 5. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe. 6. Podsumowanie Novel methods of bacterial biofilm elimination Abstract: Bacterial biofilm is defined as a sessile, tridimensional microbial community composed of bacteria immersed in a polysaccharide matrix. The structures can grow on human tissues or medical devices resulting in biofilm related infections, which are very often impossible to treat with the commonly used antibiotics. Due to their resistance to the conventional antimicrobial therapy, efficient methods of treatment as well as prophylaxis need to be developed. Biofilm formation can be reduced by inhibiting the process of adhesion and by interfering with quorum sensing system. Very promising is also the application of appropriate antibodies or use of non-pathogenic bacterial strains. Another approach focuses on the surface modifications in order to obtain the resistance to microbial colonization. Disruption of mature structures can be achieved by several physical, chemical and biological methods. The novel approaches, which are currently being under intensive investigation, include: phage therapy, matrix targeting enzymes, photodynamic therapy and antimicrobial peptides. The above-mentioned strategies are described in the presented work with a special focus on antimicrobial peptides as the potential tool for prophylaxis as well as elimination of mature biofilms. 1. Introduction. 2. Stages of biofilm formation and the resistance to antibiotics. 3. Strategies of prevention of biofilm formation. 3.1. Targeting the initial phase of biofilm formation. 3.1.1. Small Molecules. 3.1.2. Interference in quorum sensing. 3.1.3. Antibodies. 3.1.4. Biofilm of nonpathogenic microorganisms. 3.2. Modification of biomaterials for increased resistance to microbial adhesion. 3.2.1. Anti-adhesive materials. 3.2.2. Bacteriostatic/bactericidal coatings. 4. Methods for biofilm eradication. 4.1. Physical methods for biofilm eradication. 4.2. Biological methods for biofilm eradication. 4.3. Chemical methods for biofilm eradication. 5. Antimicrobial peptides. 6. Conclusions Słowa kluczowe: biofilm, eradykacja biofilmu, hamowanie rozwoju biofilmu, infekcje związane z biofilmem Key words: biofilm, biofilm elimination, biofilm growth inhibition, biofilm related infections 1. Wstęp Istotną rolę w patogenezie zakażeń związanych ze stosowaniem biomateriałów odgrywa zdolność bakterii do tworzenia biofilmu. Biofilmem nazywane są przylegające do powierzchni stałych, zorganizowane struktury, utworzone przez otoczone warstwą egzopolisacharydu komórki drobnoustrojów należących do jednego, kilku, a nawet kilkunastu gatunków [75]. W porównaniu do komórek wolnopływających, mikroorga­ nizmy rosnące w populacji biofilmu są znacznie mniej wrażliwe na działanie antybiotyków, antyseptyków oraz mechanizmów obronnych organizmu ludzkiego. W związku z powyższym, infekcje związane z biofilmem są przyczyną licznych komplikacji terapeutycznych. Poza tym, często przechodzą w stan przewlekły i nawracają po wyleczeniu. Dynamiczny rozwój w dziedzinie biomateriałów znacząco przyczynił się do poprawy jakości życia pacjentów, jednakże jest także przyczyną zwiększonego ryzyka rozwoju infekcji związanych z biofilmem. Niezależnie od stopnia zaawansowania implantów biomedycznych, czy produktów inżynierii tkankowej, stanowią one potencjalną powierzchnię dla kolonizacji drobnoustrojów. Szacuje się, że ok. 60–70% zakażeń szpitalnych jest wynikiem tworzenia się biofilmu na powierzchni stosowanych materiałów medycznych, m.in. implantów sercowych, cewników, rozruszników serca, protez naczyniowych oraz ortopedycznych [10]. Zdolność do adhezji, kolonizacji powierzchni, a w konekwencji do formowania biofilmu wykazuje szerokie spektrum drobnoustrojów. Do najpowszechniejszych szczepów tworzących biofilm na powierzchni biomateriałów zalicza się: Enterococcus faecalis, * Autor korespondencyjny: Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej, Wydział Farmaceutyczny, Gdański Uniwersytet Medyczny, Hallera 107, 80-416 Gdańsk; tel. 58 349 1488; fax 58 349 1624; e-mail: [email protected] 4 MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Strep­ tococcus viridans, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis i Pseudomonas aeruginosa [18]. S. aureus i S. epidermidis są najczęściej występującymi szczepami na implantach sercowo-naczyniowych [54, 55]. Szacuje się, że są odpowiedzialne za ok. 40–50% infekcji sercowo-naczyniowych związanych z biofilmem oraz za ok. 50–70% infekcji związanych z tworzeniem się biofilmu na cewnikach [2]. Występowanie szczepów E. faecalis związane jest z rozwojem infekcji u pacjentów z wkłuciem cen­ tral­nym lub wentylowanych mechanicznie. Poza tym bakterie tego gatunku często są izolowane od chorych z wprowadzonymi implantami ortopedycznymi. Biofilmy formowane przez E. faecalis i S. viridans odpowiadają za występowanie zapalenia wsierdzia [6]. Natomiast drobnoustroje Gram-ujemne są najczęstszymi czynnikami etiologicznymi zakażeń układu moczowego oraz infekcji związanych z wykorzystaniem cewników urologicznych [13]. 2.Etapy powstawania biofilmu, a oporność na antybiotyki Powstawanie biofilmu jest procesem złożonym i wieloetapowym (Rys. 1). Etapem inicjującym jest proces adhezji pojedynczych komórek do powierzchni biomateriałów, ciał obcych oraz tkanek. Następnie dochodzi do proliferacji kolonizujących komórek oraz produkcji pozakomórkowej substancji polisacharydowej (EPS, extracellular polymeric substance). Warstwa nierozpuszczalnych egzopolimerów ułatwia adhezję kolejnych bakterii do podłoża oraz stanowi barierę ochronną, zabezpieczającą mikroorganizmy przed niekorzystnymi warunkami środowiska (np. działaniem antybiotyków) oraz odpowiedzią humoralną gospodarza. Podczas fazy dojrzewania biofilmu dochodzi do zmian ekspresji genów oraz metabolizmu drobnoustrojów położonych wewnątrz zorganizowanej populacji. Może dojść do aktywacji genów kodujących enzymy rozkładające leki lub kodujących białka wypompowujące leki z komórek bakteryjnych (drug effux pumps). Maleje tempo wzrostu i metabolizm drobnoustrojów. Proces formowania biofilmu jest kontrolowany poprzez mechanizm oceny liczebności (quorum sensing) – unikalny system komunikacji międzykomórkowej zwiększający zdolności adaptacyjne biofilmu. W końcowym etapie dojrzewania biofilmu komórki bakteryjne odczepiają się od struktury, aby rozpocząć proces ekspansji nowych powierzchni. Dojrzałe struktury wykazują znacznie zmniejszoną wrażliwość na stosowane środki przeciwdrobnoustrojowe, a nieprawidłowo przeprowadzona antybiotyko­ terapia może być przyczyną rozwoju subpopulacji bak­ teryjnych komórek przetrwałych (persister cells), które po zakończeniu leczenia umożliwiają odnowienie populacji biofilmu [38, 52]. Problemy terapeutyczne wynikające z rozwoju infekcji związanych z biofilmem są przyczyną poszukiwania i rozwoju nowych metod eliminacji, jak i profilaktyki tego typu zakażeń. 3. Strategie zapobiegania tworzenia się biofilmu Ograniczenie ryzyka rozwoju biofilmu na powierzchni biomateriałów stanowi jeden z podstawowych celów grup badawczych poszukujących skutecznych strategii profilaktyki infekcji związanych z biofil- Rys. 1. Etapy formowania biofilmu NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO mem [14, 66]. Główne podejścia zakładają modyfikacje powierzchni materiałów celem ograniczenia adhezji drobnoustrojów oraz ingerencję w początkowe fazy rozwoju biofilmu. 3.1. Celowanie w początkową fazę rozwoju biofilmu 3.1.1. Związki niskocząsteczkowe (Small Molecules) W ostatnich latach wiele ośrodków naukowych skupiło swoją uwagę na związkach niskocząsteczkowych zdolnych do hamowania rozwoju biofilmu. Zidentyfikowano m.in. szereg związków, które po­przez inhibicję genów odpowiedzialnych za ekspresję czynników wirulencji szczepów, takich jak Streptococcus pyogenes i S. aureus, powodują zahamowanie formowania się ich biofilmów [41, 66]. Wykazano, że produkowany przez szczep P. aeruginosa, kwas cis-2-decylenowy posiada zdolność eradykacji dojrzałego biofilmu bakterii z gatunku E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. pyogenes, Bacillus subtilis, S. aureus i Candida albicans [16]. Podobne działanie wykazują produkowane przez bakterie D-aminokwasy. Mechanizm działania D-aminokwasów na rozwijający się biofilm nie został dotychczas wyjaśniony, jednak związki te okazały się skuteczne w hamowaniu tworzenia się biofilmu przez szczepy: S. aureus i P. aeruginosa [36]. Poprzez hamowanie rozwoju egzopolisacharydu N-acetylocysteina skutecznie zapobiega tworzeniu się biofilmu S. epidermidis [58]. Kationy metali, tj. Ca2+ i Mg2+, biorąc udział w adhezji drobnoustrojów do powierzchni, pełnią ważną rolę w procesie formowania biofilmu. Użycie związków chelatujących umożliwia inhibicję rozwoju biofilmu [1]. Liczba aktywnych związków należących do omawianej grupy stale rośnie, w związku z czym stanowią one istotny aspekt poszukiwań nowych metod walki z biofilmem. Poza poszukiwaniem nowych cząsteczek trwają badania mechanizmu działania wyżej wymienionych substancji o potwierdzonych zdolnościach do hamowania rozwoju biofilmu. Związki poddawane są także ocenie ich właściwości farmakokinetycznych [14]. 3.1.2. Ingerencja w quorum sensing Quorum sensing jest chemicznym sposobem komunikacji drobnoustrojów. Mikroorganizmy wytwarzają i wydzielają do otoczenia substancje sygnałowe, które służą m.in. do skoordynowanej regulacji ekspresji genów, których produkty zaangażowane są m.in. w proces tworzenia się biofilmu [45]. W ostatnich latach podejmowane są próby ingerencji w system quorum sensing w celu niedopuszczenia do wytworzenia się biofilmu [25]. Strategia ta opiera się na stosowaniu naturalnych lub syntetycznych analogów substancji sygnałowych wykazujących zdolność do: hamowania ich syntezy lub uwalniania, blokowania przekazu i odbioru sygnałów 5 poprzez receptory wewnątrz komórek drobnoustrojów oraz ich syntetycznej lub enzymatycznej inaktywacji [30, 76]. Badania Zimmermana i wsp. wykazały zdolność laktonu N-(3-oksododekanylo)-L-homoseryny (3OC12-HSL) do stymulacji immunologicznej odpowiedzi komórkowej poprzez chemotaksję neutrofili in vitro. 3OC12-HSL jest syntetyzowana przez P. aeruginosa i odpowiedzialna za zjawisko quorum sensing. Wyniki badań potwierdziły udział komunikacji międzykomórkowej w procesie tworzenia się biofilmu [78]. Hamowanie komunikacji szczepów tworzących biofilm stanowi obiecujący kierunek poszukiwań skutecznej terapii. Jednakże zastosowanie blokowania systemu QS stwarza także pewne trudności ze względu na specyfikę działania. Niskocząsteczkowe związki sygnałowe są charakterystyczne dla poszczególnych grup mikroorganizmów, a jeden szczep może wytwarzać kilka rodzajów takich cząsteczek [45]. Poza tym, inhibitory systemu QS zazwyczaj nie oddziałują na inne procesy życiowe drobnoustrojów, co znacznie ogranicza ich zastosowanie jako samodzielnej terapii. Dlatego prowadzone są badania w kierunku wykorzystania inhibitorów QS jako uzupełnienia leczenia konwencjonalnego [22]. 3.1.3. Przeciwciała Jedną z obiecujących strategii ograniczania kolonizacji biomateriałów jest stosowanie przeciwciał wiążących adhezyny produkowane przez drobnoustroje. Jak wcześniej wspomniano, jednym z najczęstszych czynników etiologicznych zakażeń spowodowanych stosowaniem materiałów medycznych jest S. epidermidis. Kolonizacja często jest przyczyną rozwoju trudnych w leczeniu infekcji i może prowadzić do niszczenia zaaplikowanych biomateriałów. Formowanie biofilmu przez S. epidermidis wymaga obecności białka AAP, tzw. białka akumulacji. W badaniach przeprowadzonych w warunkach in vitro wykazano, że użycie odpowiednich przeciwciał monoklonalnych efektywnie hamuje proces tworzenia się biofilmu poprzez blokowanie wyżej wymienionego czynnika [26]. Najnowsze dane dotyczące zagadnienia molekularnych mechanizmów formowania biofilmu wskazują, iż proces ten związany jest z makrocząsteczkami błony komórkowej drobnoustrojów. Uważa się, że mogą one stanowić kolejne miejsce docelowe działania przeciwciał. Przypuszczalnie ich zastosowanie zaburza interakcje na poziomie komórka drobnoustroju – powierzchnia kolonizowana oraz oddziaływania pomiędzy komórkami bakteryjnymi, co ingeruje w proces adhezji. Wykorzystanie przeciwciał nie prowadzi do śmierci drobnoustrojów, a tym samym nie indukuje silnej odpowiedzi układu immunologicznego gospodarza. Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko makrocząsteczkom błony komórkowej drobnoustrojów wydaje się więc obiecującym rozwiązaniem [65]. 6 MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL 3.1.4. Biofilm drobnoustrojów niepatogennych Innym sposobem zabezpieczającym przed rozwojem infekcji „odbiomateriałowych” jest zastosowanie interferencji bakteryjnej. Metoda ta jest rozpatrywana przede wszystkim pod kątem zapobiegania infekcjom układu moczowego. Głównym założeniem jest wykorzystanie szczepu niepatogennego do wytworzenia biofilmu na materiale wprowadzonym do organizmu pacjenta. Wykazano, że fragmenty cewnika urologicznego inkubowane wcześniej w zawiesinie komórek szczepu niepatogennego są odporne na kolonizację in vitro przez uropatogeny. Pierwsze próby przeprowadzone in vivo dotyczyły osób z uszkodzonym rdzeniem kręgowym, które wymagały cewnikowania. Doświadczenie polegało na wprowadzeniu niepatogennego szczepu E. coli do pęcherza moczowego pacjenta. Stwierdzono, że zabieg nie spowodował rozwoju infekcji, a metoda wykazała skuteczność w redukcji częstości zakażeń [68]. 3.2. Modyfikacja biomateriałów w celu zwiększenia ich odporności na adhezję drobnoustrojów 3.2.1. Materiały antyadhezyjne Właściwości fizykochemiczne wykorzystanych biomateriałów mają bardzo istotny wpływ na zdolności mikroorganizmów do tworzenia biofilmu. Zależą od nich między innymi rodzaj i liczba bakterii przylegających do powierzchni. W związku z powyższym prowadzone są intensywne badania mające na celu opracowanie materiałów o optymalnych właściwościach ograniczających ryzyko adhezji mikroorganizmów. Właściwości powierzchni biomateriałów można modyfikować poprzez aplikację powłok antyadhezyjnych, zmianę ładunku powierzchniowego, struktury, jej chropowatości, aktywności chemicznej oraz właści­ wości hydrofilowych i hydrofobowych [9, 67, 69]. Istotny wpływ na przyleganie komórek do po­ wierzchni mają właściwości hydrofobowe biomateriału. Zastosowanie nanostruktur fluorowanych koloidów krzemionkowych jako syntetycznej, silnie hydrofobowej powłoki na powierzchniach szklanych skutecznie zredukowało stopień przylegania komórek S. aureus i P. aeruginosa [59]. Niska energia powierzchniowa oraz hydrofobowość powierzchni są przyczynami zmniejszonej adsorpcji białek i adhezji drobnoustrojów. Tekstura biomateriałów również jest istotnym czynnikiem wpływającym na interakcje bakterii z kolonizowaną powierzchnią. Wyniki wielu badań potwierdziły istotny wpływ wysokiej chropowatości powierzchni biomateriałów na stopień adhezji drobnoustrojów [28, 46, 69]. Stopień adhezji i rozwój S. epidermidis na tytanowych szorstkich powierzchniach były znacząco wyższe w porównaniu do tych samych, ale gładkich, polerowanych powierzchni [73]. Zdolności przylegania do powierzchni o różnym stopniu gładkości są jednak zależne od gatunku drobnoustroju. W przypadku S. aureus zaobserwowano zwiększone przyleganie do powierzchni tytanowej poddanej mechaniczno-chemicznej obróbce i polerowaniu [69]. Wiele doniesień literaturowych dotyczy wykorzystania powłok antyadhezyjnych. Znaczące zahamowanie wiązania komórek biofilmu S. epidermidis zaobserwowano na stalowych i tytanowych biomateriałach z nanopowłoką TMS-trimetylosilkanu, natomiast powlekanie tytanowych biomateriałów PEG (polietylenoglikolem) zredukowało adhezję szczepu S. aureus [24, 40]. Xu i wsp. wykazali, że submikronowa (400–500 nm) warstwa poli(uretano-mocznika) ogranicza powierzchnię biomateriałów dostępną dla bakterii, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo rozwoju biofilmu, zwłaszcza S. epidermidis i S. aureus [74]. Obiecującą strategią zabezpieczającą przed tworzeniem się biofilmu jest pokrycie powierzchni biomateriałów tzw. szczotkami polimerowymi. Powłokę tworzą długie łańcuchy hydrofilowych polimerów związanych z powierzchnią i eksponowanych do otoczenia [11, 63]. Najczęściej stosowanymi powłokami tego typu są szczotki wykonane z politlenku etylenu (PEO) [27]. Wyniki badań wykazały znaczące zmniejszenie adsorpcji protein i przylegania bakterii, potwierdzając tym samym ich skuteczność w profilaktyce rozwoju biofilmu [61, 62]. W warunkach in vivo wyniki z użyciem PEO nie były zadowalające ze względu na niską trwałość materiału oraz na wysoką podatność na uszkodzenia oksydacyjne. Cechy te uniemożliwiają zastosowanie powłok PEO w obecnej formie w warunkach in vivo [63]. Lellouche i wsp. wykazali, że powlekanie fragmentów cewnika Foley’a za pomocą fluorku itru pozwala ograniczyć adhezję i wpływa na redukcję dojrzałego biofilmu tworzonego przez szczepy E. coli i S. aureus. Stwierdzono istotny wpływ wielkości cząsteczek zastosowanego związku chemicznego na jego właściwości przeciwbakteryjne. Największą efektywność działania uzyskano stosując powlekanie fluorkiem itru w postaci nanocząstek [39]. Zastosowanie powłok antyadhezyjnych jest bardzo skuteczną metodą zapobiegania tworzenia się biofilmu in vitro na wczesnych etapach jego rozwoju. W warunkach in vivo skuteczność tego typu powłok jest uzależniona od złożonych interakcji między powierzchnią biomateriału, a komórkami drobnoustrojów oraz organizmu ludzkiego, które mogą obniżać efektywność stosowanej metody. W związku z powyższym niezbędna jest kontynuacja badań mających na celu optymalizację powłok i ostatecznie umożliwienie wykorzystania tej obiecującej strategii zapobiegania rozwojowi infekcji związanych z biofilmem [14]. 3.2.2. Powłoki bakteriobójcze/bakteriostatyczne Obiecującą strategią stosowaną w walce z zakażeniami towarzyszącymi stosowaniu biomateriałów jest stosowanie powłok wykazujących właściwości bakte- NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO riostatyczne lub bakteriobójcze [57]. Do impregnacji materiałów biomedycznych wykorzystywano między innymi konwencjonalne antybiotyki. Wykazano, że powierzchnie tytanowe biomateriałów kowalencyjnie związane z wankomycyną skutecznie hamują rozwój biofilmu S. epidermidis [5]. S. aureus natomiast był skutecznie eliminowany z powlekanych gentamycyną protez bezcementowych stosowanych w arteroplastyce [52]. Powlekanie materiałów medycznych antybiotykami może stanowić skuteczną profilaktykę zakażeń towarzyszących stosowaniu biomateriałów. Należy jednak pamiętać, że stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania niesie za sobą ryzyko rozwoju szczepów wieloopornych. Rozwiązaniem alternatywnym jest stosowanie powłok wykonanych z metali szlachetnych. Wykazano, że pokrycie zaczepów aparatów ortodontycznych jonami srebra skutecznie hamuje wzrost drobnoustrojów odpowiedzialnych za rozwój próchnicy zębów i paradontozy w warunkach in vitro. Poza tym, powłoka spowodowała redukcję ilości komórek tworzących biofilm Streptococcus sorbinus na fragmentach zaczepów [47]. Komercyjnie dostępne są cewniki urologiczne powlekane srebrem. Wyniki badań sprzed kilku lat sugerowały ich wysoką skuteczność przeciwdrobnoustrojową i odporność na kolonizację bakteryjną. Ostatnie doniesienia wskazują jednak, że zastosowanie powłoki srebrowej nie powoduje statystycznie istotnej redukcji częstości infekcji związanych z wykorzystaniem cewników [60]. 4. Metody eradykacji biofilmu W sytuacjach, kiedy profilaktyka zawodzi, dochodzi do kolonizacji stosowanych biomateriałów i rozwoju infekcji związanych z biofilmem. W związku z tym, że wiele, do tej pory rutynowo stosowanych środków przeciwdrobnoustrojowych jest nieskutecznych w zwalczaniu tego typu infekcji, stanowią one bezpośrednie zagrożenie dla życia pacjentów. Stwarza to potrzebę rozwoju nowych strategii zwalczania zakażeń związanych z biofilmem. Dotychczas stosowane i opracowywane metody mające na celu eradykację biofilmu bakteryjnego można zaklasyfikować do 3 grup: metod fizycznych, biologicznych oraz chemicznych. 4.1. Fizyczne metody eradykacji biofilmu Podstawową metodą fizyczną, która wykazuje wysoką skuteczność, jest mechaniczne niszczenie struktury biofilmu. Oczyszczanie powierzchni można przeprowadzić poprzez szorowanie lub skrobanie. Wadą tych działań jest niewielka uniwersalność zastosowania wynikająca z różnej budowy kolonizowanych materiałów i urządzeń. 7 Inną metodą fizyczną jest zastosowanie wysokiej temperatury. Potwierdzono, że biofilm poddany działaniu temperatury powyżej 95°C przez 100 min. ulega całkowitemu zniszczeniu. Podobną efektywność uzyskuje się poprzez wykorzystanie niskich temperatur. Cykl trzykrotnego zamrażania (–12°C) i rozmrażania struktury bakteryjnej powoduje jej eliminację. Prowadzone są badania nad możliwością zastosowania fal ultradźwiękowych. Do tej pory wiadomo, że ich działanie polega głównie na redukcji ilości komórek bakteryjnych, które uległy adhezji [7, 50]. Podejmowane są także próby eliminacji biofilmu przez zastosowanie pola elektrycznego. Według literatury wykorzystanie prądu o niskim natężeniu, generowanego przez elektrody przewodzące, zwiększa przepuszczalność błony komórkowej bakterii dla substancji przeciwdrobnoustrojowych. Dodatkowo, potwierdzono hamujący wpływ pola elektrycznego na wzrost mikroorganizmów. Testy z zastosowaniem pola elektrycznego o niskim natężeniu dały obiecujące wyniki w stosunku do szczepów S. aureus i P. aeruginosa [21]. Duże nadzieje pokłada się w metodach wykorzystujących zimną plazmę będącą mieszaniną wolnych rodników, jonów, wzbudzonych cząsteczek i promieniowania UV. Dokładny mechanizm oddziaływania strumienia plazmy z komórką bakteryjną nie został jeszcze poznany. Przypuszcza się, że istnieją 3 główne drogi działania: dezorganizacja błony komórkowej, niszczenie białek wewnątrzkomórkowych i niszczenie struktury DNA [42]. Interesującą alternatywą jest także terapia fotodynamiczna. Jej działanie polega na zastosowaniu związków fotouczulających, które po aktywacji światłem wykazują działanie cytotoksyczne poprzez generowanie reaktywnych form tlenu. Terapia fotodynamiczna wykazała wysoką skuteczność w zwalczaniu infekcji przyzębia [8]. Efektywność terapii potwierdzono także w stosunku do szczepów z rodzaju Enterococcus, Escherichia, Staphylococcus i Klebsiella wyizolowanych od pacjentów z głębokimi ropniami tkanek [23]. Terapia fotodynamiczna okazała się również dobrym narzędziem w eradykacji in vitro metycylinoopornych szczepów S. aureus [77]. Prowadzone są również badania nad zmniejszaniem szkodliwości terapii fotodynamicznej. Dobrym rozwiązaniem wydaje się być zastosowanie terapii fotodynamicznej w kombinacji z nanocząsteczkemi srebra. Metoda efektywnie redukowała ilość komórek S. aureus w testach in vitro [51]. 4.2. Biologiczne metody eradykacji biofilmu Spośród intensywnie badanych metod biologicznych eradykacji biofilmu najbardziej obiecującą wydaje się fagoterapia, polegająca na wykorzystaniu wirusów atakujących bakterie. Potwierdzono wysoką aktywność bakteriofagów w stosunku do drobnoustrojów 8 MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Z powodzeniem od lat wykorzystywane są w leczeniu eksperymentalnym zakażeń szczepami m.in. z rodzaju Salmonella, Proteus, Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia i Enterobacter. Doświadczenie przeprowadzone na modelu zwierzęcym z rozwiniętą infekcją E. coli wykazało wyższą skuteczność jednorazowego podania fagów niż serii dawek antybiotyku. Fagoterapia ma największe znaczenie w przypadku eliminacji bakterii wielolekoopornych. Potwierdzono jej efektywność wobec szczepów gronkowca złocistego opornego na metycylinę i wankomycynoopornych enterokoków [44]. Badano także możliwość stosowania bakteriofagów w leczeniu infekcji płuc wywołanych przez P. aeruginosa u chorych na mukowiscydozę. Wykazano skuteczność bakteriofagów w stosunku do szczepów klinicznych zarówno w formie planktonowej, jak i tworzących zorganizowane skupiska [3]. Inną strategią biologicznej walki z biofilmem jest stosowanie enzymów skierowanych wobec macierzy polisacharydowej (matrix-targeting enzymes). Ingerencja w strukturę lub degradacja zewnątrzkomórkowej macierzy polimerowej biofilmu może skutecznie go osłabić lub prowadzić do jego rozproszenia. Przeprowadzono szereg badań nad zdolnością związków do degradacji składników macierzy, takich jak polisacharydu, zewnątrzkomórkowego genomowego DNA (eDNA) i białek [34]. Wykazano, że Dyspersyna B, produkowana przez Gram-ujemne bakterie jamy ustnej Actinobacillus actinomycetemcomitans, zakłóca strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej biofilmu innych szczepów. Związek wpływa m.in. na strukturę zewnątrzkomórkowej macierzy biofilmu S. epidermidis prowadząc do jego rozproszenia [14, 33]. Zastosowanie enzymu DNAzy okazało się skuteczne w eliminacji biofilmu S. aureus [43, 29]. Podobne właściwości wobec biofilmu S. aureus wykazały proteinaza K i trypsyna [12]. Skuteczność enzymów wobec matrix nie została jednak jeszcze potwierdzona w testach in vivo. Istnieje wiele ograniczeń w tego typu podejściu, jednym z nich jest ryzyko wystąpienia reakcji zapalnych i alergicznych [12, 14]. 4.3. Chemiczne metody eradykacji biofilmu Aktywność wielu dostępnych związków przeciw­ drobnoustrojowych w stosunku do biofilmu jest znacznie ograniczona w porównaniu do aktywności tych substancji wobec komórek wolnopływających tych samych szczepów drobnoustrojów. Wynika to przede wszystkim z warstwowej budowy biofilmu oraz obecności macierzy polisacharydowej, co utrudnia penetrację związków do wnętrza struktury. Poza tym dochodzi do zmian ekspresji genów oraz metabolizmu komórek drobnoustrojów położonych w głębszych warstwach struktury, prowadzących do obniżonej wrażliwości na wiele substancji przeciwdrobnoustrojowych [37]. Wykorzystywane metody chemiczne opierają się głównie na zastosowaniu substancji utleniających, np. chloru i jego związków, które powodują degradację budowy przestrzennej. W stosunku do biofilmu skuteczny jest także formaldehyd i czwartorzędowe sole amoniowe. Pozytywne wyniki w eradykacji biofilmu uzyskuje się również dzięki zastosowaniu surfaktantów, których mechanizm działania polega na zaburzaniu integralności struktury. Zastosowanie wyżej wymienionych związków chemicznych ogranicza się do procesów dezynfekcji powierzchni [50]. Do najskuteczniejszych, obecnie stosowanych antyseptyków należy chlorowodorek oktenidyny. Związek został wprowadzony do powszechnego użytku ponad dwie dekady temu i do tej pory stanowi najlepsze rozwiązanie w zapobieganiu i terapii infekcji ran. Potwierdzono jego wysoką skuteczność w stosunku do drobno­ustrojów Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych oraz grzybów. Ponadto, jest aktywny wobec szczepów S. aureus opornych na metycylinę. Oktenidyna jest również skuteczna w zwalczaniu biofilmu bakteryjnego. Wykazano między innymi, że preparat zawierający dichlorowodorek oktenidyny skuteczniej eliminuje biofilmy tworzone przez S. aureus i P. aeruginosa w porównaniu do mleczanu etakrydyny i jodopowidonu [31, 48]. 5. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe Obiecującą grupą związków o potencjalnym zastosowaniu do walki z biofilmem wydają się być peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP, Antimicrobial Peptides), charakteryzujące się silnymi właściwościami przeciwdrobnoustrojowymi oraz szerokim spektrum działania [17, 35]. Stanowią one istotną część wrodzonej odporności, a ze względu na wysoką aktywność wobec biofilmu i niskie ryzyko rozwoju oporności w porównaniu do konwencjonalnych antybiotyków ich potencjalne zastosowanie w terapii zakażeń wydaje się uzasadnione [64]. Wyniki licznych badań przeprowadzonych w warunkach in vitro i in vivo potwierdzają zdolność AMP do eliminacji oraz zapobiegania tworzenia się struktur biofilmu. Wykazano między innymi, że ludzka katelicydyna LL-37 hamuje proces formowania się biofilmu oraz powoduje jego eradykcję w stężeniach znacznie niższych niż stężenia hamujące wzrost komórek planktonowych [56, 70]. Już w stężeniu 0,5 μg/ml, LL-37 wykazuje silną aktywność antybiofilmową w stosunku do P. aeruginosa, głównego czynnika etiologicznego zapalenia płuc u chorych na mukowiscydozę oraz NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO wobec szczepu Francisella novicida odpowiedzialnego za rozwój tularemii [4]. Sugeruje się możliwość zastosowania wytwarzanej przez neutrofile laktoferyny (LF) w terapii stomatologicznej. Związek ten naturalnie występuje także w ślinie, łzach, mleku, nasieniu oraz w śluzowo-surowiczej wydzielinie okrężnicy. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe laktoferyny wynikają z jej zdolności do wiązania jonów Fe3+. Potwierdzono zdolność związku do hamowania i zapobiegania tworzeniu się biofilmów szczepów Porphyromonas gingivalis i Prevotella intermedia, odpowiedzialnych za powstawanie biofilmu na blaszkach poddziąsłowych [71]. Powlekanie biomateriałów za pomocą AMP stanowi obiecującą opcję profilaktyki zakażeń związanych z biofilmem. Przykładem zastosowania AMP do tego celu jest powlekanie powierzchni soczewek kontaktowych Meliminą, zbudowaną z fragmentów Mellityny i Protaminy. Peptyd ten skutecznie zapobiega adhezji komórek P. aeruginosa i S. aureus, natomiast wyniki przeprowadzonych testów toksyczności sugerują także bezpieczeństwo w stosunku do ludzkiego organizmu [19, 72]. Badania in vivo przeprowadzone na królikach i świnkach morskich, u których wywołano owrzodzenie oka i zapalenie spojówek, wykazały, że stosowanie soczewek kontaktowych pokrytych peptydem znacznie redukuje objawy zakażenia [15]. Liczne badania in vivo potwierdzają zdolność innych AMP do zapobiegania, a także eliminacji infekcji związanych z biofilmem. Potwierdzono między innymi skuteczność Citropiny 1.1, Temporyny A oraz IB-367 na zwierzęcych modelach infekcji wywołanych przez S. aureus [32]. Ponadto, Temporyna A skutecznie zapobiega adhezji komórek S. epidermidis do protezy naczyniowej na modelu szczurzym [20]. Peptyd IB-367 okazał się skuteczny w redukcji mikroflory jamy ustnej będącej potencjalnym czynnikiem etiologicznym zapalenia błony śluzowej. Zaobserwowano redukcję kolonizacji przez bakterie Gram-ujemne, szczepy z rodzaju Staphylococcus oraz całkowitą eradykację grzybów [49]. Wyniki dotychczasowych doświadczeń przeprowadzonych z wykorzystaniem peptydów przeciwdrobnoustrojowych czynią z nich doskonałą matrycę do projektowania nowych związków przeciwdrobnoustrojowych oraz zachęcają do kontynuacji badań naturalnych AMP. 6. Podsumowanie Złożoność struktury biofilmu i jego wysoka oporność wobec konwencjonalnych antybiotyków są przyczynami trudności napotykanych podczas terapii infekcji związanych z biofilmem. Pogłębianie wiedzy na temat tworzenia się, funkcjonowania i struktury biofilmu stanowią podstawę dla poszukiwania alternatyw- 9 nych metod profilaktyki i leczenia zakażeń związanych z jego występowaniem. Opisane dotychczas strategie mające na celu zmniejszenie ryzyka kolonizacji powierzchni przez drobnoustroje chorobotwórcze obejmują między innymi zastosowanie niskocząsteczkowych molekuł oraz ingerencję w procesy quorum sensing. Bardzo obiecującym rozwiązaniem jest także zastosowanie przeciwciał wiążących adhezyny bakteryjne oraz użycie biofilmu drobnoustrojów niepatogennych. Inne metody mające zapobiegać procesowi rozwoju biofilmu dotyczą modyfikacji powierzchni biomateriałów. Prowadzone badania mają na celu opracowanie materiału odpornego na kolonizację i jednocześ­ nie bezpiecznego dla ludzkiego organizmu. Modyfikacje obejmują zmiany ładunku powierzchniowego, zmniejszenie energii powierzchniowej oraz zwiększanie hydrofobowości materiałów medycznych. Istotnym podejściem jest także powlekanie biomateriałów za pomocą związków prezentujących właściwości przeciwdrobnoustrojowe. W przypadku niepowodzenia profilaktyki dochodzi do kolonizacji tkanek, bądź powierzchni biomateriałów, co często skutkuje rozwojem zakażenia. W związku z niską skutecznością antybiotykoterapii, możliwości terapii infekcji związanych z biofilmem są bardzo ograniczone. Dostępne fizyczne metody eliminacji biofilmu ograniczają się głównie do usuwania biofilmu z powierzchni nieożywionych. Zastosowanie związków o właściwościach utleniających lub surfaktantów także ogranicza się głównie do procesów dezynfekcji. Spośród antyseptyków stosowanych w lecznictwie największą skuteczność w eradykacji biofilmu wykazuje chlorowodorek oktenidyny. Do obiecujących metod alternatywnych należą terapia fotodynamiczna, fagoterapia oraz terapia z wykorzystaniem peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Piśmiennictwo 1.Abraham N.M., Lamlertthon S., Fowler V.G., Jefferson K.K.: Chelating agents exert distinct effects on biofilm formation in Staphylococcus aureus depending on strain background: Role for clumping factor B. J. Med. Microbiol. 61, 1062–1070 (2012) 2. Agarwal A., Singh K.P., Jain A.: Medical significance and management of staphylococcal biofilm. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 58, 147–160 (2010) 3. Alemayehu D., Casey P.G., McAuliffe O., Guinane C.M., Martin J.G., Shanhan F., Coffey A., Ross R.P., Hill C.: Bacteriophages ϕMR299-2 and ϕNH-4 can eliminate Pseudomonas aeruginosa in the murine lung and on cystic fibrosis lung airway cells. MBio, 3, (2012) 4.Amer L.S., Bishop B.M., Hoek van M.L.: Antimicrobial and antibiofilm activity of cathelicidins and short, synthetic peptides against Francisella. Biochem. Biophys. Res. Commun. 396, 246–251 (2010) 10 MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL 5. Antoci Jr V., Hickok N.J. i wsp.: The inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm formation by vancomycin-modified titanium alloy and implications for the treatment of periprosthetic infection. Biomaterials, 29, 4684–4690 (2008) 6. Arciolo C.R., Baldassarri L., Campoccia D., Creti R., Pirini V., Huebner J., Montanaro L.: Strong biofilm production, antibiotic multi-resistant and high gelE expression in epidemic clones of Enterococcus faecalis from orthopaedic implant infections. Biomaterials, 29, 580–586 (2008) 7.Axelsson L., Holch A., Rud I., Samah D., Tierce P., Favre M., Kure C.F.: Cleaning of conveyor belt materials using ultrasound in thin layer of water. J. Food. Prot. 76, 1401–1407 (2013) 8.Betsy J., Prasanth C.S., Baiju K.V., Prasanthila J., Subhash N.: Efficacy of antimicrobial photodynamic therapy in the management of chronic periodontitis: a randomized controlled clinical trial. J. Clin. Periodontal. 41, 573–581 (2014) 9. Boks N.P., Kaper H.J., Norde W., Mei van der H.C., Busscher H.J.: Mobile and immobile adhesion of staphylococcal strains to hydrophilic and hydrophobic surfaces. J. Colloid Interface Sci. 331, 60–64 (2009) 10. Bryers J.D.: Medical Biofilms. Biotechnol. Bioeng. 1, 1–18 (2008) 11. Busscher H.J., Rinastiti M., Siswomihardjo W., Mei van der H.C.: Biofilm formation on dental restorative and implant materials. J. Dent. Res. 89, 657–665 (2010) 12.Chaignon P., Sadovskaya I., Ragunah C., Ramasubbu N., Kaplan J.B., Jabbouri S. Susceptibility of staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 125–132 (2007) 13. Chatterjee S., Maiti P., Dey R., Kundu A., Dey R.: Biofilms on indwelling urologic devices: microbes and antimicrobial management prospect. Ann. Med. Health Sci. Res. 4, 100–104 (2014) 14.Chen M., Yu Q., Sun H.: Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int. J. Mol. Sci. 14, 18488–18501 (2013) 15. Cole N., Hume E.B.H., Vijay A.K., Sankaridurg P., Kumar N., Willcox M.D.P.: In vivo performance of Melimine as an antimicrobial coating for contact lenses in models of CLARE and CLPU. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 390–395 (2010) 16. Davies D.G., Marques C.N.: A fatty acid messenger is responsible for inducing dispersion in microbial biofilms. J. Bacteriol. 191, 1393–1403 (2009) 17.Dawgul M., Barańska-Rybak W., Bielińska S., Nowicki R., Kamysz W.: Wpływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych na biofilm Candida. Alergia Astma Immunologia, 15, 220–225 (2010) 18. Donlan R.M.: Biofilms and device-associated infections. Emerg. Infect. Dis. 7, 277–281 (2001) 19. Dutta D., Cole N., Kumar N., Willcox M.D.P.: Broad spectrum antimicrobial activity of Melimine covalently bound to contact lenses. Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 54, 175–182 (2013) 20. Ghiselli R., Giacometti A., Cirioni O., Mocchegini F., Orlando F., Kamysz W., Del Prete M. S., Lukasiak J., Scalise G., Saba V.: Temporin A as a prophylactic agent against methicillin-sodium susceptible and methicillin sodium-resistant Staphylococcus epidermidis vascular graft infection. J. Vasc. Surg. 36, 1027–1030 (2002) 21. Gilodi M. Porat X., Blatt A., Wasserman Y., Kirson E.D., Dekel E., Palti Y.: Microbial growth inhibition by alternating electric fields. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 3517–3522 (2008) 22. Gospodarek E., Zalas P.: Ingerencja człowieka w komunikowanie się drobnoustrojów. Post. Mikrobiol. 47, 365–370 (2008) 23. Haidaris C.G., Foster T.H., Waldman D.L., Mathes E.J., McNamara J., Curran T.: Effective photodynamic therapy against microbial populations in human deep tissue abscess. Laser. Surg. Med. 45, 509–516 (2013) 24. Harris L.G., Tosatti S., Wieland M., Textor M., Richards R.G.: Staphylococcus aureus adhesion to titanium oxide surfaces coated with non-functionalized and peptide-functionalized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials, 25, 4135–4148 (2004) 25. Hogan D.A.: Talking to themselves: autoregulation and quorum sensing in fungi. Eukaryot. Cell, 5, 613–619 (2006) 26. Hu J., Xu T., Zhu T., Wang X., Wu Y., Huang R., liu J., Liu H., Yu F., Ding B., Huang Y., Tong W., Qu D.: Monoclonal anti­ bodies against accumulation-associated protein affect EPS biosynthesis and enhance bacterial accumulation of S. epidermidis. PLoS One, 6 (2011) 27. Huang N.P., Michel R., Voros J., Textor M., Hofer M., Rossi A., Elbert D.L., Hubbell J.A., Spencer N.D.: Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: Surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir, 17, 489–498 (2001) 28. Ivanova E.P., Mitik-Dineva N., Wang J., Pham D.K., Wright J.P., Nicolau D.V., Mocanasu R.C., Crawford R.J.: Staleya guttiformis attachment on poly(tert-butylmethacrylate) polymeric surfaces. Micron, 39, 1197–2104 (2008) 29. Izano E.A., Amarante M.A., Kher W.B., Kaplan J.B.: Differential roles of poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide and extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 470–476 (2008) 30.Jabra-Rizk M.A., Shirtliff M., James C., Meiller T.: Effect of farnesol on Candida dubliniensis biofilm. FEMS Yeast Res. 6, 1063–1073 (2006) 31. Junka A., Bartoszewicz M., Smutnicka D., Secewicz A., Szymczak P.: Efficacy of antiseptics containing povidone-iodine, octenidine dihydrochloride and ethacridine lactate against biofilm formed by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus measured with the novel biofilm-oriented antiseptic test. Int. Wound J. 11, 730–734 (2013) 32. Kamysz W., Nadolski P.: Przeciwbakteryjna aktywność peptydów ze skóry płazów. Ann. Acad. Med. Gedan. 35, 29–34 (2005) 33. Kaplan J.B, Ragunath C., Velliyagounder K., Fine D.H, Ramasubbu N.: Enzymatic detachment of Staphylococcus epidermdis biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 2633–2636 (2004) 34. Kiedrowski M.R., Horswill A.R.: New approaches for treating staphylococcal biofilm infections. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1241, 104–121 (2011) 35. Koczulla A.R., Bals R.: Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential. Drugs, 63, 389–406 (2003) 36.Kolodkin-Gal I., Romero D., Cao S., Clardy J., Kolter R., Losick R.: D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science, 328, 627–629 (2010) 37. Kołwzan B.: Analiza zjawiska biofilmu – warunki jego powstawania i funkcjonowania. Ochrona środowiska, 33, 3–14 (2011) 38. LaFleur M., Kumamoto C.A., Lewis K.: Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 3839–3846 (2006) 39. Lellouche J., Friedman A., Banin E.: Antimicrobial and antibiofilm properties of yttrium fluoride nanoparticles. Int. J. Nanomidicine. 7, 5611–5624 (2012) 40. Ma Y., Chen M., Jones J. E., Ritts A.C., Yu Q., Sun H.: Inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm by trimethylsilane plasma coating. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5923–5937 (2012) 41.Ma Y., Xu Y., Yestrepsky B.D., Sorenson R.J., Chen M., Larsen S.D., Sun H.: Novel inhibitors of Staphylococcus aureus virulence gene expression and biofilm formation. PLoS One, 7, 47255 (2012) 42.Mai-Prochnow A., Murphy A.B., McLean K.M., Hong M.G., Ostrikov K.: Atmospheric pressure plasmas: infection control NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO and bacterial responses. Int. J. Antimicrob. Agents. 43, 508–516 (2014) 43. Mann E.E., Rice K.C., Boles B.R., Endres J.L., Ranjit D., Chandra­ mohan L., Tsang L.H., Smeltzer M.S., Horswill A.R., Bayles K.W.: Modulation of eDNA release and degradation affects Staphylococcus aureus biofilm maturation. PLoS One, 4, 5822 (2009) 44.Międzybrodzki R., Borysowski J., Fortuna W., Dąbrowska-Weber B., Górski A.: Terapia fagowa jako alternatywa w leczeniu zakażeń wywołanych przez bakterie antybiotykooporne. Kardiochir. Torakochir. Pol. 3, 201–205 (2006) 45. Miller M.B., Bassler B.L.: Quorum sensing in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 55, 165–199 (2001) 46. Mitik-Dineva N., Wang J., Truong V.K., Stoddart P., Malherbe F., Crawford R.J., Ivanova E.P.: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus attachment patterns on glass surfaces with nanoscale roughness. Curr. Microbiol. 58, 268–273 (2009) 47. Morita Y., Imai S., Hanyuda A., Matin K., Hanada N., Nakomura Y.: Effect of silver ion coating of fixe orthodontic retainers on the growth of oral pathogenic bacteria. Dent. Mater J. 33, 268–274 (2014) 48. Moritz S., Wiegand C., Wesarg F., Hessler N., Müller F., Kralisch D., Hipler U., Fischer D.: Active wound dressing based on bacterial nanocellulose as drug delivery system for octenidine. Int. J. Pharm. 471, 45–55 (2014) 49. Mosca D.A., Hurst M.A., So W., Vijar B.S.C., Fujii C.A., Falla T.J.: IB-367, a protegrine peptide with in vitro and in vivo activities against the microflora associated with oral mucositis. Anti­microb. Agents Chemother. 44, 1803–1808 (2000) 50. Myszka K., Czaczyk K.: Metody usuwania biofilmów bakteryjnych z powierzchni stałych. Przemysł Spożywczy, 2, 18–21 (2007) 51.Nakonieczna J., Rapacka-Zdonczyk A., Bielawski K.P., Grinholc M.: Sub-lethal photodynamic inactivation renders Staphylococcus aureus susceptible to silver nanoparticles. Photochem. Photobiol. Sci. 12, 1622–1627 (2013) 52. Neut D., Dijkstra R.J.B., Thompson J.I., Mei van der H.C., Busscher H.J.A gentamycin-releasing coating for cementless hip prostheses-longitudinal evaluation of efficacy using in vivo bio-optical imaging and its wide-spectrum antimicrobial efficacy. J. Biomed. Mater Res. 12, 3220–3226 (2012) 53. Nobile C.J., Mitchell A.P.: Genetics and genomics of Candida albicans biofilm formation. Cell Microbiol. 8, 1382–1391 (2006) 54. Otto M.: Staphylococcal biofilms. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 207–228 (2008) 55. Otto M.: Staphylococcus epidermidis- the “accidental” pathogen. Nat. Rev. Microbiol. 7, 555–567 (2009) 56. Overhage J., Campisano A., Bains M., Torfs E.C.W., Rehm B.H.A., Hancock R.E.W.: Human host defense peptide LL-37 prevents bacterial biofilm formation. Infect. Immun. 76, 4176–4182 (2008) 57. Pavithra D., Doble M.: Biofilm formation, bacterial adhesion and host response on polymeric implants-issues and prevention. Biomed. Mater. 3, 034003 (2008) 58. Perez-Giraldo C., Rodriguez-Benito A., Moran F.J., Hurtado C., Blanco M.T., Gomez-Garcia A.C.: Influence of N-acetylcysteine on the formation of biofilm by Staphylococcus epidermidis. J. Antimicrob. Chemother. 39, 643–646 (1997) 59. Privett B.J., Youn J., Hong S.A., Lee J., Han J., Shin J.H., Schoen­ fisch M.H.: Antibacterial fluorinated silica colloid superhydrophobic surfaces. Langmuir, 27, 9597–9601 (2011) 60. Regev-Shoshani G., Ko M., Crowe A., Av-Gay Y.: Comparative efficacy of commercially available and emerging antimicrobial urinary catheters against bakteriuria caused by E. coli in vitro. Urology, 78, 334–339 (2011) 11 61.Roosjen A., Kaper H.J., Mei van der H.C., Norde W., Busscher H.J.: Inhibition of adhesion of yeasts and bacteria by poly(ethylene oxide)-brushes on glass in a parallel plate flow chamber. Microbiology, 149, 3239–3246 (2003) 62. Roosjen A., Mei van der H.C., Busscher H.J., Norde W.: Microbial adhesion to poly(ethylene oxide) brushes: Influence of polymer chain lenghth and temperature. Langmuir, 20, 10949–10955 (2004) 63. Roosjen A., Norde W., Mei van der H.C., Busscher H.J.: The use of positively charged or low surface free energy coatings versus polymer brushes in controlling biofilm formation. Prog. Colloid. Polym. Sci. 132, 138–144 (2006) 64. Rossi L.M., Rangasamy P., Zhang J., Qiu X.Q., Wu G.Y.: Research advances in the development of peptide antibiotics. J. Pharm. Sci. 97, 1060–1070 (2008) 65. Sun D., Accavitti M.A., Bryers J.D.: Inhibition of biofilm formation by monoclonal antibodies against Staphylococcus epidermidis RP62A accumulation-associated protein. Clin. Diag. Lab. Immunol. 12, 93–100 (2005) 66.Sun H., Ginsburg D. i wsp.: Inhibitor of streptokinase gene expression improves survival after group A streptococcus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 3469–3474 (2012) 67. Tang H., Cao T., Liang X., Wang A., Salley S.O., McAllister J., Ng K.Y.: Influence of silicone surface roughness and hydrophobicity on adhesion and colonization of Staphylococcus epidermidis. J. Biomed. Mater. Res. 88, 454–463 (2009) 68. Trautner B.W., Hull R.A., Darouiche R.O.: Prevention of catheter-associated urinary tract infection. Curr. Opin. Infect. Dis. 18, 37–41 (2005) 69.Truong V.K., Lapovok R., Estrin Y.S., Rundell S., Wang J.Y., Fluke C.J., Crawford-Ivanova E.P.: The influence of nano-scale surface roughness on bacterial adhesion ultrafine-grained titanium. Biomaterials, 31, 3674–3683 (2010) 70. Varra M.: New approaches in peptide antibiotics. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 571–576 (2009) 71.Wakabayashi H., Yamauchi K., Kobayashi T., Yaeshima T., Iwatsuki K., Yoshie H.: Inhibitory effects of lactoferrin on growth and biofilm formation of Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3308–3316 (2009) 72. Willcox M.D.P., Hume E.B.H., Aliwarga Y., Kumar N., Cole N.: A novel cationic-peptide coating for the prevention of microbial colonization on contact lenses. J. App. Microbiol. 105, 1817–1825 (2008) 73.Wu Y., Zitelli J.P., Ten-Huisen K.S., Yu X., Libera M.R.: Differential response of Staphylococci and osteoblasts to varying titanium surface roughness. Biomaterials, 32, 951–960 (2010) 74. Xu L.C., Siedlecki C.A.: Submicron-textured biomaterial surface reduces staphylococcal bacterial adhesion and biofilm formation. Acta Biomater. 8, 72–81 (2012) 75. Yount N.Y., Yeaman M.R.: Multidimensional signatures in antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 7363–7368 (2004) 76. Zhang L.H., Dong Y.H.: Quorum sensing and signal interference: diverse implications. Mol. Microbiol. 53, 1563–1571 (2004) 77. Zhao Z., Li Y., Meng S., Li S., Wang Q., Lin T.: Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to photodynamic antimicrobial chemotherapy with α-D-galactopyranosyl zinc phthalocyanines: in vitro study. Lasers Med. Sci. 29, 1131–1138 (2014) 78.Zimmermann S., Wagner C., Müller W., Brenner-Weiss G., Hug F., Prior B., Obst U., Hänsch G.M.: Induction of neutrophil chemotaxis by the quorum-sensing molecule N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone. Infect. Immun. 74, 5687–5692 (2006) POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 12–18 http://www.pm.microbiology.pl ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM Sławomir Sułowicz1*, Zofia Piotrowska-Seget1 Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski 1 Wpłynęło w lutym 2015 r. Zaakceptowano w marcu 2015 r. 1. Charakterystyka fungicydów. 2. Wpływ presji fungicydowej na ekosystem glebowy. 3. Oddziaływanie fungicydów na mikroorganizmy glebowe. 4. Triazole – charakterystyka i wpływ na ekosystem glebowy. 5. Podsumowanie The impact of fungicides on soil microorganisms Abstract: Modern agriculture depends heavily on pesticides, including fungicides. Fungicides such as triazoles, when applied every year, may accumulate in soils leading to the development of resistance to the applied compounds and subsequently to the spread of resistance genes to other fungi. Additionally, fungicides can impact non-target soil microorganisms by reducing their biomass, changing microbial activity, and altering functional and structural diversity of bacterial and fungal communities. Soil quality is closely linked to the microbial activity, therefore, the effects of fungicides on non-target soil microorganisms increase concerns about the fertility of soil. This new knowledge about specific interaction between fungicides and soil microorganisms has to be taken into consideration in designing a new strategy for soil protection. 1. Fungicides. 2. The influence of fungicide pressure on soil ecosystem. 3. The impact of fungicides on soil microorganisms. 4. Triazoles – their characteristic features and influence on soil ecosystem. 5. Conclusions Słowa kluczowe: fungicydy, gleba, triazole, zespół mikroorganizmów Key words: fungicides, microbial community, soil, triazoles 1. Charakterystyka fungicydów Jednym z największych zadań stojących przed współczesnym rolnictwem jest wyżywienie wzrastającej liczby ludności. Ponieważ powierzchnia gruntów rolnych, które można wykorzystać pod uprawy, jest ograniczona, konieczne staje się zwiększanie wydaj­ności produkcji rolniczej. Do osiągnięcia tego celu stosuje się nawozy oraz środki ochrony roślin określane wspólnym mianem pestycydów (z łac. pestis – szkodnik, cedeo – niszczyć). Wśród związków wykorzystywanych jako środki ochrony roślin są zarówno substancje pochodzenia naturalnego, syntetyczne [3], jak również preparaty zawierające żywe organizmy lub ich metabolity, tzw. biopestycydy [6]. Jedną z najważniejszych i najczęściej stosowanych grup pestycydów są fungicydy, których blisko połowa światowego zużycia przypada na Europę [8]. Fungicydy stosowane są w rolnictwie do zapobiegania i zwalczania chorób roślin użytkowych wywoływanych przez grzyby. Spośród 462 dopuszczonych do stosowania w krajach Unii Europejskiej środków ochrony roślin, w 135 substancja aktywna charakteryzuje się właściwoś­ ciami przeciwgrzybicznymi [14]. Zużycie fungicydów w Europie w 2010 roku, obliczane przez ECPA (European Crop Protection Association, Europejskie Stowarzyszenie Ochrony Roślin), organizację reprezentującą producentów środków ochrony roślin z 28 europejskich krajów, szacowane jest na ponad 100 000 ton [15]. Istnieje wiele sposobów klasyfikacji fungicydów. Za kryterium podziału przyjmuje się m.in. docelowe miejsce działania związku w komórce patogenu, budowę chemiczną środków grzybobójczych czy też ich toksycz­ność [3, 51]. Powołana w 1981 roku przez producentów środków ochrony roślin organizacja FRAC (Fungicide Resistant Action Committee), monitorująca pojawianie się grzybów opornych na stosowane fungicydy, klasyfikuje fungicydy ze względu na 10 możliwych mechanizmów działania (tab. I). Klasyfikacja ta obejmuje ponadto fungicydy działające na wiele miejsc w komórce jednocześnie, jak również grupę pestycydów, dla których nie jest zdefiniowany mechanizm działania [17]. Fungicydy klasyfikuje się także ze względu na budowę chemiczną związku, będącego substancją aktywną stosowanego preparatu pestycydowego. Wśród związków wykorzystywanych jako fungicydy są zarówno związki nieorganiczne, np. związki miedzi, jak i różne grupy związków organicznych [3]. Spośród tych ostatnich do 100 najważniejszych grup wykorzystywanych w rolnictwie i sadownictwie zalicza się m.in. triazole, będące najliczniejszą grupą fungicydów, strobiluryny, ditiokarbaminiany, imidy kwasu ftalowego czy związki benzimidazolowe [8]. * Autor korespondencyjny: Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski, ul. Jagiellońska 28, 40-032 Katowice; tel. 32 2009 357; e-mail: [email protected] ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM 13 Tabela I Klasyfikacja fungicydów ze względu na sposób działania wg FRAC [17] Symbol grupy Cel działania fungicydu Wybrane grupy Przykładowy fungicyd A: synteza kwasów nukleinowych pochodne acylalaniny mefenoksam, metalaksyl B: mitoza i podział komórki benzimidazole benomyl, karbendazym, tiabendazol tiofanaty tiofanat metylowy pochodne fenylmocznika pencykuron N-fenylokarbaminiany dietofenkarb C:oddychanie strobiluryny azoksystrobina karboksyanilidy karboksyna 2,6-dinitroaniliny fluazynam D: synteza aminokwasów i białek anilinopirymidyny cyprodynil E: transdukcja sygnału dikarboksyimidy iprodion F: synteza lipidów i błon komórkowych fosforotiolany kitazin (iprobenfos) G: biosynteza steroli pirymidyny nuarimol imidazole prochloraz triazole difenokonazol, epoksykonazol, fenbukonazol, heksakonazol, penkonazol, propikonazol, tebukonazol, tetrakonazol, triadimefon, tritikonazol morfoliny fenpropimorf H: biosynteza ściany komórkowej pochodne kwasu cynamonowego dimetomorf I: synteza melaniny w ścianie komórkowej triazolobenzotiazole P: indukcja roślinnych mechanizmów obronnych tiadiazole – nieznany sposób działania tiokarbamiany metasulfokarb – wielomiejscowy sposób działania chinony ditianon imidy kwasu ftalowego kaptafol, kaptan ditiokarbaminiany mankozeb, tiram chloronitryle chlorotalonil tricyklazol izotianil Kursywą zaznaczono fungicydy wymienione w tekście. Inny użyteczny sposób podziału pestycydów, w tym fungicydów, grupuje je ze względu na stopień ich tok­ sycz­­ności. Klasyfikacja ta umożliwia szybką identyfikację potencjalnego zagrożenia, jakie niesie ze sobą stosowanie środków ochrony roślin dla zdrowia i życia ludzi. Przykładowo, WHO wyróżnia cztery klasy toksycz­ności. Do klasy związków skrajnie toksycznych (Ia) zaliczono 28 pestycydów, spośród których cztery – kaptafol, heksa­chlorobenzen, chlorek rtęci i octan fenylortęci – to związki o właściwościach przeciwgrzybicznych [51]. 2. Wpływ presji fungicydowej na ekosystem glebowy Z uwagi na sezonowe występowanie chorób grzybowych, związki wykorzystywane do zwalczania grzybów patogennych roślin stosowane są na tym samym terenie rok rocznie, często wielokrotnie w trakcie sezonu. Regularne wprowadzanie fungicydów do środowiska może prowadzić do ich akumulacji w glebie. Związki te pozostając w ekosystemie przez dłuższy czas, zwiększają swój negatywny wpływ na jego funkcjonowanie [18]. W kontekście funkcjonowania ekosystemów najważniejsze znaczenie mają dawki subletalne i stężenia resztkowe pestycydów. Dawki subletalne osiągane są w środowisku w wyniku stosowania ilości pestycydu, która nie wywołuje zamierzonego efektu biobójczego, bądź powstają na skutek rozproszenia wprowadzonego do środowiska środka ochrony roślin. Nie powodują śmierci organizmu, ale przyczyniają się do selekcji organizmów (mutantów) charakteryzujących się zmniejszoną wrażliwością na pestycyd [8]. W konsekwencji prowadzi to do rozprzestrzenienia się w populacji genów warunkujących oporność na stosowany pestycyd. Zjawisko zmniejszającej się wrażli­ wości na środki ochrony roślin dotyczy między innymi mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby. Organizmy te, z uwagi na krótki czas generacji mają duży potencjał powstawania mechanizmów oporności na środki ochrony roślin. U grzybów nowe mechanizmy 14 SŁAWOMIR SUŁOWICZ, ZOFIA PIOTROWSKA-SEGET oporności powstają głównie poprzez mutacje i późniejszy proces selekcji, podczas gdy bakterie uzyskują geny warunkujące oporność głównie poprzez wymianę materiału genetycznego na drodze horyzontalnego transferu genów [21]. Wpływ dawek subletalnych wiąże się nie tylko ze zjawiskiem nabywania oporności na stosowane pestycydy. Wśród organizmów narażonych na wpływ pestycydów obserwowane jest zjawisko tzw. oporności krzyżowej, kiedy to rozwój oporności na jeden ze stosowanych środków ochrony roślin zapewnia jedno­czesną oporność na inny pestycyd [9]. Takie zjawisko jest możliwe, gdy istnieje wspólny mechanizm oporności na dany związek, np. system transportu pestycydów z komórki (oporność krzyżowa) lub gdy geny, kodujące mecha­ nizmy warunkujące oporność na dwa różne związki, zlokalizowane są na tym samym elemencie genetycznym, np. plazmidzie [4]. Obserwowano patogenne szczepy grzybów opornych na benomyl, charakteryzujące się także opornością na inne fungicydy z grupy benzimidazoli jak karbendazym, tiabendazol czy tiofanat metylowy [9]. Zjawisko współwystępowania opor­ności na różne związki jest także odpowiedzialne za rozprzestrzenianie się, pod wpływem presji środowiskowej powstałej w wyniku stosowania pestycydów, opor­ności na antybiotyki [48]. Możliwa jest także negatywna oporność krzyżowa, gdy zmiana prowadząca do nabycia przez organizm oporności na jeden fungicyd powoduje zwiększenie wrażliwości na inny (karben­da­ zym i dietofenkarb) [9, 27, 28]. Drugim, obok dawek subletalnych, ważnym czynnikiem wpływającym na funkcjonowanie zespołu mikroorganizmów glebowych są stężenia resztkowe, czyli pozostałość pestycydu w środowisku po jego aplikacji. Główną metodą aplikacji fungicydów jest oprysk [8]. Jak się szacuje, mniej niż 0,1% stosowanego pestycydu osiąga swój cel, co sprawia, że większość aplikowanych pestycydów dostaje się bezpośrednio, bądź pośrednio wraz z deszczem do gleby [42, 43]. Oddziałując z jej elementami, stanowią potencjalne zagrożenie dla organizmów niebędących celem ich działania [52]. Jednak ocenę potencjalnego wpływu fungicydów na mikro­ organizmy glebowe utrudnia plastyczność reakcji bakterii i grzybów na jego obecność w środowisku glebowym. Z powodu małych rozmiarów mikroorganizmów stosunek powierzchni do objętości komórki jest wysoki, co znaczy, że mikroorganizmy charakteryzują się dużą powierzchnią oddziaływania ze środowiskiem. Z tego powodu odpowiedź mikroorganizmów na wprowadzenie do środowiska nowej substancji jest szybka i czuła, a wielokrotne wprowadzanie do środowiska danego środka ochrony roślin wspomaga adaptację mikro­ organizmów do niego. Obserwowany później brak reakcji zespołu mikro­ organizmów glebowych na ponowną aplikację pesty- cydu może być związany z rozwinięciem zdolności mikroorganizmów glebowych do szybszej degradacji danego środka, bądź nabytą tolerancją zespołu mikroorganizmów na pestycyd [25]. 3.Oddziaływanie fungicydów na mikroorganizmy glebowe Pomimo dużej zdolności mikroorganizmów glebowych do adaptacji i szybkiej ewolucji w wyniku presji fungicydowej, ich wpływ na mikroorganizmy niebędące celem działania środków ochrony roślin budzi obawy [11, 23]. Jakość i żyzność gleby jest ściśle związana z aktywnością mikroorganizmów glebowych – bak­ terii i grzybów. Mikroorganizmy te odgrywają kluczową rolę w obiegu pierwiastków, w tym węgla, azotu, fosforu czy siarki, jak również w procesach tworzenia gleby [5]. Liczne grupy bakterii zasiedlające ryzosferę biorą udział w promowaniu wzrostu roślin poprzez wydzielanie enzymów i hormonów wspomagających wzrost roślin, wydzielanie sideroforów ułatwiających wiązanie żelaza, jak również chronią przed patogenami [19, 31, 45]. Tym samym zmiany w obrębie zespołów mikroorganizmów glebowych powstałe pod wpływem wprowadzenia do środowiska fungicydów mogą negatywnie wpływać na żyzność gleby, a w konsekwencji prowadzić do spadku produkcji plonów [11]. Wyniki wielu badań wskazują, że stosowanie fungicydów może skutkować naruszeniem stabilności zespołu mikroorganizmów glebowych objawiającym się m.in. spadkiem liczebności mikroorganizmów niebędących celem działania fungicydu. Zmniejszenie liczeb­ności niepatogennych saprofitycznych grzybów glebowych obserwowano m.in. w przypadku wprowadzenia do gleby fungicydów takich jak ditianon [29], pencykuron [40, 41] czy prochloraz [50]. Zmniejszenie biomasy mikroorganizmów notowano także pod wpływem tebukonazolu [37], pencykuronu stosowanego do ochrony upraw ryżu [41] czy w wyniku długotrwałej aplikacji fungicydów opartych na związkach miedzi [54]. Toksyczny efekt w stosunku do bakterii zasiedlających tereny podmokłe i osady denne wykazywały także fungicydy tiram, kaptan i benomyl [33]. Ahemad i Khan [1] wykazali hamujący wpływ fungicydów (heksakonazolu, metalaksylu i kitazinu) na wzrost i aktywność bakterii promujących wzrost roślin (PGPB, plant growth promoting bacteria) z rodzaju Rhizobium. W wyniku stosowania rekomendowanych przez producenta dawek pestycydów obserwowano także ich hamujący wpływ na proces bakteryjnej syntezy auksyny i sideroforów. Fungicydy mogą także wpływać na aktywność enzymatyczną gleby. Zmniejszenie ogólnej aktyw­ności enzymatycznej gleby mierzonej jako zdolność do rozkładu ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM dwuoctanu fluoresceiny (FDA) obserwowano w glebie traktowanej iprodionem [34], a krótkotrwały spadek odnotowano w glebie traktowanej pencykuronem [40, 41]. Pod wpływem ditianonu obserwowano spadek aktywności enzymatycznej mierzonej jak zdolność redukcji dimetylosulfotlenku (DMSO) do siarczku dimetylu (DMS) [29], natomiast zmniejszenie aktywności dehydrogenazy stwierdzono w glebach traktowanych azoksytrobinem, chlorotalonilem i tebukonazolem [7, 49], mefenoksamem czy metalaksylemem [35]. Tebukonazol powodował także spadek aktywności ureazy, arylsulfatazy, β-glukozydazy i fosfatazy zasadowej w glebie badanej przez Muñoz-Leoz i wsp. [37]. Spadek aktywności ureazy, fosfatazy kwaśnej i inwertazy obserwowano również w glebach pochodzących z sadu opryskiwanego fungicydami [54]. Negatywny wpływ fungicydów na aktywność fosfataz obserwowano w glebach traktowanych kaptanem [44], benomylem [10] czy mieszaniną mankozebu i dimetomorfu [12]. Stosowanie fungicydów może prowadzić także do zaburzenia przemian związków azotowych [59]. Odnotowano, że tiram i kaptan powodowały zmniejszenie tempa procesu denitryfikacji [33], a tebukonazol w ciągu pierwszych 30 dni eksperymentu powodował zaburzenia procesu nitryfikacji [37]. Z drugiej strony wykazano, że w odpowiedzi na wprowadzenie niektórych fungicydów do środowiska obserwowany jest wzrost aktywności enzymatycznej mikroorganizmów. Zwiększenie aktywności dehydrogenazy, ureazy, β-glukozydazy i fosfatazy obserwowano w odpowiedzi na wprowadzenie do gleby prochlorazu [50]. W glebie traktowanej flua­zi­namem obserwowano wzrost aktywności chitynaz i α-glukozydaz, chociaż towarzyszył temu spadek aktywności aminopeptydazy leucynowej [38]. Aplikacja fungicydów może przyczyniać się do zmiany funkcjonalnej bioróżnorodności bakteryjnych zespołów [30, 37, 56], zmniejszenia bioróżnorod­ności zespołów mikroorganizmów i zmiany struktury zespołów mikroorganizmów glebowych [23]. Przykładowo kaptan powodował zmiany w strukturze zespołu bakterii zasiedlających osady denne [58]. Natomiast Yen i wsp. [60] obserwowali wpływ triadimefonu i propikonazolu na strukturę zespołu bakterii, który był widoczny po 2 miesiącach od aplikacji. Wykazano również zmiany w strukturze zespołu bakterii i redukcję bioróżnorodności mikroorganizmów glebowych powstałą w wyniku wielokrotnej aplikacji karbendazymu [55]. Konsekwencją wyżej wymienionych zmian zachodzących w zespole mikroorganizmów glebowych może być spadek tempa procesów odpowiedzialnych za mikrobiologiczną degradację pestycydów w glebie. Udowodniono, że aplikacja fungicydu chlorotalonilu do gleby powodowała wzrost trwałości herbicydów w glebie – czterokrotny w przypadku izoproturonu [16] oraz dwukrotny w przypadku metalochloru [57]. 15 Należy jednak zaznaczyć, że w wielu opisywanych w literaturze przypadkach negatywny wpływ pestycydów na ekosystem glebowy obserwowany był w sytua­ cji narażenia mikroorganizmów na dawki znacznie przewyższające stężenia zalecane przez producenta. Często wpływ fungicydów stosowanych w rekomendowanych dawkach na mikroorganizmy glebowe był niewielki bądź krótkotrwały [23, 40, 50, 56, 57]. Ponadto obserwowany wpływ fungicydów na funkcjonowanie ekosystemów glebowych może też być mniejszy niż to wynika z przewidywań dokonanych w oparciu o wyniki badań toksyczności związku. Chociaż badania mogą wskazywać na wysoką toksyczność testowanego związku w stosunku do konkretnego szczepu lub grupy mikroorganizmów, jednak jego wprowadzenie do środowiska może nie mieć istotnego wpływu na funkcjonowanie ekosystemu. Dzieje się tak w przypadku, gdy inne mikroorganizmy przejmują rolę fizjologiczną tych, które na skutek zanieczyszczenia pestycydami wypadły ze składu zespołu mikroorganizmów [32]. 4.Triazole – charakterystyka i wpływ na ekosystem glebowy Najliczniejszą grupą fungicydów wykorzystywanych w rolnictwie i w sadownictwie są związki z grupy azoli. Fungicydy azolowe zapobiegają rozwojowi patogennych grzybów takich jak Podosphaera leucotricha, Venturia inaequalis, Mycosphaerella fragarie, Oidium lycopersicum, Cercospora beticola czy grzybów z rodzaju Fusarium. Do najczęściej stosowanych fungicydów z grupy azoli należą triazole [53]. Mechanizm ich działania polega na hamowaniu zależnej od cytochromu P450 14α-demetylazy lanosterolu, w wyniku, czego dochodzi do zahamowania biosyntezy ergosterolu [2, 9]. Jednym ze środowisk silnie narażonych na długotrwały wpływ fungicydów triazolowych są sady. Prowadzenie sadów wiąże się z koniecznością aplikacji pestycydów o podobnym zakresie działania na tym samym obszarze przez wiele lat [54]. Jednakże częste stosowanie fungicydów z tej grupy może prowadzić do pojawiania się szczepów charakteryzujących się mniejszą wrażliwością na stosowane triazole [8, 9]. Holb i Schnabel [22] wykazali, że szczepy grzybów Monilinia fucticola izolowane z gleby z sadu brzoskwiniowego, w którym od 10 lat stosowano triazole, charakteryzowały się mniejszą wrażliwością na fenbukonazol, tebukonazol oraz propikonazol w porównaniu do szczepu izolowanego z terenu, gdzie triazole nie były stosowane. Azole zaliczane są do fungicydów charakteryzujących się średnim ryzykiem wystąpienia oporności u grzybów. Uważa się, że do pojawienia się szczepów opornych konieczne jest występowanie w komórce jednocześnie kilku mechanizmów oporności [9]. Szczepy 16 SŁAWOMIR SUŁOWICZ, ZOFIA PIOTROWSKA-SEGET grzybów tracą wrażliwość na triazole dzięki usuwa­ niu ich cząsteczek z komórki z wykorzystaniem transporterów ABC (superrodziny białek transportowych odpowiedzialnych za usuwanie z komórki m.in. metali czy antybiotyków) oraz nadprodukcji hamowanej 14α-demetylazy lanosterolu. Ponadto możliwa jest także zmiana w strukturze następnego enzymu szlaku biosyntezy sterolu, 5-6-desaturazy sterolu, która umożliwia przekształcanie metylowanego substratu [13, 47]. Badania dotyczące fungicydów z grupy triazoli wskazują, że ich stosowanie może prowadzić także do powstania oporności krzyżowej. Karaoglanidis i Thanassoulopoulos [24] obserwowali oporność krzyżową na różne fungicydy triazolowe u grzyba Cercospora beticola (chwościk burakowy). Zjawisko to obserwowano również u szczepów Cercospora beticola, których oporność na tetrakonazol była wynikiem mutagenezy indukowanej światłem UV. W tym przypadku grzyby charakteryzowały się dodatkowo opornością na inne triazole – difenokonazol i penkonazol oraz fungicyd pirymidynowy nuarimol [36]. Badania Hayashi i wsp. [20] nad opornością na okspokonazol u wywołującego pleśń szarą grzyba Botrytis cinerea wskazują, że zmniejszeniu jego wrażliwości na stosowany fungicyd towarzyszy wzrost ekspresji genu kodującego białko BcatrD, będącego transporterem ABC. Wzrost ekspresji genu kodującego to białko obserwowano także pod wpływem iprodionu (dikarboksyimid) oraz karbendazymu (benzimidazol), jak również antybiotyku cykloheksymidu. Wyniki te wskazują, że powstała pod wpływem triazoli wielo­ oporność może obniżać także skuteczność pestycydów należących do innych grup chemicznych, jak również sprzyjać rozprzestrzenianiu się antybiotykoopor­ ności. Na korelację między stosowaniem pestycydów a opornością grzybów na antybiotyki wskazuje też Verweij i wsp. [53]. Spośród izolowanych od pacjentów w Holandii opornych na azole patogennych szczepów Aspergillus fumigatus, 94% charakteryzowało się tym samym rodzajem mechanizmu oporności. Obejmował on substytucję leucyny na histydynę w kodonie 98 genu cyp51A, kodującego 14-α-demetylazę i wstawienie 34-zasadowego tandemowego powtórzenia w obrębie promotora. Autorzy sugerują, że kliniczne szczepy grzybów nabyły tę zdolność w wyniku stosowania fungicydów azolowych w rolnictwie. Hipotezę tę wspiera fakt, że większość szczepów izolowanych z gleby użytkowanej rolniczo posiada ten sam mechanizm opor­ ności, co szczepy izolowane od pacjentów. Przytoczone przez autorów statystyki wskazują, że chociaż zużycie pestycydów w krajach Unii Europejskiej zmniejszało się w ostatnich dziesięcioleciach, to zużycie fungicydów w Holandii w latach 1995–2007 utrzymywało się na stałym poziomie, a ilość stosowanych w tym czasie triazoli nawet się podwoiła. Przykładowo, w 2004 roku ilość stosowanych w Holandii związków azolowych w rolnictwie była około 320 razy większa od stosowanej w lecznictwie. Prowadzi to do powstania silnej presji selekcyjnej sprzyjającej rozwojowi i rozprzestrzenianiu się skutecznego mechanizmu oporności na azole. Wykazano także, że niektóre fungicydy hamujące syntezę ergosterolu (SBI, sterol biosynthesis inhibitors) zwiększają toksyczny efekt insektycydów z grupy pyretroidów. Mieszanina α-cypermetryny z epoksykonazolem lub propikonazolem powodowała 6–7-krotny wzrost toksyczności w środowisku wodnym względem Daphnia magna w porównaniu do wartości spodziewanej na podstawie modelu teoretycznego [39]. Wykorzystanie triazoli w rolnictwie i sadownictwie wpływa także na bakterie zasiedlające gleby. Mimo że w skład błon bakteryjnych nie wchodzą sterole, fungicydy należące do azoli mogą wywierać wpływ na te mikroorganizmy. Przykładowo obserwowano długoterminowy wpływ triadimefonu na strukturę zespołu bakteryjnego, natomiast stosowanie tritikonazolu stymulowało namnażanie się bakterii w glebie. W przypadku aplikowania do gleby propikonazolu notowano zmniejszenie aktywności enzymatycznej bakterii [59]. 5. Podsumowanie Skażenie środowiska glebowego przez środki och­ rony roślin jest jednym z wielu negatywnych aspektów działalności rolniczej prowadzonej przez człowieka. Obok rozwoju miast i skutków działalności przemysłowej przyczynia się ona do degradacji i zanieczyszczenia gleb w wielu miejscach Europy. Według szacunków Unii Europejskiej, ponad 115 milionów hektarów narażonych jest na erozję wodną, kolejne 42 miliony hektarów na erozję powietrzną, a około 3,5 miliona miejsc w Europie określa się jako potencjalnie zanieczyszczone [26]. Dane te skłoniły do podjęcia działań, mających na celu kompleksową ochronę gleby. Przyjęta 13 listopada 2007 roku przez Parlament Europejski rezolucja Komisji Europejskiej w sprawie strategii tematycznej w dziedzinie ochrony gleby „Towards a Thematic Strategy for Soil Protection” zobowiązuje kraje członkowskie do utworzenia ramowego prawodawstwa regulującego ochronę i określającego kierunki zrównoważonego użytkowania gleby, w tym utrzymania biologicznej bioróżnorodności środowiska glebowego. Przyjęta strategia zobowiązuje także do prowadzenia badań dotyczących metod rekultywacji, zapobiegania dalszej degradacji gleb oraz wprowadzenie monitoringu jakości gleb, z uwzględnieniem nie tylko fizykochemicznych, ale i biologicznych parametrów. Tym samym szczególnie ważne stają się badania mające na celu zrozumienie interakcji między organizmami zasiedlającymi glebę, a wprowadzanymi do środowiska ksenobiotykami, takimi jak pestycydy [46]. ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM Podziękowania Artykuł powstał w wyniku realizacji projektu finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji numer DEC-2011/01/N/NZ9/00245. Piśmiennictwo 1. Ahemad M., Khan M.S.: Effects of insecticides on plant-growth-promoting activities of phosphate solubilizing rhizobacterium Klebsiella sp. Strain PS19. Pestic. Biochem. Physiol. 100, 51–56 (2011) 2.Amer M.M., Shehata M.A., Lotfy H.M., Monir H.H.: Determination of tetraconazole and diniconazole fungicide residues in tomatoes and green beans by capillary gas chromatography. Yakugaku Zasshi, 127, 993–999 (2007) 3.Arias-Estévez M., López-Periago E., Martínez-Carballo E., Simal-Gándara J., Mejuto J-C., García-Río L.: The mobility and degradation of pesticides in soils and the pollution of ground­ water resources. Agric. Ecosyst. Environ. 123, 247–260 (2008) 4. Baker-Austin C., Wright M.S., Stepanauskas R., McArthur J.V.: Co-selection of antibiotic and metal resistance. Trends Microbiol. 14, 176–182 (2006) 5. Barrios E.: Soil biota, ecosystem services and land productivity. Ecol. Econ. 64, 269–285 (2007) 6. Bateman R.: Rational pesticide use: spatially and temporally targeted application of specific products (w) Optimising Pesticide Use, red. M.F. Wilson, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2003, s. 131–159 7.Bending G., Rodriguez-Cruz M.S., Lincoln S.D.: Fungicide impacts on microbial communities in soils with contrasting management histories. Chemosphere, 69, 82–88 (2007) 8. Brent K.J., Hollomon D.: Fungicide resistance in crop pathogens: how can it be managed? FRAC, Monograph No. 1 (second, revised edition), 2007, http://www.frac.info/publications/downloads (11.02.2015) 9. Brent K.J., Hollomon D.: Fungicide resistance: the assessment of risk. FRAC Monograph No. 2 (second, revised edition), 2007, http://www.frac.info/publications/downloads (11.02.2015) 10. Chen S.-K., Edwards C.A., Subler S.: Effects of the fungicides benomyl, captan and chlorothalonil on soil microbial activity and nitrogen dynamics in laboratory incubations. Soil Biol. Biochem. 33, 1971–1980 (2001) 11. Chowdhury A., Pradhan S., Saha M., Sanyal N.: Impact of pesticides on soil microbiological parameters and possible bioremediation strategies. Indian J. Microbiol. 48, 114–127 (2008) 12. Cycoń M., Piotrowska-Seget Z., Kozdrój J.: Responses of indigenous microorganisms to a fungicidal mixture of mancozeb and dimethomorph added to sandy soils. Int. Biodeter. Biodegr. 64, 316–323 (2010) 13.de Waard M.A., Andrade A.C., Hayashi K., Schoonbeek H., Stergiopoulos I., Zwiers L.: Impact of fungal drug transporters on fungicide sensitivity, multidrug resistance and virulence. Pest. Manag. Sci. 62, 195–207 (2006) 14.EU Pesticides Database, http://ec.europa.eu/food/plant/protection/evaluation/database_act_subs_en.htm (11 lutego 2015 roku) 15.European Crop Protection Association, http://www.ecpa.eu/ information-page/industry-statistics-ecpa-total (11.02.2015) 16.Fogg P., Boxall A.B.A., Walker A.: Degradation of pesticides in biobeds: The effect of concentration and pesticide mixtures. J. Agric. Food Chem. 51, 5344–5349 (2003) 17.FRAC Code List 2014: Fungicides sorted by mode of action (including FRAC Code numbering), http://www.frac.info (11.02.2015) 17 18. Gevao B., Semple K.T., Jones K.C.: Bound pesticide residue in soils: a review. Environ. Pollut. 108, 3–14 (2000) 19.Glick B.R.: Using soil bacteria to facilitate phytoremediation. Biotech. Adv. 28, 367–374 (2010) 20. Hayashi K., Schoonbeek H., Sugiura H., De Waard M.A.: Multi­ drug resistance in Botrytis cinerea associated with decreased accumulation of the azole fungicide oxpoconazole and increased transcription of the ABC transporter gene Bcatr D. Pestic. Biochem. Physiol. 70, 168–179 (2001) 21. Hof H.: Is there a serious risk of resistance development to azoles among fungi due to the widespread use a long-term application of azoles antifungals in medicine? Drug Resist. Updates, 11, 25–31 (2008) 22. Holb I.J., Schnabel G.: Differential effect of triazoles on mycelia growth and disease measurements of Monilinia fructicola isolates with reduced sensitivity to DMI fungicides. Crop Prot. 26, 753–759 (2007) 23. Imfeld G., Vuilleumier S.: Measuring the effects of pesticides on bacterial communities in soil: A critical review. Eur. J. Soil Biol. 49, 22–30 (2012) 24. Karaoglanidis G.S., Thanassoulopoulos C.C.: Cross-resistance patterns among sterol biosynthesis inhibiting fungicides (SBIs) in Cercospora beticola. Eur. J. Plant Pathol. 109, 929–934 (2003) 25. Klose S., Wu B.M., Ajwa H.A., Koike S.T., Subbarao K.V.: Reduced efficacy of rovral and botran to control Sclerotinia minori in lettuce production in the Salinas Valley may be related to accelerated fungicide degradation in soil. Crop Prot. 29, 751–756 (2010) 26. Komunikat Komisji Wspólnot Europejskich pt. „Strategia tematyczna w dziedzinie ochrony gleby” z dnia 22.09.2006 (COM (2006)0231), http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ. do?uri=COM:2006:0231:FIN:PL:PDF (11 lutego 2015) 27.Leroux P., Chapeland F., Arnold A., Gredt M.: New cases of negative cross-resistance between fungicides, including sterol biosynthesis inhibitors. J. Gen. Plant Pathol. 66, 75–81 (2000) 28. Leroux P., Fritz R., Debieu D., Albertini C., Lanen C., Bach J., Gredt M., Chapeland F.: Mechanisms of resistance to fungicides in field strains of Botrytis cinerea. Pest Manag. Sci. 58, 876–888 (2002) 29.Liebich J., Schäffer A., Burauel P.: Structural and functional approach to studying pesticide side-effects on specific soil function. Environ. Toxicol. Chem. 22, 784–790 (2003) 30.Lupwayi N.Z., Harker K.N., Dosdall L.M., Turkington K., Blackshaw R.E., O’Donowan J.T., Cárcamo H.A., Otani J.K., Clayton G.W.: Changes in functional structure of soil bacterial communities due to fungicide and insecticide applications in canola. Agr. Ecosyst. Environ. 130, 109–114 (2009) 31. Ma Y., Prasad M.N.V., Rajkumar M., Freitas H.: Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoremediation of metalliferous soils. Biotech. Adv. 29, 248–258 (2011) 32. Mele P.M., Crowley D.E.: Application of self-organizing maps for assessing soil biological quality. Agr. Ecosyst. Environ. 126, 139–152 (2008) 33. Milenkovski S., Bååth E., Lindgren P-E., Berglund O.: Toxicity of fungicides to natural bacterial communities in wetland water and sediment measured using leucine incorporation and potential denitrification. Ecotoxicology, 19, 285–294 (2010) 34. Miñambres G.G., Conles E.I.L., Verdenelli R.A., Meriles J.M., Zygadlo J.A.: Application of thymol and iprodione to control garlic white rot (Sclerotium cepivorum) and its effect on soil microbial communities. World J. Microb. Biot. 26, 161–170 (2009) 35. Monkiedje A., Spiteller M.: Effects of the phenylamide fungicides, mefenoxam and metalaxyl, on the microbiological properties of a sandy loam and a sandy clay soil. Biol. Fert. Soils 35, 393–398 (2002) 18 SŁAWOMIR SUŁOWICZ, ZOFIA PIOTROWSKA-SEGET 36. Moretti M., Arnoldi A. D’Agostina A., Farina G., Gozzo F.: Characterization of fields-isolates and derived DMI-resistant strains of Cercospora beticola. Mycol. Res. 107, 1178–1188 (2003) 37.Muñoz-Leoz B., Ruiz-Romera E., Antigüedad I., Garbisu C.: Tebuconazole application decreases soil microbial biomass and activity. Soil Biol. Biochem. 43, 2176–2183 (2011) 38. Niemi R.M., Heiskanen I., Ahtiainen J.H., Rahkonen A., Mäntykoski K., Welling L., Laitinen P., Ruuttunen P.: Microbial toxicity and impacts on soil enzyme activities of pesticides used in potato cultivation. App. Soil Ecol. 41, 293–304 (2009) 39.Nørgaard J., Cedergreen N.: Pesticide cocktails can interact synergistically on aquatic crustaceans. Environ. Sci. Pollut. R. 17, 957–967 (2010) 40. Pal R., Chakrabarti K., Chakraborty A., Chowdhury A.: Pencycuron application to soils: Degradation and effect on microbiological parameters. Chemosphere, 60, 1513–1522 (2005) 41. Pal. R., Das P., Chakrabarti K., Chakraborty A., Chowdhury A.: Side effects of pencycuron on nontarget soil microorganisms in waterlogged soil: Field experiment. App. Soil Ecol. 38, 161–167 (2008) 42. Pimentel D., Burgess M.: Small amount of pesticides reaching target insects. Environ. Dev. Sustain. 14, 1–2 (2012) 43. Pimentel D.: Amounts of pesticides reaching target pests: Environmental impacts and ethics. J. Agr. Environ. Ethic. 8, 17–29 (1995) 44. Piotrowska-Seget Z., Engel R., Nowak E., Kozdrój J.: Successive soil treatment with captan or oxytetracycline affects non-target microorganisms. World J. Microb. Biot. 24, 2843–2848 (2008) 45. Rajkumar M., Ae N., Narasimha M., Prasad V., Freitas H.: Potential of siderophore-producing bacteria for improving heavy metal phytoextraction. Trends Biotech. 28, 142–149 (2010) 46. Rezolucja Parlamentu Europejskiego z dnia 13 listopada 2007 r. w sprawie strategii tematycznej w dziedzinie ochrony gleby (2006/2293(INI), http://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc. do?pubRef=-//EP//TEXT+TA+P6-TA-2007-0504+0+DOC+ XML +V0//PL (11.02.2015) 47. Schnabel G., Jones A.L.: The 14α-demethylase (CYP51A1) gene is overexpressed in Venturia inaequalis strains resistant to myclo­ butanil. Phytopatology, 91, 102–110 (2001) 48. Shafiani S., Malik A.: Tolerance of pesticides and antibiotic resistance in bacteria isolated from wastewater-irrigated soil. World J. Microb. Biot. 19, 897–901 (2003) 49.Sopeña F., Bending G.D.: Impacts of biochar on bioavailability of the fungicide azoxystrobin: a comparison of the effect on biodegradation rate and toxicity to the fungal community. Chemosphere, 91, 1525–1533 (2013) 50. Tejada M., Gómez I., Garcia-Martinez A.M., Osta P., Parrado J.: Effects of prochloraz fungicide on soil enzymatic activities and bacterial communities. Ecotox. Environ. Safe. 74, 1708–1714 (2011) 51. The WHO recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to classification: 2009, World Health Organization 2010, http://www.who.int/ipcs/publications/pesticides_ hazard/en/ (11.02.2015) 52. Vergucht S., De Voghel S., Misson C., Vrancken, C., Callebaut K., Steurbaut W., Pussemier L., Marot J., Maraite H., Vanhaecke P.: Health and environmental effects of pesticides and type 18 biocides (HEEPEBI). Belgian Science Policy and Federal Public Service, Health, Food Chain Safety and Environment, Brussels, Belgium (2006) 53.Verweij P.E., Snelders E., Kema G.H.J., Mellado E., Melchers W.J.G.: Azole resistance in Aspergillus fumigates: a side-effect of environmental fungicide use? Lancet Infect. Dis. 9, 789–795 (2009) 54. Wang Q-Y., Zhou D-M., Cang L.: Microbial and enzyme properties of apple orchard soil as affected by long-term application of copper fungicide. Soil Biol. Biochem. 41, 1504–1509 (2009) 55. Wang X., Song M., Gao Ch., Dong B., Zhang Q., Fang H., Yu Y.: Carbendazim induces a temporary change in soil bacterial community structure. J. Environ. Sci. 21, 1679–1683 (2009) 56. Wang X., Song M., Wang Y., Gao Ch., Zhang Q., Chu X., Fang H., Yu Y.: Response of soil bacterial community to repeated applications of carbendazim. Ecotox. Environ. Safe. 75, 33–39 (2012) 57.White P.M., Potter T.L., Culbreath A.K.: Fungicide dissipation and impact on metolachlor aerobic soil degradation and soil microbial dynamics. Sci. Total Environ. 408, 1393–1402 (2010) 58. Widenfalk A., Bertilsson S., Sundh I., Goedkoop W.: Effects of pesticides on community composition and activity of sediment microbes – responses at various levels of microbial community organization. Environ. Pollut. 152, 576–584 (2008) 59. Yang Ch., Hamel Ch., Vujanovic V., Gan Y., 2011, Fungicide: Modes of action and possible impact on nontarget microorganisms. ISRN Ecology, DOI: 10.5402/2011/130289 (2011) 60. Yen J.H., Chang J.S., Huang P.J., Wang Y.S.: Effects of fungicides triadimefon and propiconazole on soil bacterial communities. J. Environ. Sci. Health, (B), 44, 681–689 (2009) POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 19–26 http://www.pm.microbiology.pl WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO DO PRODUKCJI BIOMASY DROŻDŻY PASZOWYCH CANDIDA UTILIS Agnieszka Kurcz1*, Stanisław Błażejak1, Anna Maria Kot1, Anna Bzducha-Wróbel1 1 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Żywności, Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności, Zakład Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Wpłynęło w lutym 2015 r. Zaakceptowano w czerwcu 2015 r. 1. Wstęp. 2. Biotechnologiczne wykorzystanie drożdży Candida utilis. 3. Surowce wykorzystywane do produkcji biomasy drożdży paszo­ wych. 4. Produkcja biopaliw i gospodarka odpadami z produkcji biodiesla. 4.1. Wykorzystanie glicerolu w procesach biotechnologicznych 5. Produkcja skrobi ziemniaczanej. 5.1. Charakterystyka odpadowej ziemniaczanej wody sokowej i kierunki jej wykorzystania. 6. Podsumowanie The use of agri-food industry waste for the production of Candida utilis fodder yeast biomass Abstract: Both glycerol and potato wastewater are difficult-to-utilize waste from industrial processing. Thus, it is necessary to search for new economical methods of waste utilization to obtain products of higher value, decrease the production costs and protect the environment. One of the solutions to this problem might be simultaneous application of glycerol and potato wastewater as components of culture media for the production of Candida utilis fodder yeast biomass. This yeast strain is able to use glycerol from culture media as the only source of carbon, while the deproteinated potato wastewater might be the source of nitrogenous compounds and minerals. As a result, there is the possibility to obtain C. utilis fodder yeast biomass rich in such valuable nutrients as protein, fat, β-glucans, vitamins and microelements. 1. Introduction. 2. Biotechnological use of the yeast Candida utilis. 3. Raw materials used for the production of fodder yeast biomass. 4. Production of biofuels and the management of biodiesel post-production waste. 4.1. The use of glycerol in biotechnological processes. 5. Production of potato starch. 5.1. Characteristics of potato wastewater and its potential usage. 6. Conclusion Słowa kluczowe: biodiesel, SCP, skrobia ziemniaczana, utylizacja odpadów Key words: biodiesel, SCP, potato starch, waste utilization 1. Wstęp W ostatnich latach problem ochrony środowiska naturalnego stał się jednym z najważniejszych priorytetów polityki międzynarodowej, szczególnie wśród krajów rozwiniętych. Problem postępującej degradacji środowiska spowodowany jest przede wszystkim dużymi ilościami odpadów produkowanych przez człowieka. Dotyczy to zarówno odpadów komunalnych, jak i tych wytwarzanych przez przemysł. Stanowią one często produkt bardzo trudny do utylizacji lub zagospodarowania, nie wspominając o możliwości ekonomicznego ich wykorzystania. Odprowadzanie odpadów do ścieków pociąga za sobą ryzyko nałożenia na zakład wysokich kar pieniężnych, a większość sposobów utylizacji i składowania jest kosztowna i nieopłacalna. Istnieją jednak metody przekształcania odpadów przemysłowych do produktów o wartości dodanej. Jednym z rozwiązań może być próba zastosowania ich jako surowców do produkcji biomasy drobnoustrojów. Idea produkcji biomasy i wykorzystania mikro­ organizmów jako źródła żywności dla ludzi i zwierząt powstała już na początku dwudziestego wieku. Termin SCP – single-cell protein (białko jednokomórkowców) został po raz pierwszy wykorzystany w 1966 roku w Massachusetts Institute of Technology [2]. Liczne badania [17, 46] nad możliwością produkcji białka drobnoustrojów wykazały szereg jego zalet, dzięki którym przewyższa białko pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Do najważniejszych należą: krótki czas generacji mikroorganizmów, wysoka zawartość białka o odpowiedniej jakości w komórkach oraz możliwość kształtowania profilu aminokwasowego białek poprzez regulację składu podłoża, warunków hodowli lub modyfikacje genetyczne danego szczepu. Ponadto produkcja SCP może być prowadzono w procesie ciągłym i jest niezależna od czynników klimatycznych. Do jego otrzymywania stosowane są przede wszystkim drożdże (Candida, Saccharomyces), a także bakterie (Cellulomonas, Alcaligenes), grzyby strzępkowe (Aspergillus, Penicillium) i glony (Chlorella, Scenedesmus) [17]. 2.Biotechnologiczne wykorzystanie drożdży Candida utilis Nazwa gatunkowa drożdży Candida utilis występuje w literaturze pod wieloma synonimami, między innymi Pichia jadinii, Saccharomyces jadinii, Torula utilis. * Autor korespondencyjny: Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Żywności, Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności, Zakład Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, ul. Nowoursynowska 159C, 02-776 Warszawa; tel. (022) 59 37 663; e-mail: [email protected] 20 AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL Najczęściej traktowane były jako aseksualna forma gatunku Pichia jadiini [22], chociaż najnowsze badania zaprzeczają bliskiemu pokrewieństwu filogenetycznemu tych dwóch gatunków [50]. Obecnie, według National Center for Biotechnology Information (NCBI), gatunek C. utilis jest klasyfikowany jako anamorficzna forma Cyberlindnera jadinii [35]. Drożdże, jako organizmy pozbawione chlorofilu, nie są zdolne do przeprowadzania procesu fotosyntezy. Do rozwoju i wzrostu wymagają organicznych form węgla, w związku z czym zaliczane są do chemoorganotrofów. Drożdże dzikie, do których należy rodzaj Candida, w przeciwieństwie do drożdży szlachetnych (Saccharomyces), nie są wymagające pod względem wykorzystywanych źródeł węgla i obecności substancji biologicznie aktywnych [52]. Drożdże C. utilis wykazują zdolność do fermentacji glukozy i sacharozy. Ponadto asymilują maltozę, rafinozę, trehalozę, celobiozę, ksylozę, inulinę, etanol, glicerol, cytryniany i azotany [22]. Optymalna temperatura dla ich wzrostu wynosi 25–30°C, a pH mieści się w zakresie 4,0–6,0 [3]. Drożdże C. utilis spełniają wszystkie wymagania stawiane drożdżom paszowym: wysoka zawartość białka w suchej substancji, maksymalne wykorzystanie wszystkich obecnych w pożywce substancji odżywczych, mała wrażliwość na substancje toksyczne w podłożu hodowlanym oraz krótki czas generacji [15]. Ponadto ich stosunkowo duże wymiary ułatwiają separację komórek z podłoża po hodowli [32]. Istotny jest również fakt, że zawartość kwasów nukleinowych w komórkach tych drożdży jest mniejsza niż u innych gatunków. Wynosi zwykle około 100 g/kg biomasy, a w przypadku drożdży Saccharomyces cerevisiae – 160 g/kg biomasy [3]. Koncepcja wykorzystania drożdży C. utilis do produkcji żywności na szeroką skalę została po raz pierwszy zaproponowana przez niemieckich pracowników Instytutu Przemysłu Fermentacyjnego w Berlinie podczas I Wojny Światowej. Wynikało to głównie z możliwości wykorzystania tanich substratów odpadowych jako składników podłoża hodowlanego, a w szczególności pentozanów i ługów posulfitowych z produkcji papieru [22]. Obecnie gatunek C. utilis został uznany przez FDA (Food and Drug Administration – Agencja Żywności i Leków) za bezpieczny do spożycia i wpisany na amerykańską listę GRAS (Generally Recognized As Safe – „uważane za bezpieczne”). Dzięki temu biomasa tych drożdży, jak i ich metabolity, mogą być stosowane zarówno w przemyśle spożywczym, jak i w produkcji pasz [28]. Zainteresowanie drożdżami C. utilis jako źródłem białka wynika z dużej jego zawartości w suchej substancji tych komórek, zwykle od 45 do 75%. Charakteryzuje się ono wysoką wartością odżywczą oraz dobrą strawnością sięgająca 50%. W skład tego białka wchodzi duża zawartość aminokwasów egzogennych, a w szcze- gólności lizyny. Zawartość tego aminokwasu w komórkach drożdży C. utilis wynosi około 7,1 g/100 g białka. Pomimo dobrze zbilansowanego składu aminokwasowego, białko to cechuje się niedoborem aminokwasów siarkowych, w szczególności metioniny i cysteiny. Zawartość aminokwasów może być jednak regulowana, gdyż jest w dużej mierze zależna od rodzaju podłoża hodowlanego i zawartych w nim składników [3, 52]. W biomasie komórkowej drożdży C. utilis stwierdzono obecność witamin z grupy B, na przykład ryboflawiny, kwasu foliowego i nikotynowego. Zawartość kwasu pantotenowego i pirydoksyny jest nawet wyższa niż w przypadku innych drożdży, takich jak S. cerevisiae czy Kluyveromyces marxianus [3, 54]. Gatunek C. utilis zdolny jest również do produkcji ergosterolu, związku z grupy steroidów, będących bezpośrednim prekursorem witaminy D2. Drożdże te mogą gromadzić ergosterol na poziomie od 1 do 3% w suchej substancji, zależnie od wieku komórek oraz warunków prowadzenia hodowli [30, 44]. Gatunek C. utilis może stanowić bardzo dobre źródło składników mineralnych. Drożdże te zawierają więcej wapnia, potasu, fosforu, cynku i manganu w porównaniu do innych gatunków, np. S. cerevisiae. Drożdże C. utilis są zdolne do wiązania jonów metali z podłoża hodowlanego często w ilości przekraczającej naturalne zapotrzebowanie, a następnie ich wewnątrzkomórkowej bioakumulacji i włączenia w struktury komórkowe. Podczas hodowli w podłożu suplementowanym jonami magnezu uzyskano biomasę drożdżową zawierająca 9,09 mg Mg2+/gs.s., czyli prawie 10-krotnie więcej niż w hodowli kontrolnej. Dzięki tym właściwościom istnieje możliwość wykorzystania drożdży w produkcji tak zwanych biopleksów – połączeń jonów metali z białkami. Mogą one być wykorzystywane w suplementacji diety, gdyż składniki mineralne w takiej formie są łatwiej przyswajalne przez organizmy ludzi i zwierząt niż połączenia nieorganiczne [4]. Drożdże paszowe są również stosowane w żywieniu zwierząt gospodarskich. Mogą być one dodawane do pasz w dwojaki sposób: jako komponenty, mające za zadanie zwiększenie wartości odżywczej paszy lub w postaci żywych kultur. W ostatnich latach obserwuje się wzrost znaczenia drożdży jako dodatku paszowego, co związane jest głównie z kryzysem BSE, który przyczynił się do wprowadzenia od listopada 2004 roku zakazu stosowania mączek pochodzenia zwierzęcego jako składnika paszy [8]. W paszach roślinnych aminokwasem ograniczającym jest lizyna, która z kolei występuje w dużych ilościach (8,3–7,1 g/100g) w białku drożdżowym. Przygotowanie odpowiednich mieszanek z drożdżami paszowymi umożliwia otrzymanie pełnowartościowej paszy bogatej w aminokwasy egzogenne, witaminy i składniki mineralne. Odpowiedni skład ami­nokwasowy paszy jest niezbędny dla pra- WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO widłowego wzrostu i rozwoju, szczególnie młodych osobników [16]. Stosowanie żywych kultur drożdży jako dodatków do pasz związane jest z ich działaniem probiotycznym. Produkowane przez nie enzymy w przewodzie pokarmowym ułatwiają trawienie składników żyw­ ności. Istotne znaczenie mają również składniki ściany komórkowej drożdży – oligomannany i β-glukany. Przeprowadzone badania potwierdzają ich korzystny wpływ na mikroflorę przewodu pokarmowego zwierząt, gdyż są one dobrze wykorzystywane przez bakterie kwasu mlekowego. Polisacharydy te stymulują działanie układu immunologicznego oraz wykazują niszczące działanie w stosunku do bakterii chorobotwórczych E. coli i Salmonella pullorum, będących częstą przyczyną chorób u drobiu. Polimery ściany komórkowej drożdży wykazują również zdolność do adsorpcji szkodliwych substancji chemicznych, na przykład mikotoksyn [7, 26]. Drożdże C. utilis są także zdolne do biosyntezy wew­nątrzkomórkowego tłuszczu (SCO), charakteryzującego się wartościowym, z żywieniowego punktu widzenia, profilem kwasów tłuszczowych (ok. 25% kwasu oleinowego, 32% linolowego i 18% linolenowego). Biosynteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych przez mikroorganizmy ma szansę stać się nowym, alternatywnym źródłem tych związków. Skład kwasów tłuszczowych w komórkach drożdży może być regulowany poprzez dobór odpowiedniego składu pożywki oraz warunków procesu [6, 12]. W ten sposób można ukierunkować szlaki biosyntezy w komórkach drobnoustrojów na syntezę pożądanych kwasów tłuszczowych PUFA, które mogą być stosowane jako suplementy diety oraz w żywności funkcjonalnej [13]. 3.Surowce wykorzystywane do produkcji biomasy drożdży paszowych Zrozumienie wymagań pokarmowych drożdży jest istotne, nie tylko w przypadku hodowli w warunkach laboratoryjnych, ale przede wszystkim w przemysłowej produkcji drożdży paszowych. Podczas namnażania biomasy drożdży należy zapewnić w podłożu hodowlanym obecność wszystkich niezbędnych do ich wzrostu składników. Należą do nich przyswajalne źródła węgla i azotu, związki siarki i fosforu, składniki mineralne oraz ewentualne aktywatory wzrostu (witaminy) [52]. Drożdże paszowe, zaliczane do drożdży dzikich, posiadają bogaty układ enzymatyczny umożliwiający wzrost na różnorodnych źródłach węgla. Poza węglowodanami są zdolne do asymilacji wielu innych związków organicznych (alkohole, kwasy organiczne, węglowodory), co umożliwiło wykorzystywanie do ich produkcji różnorodnych surowców odpadowych. Ważne jest również zapewnienie odpowiedniego źródła 21 azotu. W przemysłowej produkcji najczęściej stosuje się sole amonowe, które są łatwo przyswajalne przez drożdże. Są one również zdolne do wykorzystywania z podłoża azotanów. Dobrym rozwiązaniem jest dostarczenie drożdżom azotu bezpośrednio w postaci aminokwasów (hydrolizaty kazeiny, ekstrakty drożdżowe), są to jednak składniki drogie. Dlatego również w przypadku źródeł azotu poszukuje się surowców odpadowych, które mogłyby zaspokoić zapotrzebowanie drożdży na ten biopierwiastek [44, 52]. Podłoża hodowlane wzbogaca się także w związki siarki i fosforu, najczęściej poprzez stosowanie nieorganicznych form tych pierwiastków (siarczany, ortofosforany). Siarka ma szczególne znaczenie w sytuacji, gdy dąży się do zwiększenia zawartości aminokwasów siarkowych w biomasie drożdży. Z kolei fosfor jest niezbędnym składnikiem kwasów nukleinowych oraz fosfolipidów. Wśród pozostałych składników mineralnych najważniejszą rolę odgrywają potas i magnez (uznawane za makroelementy) oraz pozostałe pierwiastki wymagane w ilościach śladowych (mikroelementy): wapń, mangan, żelazo, cynk, miedź, kobalt i molibden. Niezbędne jest również dostarczenie odpowiedniej ilości tlenu, który jest wykorzystywany w procesach oddechowych komórek drożdży i namnażania biomasy bez produkcji alkoholu etylowego. Z kolei obecność czynników wzrostowych nie jest niezbędna w przypadku hodowli drożdży dzikich [52]. Przemysłowa produkcja drożdży paszowych oparta jest przede wszystkim na surowcach odpadowych, pochodzących z różnych gałęzi przemysłu [44]. W większości stosowane są surowce węglowodanowe, między innymi melasa i wywar melasowy, hydrolizaty drewna, ługi posiarczynowe, odpady skrobiowe i ligninocelulozowe oraz serwatka [18, 32]. Stanowią one tanie i dobre źródło węgla dla drożdży paszowych, a niekiedy również związków azotowych i składników mineralnych, jak w przypadku głównego odpadu z produkcji wina ryżowego (wywaru, tzw. „thin stillage”) [55]. Jako źródło azotu mogą być również wykorzystywane odpady z przetwórstwa ziemniaczanego i skrobiowego, na przykład ziemniaczana woda sokowa [5, 33]. W ostatnich latach prowadzone są badania nad zastosowaniem nowych, niekonwencjonalnych substratów do produkcji drożdży paszowych. Należą do nich między innymi odpady z przemysłu tłuszczowego, mięsnego czy zmielone muszle krewetkowe [18]. Szczególnie duże nadzieje wiąże się z możliwością utylizacji kłopotliwych odpadów tłuszczowych z procesów smażalniczych przez drożdże Yarrowia lipolytica [34]. Istnieje również możliwość wykorzystania odpadów z produkcji glutaminianu sodu jako źródła azotu do produkcji biomasy drożdży i SCO [53]. Do nowych surowców, nad którym prowadzone są w ostatnich latach badania mające na celu jego 22 AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL ekologiczną i ekonomiczną utylizację, należy glicerol. Stanowi on dobre źródło węgla dla drobnoustrojów i jest prekursorem do produkcji wielu cennych metabolitów [1]. Jak pokazują prowadzone badania [7, 18, 49] glicerol może być z powodzeniem wykorzystywany do produkcji biomasy drożdży, które są w stanie asymilować go jako jedyne źródło węgla. 4.Produkcja biopaliw i gospodarka odpadami z produkcji biodiesla Biopaliwo jest to olej napędowy stosowany w silnikach wysokoprężnych, który zawiera w swoim składzie biologiczny komponent w postaci estrów metylowych kwasów tłuszczowych (Biodiesel) lub też składa się z niego w całości (BIOESTER 100). W zależności od kraju, stosuje się różny dodatek tych estrów. Unia Europejska narzuca krajom członkowskim 5% dodatek, a do 2020 jego zwiększenie do 10%. [38, 43]. W ostatnich latach obserwuje się dynamiczny rozwój rynku biopaliw nie tylko w Europie, ale również na całym świecie. Globalna produkcja biodiesla w 2005 wyniosła nieco ponad 3 mln ton, a po 5 latach wzrosła sześciokrotnie do poziomu 18 mln ton. W 2013 roku wyprodukowano ponad 27 mln ton biodiesla i szacuje się dalszy wzrost produkcji w kolejnych latach. Również w Polsce można zaobserwować intensywny rozwój rynku biopaliw. W 2005 roku produkcja biodiesla wyniosła 64 tys. ton, a w 2013 wzrosła do 648 tys. ton [40, 43, 56]. Do produkcji biodiesla wykorzystuje się surowce oleiste, najczęściej rzepak, soję i palmę oleistą (zależnie od rejonu upraw) [43]. Otrzymany z tych surowców olej poddawany jest procesowi metanolizy, polegającemu na transestryfikacji estrów wyższych kwasów tłuszczowych – triacylogliceroli. W procesie tym olej mieszany jest z roztworem metanolu oraz katalizatorem alkalicznym. Po przeprowadzonej reakcji następuje rozdział na niepolarną fazę estrową oraz polarną glicerynową [31]. Ta druga, oprócz glicerolu stanowiącego około 40–70%, zawiera również wiele zanieczyszczeń, w szczegól­ności metanol, wolne kwasy tłuszczowe, zneutralizowany katalizator, mydła oraz wodę i inne składniki (np. śladowe ilości metali ciężkich) [9, 41]. Otrzymana w ten sposób surowa gliceryna najczęś­ ciej poddawana jest złożonym i kosztownym procesom oczyszczania, dzięki którym może być wykorzystywana w przemyśle kosmetycznym, spożywczym, farmaceutycznym lub chemicznym [39]. Jednak w małych przetwórniach budowanie instalacji oczyszczającej fazę glicerynową jest nieopłacalne. W takich warunkach utylizuje się ją poprzez rozcieńczanie wodą w stosunku 1:100 i zastosowanie jako nawozu [51]. Ponadto faza glicerynowa, ze względu na wysoką wartość opałową, może być wykorzystywana jako komponent mieszanki paliwowej dostarczanej do kotłów i pieców. Intensywny rozwój produkcji biodiesla przyczynił się do zwiększenia ilości powstającej gliceryny (z 300 tys. ton w 2005 roku do 2,7 mln ton w 2013), w wyniku czego stała się trudnym do zagospodarowania odpadem przemysłowym [41]. 4.1. Wykorzystanie glicerolu w procesach biotechnologicznych Interesującym rozwiązaniem problemu utylizacji gliceryny odpadowej jest jej wykorzystanie jako składnika podłoży w hodowlach drobnoustrojów. Dzięki bogatym i różnorodnym układom enzymatycznym, mikroorganizmy potrafią asymilować i przekształcać pobierany glicerol do wielu użytecznych przemysłowo związków chemicznych [1]. Najwięcej uwagi poświęca się badaniom nad możliwością biosyntezy 1,3-propanodiolu. Związek ten wykorzystywany jest do produkcji smarów, rozpuszczalników organicznych, poliestrów i poliuretanów. W procesie biotransformacji glicerolu do 1,3-propanodiolu mogą być wykorzystywane takie gatunki jak Klebsiella pneumoniae, Clostridium butyricum, Citrobacter freundii i Enterobacter agglomerans [47]. Glicerol może być także stosowany jako składnik podłoża do produkcji kwasu bursztynowego przez Basfia succiniciproducens, wykorzystywanego w przemyśle chemicznym i kosmetycznym [11]. Innym cennym produktem otrzymywanym w wyniku biotransformacji glicerolu jest kwas propionowy, mający zastosowanie w utrwalaniu żywności i pasz. Kwas ten produkowany jest przez bakterie z rodzaju Propionibacterium. Według badań Kośmider i wsp. [20] zastosowanie glicerolu jako jedynego źródła węgla w podłożu hodowlanym dla Propionibacterium freudenreichii spowodowało zwiększenie wydajność biosyntezy kwasu propionowego o 34% w porównaniu z podłożem zawierającym glukozę. Z kolei odpowiednio wyselekcjonowane lub zmutowane szczepy drożdży Y. lipolytica były zdolne do pobierania glicerolu i biotransformacji w warunkach tlenowych w kierunku kwasu cytrynowego [45]. Glicerol może być również wykorzystywany przez bakterie octowe, między innymi Gluconobacter oxydans, które przekształcają go do dihydroksyacetonu. Produkt ten znalazł zastosowanie w kosmetologii, farmakologii oraz w przemyśle spożywczym [48]. Liczne gatunki drożdży są w stanie wykorzystywać glicerol jako jedyne źródło węgla, co znalazło przemysłowe zastosowanie przy produkcji biomasy drożdży paszowych [18, 49]. Ze względu na małe rozmiary cząsteczki glicerolu, może być on pobierany przez mikroorganizmy na drodze dyfuzji ułatwionej, a następnie wykorzystany jako jedyne źródło węgla i energii [9]. Po wniknięciu do cytozolu ulega fosforylacji do L-3-fosfoglicerolu z udziałem jednej cząsteczki ATP WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO 23 Rys. 1. Metabolizm glicerolu w komórkach drożdży. 1 – kinaza glicerolowa, 2 – dehydrogenaza glicerolofosforanowa, 3 – izomeraza triozofosforanowa (opracowanie na podstawie [1]) przez enzym kinazę glicerolową (EC 2.7.1.30). Powstały związek w kolejnym etapie utleniany jest przez dehydrogenazą glicerolofosoranową (EC 1.1.1.8) współdziałającą z NAD+ do fosfodihydroksyacetonu. Następnie, z udziałem izomerazy triozofosforanowej (EC 5.3.1.1), ulega izomeryzacji do aldehydu 3-fosfoglicerynowego, który jako związek pośredni szlaku glikolizy zostaje włączony do dalszych jego przemian (rys. 1) [1, 14]. Powstały w procesie glikolizy pirogronian przekształcany jest do acetylokoenzymu A, a ten może zostać wykorzystany w dalszych procesach energetycznych komórki, w ten sposób umożliwiając drożdżom wykorzystanie glicerolu do wzrostu i produkcji biomasy [1]. Drożdże są również w stanie wykorzystywać powstały acetylokoenzym A w procesie biosyntezy kwasów tłuszczowych i produkcji tłuszczu mikrobiologicznego (SCO). Podczas biosyntezy SCO również istotne znaczenie odgrywa pobierany z podłoża glicerol, który po fosforylacji do L-3-fosfoglicerolu wykorzystywany jest jako szkielet do biosyntezy triacylogliceroli [37]. 5. Produkcja skrobi ziemniaczanej Skrobia jest odnawialnym biopolimerem, występującym naturalnie w przyrodzie w wielu różnych roślinach, a przede wszystkim w zbożach i bulwach ziemniaka. Określone cechy fizyczne i chemiczne umożliwiają jej łatwą modyfikację oraz przydatność w wielu gałęziach przemysłu (spożywczym, drzewno-papierniczym, włókienniczym). Światowy rynek produkcji skrobi zdominowany jest głównie przez skrobię kukurydzianą i pszeniczną, które uznawane są za w pełni zastępowalne w stosunku do ziemniaczanej. Nie można jednak zapominać o pewnych argumentach, przemawiających na korzyść produkcji skrobi z ziemniaków. W porównaniu do innych surowców, charakteryzuje się ona wyższą jakością [10]. Wynika to głównie z dużej wielkości ziaren skrobiowych w bulwach ziemniaka w porównaniu do innych surowców. Skrobia gruboziarnista charakteryzuje się lepszymi właściwościami fizycznymi (bielsza, o większej lepkości), a ponadto łatwiej ulega dekstrynizacji, scukrzaniu i kleikowaniu [42]. Argumentem przemawiającym za produkcją skrobi ziemniaczanej jest również znaczenie upraw ziemniaka skrobiowego. Dalsze zmniejszanie powierzchni upraw okopowych może prowadzić do niekorzystnych zmian w płodozmianie i zagrozić istotnemu celowi Wspólnej Polityki Rolnej, jakim jest zachowanie bioróżnorodności upraw oraz osiągnięcie zróżnicowanych strukturalnie systemów uprawy rolnej [10]. W najbliższych latach polski przemysł krochmalniczy będzie musiał zmierzyć się z kolejnymi trudnoś­ ciami, związanymi ze zmianami we Wspólnej Polityce Rolnej, a mianowicie zniesieniem dopłat produkcyjnych dla producentów skrobi. Może to doprowadzić do kryzysu w przetwórstwie krochmalniczym i zmniejszenia produkcji skrobi ziemniaczanej, która w ostatnich latach wynosiła ok. 105 tysięcy ton. W zaistniałej sytuacji przedsiębiorstwa powinny szukać nowych rozwiązań umożliwiających zmniejszenie kosztów produkcji skrobi [10]. Jednym ze sposobów może być szukanie nowych metod ekonomicznej utylizacji głównych odpadów pochodzących z procesu produkcyjnego – wycierki oraz wody sokowej. 5.1. Charakterystyka odpadowej ziemniaczanej wody sokowej i kierunki jej wykorzystania Przemysł krochmalniczy należy do największych producentów ścieków w branży spożywczej. Ich cechą charakterystyczną jest wysoka zawartość substancji organicznych i biogennych, a także kampanijność wytwarzania, co stwarza bardzo duże trudności w ich utylizacji. Podstawowym odpadem wchodzącym w skład ścieków z przemysłu ziemniaczanego jest woda sokowa [24], której powstaje około 600 ton przy przerobie 24 AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL 1000 ton ziemniaków [25]. W skład odpadowej wody sokowej wchodzi ok. 1% substancji nieorganicznych oraz 4% organicznych, z czego 2% stanowią związki białkowe [21]. W Polsce, w celu zmniejszenia obciążenia ścieków z przemysłu ziemniaczanego, stosuje się usuwanie związków azotowych poprzez koagulację kwasowo-termiczną [24]. Podczas tego procesu do koagulatu przechodzi ok. 34% suchej substancji wody sokowej, 54 % białka surowego oraz 74% białka właś­ ciwego. W związku z tym, że koagulat zawiera głównie białko właściwe, w odbiałczonej wodzie sokowej pozostaje przede wszystkim część białka surowego, w którego skład wchodzi białko rozpuszczalne oraz substancje azotowe niebiałkowe (peptydy, aminokwasy i mineralne związki azotu) [25]. Woda sokowa po odbiałczeniu w dalszym ciągu charakteryzuje się bogatym i zróżnicowanym składem chemicznym [24, 25]. Zawartość suchej substancji stwierdzono na poziomie 3,8%, a związków białkowych ok. 1,4%, z czego 78% stanowi białko rozpuszczalne i substancje azotowe niebiałkowe. Spośród aminokwasów wolnych i związanych w największej ilości występują kwas asparaginowy i glutaminowy. Zawartość cukrów redukujących (głównie glukoza, ramnoza i galaktoza) wynosi około 0,5–1,0%. Woda sokowa charakteryzuje się również zawartością popiołu rzędu 1,1–1,2%. W jego skład wchodzi między innymi potas, magnez, wapń, fosfor, sód i cynk. W wodzie sokowej wykryto również biotynę oraz kwasy organiczne, głównie szczawiowy, cytrynowy i jabłkowy. Powszechnie stosowaną metodą zagospodarowania wody sokowej jest jej rozcieńczanie wodą, a następnie wykorzystanie do spryskiwania łąk lub rolniczego nawadniania. Działanie takie umożliwia wzbogacenie gleby w związki azotowe przyswajalne przez rośliny i obniżenie jej kwasowości. Jest to naturalna, biologiczna metoda oczyszczania ścieków połączona z ich rolniczym wykorzystaniem. Do głównych zalet tej metody należą względy ekonomiczne oraz prostota jej realizacji [27]. Metoda ta może jednak budzić pewne obawy ze względu na duży ładunek zanieczyszczeń ziemniaczanej wody sokowej wyrażony wysokimi wskaźnikami ChZT i BZT5 (odpowiednio ok. 30 000 mg O2 · L–1 oraz ok. 22 000 mg O2 · L–1). W celu odpowiedniego zutylizowania tego odpadu konieczne są duże ilości tlenu, niezbędne do rozkładu obecnych w wodzie sokowej substancji. Z tego powodu wskazane jest szukanie alternatywnych metod utylizacji odpadowej ziemniaczanej wody sokowej [19, 25, 29]. Do metod takich może należeć jej wykorzystanie w procesach biotechnologicznych. Ziemniaczana woda sokowa, ze względu na bogaty skład chemiczny, może stanowić przydatny substrat do mikrobiologicznej syntezy białka. Jednocześnie można znacząco obniżyć ładunek zanieczyszczeń w ściekach poprodukcyjnych. Liczne badania [19, 23, 25, 36] potwierdziły możliwość wykorzystania odbiałczonej ziemniaczanej wody sokowej w procesach biotechnologicznych, co umożliwiło zredukowanie wskaźników BZT5 i ChZT nawet o 60–90%. 6. Podsumowanie W ostatnich latach coraz częściej podejmuje się badania nad możliwością wykorzystania surowców odpadowych w procesach biotechnologicznych. Powstająca podczas produkcji skrobi odpadowa ziemniaczana woda sokowa charakteryzuje się wysoką zawartością różnych składników odżywczych niezbędnych do wzrostu drożdży. Należą do nich przede wszystkim przyswajalne formy azotu (wolne aminokwasy i peptydy, związki nieorganiczne). Obecne są w niej również składniki mineralne, takie jak potas, magnez i fosfor, które są kluczowe do prawidłowego funkcjonowania enzymów i przebiegu procesów biochemicznych w komórkach drożdży. Ze względu na niskie stężenia cukrów prostych, korzystne jest konstruowanie pożywek poprzez łączenie wody sokowej z innymi substratami stanowiącymi źródło węgla. Jednym z takich surowców może być frakcja glicerynowa, powstająca w procesie otrzymywania biodiesla. Drożdże C. utilis wykazują zdolność do wydajnego wzrostu i asymilacji tego związku z podłoża hodowlanego [18]. Połączenie takie umożliwia uzyskanie wyższego plonu biomasy drożdży, niż podczas hodowli na samej wodzie sokowej [5]. W rezultacie istnieje możliwość utylizacji kłopotliwych odpadów przemysłowych, z jednoczesną produkcją biomasy drożdżowej ukierunkowaną na biosyntezę wartościowych składników odżywczych, takich jak białko, tłuszcz, glukany, witaminy oraz metalobiałka. Piśmiennictwo 1. Amaral P.F.F., Ferreira T.F., Fontes G.C., Coelho M.A.Z.: Glycerol valorization: New biotechnological routes. Food Bioprod. Process. 87, 179–186 (2009) 2. Anupama, Ravindra P.: Value-added food: Single cell protein. Biotechnol. Adv. 18, 459–479 (2000) 3. Błażejak S.: Studia nad pozyskiwaniem biopleksów z biomasy drożdży Candida utilis wzbogaconych magnezem. Wyd. SGGW, Warszawa, 2006 4. Błażejak S., Duszkiewicz-Reinhard W., Gniewosz M., Kamiński T.: Badanie zdolności wiązania magnezu przez drożdże paszowe Candida utilis ATCC 9950 w warunkach hodowli wgłębnej. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 2, 109–123 (2003) 5. Błażejak S., Gientka I., Bzducha-Wróbel A., Stastak-Różańska L., Maszewska M.: Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis w podłożach zawierających ziemniaczaną odpadową wodę sokową wzbogaconą glicerolem. ZPPNR, 576, 3–12 (2014) WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO 6.Brown C.M., Rose A.H.: Fatty-Acid Composition of Candida utilis as Affected by Growth Temperature and Dissolved-Oxygen Tension. J. Bacteriol. 99, 371–378 (1969) 7. Bzducha-Wróbel A., Kieliszek M., Błażejak S.: Chemical composition of the cell wall of probiotic and brewer’s yeast in response to cultivation medium with glycerol as a carbon source. Eur. Food Res. Technol. 237, 489–499 (2013) 8.Dobrzański Z., Dolińska B., Chojnacka K., Opaliński S., Ryszka F.: Znaczenie drożdży w żywieniu zwierząt gospodarskich. Acta Sci. Pol, Madic. Veterin. 5, 49–66 (2006) 9. Dobson R., Gray V., Rumbold K.: Microbial utilization of crude glycerol for the production of value – added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39, 217–226 (2012) 10. Dzwonkowski W.: Perspektywy rynku skrobi i produkcji ziemniaków skrobiowych w kontekście zmian Wspólnej Polityki Rolnej. Biul. IHAR, 265, 99–108 (2012) 11. Edzard S., Torsten R., Jochen T.: Continuous cultivation approach for fermentative succinic acid production from crude glycerol by Basfia succiniciproducens DD1. Biotechnol. Lett. 31, 1947–1951 (2009) 12. Enshaeieh M., Abdoli A., Nahvi I., Madani M.: Bioconversion of different carbon sources in to microbial oil and biodiesel using oleaginous yeats. J. Biol. Today’s World, 1, 82–92 (2012) 13. Fidler N., Koletzko B., Sauerwald T.U.: Single cell oils production and application. Zb. Biotehniske fak. Univ. v Ljubljani. Kmetijstvo. Zootehnika, 74, 37–45 (1999) 14.Gancedo C., Gancedo J.M., Sols A.: Glycerol Metabolism in Yeasts. Pathways of Utilization and Production. Eur. J. Biochem. 5, 165–172 (1968) 15. Jarociński J., Jarosz K.: Gorzelnictwo i drożdżownictwo. Wydawnictwa Szkolne i Pedagogiczne, Warszawa, 1983 16.Jamroz D., Buraczewski S., Kamiński J.: Żywienie zwierząt i paszoznawstwo tom 1. Fizjologiczne i biochemiczne podstawy żywienia zwierząt. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2001 17. Jay J.M.: Modern food microbiology. Chapman & Hall, London, 1992 18. Juszczyk P., Musiał I., Rymowicz W.: Dobór szczepów drożdży do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Acta Sci. Pol., Biotechnol. 4, 65–76 (2005) 19. Kosiek E.: Próby wykorzystania soku ziemniaczanego w produkcji drożdży piekarskich. Zesz. Nauk. PŁ, Technol. Chem. Spoż. 648, 31–41 (1993) 20. Kośmider A., Drożdżyńska A., Czaczyk K.: Możliwość wykorzystania surowców odpadowych w procesie fermentacji propionowej. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 6, 45–58 (2009) 21. Kowalczewski P., Celka K., Białas W., Lewandowicz G: Antioxidant activity of potato juice. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 11, 175–181 (2012) 22. Kurtzman C.P., Fell J.W.: The Yeasts A Taxonomic Study. Fourth Revised and Enlarged Edition. Vol 1. Elsevier, New York, 1998 23. Liu B., Song J., Li Y., Niu J., Wang Z., Yang Q.: Towards Industrially Feasible Treatment of Potato Starch Processing Waste by Mixed Cultures. App. Biochem. Biotechnol. 171, 1001–1010 (2013) 24.Lubiewski Z., Śmiegielska H., Lewandowicz G., Balcerek W.: Charakterystyka odcieku po koagulacji białka pozyskiwanego w toku kampanii krochmalniczej. ZPPNR, 511, 617–626 (2006) 25.Łabendziński S.: Surowce niekonwencjonalne dla przemysłowej biosyntezy białka. II. Odpady przemysłu krochmalniczego. Przem. Ferm. i Rolny, 20, 1–3 (1976) 26. Mardarowicz L.: Drożdże w żywieniu drobiu. Pol. Drobiar. 9, 14–16 (1997) 27. Marzec H.: Wpływ nawadniania ściekami krochmalniczymi na plonowanie roślin. ZPPNR, 414, 119–125 (1994) 25 28. Microorganisms & Microbial-Derived Ingredients Used in Food (Partial List). Food and Drug Administration, http://www.fda. gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/MicroorganismsMicrobialDerivedIngredients/default.htm (22.02.2015) 29. Miedzianka J., Pęksa A., Smolarczyk E.: Zastosowanie przemysłowego soku ziemniaczanego do otrzymywania preparatów białka arylowanego. ZPPNR, 557, 261–273 (2010) 30.Miura Y., Kondo K., Toshiko S., Shimada H., Fraser P.D., Misawa N.: Production of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1226–1229 (1998) 31. Moser R.B.: Biodiesel production, properties, and feedstocks. In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant, 45, 229–266 (2009) 32. Munawar R.A., Irfan M., Nadeem M., Syed Q.A., Siddique Z.H.: Biosynthesis of single cel biomass of Candida utilis by submerged fermentation. Pak. J. Sci. 62, 1–5 (2010) 33. Muniraj I.K., Xiao L., Hu Z., Zhan X., Shi J.: Microbial lipid production from potato processing wastewater using oleaginous filamentous fungi Aspergillus oryzae. Water Res. 47, 3477–3483 (2013) 34.Musiał I., Rymowicz W., Kita A.: Produkcja biomasy drożdży Yarrowia lipolytica z tłuszczów odpadowych po smażeniu produk­ tów przekąskowych. Acta Sci. Pol., Biotechnol. 3, 75–83 (2004) 35. National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm. nih.gov/taxonomy (22.02.2015) 36. Nowak J., Lasik M.: Wysokotemperaturowa bioremediacja ścieków z przemysłu ziemniaczanego z wykorzystaniem mieszanej kultury bakteryjnej. Nauka Przyr. Technol. 3, 1–10 (2009) 37. Papanikolaou S., Aggelis G.: Lipids of oleaginous yeast. Part I: Biochemistry of single cell oil production. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 113, 1052–1073 (2011) 38. Piwowarczyk K.: Zachowanie otoczenia przy produkcji biodiesla do celów transportowych, pochodzących z przeróbki rzepaku (w) Materiały Krakowskiej Konferencji Młodych Uczonych, Fundacja Studentów i Absolwentów Akademii Górniczo-Hutniczej „Academica”, Kraków, 2007, 335–341 39. Podkówka W.: Biopaliwo, gliceryna, pasza z rzepaku. Wyd. Akademii Techniczno-Rolniczej, Bydgoszcz, 2004 40.Produkcja biodiesla na świecie w 2013 roku i prognozy na rok 2014. Gospodarz.pl, http://www.gospodarz.pl/aktualnosci/ paliwa-i-biopaliwa/produkcja-biodiesla-na-swiecie-w-2013roku-i-prognozy-na-2014-rok.html (22.02.2015) 41. Quispe C.A.G., Coronado C.J.R., Carvalho J.A.Jr.: Glycerol: Production, consumption, prices, charakterization and new trends in combustion. Renew. Sust. Energ. Rev. 27, 475–493 (2013) 42. Ratuszniak E., Kubas A.: Wykorzystanie metody mikroskopowej do badania wielkości ziaren skrobi u różnych gatunków roślin. SPB, 4, 93–107 (2007) 43.Rosiak E., Łopaciuk W., Krzemiński M.: Produkcja biopaliw i jej wpływ na światowy rynek zbóż oraz roślin oleistych i tłuszczów roślinnych. Instytut Ekonomiki Rolnictwa i Gospodarki Żywnościowej – Państwowy Instytut Badawczy, Warszawa, 2011 44. Russel S.: Biotechnologia. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa, 1990 45. Rywińska A.: Wykorzystanie glicerolu odpadowego do biosyntezy kwasu cytrynowego przez Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG 7. Acta Sci. Pol., Biotechnol. 7, 13–22 (2008) 46. Rywińska A., Juszczyk P., Wojtatowicz M., Robak M., Lazar Z., Tomaszewska L., Rymowicz W.: Glycerol as a promising substrate for Yarrowia lipolytica biotechnological applications. Biomass Bioenerg. 48, 148–166 (2013) 47. Sun-Ae J., Chuloo M., Cheol-Hee K., Sean W.K., Byoung-In S., Youngsoon U.: Microbial Fed-batch Production of 1,3-Propanediol Using Raw Glycerol with Suspended and Immobilized Klebsiella pneumoniae. Appl. Biochem. Biotechnol. 161, 491–501 (2010) 26 AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL 48.Stasiak L., Błażejak S.: Acetic acid bacteria – perspectives of application in biotechnology – a review. Pol. J. Food Nutr. Sci. 59, 17–23 (2009) 49. Taccari M., Canonico L., Comitini F., Mannazzu I., Ciani M.: Screening of yeasts for growth on crude glycerol and optimization of biomass production. Bioresour. Technol. 110, 488–495 (2012) 50.Tomita Y., Ikeo K., Tamakawa H., Gojobori T., Ikushima S.: Genome and Transcriptome Analysis of the Food-Yeast Candida utilis. PLoS ONE, 7: e37226. Doi:10.1371/journal.pone.0037226, 1–10 (2012) 51. Tys J., Piekarski W., Jackowska I., Kaczor A., Zając G., Starobrat P.: Technologiczne i ekonomiczne uwarunkowania produkcji biopaliw z rzepaku. Acta Agrophys. 99 (2003) 52. Walker G.M.: Yeast – Physiology and Biotechnology. Wiley, New York, 1998 53. Xue F., Miao J., Zhang X., Luo H., Tan T.: Studies on lipid production by Rhodotorula glutinis fermentation using monosodium glutamate wastewater as culture medium. Bioresour. Technol. 99, 5923–5927 (2008) 54. Yanez E., Ballester D., Fernandez N., Gattas V., Monckeberg F. 1972: Chemical composition of Candida utilis and the biological quality of the yeast protein. J. Sci. Food Agric. 23, 581–586 (1972) 55. Yen H., Yang Y., Yu Y.: Using crude glycerol and thin stillage for the production of microbial lipids through the cultivation of Rhodotorula glutinis. J. Biosci. Bioeng. 114, 453–456 (2012) 56.Zestawienie wytworzonych i sprzedanych biokomponentów – 2013. Urząd Regulacji Energetyki, http://www.ure.gov.pl/pl/ rynki-energii/paliwa-ciekle/biokomponenty-i-biopal/danedotyczace-rynku-b/5379,Zestawienie-wytworzonych-isprzedanych-biokomponentow-2013.html (22.02.2015) POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 27–44 http://www.pm.microbiology.pl ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH WE WSPÓŁCZESNEJ WAKCYNOLOGII Katarzyna Roeske1*, Radosław Stachowiak1, Jacek Bielecki1 1 Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Wpłynęło w kwietniu 2015 r. Zaakceptowano w listopadzie 2015 r. 1. Wakcynologia – rys historyczny i perspektywy. 2. Swoista (nabyta) odpowiedź immunologiczna. 3. Komórki efektorowe odpowiedzi typu komórkowego. 4. Prezentacja antygenu i jego rozpoznanie przez limfocyty. 5. Pamięć immunologiczna. 6. Szczepionki indukujące odpowiedź komórkową. 7. Szczepionki podjednostkowe. 8. Adiuwanty. 9. Szczepionki wektorowe. 10. Bakterie patogenne jako wektory szczepionkowe. 11. Bakterie niepatogenne jako wektory szczepionkowe. 12. Podsumowanie Principles and perspectives of using live bacterial vectors in modern vaccinology Abstract: Various strategies can be used to deliver antigens to the cytosol of antigen presenting cells, e.g. using nanoparticles, liposomes, immune stimulating complexes, viruses or bacteria. Among them, the use of bacterial carriers constitutes probably the most studied strategy. Depending on the extra- or intracellular life cycle of the pathogen, different immune responses are required for protection. Vaccines formulated on the basis of killed whole cells or isolated cell fractions tend to induce strong antibody response, however, they are ineffective at inducing cellular immunity. Due to these characteristics such antigens are used mainly to immunize against extracellular pathogens. Conversely, live attenuated mutants induce a broad range of immune responses including CD8+ T cell response, thereby leading to effective immunization against intracellular pathogens. Besides adjuvant properties provided by carried molecular patterns, live bacterial carriers have other important advantages, such as the ability to mimic natural infection and possibility to be administered in a needle-free manner. Remarkably, vector-based vaccines can be designed to enable induction of immune response against their own or carried heterologous antigens. Both pathogenic and commensal microorganisms are used in the next generation vaccine design, however, due to the potential risk of conversion to a virulent strain and causing infection or the loss of immunogenic potency, pathogenic vectors are less likely to use. Questions concerning safety which have arisen with the advent of live-attenuated bacterial vectors made the researchers turn their attention to non-pathogenic bacteria. 1. Vaccinology – historical background and perspectives. 2. Acquired immunity. 3. Effector cells of cell-mediated immune response. 4. Antigen presentation and its recognition by T-cells. 5. Immunological memory. 6. Vaccines inducing cellular immune response. 7. Subunit vaccines. 8. Adjuvants. 9. Vector vaccines. 10. Pathogenic bacteria as vaccine vectors. 11. Non-pathogenic bacteria as vaccine vectors. 12. Summary Słowa kluczowe: odpowiedź komórkowa, pamięć immunologiczna, prezentacja antygenu, szczepionka, wektor bakteryjny Key words: antigen presentation, bacterial vector, cell-mediated immune response, immune memory, vaccine 1. Wakcynologia – rys historyczny i perspektywy Postępy w nauce od zawsze stanowiły siłę napędową w badaniach nad konstrukcją nowych, skutecznych szczepionek (Rys. 1). Termin „szczepionki” w znaczeniu preparatu biologicznego wzmagającego odporność na daną chorobę oraz koncepcja szczepień zostały wprowadzone przez Edwarda Jennera w 1796 roku. Wykorzystał on materiał zakaźny ospy krowianki do zaszczepienia 8-letniego chłopca, co przyniosło efekt w postaci skutecznej immunizacji przeciw wirusowi ospy prawdziwej [73]. Złotą erę wakcynologii zapoczątkowały odkrycia Pasteura i Kocha, którzy opracowali preparaty szczepionkowe opierające się na żywych, atenuowanych mikroorganizmach, organiz­mach inaktywowanych bądź produkowanych przez nie toksynach. Ludwik Pasteur w 1885 roku dokonał pierwszych skutecznych szczepień chroniących przed wirusem wścieklizny. Opracował on metodę szybkiego namnażania wirusa poprzez hodowlę w organizmach królików oraz jego atenuacji na drodze odwadniania płynu mózgowo-rdzeniowego zainfekowanych wirusem króli­ ków poprzez jego ekspozycję na działanie powietrza [13]. Robert Koch w toku swoich badań nad przecinkowcem cholery (Vibrio cholerae) dowiódł, że pojedyncze zakażenie chroni przed kolejnymi infekcjami w czasie tej samej epidemii. Pierwsze próby zastosowania zabitych komórek V. cholerae do immunizacji zostały natomiast podjęte pod koniec XIX wieku przez Jaime Ferrána, a także Sawtschenko i Sabolotnego [47]. Początek XX wieku przyniósł odkrycie nowego typu szczepionek, w których wykorzystywano toksoidy, inaktywowane na drodze chemicznej lub termicznej toksyny bakteryjne, które pozbawione były cech toksyczności, ale jednocześnie wykazywały potencjał immunizacyjny. Powstały szczepionki na bazie toksyny * Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego; ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 55 41 311; e-mail: [email protected] 28 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI Rys. 1. Główne odkrycia wakcynologii – objaśnienia w tekście tężcowej Clostridium tetani oraz toksyny błoniczej Corynebacterium diphtheriae. Następnym krokiem było opracowanie pierwszych skojarzonych szczepionek, uodparniających na błonicę i tężec (Di-Te) lub na błonicę, krztusiec i tężec równocześnie (Di-Per-Te). Kolejny przełom w badaniach z dziedziny wakcyno­ logii nastąpił w drugiej połowie XX wieku jako następstwo rozwoju technik hodowli komórkowych, dzięki którym możliwe stało się namnażanie cząstek wirusowych. Umożliwiło to stworzenie szczepionek skutecznie immunizujących przeciw rotawirusom czy wirusom zapalenia wątroby typu A, polio, różyczki, świnki, odry i ospy wietrznej. Dalszy postęp w dziedzinie mikrobiologii doprowadził do opracowania szczepionek polisacharydowych, które wywoływały odpowiedź przeciw polisacharydom otoczkowym bakterii takich jak Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis serotyp A, C, W i Y czy Haemophilus influenzae. Tego typu terapeutyki indukowały jednak stosunkowo słabą reakcję odpornościową u dzieci. Opracowanie szczepionek w formie glikokoniugatów pozwoliło na pokonanie tych ograniczeń, gdyż powodowało indukcję humoralnych mechanizmów odpornościowych. Odkrycia biologii molekularnej pozwoliły również na skonstruowanie preparatów immunizujących przeciw mikroorganiz­ mom nie dającym się namnażać w hodowli komórkowej, takim jak wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) czy wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). Szczepionki przeciw tym patogenom mają postać oczyszczonych, zrekombinowanych białek wirusa, które tworzą niewirulentne cząstki wirusowe (viral-like particle, VLP) [20]. Ostatnie dwie dekady przyniosły nowe rozwiązania w wakcynologii, które umożliwiają poszukiwanie najbardziej immunogennych antygenów. Zsekwencjonowanie kompletnych genomów organizmów chorobotwórczych oraz człowieka doprowadziło do powstania tzw. „odwrotnej wakcynologii”, techniki, która na drodze analiz genomicznych pozwala na wytypowanie najlepszych celów dla komórek układu odpornościowego. Genom danego organizmu stanowi bowiem rezerwuar ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH genów kodujących białka stanowiące potencjalny immunogen, który może być zastosowany do konstrukcji szczepionki [40]. Sztandarowym przykładem wykorzystania tej techniki jest opracowanie szczepionki wywołującej odpowiedź przeciw bakterii Neisseria meningitidis serotypu B (MenB), która w przeciwieństwie do meningokoków innych typów pokryta jest polisacharydem wykazującym duże podobieństwo do polisacharydu obecnego w ludzkich tkankach. Cecha ta sprawiła, że szczepionki glikokoniugatowe były nieskuteczne w immunizacji przeciw MenB. Wybrane na drodze analiz genomu białka poddano ekspresji w komórkach E. coli, dzięki czemu uzyskano pierwszą skuteczną szczepionkę przeciw MenB [30]. Kolejnym wyzwaniem współczesnej wakcynologii stało się również opracowanie szczepionek przeciw mikroorganizmom wykazującym duże różnice w ekspresji antygenów, jako że preparaty opracowane w XX wieku wykazują skuteczność głównie w profilaktyce zakażeń patogenami cechującymi się niską zmiennością antygenową. Rozwiązaniem jest stosowanie szczepionek zawierających antygeny wielu szczepów jednocześnie. Przykładem takich immunoterapeutyków są poliwalentne szczepionki koniugatowe zawierające antygeny 7, 9 lub 13 spośród 93 znanych serotypów streptokoków [8] lub poliwalentna szczepionka przeciw wirusowi grypy zmieniana sezonowo w oparciu o przewidywania dotyczące ewolucji biologicznej szczepów [48]. Do tej pory nie udało się jednak opracować skutecznej i trwale immunizującej szczepionki przeciw mikroorganizmom, które charakteryzuje bardzo duże tempo mutacji, takim jak wirusy HIV czy HCV. Potrafią one uniknąć mechanizmów obronnych orga­nizmu gospodarza dzięki zmianom antygenów będących celem układu odpornościowego. W ciągu ostatniego wieku szczepienia w bardzo znaczącym stopniu przyczyniły się do ograniczenia zapadalności na choroby zakaźne oraz zmniejszyły wywoływaną przez nie śmiertelność. Światowa Organizacja Zdrowia (World Health Organization, WHO) podaje, że szczepienia mogą ratować życie od 2 do 3 milionów ludzi każdego roku. Dzięki rozbudowanym programom szczepień choroby takie jak ospa prawdziwa czy polio zostały wyeliminowane na całym świecie. Z danych raportu WHO z 2014 roku wynika, że w latach 2000–2012 o 78% spadła również liczba zgonów spowodowanych przez odrę. Jednocześnie organizacja informuje, że przy pomocy szczepień można kontrolować zapadalność na jedynie 25 ze wszystkich znanych chorób zakaźnych (Tab. I). W 2012 roku w czołówce chorób powodujących najwyższą śmiertelność i przeciw którym nie istnieje skuteczna szczepionka AIDS (1,6 miliona zgonów), gruźlica (1,3 miliona zgonów) czy malaria (0,6 miliona zgonów). Coraz większe zagrożenie stanowią również nowotwory, które w 2012 roku spowo- 29 Tabela I Dostępne szczepionki uodparniające przeciw chorobom zakaźnym Choroby bakteryjne wąglik cholera zakażenia meningokokowe dyfteryt tężec krztusiec gruźlica zakażenia pneumokokowe dur brzuszny zakażenia Haemophilus influenzae Choroby wirusowe odra różyczka grypa świnka WZW A WZW B WZW E polio wirusowe zapalenie mózgu wścieklizna ospa wietrzna zakażenia papillomawirusami zakażenia rotawirusami żółta febra japońskie zapalenie mózgu dowały śmiertelność rzędu 8,2 miliona osób. Ich profilaktyka za pomocą szczepień stanowi więc poważne wyzwanie dla współczesnej wakcynologii. 2. Odporność swoista Szczepienie ma na celu wywołanie swoistej odpowiedzi odpornościowej, dlatego warunkiem niezbędnym do opracowania nowych metod skutecznej immunizacji jest bardzo dokładne poznanie jej mechanizmów. Terminem swoistej odpowiedzi immunologicznej określa się mechanizm nabytej odporności organizmu zależny od rozpoznania antygenów przez przeciwciała produkowane przez limfocyty B (odpowiedź humoralna) i receptory znajdujące się na limfocytach T (odpowiedź komórkowa). Cechuje ją specyficzność względem unikalnego antygenu oraz zdolność do wywoływania tzw. pamięci immunologicznej zapewniającej długotrwałą odporność organizmu na dany patogen. Przeciwciała produkowane przez limfocyty B wiążą się z antygenami na powierzchni czynników infekcyjnych. Może to skutkować zniszczeniem patogenu w drodze różnych mechanizmów takich jak fagocytoza czy aktywacja dopełniacza lub mobilizacją komórek odpornościowych na skutek wydzielania mediatorów stanu zapalnego. Przeciwciała są odpowiedzialne za eliminowanie zakażeń patogenami, które mają pozakomórkowy etap w swoich cyklach życiowych lub które produkują metabolity wydostające się poza komórki gospodarza. Drugim typem odpowiedzi swoistej, która ma decydujące znaczenie w niszczeniu patogenów wewnątrzkomórkowych, a także przy zwalczaniu komórek nowotworowych jest odpowiedź typu komórkowego. Komórkami efektorowymi tej odpowiedzi są limfocyty cytotoksyczne, CD8+ (cytotoxic T cell, CTL) oraz limfocyty pomocnicze, CD4+ (helper T cell, Th). Komórki 30 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI CD8+ rozpoznają obce antygeny i prowadzą do zabicia komórki zainfekowanej wirusem, wewnątrzkomórkową bakterią czy też do eliminacji komórki nowotworowej, podczas gdy komórki CD4+ stymulują aktywność pozostałych leukocytów poprzez wydzielanie cytokin bądź przez bezpośredni kontakt z nimi. Na skuteczność odporności nabytej wpływają zarówno prawidłowy przebieg humoralnej oraz komórkowej odpowiedzi, jak i odpowiednia interakcja między komórkami efektorowymi obu typów odpowiedzi. Bardzo duże znaczenie w odpowiedzi humoralnej, zwłaszcza na antygeny białkowe, ma współpraca limfocytów T helperowych CD4+ z limfocytami B. Co najważniejsze, w przebiegu odporności nabytej powstają limfocyty pamięci, dzięki którym ponowny kontakt z tym samym antygenem prowadzi do szybszej i efektywniejszej odpowiedzi odpornościowej [68]. 3.Komórki efektorowe odpowiedzi typu komórkowego Limfocyty T pomocnicze (CD4+, Th) Limfocyty T pomocnicze (T helper cells, Th) o fenotypie CD4+ odgrywają kluczową rolę w rozwoju odporności nabytej. Regulują funkcje efektorowe limfocytów B i limfocytów T cytotoksycznych, komórek odpor­ ności wrodzonej, szczególnie o aktywności fagocytarnej, a także odpowiadają za utrzymanie homeostazy i uczestniczą w kontroli reakcji autoimmunizacyjnych. Są również mediatorami pamięci immunologicznej, a zmniejszenie ich liczby w organizmie przyczynia się do zwiększonej podatności na choroby infekcyjne. Tak różnorodną rolę mogą pełnić dzięki różnicowaniu naiwnych limfocytów T CD4+ do odmiennych efektorowych limfocytów T w odpowiedzi na aktywację antygenami prezentowanymi przez komórki prezentujące antygen (APC, antigen-presenting cells). W 1986 roku Mosmann i wsp. [54] wykazali istnienie dwóch populacji limfocytów T CD4+, (Th1 i Th2) różniących się profilem produkowanych cytokin oraz markerami powierzchniowymi. Cechą charakterystyczną limfocytów Th1 wspomagających głów­ nie odpowiedź typu komórkowego jest wydzielanie interferonu-γ (IFN-γ) oraz interleukiny-2 (IL‑2). Limfocyty Th2 biorące udział w odpowiedzi humoralnej produkują inny, charakterystyczny zestaw cytokin: interleukiny IL-4, IL-5 i IL-13. W 2003 roku zidentyfikowano kolejną populację limfocytów T CD4+, która charakteryzuje się zdolnością do syntezy następującego zestawu interleukin: IL-17A, IL-17F i IL-22 [55]. Limfocyty te nazwano Th17 [36, 61] i wykazano ich rolę między innymi w generowaniu odporności przeciwbakteryjnej we wczesnych etapach zakażeń M. tuberculosis [43]. Ponadto aktywowane, naiwne limfocyty T CD4+ różnicują w limfocyty o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ charakteryzujące się aktywnością supresorową [17]. Są one zaangażowane w utrzymanie tolerancji na antygeny własne i obce. Powstają one w obwodowych narządach limfoidalnych, co odróżnia je od naturalnych regulatorowych limfocytów T o takim samym fenotypie powstających w grasicy [35]. Wśród różnych funkcjonalnie populacji limfocytów T CD4+ opisano pęcherzykowe limfocyty Tfh (follicular T helpers). Migrują one do ośrodków rozmnażania (GC, germinal centers) limfocytów B w tkance limfoidalnej, gdzie wspomagają ich różnicowanie w komórki plazmatyczne lub limfocyty B pamięci [62]. Scharakteryzowano również inne populacje limfocytów Th, takie jak aktywne w trakcie zakażeń pasożytniczych i mogące się przyczyniać do chorób autoimmunizacyjnych limfocyty Th9 [85] czy Th22, które mogą być zaangażowane w reakcje odpornościowe i naprawę tkanki skórnej [23]. Powstanie tak zróżnicowanych populacji efektorowych i regulatorowych limfocytów T CD4+ zależy od ekspresji specyficznych czynników transkrypcyjnych i rodzaju transkrybowanych genów, co w hodowlach in vitro warunkowane jest obecnością różnych zestawów cytokin tworzących mikrośrodowisko w trakcie aktywacji naiwnych limfocytów T CD4+ przy udziale receptora TCR. Różnicowanie naiwnych limfocytów Th do populacji Th1 wymaga obecności IL-12, która jest produkowana przez komórki dendrytyczne aktywowane substancjami pochodzącymi od patogenów. Powstałe limfocyty Th1 wytwarzają natomiast IFN-γ, który aktywuje makrofagi działające na bakteryjne i wirusowe czynniki infekcyjne. Tego typu sprzężenie dodatnie obserwowane jest również przy różnicowaniu populacji komórek Th2, która generowana jest w obecności IL-4. Ta cytokina aktywuje limfocyty B oraz pobudza makrofagi i monocyty do wydzielania cytokin prozapalnych, pośrednio przyczyniając się do wytworzenia ogniska zapalnego, co prowadzi do usunięcia infekcji tego typu patogenami. W przypadku zakażeń grzybami lub niektórymi gatunkami bakterii komórki prezentujące antygen wytwarzają z kolei IL-1β, IL-6 i IL-23 indukujące powstanie limfocytów Th17, które przez sekrecję IL-17 i rekrutację neutrofilów pośredniczą w obronie przed patogenami zewnątrzkomórkowymi [69]. Różnicowanie limfocytów iTreg odbywa się natomiast w obecności TGF-β i IL-2 [93]. Odebranie pozakomórkowego sygnału ze strony cytokin przez aktywowane limfocyty Th powoduje zmianę ekspresji czynników transkrypcyjnych. Różnicowanie do komórek Th1 zależy od aktywacji czynnika STAT1 i ekspresji T-box (T-bet) [41]. W procesie różnicowania limfocytów Th2 IL-4 aktywuje z kolei czynnik STAT6, co prowadzi do syntezy czynnika transkrypcyjnego Gata3 [4]. Przy powstawaniu limfocytów Th17 indukowana jest ekspresja czynnika RORγT [22], nato- ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH 31 Rys. 2. Różnicowanie limfocytów CD4+ Limfocyty Th posiadają zdolność różnicowania do różnych populacji w zależności od obecności cytokin w trakcie rozpoznania kompleksów MHC-peptyd, np. komórki Th1 różnicują w obecności IL-12. Indukcja różnicowania powoduje uruchomienie ekspresji różnych czynników transkrypcyjnych, np. RoRγt w limfocytach Th17. Powstałe populacje limfocytów wytwarzają cytokiny regulujące przebieg odpowiedzi odpornościowej na patogen. miast czynnik transkrypcyjny Foxp3 syntetyzowany jest w przypadku komórek regulatorowych Treg (Rys. 2). Limfocyty cytotoksyczne (CD8+, Tc) Limfocyty T cytotoksyczne (Tc) cechujące się obecnością powierzchniowego markera CD8 odpowiadają za eliminację komórek nowotworowych lub komórek zainfekowanych patogenami wewnątrzkomórkowymi. Swoją funkcję efektorową zyskują dzięki produkcji cytokin takich jak IFN-γ czy TNF-α (tumor necrosis factor α) lub poprzez aktywność cytolityczną. Po aktywacji limfocytów Tc dochodzi do uwolnienia granzymów i uszkadzających błonę komórkową perforyn, a także do indukcji apoptozy w zainfekowanej komórce na drodze FasL. Produkowana przez limfocyty Tc cytokina FasL łączy się z komórką przeznaczoną do apoptozy za pośrednictwem zewnątrzkomórkowej domeny receptora Fas, FASR, który zawiera również domenę transbłonową kotwiczącą receptor i domenę cytoplazmatyczną, zwaną domeną śmierci FADD (Fas associated death domain) o charakterze wykonawczym. Przekazuje ona sygnał do białek cytoplazmy, kontrolujących fazę kontrolno-decyzyjną [70]. 4.Prezentacja antygenu i jego rozpoznanie przez limfocyty T Antygeny są cząsteczkami lub fragmentami cząsteczek posiadającymi zdolność do wiązania się z przeciwciałem lub receptorem na powierzchni limfocy- tów B lub T. Jeśli przyczyniają się one do wzbudzenia odpowiedzi odpornościowej, nazywa się je immunogenami. Nie wszystkie antygeny mają potencjał immunogenny, co jest bardzo istotnym aspektem konstruo­ wania nowych szczepionek, które powinny indukować wysoki poziom odpowiedzi odpornościowej, aby skutecznie chronić przed patogennymi mikroorganiz­ mami. Immunogenność zależy od wielu czynników. Duże znaczenie ma stopień obcości danej molekuły dla organizmu, gdyż autoantygeny zazwyczaj nie indukują odpowiednio silnej odpowiedzi odpornościowej. Równie istotne są parametry fizyczne – duże cząsteczki takie jak białka, polisacharydy czy kwasy nukleinowe należą do najbardziej immunogennych. Cząsteczki o mniejszej masie molekularnej mogą zaś funkcjonować jako hapteny, antygeny zyskujące immunogenność po połączeniu z odpowiednim nośnikiem. Obok fizyko-chemicznych cech antygenu, skuteczną odpowiedź przeciw niemu warunkuje również jego stężenie i droga podania. Immunogenność antygenu może być również wzmagana poprzez dostarczanie antygenu z innymi substancjami, zwanymi adiuwantami [68]. Limfocyty biorące udział w komórkowej odpowiedzi immunologicznej rozpoznają antygeny, które są prezentowane na komórkach eukariotycznych w kompleksach z cząsteczkami układów zgodności tkankowej MHC klasy I (limfocyty Tc) i MHC klasy II (limfocyty Th). Cząsteczki MHC klasy I eksprymowane na wszystkich jądrzastych komórkach prezentują peptydy endogennego, cytoplazmatycznego lub jądrowego pochodzenia (Rys. 3). Znane są dwa szlaki prezentacji antygenu 32 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI Rys. 3. Ścieżka prezentacji antygenu w kompleksach z cząsteczkami MHC klasy I. Prezentacja wewnątrzkomórkowych immunogennych peptydów jest wynikiem serii zdarzeń. Antygeny ulegają degradacji w proteasomie, a powstałe peptydy są translokowane za pomocą transporterów TAP do ER, gdzie tworzą kompleksy z cząsteczkami MHC I. Kompleksy peptyd-MHC I są uwalniane z ER i przy udziale aparatu Golgiego transportowane na powierzchnię komórki, gdzie mogą być rozpoznane przez limfocyt cytotoksyczny. APC – komórka prezentująca antygen; TAP – transporter associated protein; ER – retikulum endoplazmatyczne; TCR – receptor limfocytu T. w MHC I: a) endogenny szlak przetwarzania antygenów wewnątrzkomórkowych w proteasomie i tworzenia kompleksów z MHC I, b) prezentacja krzyżowa pozakomórkowych antygenów, które trafiają do wnętrza komórki prezentującej na drodze endocytozy lub peptydów pochodzących z degradacji antygenu białkowego przekazywanych przez wyspecjalizowane wewnątrzkomórkowe kanały zwane „gap junctions”. W procesie krzyżowej prezentacji zachodzącej tylko w niektórych typach APC antygeny trafiają do komórki na drodze fagocytozy lub makropinocytozy, a następnie ulegają kompleksowaniu z MHC I na drodze jednego z trzech znanych szlaków. Pierwszym z nich jest proces o nieznanym mechanizmie, udokumentowany dla wirosomów, kompleksów immunostymulujących czy liposomów, w którym białko przedostaje się z fagosomu do cytoplazmy, a następnie wchodzi na ścieżkę TAP-zależnej prezentacji [75]. Drugim sposobem jest opuszczenie fagosomu przez antygen, jego obróbka w proteasomie, a następnie powrót do fagosomu, w którym zachodzi łączenie z MHC klasy I [67]. Trzecia ścieżka zwana wakuolarną różni się od pierwszej brakiem zaangażowania transporterów TAP i proteasomu w kompleksowaniu antygenu z MHC [67]. Najczęściej wykorzystywany jest klasyczny, endogenny szlak prezentacji. Białka cytoplazmatyczne lub jądrowe podlegają w nim ubikwitynylacji, a następnie degradacji w proteasomie. Są to białka, których czas trwania kończy się, białka będące defektywnymi produktami translacji zwanymi DRiPs (defective ribosomal products) lub białkowe produkty patogenów wewnątrzkomórkowych. Powstałe w wyniku degradacji peptydy są translokowane do retikulum endoplazmatycznego (ER) przez białka transportujące TAP (transporters associated with antigen presentation), gdzie łączą się z cząsteczkami MHC I. Heterodimery MHC I składają się z polimorficznych łańcuchów: ciężkiego α i lekkiego zwanego β2‑mikroglobuliną (β2m). Związanie 8–10-aminokwasowego peptydu do rowka MHC I zapewnia stabilność całej strukturze. W stanie nie wiążącym peptydu łańcuchy MHC są stabilizowane przez białka chaperonowe ER takie jak kalretikulina, ERp57, izomeraza PDI czy tapazyna. Ostatnie z wymienionych białek oddziałuje z transporterem TAP, zapewniając łączność między procesem translokacji peptydu do ER i jego dostarczaniem do MHC I. Po związaniu peptydu białka chaperonowe są uwalniane, a kompleksy są transportowane na powierzchnię komórki, gdzie mogą być rozpoznane przez limfocyty T cytotoksyczne (CD8+, Tc) [56]. W przeciwieństwie do MHC klasy I, kompleksy MHC klasy II są obecne na profesjonalnych komórkach prezentujących antygen takich jak komórki dendrytyczne (DC), makrofagi i limfocyty B. Ich ekspresja może być jednak wzbudzona przez IFN-γ lub inne czynniki na nieprofesjonalnych komórkach prezentujących, takich jak fibroblasty, komórki nabłonkowe, keratynocyty, co obserwuje się w przypadku dermatoz, a także na jelitowych komórkach glejowych w przebiegu choroby Crohna. Kompleksy MHC II powstają w ER z transmembranowych łańcuchów α i β i połączonych z łańcuchem niezmiennym Ii zapobiegającym tworzeniu kompleksów z peptydami pochodzącymi z degradacji wewnątrzkomórkowych białek. Kompleksy te trafiają do endosomu MIIC (MHC class II compartment), gdzie łańcuch Ii jest trawiony. Pozostały w rowku heterodimeru peptyd CLIP jest następnie wymieniany przy udziale chaperonu HLA-DM na specyficzny peptyd pochodzenia pozakomórkowego uzyskany poprzez degradację na ścieżce endosomalnej (Rys. 4). Następnie kompleksy MHC II-peptyd są transportowane na powierzchnię komórki, gdzie mogą zaprezentować antygen limfocytom T CD4+ [56]. ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH 33 Rys. 4. Ścieżka prezentacji antygenu w kompleksach z cząsteczkami MHC klasy II. Składanie heterodimerów MHC II z łańcuchów α i β oraz łańcucha zmiennego Ii odbywa się w ER. Przy udziale aparatu Golgiego są one bezpośrednio lub poprzez błonę komórkową transportowane do kompartmentu MIIC. W MIIC łańcuch Ii oraz białka pobrane poprzez endocytozę są trawione przez obecne tam proteazy. Peptyd CLIP będący produktem degradacji Ii początkowo blokuje rowek wiążący peptyd w dimerze MHC II, a następnie jest wymieniany na antygenowy peptyd przy pomocy chaperonu HLA-DM. Kompleksy peptyd-MHC II są kolejno transportowane na powierzchnię błony komórki APC, gdzie mogą być rozpoznane przez limfocyty pomocnicze. APC – komórka prezentująca antygen; ER – retikulum endoplazmatyczne; TCR – receptor limfocytu T; CLIP – fragment peptydu Ii związanego z MHC II; MIIC – kompartment MHC II. Cytotoksyczne lub pomocnicze limfocyty T do proliferacji i różnicowania w komórki efektorowe wymagają obecności trzech sygnałów. Dwa z nich dostarczane są przez komórki dendrytyczne, których rola w aktywacji bądź wywołaniu stanu anergii limfocytów jest kluczowa. Pierwszy sygnał zapewnia inter­ akcja cząsteczek MHC wiążących peptyd na komórce dendrytycznej z receptorem TCR (T cell receptor) na limfocycie. W celu uniknięcia anergii limfocytów T oraz umożliwienia ich proliferacji niezbędny jest drugi, kostymulujący sygnał zapewniany przez interakcję cząsteczek kostymulatorowych obecnych jedynie na dojrzałych APC, takich jak białka B7 (CD80 i CD86) łączących się z powierzchniowymi cząsteczkami CD28 limfocytów T (Rys. 5). Ekspresja białek B7 na komórkach prezentujących antygen wzrasta w trakcie ich dojrzewania wskutek aktywacji przez związki, których źródłem są patogeny i jest wzmagana przez cytokiny, które stanowią trzeci sygnał aktywacji. Stopień ekspresji CD80 i CD86 warunkuje z kolei interakcję między cząsteczkami CD40 na komórkach dendrytycznych i ligandem CD40L na limfocytach. Aktywowane limfocyty CD4+ wytwarzają CD40L, który stymuluje ekspresję CD40 na APC, przez co zyskują one zdolność pobudzenia antygenowo swoistych limfocytów CD8+. Interakcja między cząsteczką kostymulatorową a CD28 limfocytu T indukuje aktywny transport białek sygnało- wych limfocytu T do miejsca kontaktu z komórką APC. Ich akumulacja wzmaga intensywność i wydłuża czas trwania procesu sygnalizacyjnego zapoczątkowanego przez pierwszy sygnał. W przypadku infekcji patogenami wewnątrzkomórkowymi komórkami efektorowymi odpowiedzi odpornościowej są limfocyty CD8+. Ich aktywacja zależy od obecności antygenowo-specyficznych prekursorów, siły oddziaływania receptora TCR z kompleksem MHC I-peptyd czy poziomu cytokin prozapalnych. W przeciwieństwie do limfocytów Th, zapoczątkowanie programu prowadzącego do osiągnięcia funkcji efektorowej oraz wytworzenia pamięci immunologicznej przez limfocyty Tc wymaga uzyskania trzeciego sygnału zapewnianego przez IL-12 lub IFN-α. W przypadku jego braku dochodzi jedynie do ograniczonej klonalnej ekspansji i wytworzenia stanu tolerancji [52]. Rola limfocytów CD4+ w inicjowaniu odpowiedzi limfocytów CD8+ jest złożona i w dużej mierze zależy od tego, w jakich warunkach analizowany jest dany model infekcji. Liczne eksperymenty, w których dokonywano immunizacji przy pomocy wirulentnych (adenowirusy, wirus grypy) lub nieinfekcyjnych czynników (owoalbumina jaja kurzego) wykazały, że limfocyty Th są niezbędne do zajścia odpowiedzi typu komórkowego, gdyż aktywują APC dostarczając ligand CD40L w procesie zwanym „licencjonowaniem”. Z drugiej strony 34 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI Rys. 5. Ścieżki aktywacji limfocytów T. A. Dojrzała komórka APC aktywuje limfocyt T dostarczając 2 sygnały. B. Niedojrzała komórka APC dostarcza jedynie I sygnał, co prowadzi do śmierci lub inaktywacji limfocytu. niejednokrotnie w toku badań wykazano, że w przypadku infekcji patogenami takimi jak wirus limfocytarnego zapalenia splotu naczyniówkowego (LCMV) czy wirus HIV dochodzi do wzbudzenia silnej odpowiedzi limfocytów CD8+, niezależnej od pomocy limfocytów pomocniczych, co związane jest ze zdol­nością danych czynników infekcyjnych do aktywacji APC poprzez receptory PRR (pattern recognition receptors). Udokumentowano także przypadki, w których mimo wykorzystania tego samego modelu infekcji uzyskiwano rozbieżne rezultaty dotyczące roli limfocytów CD4+ w generowaniu odpowiedzi limfocytów CD8+ [88]. Wszystkie wirusowe i bakteryjne patogeny niosą ligandy PRR (m. in. LPS, CpG, DNA, flagellinę), dzięki którym mogą wzbudzać odpowiedź zapalną i prowadzić do aktywacji APC. Nadal nie jest więc jasne, które z interakcji miedzy PAMP i PRR sprawiają, że aktywacja APC jest zależna lub niezależna od limfocytów Th. W przypadku infekcji patogenami niosącymi słabe ligandy PRR, limfocyty CD4+ wspomagają dojrzewanie APC poprzez regulację ekspresji cząsteczek kostymulatorowych oraz zapewnianie trzeciego sygnału ze strony cytokin takich jak IL-12. Infekcje patogenami, które indukują słabą syntezę IFN typu I mogą również wymagać obecności limfocytów pomocniczych do wytworze- nia trzeciego sygnału dla limfocytów cytotoksycznych poprzez indukcję wytwarzania IL-12 w komórkach dendrytycznych. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych, infekcje patogenami, które wywołują silną odpowiedź zapalną i produkcję wysokich stężeń IFN typu I wiążą się z wystarczającą regulacją ekspresji cząsteczek kostymulatorowych na komórkach prezentujących antygen, w związku z czym udział limfocytów CD4+ w ich dojrzewaniu nie jest wymagany [9]. 5. Pamięć immunologiczna Bardzo ważnym aspektem przebiegu swoistej odpowiedzi immunologicznej jest indukcja pamięci immunologicznej. Komórki pamięci są komórkami potomnymi naiwnych limfocytów, które uległy klonalnej ekspansji w trakcie odpowiedzi immunologicznej i przetrwały po wyeliminowaniu antygenu. Zapewniają one natychmiastową ochronę organizmu przy ponownym kontakcie z danym antygenem. Limfocyty T pamięci zdecydowanie różnią się od limfocytów T naiwnych, ponieważ odpowiadają na niższe stężenia antygenu, produkują szerszy wachlarz antywirusowych oraz prozapalnych cytokin, wzbudzają szybką cytoli- ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH tyczną aktywność oraz skuteczniej migrują do innych tkanek objętych infekcją [69]. Udowodniono również, że dzielą się one w znacznie szybszym tempie niż limfocyty T naiwne tuż po rozpoczęciu infekcji wirusowej, ale podobnie jak one wykazują 48–72-godzinną fazę opóźnienia, w której nie ulegają podziałom [87]. Komórki T pamięci dzielą się na dwie grupy. Pierwszą z nich stanowią efektorowe limfocyty T pamięci (TEM), które rezydują w tkankach lub krążą po organizmie. Są one odpowiedzialne za natychmiastową obronę organizmu przed patogenami ze względu na zachowaną gotowość do pełnienia funkcji efektorowej. Do drugiej grupy należą limfocyty TCM, centralne limfocyty pamięci, które nadzorują obwodowe tkanki limfoidalne, gdzie mogą proliferować w odpowiedzi na prezentację antygenu przez APC [69]. Komórki pamięci stanowią jedynie niewielką frakcję limfocytów powstałych podczas odpowiedzi immunologicznej. Stosunek prekursorów limfocytów efektorowych i pamięci zależy od różnej ekspresji czynników transkrypcyjnych, na którą wpływają z kolei stymulacja przez antygen, cytokiny i wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne. W toku analiz naiwnych limfocytów T znakowanych genetycznymi znacznikami w warunkach lokalnej i systemowej infekcji wykazano, że, niezależnie od warunków, jednocześnie zachodzi różnicowanie do obu typów komórek [28]. Czas życia limfocytów pamięci oraz ich liczba zależą od poziomu cytokin. W przypadku limfocytów pamięci CD4+ i CD8+, cytokinami umożliwiającymi ich przetrwanie są IL-7 i IL-15, indukujące proliferację [78]. Sun i wsp. [76] w badaniach z wykorzystaniem myszy laboratoryjnych pozbawionych limfocytów CD4+ wykazali, że właśnie limfocyty CD4+ są odpowiedzialne nie tylko za dostarczanie trzeciego sygnału indukcji niezbędnego do różnicowania limfocytów Tc, ale również za utrzymanie populacji limfocytów CD8+ pamięci. Za populację długożyjących limfocytów T pamięci uważa się limfocyty TCM, w związku z czym obecnie prowadzi się intensywne badania nad opracowaniem leków sprzyjających różnicowaniu limfocytów naiwnych CD4+ do komórek pamięci tego typu­. Araki i wsp. [5] dowiedli, że rapamycyna, obniżając aktywność kinazy treoninowo-serynowej mTOR będącej sensorem różnych czynników środowiskowych i regulatorem metabolizmu komórkowego, wpływa na przyspieszoną konwersję naiwnych limfocytów T do limfocytów TCM. 35 w taki sposób, aby stymulować odpowiedź humoralną skierowaną przeciw powierzchniowym cząsteczkom komórek bakteryjnych czy wirusów. Dowiedziono jednak, że odpowiedź taka jest nieskuteczna w wywoływaniu odporności przeciw patogenom wewnątrz­ komórkowym [16]. Preparaty nowej generacji powinny wzbudzać odpowiedź typu komórkowego z udziałem limfocytów Th oraz Tc, gdyż jedynie te komórki mogą wywoływać ochronę przed patogenami, które wykazują dużą zmienność serotypową (adenowirusy), prowadzą wewnątrzkomórkowy tryb życia lub które cechuje zdolność do wytwarzania form latentnych (np. HIV, Herpex, HBV, HCV, Helicobacter pylori, Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Salmonella enterica, Brucella spp., Burkholderia spp.). Należy podkreślić, że ten typ odpowiedzi chroni także przed rozwojem nowotworów lub chorobami auto­ immunizacyjnymi. Najnowsze badania dotyczące odpowiedzi immunologicznej myszy zakażonych prątkami gruźlicy dowodzą, że limfocyty B mogą regulować przebieg infekcji M. tuberculosis poprzez produkcję cytokin czy przeciwciał, jednak ich rola w kontroli zakażenia jest poboczna [83]. Limfocyty B mogą mieć jedynie ograniczony kontakt z antygenami prątków tuż przed ich wniknięciem do komórki gospodarza lub w czasie ich rozprzestrzeniania między komórkami. Szczepionki indukujące odpowiedź komórkową muszą być konstruowane w sposób umożliwiający dostarczenie antygenu do APC, dzięki czemu będzie on prezentowany w kontekście cząsteczek MHC na powierzchni komórki. Głównym zadaniem współczesnej wakcynologii jest opracowanie preparatów wzbudzających odpowiedź typu komórkowego. Nowe szczepionki powinny być więc konstruowane tak, aby wybiórczo aktywować limfocyty T o określonym fenotypie i w ściśle okreś­lonej lokalizacji. Najważniejszym aspektem badań jest opracowanie metod generowania stabilnej puli limfocytów T pamięci prawidłowo umiejscowionych w szczepionym organizmie w taki sposób, aby wektor szczepionkowy był jak najbardziej bezpieczny dla szczepionego organizmu, a patogen w przypadku infekcji był jak najszybciej usuwany. W celu dobrania warunków sprzyjających wywoływaniu długotrwałej odporności szczepionego organizmu opracowano szereg systemów dostarczania antygenu, do których należą szczepionki podjednostkowe kierowane i wzmacniane przy udziale adiuwantów oraz szczepionki wektorowe wykorzystujące wirusy oraz żywe atenuowane lub niewirulentne bakterie. 6.Szczepionki indukujące odpowiedź typu komórkowego 7. Szczepionki podjednostkowe Preparaty szczepionkowe konstruowane w przesz­ łości oparte na inaktywowanych organizmach lub produkowanych przez nie białkach zostały zaprojektowane Próby opracowania nowych szczepionek podjednostkowych podyktowane są wzrastającym zapotrzebowaniem na szczepionki bardzo dobrze zdefiniowane 36 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI pod względem molekularnym, które zastąpią preparaty oparte na całych inaktywowanych patogenach zawierających wiele antygenów jednocześnie. Obecnie podejmuje się próby konstrukcji szczepionek opartych na wybranych antygenach będących celem dla układu odpornościowego, a nawet na ich najbardziej immunogennych, pojedynczych peptydach zwanych epitopami, pochodzących od czynnika infekcyjnego, komórki nowotworowej bądź alergenu. Szczepionki o minimalnej zawartości antygenów, cechujące się jednocześnie wysoką specyficznością opracowywane są na podstawie wysokoprzepustowych analiz in silico lub eksperymentalnych metod mapowania epitopów [49]. Docelowe preparaty mogą być wprowadzane jako oczyszczone białko, peptyd lub niebiałkowy składnik patogenu bądź ulegać ekspresji z wektora plazmidowego lub zrekombinowanego wirusa. Poszukiwanie podjednostkowych szczepionek stanowi obecnie ważny trend współczesnej wakcynologii. Większość opracowywanych szczepionek wywołujących odporność przeciw leiszmaniozom wywoływanym przez wiciowce z rodziny Leishmania ma podjednostkową formę. Dowiedziono skutecz­ności zastosowania szczepionki zawierającej białko gp63 z adiuwantem hsp70, która powodowała wzrost poziomu IFN-γ oraz obniżenie ekspresji IL-4 i IL-10 w surowicy myszy laboratoryjnych [42]. Trwają również prace nad szczepionką podjednostkową wywołującą odporność przeciw Chlamydia muridarum, w której wykorzystano główne białko błony zewnętrznej MOMP [81] czy przeciw F. tularensis, w której białko szoku cieplnego DnaK połączono z powierzchniowym białkiem patogenu Tul4 [7]. Obie szczepionki stymulowały wydzielanie IFN-γ oraz produkcję przeciwciał. W drugą fazę badań klinicznych wchodzi obecnie szczepionka H56 przeciw M. tuberculosis zawierająca trzy gruźlicze antygeny: Ag85B, ESAT-6 oraz białko stanu latencji Rv2660c, jak również adiuwant IC31, która w myszach wzbudza silną odpowiedź limfocytów CD4+ i powstrzymuje reaktywację latentnej formy gruźlicy [86]. W ciągu ostatnich 20 lat najwięcej uwagi poświęcono konstrukcji szczepionek DNA, które z powodzeniem wprowadzono do użytku w weterynarii m.in. do prewencji zakażeń łososi wodnymi rabdowirusami [26] czy zachorowań psów na czerniaka złośliwego jamy ustnej [33]. Pomimo sukcesu szczepionek DNA o weterynaryjnym zastosowaniu, istnieje silna potrzeba optymalizacji warunków ich użycia do szczepienia ludzi. Podejmowane są liczne próby opracowania wektorów DNA – sukcesem zakończyła się między innymi druga faza badań klinicznych ludzkiej terapeutycznej szczepionki DNA VGX-3100 w postaci plazmidu kodującego antygeny E6/E7 wirusów HPV 16 i HPV 18 dostarczanego przy pomocy elektroporacji in vivo (dane National Cancer Institute z lipca 2014 roku). Podanie szczepionki kobietom, u których wykryto raka szyjki macicy typu CIN 2/3 doprowadziło do indukcji limfocytów T cytotoksycznych i znacznego ograniczenia wzrostu nowotworu lub jego zaniku [10]. 8. Adiuwanty Molekularna formuła szczepionkowa często bywa słabo immunogenna, co sprawia, że poszukiwane są odpowiednie adiuwanty, formuły szczepionkowe oraz wektory wzmagające poziom odpowiedzi komórkowej. Adiuwantem szczepionkowym określa się składnik, który może wspomagać efektywność szczepionki poprzez indukcję silnej odpowiedzi immunologicznej. Koncepcja zastosowania adiuwantów została zaproponowana w 1925 roku przez Ramona, który zaobserwował, że dodanie do szczepionek tężcowej i błoniczej substancji takich jak agar, tapioka, lecytyna, olej krochmalowy czy saponina powoduje wzrost miana specyficznych przeciwciał [71]. Jednocześnie, w 1926 roku, Glenny i wsp. zaobserwowali, że nanoszenie antygenu na nierozpuszczalne cząsteczki związków glinu przed immunizacją generuje lepszą odpowiedź za pośrednictwem przeciwciał niż w przypadku zastosowania rozpuszczalnej formy immunogennego białka [51]. Od tego odkrycia związki glinu były bardzo powszechnie wykorzystywane do wzmagania odpowiedzi immunologicznej. Zastosowanie adiuwantów w wakcynologii jest bardzo szerokie – są one wykorzystywane do modulowania odpowiedzi immunologicznej poprzez dostarczanie antygenu w natywnej formie, redukują potrzebę wieloetapowej immunizacji i obniżają tym samym jej koszty, a także przyczyniają się do wzmożonej odpowiedzi u dzieci lub dorosłych pacjentów z obniżoną odpornością [1]. Mogą być również podzielone na 2 klasy w zależności od dominującego mechanizmu działania na: a) systemy nośnikowe oraz b) wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej. Systemy nośnikowe koncentrują antygen i prezentują go w zorganizowanej formie, podczas gdy wzmacniacze aktywują mechanizmy wrodzonej odpowiedzi immunologicznej [53]. Efektami działania adiuwantów są: wzrost produkcji przeciwciał i zwiększenie populacji antygenowo-specyficznych limfocytów T, wydłużenie czasu trwania odpowiedzi, wzmocniona ochrona przeciw różnym wariantom tego samego patogenu czy zmniejszona liczba dawek wymaganych do uzyskania ochronnego poziomu przeciwciał czy limfocytów pamięci. Tabela II przygotowana według publikacji przeglądowej Mohan i wsp. [53] przedstawia listę znanych adiuwantów oraz mechanizmy ich działania. Wyniki najnowszych badań nad zastosowaniem no­wo­czesnych systemów adiuwantów wspomagających indukcję odpowiedzi immunologicznej przez szczepionki ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH 37 Tabela II Adiuwanty szczepionkowe Typ Formuła Działanie SOLE ALUMINIUM fosforan aluminium, wodorotlenek aluminium spowalnianie tempa uwalniania antygenu, wydłużanie kontaktu antygenu z układem immunologicznym, stymulowanie odpowiedzi limfocytów Th2 INNE SOLE MINERALNE, sole wapnia, żelaza, cyrkonu np. fosforan wapnia KOMPLETNY ADIUWANT FREUNDA inaktywowane termicznie komórki z rodzaju Mycobacterium EMULSJE (niekompletny adiuwant typu „olej w wodzie” i „woda w oleju” Freunda, montanid, MF59, adiuwant 65) ułatwiona adsorpcja antygenu, indukcja wysokiego poziomu przeciwciał IgG stymulacja komórkowej odpowiedzi immunologicznej oraz produkcji IgG i IgA stymulacja limfocytów B i Tc BAKTERYJNE TOKSYNY: toksyna CT mieszana lub koniugowana z antygenami Vibrio cholerae śluzówkowymi toksyna PT inaktywowane komórki B. pertussis Bordetella pertussis (mieszanina toksyny zawiera LPS) toksyna A i B oczyszczony preparat Clostridium difficile toksyna STx oczyszczony preparat Schigella dysenteriae enterotoksyny oczyszczony preparat Staphylococcus NIETOKSYCZNE BIAŁKA: wzmaganie immunogenności słabych antygenów wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej zwiększanie poziomu przeciwciał IgA wzmaganie odpowiedzi humoralnej i komórkowej zwiększanie poziomu przeciwciał IgG i IgA lipopeptydy izolowane z bakteryjnych lipoprotein dipeptyd muramylowy izolacja ze ściany komórkowej mykobakterii (MDP) adiuwanty przy szczepieniach drogą pokarmową stymulacja niespecyficznych mechanizmów skierowanych przeciw bakteriom i komórkom rakowym proteosomy niejednorodne preparaty błony zewnętrznej meningokoków zwiększanie poziomu IgA LIPOSOMY syntetyczne sfery składające się z warstwy lipidowej otaczającej antygen wzmaganie humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej ŚRODKI POWIERZCH- NIOWO CZYNNE składnik detergentu saponiny izolowanej z Quillaja saponaria wzmaganie odpowiedzi przeciw T-zależnym i T-niezależnym antygenom (Quil-A) KOMPLEKSY cząstki formowane podczas mieszania IMMUNOSTYMULUJĄCE cholesterolu z Quil-A (ISCOM) stymulacja produkcji immunoglobulin wszystkich klas, wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej, w tym odpowiedzi CTL ADIUWANTY złożone związki wodorowęglanowe naturalnego indukcja humoralnej i komórkowej odpowiedzi WODOROWĘGLANOWE pochodzenia, np. γ-inulina immunologicznej OLIGONUKLEOTYDY niemetylowane dinukleotydy CpG obecne CpG w DNA bakterii bezpośrednia aktywacja limfocytów B i komórek dendrytycznych poprzez receptory TLR9, wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej WZORCE MOLEKU- składniki komórkowe bakterii lub ich LARNE lub ich pochodne chemicznie uzyskiwane pochodne (np. MPL wzmaganie wrodzonych mechanizmów immunologicznych (fagocytozy, wydzielana prostaglandyn, rekrutacji komórek stanu zapalnego) oraz humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej (LPS, MPL, peptydo- glikan, flagellina, kwasy lipotejchojowe) – lipid A Salmonella minnesota pozbawiony grupy (R)-3-hydroksydekanoilowej CYTOKINY GM-CSF – INF – IL-1 – IL-2 – IL-6 – indukcja migracji komórek dendrytycznych, zwiększenie ekspresji MHC I na ich powierzchni indukcja proliferacji komórek T, aktywacja komórek NK, modulowanie produkcji cytokin rekrutacja neutrofili do miejsca stanu zapalnego wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej limfocytów CD4+ stymulacja limfocytów B 38 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI Tabela II c.d. Typ Formuła Działanie IL-12 – IL-15 – IL-18 – indukcja komórek NK oraz limfocytów B i T indukcja komórek NK oraz limfocytów T wzmaganie proliferacji komórek NK oraz limfocytów CD8+ CHEMOKINY wzmaganie wrodzonych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej – POLIMERY biodegradowalne – (poliliaktydy PLA, PLG) adsorpcja antygenów na powierzchni lub ich zamknięcie wewnątrz, stopniowe uwalnianie antygenu niedegradowalne (złoto, – lateks, krzem, polistyren) usprawnianie dostarczania antygenu do wnętrza komórek prezentujących antygen WIRUSOWE wirosomy struktury powstałe z połączenia lipidów błonowych z białkami błonowymi wirionu dostarczanie antygenu do wnętrza komórek prezentujących antygen VLP wielkocząsteczkowe kompleksy białek kapsydu wzmaganie odpowiedzi humoralnej i komórkowej (ang. virus-like particles) nie zawierającego informacji genetycznej DNA u ludzi są obiecujące. W badaniach klinicznych przetestowano już dużą liczbę adiuwantów będących celami receptorów Toll-like takich jak TLR4 lub TLR9. W Stanach Zjednoczonych w 2006 roku za drugi po związkach glinu adiuwant dopuszczony do użytku w licencjonowanych ludzkich szczepionkach uznano monofosfolipid-A (MPL), który jest agonistą TLR4 [29]. W Europie dopuszczone jest również stosowanie wirosomów, cząstek VLP (virus-like particles) i emulsji typu „olej w wodzie” takich jak MF59, AS03 i AF03 [25]. Pozytywne wyniki daje zastosowanie adiuwantów cytokinowych – testuje się między innymi podanie interleukiny-12 stymulującej różnicowanie aktywowanych naiwnych limfocytów T do populacji limfocytów Th1 czy czynnika wzrostu makrofagów GM-CSF, który indukuje dojrzewanie APC [24]. Należy zaznaczyć, że wybór adiuwanta może znacząco wpłynąć na ostateczny wynik szczepienia. Ota i wsp. [59] udowodnili, że obecność glinu w składzie szczepionek używanych w Rozszerzonym Programie Szczepień WHO (Expanded Programme of Immunization, EPI) spowodowała obniżenie skuteczności szczepionki MVA85B stosowanej w immunizacji noworodków przeciw gruźlicy. Adiuwanty mogą być z powodzeniem wykorzystywane jako składnik kompleksowego szczepienia podjednostkowymi szczepionkami w immunizacji typu „prime-boost”, która wzmacnia odporność organizmu uprzednio traktowanego szczepionką wektorową. Dzięki tej technice pokonany może być problem pojawiającej się odporności na zastosowany wektor. Lin i wsp. [46] wykazali, że podanie szczepionki H56 w kompleksie z adiuwantem IC31 opóźnia i osłabia objawy kliniczne gruźlicy, a także zapobiega reaktywacji uśpionej infekcji w makakach uprzednio immunizowanych szczepem BCG i eksponowanych na działanie M. tuberculosis. 9. Szczepionki wektorowe Szczepionki wektorowe dostarczają antygeny do komórek prezentujących antygen wykorzystując orga­ nizmy posiadające naturalną zdolność do wnikania do wnętrza komórki eukariotycznej, takie jak wirusy czy bakterie. Spośród wszystkich znanych typów szczepionek, szczepionki oparte na żywych atenuowanych mikroorganizmach najskuteczniej indukują komórkowe mechanizmy odporności, przy czym w najwyższym stopniu modulują odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T. Skutecznie wzbudzają również syntezę przeciwciał, a niekwestionowaną zaletą ich użycia jest możliwość podania bez użycia strzykawki [70, 82]. Śmierć zainfekowanej komórki dodatkowo promuje fagocytozę przez komórki APC, co przyczynia się do zwiększonej prezentacji antygenu. Wektory oparte na wirusach lub bakteriach za sprawą niesionych przez nie wzorców molekularnych, takich jak LPS, CpG czy flagellina, mają ponadto właściwości auto-adiuwantów, dzięki czemu wzmagana jest prezentacja heterologicznego antygenu. Zgodnie z naturalnym cyklem życiowym, wektory wirusowe posiadają zdolność do efektywnego wnikania do ludzkich komórek i do wewnątrzkomórkowej ekspresji niesionych genów. Naśladowanie infekcji ułatwia indukcję silnej odpowiedzi limfocytów T, w tym limfocytów cytotoksycznych, dzięki czemu indukowane jest powstawanie limfocytów T pamięci i trwała odporność przeciw patogenom wewnątrzkomórkowym. Do konstrukcji szczepionek wykorzystywane są zarówno replikujące, jak i niezdolne do replikacji wirusy, takie jak: pokswirusy, adenowirusy, alfawirusy, flawiwirusy, pikornawirusy czy paramykso­wirusy. Wybór odpowiedniego wirusowego wektora zależy od charakterystyki ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH patogenu, przeciw któremu wywoływana jest odpowiedź oraz od tego czy szczepionka ma powodować całkowitą immunizację lub być stosowana w modelu „prime-boost”. Większość wektorów wirusowych będących przedmiotem badań klinicznych opiera się na atenuowanych adenowirusach lub zmodyfikowanym wirusie Ankara (MVA). Adenowirusy dzięki zdolności do replikacji w ludzkich komórkach wydłużają ekspresję antygenu i jego prezentację na komórkach APC, co przyczynia się do wzmożonej odpowiedzi humoralnej i komórkowej. Duża powszechność infekcji adenowirusowych powoduje jednak, że zachodzi skierowana przeciw wektorowi odpowiedź immunologiczna skutkująca szybkim usuwaniem wirusa i obniżoną immunogen­ noś­cią szczepionki [18]. Dwie szczepionki oparte na adenowirusach 35 i 5 eksprymujących antygen Ag85A M. tuberculosis są obecnie w fazie II niezależnych od siebie badań klinicznych w Republice Południowej Afryki [38, 72]. Dowiedziona została ich skuteczność w indukowaniu odporności pacjentów uprzednio szczepionych BCG i wzmaganiu produkcji IFN-γ przez komórki Th i Tc. Podobnie jak w przypadku adenowirusów, niereplikujący wirus MVA ma duży potencjał do indukcji limfocytów CD4+. MVA85A jako pierwsza szczepionka na bazie tego wirusa osiągnęła fazę II b badań klinicznych. Badania z udziałem dzieci nie potwierdziły jednak skuteczności szczepionki, natomiast dowiodły zdolności wektora do wzmagania syntezy IFN-γ [79]. Wykorzystanie wektorów wirusowych niesie za sobą pewne ograniczenia, do których zalicza się trudności w produkcji na dużą skalę, ograniczoną wielkość informacji genetycznej pakowanej do kapsydu niektórych wirusów, odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw samemu wektorowi oraz brak możliwości transdukcji do niektórych typów komórek. Co więcej, wirusy wyzwalają silną odpowiedź zapalną, a integracja do genomu gospodarza może przyczyniać się nawet do wytworzenia stanów chorobowych takich jak białaczka [80]. Alternatywą dla użycia wektorów na bazie wirusów jest wykorzystanie komórek bakteryjnych. W ciągu ostatniego półwiecza postępy w biologii molekularnej i rozumieniu bakteryjnych cykli życiowych przyczyniły się do znacznego postępu w pracach nad stworzeniem wektorów bakteryjnych zdolnych do dostarczania heterologicznych antygenów do komórek APC in vivo. Poznano drogi trwałej i dobrze scharakteryzowanej atenuacji genów wirulencji, możliwa stała się regulacja poziomu ekspresji i lokalizacji antygenu niesionego przez komórkę bakteryjną, opracowano różne drogi podania bakteryjnego preparatu szczepionkowego, a co więcej określono potencjał do wzbudzania wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Dużą zaletą wykorzystania żywych wektorów bakteryjnych jest zdolność do naśladowania naturalnej 39 infekcji, dzięki czemu aktywowana może być zarówno niespecyficzna odpowiedź prozapalna, jak i, w przypadku użycia modyfikowanych szczepów wnikających do komórek APC, antygenowo specyficzna odpowiedź komórkowa. Bakteryjne wektory dzięki jednoczesnemu dostarczaniu sygnału antygenowego oraz wzorców molekularnych związanych z patogenami lub ligandów TLR umożliwiają przełamanie stanu tolerancji orga­ nizmu wobec antygenu, co jest podstawowym założeniem immunoterapii opierającej się na odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T. Rozpoznanie niesionych przez komórki APC wzorców prowadzi do pozytywnej regulacji ekspresji cząsteczek kostymulatorowych na powierzchni, dojrzewania i migracji komórek APC, co wzmacnia odpowiedź immunologiczną przeciw dostarczanemu antygenowi. Inną zaletą nośników antygenowych na bazie bakterii jest to, że mogą one być zaprojektowane w taki sposób, aby wywoływać odporność przeciw własnym bądź eksprymowanym heterologicznie antygenom, a składniki szczepionkowe mogą być dostarczone w formie białka, DNA lub terapeutyku. 10. Bakterie patogenne jako wektory szczepionkowe Od lat 80. XX wieku podejmowane są liczne próby wykorzystania żywych wektorów bakteryjnych do dostarczania antygenów. Wykorzystują one naturalną zdolność wirulentnych bakterii do wnikania do wnętrza komórek eukariotycznych, dzięki czemu dostarczony antygen może wywoływać komórkową odpowiedź immunologiczną. Do konstrukcji żywych, atenuowanych szczepionek wykorzystuje się bakterie Shigella flexneri [90, 92], S. enterica [19, 65], Yersinia enterocolitica [3], Listeria monocytogenes [44, 50], Mycobacterium bovis BCG [6, 32] i wiele innych. Do tej pory jedynie dwie szczepionki pozytywnie przeszły testy kliniczne i zostały dopuszczone do użytku [21]. Pierwsza z nich, szczepionka Ty21 uodparniająca na dur brzuszny, zawiera żywe atenuowane bakterie Salmonella ser. Typhi podawane doustnie w 3 dawkach w formie płynu lub kwasoodpornych kapsułek. Drugą dostępną szczepionką jest CVD 103-HgR immunizująca przeciw cholerze, która niesie atenuowane komórki V. cholerae podawane w płynnej formie w jednej dawce. Obecnie trwają testy kliniczne kilku innych szczepionek przeciw patogenom wewnątrzkomórkowym lub nowotworom. Warta uwagi jest szczepionka VPM1002 będąca w fazie II a badań klinicznych, która poprawia immunogenność szczepu BCG. Opiera się ona na szczepie BCG zmodyfikowanym poprzez wstawienie genu hly kodującego główny czynnik patogenezy L. monocytogenes, listeriolizynę O oraz delecję genu ureC kodującego ureazę C (BCGΔureChly+). Listeriolizyna O (LLO) umożliwia ucieczkę z wakuoli do cytoplazmy 40 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI zainfekowanej komórki, natomiast delecja ureazy powoduje odpowiednie dla aktywności LLO zakwaszenie wakuoli komórki. Dzięki wprowadzonym zmianom szczep BCG efektywnie ucieka z fagosomu zainfekowanej komórki i przyczynia się do wzmożonej prezentacji antygenu [32]. Zakończyła się również druga faza badań klinicznych szczepionki terapeutycznej ADXS‑HPV bazującej na bakterii L. monocytogenes, która ma na celu leczenie pacjentek chorujących na raka szyjki macicy wywołanego przez wirus HPV. Atenuowany szczep bakteryjny wydzielający jednocześ­ nie fuzyjne białko kodujące antygen E7 w fuzji z niehemolityczną częścią LLO i adiuwant okazał się mieć skuteczność porównywalną do chemioterapii [50]. W toku licznych badań opracowywane są metody trwałej atenuacji, która w jak najmniejszym stopniu wpływa na immunogenność szczepów bakteryjnych. Ten proces w wielu przypadkach jest jednak bardzo trudny, długotrwały i żmudny, a największe wyzwanie stanowi zachowanie równowagi między minimalną patogennością szczepu a maksymalną zdolnością do indukcji odpowiedzi immunologicznej. Podczas opracowywania nowych wektorów dużą uwagę należy zwracać na fakt, że w zależności od typu modyfikacji można uzyskać zróżnicowaną reakcję odpornościową, np. doustne podanie mutanta PhoP Salmonella skutkuje indukcją mechanizmów odporności wrodzonej, podczas gdy mutanty aroA wzmacniają odpowiedź limfocytów Th1 [84]. Co więcej, atenuowane szczepy nie są odpowiednimi wektorami szczepionkowymi dla osób o niskiej lub upośledzonej odporności takich jak dzieci, ludzie starsi czy zakażeni wirusem HIV czy dla pacjentów skłonnych do chorób autoimmunizacyjnych. 11. Bakterie niepatogenne jako wektory szczepionkowe W związku z licznymi zagrożeniami związanymi z wykorzystaniem patogennych bakterii do konstrukcji szczepionek, uwaga badaczy zwróciła się ku wykorzystaniu niewirulentnych gatunków. W przeciwieństwie do atenuowanych, zazwyczaj Gram-ujemnych patogennych szczepów bakterii takich jak Shigella czy Salmonella, Gram-dodatnie niewirulentne gatunki są bezpieczne, ponieważ stanowią naturalny składnik flory bakteryjnej człowieka lub są powszechnie wykorzystywane przez człowieka w przemyśle. W opracowaniu wektorów z ich użyciem często wykorzystywana jest unikalna cecha bakterii Gram-dodatnich, jaką jest zdolność do tworzenia endospor. Obecnie najczęściej podejmowane są próby konstrukcji niewirulentnych wektorów bakteryjnych z wykorzystaniem wegetatywnych bakterii kwasu mlekowego (LAB), m.in. Lactococcus lactis [66, 91], Lactobacillus plantarum [31], Lactobacillus casei [45] czy Streptococcus gordonii [12], a także spor modelowej bakterii Gram-dodatniej, B. subtilis [37, 57, 58]. Główną wadą systemów wykorzystujących niewirulentne gatunki jest brak inwazyjności, co sprawia, że dostarczanie antygenu może być mniej efektywne niż w przypadku wykorzystania patogennych bak­ terii. Sposobem na rozwiązanie tego problemu może być ekspresja determinantów patogenezy wirulentnych szczepów w gatunkach niepatogennych. Wśród białek, których aktywność prowadzi do wniknięcia do komórki eukariotycznej oraz ucieczki z fagosomu do cytoplazmy są czynniki wirulencji wewnątrzkomórkowego patogenu L. monocytogenes. Guimaraes i wsp. [34] opracowali szczep L. lactis produkujący zakotwiczoną w ścianie komórkowej internalinę A L. monocytogenes, który był zdolny do inwazji do komórek eukariotycznych in vitro i in vivo. Samo wniknięcie wektora do komórki gospodarza nie wystarcza jednak do tego, aby antygen był prezentowany w kompleksie z MHC klasy I i by w konsekwencji wzbudzona została odpowiedź limfocytów CD8+. Jednym ze sposobów na dostarczenie antygenu do cytoplazmy APC jest również ekspresja listeriolizyny O, głównego czynnika patogenezy L. monocytogenes, który umożliwia translokację komórki bakteryjnej z wakuoli komórki gospodarza do jej cytoplazmy. Za początek badań w tym obszarze uznaje się odkrycie prof. Bieleckiego i wsp. [14], którzy dowiedli, że B. subtilis wytwarzający LLO jest zdolny do wniknięcia do niefagocytujących i fagocytujących komórek eukariotycznych, ucieczki z ich wakuoli do cytoplazmy komórki gospodarza i przetrwania w jej wnętrzu. Toksyna swoje właściwości zawdzięcza specyficznej strukturze. Białko o masie 58 kDa ulega sekrecji poza komórkę bakteryjną w postaci rozpuszczalnych w wodzie monomerów, które mogą wiązać się do błon biologicznych zawierających cholesterol i oligomeryzować do struktury β-baryłki, tworząc w błonie pory. LLO jest aktywna jedynie w kwaśnym pH, co ogranicza zakres jej działalności do wakuoli komórki gospodarza i w ten sposób chroni ją przed śmiercią [77]. W trakcie infekcji L. monocytogenes odpowiedź limfocytów Th i Tc jest skierowana przeciwko LLO [27]. Permeabilizująca aktywność toksyny umożliwia dostęp heterologicznych antygenów do cytozolu i ich wejście na egzogenną TAP‑zależną ścieżkę prezentacji białka. Prezentowany w kontekście MHC klasy I antygen jest rozpoznawany przez limfocyty CD4+ i CD8+, co prowadzi do kompleksowej odpowiedzi komórkowej. Koekspresja LLO z innymi antygenami jest intensywnie wykorzystywana w badaniach nad konstrukcją żywych szczepionek. Bahey-el-Din i wsp. [11] w badaniach z wykorzystaniem zakażonych myszy wykazali, że jednoczesna ekspresja LLO z białkiem p60 w L. lactis skutecznie wywołuje odpowiedź limfocytów Tc, a także zapewnia ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH odporność na infekcje L. monocytogenes. Trwają także zaawansowane badania kliniczne nad modyfikowaną szczepionką przeciwgruźliczą BCGΔureChly+, w której toksyna dzięki swej aktywności wzmaga prezentację antygenów M. tuberculosis i generowaną dzięki niej pamięć immunologiczną [32]. Aktywność LLO wykorzystywana jest również przy opracowywaniu szczepionek przeciwnowotworowych – Radford i wsp. [63, 64] wykazali, że komórki Escherichia coli produkujące LLO oraz owoalbuminę jaja kurzego (OVA) są zdolne do usunięcia komórek czerniaka linii B16-OVA oraz skutecznie zapobiegają wzrostowi nowotworu. Bardzo interesującą cechą listeriolizyny O jest fakt, że jednocześnie stanowi ona główny czynnik patogenezy oraz główny immunogen, co sprawia, że jest ona idealnym kandydatem na adiuwant szczepionkowy. Poddanie APC działaniu nanomolarnych, niemających cytotoksycznego efektu, stężeń cytolizyny powodowało aktywację limfocytów CD8+, podczas gdy pikomolarne stężenia wystarczały do zaobserwowania aktywacji komórek CD4+ [15]. Co więcej, zainfekowane komórki i rozpoznające je limfocyty T w obecności LLO produkują szerokie spektrum cytokin i chemokin takich jak IL-1, IL-6, IL-12, CCL2, IFN-β czy TNF-α, które aktywują APC i wzmacniają odporność wrodzoną oraz odpowiedź limfocytów Th1 [60]. Huang i wsp. [39] w badaniach z wykorzystaniem spor B. subtilis koeks­prymujących LLO z antygenem protekcyjnym PA Bacillus anthracis potwierdzili wpływ LLO na poprawę odpowiedzi odpornościowej. Zaobserwowali, że spory powodowały wzrost poziomu przeciwciał IgG2a PA swoistych oraz poziomu IFN-γ i IL-12 przy jednocześnie zmniejszonym stężeniu IL-4 w surowicy myszy, co świadczy o wzmożonej odpowiedzi typu Th1. Brak związku między cytotoksycznością a immunogennością czyni ponadto z LLO wyjątkowe białko w immuno­ terapii nowotworów. Aktywność cytotoksyczna może posłużyć do bezpośredniego zabijania komórek rakowych, natomiast ze względu na swoją immunogenność LLO może mieć również aktywność adiuwantową wykorzystaną przy konstrukcji szczepionek zawierających antygeny nowotworowe, które indukują usuwanie komórek ulegających transformacji nowotworowej. Obie te cechy z powodzeniem mogą być wykorzystane jednocześnie. Stachowiak i wsp. [74] w swoich badaniach analizowali aktywność LLO względem komórek białaczkowych komórek T Jurkat, dowodząc ograniczonej selektywności toksyczności, która z powodzeniem może być zastosowana do niszczenia nowotworów przy zawężeniu obszaru działania do miejsc zawierających zmienione chorobowo komórki. Drugim sposobem umożliwiającym dostarczanie antygenów do cytoplazmy jest wykorzystanie systemu sekrecji typu 3 (T3SS). T3SS jest skomplikowanym aparatem, który umożliwia wielu Gram-ujemnym bak- 41 teriom, takim jak: S. enterica, Yersinia spp., Shigella spp., E. coli czy Pseudomonas aeruginosa dostarczanie białek efektorowych do cytoplazmy komórki gospodarza. Stworzenie minimalnego, funkcjonalnego systemu wymaga ekspresji ponad 20 genów. Pomimo to, z powodzeniem są one klonowane w niepatogennych bakteriach takich jak E. coli K12 [2] czy P. putida [89], stając się narzędziem do dostarczania antygenów i indukcji odpowiedzi limfocytów Tc. 12. Podsumowanie Początek XXI wieku przyniósł wiele nowych odkryć w dziedzinie wakcynologii, które dały początek wdrożeniu nowych preparatów szczepionkowych lub ich doprowadzeniem do zaawansowanych testów klinicznych. Dzięki zastosowaniu odwrotnej wakcynologii i znacznemu poszerzeniu wiedzy immunologicznej z zakresu prezentacji antygenu i indukcji trwałej pamięci immunologicznej testowane są obecnie liczne skierowane przeciw patogenom tj. HIV, malaria, M. tuberculosis czy S. aureus szczepionki, w opracowaniu których do tej pory zawodziły konwencjonalne metody. Nowatorskie wektory oraz adiuwanty mogą w znacznej mierze prowadzić do opracowania preparatów terapeutycznych do stosowania w leczeniu chorób nowotworowych, przewlekłych infekcji czy chorób autoimmunizacyjnych. Nowoczesne strategie mogą więc nie tyle wzmagać, ile modulować odpowiedź immunologiczną, prowadząc do osiągnięcia z góry zamierzonego efektu. Prowadzone obecnie testy kliniczne pokazują, że ważna jest nie tylko siła zachodzącej odpowiedzi i miejsce jej indukcji, ale również czas jej trwania oraz trwałość generowanej pamięci. Głównym wyzwaniem jest więc opracowanie skutecznych metod określania immunogenności patogennych i nowotworowych białek, która będzie miała przełożenie na skuteczną immunizację. Podziękowania Praca finansowana z grantów Narodowego Centrum Badań i Rozwoju (nr N R13 0046 06) oraz Narodowego Centrum Nauki (2013/09/N/NZ1/00182). Piśmiennictwo 1. Aguilar J.C., Rodriguez E.G.: Vaccine adjuvants revisited. Vaccine, 25, 3752–3762 (2007) 2. Akeda Y., Kimura T., Yamasaki A., Kodama T., Iida T., Honda T., Oishi K.: Functional cloning of Vibrio parahaemolyticus type III secretion system 1 in Escherichia coli K-12 strain as a molecular syringe. Biochem. Biophys. Res. Commun. 427, 242–247 (2012) 3.Al-Mariri A., Tibor A., Lestrate P., Mertens P., De Bolle X., Letesson J.J.: Yersinia enterocolitica as a vehicle for a naked DNA 42 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI vaccine encoding Brucella abortus bacterioferritin or P39 antigen. Infect. Immun. 70, 1915–1923 (2002) 4. Ansel K.M., Lee D.U., Rao A.: An epigenetic view of helper T cell differentiation. Nat. Immunol. 4, 616–623 (2003) 5.Araki K., Turner A.P., Shaffer V.O., Gangappa S., Keller S.A., Bachmann M.F., Larsen C.P., Ahmed R.: mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature, 460, 108–112 (2009) 6.Arbues A., Aguilo J.I., Gonzalo-Asensio J., Marinova D., Uranga S., Puentes E., Fernandez C., Parra A., Cardona P.J., Vilaplana C. et al.: Construction, characterization and preclinical evaluation of MTBVAC, the first live-attenuated M. tuberculosis-based vaccine to enter clinical trials. Vaccine, 31, 4867–4873 (2013) 7. Ashtekar A.R., Katz J., Xu Q., Michalek S.M.: A mucosal subunit vaccine protects against lethal respiratory infection with Francisella tularensis LVS. PLoS One, 7, e50460 (2012) 8. Auranen K., Rinta-Kokko H., Halloran M.E.: Estimating strain-specific and overall efficacy of polyvalent vaccines against recurrent pathogens from a cross-sectional study. Biometrics, 69, 235–244 (2013) 9.Bachmann M.F., Zinkernagel R.M., Oxenius A.: Immune responses in the absence of costimulation: viruses know the trick. J. Immunol. 161, 5791–5794 (1998) 10.Bagarazzi M.L., Yan J., Morrow M.P., Shen X., Parker R.L., Lee J.C., Giffear M., Pankhong P., Khan A.S., Broderick K.E. et al.: Immunotherapy against HPV16/18 generates potent TH1 and cytotoxic cellular immune responses. Sci. Transl. Med. 4, 155ra138 (2012) 11. Bahey-El-Din M., Casey P.G., Griffin B.T., Gahan C.G.: Expression of two Listeria monocytogenes antigens (P60 and LLO) in Lactococcus lactis and examination for use as live vaccine vectors. J. Med. Microbiol. 59, 904–912 (2010) 12.Beninati C., Oggioni M.R., Boccanera M., Spinosa M.R., Maggi T., Conti S., Magliani W., De Bernardis F., Teti G., Cassone A. et al.: Therapy of mucosal candidiasis by expression of an anti-idiotype in human commensal bacteria. Nat. Biotechnol. 18, 1060–1064 (2000) 13. Berche P.: Louis Pasteur, from crystals of life to vaccination. Clin. Microbiol. Infect. 18 Sup. 5, 1–6 (2012) 14. Bielecki J., Youngman P., Connelly P., Portnoy D.A.: Bacillus subtilis expressing a haemolysin gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells. Nature, 345, 175–176 (1990) 15. Carrero J.A., Vivanco-Cid H., Unanue E.R.: Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. PLoS One, 7, e32310 (2012) 16. Casadevall A., Pirofski L.A.: A reappraisal of humoral immunity based on mechanisms of antibody-mediated protection against intracellular pathogens. Adv. Immunol. 91, 1–44 (2006) 17.Chen W., Jin W., Hardegen N., Lei K.J., Li L., Marinos N., McGrady G., Wahl S.M.: Conversion of peripheral CD4+CD25-naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J. Exp. Med. 198, 1875– 1886 (2003) 18. Chirmule N., Propert K., Magosin S., Qian Y., Qian R., Wilson J.: Immune responses to adenovirus and adeno-associated virus in humans. Gene Ther. 6, 1574–1583 (1999) 19. Darji A., Guzman C.A., Gerstel B., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S.: Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell, 91, 765–775 (1997) 20. Delany I., Rappuoli R., De Gregorio E.: Vaccines for the 21st century. EMBO Mol. Med. 6, 708–720 (2014) 21. Dietrich G., Griot-Wenk M., Metcalfe I.C., Lang A.B., Viret J.F.: Experience with registered mucosal vaccines. Vaccine, 21, 678–683 (2003) 22. Dong C.: TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat. Rev. Immunol. 8, 337–348 (2008) 23. Duhen T., Geiger R., Jarrossay D., Lanzavecchia A., Sallusto F.: Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells. Nat. Immunol. 10, 857–863 (2009) 24.Flingai S., Czerwonko M., Goodman J., Kudchodkar S.B., Muthumani K., Weiner D.B.: Synthetic DNA vaccines: improved vaccine potency by electroporation and co-delivered genetic adjuvants. Front. Immunol. 4, 354 (2013) 25. Foged C., Hansen J., Agger E.M.: License to kill: Formulation requirements for optimal priming of CD8(+) CTL responses with particulate vaccine delivery systems. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 482–491 (2012) 26. Garver K.A., LaPatra S.E., Kurath G.: Efficacy of an infectious hematopoietic necrosis (IHN) virus DNA vaccine in Chinook Oncorhynchus tshawytscha and sockeye O. nerka salmon. Dis. Aquat. Organ. 64, 13–22 (2005) 27. Geginat G., Schenk S., Skoberne M., Goebel W., Hof H.: A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J. Immunol. 166, 1877–1884 (2001) 28.Gerlach C., van Heijst J.W., Swart E., Sie D., Armstrong N., Kerkhoven R.M., Zehn D., Bevan M.J., Schepers K., Schumacher .N.: One naive T cell, multiple fates in CD8+ T cell differentiation. J. Exp. Med. 207, 1235–1246 (2010) 29. Giannini S.L., Wettendorff M.A. i wsp.: Enhanced humoral and memory B cellular immunity using HPV16/18 L1 VLP vaccine formulated with the MPL/aluminium salt combination (AS04) compared to aluminium salt only. Vaccine, 24, 5937–5949 (2006) 30.Giuliani M.M., Adu-Bobie J., Comanducci M., Arico B., Savino S., Santini L., Brunelli B., Bambini S., Biolchi A., Capecchi B. et al.: A universal vaccine for serogroup B meningococcus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 10834–10839 (2006) 31. Grangette C., Muller-Alouf H., Goudercourt D., Geoffroy M.C., Turneer M., Mercenier A.: Mucosal immune responses and protection against tetanus toxin after intranasal immunization with recombinant Lactobacillus plantarum. Infect. Immun. 69, 1547–1553 (2001) 32. Grode L., Ganoza C.A., Brohm C., Weiner J., Eisele B., Kaufmann S.H.: Safety and immunogenicity of the recombinant BCG vaccine VPM1002 in a phase 1 open-label randomized clinical trial. Vaccine, 31, 1340–1348 (2013) 33.Grosenbaugh D.A., Wolchok J.D. i wsp.: Safety and efficacy of a xenogeneic DNA vaccine encoding for human tyrosinase as adjunctive treatment for oral malignant melanoma in dogs following surgical excision of the primary tumor. Am. J. Vet. Res. 72, 1631–1638 (2011) 34. Guimaraes V.D., Gabriel J.E., Lefevre F., Cabanes D., Gruss A., Cossart P., Azevedo V., Langella P.: Internalin-expressing Lactococcus lactis is able to invade small intestine of guinea pigs and deliver DNA into mammalian epithelial cells. Microbes. Infect. 7, 836–844 (2005) 35.Haribhai D., Williams C.B. i wsp.: A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity, 35, 109–122 (2011) 36. Harrington L.E., Hatton R.D., Mangan P.R., Turner H., Murphy T.L., Murphy K.M., Weaver C.T.: Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat. Immunol. 6, 1123–1132 (2005) 37. Hinc K., Stasilojc M., Piatek I., Peszynska-Sularz G., Isticato R., Ricca E., Obuchowski M., Iwanicki A.: Mucosal adjuvant activity of IL-2 presenting spores of Bacillus subtilis in a murine ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH model of Helicobacter pylori vaccination. PLoS One, 9, e95187 (2014) 38. Hoft D.F., Sadoff J. i wsp.: A recombinant adenovirus expressing immunodominant TB antigens can significantly enhance BCG-induced human immunity. Vaccine, 30, 2098–2108 (2012) 39.Huang J.M., La Ragione R.M., Cooley W.A., Todryk S., Cutting S.M.: Cytoplasmic delivery of antigens, by Bacillus subtilis enhances Th1 responses. Vaccine, 26, 6043–6052 (2008) 40. Kanampalliwar A.M., Soni R., Girdhar A., Tiwari A.: Reverse vaccinology: basics and applications. J. Vaccines Vaccin. 4, 194–198 (2013) 41.Kanno Y., Vahedi G., Hirahara K., Singleton K., O’Shea J.J.: Transcriptional and epigenetic control of T helper cell specification: molecular mechanisms underlying commitment and plasticity. Annu. Rev. Immunol. 30, 707–731 (2012) 42. Kaur T., Sobti R.C., Kaur S.: Cocktail of gp63 and Hsp70 induces protection against Leishmania donovani in BALB/c mice. Parasite Immunol. 33, 95–103 (2011) 43. Khader S.A., Cooper A.M. i wsp.: IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat. Immunol. 8, 369–377 (2007) 44. Le D.T., Laheru D.A. i wsp.: A live-attenuated Listeria vaccine (ANZ-100) and a live-attenuated Listeria vaccine expressing mesothelin (CRS-207) for advanced cancers: phase I studies of safety and immune induction. Clin. Cancer. Res. 18, 858–868 (2012) 45. Lee J.S., Poo H., Han D.P., Hong S.P., Kim K., Cho M.W., Kim E., Sung M.H., Kim C.J.: Mucosal immunization with surface-displayed severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein on Lactobacillus casei induces neutralizing antibodies in mice. J. Virol. 80, 4079–4087 (2006) 46. Lin P.L., Andersen P. i wsp.: The multistage vaccine H56 boosts the effects of BCG to protect cynomolgus macaques against active tuberculosis and reactivation of latent Mycobacterium tuberculosis infection. J. Clin. Invest. 122, 303–314 (2012) 47. Lopez A.L., Gonzales M.L., Aldaba J.G., Nair G.B.: Killed oral cholera vaccines: history, development and implementation challenges. Ther. Adv. Vaccines, 2, 123–136 (2014) 48. Luksza M., Lassig M.: A predictive fitness model for influenza. Nature, 507, 57–61 (2014) 49. Lundegaard C., Lund O., Nielsen M.: Predictions versus high-throughput experiments in T-cell epitope discovery: competition or synergy? Expert Rev. Vaccines, 11, 43–54 (2012) 50. Maciag P.C., Radulovic S., Rothman J.: The first clinical use of a live-attenuated Listeria monocytogenes vaccine: a Phase I safety study of Lm-LLO-E7 in patients with advanced carcinoma of the cervix. Vaccine, 27, 3975–3983 (2009) 51. Marrack P., McKee A.S., Munks M.W.: Towards an understanding of the adjuvant action of aluminium. Nat. Rev. Immunol. 9, 287–293 (2009) 52.Mescher M.F., Curtsinger J.M., Agarwal P., Casey K.A., Gerner M., Hammerbeck C.D., Popescu F., Xiao Z.: Signals required for programming effector and memory development by CD8+ T cells. Immunol. Rev. 211, 81–92 (2006) 53.Mohan T., Verma P., Rao D.N.: Novel adjuvants & delivery vehicles for vaccines development: a road ahead. Indian J. Med. Res. 138, 779–795 (2013) 54.Mosmann T.R., Cherwinski H., Bond M.W., Giedlin M.A., Coffman R.L.: Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136, 2348–2357 (1986) 55.Murphy C.A., Langrish C.L., Chen Y., Blumenschein W., McClanahan T., Kastelein R.A., Sedgwick J.D., Cua D.J.: Divergent pro- and antiinflammatory roles for IL-23 and IL-12 in joint autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 198, 1951–1957 (2003) 43 56. Neefjes J., Jongsma M.L., Paul P., Bakke O.: Towards a systems understanding of MHC class I and MHC class II antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 11, 823–836 (2011) 57.Negri A., Potocki W., Iwanicki A., Obuchowski M., Hinc K.: Expression and display of Clostridium difficile protein FliD on the surface of Bacillus subtilis spores. J. Med. Microbiol. 62, 1379–1385 (2013) 58.Ning D., Leng X., Li Q., Xu W.: Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration. J. Appl. Microbiol. 111, 1327–1336 (2011) 59. Ota M.O., McShane H. i wsp.: Immunogenicity of the tuberculosis vaccine MVA85A is reduced by coadministration with EPI vaccines in a randomized controlled trial in Gambian infants. Sci. Transl. Med. 3, 88ra56 (2011) 60. Pamer E.G.: Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat. Rev. Immunol. 4, 812–823 (2004) 61. Park H., Li Z., Yang X.O., Chang S.H., Nurieva R., Wang Y.H., Wang Y., Hood L., Zhu Z., Tian Q. et al: A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat. Immunol. 6, 1133–1141 (2005) 62. Pratama A., Vinuesa C.G.: Control of TFH cell numbers: why and how? Immunol. Cell. Biol. 92, 40–48 (2014) 63. Radford K.J., Higgins D.E., Pasquini S., Cheadle E.J., Carta L., Jackson A.M., Lemoine N.R., Vassaux G.: A recombinant E. coli vaccine to promote MHC class I-dependent antigen presentation: application to cancer immunotherapy. Gene Ther. 9, 1455– 1463 (2002) 64.Radford K.J., Jackson A.M., Wang J.H., Vassaux G., Lemoine N.R.: Recombinant E. coli efficiently delivers antigen and maturation signals to human dendritic cells: presentation of MART1 to CD8+ T cells. Int. J. Cancer, 105, 811–819 (2003) 65. Roberts M., Chatfield S., Pickard D., Li J., Bacon A.: Comparison of abilities of Salmonella enterica serovar typhimurium aroA aroD and aroA htrA mutants to act as live vectors. Infect. Immun. 68, 6041–6043 (2000) 66.Robinson K., Chamberlain L.M., Schofield K.M., Wells J.M., Le Page R.W.: Oral vaccination of mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis. Nat. Biotechnol. 15, 653–657 (1997) 67. Rock K.L., Shen L.: Cross-presentation: underlying mechanisms and role in immune surveillance. Immunol. Rev. 207, 166–183 (2005) 68. Rote N.S.: Adaptive immunity (w) Pathophysiology: The biological basis for disease in adults and children, red. K. McCance, S. Huether, Elsevier Mosby, St. Louis, 2014, s. 224–261 69. Sallusto F., Lanzavecchia A., Araki K., Ahmed R.: From vaccines to memory and back. Immunity, 33, 451–463 (2010) 70. Seder R.A., Hill A.V.: Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity. Nature, 406, 793–798 (2000) 71. Sivakumar S.M., Safhi M.M., Kannadasan M., Sukumaran N.: Vaccine adjuvants – Current status and prospects on controlled release adjuvancity. Saudi Pharm. J. 19, 197–206 (2011) 72.Smaill F., Xing Z. i wsp.: A human type 5 adenovirus-based tuberculosis vaccine induces robust T cell responses in humans despite preexisting anti-adenovirus immunity. Sci. Transl. Med. 5, 205ra134 (2013) 73.Smith K.A.: Smallpox: can we still learn from the journey to eradication? Indian J. Med. Res. 137, 895–899 (2013) 74. Stachowiak R., Lyzniak M., Grabowska M., Roeske K., Jagielski T., Bielecki J., Budziszewska B.K., Hoser G., Kawiak J.: Cytotoxicity of purified listeriolysin O on mouse and human leukocytes and leukaemia cells. BMC Biotechnol. 14, 77 (2014) 75. Sun H.X., Xie Y., Ye Y.P.: ISCOMs and ISCOMATRIX. Vaccine, 27, 4388–4401 (2009) 44 KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI 76.Sun J.C., Williams M.A., Bevan M.J.: CD4+ T cells are required for the maintenance, not programming, of memory CD8+ T cells after acute infection. Nat. Immunol. 5, 927–933 (2004) 77. Sun R., Liu Y.: Listeriolysin O as a strong immunogenic molecule for the development of new anti-tumor vaccines. Hum. Vaccin. Immunother. 9, 1058–1068 (2013) 78. Surh C.D., Sprent J.: Homeostasis of naive and memory T cells. Immunity, 29, 848–862 (2008) 79.Tameris M.D., McShane H. i wsp.: Safety and efficacy of MVA85A, a new tuberculosis vaccine, in infants previously vaccinated with BCG: a randomised, placebo-controlled phase 2b trial. Lancet, 381, 1021–1028 (2013) 80. Thomas C.E., Ehrhardt A., Kay M.A.: Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346–358 (2003) 81.Tifrea D.F., Pal S., Toussi D.N., Massari P., de la Maza L.M.: Vaccination with major outer membrane protein proteosomes elicits protection in mice against a Chlamydia respiratory challenge. Microbes Infect. 15, 920–927 (2013) 82. Titball R.W.: Vaccines against intracellular bacterial pathogens. Drug Discov. Today, 13, 596–600 (2008) 83. Torrado E., Fountain J.J., Robinson R.T., Martino C.A., Pearl J.E., Rangel-Moreno J., Tighe M., Dunn R., Cooper A.M.: Differential and site specific impact of B cells in the protective immune response to Mycobacterium tuberculosis in the mouse. PLoS One, 8, e61681 (2013) 84. VanCott J.L., Chatfield S.N., Roberts M., Hone D.M., Hohmann E.L., Pascual D.W., Yamamoto M., Kiyono H., McGhee J.R.: Regulation of host immune responses by modification of Salmonella virulence genes. Nat. Med. 4, 1247–1252 (1998) 85. Veldhoen M., Uyttenhove C., van Snick J., Helmby H., Westendorf A., Buer J., Martin B., Wilhelm C., Stockinger B.: Transforming growth factor-beta ‘reprograms’ the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset. Nat. Immunol. 9, 1341–1346 (2008) 86.Weiner J., Kaufmann S.H.: Recent advances towards tuberculosis control: vaccines and biomarkers. J. Intern. Med. 275, 467–480 (2014) 87. Whitmire J.K., Eam B., Whitton J.L.: Tentative T cells: memory cells are quick to respond, but slow to divide. PLoS Pathog, 4, e1000041 (2008) 88. Wiesel M., Oxenius A.: From crucial to negligible: functional CD8(+) T-cell responses and their dependence on CD4(+) T-cell help. Eur. J. Immunol. 42, 1080–1088 (2012) 89. Wilson J.W., Nickerson C.A.: Cloning of a functional Salmonella SPI-1 type III secretion system and development of a method to create mutations and epitope fusions in the cloned genes. J. Biotechnol. 122, 147–160 (2006) 90. Xu F., Hong M., Ulmer J.B.: Immunogenicity of an HIV-1 gag DNA vaccine carried by attenuated Shigella. Vaccine, 21, 644– 648 (2003) 91. Zhang Z.H., Jiang P.H., Li N.J., Shi M., Huang W.: Oral vaccination of mice against rodent malaria with recombinant Lactococcus lactis expressing MSP-1(19). World J. Gastroenterol. 11, 6975–6980 (2005) 92. Zheng J.P., Zhang Z.S., Li S.Q., Liu X.X., Yuan S.L., Wang P., Zhan D.W., Wang L.C., Huang C.F.: Construction of a novel Shigella live-vector strain co-expressing CS3 and LTB/STm of enterotoxigenic E. coli. World J. Gastroenterol. 11, 3411–3418 (2005) 93. Zhu J., Yamane H., Paul W.E.: Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu. Rev. Immunol. 28, 445–489 (2010) POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 45–56 http://www.pm.microbiology.pl ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE ZAKAŻEŃ UKŁADU MOCZOWEGO Sylwia Joanna Chmielewska1*, Krzysztof Fiedoruk1, Tamara Daniluk1, Małgorzata Ściepuk1, Dorota Kaczmarzyk1, Katarzyna Leszczyńska1 Zakład Mikrobiologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku 1 Wpłynęło w kwietniu 2015 r. Zaakceptowano w lipcu 2015 r. 1. Wstęp. 2. Klasyfikacja zakażeń układu moczowego (ZUM). 3. Przyczyny, czynniki ryzyka oraz objawy ZUM. 4. Czynniki etiologiczna ZUM. 4.1. Zakażenia układu moczowego u osób dorosłych. 4.2. ZUM u dzieci. 4.3. ZUM u osób starszych. 5. Uropatogenne szczepy Escherichia coli. 5.1. Adhezyny. 5.2. Odpowiedź immunologiczna gospodarza na zakażenie UPEC. 6. Podsumowanie Significance of uropathogenic strains of Escherichia coli (UPEC) in the pathogenesis of urinary tract infections Abstract: Urinary tract infections (UTIs) are one of the most widespread infections, particularly among women (40–50%) as well as newborns, infants and elderly persons. In addition, recurrent episodes of UTIs are common and frequently become chronic. Escherichia coli is the most common cause of UTIs, bothcommunity- and hospital-acquired, followed by other Enterobacteriaceae (Proteus spp., Klebsiella spp.), Pseudomonas spp. and Gram-positive cocci. The majority of UTIs are caused by uropathogenic E. coli (UPEC) characterized by the presence of various adhesive fimbriae (pili) e.g., type 1 or P, S and Afa/Dr fimbriae, the crucial virulence factors for their pathogenic capabilities. For example, type 1 fimbriae are common among cystitis-associated UPEC, P fimbriae are characteristic adhesins in E. coli pyelonephritis, and Dr fimbriae UPEC strains are frequently isolated (40%) from pregnancy-associated pyelonephritis cases. In consequence, Dr+ E. coli may contribute to serious pregnancy complications, including premature births or damage of the fetus. Therefore, the more extensive knowledge about mechanisms of pathogenesis of UPEC strains may facilitate development of novel diagnostic methods and might prove essential for better risk assessment for patients with UTIs. 1. Introduction. 2. Classification of urinary tract infections (UTIs). 3. The causes, risk factors and symptoms of UTIs. 4. Etiological factors of UTIs. 4.1. Urinary tract infections in adults. 4.2. UTIs in children population. 4.3. UTIs in the elderly. 5. Uropathogenic strains of Escherichia coli (UPEC). 5.1. Fimbriae. 5.2. Host immune response against UPEC colonization of the urinary tract. 6. Summary Słowa kluczowe: Fimbrie, UPEC, zakażenia układu moczowego Key words: Fimbriae, UPEC, urinary tract infections 1. Wstęp Zakażenia układu moczowego (ZUM, Urinary Track Infections) stanowią poważny problem kliniczny, w Polsce klasyfikują się na drugim miejscu zaraz po infekcjach układu oddechowego. Należy jednak podkreślić, że ze względu na możliwość częstych nawrotów i powikłań ZUM są poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. U pacjentów z ostrym zapaleniem pęcherza w 15–50% przypadków rozwija się odmiedniczkowe zapalenie nerek, z kolei u 12% tych pacjentów pojawia się później bakteriemia. Szacuje się, że ZUM stanowią ok. 10–20% wszystkich zakażeń pozaszpitalnych oraz ok. 40–50% zakażeń szpitalnych, a także są częstą przyczyną wypisywania leków przeciwbakteryjnych [6, 40, 58]. W USA w 2012 r. zarejestrowano ponad 7 milionów wizyt lekarskich spowodowanych przez infekcje układu moczowego, z czego 100 tysięcy pacjentów wymagało hospitalizacji, najczęściej z powodu odmiedniczkowego zapalenia nerek. Całkowite wydatki związane z leczeniem pacjentów ambulatoryjnych i szpitalnych ocenia się na ok. 1,6 miliarda dolarów rocznie [21]. W skali globalnej odnotowuje się szacunkowo 150 milionów przypadków ZUM rocznie [50]. Dlatego też tak ważna jest właściwa terapia zakażeń układu moczowego, która może przyczynić się do zmniejszenia wskaźnika zachorowań oraz obniżenia kosztów związanych z ich leczeniem [8, 45]. 2. Klasyfikacja zakażeń układu moczowego (ZUM) W piśmiennictwie stosowane są różne klasyfikacje ZUM, jednak przeważa kryterium praktyczne, w którym zwraca się uwagę przede wszystkim na lokalizację anatomiczną zakażenia i przebieg zakażenia (powikłane, niepowikłane, nawracające, ponowne, objawowe, bezobjawowe) [11, 21, 57]. Biorąc pod uwagę anatomiczną lokalizację ZUM wyróżnia się infekcje obejmujące górne (nerki, moczowody) i dolne (pęcherz moczowy, cewka moczowa) odcinki układu moczowego. Granicę między nimi wyznaczają ujścia moczowodów do pęcherza moczowego [11, 21, 57]. * Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, ul. Mickiewicza 2C, 15-222 Białystok; tel./fax (85) 748-55-62; e-mail: [email protected] 46 S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA Niepowikłane ZUM występują u pacjentów z prawidłowym pod względem anatomicznym i czynnościowym układem moczowym oraz sprawnymi mechanizmami obronnymi. Natomiast powikłane ZUM wywołane często przez nietypowe drobnoustroje, dotyczą osób z anomaliami strukturalnymi lub funkcjonalnymi w obrębie układu moczowego oraz pacjentów z upośledzonym układem immunologicznym [11, 21, 57]. Nawrót ZUM występuje po leczeniu przeciwdrobnoustrojowym, a czynnikiem etiologicznym jest drobnoustrój przetrwały w drogach moczowych będący przyczyną poprzedniego ZUM. W praktyce za nawrót ZUM przyjmuje się, objawy pojawiające się do 2 tygodni od zakończenia terapii. Reinfekcja, czyli ponowne ZUM to infekcja wywołana nowym czynnikiem etiologicznym pochodzącym spoza układu moczowego [17, 57]. Bakteriuria bezobjawowa powinna być traktowana, jako szczególna jednostka, ponieważ może mieć swoje źródło zarówno w obrębie dolnych jak i górnych dróg moczowych. W bakteriurii bezobjawowej stwierdza się obecność bakterii w moczu (bakteriuria znamienna), przy czym brak jest leukocyturii oraz klinicznych objawów zakażenia. Bakteriuria bezobjawowa wymaga leczenia tylko w określonych przypadkach np. dotyczy około 4–10% kobiet w ciąży [17, 21, 57]. Występowanie bakteriurii bezobjawowej szacowane jest na około 3,5% populacji i wzrasta wraz z wiekiem; częściej dotyczy kobiet, a także mężczyzn powyżej 70 r.ż. z zapaleniem gruczołu krokowego [17, 30]. Czynnikiem sprzyjającym bakteriurii bezobjawowej jest cukrzyca. Przeprowadzone badania wskazują, że u kobiet z cukrzycą typu 2, u których stwierdzono bezobjawową bakteriurię istnieje większe ryzyko rozwoju objawowego zakażenia układu moczowego. Ponadto bakteriuria bezobjawowa u osób chorych na cukrzycę wiąże się z czterokrotnie wyższym ryzykiem hospitalizacji [30]. 3. Przyczyny, czynniki ryzyka oraz objawy ZUM W warunkach zdrowia drogi moczowe powyżej zwieracza pęcherza są jałowe (nie zawierają bakterii), w niektórych sytuacjach dochodzi jednak do wniknięcia drobnoustrojów i ich namnożenia. Bakterie mogą przedostać się do układu moczowego na kilka sposobów np. drogą wstępującą przez cewkę moczową (zakażenie urogenne), drogą krwionośną (zakażenie hematogenne), drogą naczyń chłonnych (zakażenie limfogenne) oraz przez przetoki pomiędzy drogami moczowymi a pochwą lub macicą, lub przez przetoki moczowodowo-pęcherzowo-jelitowe, istnieje również możliwość przedostania się bakterii poprzez naruszenie ciągłości tkanek [44, 57, 58]. Do czynników utrudniających drobnoustrojom kolonizację układu moczowego należą: 1) wypłukiwanie drobnoustrojów w czasie opróżniania pęcherza moczowego (mikcji), co zapobiega namnażaniu się bakterii, 2) kwaśne pH moczu oraz wydzieliny z pochwy (hamowanie wzrostu bakterii), 3) przeciwbakteryjne działanie wydzieliny gruczołu krokowego, 4) obecność białka Tamma-Horsfalla, które chroni przed adhezją bakterii, 5) naturalna mikroflora okolicy cewki moczowej zapobiegająca kolonizacji patogennych bakterii, 6) mukopolisacharydy błony śluzowej pęcherza moczowego uniemożliwiające przyleganie bakterii, 7) obecność wydzielniczej immunoglobuliny IgA, 8) fagocytarne działanie leukocytów, 9) złuszczanie się komórek nabłonka dróg moczowych [57]. Dodatkowo bardzo ważną funkcję ochronną pełni uroepithelium, spełniające rolę bariery przeciwko patogenom, toksynom, jonom zapobiegając ich przejściu do głębszych warstw tkanek [3]. Główne czynniki ryzyka zakażeń układu moczowego przedstawiono na Rys. 1 [44, 51]. ZUM stwierdza się najczęściej w okresie niemowlęctwa oraz u osób po 65 roku życia, u których infekcje dróg moczowych odnotowuje się u po­nad 20% kobiet i ponad 10% mężczyzn. Kobiety (z wyjątkiem pierwszych kilku miesięcy) są zdecydowanie bardziej podatne na ZUM. Określa się, że schorzenia układu moczowego występują nawet 14 razy częściej u kobiet niż u mężczyzn. Szacuje się około 40–50% dorosłych kobiet doświadczyła przynajmniej raz w życiu zakażenia dróg moczowych, z czego u większości obserwuje się wielokrotne zakażenia. Ponadto częstotliwość ta zwiększa się wraz z wiekiem; u kobiet w przedziale 65–70 lat bakteriomocz stwierdzono w 10–15% przypadków, zaś u pacjentek po 80 r.ż. u 15–20%. Zmiany hormonalne po menopauzie, powodują, że liczba zakażeń układu moczowego wzrasta nawet, o 40%, co związane jest z niedoborem estrogenów zapewniających prawidłową florę pochwy oraz z nadmiernym namnażaniem się Escherichia coli. Do wad anatomicznych lub czynnościowych dróg moczowych utrudniających odpływ moczu i predysponujących do ZUM zalicza się: przerost gruczołu krokowego, zaburzenia w odpływie pęcherzykowo-moczowodowym, neurogenne zaburzenia czynności pęcherza, niedrożność spowodowana kamicą dróg moczowych. Wśród innych przyczyn i czynników ryzyka infekcji dróg moczowych należy wymienić: cukrzycę (zwłaszcza niekontrolowaną i źle leczoną), nabyte niedobory odporności (zakażenie wirusem HIV), niektóre zabiegi diagnostyczne lub lecznicze wykonywane w obrębie dróg moczowych (cewnikowanie, chirurgia urologiczna, przezcewkowa resekcja gruczołu krokowego), stany zapalne w okolicy krocza, pochwy, stulejkę z zapaleniem żołędzi, złe nawyki higieniczne, zaparcia oraz zbyt rzadkie oddawanie moczu (przetrzymywanie moczu w pęcherzu) [11, 17, 44, 57]. Do głównych objawów zakażenia układu moczowego należą – trudności w oddawaniu moczu, dysu- ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE 47 Rys. 1. Czynniki sprzyjające zakażeniom układu moczowego ria (bolesność przy oddawaniu moczu), częstomocz, nykturia (oddawanie moczu w nocy, więcej niż jeden raz), tkliwość pęcherza, gorączka, bóle w okolicy lędźwiowej, bóle brzucha, czasami bóle głowy i nudności [21]. W około 30% przypadków ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek może rozwinąć się bakteriemia prowadząca do posocznicy, a nawet do śmierci pacjenta [8, 21, 45]. 4. Czynniki etiologiczne ZUM Czynniki etiologiczne ZUM zostały dobrze poznane, jednak w ciągu ostatnich 10 lat obserwuje się znaczne zmiany w profilu lekooporności drobnoustrojów, co stanowi poważny problem współczesnej medycyny. Leczenie empiryczne wymaga stałej oceny wrażliwości bakterii na antybiotyki, a wybór skutecznego przeciwbakteryjnego leku pozwalającego na właściwe wyleczenie pacjenta oraz niepowodującego selekcji szczepów opornych jest wyzwaniem dla urologii [21, 51]. Głównymi czynnikami etiologicznymi zakażeń układu moczowego są bak­terie. Zdecydowanie w mniejszym stopniu za infekcje odpowiedzialne są wirusy, grzyby, pierwotniaki oraz pasożyty [21, 51]. W przypadku bakterii w przeważającej większości izoluje się bakterie Gram-ujemne kolonizujące przewód pokarmowy, a także przedsionek pochwy u kobiet czy okolicę podnapletkową u mężczyzn [32]. W ostatnim czasie bakteryjne czynniki etiologiczne ZUM ulegają licznym zmianom. Wprawdzie E. coli jest nadal najczęstszą przyczyną infekcji, to udział innych pałeczek jelitowych i niefermentujących glukozy takich jak Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii znacząco wzrósł. Spośród pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae narastającym problemem jest Klebsiella pneumoniae szczególnie szczepy wytwarzające karbapenemazy KPC, które powodują ZUM zarówno u pacjentów szpitalnych jak i ambulatoryjnych. Opcje terapeutyczne tych zakażeń są bardzo ograniczone [20]. W chwili obecnej coraz częściej diagnozuje się ZUM wywołane przez bakterie atypowe Chlamydia tracho­ matis, Mycoplasma spp. i Ureaplasma urealyticum. Grzyby, a zwłaszcza gatunek Candida albicans odpowiedzialne są za zakażenia obserwowane u wcześniaków, noworodków, zaś u osób dorosłych powodują infekcje u chorych z zaburzeniami odporności lub kobiet cierpiących na grzybicze zapalenie pochwy [32]. 48 S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA Tabela I Drobnoustroje odpowiedzialne za zakażenia układu moczowego Zapalenie cewki moczowej (łac. urethritis) ZAKAŻENIA WSTĘPUJĄCE Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella spp., Neisseria gonorrhoeae Bakterie Gram-dodatnie Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus Bakterie atypowe Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium Zapalenie pęcherza moczowego (łac. cystitis) Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Inne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae Bakterie Gram-dodatnie Enterococcus spp., Staphylococcus saprophyticus (młode kobiety), Corynebacterium urealyticum ZAKAŻENIA ZSTĘPUJĄCE Ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek (łac. pyelonephritis acuta) Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa Najważniejsze bakteryjne czynniki etiologiczne infekcji dróg moczowych z uwzględnieniem ich anatomicznej lokalizacji przedstawiono w Tabeli I [51, 57]. 4.1. Zakażenia układu moczowego u osób dorosłych Najczęstszym czynnikiem etiologicznym zakażeń układu moczowego zarówno górnych jak i dolnych odcinków jest E. coli (75–90%) odpowiedzialna za około 80–90% niepowikłanych infekcji oraz około 40–60% zakażeń szpitalnych [28, 35, 45, 58]. Bakterie z rodzaju Proteus spp. odpowiedzialne są za 7% przypadków ZUM, ale odsetek ten może wzrosnąć nawet do 20% u pacjentów ze współistniejącą patologią układu moczowego [4, 25, 45]. W mniejszym odsetku izoluje się pozostałe pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae takie jak: Klebsiella spp. czy Enterobacter spp. [4, 11, 36, 45, 51]. Bakterie z rodzaju Proteus izoluje się najczęściej z moczu od pacjentów ze współistniejącymi zaburzeniami dróg moczowych. Wśród mężczyzn ważną rolę odgrywa P. vulgaris, gdyż stanowi on florę fizjologiczną okolicy napletka, a w sprzyjających okolicznościach może stać się przyczyną wstępującego zakażenia (30% zakażeń u chłopców po 6 m.ż.). Pałeczka odmieńca jest najczęstszym czynni­kiem etiologicznym skomplikowanych ZUM oraz drugą, co do częstości przyczyną bakteriurii związanej z długo­terminowym cewnikowaniem. Z kolei P. mirabilis jest powszechnym czynnikiem zakażeń szpitalnych, aczkolwiek procentowy udział tej bakterii różni się w zależności od specyfiki oddziału szpitalnego [32, 45]. Wydalany przez nerki mocznik stymuluje produkcję ureazy przez bakterie z rodzaju Proteus, zwiększając stężenie tego enzymu od 5 do nawet 25 razy [52]. Tworzenie złogów jest w szczególności udziałem Bakterie Gram-dodatnie Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus (młode kobiety), Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae P. mirabilis [57]. W układzie moczowym ureaza katalizuje reakcję hydrolitycznego rozkładu mocznika na amoniak i dwutlenek węgla, uwalniany wówczas amoniak uszkadza nabłonek i alkalizuje mocz, co skutkuje precypitacją jonów wapnia i magnezu z utworzeniem kryształów struwitu i apatytu [41, 49, 57]. Powstające kryształy łączą się z bakteriami i rozpoczyna się proces krystalizacji. W ten sposób mogą formować się pierwsze jądra krystalizacji. Bakterie z rodzaju Proteus zdolne są do przeżycia wewnątrz tworzonych kamieni, gdyż są one trudno dostępne dla stosowanych antybiotyków, co dodatkowo ogranicza skuteczne leczenie przeciwbakteryjne. Co więcej bakterie umożliwiają ciągłość reakcji chemicznych pozwalających na utrzymanie zasadowego pH moczu, które zapewnia nierozpuszczalność kryształów struwitu i apatytu [52, 57]. Kamienie moczowe zwiększają ryzyko infekcji dróg moczowych, zwężając średnicę przewodów moczowych, co skutkuje zastojem moczu. Utworzone kamienie mogą zwiększać adhezję bakterii do błony śluzowej układu moczowego, w wyniku jej uszkodzenia bądź podrażnienia [44]. Infekcje wywołane przez bakterie Gram-dodatnie występują zdecydowanie rzadziej i stanowią < 10% wszystkich ZUM [32]. Najczęściej izoluje się Sta­phy­ lococcus saprophyticus (5–10%) dominujący wśród aktywnych seksualnie kobiet, zaś u pacjentów dłu­go­ trwale leżących i cewnikowanych Enterococcus spp. [4, 11, 21, 25, 51]. Etiologia powikłanych ZUM (Rys. 2) jest zdecydowanie bardziej zróżnicowana niż tych niepowikłanych. Przy czym w obu typach infekcji wiodącą bakterią jest E. coli [17, 51]. Zakażenia układu moczowego stanowią około 30–50% zakażeń szpitalnych. Na oddziałach urologicz- ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE 49 Rys. 2. Bakteryjne czynniki etiologiczne niepowikłanych oraz powikłanych infekcji dróg moczowych nych odsetek występowania ZUM sięga nawet 70–80% [20]. Na etiologię powikłanych oraz szpitalnych zakażeń układu moczowego mają wpływ takie czynniki jak: wiek, obecność choroby podstawowej np. cukrzycy, chorób układu odpornościowego (zakażenia wirusem HIV), ciąża bądź też długotrwałe cewnikowanie chorych. Ponadto szczepy, które rzadko powodują zakażenia u pacjentów zdrowych, mogą być przyczyną groźnych infekcji w przypadku pacjentów z anatomicznymi, metabolicznymi bądź immunologicznymi przypadłoś­ ciami [45, 51]. Czynnikami etiologicznymi zakażeń powikłanych oraz wewnątrzszpitalnych są drobnoustroje rzadko izolowane w niepowikłanych infekcjach np. Serratia spp., Providencia spp. czy pałeczki niefermentujące glukozy np. Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. Dodatkowo coraz powszechniej odnotowuje się szczepy posiadające groźne mechanizmy oporności takie jak: ESBL, MBL, AmpC, a odsetek tych bakterii stale wzrasta, co silnie ogranicza skuteczną terapię pacjentów [4, 20, 45, 51]. 4.2. ZUM u dzieci Zakażenia układu moczowego u dzieci związane są ze znacznie groźniejszymi następstwami niż u pacjentów dorosłych, prowadzącymi do poważnych powikłań, w tym nawet do schyłkowej niewydolności nerek. Infekcje dróg moczowych w okresie noworodkowym oraz u niemowląt występują głównie w populacji męskiej [4, 17, 22, 51]. W pierwszym roku życia stwierdza się ZUM aż u 2,7% chłopców, 10-krotnie częściej u nieobrzeza- nych [4, 17, 51]. Jedną z przyczyn ZUM u chłopców jest stulejka polegająca na zwężeniu ujścia napletka, co uniemożliwia lub utrudnia zsunięcie napletka z żołędzi prącia. Częstość występowania stulejki patologicznej wynosi 0,4 na 1000 chłopców rocznie. Pacjentom z patologiczną stulejką towarzyszy ból, obserwuje się podrażnienie skóry, miejscowe infekcje, ponadto występuje bolesne oddawanie moczu, krwiomocz, częste epizody zakażeń dróg moczowych czy ból napletka. Z kolei w przypadku stulejki fizjologicznej polegającej na niemożliwości odprowadzenia napletka nie stwierdza się bólu, trudności w oddawaniu moczu czy infekcji układu moczowego. Stulejka fizjologiczna występuje powszechnie u noworodków i niemowląt płci męskiej, przy czym zanika wraz z wiekiem [56]. W późniejszym okresie życia ZUM w przeważającej większości diagnozuje się u dziewczynek. Zakażenia dróg moczowych występujące u dziewczynek przed okresem dojrzewania mogą przyczynić się do powikłań w czasie ciąży [4, 17, 22, 51]. Kolejnym czynnikiem odgrywającym istotną rolę w patogenezie infekcji dróg moczowych jest refluks pęcherzowo-moczowodowy (VUR – Vesicoureteral Reflux) definiowany, jako wsteczny odpływ moczu z pęcherza do moczowodów. Główną przyczyną refluksu jest wrodzona niewydolność zastawek moczowodowo-pęcherzowych. Następstwami VUR jest nadciśnienie tętnicze czy przewlekła niewydolność nerek. Szacuje się, że VUR występuje w przybliżeniu u 0,4–1,8% zdrowych niemowląt oraz dzieci. W przypadku zakażeń układu moczowego, stwierdza się, że nawet do 40% dzieci ma VUR potwierdzone VCUG – cystouretrografią 50 S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA mikcyjną. Badania wykazały, że u pacjentów z łagodnym lub umiarkowanym stopniem refluksu pęcherzowo-moczowodowego profilaktyka antybiotykowa nie zmniejsza ryzyka kolejnych epizodów ZUM [19, 27, 29]. Szacuje się, że u dzieci, które doświadczyły infekcji układu moczowego w ciągu 1 r.ż., nastąpi nawrót zakażenia w okresie kilku kolejnych miesięcy. Badania potwierdzają, że u dzieci, u których dochodzi do powtarzających się epizodów infekcji dróg moczowych, istnieje zwiększone ryzyko bliznowacenia nerek, które w dorosłym życiu może doprowadzić do poważnych schorzeń nerek [4, 17, 22, 51]. Do najczęstszych uropatogenów odpowiedzialnych za ZUM u dzieci zalicza się: E. coli (85%), Candida spp. (18%), Enterococcus spp. (13%), Enterobacter spp. (około 10%) czy Pseudomonas spp. (w przybliżeniu 10%). Allan Ronald zwrócił uwagę na fakt, że grzyby drożdżopodobne z rodzaju Candida stały się drugim najczęstszym patogenem infekcji dróg moczowych u dzieci, co może być związane z powszechnym stosowaniem antybiotyków o szerokim spektrum działania [51]. Pojawiające się coraz powszechniej infekcje grzybicze u dzieci mogą skutkować tworzeniem się tzw. kul grzybiczych w okolicy miedniczek i kielichów, co w konsekwencji prowadzi do niebezpiecznych powikłań np. zastoju moczu czy nawet całkowitego zatrzymania moczu [4]. 4.3. ZUM u osób starszych Zakażenia układu moczowego u osób starszych są również częstą przyczyną infekcji, na których przebieg ma wpływ wiele czynników np. współwystępowanie chorób przewlekłych czy status socjoekonomiczny. Pomimo, że większość zakażeń powoduje E. coli, to udział bakterii Gram-dodatnich w ZUM u osób starszych zdecydowanie wzrasta w porównaniu do innych grup wiekowych i wynosi od 10% do 20%. Zakażenia mieszane występują u 1 na 3 pacjentów. Do czynników sprzyjających ZUM zalicza się nietrzymanie moczu i kału, pęcherz neurogenny, choroby neurologiczne, takie jak choroba Alzheimera czy choroba Parkinsona, które u osób starszych zaburzają prawidłowe opróżnianie pęcherza. Wśród innych czynników predysponujących do infekcji należy wymienić przede wszystkim cewnikowanie, kamicę układu moczowego oraz sprzyjający niecałkowitemu opróżnianiu pęcherza moczowego przerost gruczołu krokowego u mężczyzn. Ponadto zaburzenie mechanizmów obronnych i częste podawanie antybiotyków podnosi ryzyko zakażeń wywołanych przez szczepy oporne na antybiotyki [5, 17, 21, 48, 51]. ZUM powiązane z cewnikowaniem chorych (CAUTI – Catheter-Associated Urinary Tract Infection) występują powszechnie u pacjentów poddanych długoterminowej opiece zdrowotnej i w tym wypadku uważa się je za najczęstsze zakażenia szpi­talne (około 90% bez- objawowych ZUM). Szacuje się, że ryzyko wystąpienia infekcji jest wprost proporcjonalne do długości okresu pozostawania cewnika w pęcherzu. Dodatkowo cewnik stwarza idealne warunki do formowania się biofilmu, co zwiększa prawdopodobieństwo zakażeń dróg moczowych [21, 38, 44]. Ryzyko rozwinięcia się CAUTI u pacjentów cewnikowanych wynosi: w przypadku jednorazowego cewnikowania 1–5%, pozostawienie cewnika powyżej 3–4 dni w systemie zamkniętym zwiększa szanse do 15–26%, zaś w systemie otwartym do 80–100%. Wśród głównych czynników etiologicznych CAUTI należy wymienić E. coli, S. epidermidis i E. faecalis; w miarę przedłużania się okresu cewnikowania dodatkowo mogą pojawić się: P. aeruginosa, P. mira­bilis, K. pneumoniae czy Morganella morganii [5, 17, 20, 21, 51]. Z kolei badania składu biofilmu powstałego na cewnikach wskazują na występowanie bakterii z rodzaju Edwardsiella, Corynebacterium, Achromobacter, Citrobacter, Stenotrophomonas czy Burkholderia [45]. W przypadku E. coli sugeruje się, że występowanie fimbrii typu 1, CsgA (Major Curlin Subunit) oraz ruchliwość tej bakterii przyczyniają się do formowania biofilmu. Z kolei bakterie zdolne do wytwarzania ureazy np. P. mirabilis, P. vulgaris, P. aeruginosa, K. pneumoniae, M. morganii oraz niektóre szczepy E. coli mogą powodować w mniejszym bądź większym stopniu inkrustację cewnika kryształami struwitu i apatytu. Dlatego też tak ważne jest, aby lekarz w swojej codziennej praktyce klinicznej kierował się dwiema zasadami: 1) system cewnikowy powinien być zamknięty, 2) czas cewnikowania powinien być jak najkrótszy, co wyraźnie ograniczy ZUM [21, 38, 44, 51]. Kolejnym ważnym czynnikiem etiologicznym ZUM u osób starszych są grzyby z rodzaju Candida, będące główną przyczyną infekcji u pacjentów leczonych chirurgicznie oraz chorych poddanych długoterminowemu leczeniu antybiotykami szerokowachlarzowymi [4]. 5. Uropatogenne szczepy Escherichia coli (UPEC) Najczęstszymi czynnikami etiologicznymi zakażeń układu moczowego są szczepy E. coli, w tym uropatogenne E. coli UPEC (Uropathogenic Escherichia coli). Szacuje się, że UPEC odpowiedzialne są za ponad 80% przypadków ZUM [8, 40, 45, 59, 64]. Sugeruje się, że szczepy UPEC kolonizujące drogi moczowe mogą pochodzić z przewodu pokarmowego pacjenta tj. własnej flory jelitowej. Transmisja UPEC może również nastąpić poprzez spożycie skażonego pokarmu lub drogą płciową [58]. Bakterie UPEC zróżnicowane są pod względem genetycznym oraz pod względem zdolności do kolonizacji i przetrwania wewnątrz komórek nabłonkowych pęcherza i komórek nerek [8]. Badania wykazały, że wiele czynników patogenności wytwarza- ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE nych przez UPEC może regulować w istotny sposób zdolność tych bakterii do inwazji układu moczowego. Czynniki te zazwyczaj kodowane są na chromosomie bakteryjnym i na ogół są częścią dużych, niestabilnych regionów zwanych wyspami patogenności [8, 40, 64]. Do najważniejszych czynników wirulencji uropato­ gennych szczepów E. coli należą adhezyny i inwazyny umożliwiające bakteriom internalizację komórek gospodarza, toksyny oraz system pobierania (wychwytu) żelaza ułatwiający drobnoustrojom przetrwanie w warunkach z ograniczonym dostępem do tego pierwiastka, który jest ważnym czynnikiem wzrostu bakterii [8, 18, 63]. Uropatogenne bakterie produkują toksyny np. alfa-hemolizy lub cytotoksyczny czynnik nekrozy 1 (CNF 1) [8, 13, 15, 40, 63]. Rola alfa-hemolizyny polega na modulacji odpowiedzi gospodarza na zakażenie poprzez zmianę sygnalizacji Ca2+ w komórkach nabłonkowych nerek. Z kolei CNF 1 przyczynia się do zjadliwości szczepów UPEC na wiele sposobów. Po pierwsze toksyna ta aktywuje grupę białek Rho (Ras Homologues) tj. białka Rac (Reorganization of Actin Cytoskeleton) bezpośrednio związanego z reorganizacją cytoszkieletu aktynowego i Cdc 42 w komórkach eukariotycznych poprzez deaminację reszt glutaminy, co wpływa na funkcję komórek np. transkrypcję genów, proliferację czy przeżycie komórki. Po drugie synteza CNF 1 zwiększa przeżywalność uropatogennych szczepów podczas odpowiedzi zapalnej poprzez modulację funkcji PMN tj. zmniejszenie ich przeciwbakteryjnych właś­ ci­ wości. Ponadto polimorfojądrowe leukocyty wykazują obniżoną zdolność do fagocytozy, dochodzi do zaburzeń dystrybucji receptorów CD 11b na powierzchni PMN. Wszystkie wymienione wyżej właś­ ciwości CNF 1 wpływają na funkcje komórek w sposób sprzyjający przetrwa­niu i rozprzestrzenianiu się drobnoustrojów [13, 15]. Charakterystyczną cechą UPEC jest również zdolność rozmnażania wewnątrzkomórkowego. Proces przedostawania się do wnętrza komórek urotelialnych polega na wiązaniu się białka FimH rozmieszczonego na powierzchni bakterii z receptorami komórek urotelialnych, co prowadzi w efekcie do otoczenia bakterii błoną komórkową (zasada działania zamka błyskawicznego) i powstania wakuoli, w której mogą namnażać się bakterie. FimH uruchamia również proces złuszczania zainfekowanych komórek. Część bak­terii uwalnia się z komórek jeszcze przed zakończeniem procesu złuszczenia i ponownie może przylegać do zdrowych komórek nabłonka [40]. Utrata fragmentów genomu UPEC kodujących fimbrie typu 1 oraz inaktywacja genów kodujących fimbrie typu P doprowadziła do wyodrębnienia nowej grupy szczepów E. coli tj. ABU (Asymptomatic Bacteriuria) odpowiedzialnych za asymptomatyczną bakteriurię. Szczepy ABU są w stanie długotrwale kolonizować drogi 51 moczowe bez wywoływania pełnoobjawowego stanu zapalnego, na skutek inaktywacji kilku genów kodujących czynniki wirulencji, co powoduje atentację odczynu zapalanego u pacjentów [31]. 5.1. Adhezyny Adhezyny warunkują przyleganie bakterii do komórek nabłonka dróg moczowych, tym samym zapobiegając szybkiemu wypłukiwaniu drobnoustrojów podczas mikcji. Ponadto w wyniku adhezji dochodzi do aktywacji szlaków sygnalizacyjnych, co ułatwia oddziaływanie toksyn na komórki gospodarza oraz umożliwia wniknięcie bakterii do komórek nabłonka. Część adhezyn jest swoista dla konkretnego gatunku, część nawet dla poszczególnych szczepów bakterii, inne zaś stwierdza się u wielu różnych gatunków. Obecność adhezyn jest zapewne najważniejszym wyznacznikiem chorobotwórczości E. coli, niezbędnym zwłaszcza w pierwszym etapie kolonizacji. Do najważniejszych adhezyn należą fimbrie [14, 55, 59, 61]. Fimbrie to nitkowate struktury składające się z jednakowych białkowych podjednostek – pilin. Fimbrie można zróżnicować ze względu na powinowactwo do struktur zawierających reszty mannozy. Fimbrie wykazujące wrażliwość na mannozę (MS) to fimbrie typu 1, zaś do fimbrii mannozo-opornych (MR) zalicza się fimbrie typu P, typu S oraz rodzinę białek Afa/Dr. Większość bak­terii wytwarza na swej powierzchni od kilku do nawet kilkuset fimbrii, często należących do różnych typów [14, 39, 47, 54, 61]. Duża liczba odmiennych adhezyn umożliwia UPEC kolonizację dróg moczowych nawet w przypadku zróżnicowanej ekspresji receptorów powierzchniowych komórek, generując przy tym różne efekty kliniczne. E. coli z fimbriami typu 1 częściej izoluje się w przypadku zapalenia pęcherza moczowego, gdyż naturalny receptor dla tych fimbrii UP 1a zlokalizowany jest na powierzchni błony śluzowej pęcherza moczowego. Z kolei szczepy UPEC z fimbriami typu P identyfikuje się w zakażeniach górnych dróg moczowych, głównie w odmiedniczkowym zapaleniu nerek [2, 7, 53, 61]. Fimbrie typu 1 są najczęściej spotykane wśród UPEC. Obecne są one również u innych gatunków z rodziny Enterobacteriaceae. Szacuje się, że ponad 85% szczepów E. coli posiada geny kodujące ten typ fimbrii, natomiast ponad 70% szczepów wytwarza je na swej powierzchni. Fimbrie typu 1 to włosowate struktury zakończone białkiem FimH, wiążącym się z różnymi receptorami. W drogach moczowych FimH poprzez wodorowęglanową część łączy się z zawierającym reszty mannozowe receptorem uroplakinowym 1a (UP 1a) komórek nabłonka pęcherza moczowego [7, 14, 39, 40]. Uroplakiny to glikoproteiny mieszczące się w błonie komórek urotelialnych. Ich główną rolą jest 52 S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA uszczelnienie urotelium oraz zmniejszenie jego przepuszczalności dla jonów i substancji rozpuszczonych w moczu [3, 14, 39]. Białko FimH pośredniczy w kolonizacji i inwazji nabłonka pęcherza moczowego oraz tworzeniu tzw. wspólnot bakteryjnych (IBCs, Intracellular Bacterial Communities), co ułatwia szczepom UPEC przeciwdziałać mechanizmom obronnym gospodarza [10]. Co istotne białko FimH pośredniczy, nie tylko w adhezji bakteryjnej, ale również w inwazji komórek nabłonka pęcherza moczowego. Badania przeprowadzone przez Martinez i współ. wykazały, że w przypadku bakteryjnej adhezji z udziałem fimbrii typu P (PapG) nie dochodziło do internalizacji komórek [37]. Białko FimH jest najważniejszym czynnikiem wirulencji szczepów UPEC, bez FimH bakterie nie potrafią skolonizować dróg moczowych, a zmiany genetyczne tego białka znoszą inwazyjność szczepów E. coli [14, 53]. W okresie ostatnich kilkunastu lat zidentyfikowano liczne odmiany alleliczne FimH, różniące się od naturalnego białka jednym aminokwasem. Zmiany te wpłynęły znacząco na właściwości wiążące tego białka, gdyż wszystkie naturalne warianty FimH łączą się ze strukturami trimannozowymi, podczas gdy ich zdolność do wiązania się z innymi receptorami zarówno węglowodanowymi oraz nie węglowodanowymi w tym monomannozowymi jest zdecydowanie zróżnicowana [64]. Badania pokazują, że około 80% komensalnych izolatów E. coli koduje adhezyny, które poprzez białko FimH wiążą tylko trimannozowe receptory, tymczasem blisko 70% szczepów UPEC posiada zmutowane FimH, przez co rośnie ich powinowactwo do pozostałych monomannozowych receptorów, co zwiększa stopień kolonizacji układu moczowego [40, 64]. Ostatnie badania wskazują również na udział fimbrii typu 1 w stymulowaniu bakteryjnej anutoagregacji i formowaniu biofilmu. Ponadto fimbrie typu 1 pośrednicząc w formowaniu biofilmu ułatwiają szczepom UPEC kolonizację cewników czy innych implantów, których obecność stwierdza się często u hospitalizowanych osób [39, 40]. Badania przeprowadzone przez Hunga i wsp., wykazały, że fimbrie typu 1 odgrywają kluczową rolę w stabilności i rozwoju struktury biofilmu. Adhezja bakterii z udziałem tych fimbrii jest niezbędna do utrzymania spójności tworzonej biomasy. Badania wykazały, bowiem, że zastosowanie szczepów z niefunkcjonalnym FimH, skutkowało utworzeniem cieńszego i słabszego biofilmu z widocznymi zaburzeniami integralności, w postaci pęknięć. Na podstawie badań przeprowadzonych przez Floyda i wsp., stwierdzono, również, że fimbrie typu 1 występują głównie u bakterii tworzących górną warstwę biofilmu, gdzie zapewniony jest dostęp powietrza [16, 26]. Do mechanizmów chroniących drogi moczowe przed inwazją bakteryjną należy wydzielane przez nerki białko Tamma-Horsfalla, produkowane w pętli Henlego. Wiele prac wskazuje na jego istotne działanie przeciwbakteryjne i immunomodulujące [24, 33, 42, 46, 53, 60]. Co ważne, białko Tamma-Horsfalla bezpośrednio łączy się z fimbrami typu 1, uniemożliwiając wiązanie bakterii z komórkami nabłonka. Ze względu na obecność w nim łańcucha o wysokiej zawartości mannozy dochodzi do połączenia z FimH, dzięki czemu część bakterii traci zdolność do związania się z receptorem UP 1a i adhezji do nabłonka dróg moczowych [53]. Fimbrie typu 1 występują u bakterii kolonizujących dolne odcinki układu moczowego, przy czym bardzo ważną rolę pewne właściwości tych fimbrii niezbędne do utrzymania bakterii w drogach moczowych. Przede wszystkim fimbrie typu 1 są sztywne, dzięki silnym połączeniom ze sobą poszczególnych jednostek, co ułatwia drobnoustrojom przeciwstawianie się nieregularnemu przepływowi moczu w cewce moczowej [2, 39, 54]. Fimbrie typu P odgrywają największą rolę wśród mannozoopornych fimbrii. Zakotwiczone są one w błonie zewnętrznej za pośrednictwem białka PapH. Włókno fimbrii składa się z powtarzających się podjednostek PapA, zaś na końcu struktury umieszczona jest adhezyna PapG. Istotne znaczenie odgrywają również inne białka PapE, PapF oraz regulujące długość włókna PapK. Adhezyna PapG rozpoznaje glikolipid receptorów obecnych na erytrocytach oraz komórkach występujących w kanalikach nerkowych. Co ciekawe nazwa fimbrii P wywodzi się z ich zdolności łączenia się z antygenem P krwinek czerwonych [39, 40, 61]. Fimbrie typu P często występują u bakterii UPEC powodujących odmiedniczkowe zapalenie nerek [4, 25, 59]. Badania naukowców wykazały obecność E. coli posiadających fimbrie P oraz powodujących mannozoporną hemaglutynację (Mannose-Resistant Hemagglutination – MRHA) u 94% szczepów odpowiedzialnych za odmiedniczkowe zapalenie nerek, tymczasem w przypadku zapalenia pęcherza odsetek ten wynosił zaledwie 19%, w bezobjawowej bakteriurii 17%, a u zdrowych dzieci 7%. Jednoznacznie można, więc stwierdzić, że fimbrie P przyczyniają się do zwiększonej wirulencji szczepu, wywołując groźne zakażenia [4]. Należy zwrócić również uwagę na fakt, że fimbrie P obserwowano u pacjentów z bezobjawową bakteriurią. Może stąd wynikać, że w dolnych odcinkach dróg moczowych obecne są miejsca wiążące PapG, które nie uruchamiają reakcji zapalnych [14, 25, 61]. W drogach moczowych bakterie narażone są na działanie mechanicznych sił obronnych gospodarza np. na przepływ moczu. W górnym odcinku układu moczowego strumień moczu jest bardziej regularny niż w dolnych drogach, co sprzyja kolonizacji przez szczepy E. coli posiadające fimbrie P, które są zdecydowanie bardziej elastyczne w porównaniu z fimbriami typu 1 [2, 25, 40]. ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE Fimbrie typu S składają się z dużej podjednostki SfaA, oraz trzech mniejszych SfaG, SfaH i SfaS. Jednostka SfaS zlokalizowana jest na końcu włókienka i może pośredniczyć w procesie łączenia się bak­terii z resztami kwasu sialowego receptorów komórek nabłonkowych nerek (kanaliki nerkowe, kłębuszki nerkowe) lub śródbłonka naczyń. Fimbrie typu S mogą uczestniczyć w rozprzestrzenianiu się bakterii do wnętrza tkanek gospodarza, albowiem są one wykrywane u szczepów wywołujących odmiedniczkowe zapalenie nerek, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych czy posocznicę. Ostatnie badania wskazują także na udział bakterii posiadających fimbrie typu S w zapaleniu pęcherza, gdyż reszty kwasu sialowego obecne są na UP 3, czyli integralnej części uroplakin występujących na powierzchni pęcherza [14, 39, 40]. Adhezyny z rodziny białek Dr/Afa to liczna grupa cząsteczek błonowych. Rodzina białek Dr/Afa reprezentowana jest przez adhezyny powiązane z fimbriami oraz adhezyny afimbriowe: Afa-I, Afa-II, Afa-III, Afa-IV oraz Dr-II [39, 40]. Z kolei inni uczeni proponują podział na adhezyny ludzkie tj. AfaE-I, AfaE-II, AfaE-III, AfaE-V, Dr, Dr-II, Nfa-I, F1845, AAF-I, AAF-II, AAF-III, adhezyny bydlęce oraz adhezyny występujące zarówno u ludzi jak i zwierząt [51]. Za zdolności wirulentne szczepów E. coli odpowiedzialne są głównie czynniki: DraE/AfaE oraz DraD/AfaD, które łączą się z komórkami gospodarza. Analiza genetyczna wykazała, że w przypadku AfaE-I istnieje 32% homologia z adhezynami Dr, z kolei sekwencja aminokwasowa AfaE-III manifestuje aż 98% zgodność z Dr [55, 62]. Wspólnym receptorem dla niemal wszystkich adhezyn z grupy Dr/Afa jest receptor DAF, czyli tzw. czynnik przyspieszający rozkład (Decay Accelerating Factor). Domeny DAF uczestniczą w regulacji układu dopełniacza. Fizjologiczną rolą DAF jest, bowiem skrócenie okresu półtrwania konwertaz, poprzez bezpośrednie oddziaływanie na C3b oraz C4b. Uniemożliwia to późniejszy wychwyt C2 oraz czynnika B. Receptory DAF w znacznej liczbie występują na powierzchni nabłonka jamy ustnej, błony śluzowej przewodu pokarmowego, pęcherza moczowego, moczowodów, kanalików nerkowych oraz błony śluzowej szyjki macicy i macicy. Czynnik DAF jest też ważnym receptorem dla szczepów E. coli posiadających adhezyny z rodziny Dr/Afa. Badania wykazały, że u myszy skolonizowanych szczepami E. coli Dr+ stwierdzano znaczne zmiany w nerkach, w tym śródmiąższowe zapalenie, zwłóknienia i atrofię, co bezpośrednio skorelowane jest z rozwinięciem się przewlekłej niewydolności nerek w późniejszym okresie. Zmian tych nie obserwowano u myszy zakażonych szczepami Dr– [55, 62]. Podczas ciąży DAF, ochrania płód przed szkodliwym działaniem układu dopełniacza. Kobiety w ciąży oraz dzieci są grupą szczególnie predysponowaną do 53 zakażeń E. coli Dr+. Przeprowadzone badania wskazały, bowiem, że blisko połowa dzieci z ZUM oraz około 30% kobiet w ciąży, (nawet 40% w III trymestrze ciąży) z odmiedniczkowym zapaleniem nerek było skolonizowanych przez szczepy posiadające adhezyny Dr. Dla kontrastu w grupie osób dorosłych, a zwłaszcza wśród kobiet niebędących w ciąży rzadziej izolowano szczepy E. coli Dr+ w zapaleniu pęcherza moczowego czy nawet w odmieniczkowym zapaleniu nerek [8, 39, 43, 55]. Ponadto wykazano, że 27% przedwczesnych porodów może być spowodowana przez ZUM [51]. W doświadczalnym modelu przewlekłego odmiedniczkowego zapalenia nerek u ciężarnych myszek po zakażeniu szczepami Dr+ zaobserwowano, że u 90% zwierząt dochodziło do przedwczesnego porodu [8, 39, 55]. Co więcej istnieje dwukrotnie większe ryzyko nawrotu zakażeń układu moczowego wywołanych przez szczepy E. coli Dr+. Ostatnio pojawiły się doniesienia, że szczepy UPEC kodujące adhezynę Dr mogą przetrwać ponad rok w nerkach. Najprawdopodobniej, dlatego nawroty zakażeń w przypadku tych bakterii są tak powszechne [14, 39, 40, 55]. Badania przeprowadzone przez Zhanga i wsp. w kierunku obecności szczepów E. coli posiadających adhezyny Dr/Afa wykazały, że 18% bakterii stanowiły szczepy AfaE-I, 12% było DraE pozytywnych, w 12% wyizolowano hybrydy DraE/AfaE-III i tylko w około 1,3% szczepy AfaE-II oraz AfaE-III [55]. Kolejnym receptorem wiążącym adhezyny Dr jest kolagen typu IV, który zlokalizowany jest w błonie podstawnej nabłonka dróg moczowych. Jedynie adhezyny Dr, a nie adhezyny Afa, łączą się z kolagenem typu IV [8, 39]. Co interesujące, AfaE-III nie wiąże się z receptorem typu IV, pomimo aż 98% zgodności z Dr (157 na 160 aminokwasów jest identycznych). Należy jednak zaznaczyć, że mutacje mogą wpływać na zdolność wiązania się z kolagenem typu IV. Ukierunkowana mutageneza wykazała, że w budowie adhezyny Dr w pozycji 54 wymagany jest aminokwas ujemnie naładowany, co zapewnia wiązanie się z chloramfenikolem a także ułatwia wiązanie się tej adhezyny z receptorem. Z kolei wymiana jednego aminokwasu w pozycji 113 podjednostki DraE skutkuje utratą wiązania kolagenu typu IV [39, 55]. Zakażenia układu moczowego powodowane przez wiążące się z kolagenem typu IV szczepy UPEC Dr+ przyczyniają się do rozwoju chronicznych pyelonephritis. Przeprowadzone badania na modelu zwierzęcym potwierdzają, że w przypadku zakażenia bakteriami eksprymującymi fimbrie Dr, dochodzi do rozwoju infekcji górnych dróg moczowych. Ponadto szczepy te są klasycznym przykładem drobnoustrojów powodujących odmiedniczkowe zapalenie nerek, które ciężko wyleczyć, gdyż bakterie te są trudne do wyeliminowania z organizmu gospodarza przez układ immunologiczny oraz stosowane chemioterapeutyki [8, 39, 55]. 54 S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA Kolejnymi dobrze poznanymi receptorami dla adhe­ zyn Dr/Afa są CEACAM, czyli karcynoembrionalne adhezyny. W obrębie CEACAM wyróżnia się: CEACAM 1, CEACAM 3, CEACAM 4, CEACAM 6, CEACAM 7, CEACAM 8 oraz CEA. Członkowie CEACAM to transmembranowe glikoproteiny należące do nadrodziny immunoglobulin, określane też, jako swoiste cząsteczki adhezyjne różnego typów komórek ludzkich. Pełnią one wiele ważnych funkcji w organizmie m.in. regulują wzrost komórek, biorą udział w różnicowaniu odpowiedzi immunologicznej, identyfikowaniu czy adhezji komórek [12, 23, 34, 39, 55]. CEACAM są też ważnym receptorem dla bakterii, ponadto przyleganie drobnoustrojów do CEACAM ułatwia inwazję do wnętrza komórek nabłonka dróg moczowych [23, 34, 39, 55]. Szczególnie ważną rolę odgrywa CEACAM 1 występujący między innymi na komórkach leukocytów (granulocyty, limfocyty T i B), ale także na komórkach śródbłonka, komórkach okrężnicy, komórkach nabłonka przełyku, dróg żółciowych, przewodów trzustkowych, kanalików nerek lub śluzówki macicy. CEACAM 1 zakotwiczony jest do błony komórkowej poprzez trans­ błonową część C-końcową; występuje w dwóch głównych izoformach tj. CEACAM 1-L oraz CEACAM 1-S, które różnią się między sobą domenami cytoplazmatycznymi. Cytoplazmatyczna domena CEACAM 1-L składa się z 73 aminokwasów oraz 2 motywów immunoreceptorowych hamujących opartych na tyrozynie ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibition Motif), zaś domena cytoplazmatyczna CEACAM 1-S zbudowana jest z 10 aminokwasów oraz nie posiada ITIM [12, 23, 39, 55]. 5.2. Odpowiedź immunologiczna gospodarza na zakażenie UPEC Obecność bakterii bądź też ich produktów w obrębie dróg moczowych stymuluje szybką odpowiedź immunologiczną. W ciągu pierwszych kilku godzin od infekcji wytwarzane są cytokiny oraz następuje napływ neutrofili, których celem jest wychwyt zainfekowanych komórek urotelium. Przyleganie bakterii UPEC do komórek gospodarza inicjuje wydzielanie cząstek prozapalnych np. IL-6, IL-8, TNF-α i produkcję tlenku azotu [40, 64]. Główną rolą wytwarzanej IL-8 jest przyciąganie do miejsca inwazji neutrofili, z kolei IL-6 stymuluje limfocyty B do różnicowania się w plazmocyty i wydzielania przeciwciał [14]. Adhezja bakterii przy udziale fimbrii typu 1 oraz fimbrii typu P aktywuje reakcję zapalną poprzez receptory TLR tj. rodzinę Toll-podobnych receptorów (Toll-Like Receptors). TLR rozpoznają wzorce molekularne patogenów (PAMP, Pathogen-Associated Molecular Patterns) oraz aktywują leukocyty, pełniąc tym samym istotną rolę w walce z zakażeniem. W organizmie ludzkim cząsteczki PAMP rozpoznawane są przez receptory PRR tj. receptory rozpoznające wzorce (Pattern Recognition Receptors) oraz rodzinę TLR, składającą się z 12 składowych. Do najważniejszych czynników z rodziny TLR rozpoznających uropatogeny należą: TLR 2 oraz heterodimery TLR 1/ TLR 2, TLR 6/TLR 2, TLR 4, TLR 5 i TLR 11. TLR 2 wykrywa lipoproteiny oraz kwas lipotejchojowy bakterii Gram-dodatnich, zaś TLR 4 jest głównym receptorem lipopolisacharydu (LPS). TLR odgrywają istotną rolę w przypadku zakażeń układu moczowego, gdyż zapoczątkowują skuteczną odpowiedź immunologiczną. Badania potwierdzają, że u myszy, u których ekspresja TLR 4 była zaburzona, neutrofile nie napływały do miejsca zakażenia i bakterie nie były efektywnie usuwane z dróg moczowych [1, 9]. Poszczególne odcinki układu moczowego w zróżnicowany sposób reagują na bodziec zapalny tj. LPS. Komórki nabłonkowe pęcherza wykazują wysoką ekspresję TLR 4, z kolei w komórkach nabłonkowych nerek ekspresja TLR 4 jest niewielka, co sprawia, że odpowiedź na uropatogenne bakterie jest zdecydowanie słabsza. Również adhezyny są w stanie reagować bezpośrednio z TLR inicjując odpowiedź układu odpornościowego [40]. W celu zwalczenia zakażenia komórki urotelium wytwarzają alfa defensyny HD 5 oraz beta defensyny HBD 1 zapobiegające rozwojowi infekcji, z kolei w momencie reakcji zapalnej pobudzone neutrofile wydzielają ludzkie defensyny neutrofilowe – HND 1, HND 2, HND 3 [14]. Kolejną odpowiedzią gospodarza na zakażenie UPEC jest złuszczanie zainfekowanych komórek w obrębie pęcherza moczowego. Badania przeprowadzone na zwierzętach wskazują, że intensywne złuszczanie komórek nabłonka następuje w ciągu 6 godzin od momentu zainfekowania szczepami E. coli, posiadającymi fimbrie typu 1. Proces eksfoliacji zależy od FimH, które aktywuje enzymy proteolityczne oraz zapoczątkowuje fragmentację DNA w komórkach gospodarza. Usunięcie zakażonych komórek nabłonkowych wraz moczem jest dość skuteczną obroną przeciwbakteryjną. Jednak z drugiej strony może nastąpić uwolnienie zainfekowanych komórek pęcherza moczowego do środowiska dróg moczowych, co ułatwia rozprzestrzenianie się bakterii [45, 64]. Należy również zaznaczyć, że podczas procesu złuszczania dochodzi do odsłonięcia głębszych warstw nabłonka. W przypadku uropatogenów dysponujących mechanizmami umożliwiającymi adhezję do kolejnych warstw komórek nie dochodzi do skutecznego ich wyeliminowania z układu moczowego, co skutkuje rozwojem infekcji [39]. Ponadto szczepy UPEC wykazują zdolność nie tylko do inwazji, ale również do uwalniania się z komórek nabłonkowych pęcherza przed zakończeniem procesu złuszczania. Bakterie, którym uda się uciec przed procesem eksfoliacji rozprzestrzeniają się na otaczającą ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE tkankę, inicjując zakażenie. Poza tym złuszczanie się komórek nabłonkowych pęcherza może nie obejmować komórek urotelium, które stają się tym samym podatne na infekcje. W komórkach tych bakterie mogą przetrwać od kilku tygodni do nawet kilku miesięcy. Bakterie w komórkach pęcherza moczowego często są niewykrywalne przez układ immunologiczny oraz są niedostępne dla antybiotyków stając się źródłem nawracających epizodów ZUM nękających wiele kobiet w ciągu ich życia [45, 64]. 6. Podsumowanie Zakażenia układu moczowego (ZUM) to jedne z najczęstszych infekcji występujących wśród dzieci i osób dorosłych. Patogeneza ZUM jest złożona gdyż mają na nią wpływ zarówno czynniki wirulencji drobnoustrojów jak również wiek chorego, obecność dysfunkcji układu moczowego czy zaburzeń odporności. Drobnoustroje powodujące ZUM, a w szczególności uropatogenne E. coli (UPEC) mają liczne czynniki zjadliwości, umożliwiające rozwój zakażenia. Wśród nich ważną rolę odgrywają fimbrie. Wczesne wykrycie ZUM oraz podjęcie właściwego leczenia jest niezmiernie ważne, gdyż zapobiega rozwojowi groźnych powikłań, w tym schyłkowej niewydolności nerek. Odpowiednia diag­nostyka i stosowana antybiotykoterapia zmniejszają ryzyko nawrotów ZUM w przyszłości oraz stwarzają szanse uzyskania trwałego efektu terapeutycznego u pacjentów. Piśmiennictwo 1. Anders H.J., Patole P.S.: Toll-like receptors recognize uropathogenic Escherichia coli and trigger inflammation in the urinary tract. Nephrol. Dial. Transplant. 20, 1529–1532 (2005) 2. Andersson M., Uhlin B.E., Fällman E.: The biomechanical properties of E. coli pili for urinary tract attachment reflect the host environment. Biophys. J. 93, 3008–3014 (2007) 3. Apodaca G.: The uroepithelium: not just a passive barrier. Traffic. 5, 117–128 (2004) 4.Baka-Ostrowska M.: Zakażenia układu moczowego u dzieci. Przeg. Urol. 40, 31–32 (2006) 5. Beveridge L.A., Davey P.G., Phillips G., McMurdo M.E.: Optimal management of urinary tract infections in older people. Clin. Interv. Aging. 6, 173–180 (2011) 6. Bochniewska V., Goszczyk A., Jung A.: Zakażenie układu moczowego u dzieci. Pediatr. Med. Rodz. 2, 30–37 (2006) 7. Bouckaert J., Knight S.D. i wsp.: The affinity of the FimH fimbrial adhesin is receptor-driven and quasi-independent of Escherichia coli pathotypes. Mol. Microbiol. 61, 1556–1568 (2006) 8. Bury K.: Białka DraD Uropatogennych szczepów Escherichia coli Dr+-Mechanizm Transportu na Powierzchnię Komórki i Rola w Procesie Polimeryzacji Struktur Fimbrialnych. Rozprawa Doktorska. Gdańsk (2008). http://pbc.gda.pl/Content/3596/ phd_bury_katarzyna.pdf (27 czerwiec 2015 roku) 9. Chassin C., Vandewalle A. i wsp.: Renal collecting duct epithelial cells react to pyelonephritis-associated Escherichia coli by activa- 55 ting distinct TLR4-dependent and -independent inflammatory pathways. J. Immunol. 177, 4773–4784 (2006) 10. Chen S.L., Hung C.S., Pinkner J.S., Walker J.N., Cusumano C.K., Li Z., Bouckaert J., Gordon J.I., Hultgren S.J.: Positive selection identifies an in vivo role for FimH during urinary tract infection in addition to mannose binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 22439–22444 (2009) 11.Chlabicz S., Leszczyńska K., Lukas W., Gualco L., Schito G., Naber K.G.: Niepowikłane zakażenia dolnych dróg moczowych u kobiet – obraz kliniczny, etiologia i wrażliwość na antybiotyki najczęstszych patogenów. Wyniki badania ARESC (Antimicrobial Resistance Epidemiological Survey on Cystitis) w Polsce i ich znaczenie w wyborze terapii empirycznej. Przegl. Epidemiol. 65, 345–351 (2011) 12.Czepczyńska-Krężel H., Krop-Wątorek A.: Rodzina ludzkich białek antygenu karcynoembrionalnego, struktura i funkcja. Postepy. Hig. Med. Dosw. 66, 521–533 (2012) 13.Davis J.M., Rasmussen S.B., O’Brien A.D.: Cytotoxic necrotizing factor type 1 production by uropathogenic Escherichia coli modulates polymorphonuclear leukocyte function. Infect. Immun. 73, 5301–5310 (2005) 14. Dybowski B.: Sztuka walki i kamuflażu u uropatogenów. Patofizjologia ostrego bakteryjnego zapalenia pęcherza moczowego. Przeg. Urol. 43, 47–48 (2007) 15. Fabbri A., Travaglione S., Fiorentini C.: Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor 1 (CNF1): toxin biology, in vivo applications and therapeutic potential. Toxins (Basel), 2, 283–296 (2010) 16.Floyd K.A., Moore J.L., Eberly A.R., Good J.A., Shaffer C.L., Zaver H., Almqvist F., Skaar E.P., Caprioli R.M., Hadjifran­ giskou M.: Adhesive fiber stratification in uropathogenic Escherichia coli biofilms unveils oxygen mediated control of type 1 pili. PLoS Pathog. 11, e1004697 (2015) 17. Foxman B.: Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis. Mon. 49, 53–70 (2003) 18. Garcia E.C., Brumbaugh A.R., Mobley H.L.: Redundancy and specificity of Escherichia coli iron acquisition systems during urinary tract infection. Infect. Immun. 79, 1225–1235 (2011) 19. Garin E.H., Olavarria F., Garcia Nieto V., Valenciano B., Campos A., Young L.: Clinical significance of primary vesicoureteral reflux and urinary antibiotic prophylaxis after acute pyelonephritis: a multicenter, randomized, controlled study. Pediatrics. 117, 626–632 (2006) 20.Giedrys-Kalemba S., Jursa J.: Zakażenia dróg moczowych na oddziałach urologicznych. Przeg. Urol. 44, 98–101 (2007) 21. Grabe M., Bjerklund-Johansen T.E., Botto H., Çek M., Naber K.G., Pickard R.S., Tenke P.,Wagenlehner F., Wullt B.: Guidelines on urological infections. European Association of Urology, 2013. http://uroweb.org/wp-content/uploads/18_Urological-infections_LR.pdf (27 czerwiec 2015 roku) 22. Grzesik A., Poletyło A., Wolska A.: Czynniki etiologiczne zakażeń układu moczowego u dzieci leczonych w Instytucie Matki i Dziecka. Med. Wieku. Rozwoj. 12, 789–794 (2008) 23. Heine M., Schumacher U. i wsp.: Investigations on the Usefulness of CEACAMs as Potential Imaging Targets for Molecular Imaging Purposes. PloS. One. 6, e28030 (2011) 24. Hong C.Y., Wong N.K., Abdullah M.: Immunomodulatory properties of Tamm-Horsfall glycoprotein (THP) and uromodulin. Asian. Pac. J. Allergy. Immunol. 33, 26–32 (2015) 25. Hryniewicz W., Sulikowska A.: Pozaszpitalne zakażenia układu moczowego. Przeg. Urol. 3, 7 (2001) 26.Hung C., Zhou Y., Pinkner J.S., Dodson K.W., Crowley J.R., Heuser J., Chapman M.R., Hadjifrangiskou M., Henderson J.P., Hultgren S.J.: Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4, e00645-13 (2013) 56 S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA 27. Ismaili K., Lolin K., Damry N., Alexander M., Lepage P., Hall M.: Febrile urinary tract infections in 0-to 3-month-old infants: a prospective follow-up study. J. Pediatr. 158, 91–94 (2011) 28. Kamble G.A., Shah R.C., Tumane P.M.: Characterization and antibiogram study of E.coli clinical isolates. Biosci. Biotechnol. Res. Asia. 10, 329–332 (2013) 29. Kari J.A., El-Desoky S.M., Basnawi F., Bahrawi O.: Vesicoureteric reflux in children. Urol. Ann. 5, 232–236 (2013) 30.Karunajeewa H., McGechie D., Stuccio G., Stingemore N., Davis W.A., Davis T.M.: Asymptomatic bacteriuria as a predictor of subsequent hospitalisation with urinary tract infections in diabetic adults: the fremantle diabetes study. Diabetologia, 48, 1288–1291 (2005) 31.Kasprzykowska U., Sobieszczańska B.M.: Plastyczność bakteryjnych genomów – wewnątrzkomórkowy transfer genów. Post. Mikrobiol. 53, 153–163 (2014) 32. Kiliś-Pstrusińska K.: Zakażenia układu moczowego. Prakt. Lek. Zeszyty specjalistyczne, 72, 1–13 (2012) 33. Kreft B., Jabs W.J., Laskay T., Klinger M., Solbach W., Kumar S., van Zandbergen G.: Polarized expression of Tamm-Horsfall protein by renal tubular epithelial cells activates human granulocytes. Infect. Immun. 70, 2650–2656 (2002) 34. Kuespert K., Pils S., Hauck C.R.: CEACAMs: their role in physiology and pathophysiology. Curr. Opin. Cell. Biol. 18, 565–571 (2006) 35.Kupilas A.: Przewlekłe zakażenia układu moczowego. Przeg. Urol. 63, 19–24 (2010) 36. Linhares I., Raposo T., Rodrigues A., Almeida A.: Frequency of antimicrobial resistance patterns of bacteria implicated in community urinary tract infections: a ten-year serveillance study (2000–2009). BMC. Infect. Dis. 13, (2013) doi:10.1186/14712334-13-19 37.Martinez J.J., Mulvey M.A., Schilling J.D., Pinkner J.S., Hultgren S.J.: Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. EMBO J. 19, 2803–2812 (2000) 38. Matusiak D.M.: Zakażenia układu moczowego z udziałem Proteus mirabilis – rola biofilmu i inkrustacji cewnika urologicznego. Post. Mikrobiol. 53, 173–181 (2014) 39. Mirecka A.: Adhezja uropatogennych szczepów Escherichia coli do komórek nabłonka moczowego. Patomechanizm zakażeń układu moczowego. Przeg. Urol. 68, 7–13 (2011) 40. Mulvey M.A.: Adhesion and entry of uropathogenic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 4, 257–271 (2002) 41.Murray P.R., Rosenthal K.S., Pfaller M.A. Enterobacteriaceae (w) Mikrobiologia, red. wyd. pol. Przondo-Mordarska A., Elsevier Urban & Partner, Wrocław, 2011, s. 305. 42. Nitschke M., Wiehl S., Baer P.C., Kreft B.: Bactericidal activity of renal tubular cells: the putative role of human beta-defensins. Exp. Nephrol. 10, 332–337 (2002) 43. Nowicki B., Selvarangan R., Nowicki S.: Family of Escherichia coli Dr adhesins: decay-accelerating factor receptor recognition and invasiveness. J. Infect. Dis. 183 Suppl 1, 24–27 (2001) 44. Okrągła E., Szychowska K., Wolska L.: Mechanizmy utrzymania sterylności układu moczowego. Postępy. Hig. Med. Dosw. 68, 684–694 (2014) 45.Ostrowska K., Strzelczyk A., Różalski A., Stączek P.: Biofilm bakteryjny jako przyczyna zakażeń układu moczowego – mikroorganizmy patogenne, metody prewencji i eradykacji. Postępy Hig. Med. Dosw. 67, 1027–1033 (2013) 46. Pak J., Pu Y., Zhang Z.T., Hasty D.L., Wu X.R.: Tamm-Horsfall protein binds to type 1 fimbriated Escherichia coli and prevents E. coli from binding to uroplakin Ia and Ib receptors. J. Biol. Chem. 276, 9924–9930 (2001) 47. Pinkner J.S., Almqvist F. i wsp.: Rationally designed small compounds inhibit pilus biogenesis in uropathogenic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 17897–17902 (2006) 48. Prączko K., Kostka T.: Infekcje u osób starszych. Część I. Etiologia i patogeneza. Wiad. Lek. 59, 538–541 (2006) 49. Prywer J., Olszynski M., Torzewska A., Mielniczek-Brzóska E.: Comparative in vitro studies on disodium EDTA effect with and without Proteus mirabilis on the crystallization of carbonate apatite and struvite. J. Cryst. Growth. 395, 123–131 (2014) 50. Raz R., Gennesin Y., Wasser J., Stoler Z., Rosenfeld S., Rottensterich E., Stamm W.E.: Recurrent urinary tract infections in postmenopausal women. Clin. Infect. Dis. 30, 152–156 (2000) 51. Ronald A.: The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis. Mon. 49, 71–82 (2003) 52. Różański W.: Kamica struwitowa. Przeg. Urol. 60, 16–20 (2010) 53. Säemann M.D., Weichhart T., Hörl W.H., Zlabinger G.J.: Tamm-Horsfall protein: a multilayered defence molecule against urinary tract infection. Eur. J. Clin. Invest. 35, 227–235 (2005) 54. Schwan W.R., Lee J.L., Lenard F.A., Matthews B.T., Beck M.T.: Osmolarity and pH growth conditions regulate fim gene transcription and type 1 pilus expression in uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 70, 1391–1402 (2002) 55. Servin A.L.: Pathogenesis of Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 18, 264–292 (2005) 56. Shahid S.K.: Phimosis in Children. ISRN Urol. (2012) doi:10.5402 /2012/707329 57. Szewczyk E.M. Diagnostyka chorób infekcyjnych układu moczowego, Pałeczki jelitowe – Enterobacteriaceae (w) Diagnostyka bakteriologiczna, red. Kruczyńska K., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2013, s. 150, 316–326. 58.Walters M.S., Lane M.C., Vigil P.D., Smith S.N., Walk S.T., Mobley H.L.: Kinetics of uropathogenic Escherichia coli metapopulaion movement during Urinary Tract Infections. MBio. 3, (2012) doi: 10.1128/mBio.00303-11 59. Watts R.E., Tan C.K., Ulett G.C., Carey A.J., Totsika M., Idris A., Paton A.W., Morona R., Paton J.C., Schembri M.A.: Escherichia coli 83972 expressing a P fimbriae oligosaccharide receptor mimic impairs adhesion of uropathogenic E. coli. J. Infect. Dis. 206, 1242–1249 (2012) 60. Wu C.H., Li K.J., Siao S.C., Chen Y.H., Wu T.H., Tsai C.Y. Yu .L.: The binding affinity and molecular basis of the structure binding relationship between urinary Tamm-Horsfall glycoprotein and tumor necrosis factor-α. Molecules. 17, 11978–11989 (2012) 61. Wullt B., Bergsten G., Connell H., Röllano P., Gebretsadik N., Hull R., Svanborg C.: P fimbriae enhance the early establishment of Escherichia coli in the human urinary tract. Mol. Microbiol. 38, 456–464 (2000) 62.Zalewska-Piątek B., Wilkanowicz S., Bruździak P., Piątek R., Kur J.: Biochemical characteristic of biofilm of uropathogenic Escherichia coli Dr(+) strains. Microbiol. Res. 168, 367–378 (2013) 63.Zaw M.T., Yamasaki E., Yamamoto S., Nair G.B., Kawamoto K. Kurazono H.: Uropathogenic specific protein gene, highly distributed in extraintestinal uropathogenic Escherichia coli, encodes a new member of H-N-Hnuclease superfamily. Gut. Pathogens. 5, (2013) doi:10.1186/1757-4749-5-13 64. Zhou G., Mo W.J., Sebbel P., Min G., Neubert T.A., Glockshuber R., Wu X.R., Sun T.T., Kong X.P.: Uroplakin Ia is the uro­ thelial receptor for uropathogenic Escherichia coli: evidence from in vitro FimH binding. J. Cell. Sci. 114, 4095–4103 (2001) POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 57–67 http://www.pm.microbiology.pl SKŁADNIKI MIKROBIOMU JAMY USTNEJ JAKO CZYNNIKI RYZYKA ZAKAŻEŃ LOKALNYCH I UOGÓLNIONYCH U PACJENTÓW BEZ ORAZ Z WADAMI WRODZONYMI NARZĄDU ŻUCIA Konrad Perkowski1*, Paweł J. Zawadzki2, Bohdan Starościak3, Monika Dybicz4, Marcin Padzik5, Magdalena Marczyńska-Stolarek1, Lidia Chomicz5 Zakład Ortodoncji WUM; 2 Klinika Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowej, Jamy Ustnej i Implantologii WUM 3 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej WUM; 4 Katedra i Zakład Biologii Ogólnej i Parazytologii WUM 5 Zakład Biologii Medycznej WUM 1 Wpłynęło w kwietniu 2015 r. Zaakceptowano w październiku 2015 r. 1. Czynniki wpływające na dynamikę środowiska jamy ustnej 2. Mikrobiota jamy ustnej u pacjentów bez wrodzonych wad narządu żucia 3. Wpływ wad narządu żucia i ich leczenia na środowisko jamy ustnej 4. Mikrobiota w jamie ustnej pacjentów z wrodzonymi wadami narządu żucia 4.1. Bakterie w jamie ustnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie 4.2. Patogeniczne Protista w mikrobiomie jamy ustnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie 4.3. Grzyby w jamie ustnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie 5. Podsumowanie Components of oral microbiome as potential risk factors of local and general infections in patients with and without congenital malformations of masticatory system Abstract: The oral cavity is an open system with complex and dynamic relations between the human host and the microbiota. Stomatognathic disorders, cleft lip and palate are the most common congenital malformations. Incidence varies from 1/500 to 1/2500 live births. In Poland, it appears every year in 800 newborns, as a single disorder or in syndromes. The environmental and hereditary factors , both have influence on the development of this pathology. Treatment of patients with cleft malformations is comprehensive and long-lasting, and includes orthodontic treatment. Both the malformation and the use of orthodontic appliances change significantly the condition of the patients’ oral cavities. Such changes have an impact on the oral cavity microbiota, shifting the composition of physiological microorganisms and evoking the appearance of opportunistic and potentially pathogenic bacteria, fungi and/or protists. Analysis of the available literature implicates that co-infections with different opportunistic/ pathogenic strains are potentially serious risk factors of local and general complications in patients with various congenital malformations. It should be emphasized that the human oral cavity may act as a major, yet poorly known, reservoir of microorganisms that can induce clinically important infections. However, there are scarce data concerning the presence of opportunistic bacteria, fungi and protists in patients with congenital cleft malformations, thus, further studies are highly important to decrease a risk of medical complications. 1. Factors influencing the dynamics of oral cavity environment. 2. Oral cavity microbiota in patients without congenital malformations of the masticatory system. 3. Influence of malformations of the masticatory system and specific treatment on oral cavity environment. 4. Oral cavity microbiota in patients with malformations of masticatory system. 4.1. Bacteria in the oral cavity of patients with congenital malformations of the masticatory system treated orthodontically. 4.2. Pathogenic Protista in the oral microbiome of patients with congenital malformations of the masticatory system treated orthodontically. 4.3. Fungi in the oral cavity of the patients with malformations of the masticatory system treated orthodontically. 5. Summary Słowa kluczowe: Key words: czynniki ryzyka infekcji lokalnych i uogólnionych, leczenie ortodontyczne, mikrobiota jamy ustnej, wady wrodzone narządu żucia local and general infection risk factors, orthodontic treatment, oral cavity microbiota, congenital malformations of masticatory system 1. Czynniki wpływające na dynamikę środowiska jamy ustnej Jama ustna z zębami, przyzębiem i tkankami miękkimi stanowi podstawową składową narządu żucia – złożonej jednostki morfologiczno-czynnościowej. Warunki biotyczne oraz abiotyczne panujące w niej są zróżnicowane, a dynamika jej składników – zmienna w czasie i zależna od właściwości poszczególnych powierzchni. Różne warunki panują na twardych powierzchniach zębów, w przestrzeniach międzyzębo- wych, na rozbudowanych, miękkich, odmiennie wyspecjalizowanych, nabłonkowych powierzchniach dziąseł, policzków, na brodawkowatym grzbiecie języka oraz na rogowaciejącym nabłonku podniebienia. Różnice dotyczą wielu cech, m. in.: parcjalnego ciśnienia tlenu, stężenia jonów wodorowych, składu i szybkości przepływu śliny, substancji odżywczych zawartych w ślinie, w płynie dziąsłowym i w pożywieniu człowieka, skutków działania środków higieny na poszczególne struktury jamy ustnej. Właściwości te mają wpływ na wnikanie do jamy ustnej mikroorganizmów, kolonizację przez * Autor korespondencyjny: Zakład Ortodoncji WUM, ul. Nowogrodzka 59, 02-005 Warszawa; e-mail: [email protected] 58 K. PERKOWSKI, P.J. ZAWADZKI, B. STAROŚCIAK, M. DYBICZ, M. PADZIK, M. MARCZYŃSKA-STOLAREK, L. CHOMICZ nie struktur narządu żucia oraz namnażanie się tych drobnoustrojów. Tworzą one wielogatunkowe zbiorowisko, o złożonych oddziaływaniach – wzajemnych oraz w odniesieniu do ludzkiego organizmu [61, 65]. Poszczególne gatunki komensaliczne, symbiotyczne oraz potencjalnie chorobotwórcze, tworzące mikrobiom narządu żucia, wykazują specyficzne preferencje topiczne, różnią się pod względem nisz ekologicznych. W zdrowej jamie ustnej pojedyncze mikroorga­nizmy oraz ich mikrokolonie przylegające do powierzchni stałych, miękkich i twardych tworzą biofilm; w tym zbiorze drobnoustrojów synergistyczne i antagonistyczne oddziaływania między gatunkami rezydującymi, w tym także potencjalnie chorobotwórczymi, pozostają we względnej, dynamicznej równowadze – homeostazie [31, 65, 66, 101]. Równocześnie mechanizmy obronne ludzkiego organizmu przeciwdziałają nadmiernemu namnażaniu się drobnoustrojów. Utrata homeostazy mikrobiota jamy ustnej prowadzić może do rozwoju zmian chorobowych, przy czym dochodzić może do nadmiernego namnażania niektórych rezydujących drobnoustrojów płytki nazębnej i błony śluzowej, jak też zasiedlania tych struktur przez gatunki egzogenne, w tym szczepy oportunistyczne oraz chorobotwórcze [61, 65]. Prezentowane opracowanie dotyczy badań nad skład­nikami mikrobiota jamy ustnej: bakteriami, pierwotniakami i grzybami. Uwzględniono dane o potencjalnych czynnikach infekcji lokalnych i uogólnionych, wykrywanych w grupie populacyjnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie – w porównaniu do składników mikrobiota pacjentów bez wad wrodzonych narządu żucia. 2.Mikrobiota jamy ustnej u pacjentów bez wrodzonych wad narządu żucia Dynamika składników bakteryjnych mikrobiomu jamy ustnej stanowi przedmiot badań prowadzonych w różnych grupach populacyjnych w wielu ośrodkach w Polsce i na Świecie [61, 65, 84]. Większość publikacji dotyczy patogenów, związanych z rozwojem próchnicy oraz choroby przyzębia, uważanych za choroby społeczne. Mikrobiota jamy ustnej, nie łączone związkiem przyczynowo-skutkowym bezpośrednio z tymi dwiema grupami chorób, badane były rzadziej, w niewielu kategoriach grup populacyjnych. Wśród ponad 1000 gatunków/szczepów drobnous­ trojów mogących zasiedlać jamę ustną przeważają bakterie; w różnych siedliskach jednej jamy ustnej wykrywa się kilkadziesiąt gatunków bakterii [61, 65, 66]. Najliczniej reprezentowane są Gram-dodatnie paciorkowce z rodzaju Streptococcus: S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. salivarius – tlenowce i beztlenowce względne. Pacior- kowce te są zdolne do kolonizowania powłoki śluzowej nabłonka i osłonki nabytej powierzchni zębów jako tzw. gatunki pionierskie, tworząc warunki do zasiedlania jamy ustnej poprzez sukcesję Gram-ujemnych ziarenkowców beztlenowych z rodzajów: Veilonella, Capnocytophaga, Campylobacter. Powstaje bardziej zróżni­ co­wane gatunkowo tzw. zbiorowisko ostateczne [65]. Wykrywane są w nim bakterie – pałeczki Gram-dodatnie: Lactobacillus acidophilus, L. salivarius, L. fer­mentum, Bifidobacterium dentium, Actinomyces israelli, A. odontolyticus, oraz Gram-ujemne z rodzaju Actinobacillus, Porphyromonas i in. [61, 65 ]. Podkreśla się, że w skład tego zbiorowiska ostatecznego wchodzą osiedlone, rezydujące mikroorganizmy. Skład ten jest stosunkowo stały, pomimo dużej dynamiki związanej z wpływem różnych czynników środowiskowych oraz reakcji obronnych ludzkiego organizmu oddziałujących na bakterie. Stałość składu mikroorganizmów rezydujących opiera się na utrzymywaniu ich w labilnej równowadze dzięki kompensacji oddziaływań środowiska i organizmu człowieka przez mechanizm sprzężenia zwrotnego [65, 66]. Badania mikrobiomu jamy ustnej koncentrowały się przez wiele lat na dwóch grupach bakterii: gatunkach próchnicotwórczych oraz na bakteriach, którym przypisuje się istotną rolę w chorobach przyzębia. Badano zróżnicowanie gatunkowe bakterii w zależności od etapu rozwoju uzębienia oraz od zmian warunków, panujących w jamie ustnej. Wykryto zależność zmian w składzie gatunkowym bakterii od diety, nawyków higienicznych, chorób ogólnych, ich leczenia oraz wielu innych czynników [65, 89]. Dzięki dziesiątkom lat intensywnych badań poznano bakteryjną etiologię próchnicy; opisano relacje między różnymi gatunkami bakterii płytki nazębnej, a występowaniem i dynamiką próchnicy zębów w różnych okresach ontogenezy człowieka. Szczególnie istotną rolę w inicjowaniu próchnicy odgrywają paciorkowce Streptococcus mutans, uczestniczące we wczesnej demineralizacji szkliwa zębów oraz różne szczepy pałeczek kwasomlekowych, powodujących powstawanie ubytków i dalszy rozwój procesu próchniczego [35, 36, 61]. W ciągu ostatnich kilku lat zwrócono uwagę na nowy gatunek – Scardovia wiggsiae, laseczki Gram-dodatnie, które znacząco wpływają na rozwój tzw. próchnicy wczesnego dzieciństwa (early childhood caries – ECC). Są one wykrywane w początkowych zmianach próchnicowych także u dorosłych [29, 97, 99]. W wielu przypadkach próchnicy stwierdzano występowanie laseczek Scardovia wiggsiae zarówno ze współwystępującymi paciorkowcami Streptococcus mutans, jak i bez innych patogenów towarzyszących. Znaczna liczba badań dotyczy roli drobnoustrojów w powstawaniu i przebiegu chorób przyzębia [74, 75, 102] . Periodontopatie, podobnie jak próchnica, uważane są za jedną z najczęstszych przyczyn przedwczes­ SKŁADNIKI MIKROBIOMU JAMY USTNEJ JAKO CZYNNIKI RYZYKA ZAKAŻEŃ LOKALNYCH nej utraty uzębienia; z tego też powodu zaliczane są one do chorób społecznych. Schorzenia przyzębia dotyczą tkanek podtrzymujących zęby, dziąseł, ozębnej, kości wyrostka zębodołowego oraz cementu korzeniowego; mogą one obejmować wszystkie wymienione rejony jamy ustnej lub wybrane części przyzębia, dając różny obraz kliniczny. Wyjaśnienie etiologii chorób przy­zębia jest trudne ze względu na złożone, niejednokrotnie wieloczynnikowe podłoże tych chorób, utrudniające także ujednolicenie ich klasyfikacji. Jedna z klasyfikacji, zaproponowana przez Offenbachera w 2008 roku, wiąże stan przyzębia z występowaniem bakterii Campylobacter rectus [47, 74]. Rola przypisywana drobnoustrojom w etiopatogenezie chorób przyzębia oraz ich źródła są nadal przedmiotem badań. Różne bakterie płytki nazębnej oraz egzogenne uważane są za czynniki etiologiczne w pewnych chorobach przyzębia, inicjujące niespecyficzny proces zapalny. Niektóre rodzaje chorób przyzębia mogą jednak mieć specyficzną etio­ logię, związaną z bezpośrednią aktywnością określonych gatunków bakterii, jak w agresywnym zapaleniu przyzębia, w którym główna rola przypisywana jest bakteriom z rodzaju Actinobacillus oraz Porphyromonas gingivalis [61, 65, 96]. Na powstawanie i przebieg chorób przyzębia ma wpływ szereg czynników, dotyczących zarówno drobno­ ustrojów, jak i reakcji obronnej ludzkiego orga­nizmu. Rozwój chorobowych zmian wynika z utraty homeo­ stazy mikrobiomu jamy ustnej i następuje pod wpływem wielu czynników wewnątrz- i/lub zewnątrzpochodnych [61]. Podkreślany jest m. innymi wpływ wieku, występowania chorób układowych, chorób metabolicznych, zaburzeń układu stomatognatycznego, zakażeń wirusowych, ubocznych skutków farmakoterapii. Zaburzenie równowagi między reakcjami obronnymi ludzkiego organizmu a działaniem bakterii jamy ustnej sprzyja stanom zapalnym i zmianom chorobowym o różnym nasileniu; rozwój choroby przyzębia jest więc wypadkową działania drobnoustrojów i odporności ludzkiego organizmu, modyfikowanej przez dodatkowo występujące czynniki ryzyka [46, 61]. W jamie ustnej stwierdzana jest także obecność grzybów drożdżopodobnych [61, 65]. W krajach europejskich, w tym w Polsce dominują inwazje drożdżopodobnych grzybów z rodzaju Candida [56, 61]. W ostatnich 20 latach znacznie wzrosła częstość zakażeń grzybami [68, 69]. Spośród opisanych ok. 500 gatunków najczęściej izolowane są szczepy Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, rzadziej: C. pseudotropicalis oraz C. parapsilosis. Drożdżopodobne grzyby są szeroko rozpowszechnione w środowisku człowieka; trafiają do wnętrza organizmu przez uszkodzoną błonę śluzową, skórę, drogą inhalacyjna, pokarmową, płciową. Wchodzą w skład różnych ontocenoz narządowych, lecz w żadnym razie nie mogą być uznane za 59 tzw. składniki fizjologiczne [54, 55]. Podobnie jak to dzieje się w przypadku bakterii, grzyby mogą zasiedlić jamę ustną zarówno we wczesnych, jak i późniejszych etapach rozwoju osobniczego. Grzyby drożdżopodobne z rodzaju Candida pochodzenia egzogennego, występujące w ontocenozie jamy ustnej, lokalizują się głównie na grzbiecie języka oraz na błonie śluzowej policzków i podniebienia. U 40 –60% ludzi grzyby te nie powodują wyraźnych zmian chorobowych między innymi dzięki równoważącemu działaniu histatyn śliny – inhibitorów C. albicans. Pomimo znacznej rozbieżności danych o częstości występowania Candida, podawanych przez różnych autorów, istnieje zgodność co do wykrywania grzybów drożdżopodobnych u osób ze zdrową jamą ustną, także u dzieci i młodzieży; często stwierdzane jest nosicielstwo szczepów Candida [94, 95, 99, 104]. Kandydoza, choroba o charakterze zapalnym – rozwija się zazwyczaj jako endogenne zakażenie oportunistyczne, któremu sprzyjają czynniki podwyższonego lub wysokiego ryzyka rozwoju grzybicy: pierwotne i wtórne niedobory odporności, zabiegi chirurgiczne, immunosupresja. Rozwija się m.in. u noworodków, osób z niedożywieniem, z chorobami układowymi, metabolicznymi, u osób upośledzonych umysłowo, przy antybiotykoterapii, u pacjentów leczonych cytostatykami, osób zakażonych wirusem HIV [45, 54, 55, 80, 90]. Zarazem składniki ściany komórkowej grzybów i produkty uwalniane przez ich komórki mogą indukować obniżenie odpowiedzi komórkowej, przez co stanowią poważne zagrożenie zdrowia, nawet u osób ze sprawnym układem immunologicznym [68, 85]. Duża gęstość populacji grzybów w jamie ustnej, gardle i krtani stanowi poważne ryzyko rozwoju grzybicy uogólnionej [83]. 3. Wpływ wad narządu żucia i ich leczenia na środowisko jamy ustnej Przyczyny powstawania wielu wad wrodzonych nie są ostatecznie wyjaśnione. Podkreśla się rolę wpływu środowiska, chorób matki, podeszłego wieku rodziców i in. Niektóre wady wrodzone powstają w pierwszych tygodniach ciąży, gdy na płód działają szkodliwe czynniki środowiskowe np.: promieniowanie RTG, niektóre leki, inne związki chemiczne. Uważa się, że takie wady jak rozszczep wargi i podniebienia, całkowity i częś­ ciowy, zależne są od czynników środowiskowych oraz genetycznych; te wrodzone wady występują z częs­ tością od 1:500 do 1:2500 żywych urodzeń [43, 92]. Mogą występować jako jeden z objawów w zespołach wad wrodzonych, np. w zespole Treachera-Collins’a, Pierre-Robina i in., lub jako wady izolowane. W Polsce rodzi się rocznie około 800 dzieci, u których występują te wady [5, 63]. 60 K. PERKOWSKI, P.J. ZAWADZKI, B. STAROŚCIAK, M. DYBICZ, M. PADZIK, M. MARCZYŃSKA-STOLAREK, L. CHOMICZ Zwykle trudno ustalić jednoznacznie przyczynę powstania rozszczepu; przyjmuje się, że zaburzenie powstało na skutek działania wielu czynników – na istniejącą predyspozycję genetyczną nałożył się wpływ środowiska, sprzyjający rozwojowi deformacji [41, 70, 100]. Deformacje rozszczepowe powstają w czasie tworzenia się odpowiednich struktur podniebienia. Brak ciągłości anatomicznej i zniekształcenia struktury prowadzą do zaburzeń czynności: żucia, połykania, oddychania, a także mowy i słuchu. Rozszczepy wargi oraz podniebienia są zamykane operacyjnie. Obecnie stosuje się różne harmonogramy operacji – terminy zabiegów zależą od przyjętej metody [3]. Podkreślenia wymaga rola szczególnych warunków panujących w jamie ustnej pacjentów z rozszczepem wargi i podniebienia [2, 23, 63, 90]. U osób z wadami wrodzonymi narządu żucia, po zabiegu chirurgicznego zamknięcia rozszczepów pozostają blizny, a często także szczeliny na podniebieniu oraz na wyrostku zębodołowym, stanowiące miejsca zalegania śliny, a także resztek pokarmowych. Zabiegi higieniczne w tych okolicach są utrudnione, co zmienia zarówno warunki morfologiczne jak i fizjologiczne panujące w jamie ustnej. Zaburzenia homeostazy mikrobiota mogą sprzyjać powstawaniu lokalnych stanów zapalnych [61, 79]. U pacjentów z wadami rozszczepowymi stwierdza się wysokie wartości parametrów określających stan jamy ustnej: wskaźnika płytki, krwawienia oraz liczby PUW (wskaźnik intensyw­ności próchnicy), znacznie wyższe niż w innych grupach populacyjnych [18, 22, 37, 80]. Pacjenci z rozszczepem wargi i podniebienia wymagają leczenia zespołowego – chirurgicznego, laryngologicznego, stomatologicznego, ortodontycznego, rehabilitacji logopedycznej i in. Prowadzenie leczenia ortodontycznego wiąże się ze stosowaniem aparatów ortodontycznych. W ortopedii szczękowo-twarzowej (ortodoncji) stosowane są aparaty stałe i zdejmowane, różniące się budową i wskazaniami do stosowania. Aparaty zdejmowane stosowane są zarówno u dzieci jak i u pacjentów dorosłych. Zasadniczymi wskazaniami do stosowania zdejmowanych aparatów ortodontycznych są: modyfikacja wzrostu, niewielkie przesunięcia zębowe, rozszerzanie łuku zębowego, korekta niewielkich nieprawidłowości zębowych. Stosowane są także w celu leczenia chorób stawu skroniowo-żuchwowego oraz jako aparaty retencyjne, utrzymujące efekty właściwego leczenia ortodontycznego, prowadzonego wcześniej zarówno z zastosowaniem aparatów stałych jak i zdejmowanych. Aparaty stałe zbudowane są z zamków, pierścieni oraz łuków ortodontycznych. Zamki ortodontyczne mogą być wykonane ze stopów metali oraz materiałów niemetalicznych (kompozyty, materiały ceramiczne); przyklejane są klejem kompozytowym w określonej pozycji do powierzchni zębów siecznych, kłów i zębów przedtrzonowych. Pierścienie ortodontyczne cementowane są zwykle na pierwszych zębach trzonowych. Zasadnicza część aparatu ortodontycznego mieści się w przedsionku jamy ustnej, lub, w przypadku pewnych rodzajów aparatów, w jamie ustnej właściwej. Stosowanie aparatów ortodontycznych wpływa na warunki panujące w jamie ustnej. Wyniki badań wskazują, że może ono powodować lokalne działania niepo­żądane, takie jak mechaniczne uszkodzenia tkanek jamy ustnej czy reakcje alergiczne na materiały, z których wykonano aparat [6, 44]. Jednocześnie, elementy aparatów utrudniają samooczyszczanie zębów śliną, sprzyjają retencji resztek pokarmowych i pogorszeniu higieny jamy ustnej. Wzrasta akumulacja płytki nazębnej i płytki na elementach aparatu. Dlatego też stosowanie aparatów ortodontycznych może zwiększać ryzyko rozwoju próchnicy zębów i chorób przyzębia [1, 4, 22, 24, 25, 81]. Utrudnione oczyszczanie zębów i wzrost ilości płytki nazębnej, mierzony tzw. wskaźnikiem płytki, związane ze stosowaniem aparatów ortodontycznych, sprzyjają wzrostowi bakterii próchnicotwórczych z rodzaju Streptococcus i Lactobacillus [7, 40, 100]. W innych badaniach stwierdza się, że w trakcie leczenia aparatami ortodontycznymi u części pacjentów rozwijają się zmiany zapalne w obrębie przyzębia [44, 72, 73, 76]. Badano także ogólnoustrojowe skutki leczenia aparatami ortodontycznymi, szczególnie w grupach podwyższonego ryzyka. Prace koncentrowały się na takich schorzeniach jak zębopochodne zapalenie wsierdzia, gorączka reumatyczna [8, 11, 12, 67]. Autorzy wskazywali na potrzebę stosowania antybiotykowej profilaktyki przed włączeniem przeprowadzaniem procedur, takich jak cementowanie ortodontycznych pier­ ś­cieni, mogących wywoływać bakteremię, szczególnie u pacjentów należących do grup podwyższonego ryzyka. 4. Mikrobiota w jamie ustnej pacjentów z wrodzonymi wadami narządu żucia Dane piśmiennictwa wskazują, że wady rozszczepowi wargi i podniebienia wpływają na warunki panujące w jamie ustnej; zwłaszcza stosowanie aparatów ortodontycznych nie pozostaje bez wpływu na składniki mikrobiomu. U pacjentów z wrodzonymi wadami narządu żucia dochodzi do adhezji drobnoustrojów na elementach aparatów ortodontycznych; obecność aparatów sprzyja akumulacji płytki nazębnej, co przyczynia się do zmian składu gatunkowego oraz liczby wykrywanych bakterii [1, 7, 23]. Aparaty ortodontyczne zaliczane są do czynników, zaburzających homeostazę składników mikrobiomu jamy ustnej, podkreślane jest zagrożenie bakteriemią, związane z cementowaniem i zdejmowaniem pierścieni aparatów ortodontycznych oraz z towarzyszącym im zwykle urazem błony śluzo- SKŁADNIKI MIKROBIOMU JAMY USTNEJ JAKO CZYNNIKI RYZYKA ZAKAŻEŃ LOKALNYCH wej [33, 67]. We krwi pacjentów, u których zdejmowano aparaty stałe, wykrywano m.in.: Streptococcus sanguinis, S. mitis, S. constelatus, S. mutans oraz gatunki z rodzaju Veillonella, Actinomyces, bakterie oportunistyczne, czynniki często ciężkich schorzeń lokalnych oraz ogólnoustrojowych [12]. 4.1. Bakterie w jamie ustnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie Wyniki badań prowadzonych w różnych ośrodkach wykazały wzajemną zależność między leczeniem ortodontycznym a częstszym występowaniem bakterii próchnicotwórczych z grupy Streptococcus mutans oraz z rodzaju Lactobacillus [43, 81, 98]. Stwierdzano obecność bakterii Actinobacillus actinomycetemcomitans, które wymienia się jako charakterystyczne dla pewnych chorób przyzębia, a także wzrost liczby beztlenowych i względnie beztlenowych bakterii oraz form ruchomych [72, 82]. W badaniach własnych, u pacjentów rozszczepo­wych leczonych ortodontycznie, oprócz szczepów z grupy S. viridans wykryto 14 gatunków innych bakterii, których obecność może stwarzać zagrożenie ogólnoustrojowe [18, 79, 80]. Bakterie potencjalnie chorobotwórcze wykryte u pacjentów z wadami rozszczepowymi, leczonych ortodontycznie z zastosowaniem aparatów stałych: Bakterie Gram-dodatnie Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Micrococcus luteus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Moraxella catarrhalis Neiseria flava Stosunkowo często, u ok. 44% pacjentów z wadami rozszczepowymi, w jamie ustnej wykrywane były Gram-dodatnie paciorkowce fekalne Enterococcus faecalis, E. faecium, mikrokoki Micrococcus luteus oraz Gram-ujemne ziarenkowce Moraxella catarrhalis i Neiseria flava (12% u pacjentów bez wad rozszczepowych). Jama ustna tych pacjentów jako rezerwuar właśnie takich paciorkowców, mikrokoków oraz ziarenkowców stanowić może źródło czynników etiologicznych infekcji lokalnych (ropnie) oraz rozsianych/uogólnionych (zakażeń dróg moczowych, dróg żółciowych, wsierdzia i in.), 61 w tym czynników zakażeń szpitalnych. Infekcje jamy ustnej powodowane przez te bakterie, które są trudne do leczenia ze względu na lekooporność, są zarazem szczególnie groźne dla osób z obniżoną odpornością. Spośród Gram-ujemnych różne szczepy pałeczek Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Enterobacter cloa­ cae, E. agglomerans, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, a także pałeczka ropy błękitnej Pseudomonas aeruginosa występowały u 48% pacjentów z wadami narządu żucia. Relatywnie małe wymagania odżywcze tych bakterii ułatwiają im kolonizację różnych ontocenoz. Rozsianie ich z jamy ustnej może powodować ciężkie zakażenia, szczególnie groźne dla osób z malformacjami, zaburzeniami odporności (ostre infekcje układowe, zakażenia szpitalne, także posocznice). W kontrolnej grupie populacyjnej osób bez wad, nie leczonych ortodontycznie, ekstensywność tych bakterii była dużo niższa, wynosiła ok.8%. Wśród mikrobiota jamy ustnej analizowanych pacjentów z wadami wrodzonymi narządu żucia izolowano też szczepy bakterii Gram-dodatnich: gronkowca złocistego Staphylococcus aureus [18, 79, 80] występujących często w środowisku człowieka, co sprzyja nosicielstwu tych bakterii w przedsionku nosa, w gardle. Gronkowiec złocisty rozprzestrzenia się z miejsca kolonizacji w jamie ustnej dość łatwo, powodując ropnie, bardzo groźne zakażenia układowe, zakażenia endodontyczne, zapalenia kości żuchwy, ślinianek. Porównanie ekstensywności niektórych bakterii potencjalnie chorobotwórczych wykrytych w badaniach własnych u pacjentów z wadami rozszczepowymi oraz bez wad wrodzonych narządu żucia przedstawiono na Rys. 1. Rys. 1. Porównanie ekstensywności niektórych bakterii potencjalnie chorobotwórczych, wykrytych u pacjentów z wadami rozszczepowymi oraz bez wad wrodzonych narządu żucia 62 K. PERKOWSKI, P.J. ZAWADZKI, B. STAROŚCIAK, M. DYBICZ, M. PADZIK, M. MARCZYŃSKA-STOLAREK, L. CHOMICZ U pacjentów rozszczepowych występował też gronkowiec S. epidermidis, dawniej uważany za gatunek niechorobotwórczy, izolowany często ze śliny, nosogardzieli, z płytek nazębnych; stwierdzano obecność tego gronkowca na protezach zębowych. Występowanie S. epidermidis wśród mikrobiota jamy ustnej analizowanych pacjentów wskazuje na zagrożenie zakażeniami lokalnymi, zwłaszcza, że wg danych piśmiennictwa gronkowiec ten może być czynnikiem etiologicznym zapalenia kości żuchwy, dziąseł oraz zakażeń endodontycznych [65,66]. U analizowanych pacjentów z wadami rozszczepowymi stwierdzono korelację między ekstensywnością S. aureus i niektórymi wartościami oceny klinicznej: wskaźnikiem płytki nazębnej (który stanowi wykładnik stanu higieny jamy ustnej) i wskaźnikiem krwawienia (jako wykładnikiem stanu zapalnego jamy ustnej) [18, 79, 80]. Wyższa ekstensywność bakterii S. aureus i wyższe wartości wskaźników klinicznych występowały u pacjentów z wadami rozszczepowymi leczonych przy pomocy stałych aparatów ortodontycznych niż u pacjentów z grupy kontrolnej, bez wad narządu żucia, nie leczonych z użyciem tych aparatów. Ekstensywność S. aureus oraz wartości procentowe wymienionych wskaźników klinicznych u pacjentów z wadami rozszczepowymi oraz bez wad wrodzonych narządu żucia przedstawiono na Rys. 2. 4.2. Patogeniczne Protista w mikrobiomie jamy ustnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie W skład mikrobiomu jamy ustnej mogą także wchodzić dwa gatunki pasożytniczych pierwotniaków (Protista): należący do wiciowców rzęsistek policzkowy Trichomonas tenax oraz pełzak dziąsłowy Entamoeba gingivalis; pierwotniaki te tylko sporadycznie występują u dzieci poniżej 14 roku życia. Kosmopolityczny wiciowiec T. tenax bytujący w formie trofozoitu o gruszkowatym kształcie i wymiarach od 3 μm do 15 μm transmitowany jest przez bezpośredni kontakt, podczas pocałunku, ale też pośrednio przez wspólnie używane naczynia. E. gingivalis to także gatunek kosmopolityczny; występuje jako trofozoit mierzący ~ 5 μm × 35 μm, o zmiennym kształcie z płatowatymi pseudopodiami; ameba ta przenoszona jest przez kontakt bezpośredni podczas pocałunku oraz za pośrednictwem przyborów do utrzymywania higieny jamy ustnej oraz używanych wspólnie naczyń. Pierwotniaki te rzadko uwzględniano w badaniach klinicznych narządu żucia; niektórzy autorzy opisują je jako nieszkodliwe komensale, pomimo, że od kilkudziesięciu lat znany jest udział tych Protista w stanach patologicznych w jamie ustnej. Wyniki prac, prowadzonych w ośrodkach światowych i w niewielu polskich, Rys. 2. Ekstensywność S. aureus a procentowe wartości niektórych wskaźników klinicznych u pacjentów z wadami rozszczepowymi oraz bez wad wrodzonych narządu żucia nad wpływem tych drobnoustrojów na stan narządu żucia, wykazały korelację między ich występowaniem w przyzębiu, w ubytkach próchnicowych, w przyleg­łych węzłach chłonnych, w śliniankach a zmianami zapalnymi stwierdzanymi w tych strukturach [26, 30, 34, 59]. Rzęsistek policzkowy był wykrywany także poza jamą ustną: w stanach zapalnych oskrzeli, gruczołu mlekowego, w ropniach wątroby [38, 48, 55, 57, 58]. Wiciowce te znajdowano w jamie ustnej, a także w treści rozstrzeni oskrzeli, ropni płuc, wysięku opłucnej, u osób z chorobami układowymi poddanych immunosupresji [16, 17, 42, 62, 64, 93]. Destrukcyjne oddziaływanie tych rzęsistków na tkanki jamy ustnej wykryli m. innymi Bózner i wsp. [10], Ribaux i wsp. [88] oraz Linke i wsp. [59]. Wykazana została zdolność adhezyjna i wysoka aktywność pozakomórkowa proteinaz rzęsistków, rozkładanie przez nie różnych typów kolagenu, a także hemolityczne działanie na błonę śluzową i inne struktury narządu żucia [10, 71, 88, 91]. W polskich badaniach wykazano T. tenax w różnych grupach populacyjnych [14, 21, 51–53]; u pacjentów ze stwierdzoną rzęsistkowicą jamy ustnej często występowały równocześnie drożdżaki Candida albicans [49, 50]. Dane piśmiennictwa z wielu krajów ukazują różnice w częstości występowania u ludzi pełzaków E. gingivalis w zależności od rodzaju grup populacyjnych, a zarazem wykazują, że ekstensywność tych ameb nasila się wraz z wiekiem badanych [9, 13,30, 87]. Pełzaki te, podobnie jak rzęsistki T. tenax, nie należą do mikroorganizmów rezydujących, a mogą wchodzić w skład mikrobiomu jamy ustnej wskutek inwazji. Wykrywa się je głównie w wymazach z przyzębia, rzadko w ślinie, u osób z roz- SKŁADNIKI MIKROBIOMU JAMY USTNEJ JAKO CZYNNIKI RYZYKA ZAKAŻEŃ LOKALNYCH ległą próchnicą, zaawansowaną chorobą przyzębia, na błonie śluzowej dziąseł, w patologicznych kieszonkach. Inwazje tych pełzaków mogą obejmować przyzębie, a także zatoki przynosowe, wykrywano je w stanach zapalnych migdałków podniebiennych, w treści ropni płuc [13, 24, 34, 39, 78]. Autorzy cytowanych badań wskazują na aktywną rolę E. gingivalis w rozwoju stanów patologicznych przyzębia. W badaniach własnych ekstensywność T. tenax wyno­siła 13.5% u osób z rozszczepowymi wadami leczonych aparatami stałymi z grupy 16–23 lata, a 8% u pacjentów zdrowych z tej samej grupy wiekowej [18, 79, 80]. Wyższa niż u młodszych ekstensywność inwazji tego rzęsistka występowała u zdrowych osób w wieku 30–50 lat; wynosiła ona średnio 20% [15, 17, 103], a u chorych z niepełnosprawnością ruchową, mentalną i wadami wrodzonymi w takim samym przedziale wieku – od 45% do 87% [14, 103]. Ekstensywność ameb jamy ustnej E. gingivalis u pacjentów z wadami rozszczepowymi leczonych aparatami stałymi różniła się w zależności od wieku badanych; u osób w wieku 16–23 lata była niższa niż rzęsistka, 8% i trochę wyższa niż u osób z grupy kontrolnej, 4% [18, 20, 78]. U chorych starszych, 30–50 lat z niepełnosprawnością mentalną i wadami wrodzonymi ekstensywność tych pełzaków sięgała 36%; u zdrowych osób w tym samym przedziale wieku – od 4% do 13.5% [19, 21, 103]. Wyniki cytowanych badań własnych wskazują, że wady rozszczepowe oraz leczenie ich z użyciem aparatów stałych mogą sprzyjać utrzymywaniu się inwazji T. tenax; potwierdzają rzadsze występowanie pierwotniaków w jamie ustnej u osób w młodym wieku i częs­ tsze w wieku starszym, zarówno u osób zdrowych jak i z niepełnosprawnościami oraz wadami wrodzonymi. Należy podkreślić, że oprócz własnych prac, nadal brak badań umożliwiających uzyskanie danych wystarczających do oceny częstości/skutków występowania pasożytniczych Protista w mikrobiomie jamy ustnej osób z wadami rozszczepowymi leczonych przy użyciu aparatów ortodontycznych. 4.3. Grzyby w jamie ustnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie Dynamika występowania grzybów w ontocenozie jamy ustnej pacjentów leczonych ortodontycznie poznana jest w niewielkim stopniu [20, 79, 86]. Problem ten ma szczególne znaczenie w przypadku pacjentów z wadami rozszczepowymi narządu żucia, u których potrzeba ortodontycznego leczenia sięga 100% [60, 77, 94, 95]. Kandydoza jamy ustnej może przybierać różne formy kliniczne: ostrą rzekomobłonową, przewlekłą atroficzną, rozrostową. Inwazyjne szczepy Candida mogą występować w formie drożdżopodobnej (blasto- 63 sporowej) lub pseudostrzępkowej (pseudomycelialnej); opinie na temat większej patogeniczności formy blastosporowej czy pseudomycelialnej są podzielone. Wystąpieniu kandydozy mogą też sprzyjać czynniki miejscowe: zła higiena jamy ustnej, mikrourazy, obecność ciał obcych (szczególnie oddziałujących na powierzchniach ściśle przylegających do błony śluzowej) – akrylowych uzupełnień protetycznych (stomatopatia protetyczna) czy aparatów ortodontycznych [61, 66, 82, 90]. Inwazja grzybów z jamy ustnej do dalszych części przewodu pokarmowego oraz innych narządów drogą krwi przebiegać może szczególnie łatwo, ponieważ na błonie śluzowej często występują otarcia i mogą pojawiać się ubytki powierzchni. Grzyby mogą być czynnikiem patogenicznym zapalenia błony śluzowej przełyku, żołądka i dwunastnicy [28]. U osób z grzybiczym zapaleniem błony śluzowej przewodu pokarmowego stwierdzano równocześnie występowanie zakażenia Candida w jamie ustnej. Aktywna rola grzybów drożdżopodobnych w rozwoju poważnych stanów patologicznych – lokalnych i uogólnionych stwierdzona została w wielu badaniach [32, 45, 56, 83]; m.in. wykazano, że w trakcie zabiegów grzyby mogą dostawać się bezpośrednio do krwi i tą drogą przenosić się do różnych narządów [61]. W badaniach własnych wykryto wyraźną zbieżność między występowaniem rozszczepów i stosowaniem aparatów stałych a częstością izolowania Candida. Ekstensywność C. albicans była skorelowana z wysokimi wartościami wskaźników płytki i krwawienia, świadczących o złej higienie jamy ustnej i występowaniu stanów zapalnych przyzębia. Znamiennie częściej szczepy C. albicans występowały u pacjentów rozszczepowych w wieku 16–23 lata leczonych ortodontycznie, 48%, niż u osób zdrowych z tego samego przedziału wiekowego, 8% [18–20, 79]. Najwyższą prewalencję grzybów grupy C. albicans, ok. 50% stwierdzano u pacjentów z najwyższymi wartościami wskaźników płytki i krwawienia, odzwierciedlającymi niezadowalający stan jamy ustnej, wzmożoną akumulację płytki nazębnej oraz nasilenie procesów zapalnych. 5. Podsumowanie U pacjentów z wadami wrodzonymi narządu żucia zmienione warunki anatomiczne oraz stosowanie aparatów ortodontycznych zaburzają homeostazę mikrobiomu jamy ustnej; może to powodować zmiany w jego składzie wpływając na wzrost ryzyka wystąpienia zakażeń lokalnych i uogólnionych. W dostępnym piśmiennictwie istnieje niewiele danych, dotyczących oceny częstości występowania bakterii oportunistycznych, pasożytniczych pierwotniaków oraz grzybów drożdżopodobnych w jamie ustnej 64 K. PERKOWSKI, P.J. ZAWADZKI, B. STAROŚCIAK, M. DYBICZ, M. PADZIK, M. MARCZYŃSKA-STOLAREK, L. CHOMICZ osób z wadami wrodzonymi narządu żucia leczonych ortodontycznie. Znaczna dysproporcja między wciąż niedostateczną wiedzą, dotyczącą zagrożeń generowanych przez składniki mikrobiomu pacjentów z wadami rozszczepowymi w porównaniu do innych, bez takich wad stanowi argument na rzecz prewencji przedzabiegowej i monitorowania ontocenozy jamy ustnej w przebiegu leczenia. W badaniach własnych, w tej grupie pacjentów wykryto kilkanaście gatunków bakterii; większość z nich stanowiły gatunki oportunistyczne, także czynniki zakażeń szpitalnych, których obecność może stwarzać zagrożenia lokalne i ogólnoustrojowe. Stosunkowo często w jamie ustnej u tych pacjentów wykrywane były bakterie Gram-dodatnie: paciorkowce fekalne, mikrokoki oraz Gram-ujemne ziarenkowce i pałeczki. Wśród mikrobiota jamy ustnej analizowanych pacjentów występowały też potencjalnie patogeniczne szczepy gronkowców. Koncentracja bakterii oportunistycznych oprócz miej­scowego, szkodliwego działania na przyzębie, może negatywnie wpływać na od­ległe tkanki i narządy i stwarza ryzyko rozwoju chorób odogniskowych. Stwierdzono większą ekstensywność inwazji rzęsistka policzkowego T. tenax niż pełzaka dziąsłowego E. gingivalis, a zarazem rzadsze występowanie pierwotniaków w jamie ustnej u pacjentów w młodym wieku i częstsze w wieku starszym, u osób zdrowych oraz z wadami wrodzonymi i mentalną i ruchową niepełnosprawnością. Obserwowano zbieżność między występowaniem rozszczepu wargi i podniebienia oraz stosowaniem leczenia ortodontycznego a częstością izolowania grzybów drożdżopodobnych. z rodzaju Candida. Zakażenia tymi grzybami wykrywane w różnych ontocenozach ludzkiego organizmu, w rozwoju zakażeń oportuni­stycz­nych, często o ciężkim przebiegu, stanowią poważny problem medyczny u pacjentów z zaburzeniami i defektami reakcji obronnej. Stwierdzono istnienie korelacji między częstością występowania grzybów drożdżopodobnych a wskaźnikami klinicznymi odzwierciedlającymi niezadowalający stan jamy ustnej i nasilone procesy zapalne. Kontynuacja badań nad skutkami zmian w składzie gatunkowym mikrobiota jamy ustnej pacjentów z wadami wrodzonymi struktur jamy ustnej jest konieczna ze względu na poważne ryzyko zakażeń lokalnych, a także ryzyko transmisji chorobotwórczych mikro­ organizmów do innych tkanek i narządów. Wyniki takich badań uwzględniane przy podejmowaniu działań prewencyjnych umożliwią ograniczenie/wyeliminowanie zagrożenia powikłaniami okołoterapeutycznymi. Dotyczy to zwłaszcza – wymagającej szczególnej opieki medycznej – grupy populacyjnej pacjentów z wadami narządu żucia leczonych ortodontycznie. Piśmiennictwo 1. Ahn S.J., Lee S.J., Lim B.S., Nahm D.S.: Quantitative determination of adhesion patterns of cariogenic streptococci to various orthodontic brackets. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 132, 815–821 (2007) 2. Akcam M.O., Evirgen S., Uslu O., Memikoglu U.T.: Dental anomalies in individuals with cleft lip and/or palate. Eur. J. Orthod. 32, 207–213 (2010) 3. Al-Nawas B., Wriedt S., Reinhard J., Keilmann A., Wehrbein H., Wagner W.: Influence of patient age and experience of the surgeon on early complications after surgical closure of the cleft palate – a retrospective cohort study. J. Craniomaxillofac. Surg. 41, 135–139 (2013) 4.Andrucioli M.C., Nelson-Filho P., Matsumoto M.A., Saraiva M.C., Feres M., de Figueiredo L.C., Martins L.P.: Molecular detection of in-vivo microbial contamination of metallic orthodontic brackets by checkerboard DNA-DNA hybridization. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 141, 24–29 (2012) 5. Antoszewski B.: Wielkość środowiska pochodzenia a częstość występowania rozszczepów wargi i (lub) podniebienia u nowo­ rodków z terenu województwa łódzkiego. Now. Lek. 76, 414–417 (2007) 6. Baricevic M., Mravak-Stipetic M,. Majstorovic M., Baranovic M., Baricevic D., Lorcar B.: Oral mucosal lesions during orthodontic treatment. Int. J. Paediatr. Dent. 21, 96–102 (2011) 7. Batoni G., Pardini M., Giannotti A., Ota F., Giuca M.R., Gab­ riele M., Campa M., Senesi S.: Effect of removable appliances on oral colonisation by mutans streptococci in children. Eur. J. Oral Sci. 109, 388–392 (2001) 8. Biancaniello T.M., Romero J.R.: Bacterial endocarditis after adju­ s­tment of orthodontic appliances. J. Pediatr. 118, 248–249 (1991) 9. Bonner M., Santi-Rocca J i wsp.: Detection of the amoeba Entamoeba gingivalis in periodontal pockets. Parasite, 21, 30 (2014) 10. Bózner P., Demeš P.: Degradation of collagen types I, III, IV and V by extracellular proteinases of an oral flagellate Trichomonas tenax. Arch. Oral Biol. 36, 765–770 (1991) 11. Burden D.J., Mullally B., Sandler J.: Orthodontic treatment of patients with medical disorders. Eur. J. Orthod. 23, 363–372 (2001) 12. Burden D.J., Coulter W.A., Johnston C.D., Mually B., Stevenson M.: The prevalence of bacteriemia on removal of fixed orthodontic appliances. Eur. J. Orthod. 26, 443–447 (2004) 13. Čechová L., Leifertova I., Lisa M.: The incidence of Entamoeba gingivalis in the oral cavity. Acta Univ. Carol. Med. 33, 549–559 (1987) 14. Cielecka D., Chomicz L., Piekarczyk J., Walski M., Zawadzki P.J., Bednarczyk A., Szubińska D. Oral cavity condition and occurrence of parasitic protozoans in patients with genetic diseases. Acta Parasitol. 45, 2, 107–112 (2000) 15. Chomicz L., Piekarczyk J., Zawadzki P.J., Piekarczyk B., Świderski Z., Bednarczyk A.: Occurrence of oral protozoans in relation to oral cavity status in patient of different population groups. Eur. J. Cell Biol. 52, 130 (2000) 16. Chomicz L., Piekarczyk J., Fiedor P., Starościak B., Szubińska D., Wojtowicz A.: Screening evaluation of oral cavity microorga­ nisms in dialyzed and kidney allograft recipients under chronic immunosuppression. Transplant. Proc. 34, 675 (2002) 17. Chomicz L., Piekarczyk J., Starościak B., Fiedor P., Piekarczyk B., Szubińska D., Zawadzki P.J., Walski M. Comparative studies on the occurrence of protozoans, bacteria and fungi in the oral cavity of patients with systemic disorders. Acta Parasitol. 47, 147–153 (2002) 18.Chomicz L., Piekarczyk P., Zawadzki P., Korczyc A., Piekarczyk B., Perkowski K., Starosciak B.: Fungal and protozoan SKŁADNIKI MIKROBIOMU JAMY USTNEJ JAKO CZYNNIKI RYZYKA ZAKAŻEŃ LOKALNYCH pathogens in oral cavity as potential factors of complications in the patients with chronic diseases. Tropical Medicine and International Health Proceedings, MJ Boeree (ed.), Medimond S. r 1, 117–120 (2007a) 19. Chomicz L., Zawadzki P., Piekarczyk P., Siemińska B., Perkowski K., Starościak B., Szałwiński M., Korczyc A.: Ocena wybranych składników ontocenozy jamy ustnej jako potencjalnych czynników powikłań przed i pozabiegowych. I. Grzyby oportunistyczne i pierwotniaki w jamie ustnej pacjentów chorych przewlekle z zaburzeniami stomatognatycznymi. (Assessment of selected components of the oral cavity ontocenosis as potential factors of before and after surgery complications. I. Opportunistic fungi and protozoans in the oral cavity of patients with chronic diseases and stomatognatic disorders). Chirurgia Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowa i Ortopedia Szczękowa, I, 1–2, 26–32, (2007b) 20.Chomicz L., Perkowski K., Siemińska-Piekarczyk B., Staroś­ ciak B., Piekarczyk P., Graczyk Z., Szałwiński M., Olędzka G., Graczyk T.K., Zawadzki P.: Assessment of various components of oral cavity ontocenosis as potential factors for pre and post-surgery complications. II. Opportunistic fungi and protozoans in the oral cavity of orthodontic patients. Chir. Czaszk. Szczęk. Twarz. Ortop. Szczęk. 4, 67–76 (2009a) 21. Chomicz L., Starościak B., Olędzka G., Zawadzki P. Piekarczyk P., Graczyk Z., Piekarczyk B., Padzik M., Graczyk T.K.: Studies on the oral cavity microorganisms as the risk factors of local/ general infections in patients of different population groups requiring the surgical procedure. Chir. Czaszk. Szczęk. Twarz. Ortop. Szczęk. 4, 149–156 (2009b) 22. Costa M.R., da Silva V.C., Miqui M.N., Colombo A.P., Cirelli J.A.: Effects of ultrasonic, electric, and manual toothbrushes on subgingival plaque composition in orthodontically banded molars. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 137, 229–235 (2010) 23. Dahllof G., Ussisoo-Joandi R., Ideberg M., Modeer T.: Caries, gingivitis, and dental anomalies in preschool children with cleft lip and/or palate. Cleft Palate Craniofac. J. 26, 233–238 (1989) 24. Dao A.H., Robinson D.P., Wong S.W.: Frequency of Entamoeba gingivalis in human gingival scrapings. Am. J. Clin. Path. 80, 380–383 (1983) 25.Demling A., Heuer W., Elter C., Heidenblut T., Bach F.W., Schwestka-Polly R., Stiesch-Scholz M.: Analysis of supra- and subgingival long-term biofilm formation on orthodontic bands. Eur. J. Orthod. 31, 202–206 (2009) 26. Dimasuay K.G.B., Rivera W.L.: First report of Trichomonas tenax infections in the Philippines. Parasitol. Int. 63, 400–402 (2014) 27. Doboucher C., Mogenet M., Perie G.: Salivary Trichomoniasis. A case report of infestation of a submaxillary gland by trichomonas tenax. Arch. Pathol. Lab. Med. 119, 277–279 (1995) 28. Doboucher C., Farto-Bensasson F., Chéron M., Peltier J., Beaufils F., Périé G.: Lymph node infection by Trichomonas tenax: report of a case with co-infection by Mycobacterium tuberculosis. Hum. Pathol. 31, 1317–1321 (2000) 29. Downes J., Mantzourani M., Beighton D., Hooper S., Wilson M.J., Nicholson A., Wade W.G.: Scardovia wiggsiae sp. nov., isolated from the human oral cavity and clinical material, and emended descriptions of the genus Scardovia and Scardovia inopinata. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 25–29 (2011) 30.Feki A., Molet B.: Importance des protozoares Trichomonas tenax et Entamoeba gingivalis dans la cavite buccale humaine. Rev. Odontostomatol. 19, 37–45 (1990) 31. Filoche S., Wong L., Sissons C.H.: Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. J. Dent. Res. 89, 8–18 (2010) 32. Fortak B., Płaneta-Małecka I., Trojanowska-Lipczyk J., Czkwianianc E., Dyńska E., Kozieł B.: Rola grzybów z rodzaju Candida w etiopatogenezie zapalenia błony śluzowej przełyku, żołądka i dwunastnicy u dzieci. Wiad. Parazytol. 50, 381–386 (2004) 65 33.Freitas A.O., Marquezan M., Nojima M.C., Alviano D.S., Maia L.C.: The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: a systematic review. Dental Press J. Orthod. 19, 46–55 (2014) 34. Ghabanchi J., Zibaei M., Afkar M.D., Sarbazie A.H.: Prevalence of oral Entamoeba gingivalis and Trichomonas tenax in patients with periodontal disease and healthy population in Shiraz, southern Iran. Indian J. Dent. Res. 21, 89–91 (2010) 35. Gizani S., Papaioannou W., Haffajee A.D., Kavvadia K., Quirynen M., Papagiannoulis L.: Distribution of selected cariogenic bacteria in five different intra-oral habitats in young children. Int. J. Paediatr. Dent. 19, 193–200 (2009) 36. Gomar-Vercher S., Cabrera-Rubio R., Mira A., Montiel-Company J.M., Almerich-Silla J.M.: Relationship of children’s salivary microbiota with their caries status: a pyrosequencing study. Clin. Oral Investig. 18, 2087–2094 (2014) 37.Hadler-Olsen S., Sandvik K., El-Agroudi M.A., Øgaard B.: The incidence of caries and white spot lesions in orthodontically treated adolescents with a comprehensive caries prophylactic regimen – a prospective study. Eur. J. Orthod. 34, 633–639 (2012) 38. Jacobsen E.B., Friis-Møller A., Friis J.: Trichomonas species in subhepatic abscess. Eur. J. Clin. Microbiol. 6, 296–297 (1987) 39.Jian B., Kolansky A.S., Baloach Z.W., Gupta P.K.: Entamoeba gingivalis pulmonary abscess-diagnosed by fine needle aspiration. Cytojournal, 30, 5–12 (2008) 40. Jordan C., LeBlanc D.J.: Influences of orthodontic appliances on oral populations of mutans streptococci. Oral Microbiol. Immunol. 17, 65–71 (2002) 41. Jugessur A., Farlie P.G., Kilpatrick N.: The genetics of isolated orofacial clefts: from genotypes to subphenotypes. Oral Dis. 15, 437–453 (2009) 42. Kaczkowski H., Sarowska J., Wojnicz D., Nowicka J., Kozłowski Z., Jankowski S.: Występowanie Entamoeba gingivalis i Trichomonas tenax w jamie ustnej u chorych na ostre białaczki i nowotwory układu limforetikularnego. Dent. Med. Probl. 41, 683–685 (2004) 43. Kamble V.D., Parkhedkar R.D., Sarin S.P., Patil P.G.: Presurgical nasoalveolar molding (PNAM) for a unilateral cleft lip and palate: a clinical report. J. Prosthod. 22, 74–80 (2013) 44. Kim K., Heimisdottir K., Gebauer U., Persson G.R.: Clinical and microbiological findings at sites treated with orthodontic fixed appliances in adolescents. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 137, 223–228 (2010) 45. King G.N., Healy C.M., Glover M.T., Kwan J.T., Wiliams D.M., Leigh I.M., Thornhill M.H.: Prevalence and risk factors associated with leukoplakia, hairy leukoplakia, erythematous candidiasis, and gingival hyperplasia in renal transplant recipients. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 78, 718–726 (1994) 46. Kornman K.S.: Host modulation as a therapeutic strategy in the treatment of periodontal disease. Clin. Infect. Dis. 28, 520–526 (1999) 47.Kowalski J.: Campylobacter rectus – charakterystyka drobnoustroju oraz jego rola w zapaleniach dziąseł i przyzębia. Dent. Med. Probl. 47, 478–481 (2010) 48. Krvavac S.: Trichomoniasis of the breast diseased by fibrocystic mastopathy: pathogenic rather than saprophytic relationship (Trichomonas in fibrocystic mastopathy process). Med. Arh. 52, 143–145 (1998) 49.Kurnatowska A.J.: Współzależność między występowaniem zmian chorobowych a Trichomonas tenax oraz grzybami w ontocenezie jamy ustnej. Czas. Stomatol. 1, 17–22 (1984) 50. Kurnatowska A.: Wartości wskaźników zalecanych przez WHO do oceny stanu jamy ustnej u pacjentów z rozpoznaną inwazją Trichomonas tenax. Wiad. Parazytol. 36, 245–249 (1990) 66 K. PERKOWSKI, P.J. ZAWADZKI, B. STAROŚCIAK, M. DYBICZ, M. PADZIK, M. MARCZYŃSKA-STOLAREK, L. CHOMICZ 51. Kurnatowska A.J.: Występowanie pierwotniaków Trichomonas tenax (O.F. Müller, 1773) Dobell, 1939 i Entamoeba gingivalis (Gross, 1879) Brumpt, 1913 w jamie ustnej. Med. Biol. 1, 21–23 (1995) 52. Kurnatowska A.J., Kurnatowski P.: Trichomonosomycosis of the oral cavity. Wiad. Parazytol. 45, 129–133 (1999) 53. Kurnatowska A.J., Dudko A.: Trichomonas tenax w ontocenozie jamy ustnej. Czas. Stomatol. 55, 559–562 (2002) 54. Kurnatowska A.J.: Występowanie grzybów w ontocenozie jamy ustnej a zmiany błony śluzowej. Mikol. Lek. 10, 295–298 (2003) 55.Kurnatowski P.: Niektóre aspekty grzybic wieloogniskowych i uogólnionych. Wiad. Parazytol. 50, 359–365 (2004) 56. Kurnatowski P., Tyczkowska-Sieroń E.: Wybrane czynniki sprzyjające zarażeniom grzybami w populacji człowieka. Wiad. Parazytol. 50, 367–372 (2004) 57. Leterrier M., Morio F., Renard B.T., Poirier A.S., Miegeville M., Chambreuil G.: Trichomonads in pleural effusion: case report, literature review and utility of PCR for species identification. New Microbiol. 35, 83–87 (2012) 58. Lewis K.L., Doherty D.E., Ribes J., Seabolt J.P., Bensadoun E.S.: Empyema caused by Trichomonas. Chest 123, 291–292 (2003) 59. Linke H.A.B., Gannon J.T., Obin J.N.: Clinical survey of Entamoeba gingivalis by multiple sampling in patients with advanced periodontal disease. Int. J. Parasitol. 19, 803–808 (1989) 60. Lucas V.S., Gupta R., Ololade O., Gelbier M., Roberts G.J.: Dental health indices and caries associated microflora in children with unilateral cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 447–452 (2000) 61. Łuczak M., Swoboda-Kopeć E.: Wybrane zagadnienia z mikrobiologii jamy ustnej. Czelej, Lublin (2004) 62.Mahmoud M.S., Rahman G.A.: Pulmonary trichomoniasis: improved diagnosis by using polymerase chain reaction targeting Trichomonas tenax 18S rRNA gene in sputum specimens. J. Egypt. Soc. Parasitol. 34, 197–211 (2004) 63.Małkiewicz E., Pisulska-Otremba A.: Orthodontic treatment within the programme of Multidisciplinary Care of Children with Clefts of the Primary and/or Secondary Palate. Dent. Med. Probl. 41, 263–266 (2004) 64. Mallat H., Podglajen I., Lavarde V., Mainardi J.L., Frappier J., Cornet M.: Molecular characterization of Trichomonas tenax causing pulmonary infection. J. Clin. Microbiol. 42, 3886–3887 (2004) 65.Marsh P.D.: The significance of maintaining the stability of the natural microflora of the mouth. Br. Dent. J. 171, 174–177 (1991) 66. Marsh P.D.: Dental plaque: biological significance of a biofilm community lifestyle. J. Clin. Periodontol. 32, 7–15 (2005) 67. McLaughlin J.O., Coulter W.A., Coffey A., Burden D.J.: The incidence of bacteremia after orthodontic banding. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 109, 639– 644 (1996) 68. Mierzwińska-Nastalska E.: Udział mechanizmów odpornościo­ wych w zakażeniach grzybiczych. Prot. Stom. 49, 305–310 (1999) 69.Miskiewicz A., Szparecki G., Nowak M., Górska R.: Analiza epi­demiologiczna występowania Candida species oraz ich leko­opor­ ności u pacjentów ze stomatopatią protetyczną. Nowa Stomatol. 3, 141–144 (2013) 70. Mossey P.A., Little J., Munger R.G., Dixon M.J., Shaw W.C.: Cleft lip and palate. Lancet, 374, 1773–1785 (2009) 71.Nagao E., Yamamoto A., Igarashi T., Goto N., Sasa R.: Two distinct hemolysins in Trichomonas tenax ATCC 30207. Oral Microbiol. Immunol. 15, 355–359 (2000) 72.Naranjo A.A., Triviño M.L., Jaramillo A., Betancourth M., Botero J.E.: Changes in the subgingival microbiota and periodontal parameters before and 3 months after bracket placement. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 130, 17–22 (2006) 73. Nelson-Filho P., Valdez R.M., Andrucioli M.C., Saraiva M.C., Feres M., Sorgi C.A., Faccioli L.H.: Gram-negative periodontal pathogens and bacterial endotoxin in metallic orthodontic brackets with or without an antimicrobial agent: an in-vivo study. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 140, 281–287 (2011) 74. Offenbacher S., Barros S.P., Beck J.D.: Rethinking periodontal inflammation. J. periodontol. 79, 1577–1584 (2008) 75. Pancerz-Łoś M., Kmieć Z., Bereznowski Z, Witali A.: Miejscowe i ogólnoustrojowe konsekwencje periodontitis i peri-implantitis. Przegląd piśmiennictwa. Local and general consequences of periodontitis and peri-implantitis: A literature review. Protet. Stomatol. LX, 1, 44–49 (2010) 76. Paolantonio M., Festa F., di Placido G., D’Attilio M., Catamo G., Piccolomini R.: Site-specific subgingival colonization by Actino­ bacillus actinomycetemcomitans in orthodontic patients. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop. 115, 423–428 (1999) 77.Perdikogianni H., Papaioannou W., Nakou M., Oulis C., Papagiannoulis L.: Periodontal and microbiological parameters in­children and adolescents with cleft lip and/or palate. Int. J. Pae­diatr. Dent. 19, 455–467 (2009) 78. Perez-Jaffe L., Katz R., Gupta P.K.: Entamoeba gingivalis identified in a left upper neck nodule by fine-needle aspiration: a case report. Diagn. Cytopathol. 18, 458–461 (1998) 79. Perkowski K. Badania nad ontocenozą jamy ustnej pacjentów leczonych ortodontycznie. Praca doktorska WUM (2006) 80.Perkowski K., Chomicz L., Starościak B., Zadurska M., Szałwiński M., Zawadzki P., Piekarczyk P., Olędzka G.: Occurrence of pathogenic bacteria in the oral cavity of the orthodontic patients requiring surgical treatment. Stomatol. Współcz. 19, 8–13 (2012) 81. Perzyńska K., Grygorczuk A., Cwalina L., Herud B.: Ocena stanu przyzębia i higieny jamy ustnej pacjentów leczonych aparatami stałymi i ruchomymi. Czas. Stomatol. 49, 636–640 (1996) 82. Petti S., Barbato E., Simonetti D’Arca A.: Effect of orthodontic therapy with fixed and removable appliances on oral microbiota: a six-month longitudinal study. New Microbiol. 20, 55–62 (1997) 83.Piątkowska-Jakubas B., Skotnicki A.N.: Zakażenia grzybicze u chorych z granulocytopenią – problem diagnostyczny i terapeutyczny. Med. po Dypl. 3, 7–12 (1995) 84. Piekarczyk J., Fiedor P., Chomicz L., Szubińska D., Starościak B., Piekarczyk B., Zawadzki P., Żebrowska J., Dudziński T.: Oral cavity as potential source of infections in recipients with diabetes mellitus. Transplant. Proc. 35, 2207–2208 (2003) 85. Pietruski J.K.: Zaburzenia odporności w kandydiazie jamy ustnej. Przegląd piśmiennictwa. Czas. Stomatol. 43, 282–286 (1995) 86. Pietrzak-Bilińska B.: Grzybice jamy ustnej u dzieci leczonych ortodontycznie. Czas. Stomatol. 51, 125–132 (1998) 87.Reczyk J., Głębski J., Nierychlewska A.: Występowanie pierwotniaków w jamie ustnej w zależności od chorób i zabiegów operacyjnych w okolicy szczękowo-twarzowej. Czas. Stomatol. 33, 237–244 (1980) 88. Ribaux C.L., Couble M.L., Magloire H., Herbage D.: Degradation of type I collagen by Trichomonas tenax: a biochemical study. J. Dent. Res. 60, 1202 (1981) 89. Sampaio-Maia B., Monteiro-Silva F.: Acquisition and maturation of oral microbiome throughout childhood: An update. Dent. Res. J. 11, 291–301 (2014) 90. Schultes G., Gaggl A., Karcher H.: Comparison of periodontal disease in patients with clefts of palate and patients with unilateral clefts of lip, palate, and alveolus. Cleft Palate Craniofac. J. 36, 322–327 (1999) 91. Segovic S., Buntak-Kobler D., Galic N., Katunaric M.: Trichomonas tenax proteolytic activity. Coll. Antropol. 22, 45–49 (1998) 92. Shafer W.G., Hine M.K., Levy B.M.: Shafer’s Textbook of Oral Pathology (ed 6). St. Louis, Elsevier, 16–17 (2009) SKŁADNIKI MIKROBIOMU JAMY USTNEJ JAKO CZYNNIKI RYZYKA ZAKAŻEŃ LOKALNYCH 93.Shiota T., Arizono N., Morimoto T., Shimatsu A., Nakao K.: Trichomonas tenax empyema in an immunocompromised patient with advanced cancer. Parasite, 5, 375–377 (1998) 94. Słotwińska S.M., Wierzbicka M.: Zakażenie grzybami w zapaleniu przyzębia. Czas. Stomatol. 51, 237–240 (1998) 95. Śmiech-Słomkowska G., Białasiewicz D., Kurnatowska A.: Zakażenia grzybami jamy ustnej dzieci leczonych ortodontycznie. Czas. Stomatol. 49, 189–193 (1996) 96. Socransky S.S., Haffajee A.D., Cugini M.A., Smith C., Kentr. L.R. Jr: Microbial complexes in subgingival plaque. J. Clin. Periodontol. 25, 134–144 (1998) 97.Tanner A.C., Mathney J.M., Kent R.L., Chalmers N.I., Hughes C.V., Loo C.Y., Pradhan N., Kanasi E., Hwang J., Dahlan M.A., Papadopolou E., Dewhirst F.E.: Cultivable anaerobic microbiota of severe early childhood caries. J. Clin. Microbiol. 49, 1464–1474 (2011) 98. Tanner A.C., Sonis A.L., Lif Holgerson P., Starr J.R., Nunez Y., Kressirer C.A., Paster B.J., Johansson I.: White-spot lesions and gingivitis microbiotas in orthodontic patients. J. Dent. Res. 91, 853–858 (2012) 67 99.Tanner A.C.: Anaerobic culture to detect periodontal and caries pathogens. J. Oral Biosci. 57, 18–26 (2015) 100. Thornton J. B., Nimer S., Howard P.S.: The incidence, classificstion, etiology and embryology of oral clefts. Semin. Orthod. 2, 162–168 (1996) 101. Thuy D., Devine D., Marsh P.: Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clin. Cosm. Invest. Dent. 5, 11–19 (2013) 102.Turkkahraman H., Sayin O., Bozkur Y., Yetkin Z., Kaya S., Onal S.: Archwire ligation techiques, microbial colonization and periodontal status in orthodontically treated patients. Angle Orthodontist. 75, 227–231 (2005) 103. Zawadzki.P. Ocena stanu jamy ustnej ze szzegolnym uwzglednieniem wystepowania drobnoustrojow jako czynnikow ryzyka infekcji u pacjentow z uposledzeniem umyslowym. Praca doktorska. WUM. Warszawa 2005. 104.Żurowski M., Szponar-Żurowska A., Jarzębowska M., Masiota J., Palicka M., Szukalska D., Śnieć M.: Występowanie grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida w jamie ustnej młodzieży licealnej. Czas. Stomatol. 47, 259–262 (1994) MORAXELLA CATARRHALIS – PATOGEN GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 68–78 http://www.pm.microbiology.pl Katarzyna Król-Turmińska1*, Alina Olender1 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie Wpłynęło w maju 2015 r. Zaakceptowano w lipcu 2015 r. 1. Wstęp. 2. Taksonomia. 3. Identyfikacja i hodowla. 4. Znaczenie kliniczne. 4.1. Zakażenia dzieci. 4.1.1. Ostre zapalenie ucha środkowego. 4.1.2. Zapalenie zatok. 4.1.3. Zapalenie płuc. 4.2. Zakażenia dorosłych. 4.2.1. Zapalenie krtani. 4.2.2. Zaostrzenie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc. 4.2.3. Zapalenie płuc. 4.3. Zakażenia szpitalne. 4.4. Kolonizacja. 5. Mechanizmy patogenezy i czynniki wirulencji. 5.1. Adhezja. 5.2. Inwazja. 5.3. Tworzenie biofilmu. 5.4. Oporność na działanie dopełniacza 6. Lekooporność. 7. Potencjalna możliwość stosowania szczepień. 8. Podsumowanie Moraxella catarrhalis – a respiratory tract pathogen Abstract: Moraxella catarrhalis is an important, exclusively human respiratory tract pathogen. For many years, M. catarrhalis was considered a harmless commensal of the human upper respiratory tract. M. catarrhalis is an emerging pathogen responsible for acute otitis media in children, and also for recurrent and persistent respiratory tract infections in patients suffering from chronic obstructive pulmonary disease. The prevalence of colonization of the upper respiratory tract is high in children, and the risk factors are as follows: a large concentration of people, low social status, and genetic predisposition. M. catarrhalis resembles commensal Neisseria species in culture, and thus, may be overlooked in samples from the human respiratory tract. The bacteria is highly susceptible to most of the antibiotics commonly used in the treatment of respiratory infections, although inherent resistance to penicillin, vancomycin, trimethoprim, and clindamycin has been documented. The major virulence factors are numerous adhesins, invasion abilities, complement resistance and biofilm formation. The recent works have elucidated mechanisms of pathogenesis focusing on vaccine development to reduce colonization rate and to prevent infections. Due to the fact that for many years a little clinical significance has been attributed to these bacteria, they have not yet been sufficiently studied, and therefore, there is an urgent need to carry out further research, especially based on molecular analysis. 1. Introduction. 2. Taxonomy. 3. Identification and culture. 4. Clinical significance. 4.1. Infections in children. 4.1.1. Acute otitis media. 4.1.2. Sinusitis. 4.1.3. Pneumonia. 4.2. Infections in adults. 4.2.1. Laryngitis. 4.2.2. Exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. 4.2.3. Pneumonia. 4.3. Nosocomial infections. 4.4. Colonization. 5. Pathogenesis mechanisms and virulence factors. 5.1. Adherence. 5.2. Invasion. 5.3. Biofilm formation. 5.4. Complement resistance. 6. Drug resistance. 7. Vaccines. 8. Summary Słowa kluczowe: Moraxella catarrhalis, oporność na leki, wirulencja, zakażenia układu oddechowego Key words: Moraxella (Branhamella) catarrhalis, drug resistance, respiratory tract infections, virulence 1. Wstęp 2. Taksonomia Moraxella catarrhalis jest tlenową, Gram-ujemną dwoinką często izolowaną od ludzi. Przez wiele lat M. catarrhalis uznawano za nieszkodliwą, typowo komensalną bakterię, stanowiącą składnik flory fizjologicznej górnych dróg oddechowych. Ostatnie 30 lat dostarczyło wielu dowodów na chorobotwórczość M. catarrhalis, która dziś jest uznawana za ważny patogen wywołujący przede wszystkim infekcje układu oddechowego. Za uznaniem patogenności tego drobnoustroju przemawia stale wzrastająca ilość izolacji tego drobnoustroju z materiałów pochodzących z układu oddechowego osób chorych oraz pojawienie się szczepów wielolekoopornych. Do chorób najczęściej wywoływanych przez ten gatunek należą ostre zapalenie ucha środkowego i zaostrzenie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc. Bakterii znanej dziś jako Moraxella catarrhalis, początkowo nadano nazwę Micrococcus catarrhalis. Nazwę tę następnie zmieniono w latach 50. XX wieku, na Neisseria catharralis, ze względu na podobieństwo morfologii i właściwości biochemicznych tych bakterii do cech uznawanych za wspólne dla rodzaju Neisseria [42]. W 1963 roku Berger [8] wykazał, że rodzaj ten obejmuje dwa odrębne gatunki (Neisseria cinerea i Neisseria catarrhalis) różniące się zdolnością do redukcji azotanu i rozkładu tributyrinu (trójmaślanu glicerolu). Rozwój technologii badań molekularnych wkrótce dostarczył dowodów na brak homologii chromosomalnego DNA N. catarrhalis i innych bakterii z rodzaju Neisseria. W związku z tym w 1970 roku nazwę drobnoustroju zmieniono z N. catarrhalis na Bran­hamella catarrhalis, ustanawiając nowy rodzaj [17]. * Autor korespondencyjny: Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, ul. W. Chodźki 1; 20-093 Lublin; tel./fax +48 81448 6400; e-mail: [email protected] MORAXELLA CATARRHALIS – PATOGEN GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH W 1984 roku na podstawie pokrewieństwa genetycznego Branhamella catarrhalis została przeniesiona do rodzaju Moraxella jako Moraxella (Branhamella) catarrhalis [13]. Rodzaj Moraxella należy obecnie do rodziny Moraxellaceae i obejmuje dwie grupy bakterii o różnej morfologii (pałeczki i ziarniaki) i o różnym znaczeniu klinicznym (bakterie oportunistyczne i chorobotwórcze). W 1991 roku pojawiły się sugestie, aby utworzyć nową rodzinę Branhamaceae, a w jej obrębie dwa rodzaje: Branhamella i Moraxella, uwzględniając te różnice [18]. Propozycja ta została jednak odrzucona m.in., na podstawie badań genetycznych [25]. Ostatecznie przyjęto wcześniej ustanowioną klasyfikację, która jest aktualnie obowiązującą, uznając, że najlepiej odzwierciedla relacje pomiędzy rodzajami należącymi do rodziny Moraxellaceae: Moraxella, Aci­ neto­bacter i Psychrobacter [92]. Nie wyklucza się, że badania ostatnich lat dostarczą nowych informacji, na podstawie których pozycja taksonomiczna M. catarrhalis zostanie wkrótce zrewidowana. Niektórzy badacze sugerują, że obecny gatunek M. catharrhalis składa się z dwóch odleg­łych filogenetycznie linii lub być może nawet z dwóch odrębnych gatunków [12, 91]. Według Wirth’a i wsp. [99] starsza linia (typ 2) istnieje od ok. 50 milionów lat, podczas gdy młodsza (subpopulacja 1) pojawiła się ok. 5 milionów lat temu wraz z Homo sapiens. Filogenetycznie młodsza subpopulacja 1 jest dobrze przystosowana do bytowania w tkankach człowieka, posiada szereg czynników wirulencji (m.in. odporność na działanie układu dopełniacza), a także zdolność do adherencji do nabłonków gospodarza. Co ciekawe, wykazano, że większość izolatów klinicznych M. catarrhalis należy do subpopulacji 1 [99]. 3. Identyfikacja i hodowla Optymalne warunki hodowli M. catarrhalis zapewnia temperatura 35–37°C i atmosfera wzbogacona o CO2 w stężeniu 3–7%. Wzrost drobnoustrojów jest również możliwy w szerszym zakresie temperatur (od 20 do 42°C) w atmosferze tlenowej. Na agarze krwawym M. catarrhalis tworzy okrągłe, jasno-szare, nieprzezroczyste, wypukłe, lśniące kolonie o równym brzegu. Kolonie mogą być łatwo przesuwane po powierzchni agaru za pomocą ezy bakteriologicznej, bez naruszenia ich struktury (tzw. test krążka hokejowego) [33]. M. catarrhalis jest często mylona z komensalnymi bakteriami z rodzaju Neisseria spp. ze względu na zajmowanie wspólnej niszy, podobny wygląd kolonii i morfologię komórek obserwowaną mikroskopowo po barwieniu metodą Grama. Oba gatunki można różnicować za pomocą testów biochemicznych: M. catarrhalis wytwarza DNazę, katalazę i oksydazę, rozkłada tributyrin, redukuje NO3 i nie tworzy kwasów z węglowo- 69 danów (glukoza, maltoza, laktoza, fruktoza, sacharoza) na drodze oksydacji. Wymienione cechy są podstawą do laboratoryjnej identyfikacji Moraxella. Opracowano również bardziej czułe molekularne metody wykrywania Moraxella, oparte na reakcji PCR (real-time PCR, multiplex PCR). Zestawy do przeprowadzania tych reakcji są już dostępne handlowo [9, 43, 36]. Metody molekularne pozwalają na szybką i pewną diagnostykę pacjentów, umożliwiają równoczesne wykrywanie najczęstszych czynników etiologicznych diagnozowanych chorób, a także pozwalają na ilościową ocenę badanego materiału. 4. Znaczenie kliniczne M. catarrhalis jest chorobotwórczym drobnoustrojem wywołującym zakażenia górnych i dolnych dróg oddechowych. Dwie najczęściej występujące postacie kliniczne tych zakażeń to ostre zapalenie ucha środkowego u dzieci oraz zaostrzenie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u dorosłych [42]. Rzadziej M. catarrhalis jest przyczyną ciężkich zakażeń nie związanych z układem oddechowym (dotychczas opisano ok. 80 przypadków tego typu zachorowań) [74] w tym m.in. bakteriemi [2, 74], zapalenia wsierdzia [84, 90], zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych [21, 40], zapalenia wyściółki komór mózgowych [70], septycznego zapalenia stawów [59], zapalenia kości i szpiku [97] czy zapalenia spojówek [61]. 4.1. Zakażenia dzieci Spośród zakażeń układu oddechowego, które M. catar­rhalis wywołuje u dzieci najczęściej występuje ostre zapalenie ucha środkowego, a także zapalenie zatok. O wiele rzadziej opisywane są zakażenia dolnych odcinków układu oddechowego. 4.1.1. Ostre zapalenie ucha środkowego Ostre zapalenie ucha środkowego (OZUŚ) jest jedną z najczęściej występujących chorób wieku dziecięcego, jednocześnie jest również najczęstszym powodem stosowania antybiotyków w tej grupie wiekowej [3]. Szczyt zachorowalności obserwuje się w okresie dwóch pierwszych lat życia, a niemowlęta i małe dzieci są bardziej narażone na wystąpienie choroby, niż starsze dzieci i osoby dorosłe. Wynika to z niedojrzałości układu immunologicznego u dzieci, jak również anatomicznych cech sprzyjających zakażeniom (krótka trąbka słuchowa o poziomym przebiegu) [57]. Blisko 80% dzieci w wieku do lat 3 doświadcza epizodu tej choroby przynajmniej jednokrotnie w ciągu życia. W Polsce około 65% dzieci poniżej 2-go roku życia 70 KATARZYNA KRÓL-TURMIŃSKA, ALINA OLENDER choruje przynajmniej jednokrotnie, a 30% więcej niż trzy razy, co więcej nawrotowość zapaleń uszu ma tendencję wzrastającą [32, 57, 71]. M. catarrhalis, poza Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae, jest najczęstszym czynnikiem etiologicznym OZUŚ u dzieci. Diagnostyka mikrobiologiczna, polegająca na posiewie płynu pobranego z jamy bębenkowej w czasie tympanocentezy nie jest rutynowo wykonywana, w związku z czym dokładne ustalenie za jaki odsetek zachorowań odpowiedzialna jest M. catarrhalis nie jest możliwe. Na podstawie przypadków OZUŚ w których wykonano szczegółową diagnostykę szacuje się, że M. catarrhalis odpowiada za ok. 15–20% zachorowań [5, 56]. W badaniach przeprowadzonych przez Sheikh i wsp. [79] na grupie 45 dzieci w wieku od 1 do 15 roku życia, obecności M. catarrhalis wykryto za pomocą metody PCR u 12% pacjentów z OZUŚ. Badania Kaur i wsp. [41] wykazały że M. catarrhalis izolowana była w 34,9% przypadków od dzieci zdrowych, a w 47,4% od tych samych dzieci badanych w trakcie epizodu OZUŚ. Na przebieg choroby ma wpływ wiele czynników. W porównaniu do S. pneumoniae, obraz choroby wywoływanej przez M. catarrhalis jest bardziej łagodny. W przypadku zakażeń M. catarrhalis rzadko obserwuje się spontaniczną perforację błony bębenkowej [14]. Zakażenie S. pneumoniae częściej wiąże się z wysoką gorączką, ostrym bólem ucha, a także uwypukleniem i przekrwieniem błony bębenkowej [69]. Udowodniono, że kolonizacja M. catarrhalis w jamie nosowo-gardłowej zwiększa ryzyko zachorowania. Poza kolonizacją, pierwotne zakażenie wirusami oddechowymi np. wirusem RSV, jest kolejnym mikrobiologicznych czynnikiem ryzyka wystąpienia OZUŚ u dzieci [9]. Infekcja wirusowa powoduje powstanie stanu zapalnego i wytworzenie podciśnienia w trąbce Eusachiusza. Bakterie w trakcie infekcji wirusowej mogą migrować z jamy nosowo-gardłowej w kierunku ucha środkowego lub być aspirowane przez różnicę ciśnień. Proliferacja bakterii w okolicach ucha środkowego może doprowadzić do nadkażenia i rozwoju wtórnego, po wirusowym, OZUŚ [10]. 4.1.2. Zapalenie zatok Zapalenie zatok jest chorobą często występującą u dzieci, stanowi powikłanie 5–10% zakażeń górnych dróg oddechowych w tej grupie wiekowej. Anatomicznie budowa zatok u dzieci znacznie różni się od budowy zatok dorosłych. Zatoki szczękowa i klinowa, a także błędnik sitowy są obecne w chwili urodzenia, natomiast zatoki czołowe rozwijają się około 5-go r.ż. Zatoki przynosowe dzieci zostają w pełni wykształcone dopiero w okolicach 5–7-go r.ż. [100]. W większości przypadków bakteryjne zapalenie zatok u dzieci rozwija się po wcześniejszym zakażeniu wirusowym, a przebieg choroby jest niemal identyczny jak w przypadku zakażenia wirusowego. Ostre bakteryjne zapalenie zatok jest stwierdzane, gdy objawy, takie jak obecność wydzieliny z nosa i kaszel w trakcie dnia i nocy utrzymują się przez więcej niż 10, ale mniej 30 dni [15]. Badania mikrobiologiczne wykonywane są rzadko, w przypadku wystąpienia powikłań [100]. Bakteriami najczęściej izolowanymi od dzieci z zapaleniem zatok są S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, beta-hemolizujące streptokoki z grupy A i S. aureus [15]. M. catarrhalis odpowiada za wywoływanie 15–30% zakażeń [4]. W badaniach Marom i wsp. [51] przeprowadzonych na 294 dzieciach u których wystąpiło łącznie 1295 epizodów zakażeń górnych dróg oddechowych, M. catarrhalis była izolowana w 20% przypadków. W badaniach tych wykazano pozytywną korelację pomiędzy obecnoś­ cią M. catarrhalis a występowaniem ostrego zapalenia zatok. Shaikh i wsp. [78] izolowali M. catarrhalis od 15% badanych dzieci. W pracy tej analizowano wyniki posiewów materiału z jamy nosowo-gardłowej pozyskanego od 150 dzieci z objawami zakażenia zatok. Poza M. catarrhalis izolowano również S. pneumoniae (29%) i H. influenzae (15%). 4.1.3. Zapalenie płuc Przypadki zakażeń dolnych odcinków układu oddec­ howego u dzieci przez M. catarrhalis są dobrze udokumentowane, jednak występują znacznie rzadziej niż infekcje innego typu [85]. M. catarrhalis należy do grupy 3–4 gatunków bakterii najczęściej izolowanych od dzieci z zapaleniem płuc. Najczęściej są to mieszane infekcje bakteryjne i wirusowe z takimi patogenami jak S. pneumoniae, H. influenzae, wirus RSV, adenowirus, wirusy paragrypy i rhinowirusy [48, 73, 85]. Również czyste kultury M. catarrhalis były izolowane z aspiratów z tchawicy od noworodków, niemowląt i dzieci z objawami zapalenia płuc [92]. Zapalenie płuc wywołane przez Moraxella ma łagodny przebieg, najczęściej dotyczy dzieci z niedoborami immunologicznymi lub chorujących na przewlekłe schorzenia dolnego odcinka układu oddechowego. Opisano również ponad 1500 przypadków pozaszpitalnych zachorowań na zapalenie płuc wywołane M. catarrhalis wśród dzieci wcześniej nie cierpiących z powodu żadnych schorzeń związanych z układem oddechowym [85]. 4.2. Zakażenia dorosłych Zakażenia układu oddechowego u dorosłych, których przyczyną jest M. catarrhalis mają różne postacie kliniczne. Do najważniejszych zalicza się zapalenie krtani, zaostrzenie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, zapalenie płuc u osób starszych i szpitalne zakażenia oddechowe. MORAXELLA CATARRHALIS – PATOGEN GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH 4.2.1. Zapalenie krtani Rola M. catarrhalis jako bezpośredniego czynnika etiologicznego zaplenia krtani nie jest w pełni potwierdzona, mimo to Moraxella jest najczęściej izolowaną bakterią od dorosłych z objawami tej choroby. Bakteria ta jest izolowana od ponad 50% przypadków, a większość izolatów to fenotyp odporny na działanie układu dopełniacza [38, 75]. Rozwinięcie tej jednostki chorobowej w wyniku zakażenia M. catarrhalis udowodniono również na modelu zwierzęcym [39]. 4.2.2. Zaostrzenie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) sta­nowi jeden z najważniejszych problemów zdrowia publicznego i jest jedną z głównych przyczyn wysokiej umieralności na całym świecie. POChP zajmuje obecnie 4 miejsce wśród najczęściej występujących przyczyn zgonów [7]. W przebiegu tej choroby obserwuje się sporadyczne pogorszenia stanu pacjenta, które nazywane są zaostrzeniami choroby. Większość zaostrzeń POChP jest spowodowanych przez infekcje bakteryjne, pozostała część przez infekcje wirusowe i przyczyny nie zakaźne [76]. M. catarrhalis jest częstą przyczyną zaostrzeń POChP [92]. Jest to druga, po H. influenzae, najczęściej izolowana bakteria od chorych z objawami zaostrzenia POChP. Szacuje się, że M. catarrhalis powoduje ok. 10% przypadków zaostrzeń POChP, co stanowi 2–4 milionów zaostrzeń rocznie na terenie samych Stanów Zjednoczonych [55]. Kliniczne objawy zaostrzenia spowodowanego przez M. catarrhalis są podobne do objawów wywoływanych przez inne bakterie patogenne, w tym H. influenzae i S. pneumoniae. Głównymi objawami są zwiększona, w porównaniu do objawów początkowych, produkcja plwociny, pojawienie się plwociny ropnej, duszności, kaszel, gorączka i zmęczenie. Podczas badania klatki piersiowej zwykle słyszalne są gwizdy i trzaski. W badaniu radiologicznym klatki piersiowej należy wykluczyć zapalenie płuc. W rozmazie plwociny barwionym metodą Grama widoczne są neutrofile i duża ilość dwoinek Gram-ujemnych, w tym zlokalizowanych wewnątrzkomórkowo [45, 56]. W połowie przypadków zaostrzenie POChP związane jest z nabyciem nowego szczepu M. catarrhalis [55]. Wykazano również, że M. catarrhalis jest obecna w dolnych drogach oddechowych u 2,5–10% pacjentów z POChP w stanie stabilnym, pomimo, że fizjologicznie okolice te winny być w pełni jałowe [53]. 4.2.3. Zapalenie płuc Zapalenie płuc spowodowane przez M. catarrhalis jest najbardziej powszechne wśród osób starszych, zwłaszcza tych u których występują istotne choroby 71 współistniejące m.in. POChP, cukrzyca, czy zaburzenia krążenia takie jak zastoinowa niewydolność serca. W badaniach Lutwick’a i wsp. [49], które obejmowały grupę 109 pacjentów z zapaleniem płuc o potwierdzonej etiologii M. catarrhalis, średnia wieku badanych osób wynosiła 74,9 lat, a ponad 67% osób było chorych na POChP, miało zaburzenia sercowo-naczyniowe, cukrzycę lub inne schorzenia współistniejące. W badaniu tym 75 infekcji było związanych ze środowiskiem szpitalnym, a 34 zachorowania były pozaszpitalne. Duża część pacjentów z zapaleniem płuc wywoływanym przez M. catarrhalis to palacze [92]. Typowy obraz kliniczny zapalenia płuc wywoływanego przez M. catarrhalis jest łagodny. Najczęstsze objawy to kaszel, obecność ropnej plwociny i duszności. W badaniu rentgenowskim widoczne są płatowe lub częściowe nacieki oskrzelowe. W tomografii komputerowej obserwowano tzw. ogniska matowej szyby, pogrubienie ścian oskrzeli, rozstrzenie, oraz guzki środkowej części zrazika [58]. Wysoka gorączka, ból w klatce piersiowej, ropnie i bakteriemia występują bardzo rzadko [49]. Collazos i wsp. [20] opisali 15 przypadków zapalenie płuc wywołanego przez M. catarrhalis w przebiegu którego wystąpiła bakteriemia. Diagnostyka mikrobiologiczna w większości przypadków obejmuje posiew z plwociny. 4.3. Zakażenia szpitalne Opisano wiele przypadków zakażeń M. catarrhalis związanych ze środowiskiem szpitalnym [47, 66]. Patter­ son i wsp. [60] opisali pierwszy przypadek wewnątrzszpitalnej epidemii spowodowanej przez M. catarrhalis, która objęła 5 pacjentów i 2 członków personelu oddziału zajmującego się chorobami układu oddechowego. Również Richards i wsp. [68] opisali epidemię szpitalną spowodowana przez Moraxella, badacze wyizolowali 6 szczepów od 5 pacjentów, a wystąpienie epidemii było potwierdzone poprzez analizę wielkości fragmentów restrykcyjnych DNA, SDS-PAGE i immunoblotting. Czynnikami ryzyka, które mogą przyczyniać się do wewnątrzszpitalnego rozprzestrzeniania się M. catarrhalis są wielołóżkowe sale, wydłużony czas hospitalizacji i zanieczyszczenie środowiska szpitalnego. Udowodniono, że Moraxella może przenosić się pomiędzy pacjentami, a także bakteria ta jest zdolna do przetrwania nawet do 3 tygodni w próbce plwociny [92]. 4.4. Kolonizacja Zjawisko kolonizacji układu oddechowego przez M. catarrhalis jest bardzo częste, szczególnie wśród bardzo małych dzieci i wynosi średnio 22–55% w 6 miesiącu życia [9]. Odsetek osób dorosłych skolonizowanych przez M. catarrhalis jest niski i wynosi 1–5%, a większość z tych osób cierpi z powodu POChP lub innych schorzeń związanych z układem oddechowym. 72 KATARZYNA KRÓL-TURMIŃSKA, ALINA OLENDER Częstość kolonizacji wzrasta ponownie wśród starszych osób po 60 roku życia [9, 24, 42]. Badania wykazały, że kolonizacja niemowląt następuje tuż po urodzeniu, a jej częstość jest zmienna i zależy w dużej mierze od wieku, pory roku, a także rozpatrywanego obszaru geograficznego. Verhaegh i wsp. [93] w swojej pracy przeprowadzonej na terenie Holandii odnotowali wzrost częstości kolonizacji małych dzieci wraz z wiekiem. Według tych badań kolonizacja wśród dzieci w wieku 1,5 miesiąca wynosiła 12%, 22% wśród dzieci w wieku 6 miesięcy i 25% w wieku 14 miesięcy. Podobne wyniki otrzymali Vuononvirta i wsp. [98] w swoich badaniach przeprowadzonych na terenie Finlandii. Częstość kolonizacji w pracy tych autorów wzrastała z 25% w 2 miesiącu życia, do 48% w 12 miesiącu i 58% w 24 miesiącu. Inne badania przeprowadzone przez Faden’a i wsp. [26] w Stanach Zjednoczonych, wykazały że kolonizacja dzieci do 1 r.ż. wynosiła 66% i wzrastała do 78% do 2 r.ż. Autorzy Ci za pomocą analizy DNA ustalili, że dzieci do 2 roku życia nabywają i tracą średnio od 3 do 4 różnych szczepów Moraxella. Badania przeprowadzone w 1994 roku na trenie Australii, wykazały 100% kolonizację wśród niemowląt pochodzenia aborygeńskiego w wieku do 3 miesięcy [46]. Obecnie powód znacznych różnic w częstości kolonizacji pomiędzy dziećmi i dorosłymi nie jest w pełni znany. Jako jedno z wyjaśnień podaje się zależny od wieku rozwój wydzielniczych przeciwciał IgA. Co więcej, poziom przeciwciał IgG nie koreluje z częstością kolonizacji i występowaniem zakażeń Moraxella u dzieci [92]. W wielu badaniach odnotowano sezonową zmienność częstości kolonizacji M. catarrhalis ze szczytem w miesiącach chłodniejszych jesień-zima [94] lub zima-wiosna [92]. Zjawisko to tłumaczy się większą wykrywalnością M. catarrhalis ze względu na wykonywanie w tych okresach większej liczby badań związanych z diagnostyką infekcji górnych dróg oddechowych. Związek między sezonowymi infekcjami wirusowymi i wynikającymi z nich wtórnymi zakażeniami bakteryjnymi został opisany przez wielu autorów [94]. Spośród czynników sprzyjających kolonizacji wymieniane są przebywanie w dużych skupiskach ludzi (uczęszczanie do przedszkoli, przebywanie w wielołóżkowych salach szpitalnych), palenie, niski status społeczny, predyspozycje genetyczne, choroby współistniejące, pory roku, płeć i przebyte szczepienia [47, 93]. Zaobserwowano również zwiększony udział M. catarrhalis w kolonizacji jamy nosowo-gardłowej u dzieci, które były szczepione przeciwko pneumokokom [67]. replikację in vivo, interakcję z układem odpornościowym i zdolność do przeciwstawiania się jego mechaniz­ mom, oraz uszkodzenie komórek i tkanek. Chorobotwórczość M. catarrhalis jest dobrze udokumentowana, a wiedza temat mechanizmów patogenezy tego drobnoustroju stale rośnie. Wykazano, że M. catarrhalis posiada zdolność do kolonizacji dróg oddechowych pacjentów z POCHP [77] i śluzówki ucha środkowego [31]. Kolonizację umożliwiają liczne receptory wiążące elementy nabłonka gospodarza oraz składniki macierzy pozakomórkowej (ECM – extra cellular matrix). Drobnoustrój ten posiada również zdolność do inwazji komórek nabłonkowych, co ma znaczenie w unikaniu odpowiedzi immunologicznej [83]. Wykazano również, że M. catarrhalis ma zdolność do interakcji i konkurencji z florą komensalną obecną w drogach oddechowych, oraz może się namnażać i rozwijać w środowisku ubogim w składniki pokarmowe. Warunki te sprzyjają formowaniu mikrokolonii oraz biofilmu [30]. Dla drobno­ustroju tego opisano również mechanizmy umożliwiające unikanie elementów układu immunologicznego gospodarza, zwłaszcza działania układu dopełniacza [54]. 5.1. Adhezja Adhezja bakterii do komórek nabłonkowych dróg oddechowych, za pośrednictwem różnego typu struktur powierzchniowych, jest uważana za pierwszy etap zasiedlania organizmu człowieka. Opisano i scharakteryzowano szereg adhezyn występujących u M. catarrhalis (Tabela I), a wśród nich lipooligosacharyd (LOS), pile typu IV, białka błony zewnętrznej OMPs (outer membrane proteins) do których należą m.in. rodzina białek Tabela I Wybrane adhezyny M. catarrhalis Adhezyny Funkcja i działanie Hag/MID Wiązanie IgD, hemaglutynina Usp A1 Wiązanie lamininy, autotransporter Usp A2 Wiązanie białek układu dopełniacza, wiązanie witronektyny i lamininy, autotransporter McaP Aktywność fosfolipazy B OMP B1 Wiązanie transferryny OMP CD Wiązanie mucyny OMP G1a Lipoproteina, transport jonów miedzi OMP E Transport kwasów tłuszczowych (prawdopodobnie) Pile typu IV Transformacja, udział w tworzeniu biofilmu 5. Mechanizmy patogenezy i czynniki wirulencji O wirulencji drobnoustroju decyduje szereg cech, które umożliwiają wiązanie, kolonizację i infekowanie organizmu gospodarza, wnikanie do jego komórek, LOS Adhezyna, potencjalny składnik szczepionki, unikanie działania układu dopełniacza Olp A Unikanie działania układu dopełniacza Msp Transport jonów dwuwartościowych M35 Poryna MORAXELLA CATARRHALIS – PATOGEN GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH Usps (ubiquitous surface proteins), białko Hag/MID (hemagglutinin/Moraxella immunoglobulin D-binding protein), białko OMP CD czy białko McaP (M. catarrhalis adherence protein) [56, 65]. Rodzina białek Usps jest najbardziej intensywnie badaną grupą adhezyn u M. catarrhlis. Do rodziny tej należą białka UspA1, UspA2 i hybrydowe białko UspA2H. Białka UspA posiadają trzyczęściową strukturę podobną do lizaka, złożoną z regionów głowy i wydłużonego trzonu oraz domeny zakotwiczonej w błonie komórkowej. Budowa ta jest homologiczna do budowy białka YadA u Yersinia spp. [37]. N-koniec białka UspA2H jest podobna do domeny UspA1, a jego C-koniec przypomina UspA2. Homologia pomiędzy UspA1 i UspA2 dotyczy regionu trzonu, natomiast region kotwiczący i N-koniec regionu głowy w obu białkach znacznie się różnią. UspA1 należy do głównych adhezyn M. catarrhalis [16]. Gen dla UspA1 jest obecny w obu liniach filogenetycznych, ale tylko typ 1 oporny na działanie dopełniacza wykazuje ekspresję tego białka [65]. UspA1 i UspA2 wiążą się do komórek gospodarza przez wielofunkcyjne miejsca wiązania [9]. Wykazano, że UspA1 wiąże się za pomocą miejsca wiązania znajdującego się w regionie trzonu z CEACAMs (cząsteczki adhezji międzykomórkowej związane z antygenem karcinoembrionalnym; carcino-embryotic antigen-related cell adhesion molecules), obecnymi na powierzchni ludzkich komórek nabłonkowych jamy gardłowej i dol­ nych dróg oddechowych [9, 65]. UspA1 i UspA2 wiążą również białka macierzy zewnątrzkomórkowej takie jak witronektyna, laminina i fibronektyna [65, 86, 87]. Badania wykazały, że białka UspA wykazują szeroki wachlarz funkcji i potencjalnych zdolności wiązania różnych struktur, co może bezpośrednio przekładać się na zdolność do adhezji i wirulencję poszczególnych szczepów M. catarrhalis. Białka UspA oprócz funkcji adhezyjnych, są autotransporterami a także biorą udział w unikaniu działania układu dopełniacza [16]. Białko Hag/MID jest kolejnym wielofunkcyjnym białkiem błony zewnętrznej M. catarrhalis. Posiada unikalną zdolność do wiązania IgD, pełni funkcję hemaglutyniny, jest autotransporterem, a także adhezyną wiążącą się do różnego typu komórek układu oddechowego (m.in. nabłonkowe komórki alweolarne typu II, komórki ucha środkowego, komórki spojówkowe Changa, komórki raka płuc linii A549) [9, 29]. Białko OMP CD M. catarrhalis również pełni funkcję adhezyny i wiąże się z mucyną ucha środkowego i jamy nosowej [33]. Lipooligosacharyd (LOS) jest ważnym składnikiem błony zewnętrznej M. catarrhalis, pełni funkcję adhezyjny umożliwiającej wiązanie bakterii do komórek układu oddechowego. Badania wykazały występowanie trzech różnych serotypów LOS (A, B i C), o wspólnej budowie rdzenia polisacharydowego lecz różniących 73 się długością i składem końcowych grup cukrowych w rozgałęzieniach. Najczęściej występującym serotypem jest LOS A, szczególnie często wykrywany u bakterii izolowanych od osób z POChP. Serotyp B częściej występuje w bakteriach wyizolowanych od dorosłych niż tych pochodzących od dzieci [23, 33]. 5.2. Inwazja Wnikanie do komórek jest kolejnym, po adhezji, krytycznym etapem zasiedlania organizmu gospodarza. Inwazja do komórek gospodarza umożliwia bakteriom uniknięcie odpowiedzi immunologicznej i chroni przed antybiotykami działającymi pozakomórkowo. Inwazja M. catarrhalis do komórek nabłonka układu oddechowego była obserwowana głównie w badaniach prowadzonych in vitro [82, 83]. W badaniach in vivo wykazano zdolność Moraxella do inwazji podnabłonkowej tkanki limfoidalnej gardła osób chorych na ciężkie infekcje dróg oddechowych [34]. Badania Slevogt i wsp. [82] przeprowadzone z wykorzystaniem skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazały, że adhezja M. catarrhalis do komórek nabłonkowych linii BEAS-2B i A549 powoduje zmiany fenotypowe w obu typach komórek. Zaobserwowano formowanie lamelliopodiów i filopodiów otaczających komórki bakteryjne, a inwazja odbywała się na drodze mechanizmu przypominającego makropinocytozę. W badaniach tych wykazano również, że M. catarr­halis sama inicjuje proces internalizacji do komórek za pośrednictwem mechanizmu zależnego od mikrofilamentów (polimeryzacja aktyny i klatryny). W badaniach tych nie odnotowano internalizacji martwych komórek bakteryjnych. Proces inwazji M. catarrhalis jest regulowany poprzez ekspresję LOS i UspA1, a także inne białka powierzchniowe. Odnotowano znaczny spadek efektywności adhezji oraz inwazji do komórek nabłonkowych u szczepów z mutacjami genów dla tych białek [82]. Praca innych autorów wykazała również, że blokowanie domeny wiążącej CEACAM-1 hamuje inwazję komórek nabłonkowych przez M. catarrhalis, H. influenzae i N. meningitidis [34]. Dokładny mechanizm inwazji M. catarrhalis nie został jeszcze w pełni wyjaśniony i istnieje potrzeba przeprowadzenia dalszych badań w tym zakresie [22, 65]. 5.3. Tworzenie biofilmu Tworzenie biofilmu jest ważnym etapem kolonizacji, pozwala na utrzymywanie się bakterii w organizmie wyższym przez długi czas, chroni je przed działaniem antybiotyków oraz pozwala uniknąć odpowiedzi immunologicznej. Patogenne bakterie uwalniane ze struktury biofilmu mogą być przyczyną rozwoju zakażenia. Badania prowadzone zarówno in vitro jak i in vivo wykazały, 74 KATARZYNA KRÓL-TURMIŃSKA, ALINA OLENDER że M. catarrhalis posiada zdolność do wytwarzania biofilmu [31, 62]. Praca Pearsona i wsp. [63] wykazała, że obecność białka UspA1 ma pozytywny wpływ na formowanie biofilmu, podczas gdy obecność białka Hag wpływa negatywnie na ten proces. Inne badania wykazały, że czynnikami, które warunkują zdolność do tworzenia mikrokolonii i formowania biofilmu u Moraxella są przede wszystkim białka UspA, TPF, pile typu IV, oraz regulatorowe białko Hfq, którego mutacja zmienia skład białek powierzchniowych (wzrost ekspresji CopB, OMP J i OMP G1b) i pośrednio wpływa na ułatwienie formowania biofilmu. Formowanie biofilmu ma kluczową rolę w długotrwałym utrzymywaniu się M. catarrhalis w drogach oddechowych dzieci [22]. Biofilm z udziałem M. catarrhalis był obserwowany wśród dzieci z OZUŚ [31]. Badania Verhaegh’a i wsp. [95] wykazały, że biofilm wytwarzany przez Moraxella jest częściej obecny w organizmie dzieci poniżej 5 r.ż. niż u dorosłych. Te dwie obserwacje mogą być klinicznie istotne i być może przyczynią się do lepszego zrozumienia patogenezy OZUŚ. Wykazano, że tworzenie biofilmu z koegzystującymi w tym samym obszarze drobnoustrojami ma duży wpływ na ich właści­wości. W badaniach Perez i wsp. [64] mieszany biofilm z udziałem M. catarrhalis i S. pneumoniae powodował bierną ochronę obu drobnoustrojów przed antybiotykami dzięki występowaniu lekooporności u jednego z gatunków, oraz dzięki mechanizmowi quorum sensing przedłużał występowanie obu patogenów w modelu in vivo. Badania Verhaegh i wsp. [96] wykazały również, że kokultura M. catarrhalis i S. pyoenes znacznie wpływa na wzrost ekspresji genów odgrywających ważną rolę w wirulencji S. pyogenes. 5.4. Oporność na działanie układu dopełniacza Układ dopełniacza jest elementem odporności wrodzonej i często stanowi pierwszą linię obrony ustroju przed bakteryjnymi patogenami. Aktywacja układu dopełniacza drogą klasyczną, alternatywną lub lektynową prowadzi do opłaszczenia powierzchni bakteryjnej przez białka dopełniacza. Prowadzi to do wytworzenia kompleksu atakującego błonę (MAC – Membrane Attack Complex) oraz opsonizacji bakterii, która ułatwia fagocytozę komórkom żernym. Oporność na działanie dopełniacza należy do grupy bardziej istotnych mechanizmów chorobotwórczości. Większość szczepów M. catarrhalis jest opornych na działanie dopełniacza. Bakterie te wykazują zdolność do przeżywania w surowicy zdrowych ludzi, a cecha ta częściej dotyczy szczepów izolowanych od osób z objawami zakażenia dróg oddechowych, niż tych pozyskiwanych od ludzi skolonizowanych, nie wykazujących objawów chorobowych [54]. Opisano wiele białek, które warunkują ochronę bakterii przed działaniem dopełniacza, a wśród nich UspAs, OMP CD, OMP E, CopB. Udział w tym procesie ma również bakteryjny LOS [22]. Najważniejszymi OMPs uczestniczącymi w oporności Moraxella są UspAs, które hamują zarówno klasyczną drogę aktywacji dopełniacza poprzez wiązania białka wiążącego inhibitor dopełniacza C4 (C4BP) i alternatywą drogę przez neutralizację białka C3. Wykazano również, że UspA2 ma zdolność blokowania wytwarzania kompleksu MAC poprzez wiązanie się z witronektyną [6]. W badaniach Singh i wsp. [81] wykazano również, że białka UspA2 i UspA2H mają zdolność do wiązania plazminogenu, który następnie jest przekształcany do plazminy, która degraduje białka C3b i C5. Wiązanie plazminogenu może prowadzić do zwiększonej wirulencji i tym samym bardziej efektywne kolonizacji gospodarza. Dla M. catarrhalis opisano również mechanizm blokowania aktywacji układu dopełniacza polegający na wytwarzaniu pęcherzyków z błony zewnętrznej (OMVs, outer membrane vesicles). Pęcherzyki te zawierają struktury znajdujące się w błonie zewnętrznej: białka OMPs (m.in. UspA1 i UspA2), pory, poryny, receptory, oraz lipopolisacharyd. Pęcherzyki zawierające białka UspAs są zdolne do inaktywacji składnika C3 dopełniacza. Co więcej, wykazano, że obecność tych pęcherzyków w środowisku zwiększa zdolność przetrwania wrażliwych na działanie surowicy szczepów H. influenzae [88]. 6. Lekooporność M. catarrhalis jest wrażliwa na większość antybiotyków stosowanych w leczeniu infekcji dróg oddechowych. Dla bakterii tej opisano, oprócz powszechnej oporności na penicyliny wynikającej z wytwarzania β-laktamaz, występowanie naturalnej oporności na trimetoprim, wankomycynę i klindamycynę [52]. Pierwszy szczep M. catarrhalis wytwarzający β-laktamazy został wyizolowany w Szwecji w 1977 roku [75]. Od lat 70. liczba szczepów laktamazododatnich drastycznie wzrastała, w tempie nie obserwowanym dla żadnego innego gatunku bakterii. Obecnie, niemal wszystkie izolaty kliniczne M. catarrhalis (90–100%) wytwarzają β-laktamazy. β-laktamazy M. catarrhalis są enzymami unikalnymi dla tego rodzaju i występują w formie 3 izotypów: BRO-1, BRO-2 i BRO-3 [11, 72]. Izotypy BRO-1 i BRO-2 różnią się pojedynczym aminokwasem i są związane z błoną komórkową. Oba enzymy kodowane są przez geny chromosomowe, które mogą być łatwo przenoszone pomiędzy bakteriami w wyniku procesu koniugacji [52]. Izotyp BRO-3 został opisany tylko dla pojedynczego szczepu [19]. Aktywność β-laktamaz Moraxella jest łatwo hamowana przez inhibitory tych enzymów, a niemal wszystkie izolaty są wrażliwe na działanie amoksycyliny z kwasem klawulonowym [50]. BRO-1 jest najczęściej wytwarzanym typem enzymu, MORAXELLA CATARRHALIS – PATOGEN GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH syntezuje go blisko 90% szczepów. Izotyp ten wykazuje wyższą aktywność niż BRO-2, a szczepy syntezujące BRO-1 wykazują silniejszą oporność na penicyliny i charakteryzują się wyższymi wartościami MIC. Wyższa aktywność BRO-1 jest związana z nawet trzykrotnie wydajniejszą ekspresją genu dla tego enzymu w porównaniu do poziomu ekspresji genu dla BRO-2 [52, 72]. Badania wskazują, że β-laktamazy Moraxella zostały nabyte w toku ewolucji i pochodzą od bakterii Gram-dodatnich. Za teorią tą przemawiają obniżona zawartość par G+C w genach bla kodujących β-lakatamazy BRO oraz fakt ze β-laktamazy Moraxella są lipidowane [33]. Powszechne występowanie oporności M. catarrhalis na antybiotyki β-laktamowe ma wpływ na obniżenie skuteczności terapii tymi lekami skierowanej przeciwko szczepom współwystępującym z Moraxella w obrębie dróg oddechowych [22, 64]. Pomimo naturalnej oporności na trimetoprim, większość szczepów M. catarrhalis jest wrażliwa na trimetoprim w połączeniu z sulfametoksazolem (kotrimoksazol). Według badań Flamm’a i wsp. [27] powyżej 90% szczepów w Europie, USA, Ameryce Południowej i Regionie Zachodniego Wybrzeża Pacyfiku było wrażliwych na kotrimoksazol. Ostatnio coraz częściej pojawiają się jednak informacje na temat wzrastającej oporności na ten antybiotyk. W pracy Maraki i Papadakis’a [50] przeprowadzonej na terenie Grecji zaobserwowano wzrost liczby szczepów opornych na kotrimoksazol z 30% w 2009 roku do 32,3% w latach 2011–2012. Abdullah i wsp. [1] w swoich badaniach przeprowadzonych na terenie Pakistanu, odnotowali oporność wśród 90% wyizolowanych szczepów. Również Gupta i wsp. [30] w swoich badaniach odnotowali wysoką oporność na ten antybiotyk tj. 82,5% badanych szczepów. Izolaty M. catarrhalis w większości przypadków są wrażliwe na działanie takich antybiotyków jak erytromycyna, chloramfenikol, tetracyklina, gentamycyna i rifampicyna. Fluorochinolony również są bardzo skuteczne w leczeniu zakażeń wywołanych przez M. catarrhalis. Doniesienia na temat oporności na wymienione antybiotyki pojawiają się sporadycznie w literaturze światowej [1, 80, 30]. 7. Potencjalna możliwość stosowania szczepień Dwie najczęściej występujące choroby wywoływane przez M. carrhalis to OZUŚ oraz zaostrzenie POChP. Obie choroby mają duże znaczenie kliniczne i ekonomiczne. Efektywna szczepionka mająca zapobiegać OZUŚ u dzieci powinna być skierowana przeciwko trzem najczęstszym bakteriom wywołującym tego typu zakażenie: S. pneumoniae, H. influenzae oraz M. catarrhalis. Opracowanie skutecznej szczepionki przeciwko Moraxella stanowi jednak duże wyzwanie. Pierwszym problemem, z którym muszą zmierzyć się badacze, jest 75 brak odpowiedniego modelu zwierzęcego [56]. Jako laboratoryjny model aktualnie używane są myszy, jednak jest to model niedoskonały, cechujący się licznymi ograniczeniami. Kilka antygenów jest obecnie przedmiotem badań jako potencjalne składniki szczepionki. Istotną cechą tych antygenów jest ich konstytutywna ekspresja na powierzchni bakterii w trakcie infekcji. Ekspresja genów dla potencjalnie odpowiednich antygenów (np. UspA1 i MID/Hag) jest zmienna fazowo, co z kolei stanowi kolejną przeszkodę w pracach nad szczepionką [89]. Nie mniej jednak białka te zawierają wysoce konserwatywne regiony, które być może zostaną użyte do skonstruowanie dobrej szczepionki [44]. Obecne badania wskazują, że skuteczna szczepionka przeciw M. catarrhalis powinna być szczepionką poliwalentną [22]. 8. Podsumowanie M. catarrhalis jest ważnym patogenem dróg oddechowych. Drobnoustrój ten przez wiele lat uznawany był za małoistotny, niechorobotwórczy organizm kolonizujący ciało człowieka. Z tego względu chorobotwórczość, oporność na antybiotyki oraz inne cechy tej bakterii są wciąż zbyt słabo zbadane i wyjaśnione. Zakażenia, wywoływane przez tę bakterię mają duże znaczenie kliniczne z uwagi na częstość występowania oraz ekonomiczne ze względu na generowane koszty leczenia. Obecnie zwraca się szczególną uwagę na potrzebę skonstruowania skutecznej szczepionki, która mogła by zapobiegać zakażeniom i ograniczyć odsetek kolonizacji zwłaszcza wśród małych dzieci. Dlatego też istnieje potrzeba prowadzenia dalszych prac, które pozwolą lepiej poznać mechanizmy warunkujące chorobotwórczość M. catarrhalis, zwłaszcza na poziomie molekularnym. Piśmiennictwo 1.Abdullah F.E., Ahuja K.R., Kumar H.: Prevalence and emerging resistance of Moraxella catarrhalis in lower respiratory tract infections in Karachi. J. Pak. Med. Assoc. 63, 1342–1344 (2013) 2.Ahmed A., Broides A., Givon-Lavi N., Peled N., Dagan R., Green­berg D.: Clinical and laboratory aspects of Moraxella catarrhalis bacteremia in children. Pediatr. Infect. Dis. J. 27, 459–461 (2008) 3. American Academy of Pediatrics. Diagnosis and management of acute otitis media. Pediatrics, 113, 1451–1465 (2004) 4. Anon J.B.: Acute bacterial rhinosinusitis in pediatric medicine: current issues in diagnosis and management. Paediatr. Drugs, 5, 25–33 (2003) 5.Arguedas, A., Dagan R., Leibovitz E., Hoberman A., Pichichero M., Paris M.: A multicenter, open label, double tympanocentesis study of high dose cefdinir in children with acute otitis media at high risk of persistent or recurrent infection. Pediatr. Infect. Dis. J. 25, 211–218 (2006) 76 KATARZYNA KRÓL-TURMIŃSKA, ALINA OLENDER 6. Attia A.S., Ram S., Rice P.A., Hansen E.J.: Binding of vitronectin by the Moraxella catarrhalis UspA2 protein interferes with late stages of the complement cascade. Infect. Immun. 74, 1597–1611 (2006) 7. Bąk-Drabik K., Ziora D.: Jakość życia w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc. Pneumonol. Alergol. Pol. 72, 128–133 (2004) 8.Berger U.: Die anspruchslosen Neisserien. Ergeb. Microbiol. Immunitaetsforsch. Exp. Ther. 36, 97–167 (1963) 9.Bernhard S., Spaniol V., Aebi C.: Molecular pathogenesis of infections caused by Moraxella catarrhalis in children. Swiss Med. Wkly. 142, w13694 (2012) 10. Bluestone C.D.: Pathogenesis of otitis media: role of eustachian tube. Pediatr. Infect. Dis. J. 15, 281–291 (1996) 11. Bootsma H.J., van Dijk H., Vauterin P., Verhoef J., Mooi F.R.: Genesis of BRO beta-lactamase-producing Moraxella catarrhalis: evidence for transformation-mediated horizontal transfer. Mol. Microbiol. 36, 93–104 (2000) 12. Bootsma H.J., van der Heide H.G., van de Pas S., Schouls L.M., Mooi F.R.: Analysis of Moraxella catarrhalis by DNA typing: Evidence for a distinct sub-population associated with virulence traits. J. Infect. Dis. 181, 1376–1387 (2000) 13. Bovre K. The Genus Moraxella (w) Bergey’s manual of systematic bacteriology, red. N.R. Krieg, J.G. Holt, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md., 1984, tom 1, s. 296–303 14. Broides A., Dagan R., Greenberg D., Givon-Lavi N., Leibovitz E.: Acute otitis media caused by Moraxella catarrhalis: epidemio­ logic and clinical characteristics. Clin. Infect. Dis. 49, 1641–1647 (2009) 15. Brook I.: Acute sinusitis in children. Pediatr. Clin. North. Am. 60, 409–424 (2013) 16. Brooks M.J., Sedillo J.L., Wagner N., Laurence C.A., Wang W., Attia A.S., Hansen E.J., Gray-Owen S.D.: Modular arrangement of allelic variants explains the divergence in Moraxella catarrhalis UspA protein function. Infect. Immun. 76, 5330–5340 (2008) 17. Catlin B.W.: Transfer of the organism named Neisseria catarrhalis to Branhamella gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 155–159 (1970) 18.Catlin B.W.: Branhamaceae fam. nov., a proposed family to accommodate the genera Branhamella and Moraxella. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 320–323 (1991) 19. Christensen J.J., Keiding J., Schumacher H., Bruun B.: Recognition of a new Branhamella catarrhalis/3-1actamase – BRO-3. J. Antimicrob. Chemother. 28, 774–775 (1991) 20. Collazos J., de Miguel J., Ayarza R.: Moraxella catarrhalis bacteremic pneumonia in adults: two cases and review of the literature. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11, 237–240 (1992) 21.Daoud A., Abuekteish F., Masaadeh H.: Neonatal meningitis due to Moraxella catarrhalis and review of the literature. Ann. Trop. Paediatr. 16, 199–201 (1996) 22. de Vries S.P., Bootsma H.J., Hays J.P., Hermans P.W.: Molecular aspects of Moraxella catarrhalis pathogenesis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73, 389–406 (2009) 23.Edwards K.J., Schwingel J.M., Datta A.K., Campagnari A.A.: Multiplex PCR assay that identifies the major lipooligosaccharide serotype expressed by Moraxella catarrhalis clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 43, 6139–6143 (2005) 24.Ejlertsen T., Thisted E., Ebbesen F., Olesen B., Renneberg J.: Branhamella catarrhalis in children and adults: a study of prevalence, time of colonisation, and association with upper and lower respiratory tract infections. J. Infect. 29, 23–31 (1994) 25. Enright M.C., Carter P.E., MacLean I.A., McKenzie H.: Phylo­ genetic relationships between some members of the genera Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, and Kingella based on partial 16S ribosomal DNA sequence analysis. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 387–391 (1994) 26. Faden H., Harabuchi Y., Hong J.J.: Epidemiology of Moraxella catarrhalis in children during the first two years of life: relationship to otitis media. J. Infect. Dis. 169, 1312–1317 (1994) 27. Flamm R.K., Sader H.S., Farrell D.J., Jones R.N.: Macrolide and tetracycline resistance among Moraxella catarrhalis isolates from 2009 to 2011. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 74, 198–200 (2012) 28. Forsgren A., Brant M., Karamehmedovic M., Riesbeck K.: The immunoglobulin D-binding protein MID from Moraxella catarr­ halis is also an adhesin. Infect. Immun. 71, 3302–3309 (2003) 29. Gupta N., Arora S., Kundra S.: Moraxella catarrhalis as a respiratory pathogen. Indian J. Pathol. Microbiol. 54, 769–771 (2011) 30. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P.: Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95–108 (2004) 31. Hall-Stoodley L., Kerschner J.E. i wsp.: Direct detection of bacterial biofilms on the middle-ear mucosa of children with chronic otitis media. JAMA, 296, 202–211 (2006) 32.Harmes K.M., Blackwood R.A., Burrows H.L., Cooke J.M., Harrison R.V., Passamani P.P.: Otitis media: diagnosis and treatment. Am. Fam. Physician. 88, 435–440 (2013) 33. Hays J.P. Chapter 3.3.38. The Genus Moraxella (w) The Prokaryo­ tes. red. M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.H. Schleifer, E. Stackebrandt. Springer-Verlag, New York, 2006, 6, 958–987. 34. Heiniger N., Spaniol V., Troller R., Vischer M., Aebi C.: A reser­ voir of Moraxella catarrhalis in human pharyngeal lymphoid tissue. J. Infect. Dis. 196, 1080–1087 (2007) 35. Hill D.J., Edwards A.M., Rowe H.A., Virji M.: Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (CEACAM)-binding recombinant polypeptide confers protection against infection by respiratory and urogenital pathogens. Mol. Microbiol. 55, 1515–1527 (2005) 36. Hirama T., Hagiwara K. i wsp.: HIRA-TAN: a real-time PCR-based system for the rapid identification of causative agents in pneumonia. Respir. Med. 108, 395–404 (2014) 37.Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M., Lupas A., Heesemann J.: Structure and sequence analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesins. EMBO J. 19, 5989–5999 (2000) 38. Hol C., Schalén C., Verduin C.M., Van Dijke E.E., Verhoef J., Fleer A., Van Dijk H.: Moraxella catarrhalis in acute laryngitis: infection or colonization? J. Infect. Dis. 174, 636–638 (1996). 39. Jecker P., McWilliam A., Napoli S., Holt P.G., Pabst R., West­ hofen M., Westermann J.: Acute laryngitis in the rat induced by Moraxella catarrhalis and Bordetella pertussis: number of neutrophils, dendritic cells, and T and B lymphocytes accumulating during infection in the laryngeal mucosa strongly differs in adjacent locations. Pediatr. Res. 46, 760–766 (1999) 40.JinY.: Moraxella catarrhalis meningitis: a case report. Chin. Med. J. 113, 381–382 (2000) 41. Kaur R., Czup K., Casey J.R., Pichichero M.E.: Correlation of nasopharyngeal cultures prior to and at onset of acute otitis media with middle ear fluid cultures. BMC Infect. Dis. 5, 640 (2014) 42.Karalus R., Campagnaria A.: Moraxella catarrhalis: a review of an important human mucosal pathogen. Microbes Infec. 2, 547−559 (2000) 43. Kunthalert D., Henghiranyawong K., Sistayanarain A., Khoo­ thiam K.: A single-step polymerase chain reaction for simultaneous detection and differentiation of nontypeable and serotypeable Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis and Streptococcus pneumoniae. Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 77, 275–280 (2013) 44. La Fontaine E.R., Snipes L.E., Bullard B., Brauer A.L., Sethi S., Murphy T.F.: Identification of domains of the Hag/MID surface protein recognized by systemic and mucosal antibodies in adults MORAXELLA CATARRHALIS – PATOGEN GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH with chronic obstructive pulmonary disease following clearance of Moraxella catarrhalis. Clin. Vaccine. Immunol. 16, 653–659 (2009) 45. Larsen M.V., Janner J.H., Nielsen S.D., Friis-Møller A., Ringbaek T., Lange P.: Bacteriology in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease in patients admitted to hospital. Scand. J. Infect. Dis. 41, 26–32 (2009) 46. Leach A.J., Boswell J.B., Asche V., Nienhuys T.G., Mathews J.D.: Bacterial colonization of the nasopharynx predicts very early onset and persistence of otitis media in Australian Aboriginal infants. Pediatr. Infect. Dis. J. 13, 983–989 (1994) 47.Levy F., Leman S.C., Sarubbi F.A., Walker E.S.: Nosocomial transmission clusters and risk factors in Moraxella catarrhalis. Epidemiol. Infect. 137, 581–590 (2009) 48. Liu X.T., Wang G.L., Luo X.F., Chen Y.L., Ou J.B., Huang J., Rong J.Y.: Spectrum of pathogens for community-acquired pneumonia in children. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi, abstrakt 15, 42–45 (2013) 49. Lutwick L., Fernandes L.: The Other Siblings: Respiratory Infections Caused by Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenza. Curr. Infect. Dis. Rep. 8, 215–221 (2006) 50.Maraki S., Papadakis I.S.: Antimicrobial Resistance Trends among Community-Acquired Respiratory Tract Pathogens in Greece, 2009–2012. Sci. World J. 2014, 941564. (2014) 51.Marom T., Alvarez-Fernandez P.E., Jennings K., Patel J.A., McCormick D.P., Chonmaitree T.: Acute Bacterial Sinusitis Complicating Viral Upper Respiratory Tract Infection in Young Children. Pediatr. Infect. Dis. J. 33, 803–808 (2014) 52. McGregor K., Chang B.J., Mee B.J., Riley T.V.: Moraxella catarrhalis: clinical significance, antimicrobial susceptibility and BRO betalactamases. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 17, 219–234 (1998) 53.Monso E., Ruiz J., Rosell A., Manterola J., Fiz J., Morera J., Ausina V.: Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease: a study of stable and exacerbated outpatients using the protected specimen brush. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152, 1316–1320 (1995) 54. Murphy S., Fitzgerald M., Mulcahy R., Keane C., Coakley D., Scott T.: Studies on haemagglutination and serum resistance status of strains of Moraxella catarrhalis isolated from the elderly. Gerontol. 43, 277–282 (1997) 55. Murphy T.F., Brauer A.L., Grant B.J., Sethi S.: Moraxella catarrhalis in chronic obstructive pulmonary disease: burden of disease and immune response. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 172, 195–199 (2005) 56. Murphy T.F., Parameswaran G.I.: Moraxella catarrhalis, a human respiratory tract pathogen. Clin. Infect. Dis. 49, 124–131 (2009) 57. Niedzielska G.: Ostre zapalenia ucha środkowego u dzieci. Nowa Med. 2, 113–116 (2009) 58. Okada F., Ando Y., Nakayama T., Tanoue S., Ishii R., Ono A., Watanabe M., Takaki H., Maeda T., Mori H.: Pulmonary thin-section CT findings in acute Moraxella catarrhalis pulmonary infection. Br. J. Radiol. 84, 1109–1114 (2011) 59. Olivieri I., Padula A., Armignacco L., Sabatella V., Mancino M.: Septic arthritis caused by Moraxella catarrhalis associated with infliximab treatment in a patient with undifferentiated spondarthritis. Ann. Rheum. Dis. 63, 105–106 (2004) 60. Patterson T.F., Patterson J.E., Masecar B.L., Barden G.E., Hierholzer W.J., Zervos M.J.: A nosocomial outbreak of Branhamella catarrhalis confirmed by restriction endonuclease analysis. J. Infect. Dis. 157, 996–1001 (1988) 61. Paul A.C., Varkki S., Mathews M.S., Moses P.D.: Pseudo-gono­coc­ cal ophthalmia neonatorum. Indian Pediatr. 37, 1368–1370 (2000) 62. Pearson M.M., Hansen E.J.: Identification of gene products involved in biofilm production by Moraxella catarrhalis ETSU-9 in vitro. Infect. Immun. 75, 4316–4325 (2007) 77 63.Pearson M.M., Laurence C.A., Guinn S.E., Hansen E.J.: Biofilm formation by Moraxella catarrhalis in vitro: roles of the UspA1adhesin and the Hag hemagglutinin. Infect. Immun. 74, 1588–1596 (2006) 64.Perez A.C., Pang B., King L.B., Tan L., Murrah K.A., Reimche J.L., Wren J.T., Richardson S.H., Ghandi U., Swords W.E.: Residence of Streptococcus pneumonia and Moraxella catarrhalis within polymicrobial biofilm promotes antibiotic resistance and bacterial persistence in vivo. Pathog. Dis. 70, 280–288 (2014) 65. Perez Vidakovics M.L., Riesbeck K.: Virulence mechanisms of Moraxella in the pathogenesis of infection. Curr. Opin. Infect. Dis. 22, 279–285 (2009) 66. Qin L., Masaki H., Gotoh K., Furumoto A., Terada M., Watanabe K., Watanabe H.: Molecular epidemiological study of Moraxella catarrhalis isolated from nosocomial respiratory infection patients in a community hospital in Japan. Intern. Med. 48, 797–803 (2009) 67. Revai K., McCormick D.P., Patel J., Grady J.J., Saeed K., Chonmaitree T.: Effect of pneumococcal conjugate vaccine on nasopharyngeal bacterial colonization during acute otitis media. Pediatr. 117, 1823–1829 (2006) 68.Richards S.J., Greening A.P., Enright M.C., Morgan M.G., McKenzie H.: Outbreak of Moraxella catarrhalis in a respiratory unit. Thorax. 48, 91–92 (1993) 69. Rodriguez W.J., Schwartz R.H.: Streptococcus pneumoniae causes otitis media with higher fever and more redness of tympanic membranes than Haemophilus influenzae or Moraxella catarrhalis. Pediatr. Infect. Dis. J. 18, 942–944 (1999) 70. Rotta A.T., Asmar B.I., Ballal N., Canady A.: Moraxella catarrhalis ventriculitis in a child with hydrocephalus and an external ventricular drain. Pediatr. Infect. Dis. J. 14, 397–398 (1995) 71. Rovers M.M., Glasziou P., Appelman C.L., Burke P., McCormick D.P., Damoiseaux R.A., Little P., Le Saux N., Hoes A.W.: Predictors of pain and/or fever at 3 to7 days for children with Otitis media not treated initially with antibiotics: A meta-analysis of individual patient data. Pediatr. 119, 579–585 (2007) 72.Saito R., Nonaka S., Fujinami Y., Matsuoka S., Nakajima S., Nishiyama H., Okamura N.: The frequency of BRO β-lactamase and its relationship to antimicrobial susceptibility and serum resistance in Moraxella catarrhalis. J. Infect. Chemother. 20, 6–8 (2014) 73. Sakwinska O., Bastic Schmid V., Berger B., Bruttin A., Keitel K., Lepage M., Moine D., Ngom Bru C., Brüssow H., Gervaix A.: Nasopharyngeal microbiota in healthy children and pneumonia patients. J. Clin. Microbiol. 52, 1590–1594 (2014) 74. Sano N., Matsunaga S., Akiyama T., Nakashima Y., Kusaba K., Nagasawa Z., Koizumi S., Goto M., Miyamoto H.: Moraxella catarrhalis bacteraemia associated with prosthetic vascular graft infection. J. Med. Microbiol. 59, 245–250 (2010) 75. Schale´n L., Christensen P., Kamme C., Miorner H., Pettersson K.I., Schale´n C. High isolation rate of Branhamella catarrhalis from the nasopharynx in adults with acute laryngitis. Scand. J. Infect. Dis. 12, 277–280 (1980) 76. Sethi S., Murphy T.F.: Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 359, 2355–2365 (2008) 77. Sethi S., Sethi R., Eschberger K., Lobbins P., Cai X., Grant B.J., Murphy T.F.: Airway bacterial concentrations and exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 356–361 (2007) 78.Shaikh N., Wald E.R., Jeong J.H., Kurs-Lasky M., Bowen A., Flom L.L., Hoberman A.: Predicting response to antimicrobial therapy in children with acute sinusitis. J. Pediatr. 164, 536–541 (2014) 78 KATARZYNA KRÓL-TURMIŃSKA, ALINA OLENDER 79. Sheikh S.O., Fasih N., Irfan S., Zafar A.: β-Lactamase production and antimicrobial susceptibility pattern of Moraxella catarrhalis isolates: report from Pakistan. Asian Pac. J. Trop. Med. 7, 228–231 (2014) 80.Sheikh AF., Saki N., Roointan M., Ranjbar R., Yadyad M.J., Kaydani A., Aslani S., Babaei M., Goodarzi H.: Identification of Alloiococcus otitidis, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae in Children With Otitis Media With Effusion. Jundishapur. J. Microbiol. 21, 8: e17985 (2015) 81. Singh B., Al-Jubair T., Voraganti C., Andersson T., Mukherjee O., Su Y.C., Zipfel P., Riesbeck K.: Moraxella catarrhalis binds plasminogen to evade host innate immunity. Infect Immun. DOI: 10.1128/IAI.00310-15 (2015) 82.Slevogt H., Seybold J., Tiwari K.N., Hocke A.C., Jonatat C., Dietel S., Hippenstiel S., Singer B.B., Bachmann S., Suttorp N., Opitz B.: Moraxella catarrhalis is internalized in respiratory epithelial cells by a trigger-like mechanism and initiates a TLR2and partly NOD1-dependent inflammatory immune response. Cell Microbiol. 9, 694–707 (2007) 83. Spaniol V., Heiniger N., Troller R., Aebi C.: Outer membrane protein UspA1 and lipooligosaccharide are involved in invasion of human epithelial cells by Moraxella catarrhalis. Microbes Infect. 10, 3–11 (2008) 84.Stefanou J., Agelopoulou A.V., Sipsas N.V., Smilakou N., Avlami A.: Moraxella catarrhalis endocarditis: case report and review of the literature. Scand. J. Infect. Dis. 32, 217–218 (2000) 85. Sy M.G., Robinson J.L.: Community-Acquired Moraxella catarrhalis Pneumonia in Previously Healthy Children. Pediart. Pulm. 45, 674–678 (2010) 86. Tan T.T., Nordstrom T., Forsgren A., Riesbeck K.: The respiratory pathogen Moraxella catarrhalis adheres to epithelial cells by interacting with fibronectin through ubiquitous surface proteins A1 and A2. J. Infect. Dis. 192, 1029–1038 (2005) 87.Tan T.T., Forsgren A., Riesbeck K.: The respiratory pathogen Moraxella catarrhalis binds to laminin via ubiquitous surface proteins A1 and A2. J. Infect. Dis. 194, 493–497 (2006) 88. Tan T.T., Morgelin M., Forsgren A., Riesbeck K.: Haemo­philus influenza survival during complement-mediated attacks is promoted by Moraxella catarrhalis outer membrane vesicles. J. Infect. Dis. 195, 1661–1670 (2007) 89. Tan T.T., Riesbeck K.: Current progress of adhesins as vaccine candidates for Moraxella catarrhalis. Expert. Rev. Vaccines, 6, 949–956 (2007) 90. Tanyel E., Taşdelen Fişgin N., Esen S., Darka O., Bahçivan M., Leblebicioğlu H., Tülek N.: A rare case of endocarditis due to Moraxella catarrhalis in an immunocompetent patient. Mikrobiol. Bul. 43, 667–670 (2009) 91.Verduin C.M., Kools-Sijmons M., van der Plas J., Vlooswijk J., Tromp M., van Dijk H., Banks J., Verbrugh H., van Belkum A.: Complement-resistant Moraxella catarrhalis forms a genetically distinct lineage within the species. FEMS Microbiol. Lett. 184, 1–8 (2000) 92. Verduin C.M., Hol C., Fleer A., Dijak H.J., Berkum A.V.: Moraxella catarrhalis from emerging to established pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 15, 125–144 (2002) 93. Verhaegh S.J.C., Lebon A., Saarloos J.A., Verbrugh H.A., Jaddoe V.W.V., Hofman A., Hays J.P., Moll H.A., van Belkum A.: Determinants of Moraxella catarrhalis colonization in healthy Dutch children during the first 14 months of life. Clin. Microbiol. Infect. 16, 992–997 (2010) 94.Verhaegh S.J., Snippe M.L., Levy F., Verbrugh H.A.,. Jaddoe V.W., Hofman A., Moll H.A., van Belkum A., Hays J.P.: Colonization of healthy children by Moraxella catarrhalis is characterized by genotype heterogeneity, virulence gene diversity and co-colonization with Haemophilus influenzae. Microbiol. 157, 169–178 (2011) 95.Verhaegh S.J., Streefland A., Dewnarain J.K., Farrell D.J., van Belkum A., Hays J.P.: Age-related genotypic and pheno­ typic differences in Moraxella catarrhalis isolates from children and adults presenting with respiratory disease in 2001–2002. Microbiol. 154, 1178–1184 (2008) 96.Verhaegh S.J.C., Flores A.R., van Belkum A., Musser J.M., Hays J.P.: Differential Virulence Gene Expression of Group A Streptococcus Serotype M3 in Response to Co-Culture with Moraxella catarrhalis. PLoS ONE. 8, e62549 (2013) 97.Verjano S.F., Calvo R.C., Pérez N.V.: Moraxella catarrhalis as a cause of osteomyelitis in the infant. An. Esp. Pediatr. 56, 190–191 (2002) 98. Vuononvirta J., Peltola V., Mertsola J., He Q.: Risk of repeated Moraxella catarrhalis colonization is increased in children with Toll-like receptor 4 Asp299Gly polymorphism. Pediatr. Infect. Dis. J. 32, 1185–1188 (2013) 99.Wirth T., Morelli G., Kusecek B., van Belkum A., van der Schee C., Meyer A., Achtman M.: The rise and spread of a new pathogen: seroresistant Moraxella catarrhalis. Genome Res. 17, 1647–1656 (2007) 100. Zielnik-Jurkiewicz B., Fudalej P.: Specyfika diagnostyki i leczenia zapalenia zatok w wieku rozwojowym. Terapia, 5, 28–34 (2009) MIKROBIOLOGICZNY ROZKŁAD CHLOROFENOLI W GLEBIE POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 79–90 http://www.pm.microbiology.pl Agnieszka Nowak1*, Izabela Greń1, Agnieszka Mrozik1 1 Katedra Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski, Katowice Wpłynęło w maju 2015 r. Zaakceptowano w czerwcu 2015 r. 1. Wprowadzenie. 2. Ogólna charakterystyka i toksyczność chlorofenoli. 3. Ogólne mechanizmy mikrobiologicznego rozkładu chlorofenoli w warunkach tlenowych. 4. Rozkład chlorofenoli w glebie. 5. Metody wspomagania rozkładu chlorofenoli w glebie. 5.1. Biostymulacja. 5.2. Bioaugmentacja. 5.3. „Aktywna gleba”. 6. Podsumowanie Microbial degradation of chlorophenols in soil Abstract: Chlorophenols are widely used in different branches of industry and agriculture as components of pesticides, disinfectants and wood treatment agents. They are hardly degradable and, therefore, can accumulate in the environment. One of the environment friendly methods of their removal from contaminated soil is microbial degradation. The efficiency of this process is determined by many abiotic and biotic factors. The first include the chemical structure of contaminants, their content and bioavailability as well as temperature, pH, soil texture, water content and oxygen concentration. In turn, biotic factors include the structure of microbial communities, stability and enzymatic activity of cells, their biomass, ability to chemotaxis and interactions between microorganisms. Several strategies have been developed to enhance the removal of chlorophenols from contaminated soil. The most effective in detoxifying these compounds are bioaugmentation, biostimulation and the use of “activated soil”. In this review, the influence of different factors on microbial degradation of chlorophenols in soil are described and the applicability of selected methods in their removal are discussed. 1. Introduction. 2. General characteristics and toxicity of chlorophenols. 3. General mechanisms of microbial degradation of chlorophenols in aerobic conditions. 4. Degradation of chlorophenols in soil. 5. Methods for enhancing the degradation of chlorophenols in soil. 5.1. Biostimulation. 5.2. Bioaugmentation. 5.3. “Activated soil”. 6. Summary Słowa kluczowe: chlorofenole, czynniki abiotyczne i biotyczne, metody bioremediacji Key words: chlorophenols, abiotic and biotic factors, methods of bioremediation 1. Wprowadzenie Rozwój wielu gałęzi przemysłu oraz rolnictwa nie byłby możliwy bez stosowania na szeroką skalę związków chemicznych, jak pestycydy, środki ochrony drewna, czy środki dezynfekujące. Składnikami tych substancji są między innymi chlorofenole, których powszechne stosowanie oraz długi czas rozpadu prowadzi do groźnego zjawiska kumulowania się ich w środowisku. Ekosystemy glebowe są szczególnie narażone na toksyczny wpływ chlorofenoli, a rosnąca antropopresja zwiększa poziom degradacji gleby. Z tego względu niezwykle istotne stało się poszukiwanie skutecznych metod usuwania tych związków ze środowiska, mających jednocześnie jak najmniejszy wpływ na funkcjonowanie ekosystemów [22]. Na skalę przemysłową chlorofenole uzyskuje się poprzez chlorowanie hydroksybenzenu lub hydroksylację chlorobenzenu. Monochlorofenoli używa się do produkcji tetrachlorofenoli (TeCP) i pentachlorofenolu (PCP) stosowanych do konserwacji drewna [51, 58]. W rolnictwie chlorofenole stosowane są jako składniki bakteriocydów, fungicydów, insektycydów i herbicydów [16]. Jako produkty uboczne powstają między innymi w procesie dezynfekcji wody związkami chloru oraz w trakcie wybielania pulpy drzewnej [22, 33, 70, 80]. W glebie chlorofenole mogą powstawać w wyniku chlorowania grup aromatycznych kwasów fulwowych z udziałem chloroperoksydaz w obecności nadtlenku wodoru oraz nieorganicznego chloru [2, 41, 69]. Szacuje się, że globalna produkcja chlorofenoli wynosi około 100 000 ton rocznie, w tym niżej chlorowanych fenoli 60 000 ton [96]. Z uwagi na to, że związki te są toksyczne dla organizmów żywych i kumulują się w środowisku, niezwykle istotne jest nie tylko monitorowanie ich losów, ale również podejmowanie działań zmierzających do ich detoksykacji i/lub usuwania. Działania takie podjęto między innymi w Finlandii, gdzie badano możliwość oczyszczania terenów skażonych środkami ochrony drewna, w tym szczególnie preparatem KY-5 zawierającym w swoim składzie mieszaninę różnych chlorofenoli [58, 59, 86]. W Wielkiej Brytanii monitorowano skład wody pitnej pod względem obecności chlorofenoli powstałych w procesie dezynfekcji wody [68], a we Włoszech analizowano obecność herbicydów i produktów ich transformacji w wodzie pitnej i w wodzie pochodzącej z Tybru [53]. W Rosji z kolei sprawdzano skład i toksyczność ścieków jednej z największych w kraju fabryk papieru, z której odpady odprowadzane są systematycznie do Jeziora * Autor korespondencyjny: Katedra Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Jagiellońska 28, 40-032 Katowice; tel. (32) 20 09 576; e-mail: [email protected] 80 AGNIESZKA NOWAK, IZABELA GREŃ, AGNIESZKA MROZIK Bajkał [89]. W Stanach Zjednoczonych podjęto natomiast próbę monitorowania losów chlorofenoli w glebie [44]. Niewiele wiadomo na temat skażenia chlorofenolami gleb i wód w Polsce. Nieliczne badania wskazują, że związki te mogą występować w wodzie pitnej oraz ściekach surowych i oczyszczonych. Michałowicz i wsp. [64] wykazali obecność fenolu, 4-chlorofenolu (4-CP), trichlorofenoli (TCP) i TeCP w wodzie pitnej w Łodzi i Warszawie, w stężeniach przekraczających dopuszczalną zawartość 0,1 µg l–1. Sezonowa analiza składu surowych i oczyszczonych ścieków pochodzących z Grupowej Oczyszczalni Ścieków w Łodzi w latach 1999–2000 wykazała, że latem i jesienią stężenia fenolu i 2,4,6-TCP były w nich wysokie i zawierały się odpowiednio w zakresach 2,52–3,076 µg l–1 i 1,1–1,2 µg l–1. W ściekach surowych oprócz tych związków wykryto 4-CP, 2,4-dichlorofenol (2,4-DCP), 2,4,5-TCP i TeCP w stężeniach przekraczających wartości dopuszczalne [64]. Prezentowane wyniki badań wskazują, że problem zanieczyszczenia środowiska chlorofenolami w Polsce jest poważny i wymaga opracowania skutecznych metod ich detoksykacji. 1. Ogólna charakterystyka i toksyczność chlorofenoli Chlorofenole tworzą grupę 19 związków, z których każdy składa się z pierścienia benzenu podstawionego grupą hydroksylową oraz podstawnikami chlorowymi w liczbie od 1 do 5. Związki te różnią się między sobą właściwościami fizykochemicznymi oraz toksycznoś­ cią względem organizmów żywych. Posiadają różny kolor, zapach, ich temperatura topnienia waha się od 9,3°C dla 2-chlorofenolu (2-CP) do 190°C dla PCP, natomiast temperatura wrzenia od 64°C dla 2,3,4,6TeCP do 310°C dla PCP. Chlorofenole są raczej słabo rozpuszczalne w wodzie, a ich rozpuszczalność spada wraz ze wzrostem liczby podstawników chlorowych w pierścieniu aromatycznym. Wyznacznik kwasowości (pKa) tych związków mieści się w zakresie od 4,74 dla PCP do 8,85 dla 4-CP [22, 70] (Tab. I). O toksyczności chlorofenoli decydują trzy elementy ich budowy: grupa hydroksylowa, podstawnik halogenowy oraz hydrofobowy pierścień aromatyczny. Obecność grupy hydroksylowej zmniejsza hydrofobowość związku z jednoczesnym wzrostem jego reaktywności. Silnie elektroujemny atom chloru przyciąga elektrony typu π z pierścienia benzenu, stabilizując jego strukturę. Powoduje to wzrost zarówno hydrofobowości, jak i kwasowości związku. Liczba oraz pozycja podstawników chlorowych wpływają na wartości pKa i współczynnika podziału danego związku w układzie oktanol-woda (logP). Wraz ze wzrostem stopnia chlorowania fenolu maleje pKa, a logP – rośnie. Za najbardziej toksyczne uważa się związki, których wartość logP mieści się w przedziale od 1 do 5 [37, 66, 77]. Wartości logP dla chlorofenoli rosną wraz ze wzrostem stopnia uchlorowania fenolu i dla monochlorofenoli miesz- Tabela I Właściwości fizykochemiczne oraz toksyczność wybranych chlorofenoli Właściwości związku Masa molowa, g mol 2-CP 4-CP 2,4-DCP 2,4,5-TCP 2,3,4,6-TeCP PCP Źródło 128,55128,55 163,00197,45 231,89 266,34 [22] –1 Gęstość (20°C), g ml–1 1,26 1,22 1,38 1,68 1,83 1,99 Rozp. w H2O (20°C), g l 28,5 27,0 4,5 0,95 0,183 0,014 –1 [70] [22, 70] Temp. topnienia, °C 7 41–44 45 67 70 190 [70] Temp. wrzenia, °C 220 300 [22, 70] 174 210 235 150 Kwasowość, pKa 8,49 8,85 7,68 7,43 5,38 4,74 [70] logP 2,17 2,35 3,20 3,72 4,45 5,01 [70] Badane mikroorganizmy Toksyczność, EC50 (mg l–1) Burkholderia sp. RASC c2 28,3 23,1 11,1 1,2 – – [13] Pseudomonas fluorescens [13] 122,1 12,2 14,7 11,3 – – P. putida DOT-T1E – 102,8 55,4 7,9 – – [20] Vibrio harveyi 151,4 – – 1,9 – 3,2 [76] V. fischeri 158,5 – – 4,5 – 1,2–3,9 [76] Rhodoccocus erythropolis – – – – – 2,8–3,1 [95] Aspergillus niger – – – – – 0,8–1,0 [95] Selenastrum capricornutum – – – – 0,07 0,091 [85] Scendesmus spinosus – – – – – 0,056 [85] Chlamydomonas sp. – – – – – 4,35 [85] – brak danych MIKROBIOLOGICZNY ROZKŁAD CHLOROFENOLI W GLEBIE czą się w zakresie 2,17–2,50, a dla PCP wartość logP wynosi 5,01 (Tab. I). Wskazuje to na większą toksyczność związków wyżej chlorowanych w porównaniu do monochlorofenoli i fenolu [63, 70]. Badania zależ­ności pozycji podstawników chlorowych w pierścieniu aromatycznym a stopniem toksyczności chlorofenoli wskazują, że izomery chlorofenoli podstawione atomami chloru w pozycjach 3 i 5 pierścienia aromatycznego są bardziej toksyczne niż izomery podstawione w pozycjach 2 i 6 [22, 82]. Ze względu na silne działanie toksyczne, niejednokrotnie kancerogenne i teratogenne, chlorofenole w państwach Unii Europejskiej oraz w Stanach Zjednoczonych znalazły się na listach substancji niebezpiecznych i priorytetowych, których stosowanie powinno być stopniowo ograniczane, a obecność w środowisku stale monitorowana [21, 22, 43]. 2.Mikrobiologiczny rozkład chlorofenoli w warunkach tlenowych Toksyczność chlorofenoli oraz groźba skażenia nimi środowiska wymuszają konieczność opracowania skutecznych metod ich detoksykacji. Jednym ze sposo- 81 bów eliminacji tych związków jest mikrobiologiczna degradacja. Polega ona na mineralizacji chlorofenoli z jednoczesnym wydzieleniem chloru nieorganicznego. W zależności od stopnia uchlorowania chlorofenoli wyróżnia się dwie główne drogi ich przemian. Monoi dichlorofenole w początkowym etapie degradacji utleniane są przez monooksygenazy do chlorokatecholi, których pierścień aromatyczny ulega intradiolowemu lub ekstradiolowemu rozszczepieniu. Rozszczepienie intradiolowe (szlak orto) katalizuje 1,2-dioksygenaza katecholowa, a rozszczepienie ekstradiolowe (szlak meta) zachodzi z udziałem 2,3-dioksygenazy katecholowej [2, 9, 38]. Powstały w wyniku rozszczepienia pierścienia łańcuch alifatyczny ulega dalszym przemianom do intermediatów szlaków metabolizmu podstawowego komórki (Rys. 1A). Znanymi z literatury szczepami bakterii zdolnymi do degradacji mono- lub/i dichlorofenoli są na przykład Alcaligenes sp. OS2 [28], Arthro­ bacter chlorophenolicus A6 [81], Bacillus subtilis OS1 [28], Comamonas testosteroni JH5 [42], Pseudomonas putida NCIM sp. 2650 [11], Rhodococcus opacus 1CP [48] i Sphingomonas sp. [35]. Polichlorofenole we wstępnym etapie rozkładu hydroksylowane są w pozycji para. W wyniku tej reakcji Rys. 1. Mikrobiologiczny rozkład monochlorofenoli (A) oraz polichlorofenoli (B) w warunkach tlenowych [17, 100] 82 AGNIESZKA NOWAK, IZABELA GREŃ, AGNIESZKA MROZIK powstaje intermediat chinonowy, ulegający kolejnym etapom dechlorynacji. W zależności od rodzaju aktywnej 1,2-dioksygenazy w komórkach bakterii, roz­szcze­ pie­­niu ulegają pierścienie aromatyczne chloro­tri­hydro­ ksybenzenów lub 2,6-dichloro-1,4-dihydro­ksy­benzenu z jednoczesnym usunięciem atomu chloru [7, 17, 23]. Produktami rozszczepienia są maleilooctan lub chloro­ maleilooctan, metabolizowane następnie do 3-oksoady­ pinianu włączanego do cyklu Krebsa (Rys. 1B). Znanymi szczepami bakterii rozkładającymi polichlorofenole są: Sphingobium chlorophenolicum ATCC 39723 [23], Burkholderia cepacia AC1100 [93], Cupriavidus necator JMP134 [83] i Saccharomonospora viridis [98]. Odrębną grupę drobnoustrojów zdolnych do rozkładu chlorofenoli stanowią grzyby białej zgnilizny. Wytwarzają one zewnątrzkomórkowe enzymy ligninolityczne, które dzięki niskiej specyficzności substratowej oraz silnym właściwościom utleniającym umożliwiają degradację wielu związków strukturalnie podobnych do lignin, w tym chlorowanych fenoli. Enzymy te katalizują reakcje odszczepienia protonu od grupy hydroksylowej, co prowadzi do powstania rodników fenoksylowych, będących substratami dla reakcji nieenzymatycznych. Do najważniejszych enzymów ligninolitycznych należą: peroksydaza ligninowa, mangano-zależna peroksydaza i lakaza [61, 79] produkowane przez grzyby Phanerochaete chrysosporium [94], Trametes versicolor [25], Penicillium camemberti [91], czy Cerrena unicolor [34]. Mechanizmy degradacji chlorofenoli przez mikroorganizmy, enzymy uczestniczące w przemianach tych związków oraz kontrola genetyczna tych procesów są dobrze zbadane i opisane w literaturze [88, 90, 92, 100]. 3. Rozkład chlorofenoli w glebie Chlorofenole uwalniane do środowiska trudno podlegają biodegradacji i kumulują się w glebie. Do skażenia tymi związkami dochodzi najczęściej na terenach rolniczych, w okolicach zakładów przetwórstwa drewna, chemicznych i farmaceutycznych [22, 53, 64, 80]. Obecność chlorofenoli wpływa niekorzystnie na bioróżnorodność środowiska glebowego, dlatego istotne jest opracowanie metod skutecznego usuwania tych zanieczyszczeń. Na zakres i intensywność biodegradacji chlorofenoli w glebie wpływa szereg czynników abiotycznych i biotycznych. Do czynników abiotycznych należą: właściwości fizykochemiczne zanieczyszczeń i ich dostępność dla mikroorganizmów, zawartość i skład materii organicznej, odczyn pH, temperatura, wilgotność, tekstura gleby oraz dostępność tlenu. Do czynników biotycznych zalicza się natomiast skład i strukturę mikroflory gleby oraz wzajemne interakcje między mikroorganizmami, jak na przykład konkurencję o źródło węgla, czy symbiozę [4, 12, 14, 62]. Głównym czynnikiem abiotycznym decydującym o skuteczności usuwania chlorofenoli z gleby jest ich biodostępność dla zasiedlających glebę mikroorganizmów. Biodostępność związku definiowana jest jako stężenie zanieczyszczenia znajdującego się w stanie wolnym, które może zostać pobrane przez organizm lub zaadsorbowane na jego powierzchni w jednostce czasu. W środowisku glebowym o biodostępności zanieczyszczeń dla mikroorganizmów, w tym chlorofenoli, decydują procesy fizykochemiczne, fizjologiczne i toksykologiczne obserwowane jako interakcje zachodzące pomiędzy glebą, zanieczyszczeniem i drobno­ ustrojami [8, 31, 55, 87]. Na podstawie badań tych zależności wyróżniono trzy rodzaje biodostępności: chemiczną, biologiczną i toksykologiczną [57]. Biodostępność chemiczna determinowana jest przez fizykochemiczne właściwości zanieczyszczenia, takie jak: jego hydrofobowość, stereochemia, rozpuszczalność w wodzie, zdolność do adsorpcji/desorpcji na cząstkach stałych i kwasowość związku oraz właściwości gleby, jak: kationowa pojemność wymienna, pH, zawartość materii organicznej oraz iłów. O biodostępności biologicznej decydują właściwości mikroorganizmu, jak jego morfologia, w tym stosunek powierzchni komórki do objętości, struktura osłon komórkowych oraz faza rozwoju. Z kolei wewnątrzkomórkowe procesy, jak pobieranie i wydalanie, metabolizm, detoksykacja oraz magazynowanie substancji wpływają na biodostępność toksykologiczną. Dodatkowo na procesy te istotny wpływ ma czas zalegania zanieczyszczeń w glebie oraz czas ekspozycji mikroorganizmów na działanie zanieczyszczenia. Czynniki wpływające na biodostępność zanieczyszczeń w glebie oraz ich wzajemne interakcje przedstawia rys. 2. Losy chlorofenoli w glebie w zależności od tych czynników są różne. Mogą one ulegać degradacji, bioakumulacji, sekwestracji, ługowaniu lub parowaniu z gleby [57, 84]. Innym czynnikiem abiotycznym wpływającym na procesy degradacji chlorofenoli przez mikroorganizmy w glebie jest zawartość w niej wody. W glebach suchych sorpcja chlorofenoli do cząstek gleby jest silniejsza w porównaniu z glebami wilgotnymi, co ogranicza ich biodostępność dla mikroorganizmów glebowych [50]. Z badań Cho i wsp. [19] zależności szybkości degradacji 4-CP, 2,4,6-TCP oraz PCP przez rodzimą mikroflorę gleby wynika, że degradacja chlorofenoli zachodziła najszybciej (12 mg kg–1 dzień–1) w glebie o zawartości wody 10–15%, natomiast najwolniej w glebie o zawartości wody 25% (5 mg kg–1 dzień–1). Niższy poziom wilgotności zapewniał swobodną dyfuzję tlenu atmosferycznego do przestrzeni między cząstkami gleby. Przy zawartości wody 25% gleba tworzyła agregaty, do wnętrza których dostęp tlenu był ograniczony. Wzrost wilgotności gleby do 30–40% powodował wzrost szybkości degradacji chlorofenoli do 8 mg kg–1 dzień–1, co mogło MIKROBIOLOGICZNY ROZKŁAD CHLOROFENOLI W GLEBIE 83 Rys. 2. Czynniki wpływające na biodostępność zanieczyszczeń w glebie [31, zmodyfikowany] być wynikiem wykorzystania przez mikroorganizmy tlenu rozpuszczonego w roztworze glebowym. Biodostępność chlorofenoli w glebie zależy w dużej mierze od ich rozpuszczalności w wodzie. Większość drobnoustrojów pobiera związki rozpuszczone w fazie wodnej, a tylko nieliczne zdolne są do degradacji zanieczyszczeń zaadsorbowanych na powierzchni cząstek glebowych [67, 74]. Polaryzacja cząsteczek chlorofenoli, dzięki obecności grupy hydroksylowej, umożliwia ich rozdział do fazy organicznej i wodnej gleby. Jednocześ­ nie rozdział ten zmienia się w zależności od wartości logP dla danego związku oraz zależy od liczby podstawników chlorowych w pierścieniu aromatycznym. Związki o logP w zakresie 3–4, do których należą di-, tri- i tetrachlorofenole, pobierane są głównie z fazy wodnej gleby, natomiast PCP, dla którego wartość logP jest wyższa (5,01) pobierany jest głównie z powierzchni cząstek stałych [22, 27, 39]. O biodostępności chlorofenoli w glebie decyduje także zawartość w niej materii organicznej. Związki o różnorodnych grupach funkcyjnych tworzące materię organiczną wiążą zanieczyszczenia poprzez słabe oddziaływania van der Waalsa, wiązania hydrofobowe i wodorowe lub silne wiązania kowalencyjne. Silne związanie zanieczyszczeń z materią organiczną ogranicza ich biodostępność [72, 75, 84]. Chlorofenole w zależności od liczby podstawników chlorowych wiążą się z cząstkami gleby na dwa sposoby. Monochlorofenole, podobnie jak fenol, biorą udział w reakcjach sprzęgania utleniającego w obecności tlenków metali obecnych na powierzchni cząstek gleby, natomiast tri-, tetrachlorofenole i PCP ze względu na silnie hydrofobowy charakter i niską rozpuszczalność w wodzie wiążą się z fazą stałą gleby oddziaływaniami hydrofobowymi [10]. Bezpośrednio z roztworu glebowego związki te są łatwo sorbowane na powierzchni cząstek gleby. Proces ten zachodzi szybko i jest odwracalny w odróżnieniu od sekwestracji, czyli powolnej dyfuzji i sorpcji zanieczyszczeń we wnętrzu porów lub cząstek gleby. Związane w ten sposób substancje stają się odporne na ekstrakcję i niedostępne dla mikroorganizmów. Sekwestracja związków jest tym silniejsza im zanieczyszczenia mają bardziej hydrofobowy charakter, dlatego procesowi temu silniej ulegają chlorofenole o większej liczbie podstawników chlorowych [1, 30, 71]. W wyniku dyfuzji zanieczyszczeń do wnętrza cząstek gleby dochodzi do ich związania głównie z fazą amorficzną materii organicznej [1, 67]. Różne sposoby wiązania związków organicznych z glebą ilustruje rys. 3. Substancje zawarte w materii organicznej mogą stanowić źródło węgla i energii dla mikroorganizmów i wspomagać procesy rozkładu zanieczyszczeń [12, 65]. Pozytywną korelację pomiędzy zawartością materii organicznej a szybkością rozkładu PCP w glebie przez jej rodzimą mikroflorę wykazali Kuwatsuka i Igarashi [52]. Na podstawie badań degradacyjnych w 10 różnych rodzajach gleb o zawartości materii organicznej w zakresie od 0,04% do 7,87% stwierdzili, że PCP w stężeniu 0,1 mg g–1 wprowadzony do gleby o zawartości materii organicznej 7,87% został całkowicie rozłożony po 50 dniach, podczas gdy w glebie o zawartości materii organicznej wynoszącej 0,04% w tym samym czasie nie stwierdzono jego ubytku. O skuteczności biologicznego oczyszczania gleby z chlorofenoli decyduje także jej tekstura. Skład granu­ lometryczny, czyli udział piasku, gliny i iłów w glebie 84 AGNIESZKA NOWAK, IZABELA GREŃ, AGNIESZKA MROZIK Rys. 3. Sposoby wiązania związków organicznych w glebie i jego biologiczne konsekwencje [67, zmodyfikowany] determinuje wielkość porów, w których możliwe jest wiązanie zanieczyszczeń. Gleby piaszczyste charakteryzuje niska pojemność wodna oraz niewielka porowatość, dlatego zanieczyszczenia są z nich szybko wypłukiwane. Ograniczenie szybkości degradacji zanieczyszczeń w glebach piaszczystych na ogół nie jest związane z biodostępnością tych związków, ale z niewielką zawartością w nich materii organicznej i substancji odżywczych, które mogą stanowić dla mikroorganiz­ mów dodatkowe źródła węgla i energii. Gleby gliniaste o wysokiej pojemności wodnej wykazują silne właściwości sorpcyjne, co ogranicza biodostępność zanieczyszczeń [56]. Z badań Cho i wsp. [19] wynika, że biodegradacja chlorofenoli w glebie gliniastej zachodziła wolniej niż w glebie piaszczystej z powodu silniejszej sorpcji zanieczyszczeń oraz ograniczonej dyfuzji tlenu do wnętrza agregatów gleby. Wielkość porów wpływa również na sekwestrację zanieczyszczeń. Przyjmuje się, że przemieszczanie związków chemicznych do wnętrza mikroporów gleby o średnicy mniejszej niż 20 nm powoduje zmniejszenie ich biodostępności, ponieważ uniemożliwia penetrację bakterii, grzybów, zwierząt oraz korzeni roślin do ich wnętrza [1]. Sorpcja związków organicznych do cząstek gleby jest uzależniona od stopnia zdysocjowania grup funkcyjnych, czyli pH środowiska. Sorpcja TeCP i PCP jest silniejsza od siły wiązania tri-, di- i monochlorofenoli, co wynika z większej hydrofobowości związków wyżej chlorowanych [78]. Odczyn środowiska ma również wpływ na aktywność mikroorganizmów. Biodegradacja chlorofenoli zachodzi najintensywniej w glebie o pH od 5,6 do 8,0 [56]. Potwierdzają to badania Cho i wsp. [19], którzy wykazali większy ubytek 4-CP, 2,4,6-TCP oraz PCP w glebie o pH 7,0 w porównaniu z glebami o pH 5,0 i 9,0. Fulthrope i Schofield [32] również stwierdzili większy ubytek PCP w glebie o pH 7,9 w porównaniu z glebą o pH 5,9. W glebach kwaśnych PCP w stężeniu 50 μg g–1 gleby w ciągu 60 dni uległ degradacji w 15%, a w glebie o odczynie słabo zasadowym – w 40%. Ważnym czynnikiem abiotycznym w rozkładzie zanieczyszczeń w glebie jest także temperatura, która wpływa na rozpuszczalność, lepkość, sorpcję i parowanie związków chemicznych oraz na aktywność mikroflory. Większość mikroorganizmów degraduje chlorofenole w zakresie temperatur od 24 do 37°C [19, 56], choć znane są również szczepy zdolne do rozkładu chlorowych pochodnych fenolu w niższych temperaturach. Przykładem jest Arthrobacter chlorophenolicus A6, zdolny do degradacji 4-CP w stężeniu 180 µg g–1 gleby zarówno w temperaturze 28°C, jak i w 5°C. Szczepy zdolne do degradacji zanieczyszczeń w szerokim zakresie temperatur są szczególnie przydatne w oczyszczaniu terenów znajdujących się w pasie klimatu umiarkowanego, gdzie temperatura zmienia się w cyklu rocznym od temperatur ujemnych zimą, do ponad 30°C latem [3, 49]. Jednym z najistotniejszych czynników biotycznych, decydujących o eliminacji zanieczyszczeń z gleby jest skład i struktura zasiedlających ją zespołów mikro­or­ ganizmów. Poza bioróżnorodnością mikroorganiz­mów zaangażowanych w procesy degradacyjne, niezwykle ważne są również interakcje między nimi, stabilność i aktywność enzymatyczna komórek, ich biomasa oraz zdolność do chemotaksji. Niektóre związki aromatyczne, w tym chlorofenole, są szybciej rozkładane przez mikroorganizmy glebowe w obecności innych związków. Zjawisko to znane jest pod nazwą kometabolizmu [40]. Rozkład chlorofenoli w glebie zależy także od wcześ­ niejszej ekspozycji mikroorganizmów na działanie tych związków. Wynika to z adaptacji bakterii do obec­ ności toksycznych związków i zwiększenia ich udziału w zespołach mikroorganizmów zasiedlających skażone środowisko. Potwierdzają to badania Männistö i wsp. [60], którzy z gleby przez ponad 50 lat zanieczyszczanej środkami ochrony drewna wyizolowali 102 szczepy MIKROBIOLOGICZNY ROZKŁAD CHLOROFENOLI W GLEBIE 85 bakterii, zdolne do wzrostu w obecności 2,3,4,6-TeCP i/lub PCP. Wśród nich były zarówno bakterie Gram-ujemne, głównie z grupy Proteobacteria, oraz bakterie Gram-dodatnie z grupy Actinobacteria. Dla porównania Caliz i wsp. [15] z gleby poddanej krótkotrwałej ekspozycji na działanie 2-CP, 2,4,6-TCP oraz PCP w zakresie stężeń od 0,1 mg do 5 g kg–1 gleby wyizolowali 23 szczepy zdolne do rozkładu tych związków. Spośród nich największym potencjałem degradacyjnym i najlepszą przeżywalnością odznaczały się 4 szczepy, oznaczone na podstawie analizy fragmentów 16S rRNA do 3 gatunków: Kocuria palustris, Lysobacter gummosus, Pseudomonas putida i 1 rodzaju Bacillus. O skuteczności rozkładu chlorofenoli w glebie decyduje również szereg interakcji pomiędzy mikroorganiz­ mami, jak również między mikroorganizmami a organizmami eukariotycznymi występującymi w glebie, jak pierwotniaki, pierścienice, czy nicienie. Oddziaływania te mogą mieć charakter konkurencji o źródło węgla czy przestrzeń życiową, drapieżnictwa, symbiozy, komensalizmu i protokooperacji [26, 97]. aby stosunek C:N:P wynosił 100:10:1 lub 100:5:1 [47, 62]. Zwiększenie dostępności tlenu zapewnia z kolei dodawanie do gleby na przykład trocin w stosunku 1:1 [47]. Oprócz regulacji stosunku C:N:P w glebie, biostymulacja może być również przeprowadzana z użyciem związków stanowiących donory lub akceptory elektronów. Stymulację beztlenowej biotransformacji PCP przez mikroflorę autochtoniczną po wprowadzeniu mleczanu i/lub antrachinono-2,6-disulfonianu do gleby bogatej w żelazo stwierdzili Chen i wsp. [18]. Mleczan służył jako donor elektronów, natomiast antrachinono-2,6-disulfonian stanowił ich przekaźnik, który umożliwiał sprzęganie redukcji tlenków żelaza z dechlorynacją PCP. Wykazano, że jednoczesne wprowadzenie do gleby tych związków zwiększyło tempo biotransformacji PCP. Dodatkowo na podstawie analizy polimorfizmu dłu­gości terminalnych fragmentów restrykcyjnych (T-RFLP) w zespołach mikroorganizmów badanej gleby stwierdzono wzrost udziału bakterii redukujących żelazo oraz przeprowadzających dechlorynację związków organicznych, głównie z rodzaju Clostridium. 4. Metody wspomagania rozkładu chlorofenoli w glebie 4.2. Bioaugmentacja Jedną ze strategii umożliwiających likwidację niebezpiecznych zanieczyszczeń w skażonej glebie jest bioremediacja. Wykorzystuje ona naturalne zdolności mikroorganizmów do całkowitej degradacji konkretnych zanieczyszczeń lub ich transformacji w formy mniej szkodliwe. Intensyfikację rozkładu toksycznych związków uzyskuje się w procesach stymulacji czynnikami fizykochemicznymi lub biologicznymi. Z danych literaturowych wynika, że najczęściej stosowanymi technikami do zwiększania efektywności usuwania chlorofenoli z gleby są: biostymulacja, bioaugmentacja oraz użycie tzw. „aktywnej gleby”. 4.1. Biostymulacja Wolne tempo procesów oczyszczania gleby z toksycznych zanieczyszczeń może być związane z pogorszeniem się warunków wzrostu mikroorganizmów, na przykład deficytem tlenowym, czy zmianą stosunku zawartości węgla do azotu. Biostymulacja, polegająca na dodaniu do gleby związków odżywczych w celu optymalizacji stosunku C:N:P i zwiększenia dostępności donorów/akceptorów elektronów, pozwala intensyfikować procesy degradacji zanieczyszczeń. Jako dodatkowe źródła azotu stosowane są mocznik, metylenomocznik lub azotan (V) amonu, a jako dodatkowe źródło fosforu wprowadzana jest mieszanina soli kwasu ortofosforowego (V). Związki dodawane są w takich stężeniach, W miejscach skażonych związkami o strukturze aromatycznej, gdzie liczebność mikroorganizmów autochtonicznych degradujących określone zanieczyszczenia jest zbyt mała stosuje się bioaugmentację. Polega ona na wprowadzaniu do gleby wyselekcjonowanych szczepów mikroorganizmów zdolnych do degradacji konkretnych zanieczyszczeń. Stosowane w tym celu szczepy powinny charakteryzować się zdolnością do degradacji zanie­ czysz­czeń w krótkim czasie, odpornością na zmiany środowiska (pH, czy siły jonowej), krótkim czasem życia, zdolnością do chemotaksji i adhezji do cząstek gleby [97]. Mikroorganizmy można wprowadzać do gleby w postaci pojedynczych, czystych szczepów lub konsorcjów złożonych z wielu ich gatunków. Przykłady mikroorganizmów użytych w bioaugmentacji terenów skażonych wybranymi chlorofenolami ilustruje Tabela II. Pomyślnie zakończoną bioaugmentację gleby skażonej PCP w stężeniu 100 µg g–1 gleby z użyciem szczepu Sphingobium chlorophenolicum przeprowadzili Dams i wsp. [24]. Wykazali, że w glebie bioaugmentowanej tymi bakteriami w ciągu 2 tygodni ubyło około 80% wprowadzonej dawki PCP, podczas gdy w glebie niebioaugmentowanej – około 40%. W innych badaniach Backman i Jansson [3] potwierdzili przydatność szczepu Arthrobacter chlorophenolicus A6 w oczyszczaniu gleby skażonej 4-CP, w temperaturach 28°C i 5°C. Stwierdzili, że szczep ten rozkładał 4-CP w stężeniu 180 µg g–1 w obu temperaturach w tym samym czasie, natomiast liczebność bakterii była większa w niższej temperaturze. Podobnie Briglia i wsp. [14] wykazali, 86 AGNIESZKA NOWAK, IZABELA GREŃ, AGNIESZKA MROZIK Tabela II Mikroorganizmy użyte w bioaugmentacji gleb skażonych chlorofenolami Mikroorganizmy Chlorofenole Lokalizacja Źródło Pseudomonas putida 2-CP Tonara, Włochy [54] Alcaligenes xylosooxidans 2-CP Tonara, Włochy [54] A. faecalis 2-CP Tonara, Włochy [54] Arthrobacter chlorophenolicus A6L 4-CP Uppsala, Szwecja [46] A. chlorophenolicus sp. nov. 4-CP Ford Collins, USA [99] Arthrobacter sp. 4-CP Uppsala, Szwecja [45] Ralstonia eutrophica TCP 2-CP, 3-CP, 4-CP Rhodococcus chlorophenolicus PCP-1 PCP Cavenago, Włochy [4] Suomusjärvi, Finlandia [14] Flavobacterium sp. PCP Suomusjärvi, Finlandia [14] Sphingomonas chlorophenolica ATCC 53874 PCP Arecibo, Portoryko [62] S. chlorophenolica ATCC 33790 PCP Arecibo, Portoryko [62] Sphingobium chlorophenolicum PCP Boyndie, Wielka Brytania [24] że w glebie inokulowanej szczepem Rhodococcus chlorophenolicus rozkład PCP przebiegał intensywniej niż w glebie kontrolnej. Porównanie skuteczności oczyszczania gleby skażonej PCP metodami bioaugmentacji z wykorzystaniem konsorcjum bakterii Gram-ujemnych wyizolowanych z gleby z okolic kompleksu petrochemicznego w Puerto Rico, bioaugmentacji z użyciem szczepów Sphingomonas chlorophenolica ATCC 53874 i ATCC 33790 znanych ze zdolności do rozkładu PCP oraz biostymulacji przeprowadzili Massol-Deyá i wsp. [62]. Spośród tych metod najbardziej efektywna w usuwaniu PCP z gleby okazała się bioaugmentacja z użyciem obu szczepów S. chlorophenolica. W glebie tej całkowity rozkład PCP w stężeniu 250 mg kg–1 gleby trwał 10 dni. Dla porównania w glebie inokulowanej konsorcjum bakterii ubytek PCP w tym czasie wynosił 24% wyjściowej dawki, a w glebie poddanej biostymulacji – 40% (Rys. 4). Rys. 4. Porównanie efektywności usuwania PCP (250 mg kg–1) z gleby poddanej bioaugmentacji z użyciem konsorcjum bakterii (A), z użyciem szczepów Sphingomonas chlorophenolica ATCC 53874 i ATCC 33790 (B) oraz biostymulacji (C) [62] (Objaśnienia w tekście) Z licznych prac wynika, że wzrost przeżywalności bakterii po introdukcji do gleby można osiągnąć poprzez unieruchomienie komórek na powierzchni lub we wnętrzu odpowiedniego nośnika. Zabieg ten stosuje się, gdy liczebność inokulantów po wprowadzeniu do gleby drastycznie maleje i obniża się ich aktywność enzymatyczna. Ochronny wpływ włókien polikaproamidu na wzrost i aktywność komórek Streptomyces rochei 303 stwierdzili Golovleva i wsp. [36] w badaniach ich zdolności do rozkładu 2,4,6-TCP. Bakterie unieruchomione w tym nośniku rozkładały 2,4,6-TCP w stężeniu 1000 mg l–1, podczas gdy komórki wolne rozkładały 2,5-krotnie niższe stężenie tego związku. W innych badaniach Balfanz i Rehm [5] wykazali, że immobilizowany szczep Alcaligenes sp. A 7–2 w granulacie z gliny i wprowadzony do przepływowego bio­ reaktora wypełnionego piaszczystą glebą skażoną 4-CP w stężeniu 40 mg l–1 degradował 6 dawek 4-CP w ciągu 36 godzin, podczas gdy komórki wolne rozkładały w podobnym czasie 3 dawki tego związku. Do śledzenia losów bakterii introdukowanych do skażonej gleby wykorzystuje się często geny markerowe, na przykład geny białka zielonej fluorescencji (gfp) czy geny lucyferazy (luc). Elväng i wsp. [29] monitorowali w ten sposób liczebność dwóch mutantów Arthrobacter chlorophenolicus A6 z wprowadzonymi genami odpowiednio gfp i luc w glebie skażonej 4-CP w stężeniu 175 µg g–1 gleby. Stwierdzili, że oba mutanty były zdolne do rozkładu tej dawki 4-CP w ciągu 8–10 dni oraz że liczba bakterii z genem gfp była większa zarówno od liczby bakterii z genem luc jak i od liczby komórek oznaczonych tradycyjną metodą płytkową. Na tej podstawie stwierdzili, że spadek fluorescencji próby oraz spadek liczby kolonii na płytkach z agarem odżywczym były wynikiem mniejszej aktywności metabolicznej mikroorganizmów, a nie ich liczebności. MIKROBIOLOGICZNY ROZKŁAD CHLOROFENOLI W GLEBIE 4.3. „Aktywna gleba” Inną skuteczną metodą zwiększania efektywności usuwania chlorofenoli z gleby jest mieszanie skażonej gleby z tak zwaną „aktywną glebą”, zawierającą mikroorganizmy eksponowane przez długi okres czasu na działanie określonego typu zanieczyszczeń. Potwierdzają to wyniki Barbeau i wsp. [6], którzy w badaniach wykorzystali dwie gleby, pochodzące ze składowiska odpadów i z tartaku w Kanadzie. Mikroflora gleby ze składowiska odpadów była zdolna do degradacji PCP w zakresie stężeń od 50 do 300 mg l–1, natomiast mikroflora gleby z tartaku nie rozkładała tego związku. Po zmieszaniu obu gleb osiągnięto prawie 100% eliminację PCP o wyjściowym stężeniu 400 mg kg–1 w ciągu 130 dni. Podobnie Otte i wsp. [73] po zmieszaniu zawiesiny glebowej zawierającej mikroorganizmy zdolne do rozkładu PCP w stężeniu 700 mg l–1 w ciągu doby z glebą skażoną PCP w stężeniu 50 mg kg–1 gleby stwierdzili rozkład tego związku w 50% w ciągu 36 godzin, podczas gdy w glebie kontrolnej rozkład PCP nie zachodził. 5. Podsumowanie Zanieczyszczenie gleby chlorofenolami stanowi poważny problem ekologiczny, wymagający nie tylko monitorowania ich losów w środowisku, ale również opracowania skutecznych metod ich detoksykacji. Jednym z przyjaznych środowisku rozwiązań jest ich rozkład mikrobiologiczny, a dobrymi praktykami w zwiększaniu tempa ich degradacji czy biotransformacji wydają się być różne techniki bioremediacji, jak bioaugmentacja, biostymulacja i stosowanie „aktywnej gleby. Kluczowe znaczenie w intensyfikacji procesów usuwania chlorofenoli z gleby ma dokładne poznanie mechanizmów regulujących aktywność degradacyjną mikroorganizmów poprzez ocenę wpływu czynników środowiskowych na te procesy i zbadanie wzajemnych interakcji między mikroorganizmami w zależności od rodzaju skażenia czy wprowadzonych inokulantów. Znajomość takich zagadnień jest niezbędna do opracowania procedur oceny ryzyka ekologicznego, które powinny być uwzględnione w przepisach prawnych dotyczących ochrony gleb, a których nadal brak w regulacjach Unii Europejskiej. Podziękowania Artykuł powstał w ramach projektu badawczego ze środków przyznanych przez Narodowe Centrum Nauki (nr N N305 061640). Piśmiennictwo 1. Alexander M.: How toxic are toxic chemicals in soil? Environ. Sci. Technol. 29, 2713–2717 (1995) 87 2. Arora P.K., Bae H.: Bacterial degradation of chlorophenols and their derivatives. Microb. Cell Fact. 13, 31 (2014) 3.Backman A., Jansson J.K.: Degradation of 4-chlorophenol at low temperature and during extreme temperature fluctuations by Arthrobacter chlorophenolicus A6. Microb. Ecol. 48, 246–253 (2004) 4.Baggi G., Cavalca L., Francia P., Zangrossi M.: Chlorophenol removal from soil suspensions: effects of a specialized microbial inoculum and a degradable analogue. Biodegradation, 15, 153–160 (2004) 5.Balfanz J., Rehm H.J.: Biodegradation of 4-chlorophenol by adsorptive immobilized Alcaligenss sp. A 7–2 in soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 662–668 (1991) 6. Barbeau C., Deschênes L., Karamanev D., Comeau Y., Samson R.: Bioremediation of pentachlorophenol-contaminated soil by bioaugmentation using activated soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, 745–752 (1997) 7. Belchik S.M., Xun L.: Functions of flavin reductase and quinone reductase in 2,4,6-trichlorophenol degradation by Cupriavidus necator JMP134. J. Bacteriol. 190, 1615–1619 (2008) 8. Belfroid A.C., Sijm D.T.H.M., van Gestel C.A.M.: Bioavailability and toxicokinetics of hydrophobic aromatic compounds in benthic and terrestrial invertebrates. Environ. Rev. 4, 276–299 (1996) 9.Bestetti G., Galli E., Leoni B., Pelizzoni F., Sello G.: Regioselective hydroxylation of chlorobenzene and chlorophenols by a Pseudomonas putida. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 260–263 (1992) 10. Bhandari A., Novak J.T., Burgos W.D., Berry D.F.: Irreversible binding of chlorophenols to soil and its impact on bioavailability. J. Environ. Eng. 123, 506–516 (1997) 11.Bhatkal A., Punage S., Deshannavar U.B.: Biodegradation of 4-chlorophenol by Pseudomonas putida NCIM sp. 2650 under aerobic conditions. Res. J. Environ. Sci. 6, 238–244 (2012) 12. Boopathy R.: Factors limiting bioremediation technologies. Bioresour. Technol. 74, 63–67 (2000) 13. Boyd E., Killham K., Meharga A.: Toxicity of mono-, di- and trichlorophenols to lux marked terrestrial bacteria Burkholderia sp. RASC c2 and Pseudomonas fluorescens. Microbiol. Lett. 43, 157–166 (2001) 14. Briglia M., Briglia E.L., Nurmiaho-Lassila G., Vallini G., Salkinoja-Salonen M.: The survival of the pentachlorophenol-degrading Rhodococcus chlorophenolicus PCP-1 and Flavobacterium sp. in natural soil. Biodegradation, 1, 273–281 (1990) 15. Caliz J., Vil X., Martí E., Sierra J., Nordgren J., Lindgren P.E., Bańeras L., Montserrat G.: The microbiota of an unpolluted calcareous soil faces up chlorophenols: Evidences of resistant strains with potential for bioremediation. Chemosphere, 83, 104–116 (2011) 16. Čerňáková M., Zemanovičová A.: Microbial activity of soil contaminated with chlorinated phenol derivatives. Folia Microbiol. 43, 411–416 (1998) 17. Chaudhry G.R., Chapalamadugu S.: Biodegradation of halogenated organic compounds. Microbiol. Rev. 55, 59–79 (1991) 18. Chen M., Shih K., Hu M., Li C., Wu W., Tong H.: Biostimulation of indigenous microbial communities for anaerobic transformation of pentachlorofenol in paddy soils of Southern China. J. Agric. Food Chem. 60, 2967–2975 (2012) 19. Cho Y.G., Rhee S.K., Lee S.T.: Influence of environmental parameters on bioremediation of chlorophenol-contaminated soil by indigenous microorganisms. Environ. Eng. Res. 5, 165–173 (2000) 20.Chrzanowski Ł., Wick L.Y., Meulenkamp R., Kaestner M., Heipieper H.J.: Rhamnolipid biosurfactants decrease the toxicity of chlorinated phenols to Pseudomonas putida DOT-T1E. Lett. Appl. Microbiol. 48, 756–762 (2009) 88 AGNIESZKA NOWAK, IZABELA GREŃ, AGNIESZKA MROZIK 21. Cooper G.S., Jones S.: Pentachlorophenol and cancer risk: focusing the lens on specific chlorophenols and contaminants. Environ. Health Perspect. 116, 1001–1008 (2008) 22. Czaplicka M.: Sources and transformations of chlorophenols in the natural environment. Sci. Total Environ. 322, 21–39 (2004) 23. Dai M.H., Copley S.D.: Genome shuffling improves degradation of the anthropogenic pesticide pentachlorophenol by Sphingobium chlorophenolicum ATCC 39723. Appl. Environ. Microbiol. 70, 2391–2397 (2004) 24. Dams R.I., Paton G., Killham K.: Bioaugmentation of pentachlorophenol in soil and hydroponic systems. Int. Biodeter. Biodegr. 60, 171–177 (2007) 25. Dodor D.E., Hwang H.M., Ekunwe S.I.N.: Oxidation of anthracene and benzo[a]pyrene by immobilized laccase from Trametes versicolor. Enzyme Microb. Technol. 35, 210–217 (2004) 26. Dong Y.H., Xu J.L., Li X.Z., Zhang L.H.: AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. PNAS, 97, 3526–3531 (2000) 27. Ekelund R., Granmo A., Berggren M., Renberg L., Wahlberg C.: Influence of suspended solids on bioavailability of hexachloro­ benzene and lindane to the deposit-feeding marine bivalve, Abra nitida (Müller). Bull. Environ. Contam. Toxicol. 38, 500–508 (1987) 28. El-Sayed W.S., Ismaeil M., El-Beih F.: Isolation of 4-chlorophenol-degrading bacteria, Bacillus subtilis OS1 and Alcaligenes sp. OS2 from petroleum oil-contaminated soil and characterization of its catabolic pathway. Aust. J. Basic Appl. Sci. 3, 776–783 (2009) 29. Elväng A.M., Westerberg K., Jernberg C., Jansson J.K.: Use of green fluorescent protein and luciferase biomarkers to monitor survival and activity of Arthrobacter chlorophenolicus A6 cells during degradation of 4-chlorophenol in soil. Environ. Microbiol. 3, 32–42 (2001) 30. Farrel J., Reinhard M.: Desorption of halogenated organics from model solids, sediments and soil under unsaturated conditions. Environ. Sci. Technol. 28, 53–62 (1994) 31. Frische T., Mebes K.H., Filser J.: Assesing the bioavailability of contaminants in soils: a review on recent concepts, Research Report 201 64 214 UBA-FB 000405, red. C. Hufenbach, Federal Environmental Agency, Berlin, 2003 32. Fulthrope R.R., Schofield L.N.: A comparison of the ability of forest and agricultural soils to mineralize chlorinated aromatic compounds. Biodegradation, 10, 235–244 (1999) 33. Ge F., Zhu L., Chen H.: Effect of pH on the chlorination process of phenols in drinking water. J. Hazard Mater. B, 133, 99–105 (2006) 34. Gianfreda L., Sannino F., Filazzola M.T., Leonowicz A.: Catalytic behavior and detoxifying ability of laccase from the fungal strain Cerrena unicolor. J. Mol. Catal. B: Enzym. 4, 13–23 (1998) 35. Godoy F., Vancanneyt M., Martinez M., Steinbüchel A., Swing J., Rehm B.H.A.: Sphingopyxis chilensis sp. nov., a chlorophenol-degrading bacterium that accumulates polyhydroxyalkanoate, and transfer of Sphingomonas alaskensis to Sphingopyxis alaskensis comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 473–477 (2003) 36. Golovleva L.A., Zaborina O.E., Arinbasarova A.Y.: Degradation of 2,4,6-TCP and mixture of isomeric chlorophenols by immobilized Streptomyces rochei 303. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 815–819 (1993) 37. Greń I., Guzik U., Wojcieszyńska D., Łabużek S.: Molekularne podstawy rozkładu ksenobiotycznych związków aromatycznych. Biotechnologia, 2, 58–67 (2008) 38. Haddock J.D.: Aerobic degradation of aromatic hydrocarbons: enzyme structures and catalytic mechanisms (w) Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology, red. K.N. Timmis, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 2010, s. 1057–1069 39. Harms H., Wick L.Y., Smith K.E.C.: Matrix-hydrophobic compound interactions (w) Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology. red. K.N. Timmis, Springer-Verlag, Berlin, Heidel­ berg, 2010, s. 1467–1478 40.Hazen T.C.: Cometabolic bioremediation (w) Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology. red. K.N. Timmis, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 2010, s. 2505–2514 41.Hoekstra E.J., Weerd H., de Leer E.W.B., Brinkman U.A.T.: Natural formation of chlorinated phenols, dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans in soil of a douglas fir forest. Environ. Sci. Technol. 33, 2543–2549 (1999) 42. Hollender J., Hopp J., Dott W.: Degradation of 4-chlorophenol via the meta cleavage pathway by Comamonas testosteroni JH5. Appl. Environ. Microbiol. 63, 4567–4572 (1997) 43.Igbinosa E.O., Odjadjare E.E., Chigor V.N., Igbinosa I.H., Emoghene A.O., Ekhaise F.O., Igiehon N.O., Idemudia O.G.: Toxico­logical profile of chlorophenols and their derivatives in the environment: the public health perspective. Scientific World J. 2013, ID 460215, 11 stron (2013) 44. Ivanciuc T., Ivanciuc O., Klein D.J.: Prediction of environmental properties for chlorophenols with posetic quantitative super-structure/property relationships (QSSPR). Int. J. Mol. Sci. 7, 358–374 (2006) 45. Jansson J.K., Björklöf K., Elvang A.M., Jørgensen K.S.: Biomarkers for monitoring efficacy of bioremediation by microbial inoculants. Environ. Pollut. 107, 217–223 (2000) 46.Jernberg C., Jasson J.K.: Impact of 4-chlorophenol contamination and/or inoculation with the 4-chlorophenol-degrading strain, Arthrobacter chlorophenolicus A6L, on bacterial community structure. FEMS Microbiol. Ecol. 42, 387–397 (2002) 47. Kauppi S., Sinkkonen A., Romantschuk M.: Enhancing bioremediation of diesel-fuel-contaminated soil in a boreal climate: comparison of biostimulation and bioaugmentation. Int. Biodeter. Biodegr. 65, 359–368 (2011) 48.Kolomytseva M.P., Solyanikova I.P., Golovlev E.L., Golov­ leva L.A.: Heterogeneity of Rhodococcus opacus 1CP as a response to stress induced by chlorophenols. Appl. Biochem. Microbiol. 41, 474–479 (2005) 49. Kossowska-Cezak U.: Changes of the thermic seasons on Warsaw in the period 1933–2004. Miscellanea Geographica, 12, 87–94 (2006) 50. Kottler B.D., White J.C., Kelsey J.W.: Infuence of soil moisture on the sequestration of organic compounds in soil. Chemosphere, 42, 893–898 (2001) 51.Kurata Y., Watanabe Y., Ono Y., Kawamura K.: Concentrations of organic wood preservatives in wood chips produced from wood wastes. J. Mater. Cycles Waste Manage. 7, 38–47 (2005) 52. Kuwatsuka S., Igarashi M.: Degradation of PCP in soils. Soil Sci. Plant Nutr. 21, 405–414 (1975) 53. Laganà A., Bacaloni A., de Leva I., Faberi A., Fago G., Marino A.: Occurrence and determination of herbicides and their major transformation products in environmental waters. Anal. Chim. Acta, 462, 187–198 (2002) 54. Lallai A., Mura G.: Biodegradation of 2-chlorophenol in forest soil: effect of inoculation with aerobic sewage sludge. Environ. Toxicol. Chem. 23, 325–330 (2004) 55.Leadbetter J.R., Greenberg E.P.: Metabolism of acyl-homo­ serine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus. J. Bacteriol. 182, 6921–6926 (2000) 56. Leung K.T., Nandakumar K., Sreekumari K., Lee H., Trevors J.T.: A case study of bioremediation of polluted soil: biodegradation and toxicity of chlorophenols in soil. (w) Modern soil microbiology. red. J.D. van Elsas, J.T. Trevors, E.M.H. Wellington Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1997, s. 577–605 MIKROBIOLOGICZNY ROZKŁAD CHLOROFENOLI W GLEBIE 57. Loibner A., Jensen J., Ter Laak T., Celis R., Hartnik T.: Sorption and ageing of soil contamination (w) Ecological risk assessment of contaminated land. Decision support for site specific investigations. red. J. Jensen, M. Mesman, RIVM report number 711701047, Dania, 2006, s. 19–29 58. Lyytikäinen M., Sormunen A., Peraniemi S., Kukkonen J.V.K.: Environmental fate and bioavailability of wood preservatives in freshwater sediments near an old sawmill site. Chemosphere, 44, 341–350 (2001) 59. Männistö M.K., Salkinoja-Salonen M.S., Puhakka J.A.: In situ polychlorophenol bioremediation potential of the indigenous bacterial community of boreal groundwater. Wat. Res. 35, 2496– 2504 (2000) 60.Männistö M.K., Tiirola M.A., Puhakka J.A.: Degradation of 2,3,4,6-tetrachlorophenol at low temperature and low dioxygen concentrations by phylogenetically different groundwater and bioreactor bacteria. Biodegradaion, 12, 291–301 (2001) 61. Marchut-Mikołajczuk O., Kwapisz E., Antczak T.: Enzymatyczna bioremediacja ksenobiotyków. Inż. Ochr. Środ. 16, 39–55 (2013) 62.Massol-Deyá A., Muniz R., Colon M., Graulau J., Tang N.S.: Microbial community structure in pentachlorophenol contaminated soils as determined by carbon utilization profiles. Carrib. J. Sci. 41, 138–146 (2004) 63. Michałowicz J., Duda W.: Phenols transformations in the envi­ ron­ment and living organisms. Curr. Top. Biophys. 30, 24–36 (2007) 64. Michałowicz J., Ożadowicz R., Duda W.: Analysis of chlorophenols, chlorocatechols, chlorinated methoxyphenols and monoterpenes in communal sewage of Łódź and in the Ner River in 1999–2000. Water, Air Soil Pol. 164, 205–222 (2005) 65. Mrozik A., Cycoń M., Piotrowska-Seget Z.: Changes of FAME profiles as a marker of phenol degradation in different soils inoculated with Pseudomonas sp. CF600. Int. Biodeter. Biodegr. 64, 86–96 (2010) 66. Mrozik A., Piotrowska-Seget Z., Łabużek S.: Kwasy tłuszczowe błon komórkowych bakterii jako wskaźniki toksyczności związków aromatycznych. Post. Mikrobiol. 41, 185–197 (2002) 67. Nam K., Kim J.Y.: Persistence and bioavailability of hydrophobic organic compounds in the environment. Geosci. J. 6, 13–21 (2002) 68. Nicholls C., Karim K., Piletsky S., Saini S., Setford S.: Displacement imprinted polymer receptor analysis (DIPRA) for chlorophenolic contaminants in drinking water and packaging materials. Biosens. Bioelectron. 21, 1171–1177 (2006) 69. Niedan V., Pavasars I., Öberg G.: Chloroperoxidase-mediated chlorination of aromatic groups in fulvic acid. Chemosphere, 41, 779–785 (2000) 70. Olaniran A.O., Igbinosa E.O.: Chlorophenols and other related derivatives of environmental concern: properties, distribution and microbial degradation processes. Chemosphere, 83, 1297– 1306 (2011) 71. Oleszczuk P.: Biodostępność i bioakumulacja hydrofobowych zanieczyszczeń organicznych. Część I. Informacje ogólne. Biotechnologia, 76, 9–25 (2007) 72. Oleszczuk P.: Biodostępność i bioakumulacja hydrofobowych zanieczyszczeń organicznych. Część II. Sorpcja zanieczyszczeń oraz czynniki wpływające na ten proces. Biotechnologia, 76, 26–39 (2007) 73. Otte M.P., Gagnon J., Comeau Y., Matte N., Greer C.W., Samson R.: Activation of an indigenous microbial consortium for bioaugmentation of pentachlorophenol/creosote contaminated soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 926–932 (1994) 74. Park J.H., Zhao X., Voice T.C.: Development of a kinetic basis for bioavailability of sorbed naphthalene in soil slurries. Wat. Res. 36, 1620–1628 (2002) 89 75. Pastuszko A.: Substancja organiczna w glebach. Ochr. Środ. Zas. Nat. 30, 83–98 (2007) 76.Peinado M.T., Mariscal A., Carnero-Varo M., Fernandez-Crehuet J.: Correlation of two bioluminescence and one fluorogenic bioassay for the detection of toxic chemicals. Ecotoxicol. Environ. Saf. 53, 170–177 (2002) 77. Penttinen O.P.: Chlorophenols in aquatic environments: structure-activity correlations. Ann. Zool. Fennici. 32, 287–294 (1995) 78. Peuravuori J., Paaso N., Pihlaja K.: Sorption behaviour of some chlorophenols in lake aquatic humic matter. Talanta, 56, 523– 538 (2002) 79.Polak J., Jarosz-Wilkołazka A.: Reakcje katalizowane przez lakazę – mechanism i zastosowanie w biotechnologii. Biotechno­ logia, 4, 82–94 (2007) 80. Roy M., Chakrabarti S.K., Bharadwaj N.K., Chandra S., Kumar S., Singh S., Bajpai P.K., Jauhari M.B.: Characterization of chlorinated organic material in Eucalyptus pulp bleaching effluents. J. Sci. Ind. Res. 63, 527–535 (2004) 81. Sahoo N.K., Pakshirajan K., Ghosh P.K., Ghosh A.: Biodegradation of 4-chlorophenol by Arthrobacter chlorophenolicus A6: effect of culture conditions and degradation kinetics. Biodegradation, 22, 275–286 (2011) 82. Saito H., Sudo M., Shigeoka T., Yamauchi F.: In vitro cytotoxicity of chlorophenols to goldfish GF-scale (GSF) cells and quantitative structure-activity relationships. Environ. Toxicol. Chem. 10, 235–241 (1991) 83. Sánchez M.A., González B.: Genetic characterization of 2,4,6-trichlorophenol degradation in Cupriavidus necator JMP134. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2769–2776 (2007) 84. Semple K.T., Morriss A.W.J., Paton G.I.: Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil Sci. 54, 809–818 (2003) 85. Silva J., Iannacone J., Cifuentes A., Troncoso L., Bay-Schmith E., Larrain A.: Assessment of sensitivity to pentachlorophenol (PCP) in 18 aquatic species, using acute and chronic ecotoxicity bioassays. Ecotoxicol. Environ. Rest. 4, 10–17 (2001) 86. Sinkkonen A., Kauppi S., Simpanen S., Rantalainen A.L., Strommer R., Romantschuk M.: Layer of organic pine forest soil on top of chlorophenol-contaminated mineral soil enhances contaminant degradation. Environ. Sci. Pollut. Res. 20, 1737–1745 (2013) 87. Smreczak B., Klimkowicz-Pawlas A., Maliszewska-Kordybach B.: Biodostępność trwałych zanieczyszczeń organicznych (TZO) w glebach. Studia i Raporty IUNG-PIB, 35, 137–153 (2013) 88. Solyanikova I.P., Golovleva L.A.: Bacterial degradation of chlorophenols: pathways, biochemical and genetic aspects. J. Environ. Sci. Health Part B, 39, 333–351 (2004) 89.Stepanova L.I., Lindstrom-Seppa P., Hanninen O.O.P., Kote­ levtsev S.V., Glaser V.M., Novikov C.N., Beim A.M.: Lake Baikal: biomonitoring of pulp and paper mill waste water. Aquat. Ecosyst. Health, 3, 259–269 (2000) 90. Szewczyk R., Długoński J.: Mikrobiologiczny rozkład pentachlorofenolu. Biotechnologia, 1, 121–134 (2007) 91.Taseli B.K., Gockay C.F.: Degradation of chlorinated compounds by Penicillium camemberti in batch and up-flow column reactors. Process Biochem. 40, 917–923 (2005) 92. Torii H., Machida A., Hara H., Hatta T., Takizawa N.: The regulatory mechanizm of 2,4,6-trichlorophenol catabolic operon expression by HadR in Ralstonia pickettii DTP0602. Microbiology 159, 665–677 (2013) 93. Travkin V.M., Solyanikova I.P., Golovleva L.A.: Hydroxyquinol pathway for microbial degradation of halogenated aromatic compounds. J. Environ. Sci. Health B, 41, 1361–1382 (2006) 94. Tuor U., Wariishi H., Schoemaker H.E., Gold M.H.: Oxidation of phenolic arylglycerol β-aryl ether lignin model compounds 90 AGNIESZKA NOWAK, IZABELA GREŃ, AGNIESZKA MROZIK by manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium: oxidative cleavage of an α-carbonyl model compound. Biochem. 31, 4986–4995 (1992) 95. van Beelen P., Fleuren-Kemilä A.K.: Influence of pH on the toxic effects of zinc, cadmium and pentachlorophenol on pure cultures of soil microorganisms. Environ. Toxicol. Chem. 16, 146–153 (1997) 96. Veenagayathri K., Vasudevan N.: Degradation of 4-chlorophenol by a moderately halophilic bacterial consortium under saline conditions. Brazil. Microbiol. Res. J. 3, 513–524 (2013) 97. Vogel T.M.: Bioaugmentation as a soil bioremediation approach. Curr. Opin. Biotechnol. 7, 311–316 (1996) 98.Webb M.D., Ewbank G., Perkins J., McCarthy A.J.: Meta­ bolism of pentachlorophenol by Saccharomonospora viridis strains isolated from mushroom compost. Soil Biol. Biochem. 33, 1903–1914 (2001) 99.Westerberg K., Elväng A.M., Stackebrandt E., Jansson J.K.: Arthrobacter chlorophenolicus sp. nov., a new species capable of degrading high concentrations of 4-chlorophenol. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 2083–2092 (2000) 100.Wojcieszyńska D., Guzik U., Greń I., Perkosz M., Hupert-Kocurek K.: Induction of aromatic ring: cleavage dioxygenases in Stenotrophomonas maltophilia strain KB2 in cometabolic systems. World J. Microbiol. Biotechnol. 27, 805–811 (2011) POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 91–98 http://www.pm.microbiology.pl PAŁECZKI GRAM-UJEMNE BEZTLENOWO ROSNĄCE – DIAGNOSTYKA I ZNACZENIE KLINICZNE Marta Kierzkowska1, 2, Anna Majewska1, 2*, Anna Sawicka-Grzelak1, 2, Grażyna Młynarczyk1, 2 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Szpital Kliniczny Dzieciątka Jezus Wpłynęło w maju 2015 r. Zaakceptowano w sierpniu 2015 r. 1. Wstęp. 2. Diagnostyka laboratoryjna beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych. 3. Znaczenie kliniczne beztlenowych pałeczek Gramujemnych. 4. Podsumowanie Gram-negative anaerobic rods – diagnostics and clinical significance Abstract: Among the broad spectrum of anaerobic bacteria constituting the normal flora of humans, some exhibit pathogenic potential and are responsible for serious infections. Gram-negative anaerobic rods belonging to the genera Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Fusobacterium and Porphyromonas represent the most common cause of endogenous, usually mixed, infections. Anaerobes are important pathogens causing infections after abdominal or gynecologic surgery, oral-cavity infections and other infections originating from the mouth or abdomen. The virulence of different species depends on the combination of bacterial properties, including surface structures, metabolic functions, the ability to avoid the host’s defenses and the capacity to damage tissues. Special laboratory procedures are needed for the isolation and identification of this diverse group of bacteria. The identification to the species level, if based on phenotypic features, is often time-consuming and not always easy to carry out. Some molecular methods may help in the everyday clinical microbiological practice in laboratories dealing with the diagnostics of anaerobic infections. The taxonomy of the anaerobic bacteria is in a state of continuous change, due to the constant addition of new species and the reclassification of the old ones. 1. Introduction. 2. Laboratory diagnostics of Gram-negative anaerobic rods. 3. Clinical significance of Gram-negative anaerobic rods. 4. Summary Słowa kluczowe: Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Fusobacterium, Porphyromonas Key words: Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Fusobacterium, Porphyromonas 1. Wstęp Beztlenowe pałeczki Gram-ujemne (Anaerobic Gram-Negative Bacilli – AGNB) wchodzą w skład fizjologicznej mikroflory człowieka. Kolonizują jamę ustną, górne drogi oddechowe, przewód pokarmowy i drogi moczowo-płciowe. Drobnoustroje te są patogenami oportunistycznymi, odpowiadają za zakażenia endogenne. W przypadku osłabienia wydolności immunologicznej, niedotlenienia tkanek, kwasicy, przerwania ciągłości skóry i/lub błon śluzowych lub innych zdarzeń, dochodzi do namnażania się bakterii i infekcji. Zakażenia mogą dotyczyć różnych tkanek i narządów. Beztlenowe pałeczki Gram-ujemne, często wraz z mikroflorą tlenową izolowane są z wielu materiałów klinicznych. Beztlenowce w zakażeniach działają synergistycznie ze sobą oraz bakteriami tlenowymi. Takie wielogatunkowe zakażenia nasilają proces zapalny, są wyzwaniem diagnostycznym i problemem terapeutycznym. Do najistotniejszych klinicznie beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych należą: Bacteroides spp., Parabacteroides spp., Porphyromonas spp., Prevotella spp. oraz Fusobacterium spp. Metody hodowli i identyfikacji bakterii beztlenowych prowadzone są często w laboratoriach mikro­bio­ logicznych w ograniczonym zakresie. Stopień zaawansowania diagnostyki zakażeń bakteriami beztlenowymi zależy od stopnia referencyjności laboratorium. Identyfikacja najczęściej może być dokonana za pomocą komercyjnych zestawów, opartych na analizie cech biochemicznych bakterii. Obecnie coraz częściej stosowane metody biologii molekularnej, takie jak PCR, multiplex PCR pozwalają na skrócenie czasu badania. Metody te cechują się dużą czułością i powtarzalnością. W ostatnim czasie wprowadzono do laboratoriów metodę spektrometrii masowej, która umożliwia identyfikację bakterii na podstawie analizy białek rybosomalnych. Jednak „złotym standardem” w identyfikowaniu do poziomu gatunku jest sekwencjonowanie bakteryjnego genu 16S rRNA. Niestety, wysoki koszt badania uniemożliwia zastosowanie tej metody w rutynowej diagnostyce [1, 27, 29, 34, 68, 69]. Wadą * Autor korespondencyjny: Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul. T. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa; tel. 22 628 27 39; e-mail: [email protected] 92 MARTA KIERZKOWSKA, ANNA MAJEWSKA, ANNA SAWICKA-GRZELAK, GRAŻYNA MŁYNARCZYK jest również stosunkowo długi czas oczekiwania na wynik, jako że badania są zwykle wykonywane przez placówki zewnętrzne. 2. Diagnostyka laboratoryjna beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych Schemat postępowania diagnostycznego obejmuje: ocenę makroskopową materiału klinicznego (obecność krwi, gazu, zapach, kolor), wykonanie preparatu bezpośredniego barwionego metodą Grama, hodowlę w warunkach beztlenowych i tlenowych, ocenę makroskopową i mikroskopową wyhodowanych kolonii, identyfikację (różne metody), oznaczenie lekowrażliwości oraz ewentualne wykrycie genów odpowiedzialnych za produkcję toksyn metodami biologii molekularnej [35, 36]. Materiał diagnostyczny posiewany jest na pożywki wzbogacone, specjalnie opracowane do hodowli bezwzględnych beztlenowców. Zawierają one m.in. wyciąg mięsny, będący źródłem składników odżywczych, wyciąg drożdżowy jako bogate źródło witamin oraz glukozę stanowiącą źródło energii. Hemina (czynnik X) i krew są źródłem hemu, niezbędnego składnika umożliwiającego wzrost beztlenowców i dodatkowych substancji wzrostowych. Witamina K uznawana jest za składnik ułatwiający wzrost beztlenowym pałeczkom Gram-ujemnym. Komercyjnie dostępne są: podłoże Schaedler agar z 5% krwią baranią i wit. K1, podłoże Wilkins-Chalgrena z 5% krwią baranią i wit. K3, agar Columbia z dodatkiem krwi baraniej, oraz podłoże Brucella z 10% krwią końską [19, 33–35, 41]. Niezwykle praktyczne w diagnostyce laboratoryjnej są podłoża wybiórcze, pozwalające na izolowanie Gram-ujemnych pałeczek beztlenowych bezpośrednio z materiału klinicznego. Do izolacji pałeczek z grupy B. fragilis wykorzystuje się podłoże BBE (Bacteroides Bile Esculin). Zawarta w podłożu żółć i antybiotyki, takie jak gentamycyna lub amikacyna hamują namnażanie bakterii względnie beztlenowych i większość Gram-ujemnych pałeczek beztlenowych innych niż z rodzaju Bacteroides. Różnicowanie grupy B. fragilis opiera się na hydrolizie eskuliny obecnej w podłożu. Uwolniona eskuletyna reaguje z jonami żelaza, tworząc kompleks widoczny w postaci zabarwienia ciemnobrązowego lub czarnego wokół ciemnych kolonii pałeczek grupy B. fragilis [23, 50]. Inkubację bakterii beztlenowo rosnących należy prowadzić w anaerostatach (N2 85%, H2 10%, CO2 5%) w temperaturze 37°C od 48 godzin do 7 dni. Metoda hodowli pozwala na ocenę morfologii kolonii i badanie mikroskopowe. Pałeczki rodzaju Bacteroides wzrastają w postaci szarych, gładkich, lśniących kolonii o średnicy 1–3 mm. W preparatach barwionych metodą Grama obserwo- wane są formy polimorficzne: z rozszerzonym środkiem zawierającym wakuolę, nitkowate lub kuliste. Większość gatunków z rodzaju Bacteroides wykazuje właś­ ciwości sacharolityczne i proteolityczne [17, 22, 33]. Z kolei niektóre pałeczki z rodzajów Prevotella i Porphyromonas mają zdolność wytwarzania barwnika (BPAR – black-pigmented anaerobic rod-shaped bacteria). Gatunki pigmentujące należące do rodzaju Prevotella to: P. intermedia, P. melaninogenica, P. corporis, P. denticola, P. loescheii. Wykazują zdolność do asymilowania hemoglobiny z krwi zawartej w podłożu, a następnie konwertowania jej do protoheminy, która akumulowana jest w komórkach bakteryjnych, powodując ciemnobrązowe lub czarne zabarwienie kolonii po kilkudniowej inkubacji. Kolonie, które nie wytworzyły jeszcze barwnika, fluoryzują na czerwono w świetle lampy UV, emitującej światło o długości fali 366 nm. Głównym czynnikiem odpowiedzialnym za świecenie jest protoporfiryna IX. Kolonie gatunków niepigmentujących, wyglądem przypominają kolonie Bacteroides spp., są szare, błyszczące, okrągłe, o średnicy 1–2 mm. W preparacie mikroskopowym widoczne są krótkie pałeczki, co nie wyróżnia ich spośród innych gatunków bakterii Gram-ujemnych. Pałeczki Prevotella spp. mają zdolność fermentacji węglowodanów, produkują z glukozy kwas octowy, bursztynowy i inne [17, 58]. Bakterie rodzaju Porphyromonas tworzą małe, szare kolonie o średnicy poniżej 1mm. Widoczne są na podłożu hodowlanym po co najmniej 48 godzinnej inkubacji. Ciemne zabarwienie kolonii niektórych gatunków (P. gingivalis) pojawia się po 3–7 dobach wzrostu na podłożu hodowlanym. Pałeczki Porphyromonas nie fermentują glukozy ani innych węglowodanów. Morfologia kolonii Fusobacterium jest zróżnico­ wana. Wzrastają w postaci kolonii o nierównych, ząbkowanych brzegach i średnicy 1–3 mm, po co najmniej 48 godzinach hodowli. Głównym produktem meta­ bolicznym fermentacji cukrów jest kwas masłowy, co nadaje hodowlom nieprzyjemny zapach. W preparacie mikroskopowym widoczne są jako wydłużone komórki o zaostrzonych końcach. Pałeczki mogą również przyjmować kształt pałeczkowaty, kokoidalny lub nitkowaty. Gatunki z rodzaju Fusobacterium wykazują słabą aktywność metaboliczną [17]. Klasyczna diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń wywołanych przez te bakterie jest trudna. Wysoką wartość diagnostyczną posiadają metody molekularne [9]. Na podstawie powyższych informacji można stwierdzić, że różnicowanie i identyfikacja niektórych gatunków beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych może być trudna z powodu ich niecharakterystycznej morfo­logii i słabej aktywności metabolicznej. W laboratoriach dia­g­­­­­­­­­nostycznych dostępne są komercyjne testy oparte na badaniu właściwości biochemicznych, dedykowane dla beztlenowców, takie jak np.: RapID-ANA II (Inno- PAŁECZKI GRAM-UJEMNE BEZTLENOWO ROSNĄCE – DIAGNOSTYKA I ZNACZENIE KLINICZNE vative Diagnostic Systems, Atlanta, GA), Rapid ID 32A (bioMerieux SA, Francja) oraz API 20 A w automatycznym systemie ATB Expression (bioMerieux SA, Francja) [10, 34]. Są to zminiaturyzowane systemy manualne, gdzie w mikroprobówkach znajduje się zliofilizowany substrat i wskaźnik reakcji biochemicznej. Oznaczanych jest co najmniej 20 cech biochemicznych drobnoustroju i na tej podstawie powstaje profil numeryczny, który odpowiada konkretnemu gatunkowi z procentowym prawdopodobieństwem właściwej identyfikacji. Inną metodą detekcji wykorzystującą profil biochemiczny bakterii jest automatyczny system Vitek 2 (bioMerieux SA, Francja), w którym stosowane są karty ANC, identyfikujące oprócz beztlenowców także maczugowce. Obecnie istnieje również możliwość identyfikowania drobnoustrojów za pomocą spektrometrii masowej: MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS: MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Niemcy) i VITEK® MS (bioMerieux SA, Francja). Analiza oparta jest na jonizacji laserowej białek rybosomalnych i porównaniu otrzymanego widma z widmami referencyjnymi drobnoustrojów zapisanymi w bazie danych. Aparat wskazuje zakresy wiarygodności identyfikacji do poziomu gatunku i rodzaju [2, 34, 36, 38, 39, 44, 52]. Wyniki badań sugerują, że metoda spektrometryczna jako jednostopniowa identyfikacja istotnych klinicznie gatunków bakterii beztlenowych z sukcesem została zaadoptowana do rutynowej diagnostyki tych bakterii. Pozwala na szybszą i łatwiejszą identyfikację drobnoustrojów w porównaniu z innymi metodami fenotypowymi i molekularnymi [11, 53]. Aktualna taksonomicznie baza systemów rozpoznaje gatunki, które mają obecnie nową pozycję systematyczną i nie są uwzględnione w systemie ApiwebTM. Należy zwrócić uwagę, że nowe gatunki rodzaju Bacteroides takie jak: B. dorei, B. xylanisolvens i B. faecis nie są włączone do bazy danych systemów MALDI Biotyper i VITEK® MS więc mylnie oznaczane są jako B. vulgatus, B. ovatus i B. thetaiotaomicron [10, 34]. W laboratoryjnej diagnostyce zakażeń bakteryjnych coraz chętniej korzysta się z metod innych niż analizy fenotypowe. Powszechnie stosowaną metodą jest PCR i jej modyfikacje (muliplex PCR i inne), a także hybrydyzacja czy hybrydyzacja in situ (FISH). Często łączy się kilka metod molekularnych w celu uzyskania optymalnego efektu. „Złotym standardem” obecnie w identyfikowaniu gatunków beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych jest metoda oparta na podobieństwie w sekwencji genu kodującego 16S rRNA. W genie tym występują zmienne regiony, które warunkują różnicę pomiędzy rodzajami i gatunkami drobnoustrojów. Metoda 16S rRNA umożliwia dokonanie właściwej identyfikacji, ale także szybkie rozpoznanie i klasy­ fikację wcześniej nieopisanych drobnoustrojów. Bazy danych zawiera­ jące sekwencję genu 16S rRNA są ogólnodostępne: Basic Local Alignment Search Tool 93 (BLAST), Ribosomal Database Project (RDP) lub European Molecular Biology Laboratory (EMBL), co umożliwia porównanie uzyskanych sekwencji ze szczepami referencyjnymi [60, 65, 68]. 3.Znaczenie kliniczne beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych Beztlenowe pałeczki Gram-ujemne należą do drobnoustrojów komensalnych, stanowią naturalny składnik mikroflory przewodu pokarmowego, dróg moczowo-płciowych i górnych dróg oddechowych. Do najistotniejszych klinicznie rodzajów zalicza się: Bacteroides, Parabacteroides, Porphyromonas, Prevotella i Fusobacterium [33, 34, 48]. 3.1. Bacteroides i Parabacteroides Bakterie z rodzajów Bacteroides i Parabacteroides stanowią ważny składnik naturalnego mikrobiomu jelit. Gatunkami najczęściej zasiedlającymi przewód pokarmowy są: B. vulgatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis i P. distasonis. Tymczasem większość zakażeń w obrębie jamy brzusznej wywołuje, charakteryzujący się najwyższą zjadliwością B. fragilis. Pałeczki Bacteroides spp. i Parabacteroides spp. uczestniczą w zakażeniach endogennych, często o charakterze ropnym. Powodują zakażenia w obrębie jamy brzusznej: ropnie wątroby, trzustki, nerki, zapalenie dróg żółciowych, zapalenie wyrostka robaczkowego, zapalenie błony śluzowej macicy, ropnie jajników i jajowodów. W układzie oddechowym pałeczki te mogą powodować: zapalenie ucha środkowego, zatok, ropnie płuc, aspiracyjne zapalenie płuc, ropniak opłucnej. Związane są również etiologicznie z ropniami mózgu, szczególnie pochodzenia usznego lub zatokowego, oraz ropniami w okolicy oko­ ło­odbytniczej, a także z pourazowym zapaleniem kości, szpiku i tkanek miękkich oraz bakteriemią. Chorobotwórczość B. fragilis związana jest z właś­ ci­wościami adhezyjnymi: wytwarzaniem otoczki, śluzu powierzchniowego, obecnością fimbrii. Gatunki posiadające fimbrie wykazują zdolność wiązania się z komórkami nabłonka i białkami gospodarza: fibrynogenem, fibronektyną, lamininą i laktoferyną. Otoczka chroni drobnoustrój przed układem immunologicznym gos­po­darza, gdyż stanowi fizykochemiczną barierę chroniącą przed fagocytozą i działaniem enzymów lizosomalnych. Unikatowa struktura wielocukru otoczkowego (zwitterionic polysaccharide) predysponuje do tworzenia ropni. W związku z tym bakterie wytwarzające te zewnątrzkomórkowe polisacharydy biorą udział w zakażeniach ran, stopy cukrzycowej, prowadzą do powstawania owrzodzeń i przetok. Kolejna grupa czynników wirulencji odpowiedzialna jest za destrukcję komórek 94 MARTA KIERZKOWSKA, ANNA MAJEWSKA, ANNA SAWICKA-GRZELAK, GRAŻYNA MŁYNARCZYK i inwazję do głębiej leżących tkanek. Należy tu wymienić enzymy: kolagenazę, fibrynolizynę, neuraminidazę, hialuronidazę, chondroitynazę, heparynazę, lecytynazę, deoksyrybonukleazy, lipazy, fosfolipazy. Przed toksycznym działaniem tlenu w tkankach bakterie są chronione przez katalazę i dysmutazę nadtlenkową, inaktywującą H2O2 i wolne rodniki nadtlenkowe. W wyniku przemian metabolicznych B. fragilis produkuje krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe: octowy, bursztynowy, masłowy, izomasłowy, propionowy, które hamują chemotaksję granulocytów obojętnochłonnych, umożliwiając ucieczkę pałeczek spod kontroli układu immunologicznego. Ważnym czynnikiem chorobotwórczości tych pałeczek jest lipopolisacharyd (LPS), który zawiera kwas 2-keto-3-deoksy-D-manno-oktulozonowy (KDO). Ma budowę podobną do LPS bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, jednak charakteryzuje się słabszą aktywnoś­ cią, czego przyczyną są różnice w budowie lipidu A. Niektóre szczepy gatunku B. fragilis wytwarzają fragilizynę (BFT, Bacteroides fragilis toxin), ciepłowrażliwą enterotoksynę o masie 20 kDa, będącą metaloproteazą zależną od Zn2+, która kodowana jest przez gen bft. Gen enterotoksyny występuje w trzech allelach: bft-1, bft-2 i bft-3. Toksyna posiada właściwości proteolityczne, hydrolizuje żelatynę, azocoll, fibrynogen, tropomiozynę, G-aktynę, kolagen typu IV, składnik C3 dopełniacza. Oddziałuje na białko powierzchniowe komórek eukariotycznych E-kadherynę odpowiadającą za przyleganie komórek. BFT wpływając na E-kadherynę uwalnia związaną z nią β-kateninę, która przedostaje się do jądra. β-katenina po połączeniu z czynnikiem transkrypcyjnym komórki T aktywuje transkrypcję oraz translację protoonkogenu c-myc. W związku z tym enterotoksynotwórcze szczepy B. fragilis (ETBF) mogą przyczyniać się do transformacji nowotworowej komórek jelita grubego. Szczepy ETBF odpowiadają za występowanie biegunek. Enterotoksyna B. fragilis powoduje reorganizację struktury F-aktyny, zniekształca filamenty aktynowe w komórkach nabłonka jelit, co odpowiada za sekrecję jonów chlorkowych i wody do światła jelita. Stymuluje również komórki nabłonka do wydzielania IL-8, która z kolei odpowiada za zapalne uszkodzenie nabłonka. Szczepy ETBF hodowane są z kału ludzi i zwierząt, a także ze źródeł pozajelitowych. Rola enterotoksyny B. fragilis w patogenezie chorób biegunkowych oraz innych zakażeń nie jest jeszcze do końca wyjaśniona i pozostaje przedmiotem badań w wielu ośrodkach na całym świecie [20, 48, 54–56, 61, 64]. 3.2. Porphyromonas Do gatunków najistotniejszych klinicznie zaliczamy P. asaccharolytica, P. gingivalis i P. endodontalis. Przedstawiciele tych gatunków prezentują podobny profil biochemiczny i z tego powodu ich identyfikacja przy pomocy konwencjonalnych metod diagnostycznych jest niewiarygodna. Prawidłowe identyfikowanie do poziomu gatunków umożliwia analiza 16S rRNA [21]. P. gingivalis ma zdolność wytwarzania różnorodnych czynników warunkujących zjadliwość. Wprawdzie beztlenowiec ten jest naturalnym składnikiem mikrobiomu jamy ustnej, może jednak powodować zmiany chorobowe. P. gingivalis jest kluczowym patogenem uczestniczącym w zapaleniu przyzębia (periodon­ titis), choroby infekcyjnej prowadzącej do destrukcji wyrostka zębodołowego oraz degradacji tkanek utrzymujących ząb [47, 66]. Zdaniem wielu badaczy również P. endodontalis uczestniczy w tej patologii [22]. Bakteria posiada wiele czynników wirulencji, które umożliwiają adhezję, inwazję do wnętrza komórek, a także ewazję spod kontroli układu immunologicznego [31, 57]. Bakterie stałej mikroflory jamy ustnej, w tym P. gingivalis w warunkach zachwianej równowagi ilościowej i jakościowej stają się czynnikiem etiologicznym stanów zapalnych tkanek miękkich jamy ustnej. Kolonizacja tymi bakteriami przyjmuje postać płytki nazębnej – biofilmu [49]. Tworzenie płytki jest wynikiem procesu przylegania i namnażania bakterii dzięki adhezji i koagregacji [66]. W rozwoju biofilmu bakteryjnego pewną rolę może odgrywać reakcja krzyżowa z przeciwciałami skierowanymi przeciwko białku szoku termicznego (HSP60), wytwarzanemu przez bakterie z gatunku P. gingivalis [45]. Podkreśla się fakt występowania tego drobnoustroju, przede wszystkim w płytce poddziąsłowej, u osób z ciężkimi przypadkami przewlekłego zapalenia przyzębia [59]. Bakterie występujące w postaci biofilmu tworzą przestrzenną, doskonale zorganizowaną strukturę otoczoną zbudowaną z polimerów cukrów i białek macierzą. Biofilm chroni bakterie przed działaniem komórek układu immunologicznego oraz przed penetracją antybiotyków. Enzymy bakteryjne (hialuronidaza, kolagenaza, fosfolipaza A, fibrynolizyna) rozkładają struktury tkanki łącznej oraz nabłonka [49, 66]. Istotnym czynnikiem zjadliwości P. gingivalis są fimbrie, które biorą udział w adhezji komórki bakteryjnej do powierzchni nabłonka dziąsła. Fimbrie posiadają również właściwości inwazyjne oraz są ważnym induktorem wydzielania prozapalnych cytokin [42, 43]. Otoczka zbudowana z glukozy, glukozaminy, galaktozaminy oraz ze związków kwasu moczowego i galaktozaminy jest następnym czynnikiem zjadliwości [57, 59]. Negatywne oddziaływanie na organizm związane jest z bezpośrednim wpływem drobnoustroju oraz produktów jego metabolizmu na komórki tkanki łącznej i nabłonka, a także indukcją reakcji prozapalnej. Mimo że etiopatogeneza zapalenia przyzębia nie została w pełni wyjaśniona, jednym z mediatorów biologicznych w patogenezie chorób jamy ustnej jest tlenek azotu (NO) i jego metabolity [5, 12, 32, 37]. Wykazano, że P. gingivalis oprócz powodowania przewlekłego PAŁECZKI GRAM-UJEMNE BEZTLENOWO ROSNĄCE – DIAGNOSTYKA I ZNACZENIE KLINICZNE stanu zapalnego w początkowej fazie zakażenia może być czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju np.: miażdżycy naczyń wieńcowych, reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia tęczówki i siatkówki, zapalenia mięśnia sercowego, wsierdzia, a także rozwoju cukrzycy [45, 66, 67]. Istotnym czynnikiem zjadliwości Porphyromonas jest lipopolisacharyd (LPS) o właściwościach endotoksyny. Lipopolisacharyd jest składnikiem błony zewnętrznej bakterii (outer membranę, OM). Uwalniany z rozpadających się komórek jest jedną z silniejszych substancji aktywujących układ immunologiczny. LPS P. gingivalis hamuje aktywność fosfatazy zasadowej (warunkuje mineralizację kości), alfa kolagenu typu I, oraz produkcję osteokalcyny i komórek macierzystych z więzadła trzyzębnego, biorących udział w regeneracji struktur zęba. Proteazy cysteinowe (gingipainy) biorą również udział w etiopatogenezie zapaleń przyzębia. Uczestniczą w procesie adhezji oraz niszczą składniki C3 i C5 dopełniacza, immunoglobuliny klasy IgG, IgM, IgA oraz inne białka gospodarza jak: albumina, transferyna, haptoglobina, hemopeksyna. Powodują destrukcję tkanek zawierających fibronektynę i kolagen, zaburzają opsonizację oraz upośledzają chemotaksję granulocytów obojętnochłonnych. Natomiast inny enzym wytwarzany przez pałeczki P. gingivalis, deiminaza peptydyloargininy, odgrywa rolę w destrukcji tkanek dziąsła i mostków kolagenowych w szczelinie dziąsłowej w zapaleniu przyzębia. Końcowe produkty przemian metabolicznych pałeczek Porphynomonas jak np. kwas masłowy, kwas propionowy, aminy, amoniak, indol są ważnymi cytotoksynami hamującymi wzrost i metabolizm komórek gospodarza. Lotne związki siarki (siarkowodór, merkaptan metylu) wpływają na przepuszczalność komórek błony śluzowej i redukcję syntezy kolagenu [31, 43, 62]. 3.3. Prevotella Wiele gatunków z rodzaju Prevotella należy do fizjologicznej mikroflory błon śluzowych jamy ustnej (P. melaninogenica, P. intermedia, P. oralis), przewodu pokarmowego oraz dróg rodnych (P. disiens, P. bivia, P. melaninogenica, P. buccae). Zachwianie równowagi ilościowej i jakościowej mikrobiomu oraz translokacja bakterii poza miejsce naturalnego bytowania skutkuje zakażeniem. Prevotella należy do bakterii inwazyjnych, powoduje infekcje wielobakteryjne. Gatunki należące do tego rodzaju wspólnie z F. nucleatum mają zdolność do formowania biofilmu w postaci płytki nazębnej. Z zakażeniami w stomatologii związane są przyczynowo P. intermedia, P. melanogenica, P. oris i P. buccae. P. intermedia jest przyczyną zapalenia dziąseł u kobiet w ciąży i jednym z ważniejszych czynników zapalenia przyzębia [17, 26]. Z próbek klinicznych pobranych od pacjentów z problemami otorynolaryngologicznymi, 95 często w przebiegu ostrego i przewlekłego zapalenie zatok, z ropni zamkniętych czy okołomigdałkowych, izolowane są P. intermedia, P. ruminicola, P. brevis, P. melaninogenica, P. oralis, P. bivia. Bakterie z rodzaju Prevotella wywołują bakteriemie, krwiopochodne zapalenie kości i stawów oraz uczestniczą w formowaniu ropni np.: mózgu i rzadziej w tkance płucnej. Pałeczki rodzaju Prevotella są często izolowane z zakażonych ran powstałych po pogryzieniu przez człowieka lub zwierzę [3, 28, 30]. P. melaninogenica, P. intermedia i P. denticola wywołują zachłystowe zakażenie układu oddechowego. Do czynników ryzyka wystąpienia takiej infekcji należą: choroby przyzębia, cukrzyca, przewlekłe choroby płuc, alkoholizm oraz nikotynizm [19, 24, 27, 30]. P. bivia, P. disiens, P. intermedia, P. loescheii oraz P. melaninogenica izolowane są z materiałów pobranych w przebiegu zakażenia dróg rodnych, zapalenie narządów miednicy mniejszej [25]. Czynniki zjadliwości wytwarzane przez te bakterie umożliwiają kolonizację (otoczka, fimbrie, adhezyny), degradację immunoglobulin (proteazy) oraz destrukcje tkanek (hemaglutyniny, hemolizyny) [14, 17]. Niektóre gatunki mają zdolność wytwarzania bakteriocyn (nigrescyna), która wykazuje aktywność przeciwko P. gingivalis, P. intermedia, Actinomyces spp. [46]. 3.4. Fusobacterium Bakterie z rodzaju Fusobacterium wchodzą w skład normalnej mikroflory jamy ustnej, przewodu pokarmowego, występują w drogach oddechowych i drogach rodnych. Mogą powodować zakażenia mieszane z udziałem mikroflory tlenowej. Biorą udział w zakażeniach ropnych, izolowane są z ropni płuc, mózgu, narządów miednicy mniejszej oraz z krwi. Uczestniczą w zakażeniach w obrębie jamy ustnej, takich jak: ropnie okołomigdałkowe, zapalenie gardła i migdałków, choroby przyzębia. Mogą być przyczynowo związane z septycznym zapaleniem stawów, zapaleniem wsierdzia, zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych [6–9, 15, 16, 18, 40]. Do gatunków najistotniejszych klinicznie zaliczane są: F. nucleatum, F. necrophorum, F. mortiferum, F. va­rium. Na podstawie badań homologii DNA i analizy białek komórkowych w obrębie F. nucleatum wyodrębniono pięć podgatunków, z których najczęściej izolowany jest F. nucleatum subsp. nucleatum. Natomiast w obrębie F. necrophorum wyodrębniono dwa podgatunki, z których najistotniejszym jest F. necrophorum subsp. necrophorum. Obecność adhezyn u Fusobacterium umożliwia przyleganie do błon śluzowych. Bakterie posiadają zdolność produkcji amoniaku i siarkowodoru z cysteiny oraz melatoniny. F. necrophorum jest wybitnie inwazyjnym patogenem. Posiada klasyczną endotoksynę 96 MARTA KIERZKOWSKA, ANNA MAJEWSKA, ANNA SAWICKA-GRZELAK, GRAŻYNA MŁYNARCZYK (lipopolisacharyd) i chroniące przed ewazją układu immunologicznego leukotoksyny. Produkuje toksyny dermonekrotyczne, cytotoksyny, hemolizyny. Bakteria generuje także substancje, takie jak: lotne związki siarki, enzymy proteolityczne i fosfatazy. Produkuje hemaglutyninę, która prowadzi do agregacji płytek, a w efekcie rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego i trombocytopenii. Aktywność plazminy na powierzchni bakterii jest również uznawana za ważny czynnik zjadliwości umożliwiający inwazję bakterii. Współwystępując z bakteriami tlenowymi, wykorzystującymi do własnych procesów metabolicznych tlen, korzystają z obniżenia potencjału oksydo-redukcyjnego. Zapewnia to bakteriom F. necrophorum dogodne warunki do namnażania się [17]. F. nucleatum bierze udział w zakażeniach mieszanych, głównie w patogenezie chorób przyzębia. Obecność adhezyny A (FadA), umożliwia przyleganie do błon śluzowych. Ważnym schorzeniem jest ostre martwiczo-wrzodziejace zapalenie dziąseł (acute necrotizing ulcerative gingivitis – ANUG), zwykle spowodowane brakiem higieny jamy ustnej, niedożywieniem, chorobami ogólnoustrojowymi czy zakażeniami wirusowymi (np.: pierwotne opryszczkowe zapalenie jamy ustnej i HIV). Czynnikami sprzyjającymi są również: nałogowe palenie tytoniu i stres psychiczny. Choroba jest skutkiem współdziałania F. nucleatum, Treponema vincentii, Treponema denticola, Prevotella intermedia i Porphyromonas gingivalis. Charakterystycznym objawem jest stan zapalny dziąseł z krwawieniem i owrzodzeniem. Zmiany miejscowe pokryte są błoną rzekomą lub tkanką martwiczą złożoną z leukocytów, erytrocytów, fragmentów tkanek i drobnoustrojów. Chory odczuwa metaliczny, nieprzyjemny smak w ustach. Typowym objawem klinicznym jest również cuchnący zapach z ust [9, 51]. Diagnostyka ANUG opiera się na obserwacji specyficznych objawów klinicznych. Potwierdzeniem jest ocena preparatu mikroskopowego z materiału pobranego z wrzodziejących zmian na dziąsłach. Nieleczona choroba prowadzi do postaci przewlekłej – zgorzelinowego zapalenia jamy ustnej. Zgorzelinowe zapalenie jamy ustnej zwane nomą jest bardzo ciężką postacią ANUG. Stan zapalny o charakterze zgorzeli obejmuje tkanki miękkie i kości w okolicach żuchwy, szczęki, nosa, i czasem okolice podoczodołowe, co prowadzi do dużego ubytku tkanek i poważnych zniekształceń twarzy. Choroba dotyczy głównie dzieci w wieku poniżej 10 roku życia. Czynnikami predysponującymi są: ubóstwo, niedobory żywieniowe i towarzyszące zakażenia wirusowe (np. odra, świnka, zakażenie CMV lub HSV) lub bakteryjne (np. gruźlica). Obecnie noma bardzo rzadko występuje w krajach rozwiniętych, natomiast zachorowania nadal obserwowane są w krajach Afryki Subsaharyjskiej. Zgorzelinowe zapalenie jamy ustnej rozpoznawano wśród więźniów obozów koncentracyjnych w Bergen-Belsen i Auschwitz, u pacjentów z HIV/AIDS i innych osób z głębokimi niedoborami odporności [4, 9, 16, 63]. Kompleks wrzecionowców z krętkami jamy ustnej (F. necrophorum i Treponema vincentii) jest czynnikiem etiologicznym anginy Plauta-Vincenta. Oba gatunki stanowią fizjologiczną mikroflorę jamy ustnej, ale w wyniku nieprawidłowej higieny, niedoborów żywieniowych oraz infekcji wirusowych, nadmiernie się namnażają, co może doprowadzić do zajęcia migdałków podniebiennych i martwiczo-wrzodziejącego zapalenia dziąseł [6, 9, 13]. 4. Podsumowanie Beztlenowe pałeczki Gram-ujemne to bakterie oportunistyczne, które w przypadku obniżonej lokalnie lub systemowo odporności lub na skutek translokacji poza miejsce naturalnego bytowania powodują zakażenia. Bakterie te wytwarzając liczne czynniki wirulencji, z powodzeniem kolonizują tkanki człowieka, dokonują inwazji do wnętrza komórek oraz unikają odpowiedzi immunologicznej. Ponieważ beztlenowce często są związane z poważnymi stanami chorobowymi szybkie oraz wiarygodne rozpoznanie czynnika etiologicznego niewątpliwie stanowi wyzwanie dla laboratorium mikrobiologicznego. Piśmiennictwo 1.Asnani J.: Persistent fever, left-sided neck pain, night sweats –Dx? J. Fam. Pract. 63, 193–196 (2014) 2.Azarko J., Wendt U.: Identyfikacja drobnoustrojów – porównanie metody biochemicznej i spektrometrii masowej. Diagnostyka Laboratoryjna, 47, 409–417 (2011) 3. Berardino M., Spanu T., i wsp. Empyema caused by Prevotella bivia complicating an unusual case of spontaneous chylothorax. J. Clin. Microbiol. 52, 1284–1286 (2014) 4. Berthold P.: Noma: a forgotten disease. Dent. Clin. North. Am. 47, 559–574 (2003) 5. Boutrin M.C., Wang C., Aruni W., Li X., Fletcher H.M.: Nitric Oxide Stress Resistance in Porphyromonas gingivalis is mediated by a putative hydroxylamine reductase. J. Bacteriol. 194, 1582–1592 (2012) 6.Brazier J.S.: Human infections with Fusobacterium necrophorum. Anaerobe, 206, 165–172 (2006) 7. Brook I.: Fusobacterial infections in children. Curr. Infect. Dis. Rep. 15, 288–294 (2013) 8. Brook I.: Microbiology of polymicrobial abscesses and implications for therapy. J. Antimicrob. Chemother. 50, 805–810 (2002) 9. Chukwu E.E., Nwaokorie F.O., Coker A.O.: A Review of Fusobacterium necrophorum infections in humans. Br. Microbiol. Res. J. 4, 480–496 (2014) 10. Culebras E., Rodriques-Avial I., Betriu C., Gomez M., Picazo J.J.: Rapid identification of clinical isolates of Bacteroides species by matrix-assisted laser-desorption/ionization time – of-flight mass spectrometry. Anaerobe, 18, 163–165 (2012) PAŁECZKI GRAM-UJEMNE BEZTLENOWO ROSNĄCE – DIAGNOSTYKA I ZNACZENIE KLINICZNE 11.De Bruyne K., Slabbinck B., Waegeman W., Vauterin P., De Baets B., Vandamme P.: Bacterial species identification from MALDI-TOF mass spectra through data analysis and machine learning. Syst. Appl. Microbiol. 34, 20–29 (2011) 12.Dembowska E., Wiernicka-Menkiszak M., Samulak-Zielińska R.: Uogólnione agresywne zapalenie przyzębia – diagnostyka, występowanie, etiopatogeneza. Dent. Med. Probl. 46, 55–62 (2009) 13.De Vos A.I., van Rossem R.N., van Elzakker E.P., Nijhuis-Heddes J.M., Maartense E.: Lemierre’s syndrome. Sepsis complicating an anaerobic oropharyngeal infection. Neth. J. Med. 59, 181–183 (2001) 14. Dorn B.R.: Invasion of Human Oral epithelial cells by Prevotella intermedia. Infect. Immun. 66, 6054–6057 (1998) 15. Eilbert W., Singla N.: Lemierre’s syndrome. Int. J. Emerg. Med. 6:40 doi:10.1186/1865-1380-6-40 (2013) 13.04.2015 16. Enwonwu C.O., Falkler W.A., Idigbe E.O.: Oro-facial gangrene (noma/cancrum oris): pathogenetic mechanisms. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11,159–171 (2000) 17. Finegold S.M.: Chapter 20. Anaerobic Gram-negative Bacilli (w) Medical Microbiology, red. Baron S. 4th edition. Galveston, 1996 18. Fourage M., Bourguignat C., Fermond B., Delobel P.: A recurrent tonsillitis. Lancet, 381, 266 (2013) 19. Fteita D., Könönen E., Söderling E., Gürsou U.K.: Effect of estradiol on planctonic growth, coaggregation, and biofilm formation of the Prevotella intermedia group bacteria. Anaerobe, 26, 7–13 (2014) 20. Galvão B.P., Weber B.W., Rafudeen M.S., Ferreira E.O., Patrick S., Abratt V.R. Identification of a Collagen Type I Adhesin of Bacteroides fragilis. PLoS One, 9, e91141 (2014) 21. Gomes B.P., Jacinto R.C., Pinheiro E.T., Sousa E.L., Zaia A.A., Ferraz C.C., Souza-Filho F.J.: Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens in endodontic lesions detected by culture and by PCR. Oral Microbiol. Immunol. 20, 211–215 (2005) 22. Guidelines for diagnosis and treatment of anaerobic infections. Chapter 1–1. Anaerobic infections (General): epidemiology of anaerobic infections. J. Infect. Chemother. 17 Suppl. 4–12 (2011) 23. Guidelines for diagnosis and treatment of anaerobic infections. Chapter 1–2. Anaerobic infections (general) testing anaerobic infections. J. Infect. Chemother. 17 Suppl. 13–25 (2011) 24. Guidelines for diagnosis and treatment of anaerobic infections Chapter 2–1. Anaerobic infections (individual fields): respiratory infections. J. Infect. Chemother. 17 Suppl. 42–46 (2011) 25. Guidelines for diagnosis and treatment of anaerobic infections. Chapter 2–6–2. Anaerobic infections (individual fields): femal genital infections. J. Infect. Chemother. 17 Suppl. 99–101 (2011) 26. Guidelines for diagnosis and treatment of anaerobic infections Chapter 2–10. Anaerobic infections (individual fields): dental and oral infections. J. Infect. Chemother. 17 Suppl. 112–115 (2011) 27. Guidelines for diagnosis and treatment of anaerobic infections Charter 2–11. Anaerobic infections (individual fields): otorhinolartngological infections. J. Infect. Chemother. 17 Suppl. 116–118 (2011) 28.Gwo-Jong H., Cheng-ren C., Mei-chu L., Shi-ping L.: Chest wall abscess due to Prevotella bivia. J. Zhejiang Univ. Sci B, 10, 233–236 (2009) 29.Han A., Lazarus G.S. i wsp.: The importance of a multifaceted approach to characterizing the microbial flora of chronic wounds. Wound Repair Regen. 19, 532–541 (2011) 30. Karabinas P.K., Stergios E.D., Athanasopoulou M.G.,Vlamis J.: Hematogenous Long Bone Osteomyelitis by Prevotella (Bacteroides) melaninogenicus. J. Clin. Med. Res. 2, 277–280 (2010) 31.Kato H., Taguchi Y., Tominaga K., Umeda M., Tanaka A.: Porphyromonas gingivalis LPS inhibits osteoblastic differen- 97 tiation and promotes pro-inflammatory cytokine production in human periodontal ligament stem cells. Arch. Oral Biol. 59, 167–175 (2014) 32. Kendall H.K., Haase H.R., Li H., Xiao Y., Bartold P.M.: Nitric oxide synthase type – II is synthesized by human gingival tissue and cultured human gingival fibroblasts. J. Periodont. Res. 34, 194–200 (2000) 33.Kierzkowska M., Majewska A., Kądzielska J., Rozpara A., Sawicka-Grzelak A., Młynarczyk G.: Udział beztlenowych Gram-ujemnych bakterii w zakażeniach hospitalizowanych pacjentów. Med. Dosw. Mikrobiol. 63, 235–240 (2011) 34. Kierzkowska M., Majewska A., Kuthan R.T., Sawicka-Grzelak A., Młynarczyk G.: A comparison of Api 20A vs MALDI-TOF MS for routine identification of clinically significant anaerobic bacterial strains to the species level. J. Microbiol. Methods, 92, 209–212 (2013) 35.Kierzkowska M., Majewska A., Sawicka-Grzelak A., Młynarczyk A., Ładomirska-Pestkowska K., Młynarczyk G.: Specyfika zakażeń bakteriami beztlenowymi na oddziałach chirurgicznych i ortopedycznych. Med. Dosw. Mikrobiol. 64, 29–34 (2012) 36.Kierzkowska M., Majewska A., Sawicka-Grzelak A., Młynarczyk G.: Beztlenowe ziarenkowce Gram-dodatnie (GPAC) – diagnostyka i znaczenie kliniczne. Post. Mikrobiol. 53, 35–42 (2014) 37.Kozłowski Z., Konopka T., Karolewska E., Kaczmarek U., Wnukiewicz J.: Ocena stężenia tlenków azotu w ślinie pacjentów chorych na raka płaskonabłonkowego błony śluzowej jamy ustnej i przewlekłe zapalenie przyzębia. Dent. Med. Probl. 46, 55–62 (2009) 38. Kuthan R.T., Chabros Ł., Sawicka-Grzelak A., Młynarczyk G.: Zastosowanie spektrometrii masowej MALDI-TOF w rutynowej medycznej diagnostyce bakteriologicznej. Zakażenia, 1, 87–90 (2013) 39. Lee E.H., Degener J.E., Welling G.W., Veloo A.C.M.: Evaluation of Vitek 2 ANC card for identification of clinical isolates of anaerobic bacteria. J. Clin. Microbiol. 49, 1745–1749 (2011) 40. Megged O., Assous M.V., Miskin H., Peleg U., Schlesinger Y.: Neurologic manifestations of Fusobacterium infections in children. Eur. J. Pediatr. 172, 77–83 (2013) 41. Młynarczyk G., Młynarczyk A.: Znaczenie diagnostyki mikrobiologicznej w rozpoznawaniu i terapii zakażeń bakteriami rosnącymi beztlenowo. Zakażenia, 3, 90–95 (2013) 42. Moreno S., Contreras A.: Functional differences of Porphyromonas gingivalis fimbriae in determining periodontal disease pathogenesis: a literature review. Colomb. Med. 44, 48–56 (2013) 43. Mysak J., Podzimek S., Sommerova P., Lyuya-Mi Y., Bartova J., Janatova T., Prochazkova J., Duskova J.: Porphyromonas gingivalis: Major Periodontopathic Pathogen Overview. J. Immunol. Res. DOI:10.1155/2014/476068 (2014) 44. Nagy E.: Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: a new possibility for the identification and typing of anaerobic bacteria. Future Microbiol. 9, 217–233 (2014) 45. Napora M., Krajewski J., Górska R.: Czy wiemy już wystarczająco dużo o związku chorób przyzębia z patologiami ogólnoustrojowymi? Nowa Stomatologia, 1, 3–33 (2010) 46. Okuda T., Kokubu E., Kawana T., Saito A., Okuda K., Ishihara K.: Synergy in biofilm formation between Fusobacterium nukleatum and Prevotella species. Anaerobe, 18, 110–116 (2012) 47.Palm E., Khalf H., Bengtsson T.: Porphyromonas gingivalis downregulates the immune response of fibroblasts. BMC Microbiology, 13, 155 (2013) 48.Papaparaskevas J., Katsandri A., Pantazatou A., Stefanou I., Avlamis A., Legakis N., Tsakris A.: Epidemiological characteristics of infections caused by Bacteroides, Prevotella and Fusobacterium species: A prospective observational study. Anaerobe, 17, 113–117 (2011) 98 MARTA KIERZKOWSKA, ANNA MAJEWSKA, ANNA SAWICKA-GRZELAK, GRAŻYNA MŁYNARCZYK 49. Pasich E., Walczewska M., Pasich A., Marcinkiewicz J.: Mechanizm i czynniki ryzyka powstawania biofilmu bakteryjnego jamy ustnej. Post. Hig. Med. Dosw. 67, 736–741 (2013) 50. Ramamurthy D., Pazhani G.P., Sarkar A., Nandy R.K., Rajendran K., Ramamurthy T.: Case-control study on the role of entero­toxigenic Bacteroides fragilis as a cause of diarrhea among children in Kolkata, India. PloS One, 8, e60622 (2013) 51.Roberts G.L.: Fusobacterial infections: an underestimated threat. Br. J. Biomed. Sci. 57, 156–162 (2000) 52. Sakamoto M., Benno Y.: Reclassification of Bacteroides distasonis, Bacteroides goldsteinii and Bacteroides merdae as Parabacteroides distasonis gen. nov., comb. nov., Parabacteroides goldsteinii comb. nov. and Parabacteroides merdae comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 1599–605 (2006) 53. Seng P., Rolain J.M., Fournier P.E., La Scola B., Drancourt M., Raoult D.: MALDI-TOF-mass spectrometry applications in clinical mikrobiology. Future Microbiol. 5, 1733–1754 (2010) 54. Sears C.L.: Enterotoxigenic Bacteroides fragilis: a rogue among symbiotes. Clin. Microbiol. Rev. 22, 349–369 (2009) 55. Sears C.L.: The toxins of Bacteroides fragilis. Toxicon, 39, 1737– 1746 (2001) 56. Sears C.L., Geis A.L., Housseau F.: Bacteroides fragilis subverts mucosal biology: from symbiont to colon carcinogenesis. J. Clin. Invest. 124, 4166–4172 (2014) 57. Singh A., Wyant T., Anaya-Bergman C., Aduse-Opoku J., Brunner J., Laine M.L., Curtis M.A., Lewis J.P: The capsule of Porphyromonas gingivalis leads to a reduction in the host inflammatory response, evasion of phagocytosis, and increase in virulence. Infect. Immun. 79, 4533–4542 (2011) 58.Shah H.N., Collins D.M.: Prevotella, a new genus to include Bacteroides melaninogenicus and related species formerly classified in the genus Bacteroides. Int. J. Syst. Bacteriol. 40, 205–208 (1990) 59. Słotwińska, S.M.: Mikrobiologia zapaleń przyzębia na podstawie piśmiennictwa i badań własnych. Cz. II: Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia. Nowa Stomatologia, 3, 151–154 (2005) 60. Song Y., Liu C., Mc Teague M., Finegold S.M.: 16S ribosomal DNA sequence-based analysis of clinically significant Gram-positive anaerobic cocci. J. Clin. Microbiol. 41, 1363–1369 (2003) 61. Stachowicz A.M., Łaniewski P., Jagusztyn-Krynicka E.K.: Wpływ toksyn bakteryjnych na proces nowotworzenia. Post. Biochemii, 56, 389–399 (2010) 62.Szulc M., Radwan-Oczko M.: Rola Porphyromonas gingivalis w miażdżycy tętnic. Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska, 1, 100–105 (2012) 63. Tempest M.N.: Cancrum oris. Br. J. Surg. 53, 949–969 (1966) 64. Wexler H.M.: Bacteroides: the good, the bed, and the nitty-gritty. Clin. Microbiol. Rev. 20, 593–621 (2007) 65.Wildeboer-Veloo A.C.M., Harmsen H.J.M., Welling G.W., Degener J.E.: Development of 16S rRNA-based probes for the identification of Gram-positive anaerobic cocci isolated from human clinical specimens. Clin. Microbiol. Infect. 13, 985–992 (2007) 66.Wożakowska-Kapłon B., Filipiak K.J., Opolski G., Górska R.: Związek chorób przyzębia z cukrzycą i nefropatią cukrzycową. Diabet. Prakt. 10, 72–75 (2009) 67.Wożakowska-Kapłon B., Filipiak K.J., Opolski G., Górska R.: Znaczenie opieki periodontologicznej u pacjentów ze schorzeniami sercowo-naczyniowymi. Kardiol. Pol. 67, 1125–1127 (2009) 68. Veloo A.C.M., Erhard M., Welker M., Welling G.W., Degener J.E.: Identification of Gram-positive anaerobic cocci by MALDI-TOF mass spectrometry. Syst. Appl. Microbiol. 34, 58–62 (2011) 69.Żabicka D., Literacka E.: Nowoczesne metody wykrywania i identyfikacji bakterii. Forum Zakażeń, 4, 65–72 (2013) P U B L I K AC J E M E TO DYC Z N E I STA N DA R DY POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 99–104 http://www.pm.microbiology.pl OCENA DZIAŁANIA CHEMICZNYCH PREPARATÓW DEZYNFEKCYJNYCH PRZEZNACZONYCH DO POWIERZCHNI Z ZASTOSOWANIEM METOD NOŚNIKOWYCH. DZIAŁANIE BAKTERIOBÓJCZE, DROŻDŻOBÓJCZE I SPOROBÓJCZE Patryk Tarka1*, Krzysztof Kanecki2, Krzysztof Tomasiewicz3 1 Zakład Medycyny Zapobiegawczej i Higieny, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 Zakład Opieki Zdrowotnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 Katedra i Klinika Chorób Zakaźnych, Uniwersytet Medyczny w Lublinie Wpłynęło we wrześniu 2015 r. Zaakceptowano w grudniu 2015 r. 1. Wprowadzenie. 2. Co obowiązuje dzisiaj? Metody zawiesinowe w ocenie działania bakterio/drożdzo/grzybo/sporobójczego chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni. 3. Co będzie obowiązywało? Metody nośnikowe w ocenie działania bakterio/ drożdżobójczego chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni. 4. Interakcje między materiałem chusteczki, a środkiem dezynfekcyjnym. 5. Przedłużony efekt działania preparatu dezynfekcyjnego. 6. Czas kontaktu preparatu dezynfekcyjnego z powierzchnią. 7. Perspektywy standaryzacji badań działania sporobójczego chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni z użyciem nośników. 8. Podsumowanie Evaluation of chemical agents intended for surface disinfection with the use of carrier methods. Bactericidal, yeasticidal and sporocidal activity Abstract: Disinfection of surfaces in medical facilities is an important element in the control of hospital infections, including these caused by bacteria, viruses and spores. Disinfecting agents need to exhibit specific characteristics, namely potential killing activity towards test bacteria which was determined experimentally in the laboratory. The methods in which a suspension of test bacteria is subject to the given agent are most often applied. However, the suspension methods do not fully imitate the conditions present in reality. Thus, in order to determine the concentrations of chemical disinfecting agents, carrier methods are applied. The new European standard i.e. EN 16615 Chemical disinfectants and antiseptics – Quantitative test method for the evaluation of bactericidal and yeasticidal activity on non-porous surfaces with mechanical action employing wipes in the medical area (4-field test) – Test method and requirements (phase 2, step 2), is a completely new standard for testing chemical surface disinfecting agents. It allows not only to assess the reduction in the number of test bacteria on the carrier, but also to examine possible interactions between the disinfecting agent and the material of which tissues and cloths are made. Additionally, it enables the evaluation of possible transfer of bacteria to adjucent areas via wiping. 1. Introduction. 2. What is obligatory today? Suspension-based tests used for the evaluation of antimicrobial activity of chemical products used for surface cleaning. 3. What will be obligatory? Carrier tests used for the antimicrobial activity evaluation of chemical products used for surface cleaning. 4. Interaction between the carrier material and the disinfectant 5. Prolonged effect of disinfectants. 6. Interaction time between the disinfectant and the surface. 7. Estimation of anti-spore activity of disinfectants used for surface cleaning. Perspectives of standardization. 8. Summary Słowa kluczowe: Key words: Aktywność bakteriobójcza, aktywność grzybobójcza, aktywność sporobójcza, metody zawiesinowe, metody nośnikowe. Norma Europejska EN 16615 Bactericidal activity, yeasticidal activity, sporicidal activity, suspension methods, carrier methods, European Standard EN 16615 1. Wprowadzenie W zapobieganiu zakażeniom szpitalnym kluczowe znaczenie ma prawidłowa dezynfekcja rąk. Jest to dogmat funkcjonujący od czasów Ignacego Semmelweissa potwierdzony wieloma badaniami klinicznymi [6, 29]. Natomiast dezynfekcja powierzchni za pomocą chemicznych preparatów dezynfekcyjnych stanowiła pewnego rodzaju element, który nie był poparty danymi naukowymi o zmniejszeniu się liczby zakażeń [5, 6, 9, 27], Nowe wyniki badań pozwalają wykazać, że powierzchnie kontaminowane drobnoustrojami stanowią istotną składową w przenoszeniu zakażeń szpitalnych [5, 6, 9, 27]. Skażone powierzchnie zwiększają ryzyko kontaminacji rąk, a sale skażone drobnoustrojami zwiększają ryzyko nabycia infekcji przez * Autor korespondencyjny: Zakład Medycyny Zapobiegawczej i Higieny, Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul. Oczki 3, 02-007 Warszawa; tel. (22) 621 51 97; e-mail: [email protected] 100 PATRYK TARKA, KRZYSZTOF KANECKI, KRZYSZTOF TOMASIEWICZ pacjenta [5, 6, 9, 27]. Drobnoustroje mogą przetrwać na powierzchniach nawet 5 miesięcy i nie dotyczy to tylko spor bakteryjnych ale także wegetatywnych form bakterii [8]. Na skuteczność procesu dezynfekcji składa się kilka czynników takich jak: sposób aplikacji preparatu (spryskiwanie, przecieranie), rodzaj powierzchni (porowata, nieporowata), rodzaj zanieczyszczenia (organiczne, nieorganiczne), temperatura i czasu kontaktu, a także wilgotność [6]. Preparat chemiczny stosowany do dezynfekcji powinien charakteryzować się określoną aktywnością przeciwdrobnoustrojową wyznaczoną w laboratorium. W Europie w tym względzie funkcjonują Normy EN opracowane przez Komitet Techniczny ds. dezynfekcji i antyseptyki nr 216 Europejskiego Komitetu Normalizacyjnego (CEN) [2, 18, 24]. W wyznaczaniu parametrów stężeń użytkowych chemicznych preparatów dezynfekcyjnych największe znaczenia mają metody nośnikowe, w których to zawiesinę drobnoustrojów testowych nanosi się na powierzchnię nośnika, suszy się i poddaje działaniu środka dezynfekcyjnego [24]. Metody zawiesinowe stosowane obecnie stanowią jedynie jeden z etapów badania chemicznych preparatów dezynfekcyjnych. Sytuacja ta uległa zmianie, gdyż została opracowana norma nośnikowa tzw. 4 obszarów stanowiąca podstawę Normy Europejskiej PN-EN 16615 [10]. Wyznaczone stężenia roztworów według tej normy będą stanowiły podstawę określania stężenia użytkowego chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni z użyciem czynnika mechanicznego. 2. Co obowiązuje dzisiaj? Metody zawiesinowe w ocenie działania bakterio/drożdzo/grzybo/ sporobójczego chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni Obecnie w przypadku oceny działania chemicznego preparatu dezynfekcyjnego przeznaczonego do powierzchni w zakresie działania bakteriobójczego została opracowana przez Komitet Techniczny 216 CEN norma PN-EN 13727+A1:2014 [14]. Jako organizmy testowe w tej normie stosuje się: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Enterococcus hirae [14]. W zakresie działania drożdżobójczego lub grzybobójczego została opracowana przez Komitet Techniczny CEN norma PN-EN 13624:2013 [11]. Organizmami testowymi w tej normie są: Candida albicans (działanie drożdżobójcze) i Candida albicans oraz Aspergillus brasiliensis (działanie grzybobójcze) [11]. W przypadku oceny działania chemicznego preparatu dezynfekcyjnego na prątki funkcjonuje zarówno do powierzchni jak i narzędzi norma PN-EN 14348:2006 [15]. Jako prątki testowe stosuje się: Mycobacterium terrae ATCC 15755 (działanie bójcze wobec prątków gruźlicy), oraz M. terrae i M. avium ATCC 15769 (działanie prątkobójcze) [15]. Jeszce trudniej sytuacja wygląda w sprawie oceny działania sporobójczego w obszarze medycznym. Norma europejska PN-EN 14347:2005 jest normą fazy 1 [16]. Normy fazy 1 służą wyłącznie badaniom wstępnym podczas projektowania chemicznych preparatów dezynfekcyjnych i nie służą wyznaczaniu stężeń użytkowych preparatów dezynfekcyjnych [16]. Funkcjonująca inna norma europejska PN-EN 13704:2004 [13], nie jest przeznaczona dla obszaru medycznego. Wadą metod zawiesinowych jest poddawanie zawiesiny testowych drobnoustrojów dużą objętością chemicznego preparatu dezynfekcyjnego. W takich warunkach zachodzi łatwiejszy kontakt drobnoustroju z dezynfektantem. Po wyznaczeniu parametrów stężenia w czasie reakcji preparatu dezynfekcyjnego z zawiesiną drobnoustrojów (faza 2 etap 1) należy sprawdzić czy tak wyznaczone parametry mogą być wykorzystane w warunkach rzeczywistych [24]. W tym celu należy przejść do metod nośnikowych (fazy 2 etapu 2). Było to dotychczas niemożliwe, ponieważ nie istniały odpowiednie normy fazy 2 etapu 2 (nośnikowe) do powierzchni z obszaru medycznego. 3.Co będzie obowiązywało? Metody nośnikowe w ocenie działania bakterio/drożdżobójczego chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni W 2004 zostały opublikowane [5] pierwsze wyniki badań dotyczące zastosowania nowej eksperymentalnej metody nośnikowej tzw. 4 obszarów do oceny działania chemicznych preparatów dezynfekcyjnych z użyciem organizmu testowego Staphylococcus aureus ATCC 6538. Testowi poddano preparaty z różnych grup chemicznych: pochodnych glikolu i czwartorzędowych soli amoniowych, alkiloamin, aldehydów, i związków nadtlenowych. Jako kontrolę stosowano czystą wodę oraz wodę z dodatkiem związku powierzchniowo czynnego (detergentu). Na podstawie wyników badań wykazano, że tylko preparaty oparte na bazie związków nadtlenowych i aldehydów nie powodowały rozprzestrzeniania się S. aureus na dalsze obszary testowe [5]. Na podstawie opisanej i testowanej metody w 2004 roku, został opracowany przez grupę roboczą pod kierunkiem prof. J. Gebela z Kliniki Uniwersyteckiej w Bonn, projekt normy europejskiej nośnikowej Pr EN 16615 pod nazwą: Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa zawiesinowa metoda określania działania bakteriobójczego oraz bójczego na grzyby drożdżopodobne na powierzchniach nieporowatych z wykorzystaniem działania mechanicznego 101 OCENA DZIAŁANIA CHEMICZNYCH PREPARATÓW DEZYNFEKCYJNYCH przy zastosowaniu przecierania w obszarze medycznym (badanie w 4 obszarach) – Metoda badania i wymagania (faza 2, etap 2) [6,10]. Jako organizmy testowe wybrano: S. aureus ATCC 6538, E. hirae ATCC 10541, P. aeruginosa ATCC 15442 i C. albicans ATCC 10231 [6,10]. Norma PN-EN 16615 [10] stanowi zupełnie nowy standard w Normach Europejskich. Po raz pierwszy w praktyce opracowano test symulujący badania skuteczności chemicznych preparatów dezynfekcyjnych z zastosowaniem czynnika mechanicznego – wycierania [6]. Nazwa „4 obszarów” pochodzi od tego, że w tym teście oceniana jest nie tylko skuteczność redukcji drobnoustrojów na zanieczyszczonej powierzchni testowanej, lecz również zdolność rozprzestrzeniania się drobnoustrojów na inne powierzchnie (obszary) nośnika [6]. Jest to bardzo ważne ponieważ jednym z celów zastosowania preparatu dezynfekcyjnego jest zapobieganie przenoszenia drobnoustrojów z jednej powierzchni na drugą podczas procedur dekontaminacji. Norma Europejska PN-EN 16615 [10] uwzględnia gotowe do użycia chusteczki, które są nasączone roztworem biobójczym (do rozcieńczania, lub produkty gotowe do użycia). Norma EN 16615 została przyjęta jako Polska Norma PN-EN 16615 w czerwcu 2015 roku [22]. 4. Interakcje między materiałem chusteczki, a środkiem dezynfekcyjnym W ostaniem czasie zainteresowanie u użytkowników budzi nowy sposób aplikacji chemicznych preparatów dezynfekcyjnych z użyciem nasączanych środkiem dezynfekującym chusteczek. Wynika to z dużej łatwości ich stosowania. Niestety pojawiły się nowe problemy dotyczące interakcji między składnikami substancji czynnych preparatów dezynfekujących z materiałem, z którego są wykonane chusteczki. Problem adsorbcji kationowych związków powierzch­niowo czynnych stosowanych jako dezynfektanty nie jest nowy. Już w latach 50 XX wieku zauważono, że niektóre materiały włókiennicze mogą reagować z dezynfektantami i zmniejszać ich stężenie użytkowe lub prowadzić do ich całkowitej inaktywacji [6]. Kationowe związki powierzchniowo czynne (czwartorzędowe związki amoniowe, alkiloaminy) jako grupa chemiczna są bardzo szeroko stosowane w dezynfekcji w praktyce medycznej, dlatego zagadnienia związane z ich inaktywacją przez materiały stosowane do procedury mycia i dezynfekcji są bardzo ważne. Charakter chemiczny kationowych detergentów powoduje, że mogą one reagować z materiałem z którego wykonane są chusteczki. Na podstawie opublikowanych wyników badań [1] stwierdzono, że materiał z którego są wykonane chu- Tabela I Adsorbcja chlorku benzalkoniowego przez różne materiały z których wykonane są chusteczki [1] Materiał chusteczki Adsorbcja chlorku benzalkoniowego (czwartorzędowy związek amoniowy) Celuloza – poliestr Do 61% Wiskoza, celuloza i mieszanka poliestru Do 54% Wiskoza Do 70% Poliester Do 7% steczki może adsorbować substancje czynne kationowych detergentów i zmniejszać ich stężenie, co może być powodem utraty aktywności bójczej (Tabela I). 5. Przedłużony efekt działania preparatu dezynfekcyjnego Test 4 obszarów umożliwia także ocenę przedłużonego działania środka dezynfekcyjnego. Efekt przedłużonego działania najbardziej widoczny jest w przypadku kombinacji czwartorzędowych związków amoniowych i alkiloaminy (czyli kationowych związków powierzchniowo czynnych), mniejszy dla aldehydów, a najmniejszy dla alkoholi, co wynika z ich lotności i szybkiej utraty aktywności [6]. Związki kationowe posiadając ładunek dodatni, adsorbują się na powierzchniach posiadających ładunki ujemne i modyfikują te powierzchnie w kierunku nadawania im właściwości biobójczych [19]. Plany higieny placówki medycznej powinny uwzględniać, gdzie potrzebne są środki dezynfekujące powierzchnię o przedłużonym działaniu i jakie są zagrożenia związane z ich stosowaniem. Jest to szczególnie ważne, gdy dezynfektanty są stosowane w niskich stężeniach, ponieważ istnieją dowody na to, że niskie ilości środka dezynfekującego mogą powodować rozwój oporności [6]. 6. Czas kontaktu preparatu dezynfekcyjnego z powierzchnią Bardzo ważnym elementem jest czas kontaktu preparatu dezynfekcyjnego z powierzchnią. Centrum Zwalczania i Zapobiegania Chorobom w Atlancie (CDC) zaleca/ aby czas działania preparatów do dezynfekcji powierzchni nie przekraczał 10–15 minut [22]. Argumentowane jest to faktem wysychania środka dezynfekcyjnego nawet w czasie krótszym niż 15 minut, a także wynikami badań sugerującymi znaczną redukcję drobnoustrojów w czasie kontaktu dezynfektanta z powierzchnią od 30 do 60 sekund [22, 23, 28]. Należy jednak mieć na uwadze, że redukcja dotyczy najczęściej wegetatywnych form bakterii i drożdży. Prątki, a także wirusy wymagają dłuższego czasu kontaktu 102 PATRYK TARKA, KRZYSZTOF KANECKI, KRZYSZTOF TOMASIEWICZ z dezynfektantem aby ulec wymaganej redukcji. Inne stanowisko prezentowały Niemcy. Czas działania preparatów dezynfekcyjnych do powierzchni mógł wynosić nawet do 4 godzin [9]. Argumentowane było to faktem, że nawet jeśli dezynfekowana powierzchnia wyschnie, proces dezynfekcji trwa nadal, bo drobnoustroje zaabsorbowały odpowiednią ilość środka dezynfekującego podczas fazy mokrej (kiedy powierzchnia była zwilżona preparatem) [9]. Nie dotyczy to preparatów alkoholowych, które bardzo szybko odparowują i nie mają przedłużonego działania [6]. Test 4 obszarów zdaje się potwierdzać zalecenia niemieckich wytycznych. Preparat może wykazywać działanie bójcze nawet kiedy powierzchnia dezynfekowana jest już wizualnie sucha (wcześniej oczywiście musi być zwilżona odpowiednią ilością preparatu dezynfekującego) [9]. Stanowisko CEN dotyczące maksymalnego czasu działania chemicznych preparatów dezynfekcyjnych na powierzchniach znajdujemy w normie dotyczącej określania działania bakteriobójczego PN-EN 13727+A1:2014 [14], oraz normie dotyczącej określania aktywności wirusobójczej PN-EN 14476:2013 [18]. Dla tzw. powierzchni dotykowych czas działania preparatu powinien wynosić maksimum 5 minut, a dla pozostałych powierzchni – do 60 minut. Preparaty dezynfekcyjne przeznaczone do dużych powierzchni o długich czasach działania zwykle stosowane są w niskich stężeniach, co ma przełożenie w ekonomicznym gospodarowaniu preparatem dezynfekcyjnym, a także zmniejsza ryzyko uszkodzenia dezynfekowanej powierzchni przez środek dezynfekujący w wysokim stężeniu ale o szybkim czasie działania. 7. Perspektywy standaryzacji badań działania sporobójczego chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni z użyciem nośników Preparaty o działaniu sporobójczym mają duże znaczenie w opiece zdrowotnej ze względu na zapotrzebowanie na produkty, które skutecznie zabijają przetrwalniki Clostridium difficile. C. difficile występuje obecnie w Polsce jako numer jeden w przypadku szpitalnych ognisk epidemicznych [7]. Podobnie jak w przypadku testowania chemicznych preparatów dezynfekcyjnych metodami zawiesinowymi wobec bakterii grzybów czy wirusów, również w ocenie działania sporobójczego pojawia się problem niedostatecznej symulacji warunków panujących w praktyce. Dlatego dąży się do tego aby działanie sporobójcze było wyznaczone metodami nośnikowymi. Przykładem takiej metody, którą można się posłużyć aby ocenić aktywność sporobójczą preparatu jest norma PN-EN 13697:2015-06 [12]. Jest to norma doty- czącą badania aktywności bakterio i grzybobójczej w obszarze niemedycznym ale zastosowaniem metalowych nośników. Na wymienionych w normie nośnikach można zaszczepić spory C. difficile. Niektórzy producenci sporobójczych preparatów dezynfekcyjnych podają parametry działania sporobójczego właś­ nie z użyciem tej normy [25]. W 2008 roku opublikowano wyniki badań działania sporobójczego względem spor C. difficile rybotyp 027 oraz szczepu C. difficile ATCC 9689 z zastosowaniem metody nośnikowej 4 obszarów z użyciem czynnika mechanicznego [3]. Potwierdziły one pogląd, że preparaty aktywne wobec spor w teście zawiesinowym, nie osiągają wymaganego poziomu redukcji spor w teście nośnikowym z zastosowanemu metody 4 obszarów z użyciem czynnika mechanicznego. Na podstawie badań z użyciem metody nośnikowej z zastosowaniem 4 obszarów wykazano, że skuteczne działanie sporobójcze wykazywały preparaty myjąco-dezynfekujące na bazie generowanego kwasu nadoctowego z adduktów nadtlenku wodoru (nadwęglan sodu) z donorami grupy acetylowej w postaci tetraacetylenidiaminy (TAED). Aktywne były także niektóre preparaty na bazie aldehydu glutarowego z tym, że wymagają one długiego czasu działania (nawet 8 godzin). Działanie sporobójcze wykazywał także preparat myjąco dezynfekujący na bazie aktywnego chloru z substancją czynną dichloroizocyjanuranem sodu (NaDCC) o stężeniu 10 000 ppm aktywnego chloru. Z kolei preparat dezynfekcyjny z tą samą substancją aktywną (NaDCC) i o tym samym stężeniu, ale bez dodatku związku powierzchniowo czynnego (detergentu) nie wykazywał wymaganej redukcji spor w metodzie 4 obszarów [3]. Związki powierzchniowo czynne zawarte w prepara­ tach myjąco-dezynfekujących ułatwiają zwilżenie dezynfekowanych powierzchni, obniżają napięcie powierzchniowe i ułatwiają penetracje czynnika bójczego do drobnoustrojów. Muszą być one jednak odpowiednio dobrane pod względem chemicznym, tak aby nie dochodziło do inaktywacji substancji czynnej. W przypadku preparatów na bazie aktywnego chloru zawierających dichloroizocyjanuran sodu nie można ich łączyć z kationowymi związkami powierzchnio czynnymi i nie­ którymi niejonowymi, ze względu na rozkład kwasu podchlorawego odpowiedzialnego za działanie bójcze. Przyjęcie testu nośnikowego „4 obszarów” dla oceny działania sporobójczego jako Normy Europejskej zaproponowali Gebel i Gemein w 2011 roku [6]. 7. Podsumowanie Normy nośnikowe w sposób możliwie najwierniejszy symulują warunki zachodzące podczas dezynfekowania powierzchni. Dużą nowością, niespotykaną OCENA DZIAŁANIA CHEMICZNYCH PREPARATÓW DEZYNFEKCYJNYCH wcześniej jest test nośnikowy 4 obszarów, zawarty w normie PN-EN 16615 [10], który łączy w sobie kilka elementów. Po pierwsze pozwala zbadać stopień redukcji biologicznych czynników na powierzchni z użyciem czynnika chemicznego i mechanicznego, określić czy preparat ma działanie przedłużone a tym samym może być stosowany w czasach działania nawet 1 godziny, a także określić przeniesienie drobnoustrojów na inne powierzchnie podczas procesu dezynfekcji. Metody nośnikowe CEN zamierza włączyć także do badania aktywności wirusobójczej preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni. Komitet Techniczny 216 CEN opracował w tym zakresie projekt normy badania aktywności wirusobójczej z użyciem metod nośnikowych Pr EN 16777 [20] „Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa powierzchniowa metoda określania wirusobójczego działania chemicznych środków dezynfekcyjnych stosowanych w obszarze medycznym na nieporowatych powierzchniach, bez działania mechanicznego – Metoda badania i wymagania (faza 2/etap 2)”. Wirusami testowymi w tej normie są: adenowirus typ 5 szczep (AdV-5) Adenoid 75, oraz mysi norowirus (MNV) szczep S99 [20]. Ponieważ ręce są najczęstszym wektorem przenoszenia zakażeń w tym wirusowych w placówkach medycznych, skuteczna ich dezynfekcja jest bardzo istotna. Z uwagi na to, że testy metodami zawiesinowymi nie odzwierciedlają w pełni warunków występujących w praktyce Komitet Techniczny ds. dezynfekcji i antyseptyki nr 216 Europejskiego Komitetu Normalizacyjnego rozpoczął w dniu 8.12.2014 projekt pod nazwą: „Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – wirusobójcze działanie preparatów do higienicznej dezynfekcji rak metodą wcierania – Metoda badania i wymagania (faza 2/etap 2)” [4]. Celem projektu będzie wytypowanie odpowiednich wirusów testowych, oraz metod nośnikowych z użyciem rąk ochotników. Parametry stężeń użytkowych chemicznych preparatów dezynfekcyjnych uzyskane za pomocą metod nośnikowych są wielokrotnie większe niż w przypadku metod zawiesinowych, ale gwarantują odpowiedni stopień redukcji liczby drobnoustrojów na dezynfekowanych powierzchniach. Piśmiennictwo 1. Bloß R., Meyer S., Kampf G.: Adsorption of active ingredients from surface disinfectants to different types of fabrics. J. Hosp. Infect. 75, 56–61 (2010) 2.Bocian E., Tyski S.: 3.8. Metody badania środków dezynfekcyjnych. 3.8.1. Normy europejskie wprowadzone do katalogu polskich norm (PN-EN), w „Higiena w placówkach opieki medycznej” red. E. Lejbranndt, A. Tymoczko, Verlag Dashofer Sp. z o.o. Warszawa (2014) 3. Buttgen S., Gebel J., Rheinbaben F.V, Hornei B., Engelhart S., Exner M.: Efficacy of surface and instrument disinfectants with 103 sporicidal claims against spores of Clostridium difficile ribotype 027. Hyg. Med. 33, 194–200 (2008) 4.Chemical disinfectants and antiseptics – Virucidal Hygienic handrub – Test method and requirements (phase 2/step 2) http://standards.cen.eu ( 27.11.2015) 5. Exner M., Vacata, V., Hornei B., Dietlein E., and Gebel J.: Household cleaning and surface disinfection: new insights and strategies. J. Hosp. Infect. 56, 70–75 (2004) 6. Gebel J., Exner M., French G. i inni.: The role of surface disinfection in infection prevention. GMS Hyg. Infect. Control. 8, 1–12 (2013) 7. Główny Inspektor Sanitarny. Stan sanitarny kraju w 2014 roku. 8.Kramer A., Schwebke I., Kampf G: How long do nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? A systematic review. BMC Infect. Dis. 6, 130–137 (2006) 9. Meyer B.: Dezynfekcja powierzchni zmywalnych w nieożywionym środowisku pacjenta – czy dzięki temu można zmniejszyć częstość występowania zakażeń szpitalnych? Zakażenia, 3, 23–28 (2009) 10. PN-EN 16615 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa metoda określania działania bakteriobójczego oraz bójczego na grzyby drożdżopodobne na powierzchniach nieporowatych z wykorzystaniem działania mechanicznego przy zastosowaniu przecierania w obszarze medycznym (badanie w 4 obszarach) – Metoda badania i wymagania (faza 2, etap 2). 11. PN-EN 13624:2013 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa metoda określania działania grzybobójczego lub działania bójczego na grzyby drożdżopodobne w obszarze medycznym – Metoda badania i wymagania (faza 2, etap 1). 12. PN-EN 13697:2015-06 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa metoda określania, na nieporowatych powierzchniach, działania bakteriobójczego i/lub grzybobójczego chemicznych środków dezynfekcyjnych stosowanych w sektorze żywnościowym, warunkach przemysłowych i domowych oraz zakładach użyteczności publicznej – Metoda badania (bez działania mechanicznego) i wymagania (faza 2/etap 2) 13. PN-EN 13704:2004 Chemiczne środki dezynfekcyjne – Ilościowa zawiesinowa metoda określania działania sporobójczego chemicznych środków dezynfekcyjnych stosowanych w sektorze żywnościowym, warunkach przemysłowych i domowych oraz zakładach użyteczności publicznej – Metoda badania i wymagania (faza 2, etap 1) 14. PN-EN 13727+A1:2014 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa zawiesinowa metoda określania bakteriobójczego działania w obszarze medycznym – Metoda badania i wymagania (faza 2, etap 1) 15. PN-EN 14348:2006 P Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa zawiesinowa metoda określania prątkobójczego działania chemicznych środków dezynfekcyjnych stosowanych w obszarze medycznym, w tym środków do dezynfekcji narzędzi – Metoda badania i wymagania (faza 2, etap 1). 16. PN-EN 14347:2005 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Podstawowe działanie sporobójcze – Metoda badania i wymagania (faza 1, etap 1) 17.PN-EN 14476+A1:2015-10 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa zawiesinowa metoda określania wirusobójczego działania w obszarze medycznym – Metoda badania i wymagania (Faza 2/Etap 1) 18. PN-EN 14885:2008P Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Zastosowanie Norm Europejskich dotyczących chemicznych środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych 19. Przondo J.: „Związki powierzchniowo czynne i ich zastosowanie w produktach chemii gospodarczej”. Wyd. Politechniki Radomskiej, Radom, (2007) 20. prPN-prEN 16777E Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne – Ilościowa powierzchniowa metoda określania wirusobójczego 104 PATRYK TARKA, KRZYSZTOF KANECKI, KRZYSZTOF TOMASIEWICZ działania chemicznych środków dezynfekcyjnych stosowanych w obszarze medycznym na nieporowatych powierzchniach, bez działania mechanicznego – Metoda badania i wymagania (faza 2/etap 2) 21. Polski Komitet Normalizacyjny https://pzn.pkn.pl/kt296 (27.11. 2015) 22. Rutala W. A, Weber D. J,: Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee. CDC Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities, (2008) 23.Rutala WA, Barbee SL, Aguiar NC, Sobsey MD, Weber DJ.: Antimicrobial activity of home disinfectants and natural products against potential human pathogens. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 21, 33–38 (2000) 24.Tadeusiak B.: Rynek preparatów dezynfekcyjnych w Polsce a ocena ich działania na mikroorganizmy. Aseptyka, 3, 3–5 (2003) 25. Tarka P.: Eradykacja Clostridium difficile ze środowiska szpitalnego – przegląd skutecznych metod. Zakażenia, 5, 37–44 (2015) 26.Tyski S.: Jakich badań aktywności przeciwdrobnoustrojowej powinno się wymagać od wytwórców preparatów antyseptycznych i dezynfekcyjnych z obszaru medycznego. Zakażenia, 4, 9–15 (2007) 27.Weber D.J, Rutala W.A., Miller M.B, Huslage K., Sickbert-Bennett E.: Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. Am. J. Infect. Control. 38, 25–33 (2010) 28. Weber D.J., Rutala W. A. Role of environmental contamination in the transmission of vancomycin-resistant enterococci. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 18, 306–309 (1997) 29. World Health Organization., WHO Patient Safety. WHO guidelines on hand hygiene in health care. Geneva (2009) INFORMACJA DLA AUTORÓW Postępy Mikrobiologii zamieszczają artykuły przeglądowe ze wszystkich dziedzin mikrobiologii nie drukowane w innych czaso­ pismach, prace przeglądowe metodyczne oraz w dziale Nowości Wydawniczych recenzje nowych książek z zakresu mikrobiologii i nauk pokrewnych, które ukazują się w Polsce. Artykuły i ilustracje drukowane w Postępach Mikrobiologii nie mogą być bez zgody Redakcji publikowane w innych periodykach. 1.Sposób przygotowania manuskryptu 1.1. Tekst. 1.2. Ilustracje i tabele. 1.3. Piśmiennictwo. 1.4. Cyto wanie danych z sieci internetowej 2.Prawa autorskie 3.Zalecenia szczegółowe 3.1. Nazewnictwo drobnoustrojów. 3.2. Nomenklatura genetyczna 3.3. Skróty nazw chemicznych. 3.4. Pisownia danych numerycz nych. 3.5. Pisownia substancji znakowanych izotopami 4.Proces recenzowania 5.Sposób przygotowania i nadesłania manuskryptu 6.Uwagi dodatkowe 1. Sposób przygotowania manuskryptu 1.1. Tekst Prace należy przysyłać do Redakcji w postaci elektronicznego zapisu tekstu w edytorze Microsoft Word dowolnej edycji w wersji PL jako załącznik poczty elektronicznej. Objętość pracy nie powinna przekraczać wraz z piśmiennictwem i ilustracjami 30 stron (wielkość czcionki 12, odstęp pomiędzy wierszami 1,5). Po tytułach wydzielonych nie należy stawiać kropek. Na oddzielnej stronie (strona tytułowa) należy podać tytuł pracy, pod nim w pełnym brzmieniu imiona i nazwiska autorów, adresy autorów i afiliacje, telefony oraz e-mail z zaznaczeniem autora korespondencyjnego, spis treści (tytuły poszczególnych rozdziałów) oraz kilka (nie więcej jak pięć) słów kluczowych (keywords). Tytuł pracy, spis treści i słowa kluczowe należy powtórzyć w języku angielskim. Słowa kluczowe mogą bądź nie pojawiać się w tytule pracy – należy je podać w porządku alfabetycznym. Na oddzielnej stronie za stroną tytułową należy dołączyć krótkie streszczenie pracy w języku angielskim (maksymalnie 250 słów). Tekst pracy powinien być zgodny z zaleceniami szczegółowymi Redakcji. Praca powinna kończyć się krótkim podsumowaniem, zawierającym najistotniejsze elementy treści. W przypadku prac kierowanych do działu „Publikacje metodyczne i standardy” prace przygotowane wg. wyżej wymienionych wytycznych należy przesłać na adres Redaktora Działu. Przesłane do redakcji prace winny być napisane poprawną polszczyzną. Redakcja rekomenduje P.T. Autorom Słownik Poprawnej Polszczyzny (Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa) jako pomoc w redagowaniu tekstu. Jakkolwiek Postępy Mikrobiologii są polsko­ języczne, nie wyklucza się druku prac napisanych po angielsku. 1.2. Ilustracje i tabele Tabele i rysunki powinny być dostarczone jako osobne pliki. Maksymalne rozmiary rysunków i tabel planowanych w artykule w jednej szpalcie nie powinny przekraczać szerokości 82 mm, a zaplanowanych w obszarze dwóch szpalt – 169 mm. Dozwolona wysokość grafik wynosi 246,6 mm. W manuskrypcie nie należy pozostawiać wolnych miejsc na tabele, rysunki i zdjęcia, a tylko w tekście zaznaczyć miejsce, w którym powinny być umieszczone, np. tab. I, rys. 1. Liczbę rysunków i tabel należy ograniczyć do istotnie niezbędnej ilości. Te same wskazówki odnoszą się do pojedynczych wzorów chemicznych. Każda tabela powinna być oznaczona kolejnym numerem rzymskim oraz mieć nagłówek opisujący jej treść. Na osobnej kartce należy załączyć spis z objaśnieniami jakie powinny się znaleźć pod rysunkami lub z uwagą „objaśnienia w tekście”. Podpisy pod wykresami, rysunkami, zdjęciami należy umieścić na osobnej stronie. Pliki cyfrowe zawierające ilustracje akceptowane do druku należy przygotować zgodnie z zaleceniami Redakcji. Ilustracje we wstępnej wersji artykułu przeznaczonej dla recenzentów mogą być dostarczone jako dowolne pliki graficzne lub tekstowe, ale w wersji ostatecznej do druku powinny być dostarczone jako pliki TIFF albo EPS. Grafiki należy przesyłać w ich naturalnym planowanym formacie, aby nie istniała konieczność ich powiększania lub zmniejszania w Wydawnictwie. Minimalna rozdzielczość stosowana w ilustracjach powinna wynosić 300 dpi dla zdjęć szarych i kolorowych, 600 dpi dla liter i 1200 dpi dla linii w wykresach. Kolorowe ilustracje muszą pozostawać także w systemie CMYK jako obrazy CMYK TIFF o rozdzielczości 300 dpi. Wydawca pobiera opłatę za wydruk kolorowych ilustracji. Pliki pochodzące z programu Microsoft Office (Power Point, Word) akceptowane są jedynie w wersji ilustracji czarno białej. Wszystkie rysunki (oprócz czarno białych z MS Office) wyeksportowane do formatu bitmapy muszą być zachowane w skali szarości albo w systemie CMYK (Cyan, Magenta, Yellow, blacK). Nie należy stosować zapisu w systemie RGB (Red, Green, Blue). Obrazy stonowane (zróżnicowanie gęstości lub cienie) muszą być sporządzone w skali szarości (nie używać bitmapy). Redakcja nie akceptuje kolorowych ilustracji wykonanych w Microsoft Office ponieważ są one zapisane w systemie RGB. Wszystkie ostateczne napisy, oznaczenia czy też klucze oznaczeń muszą być wprowadzone do rysunków. Każdy rysunek musi być dołączony jako osobny plik, a rysunki wielo panelowe muszą być podane w jednym pliku. Aby uniknąć problemu z różnymi fontami Redakcja zaleca stosowanie następujących czcionek: Times New Roman, Times New Roman Pl, Arial, Arial Pl oraz Symbol. W celu szczegółowej informacji proszę wysyłać zapytanie przez e-mail na adres sekretarza redakcji. 1.3. Piśmiennictwo Cytowaną literaturę (Piśmiennictwo) należy wpisać oddzielnie jako ostatnie strony manuskryptu, wymieniając pozycje w kolej­ ności alfabetycznej. W wykazie powinny być podane kolejno: liczba porządkowa, nazwisko autora, pierwsze litery imion, nazwiska współautorów pracy i pierwsze litery ich imion (w kolejności podanej w cytowanej pracy), pełny tytuł cytowanej pracy, skrócony tytuł czasopisma (w przypadku nieskracalnych nazw [1] stawiamy za nazwą przecinek, natomiast za każdym skróconym członem nazwy kropkę [2]), tom, strona, i rok wydania (w nawiasie), np.: 1.Adams G.M., Blumenthal R.M.: Gene pvuIIW: a possible modulator of PvuII endonuclease subunit association. Gene, 157, 193–199 (1999) 2.Beld J., Woycechowsky K.J., Hilvert D.: Diselenides as universal oxidative folding catalysts of diverse proteins. J. Biotechnol. 150, 481–489 (2010) 106 INFORMACJA DLA AUTORÓW Lista stosowanych nazw i skrótów czasopism znajduje się w bazie Journal Title Abbreviations – Web of Science. W przypadku gdy liczba współautorów pracy przekracza 10 (przytoczona poniżej praca jest dziełem 42 autorów), należy podać nazwiska i inicjały pierwszego oraz ostatniego współautora a następnie dodać uwagę i wsp., np.: 1.Tomb J.F., Venter J.C. i wsp.: The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 338, 539–543 (1997) Cytacje prac z czasopism ukazujących się tylko w sieci internetowej powinny zawierać następujące dane: liczba porządkowa, nazwisko autora, pierwsze litery imion, nazwiska współautorów pracy i pierwsze litery ich imion (w kolejności podanej w cytowanej pracy), pełny tytuł cytowanej pracy, skrócony tytuł czasopisma, tom, strona (lub jej odpowiednik [1]), i rok wydania (w nawiasie). W przypadku, gdy wydawnictwo nie stosuje numeracji stron [2], należy podać numer DOI, np.: 1.Esberg A., Muller L.A., McCusker J.H.: Genomic structure of and genome-wide recombination in the Saccharomyces cerevisiae S288C progenitor isolate EM93. PloS One, 6, e25211 (2011) 2.Stachowiak R., Łyżniak M., Budziszewska B.K., Roeske K., Bielecki J., Hoser G., Kawiak J.: Cytotoxicity of bacterial metabolic products, including Listeriolysin O, on leukocyte targets. J. Biomed. Biotechnol. DOI:10.1155/2012/954375 (2012) Dla cytowanych wydawnictw nieperiodycznych należy podać kolejno: nazwisko i pierwsze litery imion autora lub współautorów, tytuł dzieła, wydawnictwo, miejsce i rok wydania. W przypadku odwoływania się do artykułu w pracy zbiorowej, np. rozdziału w książce [2], należy dodatkowo podać tytuł tej pracy oraz nazwisko jej redaktora, wydawnictwo, miejsce wydania, rok, tom oraz na końcu stronę, np.: 1.Boulton R.B., Singleton V.L, Bisson L.F., Kunkee R.E.: Principles and practices of winemaking. Chapman Hall, New York, 1996 2.Portnoy D.A., Sun A.N., Bielecki J.E.: Escape from the phago­ some and cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes (w) Microbial Adhesion and Invasion, red. M. Hook, L. Świtalski, Springer, New York, 1992, s. 85–94 Powoływanie się w tekście na pozycje cytowanej literatury następuje przez wymienienie liczby porządkowej w nawiasach, np. [10], [10–12], [10, 25]. Ze względu na możliwość zmian w piśmiennictwie podczas procesu recenzowania artykułów, Redakcja dopuszcza stosowanie tymczasowych odnośników. Wewnątrz nawiasów kwadratowych można wziąć w okrągły nawias odnośnik w dowolnym formacie, np. [(Adams i wsp.)]. Po uzyskaniu akceptacji artykułu należy zamienić formatowanie odnośników na docelowe. Liczba cytowań w piśmiennictwie nie może przekraczać 100 pozycji. 1.4. Cytowanie danych z sieci internetowej Preferowane jest cytowanie informacji pochodzących z prac oryginalnych wydawanych przez uznane w środowisku naukowym oraz recenzowane czasopisma. Redakcja będzie również uznawać cytacje informacji ze źródeł autoryzowanych przez uznane w środowisku autorytety z dziedziny nauk przyrodniczych. Warunkiem koniecznym przy użyciu informacji ze strony internetowej jest sprawdzenie i aktualizacja zapisu informacyjnego na stronie WEB w dniu wysyłania pliku. W przypadku niewłaściwego adresu i niemożliwości odtworzenia informacji z sieci komputerowej, prace będą zwracane autorom. Cytowanie informacji publikowanej na stronach sieci internetowej powinno wyglądać następująco: autorzy (jeśli są znani [1]) lub nazwa organizacji (wydawca strony [2]), tytuł artykułu, nazwa strony (jeśli nie została już wcześniej podana), data publikacji (jeśli została podana [3]), adres www, data ostatniego sprawdzenia adresu np.: 1.Harmon K.: Ancient “Fossil” virus shows infection to be millions of years old. Scientific American, http://www.scientificamerican.com/article/fossil-virus-bird-genome (31.12.2015) 2.World Health Organization: Poliomyelitis, http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs114/en (06.03.2014) 3.World Health Organization: What we know about transmission of the Ebola virus among humans. Ebola situation assessment, 06.10.2014, http://www.who.int/mediacentre/news/ebola/06-october-2014 (31.12.2015) 2. Prawo autorskie W polskim prawodawstwie autorskie prawo osobiste interesujące szczególnie autorów Postępów Mikrobiologii oraz autorskie prawo majątkowe reguluje Ustawa z dn. 4-tego lutego 1994 r. (Dz.U. Nr 90, poz. 631 ze zm.). Autorskie prawo osobiste, zwane dalej w Informacji dla Autorów prawem autorskim dotyczy niemajątkowych interesów twórcy związanych z danym utworem oraz określa zasady ochrony więzi twórcy z utworem. Do praw tych między innymi należy: • prawo do autorstwa utworu – wyrażające m.in. zakaz „przywłaszczania” utworu przez inne niż twórca osoby (zakaz dokonywania plagiatów) • prawo do oznaczenia utworu swoim nazwiskiem albo udostępnienia utworu anonimowo • prawo do nienaruszalności treści i formy utworu oraz jego rzetelnego wykorzystania. Konieczność ochrony Autorskich praw osobistych innych Autorów przez Redakcję Postępów Mikrobiologii obliguje nas do przyjęcia następującej procedury: (a)Reprodukcja utworów wytworzonych przez innych Autorów w pracy własnej, przesłane do opublikowania w P.M. tj. cudzych rysunków lub tabel – pochodzących z oryginalnej, pierwotnej pracy innego Autora/twórcy – bądź cytowanie fragmentów cudzego tekstu, wymaga od Autorów P.M. wcześ­ niejszego uzyskania przez nich pisemnej zgody od Autorów pierwotnej pracy lub Wydawnictwa (z której materiały te po chodzą) na ich reprodukcję. Zgodę tę w formie oryginalnego zaświadczenia należy przysłać wraz z materiałami reprodukowanymi do Redakcji P.M. •Pod cytowanym rysunkiem należy w opisie podać nazwisko pierwotnego Autora, pełną bibliografię pracy z której pochodzi rysunek oraz informację o zgodzie Wydawnictwa lub Autora na jego reprodukcję. •Cytowany tekst powinien być wyraźnie oznaczony w odpowiednim miejscu manuskryptu, zaś u dołu strony powinna być zamieszczona informacja dotycząca pochodzenia cytatu oraz uzyskanej zgody na przedruk. (b)Dozwolone jest wprowadzanie zmian w cytowanych rysunkach innych Autorów/twórców pod warunkiem każdorazowego uzyskania ich zgody (lub osób upoważnionych przez nich) na dokonanie takich zmian. Zmiany w oryginalnych rysunkach mogą wynikać z chęci Autorów P.M. do dokonania nowego opracowania lub nowego przedstawienia omawianego przez siebie zagadnienia. W tych przypadkach wskazane jest, aby zgoda twórcy wskazywała na zakres dokonywanych zmian, gdyż pozwoli to uniknąć wątpliwości odnośnie zakresu wyrażonej tak zgody. Wreszcie konieczność uzyskania zgody pierwotnego Autora/twórcy na dokonanie zmian w reprodukowanym rysunku wynika z możliwości ingerencji Autorów P.M. w autorskie prawo osobiste w postaci nienaruszalności formy i treści utworu oraz jego rzetelnego wykorzystania. (c) Warunkiem przyjęcia przez Redakcję P.M. manuskryptu pracy oraz poddania jej dalszej procedurze wydawniczej jest złożenie wraz z manuskryptem Oświadczenia dotyczącego praw autorskich. INFORMACJA DLA AUTORÓW 3. Zalecenia szczegółowe* 3.1. Nazewnictwo drobnoustrojów Należy stosować dwuczłonowe nazwy zawierające nazwę rodzajową oraz gatunkową (np. Escherichia coli). Nazwy rodzajowe mogą być użyte same tj. bez nazwy gatunkowej, natomiast nie można użyć samych tylko nazw gatunkowych. Gdy w pracy podaje się pierwszy raz nazwę gatunku, musi ona składać się z pełnych wyrazów, przy ponownym użyciu tej nazwy, podaje się tylko pierwszą literę nazwy rodzajowej (zawsze dużą ) oraz nazwę gatunkową w pełnym brzmieniu np. E. coli. Nazwy gatunku, rodziny, rzędu, klasy, działu oraz królestwa należy pisać kursywą. Informacje szcze­gółowe dotyczące pisowni oraz prawidłowego nazewnictwa (zgodnego z wymogami współczesnej systematyki ) – przyjęte przez Redakcję Postępów Mikrobiologii, za instrukcją ASM – można znaleźć w Instructions to Authors, J. Bacteriol. Zgodnie z propozycjami WHO – Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella (“Antigenic Formulas of the Salmonella Serovars” (M.Y. Popoff i L. Le Minor, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France, 1997) and “Identification and Serotyping of Salmonella and an Update of the Kaufmann-White Scheme” (A.C. McWhorter-Murlin and F.W. Hickman-Brenner, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.) do rodzaju Salmonella należą tylko dwa gatunki tj. S. enterica i S. bongori – pierwszy z nich podzielony został na 6 podgatunków. Stosowane dotychczas zwyczajowe nazwy, nie posiadające statusu taksonomicznego, takie jak serotyp, typ serologiczny, zostały zastąpione nazwą serowaru (w oryginale serovar, sv.). Nazwę serowaru należy pisać dużą literą oraz prostym pismem (np. Typhi, Paratyphi B, Typhimurium itp.). Zgodnie z powyższym, nazwę pierwszego podgatunku rodzaju Salmonella można zapisać: S. enterica subsp. enterica ser. Typhimurium lub Salmonella subsp. I. ser. Typhimurium, bądź po prostu, Salmonella Typhimurium. 3.2. Nomenklatura genetyczna Właściwości genetyczne szczepu opisywane są w terminach fenotypu oraz genotypu. Fenotyp opisuje obserwowane właści­ wości organizmu. Genotyp określa genetyczną strukturę organizmu, zwykle odnosi się do szczepu dzikiego. Ww. określenia są bliżej objaśnione w pracy Demerec i wsp.: Genetics, 54, 61–76 (1966). (a)Fenotypowe określenie właściwości organizmu stosuje się gdy zmutowane loci nie zostały zidentyfikowane oraz zmapowane. Może być także użyte w przypadku, gdy identyfikuje się produkt genu np. białko OmpA. Zapis fenotypu zasadniczo składa się z trzech liter, nie można ich pisać kursywą, pierwsza litera powinna być zawsze dużą literą. Preferuje się użycie liczb rzymskich lub arabskich dla oznaczania bliźniaczych fenotypów np. Pol1, Pol2, Pol3 itd. Typ dziki można zapisać dodatkowym oznaczeniem plus (Pol+); w odróżnieniu do tego oznaczenie minus określać będzie fenotyp mutanta (Pol–). Czasami pewne charakterystyczne właściwości organizmu można zapisać używając liter np. (StrS). (b)Genotypowe oznaczenia są podobne do fenotypowych – w obu przypadkach stosuje się zestaw trzech liter; genotyp pisze się zawsze małymi literami oraz kursywą np. ara, his, rps. Promotor, terminator oraz operator oznacza się literami p, t oraz o np. lacZp, lacZt, lacZo; Bachman i Low; Microbiol. Rev. 44, 1–56 (1980). (c)Typ dziki alleli można zaznaczyć wpisując dodatkowe oznaczenie plus nad oznaczeniem genu np. ara+, his+, nie oznacza się natomiast zmutowaych alleli znakiem minus. * Fragmenty instrukcji dla autorów czasopism wydawanych przez American Society for Microbiology – wykorzystywanie w P.M. za zgodą Journals Departments ASM. 107 (d)Miejsca mutacji oznacza się poprzez wstawiania liczby kolejnych izolacji (liczby alleli) po symbolu zmutowanego locus (np. araA1, araA2 itp.). W przypadku, gdy tylko jedno takie locus istnieje, lub gdy nie wiadomo w którym kolejnym locus mutacja powstała – po oznaczeniu genu wstawia się myślnik w miejscu dużej litery oznaczającej locus , zaś dalej podaje się liczbę izolacji (np. ara-23). (e) Zapis genotypu może być wzbogacony innymi oznaczeniami, jak plus dla typu dzikiego – można wprowadzić oznaczenia okreś­ lające mutacje jak np. mutacja Amber (Am), mutant termo­ wrażliwy (Ts), mutant konstytutywny (Con), mutant wrażliwy na niskie temperatury (Cs), białko hybrydowe (Hyb) np. araA230(Am), his D21(Ts). Wprowadzanie innych wzbogaceń powinno być poprzedzone w tekście odpowiednim wyjaśnieniem. (f)Dodatkowe oznaczenia mogą też być użyte w przypadku konieczności rozróżnienia tego samego genu znajdującego się w różnych organizmach lub szczepach tego samego gatunku np. hisE.coli lub hisK-12. Dodatkowe oznaczenia stosuje się również dla rozróżnienia pomiędzy genetycznymi elementami o tej samej nazwie np. promotory operonu gln; glnA1 i glnA2. (g)Delecję oznacza się symbolem, ∆ usytuowanym przed zdelecjonowanym genem lub regionem np. ∆ trpA432, ∆ (aroP-aceE)419, lub ∆ his(dhuA hisJ hisQ)1256. Fuzję genów ara i lac można przedstawić w ten sam sposób – F (ara-lac)1256. Podobnie F (araB’ -lacZ+)(Hyb) oznacza, że fuzja nastąpiła pomiędzy genami araB a lacZ. Inwersja jest oznaczana następująco IN (rrnD-rrnE)1. Insercję genu his E. coli do plazmidu pSC101 w pozycji 0 zasad (0 kb) zapisuje się następująco pSC101 W (Okb::K-12hisB)4. Oznaczenie obecności episomu polega na podaniu jego symboli w nawiasie po nazwie szczepu rodzicielskiego np. W3110/F’ 8(gal+). 3.3. Skróty nazw chemicznych Nie wymagają dodatkowych wyjaśnień skróty nazw, takich jak: – nazwy miar i wag regulowanych przez Systeme International dc Unites (SI), ogólnie akcetowane jednostki takie jak bp, kb, Da, masa cząst., m. cząst. –skróty nazw chemicznych takich jak: DNA, cDNA, RNA, cRNA, RNaza, DNaza, rRNA, mRNA, tRNA; AMP, ADP, ATP, dATP,ddATP, GTP itp., –ATPaza, dGTPaza itp. NAD+, NADH, NADPH, NADP+, poly(A), poly(dT) itp., – nazwy powszechnie stosowanych technik biologii molekularnej np. PCR, SDS-PAGE, nazwy ogólnie znanych linii komórkowych np. HeLa, J774 –nazwy jednostek biologicznych; PFU ( jednostka formowania łysinek), CFU (jednostka formowania kolonii), MIC (minimalne stężenia hamujące wzrost), itp. Zasady kształtowania nomenklatury endonukleaz restrykcyjnych oraz metylotransferaz zostały opublikowane w Nucleic Acids Res. 31, 1805–1812 (2003). Przy pisaniu prac prosimy o korzystanie z zawartych tam informacji. 3.4. Pisownia danych numerycznych Standardowe jednostki metryczne są stosowane dla określania długości, wagi i objętości. W przypadku przedstawiania tych war­ tości oraz molarności należy stosować przedrostki m, µ, n oraz p dla wartości 10–3, 10–6, 10–9 oraz 10–12. Temperaturę należy przedstawiać tylko w stopniach Celsjusza np. 37°C. 3.5. Pisownia substancji znakowanych izotopami Jeśli wyznakowana jest pojedyncza cząsteczka w związku chemicznym należy nazwę tego związku zapisać w następujący sposób 14CO2, 3H2O, H235SO4. Taki sam sposób zapisu stosuje się gdy radioaktywna cząsteczka nie występuje w naturalnej formie 108 INFORMACJA DLA AUTORÓW wyznakowanego związku np. 32S-ATP lub gdy symbol izotopu związany jest z niespecyficzną nazwą związku np. 14C aminokwasy, 3 H-liganty itp. W przypadku niektórych specyficznych związków chemicznych można stosować nawiasy kwadratowe obejmujące symbole radioaktywnej cząsteczki przed nazwą chemiczną związku np. [14C] mocznik, L-[metylo-14C] metionina, [g–32P] ATP. 4. Proces recenzowania Prace przysyłane do Redakcji w celu ich opublikowania w Postępach Mikrobiologii podlegają podwójnej ocenie tj. ich wartości merytorycznej (Recenzje) oraz poprawności pod względem redakcyjnym (układ pracy, język, załączniki ilustrujące tekst, oświadczenia autorów). • Każda praca przesłana do Redakcji jest oceniana przez jednego ze stałych Recenzentów P.M. (lista Recenzentów, patrz Rada Redakcyjna jest również publikowana w każdym zeszycie P.M. oraz na stronie internetowej http:www.pm.microbiology.pl). W przypadku braku w Radzie Redakcyjnej P.M. Recenzenta o odpowiedniej specjalności lub jego braku z innych ważnych przyczyn, Redaktor naczelny powołuje Recenzenta spoza Rady Redakcyjnej. • Recenzje są anonimowe oraz dokonywane na specjalnie do tego przygotowanych arkuszach • Recenzenci nie otrzymują zapłaty od PTM za wykonaną pracę. • Nazwiska Recenzentów z poza Rady Redakcyjnej są wraz z podziękowaniami publikowane ostatnim zeszycie P.M. odpowiedniego roku. • W przypadku ujemnej oceny pracy przez Recenzenta oraz jego sugestii skierowanej do Redaktora naczelnego odrzucenia recenzowanej pracy, bądź jej znacznego przeredagowania, Autor P.M. ma prawo odwołania się od tej sugestii do Redaktora naczelnego. W opisywanym przypadku decyzją Redaktora powoływany jest dodatkowy Recenzent z poza Rady Redakcyjnej P.M. 5. Sposób przygotowania i nadesłania manuskryptu Pracę wraz z kompletem oświadczeń należy przesyłać na adres poczty elektronicznej Redakcji: e-mail: [email protected] W przypadku prac kierowanych do działu „Publikacje metodyczne i standardy” prace przeglądowe przygotowane zgodnie z ogólną instrukcją dla Autorów oraz zasadami wymienionymi w informacjach dotyczących prac kierowanych do działu „PMiS” należy przesłać w wersji elektronicznej na adres Redaktora Działu: Prof. dr hab. Stefania Giedrys-Kalemba e-mail: [email protected] lub [email protected] Przed wysłaniem pracy do Redakcji prosimy o sprawdzenie kompletności wysyłanych plików przy pomocy poniższej listy: 1. Strona tytułowa ze streszczeniem 2. Manuskrypt (zawierający tytuł oraz właściwy tekst pracy) 3. Rysunki 4. Opis do rysunków 5. Tabele Wymagane dokumenty: 1. Deklaracja oryginalności pracy. 2. Oświadczenie dotyczące praw autorskich. 3. Oświadczenie dotyczące konfliktu interesów. 4. Zobowiązanie do zapłaty w przypadku przyjęcia pracy do druku. 6. Uwagi dodatkowe Redakcja zastrzega sobie możliwość dokonywania skrótów i poprawek nie wpływających na treść pracy. W przypadku konieczności wprowadzenia zmian w treści odsyła się autorowi manuskrypt pracy w celu dokonania poprawek. Adresy instytucji, w których pracują autorzy (adres pocztowy oraz e-mail) należy podawać w pracy na dole strony tytułowej. Prace nie odpowiadające wymaganiom Redakcji będą odsyłane autorom bez rozpatrzenia merytorycznego. Za datę wpływu przyjmuje się dzień otrzymania pracy w formie zgodnej z instrukcją dla autorów. Jako datę przyjęcia do druku przyjmuje się dzień, w którym Redakcja powiadamia P.T. Autorów, że praca spełnia już zarówno wymagania merytoryczne oraz formalne i została zakwalifikowana do druku. Za prace opublikowane w Postępach Mikrobiologii nie przewiduje się honorariów autorskich. Zgodnie z decyzją Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów pobierane są opłaty za prace przyjmowane do druku w naszym piśmie. Przesłanie kompletu podpisanych oświadczeń, w tym zobowiązania do zapłaty za artykuł zakwalifikowany do wydania, jest warunkiem uruchomienia procedury wydawniczej. INFORMACJA DLA AUTORÓW o opłatach za prace publikowane w Postępach Mikrobiologii Uprzejmie informujemy PT Autorów PM, że zgodnie z decyzją Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów z dnia 6 lutego 2007 roku oraz z dnia 2 marca 2011 r. wprowadzono zasady płatności za prace przyjmowane do druku w naszym piśmie. Autorzy manuskryptów proszeni są o wnoszenie opłat w wysokości 250 PLN + VAT 23% – razem 307,50 PLN za każdy artykuł na konto Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów: BGŻ SA 57 2030 0045 1110 0000 0261 2550 Opłatę można wnosić indywidualnie. W imieniu Autorów opłatę może wnosić sponsorująca instytucja, fundacja itp. W takim przypadku proszę przesłać do Redakcji informacje potrzebne do wystawienia faktury. Opłatę należy wnieść po otrzymaniu faktury. W przypadku gdy faktura nie jest potrzebna do dokonania wpłaty (opłata indywidualna) przelewu proszę dokonać po uzyskaniu od Redakcji informacji, że praca została przyjęta do druku. Dodatkowo, wydawca pobiera opłaty za wydruk kolorowych ilustracji w wysokości 300 PLN + VAT 23% (369 PLN) za stronę. Otrzymanie przez Redakcję pracy wraz z zobowiązaniem zapłaty jest warunkiem uruchomienia procedury wydawniczej. Do zobowiązania zapłaty należy dołączać informacje zawierające tytuł pracy i nazwisko Autora korespondencyjnego. INFORMACJA DLA AUTORÓW 109 INFORMACJE DOTYCZĄCE PRAC DRUKOWANYCH W DZIALE PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY W dziale zatytułowanym PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY publikowane są artykuły przeglądowe o charak­ terze meto­dycznym, reprezentujące dowolną dziedzinę mikrobio­logii. Redakcja Postępów Mikrobiologii (PM), w porozumieniu z Zarządem Głównym PTM ustaliła, iż drukowanych będzie rocz­nie nie więcej niż cztery artykuły tej kategorii. Redaktorem odpowiedzialnym za wartość merytoryczną, redakcję tekstu oraz ostateczne przyjęcie pracy do druku jest prof. dr hab. Stefania Giedrys-Kalemba (adres: ul. Malinowa 11, 72-003 Wołczkowo, tel. 605031324, fax: (91) 3113186, e-mail: [email protected] lub [email protected]) Prace metodyczne przeznaczone do druku podlegają ocenie dokonywanej przez stałych Recenzentów lub Ekspertów powoły­wanych każdorazowo przez Redaktora działu. Lista stałych Recenzentów, patrz Zalecenia dla Autorów, pkt. 5. Strona tytułowa każdego artykułu zaopatrzona będzie w infor­ma­ cje, iż praca należy do PUBLIKACJI METODYCZNYCH I STANDARDÓW oraz każdorazowo podana będzie data otrzy­mania od Autorów manuskryptu jak i data zaakceptowania go do druku. Zalecenia dla Autorów: 1. Przesyłanie publikacji: ●Manuskrypt (w dwu egzemplarzach w formie papierowej oraz jednym egzemplarzu na nośniku elektronicznym wraz z rysun­kami, tabelami itp.) proszę przesyłać bezpośrednio do Redak­tora PUBLIKACJI METODYCZNYCH I STANDARDÓW. ● Podając adres/y Autorów publikacji należy zaznaczyć Autora korespondencyjnego – prócz adresu pocztowego, numeru telefonu i ew. faxu należy obligatoryjnie podać adres e-mail Autora korespondencyjnego. 2. Sposób przygotowania manuskryptu – Pracę należy opracować zgodnie z ogólnymi zaleceniami zawartymi w INFORMACJI DLA AUTORÓW aktualnie wydanego Tomu Postępów Mikrobiologii (Zeszyt 1) z uwzględnieniem następujących zmian: ●Objętość pracy nie może przekraczać wraz z piśmiennictwem i ilustracjami 20 stron. ● Ilość cytowań w rozdziale Piśmiennictwo nie powinna prze­ kraczać 50 pozycji. ●W spisie cytowanego piśmiennictwa należy umieszczać wyłącznie prace drukowane w czasopismach naukowych, niedopuszczalne jest zamieszczanie danych bibliograficznych prospektów reklamowych lub promocyjnych firm farmaceu­tycznych. 3. Prawa autorskie – do każdej przygotowanej do druku publika­ cji załączyć Oświadczenie dotyczące praw autorskich. Wzór oświadczenia można pobrać ze strony internetowej P.M. 4. Zalecenia i uwagi dodatkowe: W celu uniknięcia kryptoreklamy, proszę o zwrócenie szcze­ gólnej uwagi na sposób przedstawienia czytelnikom produktów komercyjnych lub metod opracowanych przez producentów. Autorzy są również zobowiązani do ujawnienia (jeżeli takie ist­ nieją) wszelkich powiązań (honoraria, granty, płatne ekspertyzy lub inne formy uzyskiwania korzyści osobistych) między Auto­ rami a firmą, której produkt ma istotne znaczenie w nadesłanej pracy. W tym celu każdy z Autorów proszony jest o złożenie Oświadczenia o oryginalności pracy, Oświadczenia dotyczącego praw autorskich oraz Oświadczenia dotyczącego „konfliktu inte­resów”. Konflikt interesów występuje, kiedy Autor lub zakład pracy Autora ma finansowe lub osobiste związki z innymi oso­bami lub instytucjami, które mogą wpływać na jego działania i decyzje. Wzór deklaracji można pobrać ze strony internetowej PM. ●Redakcja PM zastrzega sobie prawo ostatecznej decyzji o ak­ceptacji pracy przeznaczonej do druku w dziale PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY. ● Wszelkie proponowane zmiany w INFORMACJI DLA AUTORÓW P.M. zostaną przedstawione PT Czytelnikom Postępów Mikrobiologii przed ich wprowadzeniem. 5. Stali recenzenci działu PUBLIKACJE METODYCZNE I STAN­DARDY: Jerzy Długoński (Uniwersytet Łódzki) Waleria Hryniewicz (Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego) Józef Kur (Politechnika Gdańska) Anna Przondo-Mordarska (Akademia Medyczna we Wrocławiu) 110 INFORMACJA DLA AUTORÓW Oświadczenie o oryginalności pracy ................................................................................................................................ Nazwisko i imię Autora (korespondencyjnego) ................................................................................................................................ ................................................................................................................................ Tytuł pracy ............................................................. Data złożenia pracy w Redakcji Postępów Mikrobiologii Oświadczam, że złożona przeze mnie praca, zatytułowana jak wyżej, jest moim oryginalnym utworem i stanowi przedmiot prawa autorskiego w myśl Ustawy o prawie autorskim i prawach pokrewnych z dn. 4 lutego 1994 r. Oświadczam również, że praca ta ani w całości, ani we fragmentach nie została opublikowana wcześniej w żadnym innym czasopiśmie lub wydawnictwie naukowym. Dodatkowo stwierdzam, iż w/w pracy nie wysłano równolegle do opublikowania w innym czasopiśmie naukowym lub wydawnictwie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (miejsce, data) ............................................... (podpis Autora korespondencyjnego) Oświadczenie dotyczące praw Autorskich 1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (nazwisko/a i imię/ona Autora/ów – proszę podkreślić Autora korespondencyjnego) Adres Autorów: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ................................................................................................................................ Tytuł pracy: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ................................................................................................................................ 2. Oświadczenie (proszę wypełnić a lub b) (a)Oświadczam, iż w mojej/naszej pracy przeznaczone do opublikowania rysunki oraz tabele, są dziełem mojej/naszej oryginalnej twórczości (tzn. zostały wymyślone i zaprojektowane przez Autorów przedkładanego Redakcji manuskryptu), nie są obciążone jakimikolwiek prawami osób trzecich, ani nie naruszają jakichkolwiek przepisów prawa i interesów dóbr osób trzecich. W pracy nie ma cytatów z obcej publikacji/ ewentualnie w pracy zamieszono cytaty w ramach dozwolonego prawnie prawa cytatu, przy czym wszystkie zamieszczone cytaty zostały należycie oznaczone wraz z wymienieniem twórcy i źródła cytatu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (miejsce, data) ............................................... (podpis Autora korespondencyjnego) (b)Oświadczam, iż uzyskałem/liśmy wymaganą prawem zgodę uprawnionych autorsko podmiotów na reprodukcję rysunków nr: . . . . . . . . . . . . . . . . . . , zamieszczonych w*: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oświadczam, iż uzyskałem/liśmy wymaganą prawem zgodę uprawnionych autorsko podmiotów na reprodukcję tabel nr: . . . . . . . . . . . . . . . . . . , zamieszczonych w: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (* podać bibliografie prac oryginalnych z których reprodukowane będą rysunki lub tabele) Do Oświadczenia załączam oryginalne zezwolenia reprodukcji w liczbie: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . rysunków: . . . . . . . . . . . . . . . tabel: . . . . . . . . . . . . . cytowanego tekstu: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (miejsce, data) ............................................... (podpis Autora korespondencyjnego) INFORMACJA DLA AUTORÓW 111 Oświadczenie dotyczące „konfliktu interesów”1 1. Nazwisko i imię Autora: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. Tytuł pracy: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........................................................................................................................... ........................................................................................................................... 3.Oświadczenie (proszę wypełnić a lub b, niepotrzebne skreślić) (a) Oświadczam, że „konflikt interesów” nie występuje (b) Oświadczam, że występuje „konflikt interesów”, który polega na: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........................................................................................................................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (miejsce, data) ............................................... (podpis Autora korespondencyjnego) 1 Konflikt interesów występuje, kiedy Autor lub zakład pracy Autora ma finansowe lub osobiste związki z innymi osobami lub instytucjami, które mogą wpływać na jego działania i decyzje. Zobowiązanie do zapłaty ............................................................................................................................ Nazwisko i imię Autora korespondencyjnego .............................................................................................................................. ............................................................................................................................ Afiliacja Autora korespondencyjnego Autor korespondencyjny pracy pod tytułem: „. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .” zobowiązuje się w imieniu pozostałych współautorów do wniesienia opłaty 307,5 zł w przypadku przyjęcia pracy do druku w Postępach Mikrobiologii na konto Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (miejsce, data) ............................................... (podpis Autora korespondencyjnego) 112 INFORMACJA DLA AUTORÓW INSTRUKCJA DLA AUTORÓW PRAC PUBLIKOWANYCH W SUPLEMENTACH DO KWARTALNIKA POSTĘPY MIKROBIOLOGII W celu ułatwienia publikowania w jednym miejscu artykułów o podobnej problematyce, Postępy Mikrobiologii wydawać będą w formie suplementów, następujące prace naukowe: 1. Referaty z sesji plenarnych Zjazdów naukowych, Konferencji naukowych oraz Sympozjów organizowanych staraniem Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów oraz Komitetu Mikrobiologii Polskiej Akademii Nauk. Manuskrypt pojedynczego referatu nie powinien przekraczać 25-ciu stron i powinien być przygotowany wg Informacji dla Autorów Postępów Mikrobiologii. Całość materiałów przygotowanych do jednego suplementu nie może przekraczać 150 stron. 2. Streszczenia przyjętych przez organizatorów referatów oraz doniesień prezentowanych na ww. Zjazdach naukowych, Konferencjach oraz Sympozjach. Streszczenie nie powinno przekraczać jednej strony tekstu i kończyć się nie więcej jak trzema pozycjami cytowanego piśmiennictwa. W suplemencie nie będą publikowane oryginalne prace doświadczalne prezentowane na ww. Zjazdach naukowych. Prace te po odpo­wiednim przygotowaniu, zgodnie z instrukcją dla autorów, można przesyłać do Redakcji Polish Journal of Microbiology (Acta Microbiologica Polonica) lub innego czsopisma naukowego. Autorzy lub zamawiający suplement ponoszą pełny koszt jego opracowania oraz wydania. Możliwy jest druk czterech suplementów rocznie. Ponieważ materiały przeznaczone do suplementu nie są opracowywane oraz nie podlegają ocenie Zespołu Redakcyjnego Postępów Mikrobiologii, zamawiający suplement, tj. osoba upoważniona przez Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów lub Komitet Mikrobiologii PAN, bierze całkowitą odpowiedzialność za redakcję oraz wartość merytoryczną suplementu. Wydanie suplementu powinno być poprzedzone jego akceptacją przez Zespół Redakcyjny Postępów Mikrobiologii. Oferta Reklamy Postępy Mikrobiologii udostępnią w każdym numerze kilka stron (łącznie z wewnętrznymi stronami okładek) reklamie. Pismo nasze dociera co kwartał do kilku tysięcy odbiorców. Są wśród nich specjaliści różnych dziedzin mikrobiologii, pracujący jako nauczyciele wyższych uczelni, szkół średnich oraz pracownicy naukowi instytutów badawczych, biotechnolodzy oraz lekarze. Dużą grupę naszego pisma stanowią studenci. Cena ogłoszenia czarno-białego wewnątrz numeru wynosi: 1/2 strony 250,– zł cała strona 500,– zł Proponujemy również ogłoszenia kolorowe – cena do uzgodnienia. Teksty opracowanych graficznie reklam proszę składać na adres Redakcji Postępów Mikrobiologii, 02-007 Warszawa, ul. Oczki 3, tel. 628 08 22. Redakcja nie ponosi odpowiedzialności za treść reklam i ogłoszeń SPIS TREŚCI M. M a c i e j e w s k a, M. B a u e r, M. D a w g u l – Nowoczesne metody zwalczania biofilmu bakteryjnego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 S. S u ł o w i c z, Z. P i o t r o w s k a - S e g e t – Oddziaływanie fungicydów na mikroorganizmy w środowisku glebowym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 A. K u r c z, S. B ł a ż e j a k, A. M. K o t, A. B z d u c h a - W r ó b e l – Wykorzystanie odpadów pochodzących z przemysłu rolno-spożywczego do produkcji biomasy drożdży paszowych Candida utilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 K. R o e s k e, R. S t a c h o w i a k, J. B i e l e c k i – Założenia i perspektywy wykorzystania żywych wektorów bakteryjnych we współczesnej wakcynologii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 S. J. C h m i e l e w s k a, K. F i e d o r u k, T. D a n i l u k, M. Ś c i e p u k, D. K a c z m a r z y k, K. L e s z c z y ń s k a – Znaczenie uropatogennych szczepów Escherichia coli (UPEC) w etiopatogenezie zakażeń układu moczowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 K. P e r k o w s k i, P. J. Z a w a d z k i, B. S t a r o ś c i a k, M. D y b i c z, M. P a d z i k, M. M a r c z y ń s k a - S t o l a r e k, L. C h o m i c z – Składniki mikrobiomu jamy ustnej jako czynniki ryzyka zakażeń lokalnych i uogólnionych u pacjentów bez oraz z wadami wrodzonymi narządu żucia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 K. K r ó l - T u r m i ń s k a, A. O l e n d e r – Moraxella catarrhalis – patogen górnych dróg oddechowych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 A. N o w a k, I. G r e ń, A. M r o z i k – Mikrobiologiczny rozkład chlorofenoli w glebie . . . . . . . 79 M. K i e r z k o w s k a, A. M a j e w s k a, A. S a w i c k a - G r z e l a k, G. M ł y n a r c z y k – Pałeczki Gram-ujemne beztlenowo rosnące – diagnostyka i znaczenie kliniczne . . . . . . . . . . . 91 PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY P. T a r k a, K. K a n e c k i, K. T o m a s i e w i c z – Ocena działania chemicznych preparatów dezynfekcyjnych przeznaczonych do powierzchni z zastosowaniem metod nośnikowych. Działanie bakteriobójcze, drożdżobójcze i sporobójcze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 INFORMACJA DLA AUTORÓW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 CONTENTS M. M a c i e j e w s k a, M. B a u e r, M. D a w g u l – Novel methods of bacterial biofilm elimination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S. S u ł o w i c z, Z. P i o t r o w s k a - S e g e t – The impact of fungicides on soil microorganisms A. K u r c z, S. B ł a ż e j a k, A. M. K o t, A. B z d u c h a - W r ó b e l – The use of agri-food industry waste for the production of Candida utilis fodder yeast biomass . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K. R o e s k e, R. S t a c h o w i a k, J. B i e l e c k i – Principles and perspectives of using live bacterial vectors in modern vaccinology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S. J. C h m i e l e w s k a, K. F i e d o r u k, T. D a n i l u k, M. Ś c i e p u k, D. K a c z m a r z y k, K. L e s z c z y ń s k a – Significance of uropathogenic strains of Escherichia coli (UPEC) in the pathogenesis of urinary tract infections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K. P e r k o w s k i, P. J. Z a w a d z k i, B. S t a r o ś c i a k, M. D y b i c z, M. P a d z i k, M. M a r c z y ń s k a - S t o l a r e k, L. C h o m i c z – Components of oral microbiome as potential risk factors of local and general infections in patients with and without congenital malformations of masticatory system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K. K r ó l - T u r m i ń s k a, A. O l e n d e r – Moraxella catarrhalis – a respiratory tract pathogen A. N o w a k, I. G r e ń, A. M r o z i k – Microbial degradation of chlorophenols in soil . . . . . . . . M. K i e r z k o w s k a, A. M a j e w s k a, A. S a w i c k a - G r z e l a k, G. M ł y n a r c z y k – Gram-negative anaerobic rods – diagnostics and clinical significance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 12 19 27 45 57 68 79 91 METHODS AND STANDARDS P. T a r k a, K. K a n e c k i, K. T o m a s i e w i c z – Evaluation of chemical agents intended for surface disinfection with the use of carrier methods. Bactericidal, yeasticidal and sporocidal activity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 INFORMATION FOR AUTHORS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
