Ocena odsetka limfocytów CD19+CD5+ w

ed
.
tio
np
roh
ibit
Ocena odsetka limfocytów CD19+CD5+
w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci chorych
na wysiękowe zapalenie ucha środkowego
Evaluation of percentage of the CD19+CD5+ lymphocytes
in hypertrophied adenoids at children with otitis media with effusion
rso
na
lu
se
on
ly -
Summary
Introduction. Otitis media with effusion and hypertrophied adenoid are still common diseases in childhood. Adenoid has
particular meaning to develop of immunological response to inflammations in upper respiratory inclusive middle ear. The
origin CD19+CD5+ B cells remains controversial. The differentiation response to ligation of CD5 resulting in apoptosis or
proliferation lymphocytes. The aim of this study was compare the percentage of CD19+CD5+ lymphocytes in hypertrophied
adenoid tissue at children with otitis media with effusion to comparative group without inflammatory state in middle ear.
Material and methods. We tested 37 children in examine group with hypertrophied adenoid and otitis media with effusion
(OME), and 32 children in comparative group only with hypertrophied adenoid (HA). We also divided both groups into two
groups, above 5 and over 5 years old. We made the research by flow cytometry method. We used anty-CD19 and anty-CD5
monoclonal antibodies to examinations. Results. In this study we showed significantly higher percentage of the CD19+CD5+
lymphocytes at children with examined group (OME 22.12 ± 4.31%) than in comparative group (HA 19.16 ± 4.32%), p<0,04.
Percentage of the subpopulation CD5+ B cells was significantly higher (p < 0,02) at younger subgroup (21.55 ± 5.34%) than
in older subgroup (18.24 ± 2.35%) of children with both groups (OME + HA). Conclusions. The significant higher percentage of B lymphocytes with expressions of CD5+ receptor in hypertrophied adenoid tissue at children with otitis media with
effusion are important to develop of early immunological response to inflammatory state in middle ear.
pe
Hasła i n de kso we : CD19+CD5+, limfocyty, przerost migdałka gardłowego (PMG), wysiękowe zapalenie ucha (WZU)
Ke y wo rds: CD19+CD5+, lymphocytes, adenoid hypertrophy (AH), otitis media with effusion (OME)
Otolaryngol Pol 2007; LXI (6): 962–966 © 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
y is
WSTĘP
is c
op
Cząsteczka CD5, glikoproteina o masie cząsteczkowej 67 kDa występuje konstytutywnie na powierzchni prawie wszystkich limfocytów T. Tylko niewielki
odsetek limfocytów B wykazuje jej powierzchniową
ekspresję [17].
W życiu pozapłodowym znaczne ilości limfocytów B CD5+ znajdują się w krwi pępowinowej, u
osób dorosłych w krwi obwodowej limfocyty te stanowią 18–36% komórek B. Występują one w śledzionie, w strefie płaszczowej drugorzędowych grudek
chłonnych w węzłach chłonnych oraz migdałkach.
Nie występują natomiast w szpiku [2, 16, 17].
Odsetek limfocytów B CD5+ nazywanych także
komórkami B-1a po okresie okołoporodowym obniża
się na korzyść komórek CD5-ujemnych, tzw. „limfocytów konwencjonalnych” B-2 występujących u
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
dis
tr
Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Białymstoku
Kierownik: prof. dr hab. J. Wysocka
2Klinika Otolaryngologii Dziecięcej AM w Białymstoku
Kierownik: prof. dr hab. E. Hassmann-Poznańska
for
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
1Zakład
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
ibu
Karol Ratomski1, Bożena Skotnicka2, Edwina Kasprzycka1,
Beata Żelazowska-Rutkowska1, Jolanta Wysocka1, Sławomir Anisimowicz1
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
K. Ratomski i inni
962
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
lu
rso
na
MATERIAŁ I METODY
is c
op
y is
for
pe
Materiałem badanym były migdałki gardłowe
uzyskane od dzieci w czasie zabiegu adenoidektomii przeprowadzonego w Klinice Otolaryngologii
Dziecięcej Akademii Medycznej w Białymstoku.
Na wykonanie badań uzyskano zgodę Komisji
Bioetycznej Akademii Medycznej w Białymstoku.
Grupa badana z przerostem migdałka gardłowego
i wysiękowym zapaleniem ucha środkowego trwającym powyżej 3 miesięcy (WZU) liczyła 37. pacjentów w wieku od 2. do 17. r.ż. Grupa porównawcza
jedynie z przerostem migdałków gardłowych (PMG),
którą stanowili rówieśnicy liczyła 32 dzieci.
Z uwagi na stopień dojrzałości układu immunologicznego obydwie grupy WZU i PMU podzielono
na podgrupy wiekowe dzieci młodszych (mł.) od 2.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
-
ed
.
on
ly -
dis
tr
ibu
tio
np
roh
ibit
do 5. r.ż. i dzieci starszych (st.) od 6. do 17. r.ż. W
grupie badanej wśród dzieci młodszych WZUmł.
znalazło się 17. osób, a w podgrupie dzieci starszych
WZU st. 20 badanych. Grupa dzieci młodszych z
przerostem migdałka gardłowego PMG mł. liczyła 14
osób, a grupa starsza PMG st. 18 dzieci.
Wszystkie oceniane dzieci podzielono także na
podgrupy wiekowe (do lat 5 i powyżej 5 lat) bez
zróżnicowania na grupę badaną i porównawczą. W
grupie dzieci młodszych znalazło się 31 osób, grupa
starsza liczyła 38 dzieci.
Badania zostały wykonane metodą dwukolorowej cytometrii przepływowej na cytometrze Coulter
PC 500 (firmy Beckman Coulter). Procedurę przygotowania tkanki przerosłych migdałków gardłowych do badań opisano we wcześniejszej publikacji
[15]. Do badań zastosowano przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw następującym antygenom powierzchniowym limfocytów: CD19, CD5
(DakoCytomation) oraz kontrolę negatywną zgodną
izotopowo z klasą stosowanych przeciwciał.
Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono testem nieparametrycznym U MannaWhitneya przy użyciu programu STATISTICA 5.0.
Wyniki podawano w wartościach odsetkowych. Za
istotną statystycznie przyjęto wartość przy p<0,05.
se
osób dorosłych [8, 10, 11]. Najniższy odsetek stanowią komórki B-1b, które są subpopulacją „siostrzaną” do B-1a, jednak nieposiadającą powierzchniowego antygenu CD5.
Charakterystyczną cechą limfocytów B CD5+
jest produkcja wieloreaktywnych przeciwciał o
niskim powinowactwie i małej specyficzności. Są
one pierwotnym źródłem naturalnych przeciwciał
IgM, które pojawiają się w surowicy bez stymulacji
antygenowej [4]. Nie do końca została wyjaśniona
rola tych przeciwciał w regulacji odpowiedzi immunologicznej.
Limfocyty B występujące w drugorzędowej grudce limfatycznej migdałków wykazują zróżnicowany
fenotyp komórkowy. Z badań immunohistochemicznych wynika, że komórki B płaszcza grudkowego
z ekspresją CD5+ posiadają na powierzchni również antygeny CD23+, CD39+ i powierzchniowe
immunoglobuliny IgM+ i IgD+. Ponadto komórki
CD19+CD5+ izolowane z tkanki migdałków wykazywały podobny fenotyp jak komórki obecne w
płaszczu grudkowym [2, 7]. Kodama i wsp. [12]
uważają, że komórki B CD5+ są znaczącym źródłem
komórek produkujących IgA w błonach śluzowych.
Specyfika antygenu CD5+ B sugeruje, że subpopulacja ta stanowi pierwotny element układu immunologicznego, który odgrywa znaczącą rolę jako pierwsza
linia obrony w zakażeniach.
Celem przeprowadzonych badań była ocena
odsetka limfocytów B CD5+ w tkance przerosłych
migdałków gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego z grupą porównawczą bez stanu zapalnego ucha.
WYNIKI
Średni odsetek limfocytów B z ekspresją antygenu CD5+ w przerosłych migdałkach gardłowych
dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego (WZU) wynosił 22,12% i był statystycznie
znamiennie wyższy p<0,04 w porównaniu do grupy
porównawczej (PMG = 19,16 ± 4,32%) (tab. I).
Po podziale na podgrupy wiekowe najwyższy
odsetek limfocytów B CD5+ obserwowano w podgrupie dzieci młodszych grupy badanej (WZU mł.
24,45 ± 4,56%). Odsetek ten był statystycznie znamiennie wyższy p<0,02 w porównaniu do podgrupy
dzieci starszych (WZU st. 19,46 ± 1,81%) oraz podgrupy dzieci młodszych grupy odniesienia (PMG mł.
19,34 ± 5,01%). W podgrupie dzieci starszych bez
zapalenia ucha środkowego odsetek limfocytów B
CD5+ (PMG st. 17,53 ± 2,04%) był nieznacznie niższy niż w analogicznej podgrupie wiekowej grupy
badanej (tab. II).
W kolejnym etapie opracowań statystycznych
wszystkie oceniane przypadki podzielono na dwie
podgrupy wiekowe bez podziału na WZU i PMG.
Wykazano istotnie statystycznie wyższą wartość
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
Ocena odsetka limfocytów CD19+CD5+ w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci
963
Grupa porównawcza(PMG)N = 32
19,16 ± 4,32*
Tabela II. Odsetek subpopulacji limfocytów B CD5+ w tkance przerosłych migdałków gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego (WZU) i u dzieci z przerosłym migdałkiem gardłowym (PMG) po podziale na podgrupy wiekowe
do lat 5 i powyżej 5 r.ż.
Grupa badana (WZU)
WZUmł.(do 5 r. ż.)
WZUst.(powyżej 5 r. ż.)
N = 17
N = 20
24,45 ± 4,56AB
19,46 ± 1,81A
P < 0,02A p < 0,02B
CD19+CD5+ (%)
Grupa porównawcza (PMG)
PMGmł.(do 5 r. ż.)
PMGst.(powyżej 5 r. ż.)
N = 14
N = 18
B
19,34 ± 5,01
17,52 ± 2,04
ibu
Oceniany parametr
CD19+CD5+ (%)
Dzieci młodsze do 5 r.ż.(WZU + PMG)N = 31 Dzieci starsze powyżej 5 r.ż.(WZU + PMG)N
= 38
21,55 ± 5,34*
18,24 ± 2,35*
p<0,02*
ly -
Oceniane limfocyty(± SD)
dis
tr
Tabela III. Odsetek subpopulacji limfocytów B CD5+ w tkance przerosłych migdałków gardłowych u dzieci poddanych adenoidektomii po podziale na podgrupy wiekowe do lat 5 i powyżej 5 r.ż.
średniego odsetka limfocytów B z fenotypem
CD19+CD5+ w grupie dzieci młodszych (21,55
± 5,34%) niż u dzieci starszych (18,24 ± 2,35%),
p<0,02 (tab. III).
antygenu CD5 w grupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego z przerostem migdałka gardłowego (WZU X = 22,12%) niż w grupie
porównawczej (PMG). Wyższy odsetek tej subpopulacji odnotowano w grupie badanej również po
podziale na podgrupy wiekowe.
Komórki CD19+CD5+ uzyskane z tkanki migdałków oceniane metodą cytometrii przepływowej, jak i ocenione metodą immunohistochemiczną
wykazywały ten sam fenotyp (antygenów CD23+,
CD39+ i powierzchniowych immunoglobulin IgM+
i IgD+). Głównym miejscem występowania limfocytów B CD5+ jest strefa płaszcza grudkowego [7].
Jednocześnie jest to przestrzeń w której dochodzi do
aktywacji immunologicznej inicjowanej prezentacją
antygenów T-komórkowo zależnych.
Limfocyty B migdałków z ekspresją CD5+ składają
się głównie z krążących, dojrzałych limfocytów dziewiczych. Rzadko biorą one udział w reakcjach immunologicznych zachodzących w ośrodkach rozmnażania drugorzędowych grudek limfatycznych [3, 9].
Morikawa i wsp. [13] wykazali, że połowa populacji komórek B-1 posiada ekspresję powierzchniową
sIgD+/sCD38+. Fenotyp ten odpowiada aktywowanym limfocytom B. Wśród komórek B-1 migdałków
są również małe populacje o fenotypie sIgD+/
sCD38- i sIgD-/sCD38- (odpowiednio komórki charakterystyczne dla ośrodka rozmnażania i pamięci).
Ci sami autorzy [13] zauważyli, że w wyniku
stymulacji przeciwciałem anty-CD5 dochodzi do
on
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
Grupa badana (WZU) N = 37
22,12 ± 4,31*
p<0,04*
tio
np
roh
ibit
Oceniane limfocyty (± SD)
CD19+CD5+ (%)
se
-
lu
DYSKUSJA
is c
op
y is
for
pe
rso
na
W tkance migdałka gardłowego dominującą
populacją wśród wszystkich komórek jednojądrzastych są limfocyty B (CD19+). Brodsky i wsp. [6]
wykazali, że w prawidłowych migdałkach gardłowych odsetek limfocytów CD19+ stanowi 47%.
Natomiast w przerosłych migdałkach gardłowych
odsetek ten jest znacznie wyższy i wynosi od 59
do 65% [6, 15]. W wielu badaniach wykazano
podobne wartości odsetkowe limfocytów B w grupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha
środkowego [5, 6, 15]. Komórki te są obecne głównie w ośrodkach rozmnażania drugorzędowych
grudek limfatycznych migdałka gardłowego [7].
W tkance migdałka gardłowego obecne są również
limfocyty B CD5+ [1]. Według Arity i wsp. [1] w
tkance przerosłych migdałków gardłowych u dzieci
do trzeciego roku życia limfocyty B CD5+ stanowią
30% komórek B w migdałku gardłowym. Ponadto
autorzy ci wykazali znaczne obniżenie odsetka
tych limfocytów do 10% u dzieci powyżej 10 r.ż.
W przeprowadzonych badaniach wykazano statystycznie wyższy odsetek limfocytów B z ekspresją
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
ed
.
Tabela I. Odsetek subpopulacji limfocytów B CD5+ w tkance przerosłych migdałków gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe
zapalenie ucha środkowego (WZU) i u dzieci z przerosłym migdałkiem gardłowym (PMG)
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
K. Ratomski i inni
964
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
lu
rso
na
pe
for
y is
op
is c
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
-
ed
.
dis
tr
ibu
tio
np
roh
ibit
Malejąca wraz z wiekiem ilość limfocytów B
CD5+ może być powodem zmniejszającej się liczby
komórek zdolnych do produkcji przeciwciał w migdałku gardłowym i tym samym obniżenia z wiekiem
jego roli immunoprotekcyjnej. Z drugiej jednak
strony zmniejszenie z wiekiem tej subpopulacji
może być następstwem wzrastającej adaptacji układu immunologicznego w grupach dzieci starszych.
Można więc stwierdzić, że wzrost odsetka limfocytów B z ekspresją CD5+ w migdałku gardłowym dzieci chorych na wysiękowe zapalenie
ucha środkowego wskazuje na pozytywny udział
tej subpopulacji komórek w rozwijaniu odpowiedzi
immunologicznej na toczący się proces zapalny. Ma
to miejsce szczególnie w wieku wczesnodziecięcym,
kiedy układ immunologiczny jeszcze rozwija swoje
zdolności odpornościowe.
PIŚMIENNICTWO
on
ly -
01. Arita M, Kodama S, Suzuki M, Mogi G. Single cell analysis of
adenoid CD5+ B cells and their protective contributions to
nasopharyngeal immunity. Laryngoscope 2003; 113: 484–491.
02. Bergler W, Adam S, Gross HJ, Hörmann K, Schwartz-Albiez
R. Age-dependent altered proportions in subpopulations of
tonsillar lymphocytes. Clin Exp Immunol 1999; 116: 9–18.
03. Berland R, Wortis HH. Origins and functions of B-1 cells
with notes on the role of CD5. Ann Rev Immunol 2002; 20:
253–300.
04. Boes M, Prodeus AP, Schmidt T, Carroll M, Chen J. A critical
role of natural immunoglobulin M in immediate defense against
systemic bacterial infection. J Exp Med 1998; 188: 2381–2386.
05. Brodsky L, Moore L, Stanievich JF, Orga PL. The immunology
of tonsils in children: the effect of bacterial load on presence
of B- and T-cells. Laryngoscope 1988; 98: 93–98.
06. Brodsky L, Koch RJ. Bacteriology and immunology of normal
and diseased adenoids in children. Arch Otolaryngol Head
Neck Surg 1993; 119: 821–829.
07. Dono M, Burgio VL, Tacchetti C, Favre A, Augilera A, Zupo
S, i wsp. Subepithelial B cells in the human palatine tonsil. I.
Morphologic, cytochemical and phenotypic characterization.
Eur J Immunol 1996; 26: 2035–2042.
08. Dono M, Cerruti G, Zupo S. The CD5+ B-cells. Int J Biochem
Cell Biol 2004; 36: 2105–2111.
09. Fischer M, Klein U, Kuppers R. Molecular single-cell analysis
reveals that CD5-positive peripheral blood B cells in healthy
humans are characterized by rearranged V genes lacking
somatic mutation. J Clin Invest 1997; 100: 1667–1676.
10. Gagro A, McCloskey N, Challa A, Holder M, Grafton G, Pound
JD, i wsp. CD5-positive and CD5-negative human B cells
converge to an indistinguishable population on signalling
se
wzrostu odsetka komórek B sIgD-/sCD38- (komórek
pamięci) i spadku sIgD-/sCD38+ (komórek naiwnych). Sugerują też możliwość regulacji dojrzewania
limfocytów B poprzez przekazanie tym komórkom sygnału transdukcji z jednoczesnym udziałem
receptorów BCR i CD5.
Najbardziej znaczącą cechą komórek B-1 jest ich
zdolność do produkcji wieloreaktywnych przeciwciał o niskim powinowactwie i swoistości [4, 17].
Przeciwciała te rozpoznają różnorodne autoantygeny
i wykazują reakcje krzyżowe z wieloma antygenami
bakteryjnymi, w tym z LPS. Według Arity i wsp. [1]
produkcja przeciwciał klas IgM i IgA przez komórki
CD5+ migdałka gardłowego jest większa niż przez
komórki CD5- i to zarówno bez- jak i po stymulacji
antygenami bakteryjnymi limfocytów B.
Hayakawa i Hardy [11] uważają, że IgM może
wpływać na częstość występowania CD5+ na drodze
mechanizmu sprzężenia zwrotnego. Doświadczenia
na modelach zwierzęcych wskazują przede wszystkim na możliwość ich udziału w rozwoju pierwotnej
odpowiedzi immunologicznej [3]. Według Persa i
wsp. [14] limfocyty B CD5+ migdałka są bardziej
wrażliwe na apoptozę zależną od IgM niż komórki
B CD5-. Ponadto autorzy ci wykazali, że limfocyty B
CD5+ ulegają częściej apoptozie niż komórki B CD5.
Być może mogło to być spowodowane obecnością
rozpuszczalnego ligandu dla CD5, cząsteczki CD72
w badanych migdałkach.
Rozwój systemu immunologicznego migdałka
gardłowego zależny jest od dojrzewania i adaptacji
immunologicznej, powodowanej kontaktem z obcymi antygenami docierającymi do organizmu. Wydaje
się, że komórki B CD5+ stanowią element naturalnej
pamięci immunologicznej, która jest istotna w pierwszych latach rozwoju układu odpornościowego.
Wyniki badań wykazały znaczący spadek wartości odsetkowych limfocytów CD19+CD5+ niemal
we wszystkich grupach dzieci starszych. Podobne
wyniki otrzymali inni autorzy [2, 14].
Wraz z wiekiem układ immunologiczny staje się
bardziej dojrzały. W migdałku gardłowym zmniejsza
się ilość komórek B produkujących przeciwciała [2]
oraz ilość samych przeciwciał. Natomiast powstające przeciwciała w miarę dorastania dziecka stają się
bardziej swoiste [1].
Migdałek gardłowy pełni znaczącą rolę w obronie
górnych dróg oddechowych przeciw docierającym do
ustroju patogenom. Zmiany odsetkowe subpopulacji
limfocytów migdałka gardłowego podczas dorastania
mogą wpływać korzystnie na zdolność do odpowiedniego podnoszenia jego odporności immunologicznej.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
Ocena odsetka limfocytów CD19+CD5+ w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci
965
ed
.
tio
np
roh
ibit
16. Roliński J, Rupniewska ZM, Wąsik-Szczepanek E. Ekspresja
cząsteczki CD5 na komórkach B i T we krwi pępowinowej,
we krwi dorosłych osób zdrowych i chorych na przewlekłą
białaczkę limfatyczną B-komórkową (PBL-B). Pol Arch Med
Wewn 1999; 4: 307–314.
17. Youinou P, Jamin Ch, Lydyard PM. CD5 expression in human
B-cell populations. Immunol Today 1999; 20: 312–316.
ibu
Adres autora:
dr n. med. Karol Ratomski
Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej
AM w Białymstoku
ul. J. Waszyngtona 17
15-274 Białystok
ly -
dis
tr
Pracę nadesłano: 26.06.2007 r.
on
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
through B-cell receptors and CD40. Immunology 2000; 101:
201–209.
11. Hayakawa K, Hardy RR. Development and function of B-1
cells. Cur Opin Immunol 2000; 12: 346–353.
12. Kodama S, Suzuki M, Arita M, Mogi G. Increase in tonsillar
germinal center B-1 cell numbers in IgA nephropathy (IgAN)
patients and reduced susceptibility to Fas-mediated apoptosis.
Clin Exp Immunol 2001; 123: 301–308.
13. Morikawa K, Torii I, Morikawa S. Modulation of IgD CD20 by
ligation CD5 on tonsillar B cells. Scand J Immunol 2002; 55:
44–52.
14. Pers JO, Jamin Ch, Le Corre R, Lydyard PM, Youinou P.
Ligation of CD5 on resting B cells, but not on resting T cells,
result in apoptosis. Eur J Immunol 1998; 28: 4170–4179.
15. Ratomski K, Wysocka J, Hassmann-Poznańska E, Kasprzycka
E. Ekspresja receptora CD23 na limfocytach przerosłych migdałków gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie
ucha. Otolaryngol Pol 2005; 59: 219–223.
-
Th
is c
op
y is
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
for
pe
rso
na
lu
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
se
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
K. Ratomski i inni
966
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6