uzupelnione_pyt_z_inz[1]1 EDYTOWANA

uzupelnione_pyt_z_inz[1]1 EDYTOWANA.doc
(80 KB) Pobierz
1. Synteza dsDNA pełnej długości odbywa się przy pomocy:
a) odwrotnej transkryptazy, DNAzy I, fragmentu Klenowa, ligaza (0)
b) odwrotnej transkryptazy, RNAzy H, fragmentu Klenowa, ligaza (1)
c) odwrotnej transkryptazy, nukleazy S, fragmentu Klenowa, ligaza (0)
d) odwrotnej transkryptazy, hydrolizy alkalicznej, fragmentu Klenowa (0)
2. Adaptory:
a) mogą być jednoniciowe (1)
(ale rzadko, jeżeli mamy do czynienia z lepkim końcami różnego typu wtedy możemy
zastosować adaptory jednoniciowe. Te adaptory stanowią spinkę – mostek – łączący 2
końce o różnym charakterze)
b) mogą być dwuniciowe (1) (przeważnie używa się dwuniciowych)
c) mogą wykazywać się niekomplementarnością (1)
d) mogą łączyć lepki koniec 5' z lepkim 3' (albo lepki 3' z lepkim 5') (1)
3. Fragment Klenowa polimerazy I E coli:
a) wykorzystywany w znakowaniu random priming (1) (inaczej metoda przypadkowych
starterów)
b) ma aktywność egzonukleazy 5'-3' (0) (posiada aktywność egzonukleazy 3’–5’ i
polimerazy 5’-3’.
W stosunku do enzymu wyjściowego jest pozbawiony aktywności egzonukleazy 5’-3’, jest
ona bowiem kłopotliwa ze względu na to że, może degradować startery związane z matrycą
jak również może usuwać grupę 5’-fosforanową z końców DNA, które później będziemy
chcieli poddać ligacji)
c)wykorzystywany do znakowania schowanych 3' (1)
(wypełnianie i znakowanie schowanych końców 3’ dsDNA)
d)w sekwencjonowaniu DNA (1) (ale tylko metodą dideoksypochodnych, przestarzała
metoda)
Poza tym wykorzystywane też do syntezy drugiej nici cDNA i miejscowo-specyficznej
mutagenezy z wykorzystaniem syntetycznych oligonukleotydów.
4. His Taq w białku rekombinantowym:
a) zwykle nie wpływa znacząco na jego strukturę, funkcje i właściwości (1)
(spowodowane jest to małymi rozmiarami ogonka histydynowego tj. His Taq)
b) pozwala na jego oczyszczanie na złożu z tlenkiem fenyloarsenu (0)
(złożem do oczyszczania białka rekombinantowego jest kompleks Ni-kwas metylotrójoctowy
sprzężony ze złożami o charakterze wielocukrowym. Złoża wielocukrowego z tlenkiem
fenyloarsenu używa się do oczyszczania tylko jeżeli białko jest zfuzjowane z tioredoksyną)
c) stanowi sekwencję docelową dla enterokinazy (0)
d) umożliwia detekcję metodą Western Blot (1) (w przypadku białek rekombinantowych jest
to metoda klasyczna, do detekcji tą metodą można wykorzystać przeciwciało
antyhistydynowe)
5. Nick-translation inaczej metoda translacji nacięć, wykorzystywana do znakowania sond
hybrydyzacyjnych.
Przebieg procesu:
wychodzimy od matrycy, która jest nadtrawiana niewielką ilością DNAzy I (generuje ona
pewne nacięcia w wyjściowej cząsteczce DNA).
Nacięcia te służą później jako miejsca primingu dla cząsteczek polimerazy I która w nie
wchodzi i do końca 3’ dobudowuje nowe nukleotydy – do tego służy aktywność polimerazy
5’-3’.
Jeżeli substraty (deoksyrybonukleotydy), będą znakowane (haptenami lub izotopowo), to
syntezowany odcinek DNA będzie wyznakowany. O translacji nacięć mówimy w tym
przypadku dlatego, że synteza przez polimerazę I sprzężona jest z trawieniem nici DNA
znajdującej się przed enzymem – nacięcie wygenerowane przez DNAzę I w wyniku
aktywności polimerazy jest przesuwane wraz z jej aktywnością. Wytrawianie
poprzedzającego odcinka DNA jest aktywnością analogiczną do wytrawiania starterów RNA
w czasie replikacji (5’-3’)
6. BAC'i (sztuczne chromosomy bakteryjne są to odpowiednio przekonstruowane plazmidy
płciowe E.coli)
a) mogą występować w systemie binarnym (1)
(wtedy mówimy o BIBAC’ach czyli binary bacterial artificial chromosome)
b) pomieszczą insert do 1000 kb (0) (kodują b. duże odcinki DNA do ok. 350 kb, zazwyczaj
200kb)
c) w komórce występuję w formie liniowej (0) (BAC’i są koliste a YAC’i są liniowe)
d) wprowadza się je do komórki metodą elekrtotransfuzji (1) (prawda jeżeli
elektrotransfuzja = elektroporacja)
BAC’i są wykorzystywane do konstrukcji bibliotek genomowych które służą do: izolacji
określonych genów, mapowania fizycznego, sekwencjonowanie genomu. Klony w BAC’ach są
często materiałem wyjściowym do syntezy sond dla eksperymentów FISH tzn.
fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.
7. Konsekwencją integracji wektora pMutin jest:
a) insercyjna inaktywacja genu docelowego (1)
(gen docelowy jest przerwany – sekwencja orf2 została insercyjnie inaktywowana)
b) podpięcie genu reporter. lacZ pod promotor znajdujący się powyżej miejsca integracji
(1)
c) podpięcie sekwencji znajdujących się poniżej miejsca integracji pod promotor wektora
(1)
d) otrzymanie szczepu mutanta, który można wykorzystać do badania funkcji genu (1)
8. YEp: (drożdżowe wektory episomalne)
a) zawierają drożdżowy marker selekcyjny (1) (taki jak: HIS3, LEU2, LYS2, TRP1, URA3.
Markery te komplementują (uzupełniają) specyficzne mutacje auksotroficzne)
b) zawierają bakteryjny marker selekcyjny (0) (zawierają składnik bakteryjny ale nie
marker)
c) mogą się namnażać w komórkach drożdżowych (1)
d) mogą się namnażać w komórkach bakteryjnych (1)
(mają charakter wahadłowy – oprócz tego że, że posiadają zdolność funkcjonowania w kom.
drożdży, to mogą też replikować się autonomicznie w komórkach E. coli)
Należą do grupy wektorów, które replikują się autonomicznie.
Sekwencje występujące w nich to: składnik bakteryjny, klonowane DNA, drożdżowe
markery selekcyjne, sekwencje pochodzące z plazmidu o nazwie 2μm.
YEp’y utrzymywane są w kilkudziesięciu kopiach na komórkę, w porównaniu z plazmidami
integracyjnymi charakteryzują się obniżoną stabilnością. YEp’y wykorzystywane są do
nadprodukcji białek rekombinantowych, nadają się do prowadzenia kultur na dużą skalę w
różnego rodzaju fermentatorach.
9. T DNA (transformujące DNA) plazmidu Ti Agrobacterium:
a) zawiera odcinek flankujący (graniczny) prawą i lewą sekwencję (1)
(proste powtórzenia o długości 25 nukleotydów)
b) zawiera geny związane z formowaniem tumorów i katabolizowaniem opin (0)
(lewa sekwencja zawiera geny związane z formowaniem tumorów a prawa z syntezą opin,
natomiast geny katabolizujące opiny są poza T DNA)
c) zawiera geny wirulencji (0)
(geny wirulencji są w plazmidzie Ti Agrobacterium ale nie w T DNA tylko w regionie
wirulencji VIR)
d) jest przenoszone do jądra (1) (bez przeniesienia do jądra proces nie zakończy się
sukcesem z punktu widzenia bakterii. Przenoszenie do jądra zachodzi na zasadzie importu
jądrowego)
Rekombinacja pomiędzy sekwencjami granicznymi T DNA a genomem ma charakter
nieuprawniony
(nie istnieje homologia rekombinujących sekwencji).
To sprawia że, miejsce wbudowania T DNA do genomu rośliny jest nieswoiste.
10. Wektor binarny:
a) może się replikować w E. coli i u Agrobacterium (1) (ponieważ zawarte w nim ori RK2
funkcjonuje zarówno w E. coli jak i w Agrobacterium – ma zdolności autonomicznej
replikacji u obu gospodarzy)
b) ma sekwencje homologiczną do Ti (1)
c) T DNA jest oflankowane sekwencjami granicznymi (1)
System binarny bazuje na plazmidzie przygotowanym w E. coli – budowa wektora
binarnego:

sekwencje graniczne LB i RB pomiędzy którymi znajduje się miejsce klonowania MCS
oraz roślinny marker selekcyjny PTM (ta część znajdzie się w genomie komórki
roślinnej),

bakteryjny marker selekcyjny RES,

ori RK2,

ori T – warunkuje transfer koniugacyjny.
Wektor binarny po przygotowaniu w E. coli wprowadzamy do Agrobacterium, przy czym
plazmid ten w Agrobacterium może funkcjonować w postaci autonomicznej, ponieważ ma
odpowiednie ori.
Szczep Agrobacterium również posiada plazmid (plazmid pomocniczy) który jest pochodną
plazmidu Ti (nie posiada T DNA, posiada geny wirulencji). W systemie binarnym transgen
jest obecny na innym plazmidzie (binarnym), a na innym są obecne geny wirulencji
(pomocniczy) – czyli układ genu wirulencji w stosunku do transgenu ma układ trans.
11. Somatyczny transfer jądrowy:
a) pozwala na selekcje in vitro na etapie zarodków (0) (in vitro przeprowadzamy selekcję
fibroblastów, ze stabilnie wbudowanym transgenem, w efekcie dokonuje się wyboru
odpowiedniej linii komórkowej)
b) wykorzystuje enukleowane oocyty (1) (przygotowane w warunkach in vitro fibroblasty
poddaje się fuzji z enukleowanymi oocytami - czyli oocytami bez jader)
c) etapem jest mikroiniekcja do przedjądrzy męskich (0) (to jest całkiem odrębna metoda)
d) nie ma konieczności implantacji zarodków do organizmu biorczyni (0) (produkty fuzji
fibroblastów z oocytami enukleowanymi prowadzi się w kulturze do stadium moruli lub
blastuli po czym poddaje się je implantacji)
12. Rekombinacja z udziałem sekwencji lox P:
a) katalizowana jest przez drożdżową rekombinazę FLP (0) (enzymem, który przeprowadza
rekombinację w obrębie miejsc Lox P jest rekombinaza Cre pochodzenia fagowego)
b) w układzie cis loxP ze zgodna orientacją następuje inwersja sekwencji zawartej miedzy
nimi (0)
(w wyniku rekombinacji następuje delecja sekwencji zawartej między nimi)
c) w układzie cis lox P z niezgodną orientacja następuje delecja sekwencji (0)
(w wyniku rekombinacji następuje inwersja sekwencji)
d) ma charakter uprawniony (0)
Sekwencje Lox P to 2 miejsca DNA składające się z palindromowych sekwencji 13nukleotydowych i sekwencji rdzeniowej 8-nukleotydowej, która określa orientację tej
sekwencji – ma charakter kierunkowy. Oprócz 2 układów cis Lox P jest jeszcze układ trans
gdzie miejsca te są na różnych cząsteczkach DNA a rekombinacja między nimi prowadzi do
translokacji.
13. Do Vectorette PCR:
a) używamy starterów sekwencji znanej i adaptora (1)
b) startera sekwencji znanej i nieznanej (0)
c) startera sekwencji znanej i sekwencji homologicznej (0)
d) startera sekwencji znanej i zdegenerowanego (0)
Do Vectorette PCR używamy 2 starterów: startera specyficznego – przyłączającego się w
obrębie sekwencji znanej i startera posiadającego miejsce annealingu w obrębie kasety
vectorette
(czyli adaptora)
14. RACE PCR:
a) tzn. technika szybkiej amplifikacji końców chromosomów (0)
(technika szybkiej amplifikacji końców cDNA)
b) położenie konkretnych genów (0)
(technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości sekwencji, gdy znany jest tylko
fragment)
c) matryca to cDNA (1)
d) końce 2', 5' (0)
(są dwie wersje metody które odpowiadają różnym końcom cząsteczki cDNA : 3’ RACE i 5’
RACE )
15. Pytanie dotyczyło klonowania TA
Ta cloning bazuje na pewnej właściwości niektórych polimeraz termostablinych np. Taq, a
mianowicie na ich cząstkowej aktywności terminalnej transferazy co oznacza że, niektóre
polimerazy w sposób niezależny od matrycy do końca 3’ dodają nukleotydy adeninowe
tworząc w ten sposób lepkie końce – końce adeninowe są wykorzystywane do klonowania
TA. Wektor posiada analogiczne końce tymidynowe – jednonukleotydowe zazębienie
wystarcza do tego, by stosunkowo wydajnie ligować produkty PCR z takim wektorem. Jeżeli
klonujemy fragmenty restrykcyjne, to DNA klonowane jest ufosforylowane, w związku z tym
można defosforylować wektor i mimo to ligacja zajdzie. Jeżeli natomiast klonujemy produkty
PCR to DNA nie jest ufosforylowane, dlatego przy klonowaniu TA nie można zastosować
defosforylowanych wektorów – ponieważ nie połączymy cząstek. Konsekwencją tego jest
znaczne tło klonów nierekombinowanych czyli mała wydajność procesu.
16. Hybrydyzacja różnicowa:
a) służy do klonowania genów o różnej lokalizacji (0)
b) służy do klonowania genów o różnym fenotypie (1)
c) służy do wykrywania specyficznych transkryptów dla danej linii komórek (1)
d) żadna z powyższych odpowiedzi nie jest prawidłowa (0)
17. Metoda cDNA AFLP: (polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów cDNA)
a) ma mniejszą czułość niż hybrydyzacja plus/minus różnicowa (0)
b) stosujemy do syntezy ds DNA (1)
c) startery dobudowują się z sekwencja 3' (0)
d) wykorzystujemy dwustopniowa amplifikację (1) (preamplifikacja i amplifikacja
selektywna)
19. Do pozycyjnego klonowania genu metodą spaceru po chromosomie
wykorzystuje się:
A) informacje w markerach molekularnych
B)biblioteki genomowe w wektorach BAC lub YAC
C) sondy.....
mapę zintegrowaną – mamy na niej gen w otoczeniu sprzężonych loci dla markerów
molekularnych, bibliotekę genomową uszeregowaną – tzn. musimy dysponować kolekcją
klonów bakteryjnych lub drożdżowych z których każdy zawiera określoną porcję genomu i
którego lokalizację w obrębie biblioteki znamy. Ograniczenia chromosome walking:
obecność sekwencji powtarzalnych (może prowadzić to tzw. walka zbłądzonego) i obecność
sekwencji nieklonowalnych (prowadzi do walka zatrzymanego).
20. Biblioteki linking (sprzęgające):
A) ?pozwalają na klonowanie? krótki odcinków w pobliżu miejsca restrykcyjnego
B) tworzy sie w sposób... (taki jak sie naprawdę tworzy)
C)
D)Pozwalają uniknąć problemów spowodowanych przez sekwencje nieklonowane i
powtarzalne
Nie reprezentują całości genomu, ale pewną frakcję, którą stanowią sekwencje otaczające
miejsce trawienia enzymu rzadkotnącego: Procedura przygotowania biblioteki: wychodzimy
od DNA genomowego, które na początku trawimy częściowo enzymem gęsto tnącym. W
wyniku trawienia powstaje wiele małych kawałków. Produkty trawienia cyrkularyzuje się w
obecności odcinka DNA, który zawiera marker selekcyjny. Produkty ligacji są cząsteczkami
kolistymi ze spułapkowanym odcinkiem DNA zawierającym marker selekcyjny. Produkty
ligacji poddaje się trawieniu enzymem rzadkotnącym, w efekcie czego otrzymuje się małą
frakcję cząsteczek zlinearyzowanych. Fragmenty zlinearyzowane będą klonowane w
wektorze fagowym lub kosmidowym który zawiera komplementarny marker selekcyjny do
wcześniej stosowanego. Po wysianiu biblioteki otrzymamy klony zawierające marker
selekcyjny (zligowany) otoczony przez sekwencje flankujące miejsce trawienia. Użycie w
technice chromosome jumping bibliotek typu jumping i linking pozwala wyeliminować
trudności związane z sekwencjami nieklonowalnymi i powtórzonymi. Posiadanie
zidentyfikowanych ciągów klonów skaczących i sprzęgających pozwala za ich pomocą wrócić
do biblioteki standardowej i wyizolować kompletne sekwencje.
21. Drożdżowe systemy dwuhybrydowe:
a) na podstawie tej techniki możemy mieć informację o sekwencji DNA (0)
(mamy tylko informację o genach kodujących białka)
b) czy DBD wiąże się z przynętą (1) (ekspresja wektora prowadzi do powstania białka
fuzyjnego – jedna jego część odpowiada przynęcie, a druga – domenie DBD)
c) czy AD wiąże się z zdobyczą (1) (PRAY-AD)
d) czy między przynętą a zdobyczą wiązanie jest kowalencyjne (0) (oddziaływanie
niekowal.)
e) wykorzystanie białka zawierającego domenę AD (domenę aktywującą) i wiążącego się z
przynętą (0) (AD wiąże się z Prey czyli częścią rekombinantową)
f) wykorzystanie białka zawierającego domenę DBD (wiążącą DNA) i będącego przynętą (0)
(to białko nie jest przynętą tylko się z nią wiąże)
Oddziaływanie między DNA a DBD ma charakter oddziaływania niekowalencyjnego
natomiast oddziaływanie między DBD a wabikiem oraz oddziaływanie zdobycz-domena
aktywująca (PREY – AD) maja charakter kowalencyjny.
22. Touchdown PCR:
A) temperatura idzie do góry
B) używamy startera arbitralnego
C) polimerazę dodajemy pod warstwą wosku
D)
23. W metodzie real time PCR współczynnik C to:
a) współczynnik C określa cykl (nr cyklu) w którym wartość fluorescencji przekracza
wartość progową (0) (określa cykl w którym wartość fluorescencji osiąga a nie przekracza
wartość progową)
b) wartość ta daje informacje o tym ile kopii docelowej sekwencji dostarczono z matrycą do
reakcji (1)
T
T
W metodzie tej wykorzystujemy zależność, jaka istnieje między liczbą kopii docelowej
sekwencji w wyjściowym preparacie matrycy a ilością amplifikowanego produktu w danym
cyklu – im więcej docelowej sekwencji tym silniejszy produkt na danym etapie PCR.
Technika ta bazuje na obserwacji poziomu amplifikacji poprzez śledzenie natężenia
fluorescencji odpowiadającej amplifikowanemu produktowi (które jest pochodną stężenia
produktu). Stosuje się różne badania dla powiązania ilości produktu z fluorescencją np.
zastosowanie barwnika CYBERGreen lub sondy TaqMan.
24. Pirosekwencjonowanie:
a) coś o luminescencji
b) czy nukleotydy są dodawane do reakcji po kolei
c) coś o fluorescencji
d) czy usuwamy nadmiar ATD i dNTP-ów
opiera się na wykorzystaniu 3 reakcji: syntezy DNA – primer pod wpływem polimerazy
będzie miał przyłączony nukleotyd w związku z tym będzie wydłużał się on o ten nukleotyd a
jako produkt uboczny powstanie pirofosforan który jest wykorzystywany do detekcji
zdarzenia inkorporacji (włączenia nowego nukleotydu). W kolejnej reakcji którą katalizuje
enzym sulfunylaza, pirofosforan ulega konwersji w ATP. ATP jest konsumowane przez
lucyferazę w reakcji utleniania lucyferyny, a produktem ubocznym tej reakcji jest błysk
światła, który może być zarejestrowany przez odpowiedni detektor
(mamy do czynienia z chemiczną luminescencją).
Jeżeli podczas przebiegu procesu podany jest właściwy nukleotyd – zgodny z matrycą, to
jest on włączany, ale istnieje konieczność usunięcia nadmiaru substratu – nukleotydów
niewbudowanych oraz tych nukleotydów, które były niezgodne z matrycą w danym
momencie.
25. W toku testu opóźnienia w żelu (band shift assay):
a) białko oddziałujące z DNA zabezpiecza przed trawieniem przez DNazę I (1)
b) dodanie DNA niewyznakowanego ma konkurować z DNA wyznakowanym o wiązanie z
białkiem i powoduję że sygnał jest słabszy (1)
c) pytanie o tożsamość oddziałującego z DNA białka
d) superopóźnienie migrującego kompleksu osiągamy poprzez dodatek współpracującego z
sondą oligonukleotydu (0)
26. RNAse protection assay:
czy bardziej czuła od northern
Obejmuje uzyskanie sondy antysensownej, która powstaje w reakcji transkrypcji in vitro na
bazie sklonowanego fragmentu DNA, który otoczony jest przez odpowiednie promotory
fagowe.
Otrzymane sondy są w roztworze hybrydyzowane z preparatem RNA badanych.
Hybrydy są następnie obtrawiane RNAzą trzustkową i tylko perfekcyjnie dopasowane rejony
pomiędzy sondą a badanym RNA przetrwają trawienie. Żeby metoda pracowała w sposób
ilościowy trzeba do hybrydyzacji zastosować nadmiar sondy (tak by wysycać całą możliwą
pulę docelowych cząsteczek). Zaletami tej metody są: wysoka czułość – ale nie aż taka jak
RT-PCR, hybrydyzacja w roztworze zachodzi wydajniej niż na błonach, mniejsze niż w
Northern wymagania co do jakości preparatu, wygodne jest analizowanie wielu docelowych
cząsteczek RNA jednocześnie – w przeciwieństwie do Northern – na jednym żelu można
analizować ekspresję różnych genów poprzez zastosowanie różnych sond.
Wady: tracimy informacje o wielkości transkryptu, gdyż jego końcowe rejony oraz sondy są
obtrawiane działaniem nukleolitycznym, wymagana jest bezwzględna homologia pomiędzy
sondą i docelową cząsteczką.
27. W metodzie FAR WESTERN:
A) sondą jest zawsze przeciwciało dla danego białka (0)
B)białka mogą być przygotowywane podobnie jak w metodzie western blot (?)
C)sondy białkowe mogą być wykorzystywane w sekwencjonowaniu..... (0)
D)możemy poznać tożsamość badanego białka (1)
28. Forward genetics [odwrotna genetyka]
A) Punktem wyjścia dla... charakterystyki docelowego genu jest fenotyp molekularny
B)Punktem wyjścia jest... gen, który poddaje się mutacji w celu poznania jego funkcji
C)Mozna wykorzystać... funkcjonalne fenokopie zmutowanych...
D)
29.Proteomika
30. Przy konstrukcji bibliotek genomowych:
a) stosujemy elektroforezę pulsową (1)
b) duża pojemność wektora zmniejsza szanse na znalezienie docelowej sekwencji (1)
c) bazu...
Plik z chomika:
Yato-sama
Inne pliki z tego folderu:

pytania INZYNIERIA GENETYCZNA 2009.doc (3149 KB)
 Sprawozdanie.docx (256 KB)
 2 termin poprzedniego roku.doc (54 KB)
 kompilacja pytań.doc (89 KB)
 Inżynieria genetyczna - pytania 2014r.docx (16 KB)
Inne foldery tego chomika:

Analiza i diagnostyka mikrobiologiczna
 Enzymologia
 Grafika inżynierska
 Inżynieria bioprocesowa
 Podstawy biotechnologii przemysłowej
Zgłoś jeśli naruszono regulamin







Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dla Mediów
Dział Pomocy
Opinie
Program partnerski




Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Ochrona praw autorskich
Platforma wydawców
Copyright © 2012 Chomikuj.pl