Ćwiczenie 3A. Procedura wykonania

Ćwiczenie 3A. Procedura wykonania
1.
Izolacja limfocytów z krwi obwodowej metodą wirowania w gradiencie. Rozetkowanie.
Przygotowanie zawiesiny komórkowej o określonej koncentracji.
Przygotowanie sprzętu:
- narzędzia: statywy, laboratoryjny pojemnik na odpady, zlewki, pojemniki na
dopełniacz i eozynę
- probówki plastikowe 12ml i 4ml, pipetki plastkowe, szklane butelki,
- płytki Terasakiego, szkiełka nakrywkowe
- pipety eppendorffa o zakresie do 1ml
- jałowe tipsy – 1ml
- dyspensery – 1 i wielokanałowe (mikrostrzykawka Hamiltona)
- stopery
-pudełko styropianowe jako ciemnia
- mikroskop - inwertoskop
Odczynniki:
- płytki Terasakiego z surowicami
- PBS, płyn Hanksa, Gradisol L, 0,9%NaCl, woda destylowana
- eozyna, formalina
- dopełniacz króliczy-liofilizat
- jałowa woda destylowana w ampułkach
- FCS
- parafina
- krwinki baranie
Materiał:
- krew pobrana do strzykawkoprobówki z heparyną (lub węzły chłonne – wtedy inna procedura
izolacji)
Wykonanie:
1. Krew przenosimy ze strzykawkoprobówki do dużej probówki.
2. Wirujemy 5-7min z prędkością 1500 obr/min
3. Ściągamy kożuszek limfocytów do przeplukanych PBS butelek z 12 ml płynu Hanksa
4. Przygotowaną zawiesinę limfocytów nawarstwiamy na Gradisol L w probówkach 12ml
(2-4probówki) do 1/3 ich wysokości
5. Wirujemy 20min z prędkością 2200 obr/min – zaczynamy od 1500obr/min, pełne obroty
osiągamy stopniowo przez 2-3min
6. Ściągamy uzyskany pierścień limfocytów do 2 dużych probówek podpisanych B (z 3
probówek) i T (z 1 probówki) i do dodajemy płyn Hanksa do probówki T i 10%
roztworem FCS do probówki B.
7. Wirujemy 5-7min z prędkością 1500 obr/min
8. Roztrzepujemy guziczek limfocytów i dodajemy płyny jak w etapie 6.
9. Wirujemy 5-7min z prędkością 1500 obr/min
10. Roztrzepujemy guziczek limfocytów i od tej pory procedura izolacji limfocytów B z
zawiesiny metodą rozetkowania i wykonania testu limfocytotoksycznego inaczej
wygląda dla limfocytów T i limfocytów B
2.
Wykonanie testu limfocytotoksycznego.
1.
Przygotowanie roztworów

1% krwinki baranie – ściągamy supernatant z próbówki z krwinkami barana, do
osadu dodajemy 15ml płynu Hanksa, lekko mieszamy i przenosimy do podpisanej
buteleczki

10% roztwór FCS+płyn Hanksa- 2,5ml FCS + 22,5 ml płynu Hanksa

20% roztwór FCS+płyn Hanksa- 1ml FCS + 4 ml płynu Hanksa
2.
Test limfocytotoksyczny
Limfocyty T
1.
2.
Do probówki T z roztrzepanym
guziczkiem dodajemy kilka
kropel płynu Hanksa, tak aby
uzyskać zawiesine komórek o
gęstości 2000 komórek/ul i
kontrolujemy gęstość na płytce
Terasakiego w inwertoskopie
Przechodzimy do etapu 10
Limfocyty B – rozetkowanie
1. Do roztrzepanego guziczka dodajemy 1ml
krwinek baranich i 1 ml 20% FCS
2. Do probówek 4ml wlewamy Gradisol L do 1/2
wysokości i nawarstwiamy na niego
przygotowaną mieszaninę
3. Inkubujemy 5 min. W temperaturze pokojowej
4. Wirujemy 15 min z prędkością 2000 obr/min –
zaczynamy od 1500obr/min, pełne obroty
osiągamy stopniowo przez 2-3min
5. Ściągamy pierścień i płuczemy 10% FCS
6. Wirujemy 5-7min z prędkością 1500 obr/min
7. Roztrzepujemy guziczek i wykonujemy
ponownie etapy 1-6
8. Roztrzepujemy guziczek i dodajemy kilka
kropel 10% FCS, tak aby uzyskać zawiesine
komórek o gęstości 2000 komórek/ul i
kontrolujemy gęstość na płytce Terasakiego w
inwertoskopie
9. Dalej wykonujemy tak jak od pkt. 10w
procedurze dla limfocytów T – czasy inkubacji
odpowiednio z surowicami -60min, z
dopełniaczem 75min
10. kapiemy zawiesinę dyspenserem 1-kanałowym na płytkę Terasakiego z surowicami
11. inkubujemy 40min
12. dodajemy dopełniacz króliczy rozpuszczony w 1 ml wody destylowanej w pojemniku
na dopełniacz używając dyspensera wielokanałowego
13. inkubujemy 60min bez dostępu światła
14. dodajemy eozynę i formalinę nałożone do pojemnika używając dyspensera
wielotorowego w odstępie 5 min
15. płytki zostawiamy na 5min
16. pokrywamy otworki warstwą parafiny
17. kładziemy szkiełka nakrywkowe
18. po 10 min odczytujemy w inwertoskopie