Metody oceny odpowiedzi humoralnej

Metody oceny odpowiedzi
humoralnej
Renata Jenek
Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej
Uniwersytetu Medycznego
im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
Reakcje antygen-przeciwciało
1. Odczyn precypitacji
– krzywa precypitacji
– techniki immunodiagnostyczne przeprowadzane w żelach (agar,
agaroza)
– pomiar zmętnienia
– testy wykorzystujące odczynniki znakowane (izotopy, enzymy,
fluorochromy)
2. Odczyn aglutynacji
– aglutynacja bezpośrednia (czynna)
– aglutynacja pośrednia (bierna)
– odczyn antyglobulinowy (test Coombsa)
3. Przykłady zastosowania testów,wybór metod
immunodiagnostycznych
Odczyn precypitacji
Techniki immunodiagnostyczne przeprowadzane w
żelu agarowym lub agarozowym
•
•
•
•
•
•
•
Podwójna dyfuzja w agarze (PDA) wg Ouchterlony
Immunoelektroforeza przeciwprądowa
Dyfuzja radialna wg Mancini
Immunoelekroforeza rakietkowa
Immunoelektroforeza
Immunoelektroforeza krzyżowa wg Laurella
Immunofiksacja
Podwójna dyfuzja w agarze
Podwójna dyfuzja w agarze
• Oznaczanie miana swoistych
przeciwciał w surowicy
• Miano to najwyższe
rozcieńczenie surowicy przy
którym (po 24-48 godz.
dyfuzji) obserwujemy prążek
precypitatu
Immunoelektroforeza
• Antygeny ze studzienek są
rozdzielane w polu
elektrycznym
• Pomiędzy studzienkami
wycina się rowek do którego
wprowadza się przeciwciała,
które dyfundują do żelu
• Reagujące ze sobą antygeny i
przeciwciała tworzą łuki
precypitacyjne
Immunoelektroforeza krzyżowa
•
•
Po I rozdziale elektroforetycznym antygenów ze studzienki, przeprowadza
się II elektroforezę w kierunku prostopadłym do pierwszego
Rozdzielone wstępnie antygeny wędrując poprzez żel zawierający
przeciwciała tworzą łuki precypitacyjne
Odczyn precypitacji
Pomiar zmętnienia
• Turbidymeria
• Nefelometria
Turbidymetria
• Pomiar zmętnienia roztworu,
który zawiera kompleksy
antygen-przeciwciało.
badana próbka
fotodetektor
• Służy do oznaczania
ilościowego różnych
cząsteczek w płynach
ustrojowych m.in.:
– Immunoglobulin –
podstawowych klas,
swoistych np. RF.
– Składowych dopełniacza
– Innych białek osocza
Źródło światła
osłony
Nefelometria
• Pomiar rozproszenia
światła przez zawiesinę
antgen-przeciwciało
Żródło światła
• Bardziej czuła w
porównaniu z turbidymetrią
• Zastosowania jak
turbidymetria dodatkowo:
– Podklasy Ig’s
– Łańcuchy lekkie Ig
Zawiesina
antygen-przeciwciało
Układ optyczny
Detoktor
Testy wykorzystujące odczynniki
znakowane
1. Metody izotopowe (RIA)
–
–
–
Test bezpośredni (Farra)
Test pośredni w fazie stałej, np. RAST
Test podwójnego wiązania (test „kanapkowy”, sandwich test),
np. RIST
2. Metody immunoenzymatyczne (ELISA)
•
•
Test pośredni w fazie stałej
Test podwójnego wiązania (test „kanapkowy”, sandwich
test)
Immunoblotting- testy paskowe
• Metoda kropkowa - nanoszenie białek na
membrany (dot-blot, immunofiksacja punktowa)
• Western blots – przenoszenie białek z żeli na
membrany
Testy immunohistochemiczne
Wykrywanie i identyfikacja antygenów, przeciwciał
i kompleksów immunologicznych na poziomie
komórek i tkanek
• Immunofluorescencja bezpośrednia
• Immunofluorescencja pośrednia
• Wykorzystanie przeciwciał znakowanych
enzymami (HRP, ALP)
Immunofluorescencja bezpośrednia
Immunofluorescencja pośrednia
Metodyka:
• Przyrządzanie skrawków
mrożeniowych z pożądanych
tkanek lub osadów
komórkowych
• Utrwalanie
• Inkubacja z odpowiednio
rozcieńczoną surowicą
badaną
• Inkubacja ze znakowanym
przeciwciałem skierowanym
przeciwko ludzkim
immunoglobulinom
• Ocena w mikroskopie
fluorescencyjnym
Odczyn aglutynacji
•
•
•
•
•
Aglutynacja bezpośrednia (czynna)
Aglutynacja pośrednia (bierna)
Hemaglutynacja (czynna i bierna)
Odczyn antyglobulinowy Coombsa
Test hamowania aglutynacji
Wiarygodność metody
Wiarygodność metody określają takie
czynniki jak:
– swoistość
– dokładność
– precyzja (powtarzalność, odtwarzalność,
porównywalność międzylaboratoryjna)
– czułość
Zastosowanie testów, przykłady
• Diagnostyka niedoborów odpornościowych:
– oznaczenie poziomu klas i podklas Ig i składowych dopełniacza metodą
immunodyfuzji radialnej, turbidymetria, nefelometria, ELISA
• Wykrycie i różnicowanie gammapatii poliklonalnej i monoklonalnej:
– elektroforeza surowicy na octanie celulozy, immunoelektroforeza lub
immunofiksacja, wykrywanie białka Bence-Jonesa w moczu metodą
immunoelektroforezy, oznaczenie poziomu Ig i łańcuchów lekkich
immunoglobulin w surowicy i w moczu metodą turbidymetrii lub
nefelometrii
• Wykrywanie obecności kompleksów immunologicznych w surowicy:
– immunoelektroforeza
– i w tkance : test fluorescencji bezpośredniej
• Wykrywanie obecności autoprzeciwciał :
– fluorescencja pośrednia, elektroforeza przeciwprądowa, immunofiksacja
punktowa dot-blot, Western-blot, ELISA
• Ocena antygenów i przeciwciał w chorobach infekcyjnych :
– aglutynacja bierna, immunoelektroforeza przeciwprądowa, ELISA
• Ocena IgE w chorobach alergicznych :
– testy izotopowe RIST, RAST, testy paskowe dot-blot, Western-blot
• Oznaczanie poziomu hormonów :
– testy izotopowe metoda kompetycyjna
•
Typowanie grup krwi :
–
•
Wykrywanie czynnika reumatoidalnego :
–
•
test hemaglutynacji bezpośredniej
test lateksowy na szkiełkach, test Waalera-Rosego,
turbidymetria, nefelometria
Wykrywanie przeciwciał anty Rh w anemii
hemolitycznej noworodków :
–
test Coombsa