markery genetyczne.cdr - Instytut Badawczy Leśnictwa

Instytutu Badawczego Leœnictwa
P r z e c z y ta j, w y k o r z y s ta j, z a c h o w a j
ISSN 1509–7447
4(64)/2004(XII)
Notatnik Naukowy
Badanie zró¿nicowania genetycznego
u sosny zwyczajnej za pomoc¹
markerów genetycznych (RAPD)
Justyna Nowakowska
Instytut Badawczy Leœnictwa,
Zak³ad Genetyki i Fizjologii Drzew Leœnych
e-mail: [email protected]
Zró¿nicowanie genetyczne populacji drzew leœnych jest podstawowym czynnikiem utrzymania równowagi ekologicznej, m.in. poprzez zachowanie
podstawowej puli genowej, warunkuj¹cej stabilnoœæ gatunku w przyrodzie.
Identyfikacja organizmów lub ich populacji jest mo¿liwa dziêki ró¿nicom w
budowie kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA). Zró¿nicowanie to, inaczej polimorfizm DNA, jest charakterystyczne zarówno dla grup populacji
(zmiennoœæ miêdzypopulacyjna), jak i dla pojedynczych populacji (zmiennoœæ wewn¹trzpopulacyjna).
Ustalenie to¿samoœci genetycznej materia³u biologicznego i okreœlenie jego
genetycznego pochodzenia, czyli filogenezy, opiera siê na badaniu markerów
genetycznych. S¹ to fragmenty DNA lub RNA, które identyfikuj¹ ró¿nice w
budowie genomu miêdzy organizmami. Obecnie rozpoznano wiele ró¿nych
markerów DNA, które umo¿liwiaj¹ badanie kodu genetycznego w DNA
j¹drowym, mitochondrialnym i chloroplastowym. Dziêki temu markery molekularne znajduj¹ szerokie zastosowanie w identyfikacji ró¿nic genetycznych miêdzy drzewami oraz miêdzy drzewostanami. Precyzyjn¹ detekcjê
polimorfizmu w ca³ym genomie umo¿liwia technika oparta na ³añcuchowej
reakcji polimerazy (PCR), która polega na losowym powieleniu wybranych
fragmentów DNA , (z ang. randomly amplified polymorphic DNA – RAPD).
Czu³oœæ tej metody jest bardzo wysoka i teoretycznie pozwala na wielokrotne
powielenie jednej cz¹steczki DNA obecnej w ekstrakcie. Powielane fragmenty DNA s¹ nastêpnie identyfikowane poprzez elektroforezê1, podczas
której nastêpuje rozdzia³ fragmentów DNA wed³ug ich wielkoœci i masy
cz¹steczkowej. W Zak³adzie Genetyki i Fizjologii Drzew Leœnych zakoñInstytut Badawczy Leœnictwa
ul. Bitwy Warszawskiej 1920 Roku nr 3, 00-973 Warszawa, e-mail: [email protected]
Odleg³oœci genetyczne (podobieñstwo, w %)
Ryc. 1: Rozdzia³ elektroforetyczny fragmentów
DNA dla populacji sosny, pochodzenie Smolarz
(Nadl. Smolarz, leœnictwo Zagórze,
oddzia³ 268-b, c, g) przy u¿yciu metody RAPD:
M – wyznacznik wielkoœci fragmentów,
1-13 – drzewa wybrane losowo w drzewostanie,
995-996 – drzewa doborowe.
czono aktualnie badania 30 pochodzeñ sosny zwyczajnej z ró¿nych mikroregionów nasiennych
z u¿yciem metody RAPD, okreœlaj¹c stopieñ zró¿nicowania genetycznego ka¿dego z badanych
pochodzeñ. Zilustrowany przyk³ad dotyczy wyników analiz RAPD pochodzenia Smolarz (ryc.
1). Uzyskany na podstawie rozdzia³u elektroforetycznego dendrogram podobieñstwa genetycznego miêdzy drzewami tego pochodzenia wskazuje, ¿e kszta³tuje siê ono na poziomie 80100%. Podobny stopieñ podobieñstwa drzew jest m.in. w pochodzeniach Supraœl, Bytów, Wejherowo, Syców i Nowogród. Oznacza to, ¿e populacje te posiadaj¹ doœæ jednorodn¹ strukturê
genow¹ pod wzglêdem zastosowanych markerów RAPD. Pochodzenia sosny najbardziej zró¿nicowane pod wzglêdem stosowanych markerów RAPD to m.in. Nowe Ramuki, Janów Lub.,
Kozienice, Gubin i Miêdzyzdroje. Analiza stopnia pokrewieñstwa miêdzy pochodzeniami sosny
zwyczajnej z ró¿nych mikroregionów nasiennych w Polsce wskazuje na wystêpowanie trzech
g³ównych grup pochodzeñ zbli¿onych genetycznie (ryc. 2 i 3). Dendrogram dystansów genetycznych wskazuje na wyró¿nienie takich grup jak: 1) grupa populacji Kluczbork – Józefów; 2)
grupa Spa³a – Lipka oraz 3) grupa Boles³awiec – Krucz. Pochodzenie Bia³owie¿a oddziela najwiêkszy dystans genetyczny od pozosta³ych populacji, co wskazywa³oby na odrêbn¹ filogenezê
tego pochodzenia oraz na najmniejsz¹ ingerencjê cz³owieka w sk³ad gatunkowy Puszczy w przesz³oœci. Wymienione grupy pochodzeñ zbli¿onych genetycznie s¹ zlokalizowane w Polsce w
sposób rozproszony (ryc. 3). Jedynie w po³udniowej czêœci kraju dominuj¹ cztery pochodzenia
sosny z pierwszej grupy (Kluczbork, Niepo³omice, Janów Lubelski i Józe-fów), a w regionie
pó³nocno-zachodnim pochodzenia z drugiej grupy filogenetycznej (Smolarz, Goleniów, Miêdzyzdroje, NiedŸwiady, Bytów, Woziwoda i Wejherowo).
Pochodzenie
0,045
0,037
0,029 0,023 0,017
Ryc. 2. Dendrogram odleg³oœci
genetycznej 30 badanych pochodzeñ
sosny zwyczajnej na podstawie analizy
skupieñ (UPGMA).
0,008
0
Microregion
nasienny
Kluczbork
654
Mi³om³yn
106
Bolewice
306
Niepo³omice
607
£ochów
403
Gubin
307
Supraœl
207
Janów Lub.
606
Józefów
606
Spa³a
601
Nowogród
401
Wyszków
402
Syców
501
Goleniów
101
NiedŸwiady
302
Bytów
105
Miêdzyrzec
404
Smolarz
104
Woziwoda
305
Wejherowo
108
Miêdzyzdroje
107
Strzelce
405
Nowe Ramuki
205
Lipka
303
Boles³awiec
504
Augustów
204
Kozienice
Strza³owo
602
206
Krucz
Bia³owieza
352
208
Analiza zmiennoœci genetycznej sosny zwyczajnej z ró¿nych mikroregionów matecznych
za pomoc¹ markerów RAPD potwierdzi³a s³usznoœæ przyjêtego w Polsce podzia³u na bazy nasienne. Mog¹ byæ one stosowane równie¿ do wyznaczania regionalizacji nasiennej zasobów
genowych.
Ogólnie mo¿na przyj¹æ, ¿e populacje o wysokim stopniu zró¿nicowania genetycznego s¹ bardziej odporne na takie czynniki œrodowiskowe jak gradacje szkodliwych owadów, choroby (wywo³ane przez grzyby, bakterie i wirusy) oraz anomalie klimatyczne (stres termiczny, susza itp.). Markery genetyczne mog¹ mieæ równie¿ zastosowanie w diagnostyce czynników chorobotwórczych
roœlin, czyli w wykrywaniu obecnoœci patogenów (bakterii, wirusów, grzybów) przed pojawieniem
siê makroskopowych symptomów chorobowych. Ponadto, mog¹ byæ wykorzystane do oceny materia³u rozmno¿eniowego, m.in. w identyfikacji Ÿród³a pochodzenia nasion. Ocena zmiennoœci genetycznej gatunków drzew leœnych na podstawie analiz DNA mo¿e mieæ równie¿ szerokie zastosowa-
Ryc. 3. Mapa zró¿nicowania genetycznego badanych pochodzeñ sosny zwyczajnej
wed³ug stopnia pokrewieñstwa UPGMA i podzia³u na mikroregiony nasienne
108
105
107
302
101
305
205
207
303
104
352
402
403
208
306
307
602
504
501
405
Jan
654
Joz
LEGENDA:
grupa 1
grupa 2
607
grupa 3
Puszcza Bia³owieska
granice makroregionów nasiennych
granice mikroregionów nasiennych
nie w regionalizacji nasiennej zasobów genowych nie tylko sosny. Dziêki markerom DNA w
najbli¿szej przysz³oœci bêdzie mo¿na rozró¿niæ krzy¿ówki np. dêbu szypu³kowego i bezszypu³kowego, czy modrzewia europejskiego i japoñskiego.
Wiêcej szczegó³ów dotycz¹cych wyników badañ nad zmiennoœci¹ genetyczn¹ sosny zwyczajnej mo¿na znaleŸæ w: Nowakowska J. 2003. Zró¿nicowanie genetyczne wybranych populacji sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) na podstawie analiz RAPD. Sylwan 11: 26-37.
––––––––––––––––––––––
1 Na³adowane ujemnie cz¹steczki DNA umieszczone s¹ w ¿elu i poddane migracji w w polu elektrycznym.
Szybkoœæ ich ruchu zale¿y od d³ugoœci fragmentów badanych kwasów nukleinowych, widocznych po
naœwietleniu ¿elu promieniami UV.