Post. Mikrobiol. 3-2014.indb - Postępy Mikrobiologii
advertisement
PO L SK IE TOWA R Z YST WO MIK RO B IO LOGÓW Kwartalnik Tom 53 Zeszyt 3•2014 LIPIEC – WRZESIE¡ CODEN: PMKMAV 53 (3) 2014 Advances in Microbiology PO L SK IE TOWA R Z YST WO MIK RO B IO LOGÓW Kwartalnik Tom 53 Zeszyt 4•2014 PAèDZIERNIK – GRUDZIE¡ CODEN: PMKMAV 53 (4) 2014 Index Copernicusin ICVMicrobiology = 9,52 (2012) Advances Impact Factor ISI = 0,271 (2013) Punktacja MNiSW = 15,00 (2012) http://www.pm.microbiology.pl RADA REDAKCYJNA JACEK BARDOWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), DARIUSZ BARTOSIK (Uniwersytet Warszawski), JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), NADZIEJA DRELA (Uniwersytet Warszawski), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), JACEK MIĘDZOBRODZKI (Uniwersytet Jagielloński), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), RADOSŁAW STACHOWIAK (Uniwersytet Warszawski), BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański), ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowa Akademia Techniczna), STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Narodowy Instytrut Zdrowia Publicznego, Państwowy Zakład Higieny), GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JACEK BIELECKI (redaktor naczelny), BOHDAN STAROŚCIAK (zastępca), RADOSŁAW STACHOWIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich) ADRESY REDAKCJI Redaktorzy: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 04, fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (22) 628 08 22, (22) 621 13 51 e-mail: [email protected] Sekretarz Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 12, fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie) Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardy Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorski Uniwersytet Medyczny, Al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin, tel./fax: (91) 46 616 51, 52, lub fax: (91) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected] STALI RECENZENCI: JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), JÓZEF KUR (Politechnika Gdańska), EUGENIUSZ MAŁAFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wrocławiu) CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOWĄ POMOCĄ MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1 Informacja o zdjęciu na okładce: Prototheca blaschkeae – stadia rozwojowe: sporangia i sporangiospory. SEM, pow. 2 000 x. Autor zdjęcia: dr n. med. Tomasz Jagielski; Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, ul. I. Miecznikowa 1; 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected]. P O L S K I E T O WA R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W Nakład 1150, Objętość 12,5 ark. wyd., Papier offset 80 g Skład i druk: Zakład Wydawniczy Letter Quality, tel. 22 115 38 10, 607 217 879 e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 207–209 http://www.pm.microbiology.pl WSPOMNIENIE Profesor dr habilitowany Marek Niemiałtowski 1945–2014 15 czerwca 2014 r., zmarł profesor zwyczajny dr hab. Marek Niemiałtowski, zasłużony nauczyciel akademicki i wybitny immunolog, wieloletni kierownik Katedry Nauk Przedklinicznych, kierownik Zakładu Immunologii i były prodziekan ds. nauki Wydziału Medycyny Weterynaryjnej SGGW, były przewodniczący Komitetu Mikrobiologii PAN. Całe życie zawodowe związał ze Szkołą Główną Gospodarstwa Wiejskiego, w której przepracował 42 lata. Profesor Marek Niemiałtowski urodził się 29 marca 1945 roku w Zielonej, powiat Otwock. W roku 1963 ukończył Liceum im. Jana Zamoyskiego w Warszawie. W latach 1966–1972 studiował na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Warszawskiego. W 1972 r. otrzymał tytuł magistra biologii w zakresie mikrobiologii i podjął pracę w Zespole Mikrobiologii Instytutu Chorób Zakaźnych i Inwazyjnych Wydziału Wetery­na­ ryjnego SGGW, kolejno na stanowisku asystenta stażysty, asystenta i starszego asystenta. Praca nauczyciela była Jego powołaniem. Chętnie i z satysfakcją dzielił się swoją wiedzą i umiejętnoś­ ciami. Prowadził zajęcia z mikrobiologii dla studentów Wydziału Weterynaryjnego, Wydziału Zootechnicznego, specjalistyczne zajęcia na Studium Doktoranckim oraz dla słuchaczy Studium Medycznego. Z pasją realizował swoje zainteresowania naukowe, które koncentrowały się wokół wirusologii i immunologii. Niezależnie od głównego nurtu zainteresowań, uczestniczył w badaniach nad cytotoksycznym oddziaływaniem enteropatogennych szczepów E. coli, we współpracy z prof. dr hab. Zbigniewem Szynkiewiczem. Na stałe związał się z wirusologicznym zespołem badawczym, a opiekunem naukowym i promotorem Jego pracy doktorskiej został prof. dr hab. Konrad Malicki. W 1981 roku uzyskał stopień naukowy doktora nauk przyrodniczych w Wojskowym Instytucie Higieny i Epidemiologii w Warszawie na podstawie pracy: Charak­ terystyka dzikich szczepów, temperaturowych linii oraz klonów wirusa choroby pęcherzykowej świń (SVD) na podstawie morfologii łysinek i patogenności dla osesków myszy i w tym samym roku awansował na stanowisko adiunkta w Zespole Mikrobiologii Wydziału Weterynaryjnego SGGW. W kolejnych latach Profesor Marek Niemiałtowski doskonalił swój warsztat badawczy odbywając liczne staże naukowe, krajowe i zagraniczne. W latach 1983–1985 przebywał w National Animal Disease Center, Ames, USA, gdzie pracował w zespole profesora Stanisława P. Targowskiego. To spotkanie i współpraca zaowocowały serdeczną przyjaźnią. Badania jakie prowadzili, dotyczyły roli komórek układu białokrwinkowego w odporności miejscowej gruczołu mlekowego u krowy. Po powrocie ze stażu, Profesor Niemiałtowski zajął się badaniem roli granulocytów obojętnochłonnych w przebiegu zakażeń wirusowych. W swojej pracy zastosował oryginalną metodykę z użyciem komory migracyjnej. Wyniki prowadzonych badań stały się podstawą do przygotowania pracy habilitacyjnej. 30 kwietnia 1988 r., Rada Wydziału Weterynaryjnego SGGW-AR w Warszawie nadała dr Markowi Niemiałtowskiemu stopień doktora habilitowanego nauk weterynaryjnych, na podstawie dorobku naukowego i rozprawy habilitacyjnej: Wpływ wirusowego zakażenia na receptory Fc i receptory immunologiczne nieswoiste granulocytów obojętnochłonnych krwi – bada­ nia modelowe in vitro. 208 WSPOMNIENIE W styczniu 1989 r. został powołany na stanowisko docenta w Katedrze Mikrobiologii Wydziału Weterynaryjnego SGGW-AR w Warszawie. Intensywnie pracował badawczo i dydaktycznie, nie utracił jednak pasji poznawczej i w roku 1989 ponownie wyjechał do USA, tym razem do zespołu profesora Barry T. Rouse’a w University of Tennessee, Knoxville, gdzie pracował do 1992 r. Zajmował się tam mechanizmami immunopatologicznymi towarzyszącymi zapaleniu rogówki w przebiegu zakażenia herpeswirusem typu 1 (HSV-1) u ludzi. Podczas pobytu w zespole profesora Rouse’a poznał wybitnych immunologów i wirusologów amerykańskich. Bardzo cenił te osobiste kontakty. Podczas pobytu w USA, został członkiem American Association of Immunologists i American Association of the Advancement of Science oraz Association for Research in Vision and Ophthalmology. Z profesorem B.T. Rouse’m połączyła Go serdeczna przyjaźń, którą cementowały późniejsze, wielokrotne wizyty w Polsce i jego udział w konferencjach naukowych. Opublikował ważne poznawczo prace i sformułował własny program badawczy, który konsekwentnie realizował po powrocie do kraju. W ramach Katedry Mikrobiologii stworzył zespół, zajmujący się immunobiologią wirusa ektromelii, wybranego jako naturalny model badawczy w wirusologii doświadczalnej i w immunologii zakażeń pokswirusami. W roku 1997 został powołany na stanowisko kierownika Katedry Mikrobiologii i Immunologii na macierzystym wydziale. Wprowadził zwyczaj cotygodniowych seminariów naukowych, podczas których występowali zarówno doktoranci, jak i znani profesorowie z krajowych i zagranicznych ośrodków naukowych. Było to bardzo inspirujące i przyczyniło się do nawiązania i utrwalenia naukowych i osobistych bliskich znajomości z wybitnymi przedstawicielami polskiej immunologii, medycyny i wirusologii. Profesor Marek Niemiałtowski aktywnie działał w Polskim Towarzystwie Immunologii Doświadczalnej i Klinicznej (PTIDiK), w latach 1986–2014. Jako przewodniczący Sekcji Immunologii Zakażeń został głównym organizatorem IX Zjazdu PTIDiK, który odbył się na SGGW w 1998 r. Wzięli w nim udział wybitni naukowcy, w tym profesorowie Peter C. Doherty i Rolf Zinkernagel, laureaci Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny z 1996 r. Obaj, z inicjatywy Profesora Niemiałtowskiego, który został ich promotorem, otrzymali doktoraty honorowe SGGW w 1998 r. Organizacja sympozjów, konferencji i zjazdów, stała się pasją Profesora Niemiałtowskiego, a konferencje pod auspicjami Komitetu Mikrobiologii PAN i SGGW weszły na stałe do kalendarza spotkań naukowych w Polsce. Drugą Jego pasją była praca dydaktyczna nie ograniczająca się do programowych zajęć z mikrobiologii, wirusologii i immunologii, ale skierowana także do absolwentów, magistrów i lekarzy, uczestników Studium Doktoranckiego przy Wydziale Medycyny Weterynaryjnej SGGW, które zorganizował w 1999 r. i którym kierował do śmierci. W 1999 r. Profesor Marek Niemiałtowski uzyskał tytuł profesora nauk weterynaryjnych. W 2002 r. został powołany na stanowisko profesora zwyczajnego SGGW w Warszawie. Z głębokim zaangażowaniem wypełniał swoje obowiązki naukowe, dydaktyczne i organizacyjne. Dwukrotnie pełnił funkcję prodziekana ds. nauki Wydziału Medycyny Weterynaryjnej SGGW oraz brał udział w pracach Komisji Senackich SGGW. Wypromował wielu magistrów, licencjatów i inżynierów, absolwentów Międzywydziałowego Studium Biotechnologii oraz Wydziału Rolnictwa i Biologii SGGW. Profesor Marek Niemiałtowski był autorem i współautorem ponad 70. prac naukowych, w większości opublikowanych w czasopismach o zasięgu światowym. Był też stałym recenzentem projektów badawczych składanych do konkursów Komitetu Badań Naukowych, a obecnie Narodowego Centrum Nauki. Do roku 2013 w ramach Studium Doktoranckiego, którego pięć kolejnych edycji prowadził, wypromował dwunastu doktorów nauk weterynaryjnych, a trzynasty doktorat ostatecznie zaaprobował do obrony w czasie choroby, w maju 2014 r. Pozostawił dwa otwarte przewody doktorskie. Był też recenzentem dorobku naukowego doktorów habilitowanych i pro­ fesorów. Pracował w radzie naukowej Instytutu Weterynarii w Puławach W latach 1999–2002 Profesor pełnił funkcję wiceprzewodniczącego Komitetu Mikrobiologii Wydziału II Polskiej Akademii Nauk i z pasją i głębokim przekonaniem zaangażował się w prace Komitetu. Ta aktywność przyczyniła się do wybrania w 2003 r., Profesora Marka Niemiałtowskiego na przewodniczącego Komitetu Mikrobiologii PAN. Funkcję tę sprawował przez dwie kadencje, do 2011 r. Już w roku 2003 zgłosił propozycję ustanowienia głównej nagrody Komitetu Mikrobiologii im. profesora Kazimierza Bassalika, przeznaczonej dla najlepszej pracy eksperymentalnej wykonanej w polskich laboratoriach naukowych. Po raz pierwszy nagroda była wręczona w grudniu 2004 r. Jednym z priorytetów Profesor uczynił stworzenie stałej platformy spotkań naukowców z kraju i zagranicy i zrealizował ten cel w postaci corocznych konferencji, które odbywały się w Szkole Głównej Gospodarstwa Wiejskiego. Uważał tez za niezwykle ważne zbliżenie środowisk naukowych Ukrainy i Polski. Chciał, żeby Polska przyczyniła się do wprowadzenia Ukrainy do Unii Europejskiej. W tym działaniu mógł liczyć na profesora Andriya Sibirnego, z Ukraińskiej Akademii Nauk we Lwowie. Profesor Niemiałtowski wielką wagę przywiązywał do integracji środowisk polonijnych. W latach 1998–1999, nawiązał współpracę z senatorem RP Janem Stypułą i Stowarzyszeniem „Wspólnota Polska”, brał udział w licznych wyjazdach WSPOMNIENIE do polonijnych ośrodków na Litwie, w Łotwie, Estonii i Rosji. Ważnym wydarzeniem był, współorganizowany przez Profesora, Polonijny Kongres Nauk Weterynaryjnych na SGGW w 1999 r. Dzięki Jego zaangażowaniu i konsekwentnemu działaniu, na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej SGGW, odbyło się ponad 30 konferencji naukowych, w tym czternaście z cyklu „Biologia molekularna w diagnostyce chorób zakaźnych i biotechnologii”. Profesor Niemiałtowski zorganizował także trzy Polsko-Ukraiń­ skie Konferencje Weiglowskie oraz Międzynarodową Konferencję „Szczepionki: postępy w biotechnologii roślin i mikroorganizmów, odporności antyzakaźnej i terapii antynowotworowej. Obchody 50. rocznicy pierwszego szczepienia dziecka w Polsce przeciwko polio przy użyciu doustnej szczepionki profesora Hilarego Koprowskiego”. Dzięki profesorowi Markowi Niemiałtowskiemu udział w tych naukowych spotkaniach brali, od lat pracujący w USA, nestorzy światowej nauki profesorowie: Hilary Koprowski, Karl Maramorosch i Wacław Szybalski, Profesor Niemiałtowski wraz z zespołem uczestniczył także w organizacji zjazdów PTIDiK, łącznie z ostatnim, który odbył się już po Jego śmierci, w czerwcu 2014 r., we Wrocławiu. Od 2001 r. był członkiem Polskiej Akademii Medycyny. Niewątpliwie bardzo przyczynił się do integracji środowiska medyków, biologów, biotechnologów i lekarzy weterynarii. Trudnym zadaniem jest opisanie życie zawodowego człowieka, który odznaczał się ogromną aktywnością, nieustępliwością, który był inspiratorem licznych działań naukowych i organizacyjnych, który pierwszego dnia po wakacjach zwoływał swój zespół i komunikował: „Słuchajcie, wpadłem w nocy na świetny pomysł zorganizowania konferencji Weiglowskiej w Odessie. Pojedziemy autokarem, najlepiej w maju. Jutro o 12 zrobimy zebranie, bo czasu jest mało”. Podobnie było z ambitnymi pomysłami projektów naukowych badawczych i promotorskich, które dawały szanse rozwoju doktorantom i których wyniki zapoczątkowywały 209 kolejne kierunki badań. Profesor Niemiałtowski zawsze dbał o rozwój młodych pracowników nauki i organizował im staże w renomowanych ośrodkach Za swoją pracę był wielokrotnie odznaczany, w tym Srebrnym i Złotym Krzyżem Zasługi, Medalem Komisji Edukacji Narodowej, Złotym Medalem za Długoletnią Służbę, Odznaką Honorową „Za Zasługi dla SGGW”, Honorową Odznaką „Zasłużony dla Rolnictwa”, odznaką „Pro Scientia Veterinaria Polona” oraz wyróżniany nagrodami JM Rektora SGGW i Wydziału V PAN. Utrzymywał bardzo przyjazne kontakty z przedstawicielami światowej nauki. Znał osobiście wybitnych wirusologów, immunologów i mikrobiologów i zapraszał ich do uczestnictwa w organizowanych regularnie sympozjach i konferencjach naukowych. badawczych. Zasługą Profesora Niemiałtowskiego były też wydarzenia artystyczne towarzyszące konferencjom i stały udział profesor Teresy Zaniewskiej, dzięki której spotkania z honorowymi gośćmi konferencji, zyskały wyjątkowy, niepowtarzalny charakter. Był bardzo dumny z wypromowania doktorów honoris causa SGGW – Petera C. Doherty’ego i Rolfa Zinkernagla w 1998 r., Hilarego Koprowskiego w 2008 r. i Karla Maramoroscha, którego promocja odbędzie się 24 października 2014 r. Kiedy zachorował, nie zajmował innych swoimi problemami. Pobyt w szpitalu miał się przyczynić do odzyskania zdrowia i sił, potrzebnych do wzięcia udziału w czerwcowym Zjeździe PTIDiK we Wrocławiu, którego gościem miał być Jego przyjaciel, profesor Barry T. Rouse. Był bardzo potrzebny. Czekała praca nad organizacją kolejnej konferencji. Czekało życie. Profesor Marek Niemiałtowski umarł 15 czerwca 2014 r. Został pochowany na cmentarzu w Marysinie Wawerskim. XV Konferencja DIAGMOL, która odbędzie się 25 października 2014 r., będzie spotkaniem naukowym, ofiarowanym pamięci Profesora Marka Niemiałtowskiego. Dr Ada Schollenberger POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 211–222 http://www.pm.microbiology.pl EWOLUCJA ADAPTATYWNA GENOMÓW DROŻDŻY Z GRUPY SACCHAROMYCES CEREVISIAE SENSU STRICTO Anna Misiewicz1*, Sylwia Wróblewska-Kabba2 Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego im. prof. Wacława Dąbrowskiego, Zakład Mikrobiologii, Kolekcja Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych , 02-532 Warszawa, Rakowiecka 36 2 Centrum Badań DNA sp. z o.o., ul. Mickiewicza 31, 60-688 Poznań 1 Wpłynęło w marcu 2014 r. 1. Wstęp. 2. Historia badań. 3. Występowanie winorośli i drożdży 4. Różnicowanie drożdży Saccharomyces cerevisiae 5. Wyodrębnianie gatunków w grupie Saccharomyces sensu stricto. 6. Budowa hybrydowa. 6.1. Drożdże piwowarskie lager. 6.2. Drożdże piwowarskie ale. 6.3. Drożdże winiarskie. 6.4. Drożdże do produkcji cydru. 7. Zmiany w budowie genomu. 7.1. Duże rearanżacje chromosomalne. 7.2. Zmienna liczby kopii genów. 7.3. Polimorfizm sekwencji. 7.4. Transfer DNA. Introgresje. 7.5. Sekwencje powtórzone. 8. Pangenom drożdży Saccharomyces sensu stricto. Różnorodność szczepów w obrębie grupy Adaptive evolution of yeasts genomes from Saccharomyces cerevisiae sensu stricto group Abstract: Saccharomyces sensu stricto yeasts includes important strains for many biotechnological procesess, specially in wine and brewery fermentation. Their plasticity and adaptation to different industrial niches may be result of complex genomic construction, polyploidy, chromosomal rearragements, DNA transfer, SNP occurrence. “Mixed” genetic lines known as hybrids, have more adaptation “abilities” than “pure” lines. Genomic datas from the first strain yeast S288c, sequencing in 1996, and from many others sequencing strains from different origins and applications was obtained. Adaptative evolution of industrial yeast using different molecular tools became as important area to research in last few years. 1. Introduction. 2. History of investigation. 3. Biogeography of grape and yeasts. 4. Differentiation of Saccharomyces cerevisiae yeasts. 5. Identification of yeasts in Saccharomyces cerevisiae group. 6. Hybrids. 6.1. Lager brewers yeasts. 6.2. Ale brewers yeasts. 6.3. Wine yeasts. 6.4. Cidr yeasts. 7. Changes in genome construction. 7.1. Gross chromosomal rearagements. 7.2. Variable number of gene copies 7.3. Sequence polymorphism. 7.4. DNA transfer. Introgressions. 7.5. Repeated sequences. 8. Pangenom of Saccharomyces sensu stricto yeasts. Biodiversity of strains in this group Słowa kluczowe: adaptacja molekularna, hybrydy, wpływ czynników technologicznych, Saccharomyces cerevisiae Key words: hybrids, influence of technological factors, molecular adaptation, Saccharomyces cerevisiae 1. Wstęp Drożdże są jednokomórkowymi mikroorganizmami, należącymi do różnych grup taksonomicznych. Znanych jest ponad 700 gatunków drożdży, najszerzej użytkowane są drożdże z rodzaju Saccharomyces, szczególnie Saccharomyces cerevisiae. Drożdże z grupy Sac­ charomyces sensu stricto są wykorzystywane przez człowieka od dawna [87]. Wiele tysięcy lat temu w Egipcie stosowano drożdże do wypieku chleba. Molekularne dowody archeologiczne na wytwarzanie fermentowanych napoi datuje się na 7000 lat p.n.e. [63], choć proces fermentacji cukrów z udziałem drożdży został naukowo udowodniony dopiero w 1860 r. [76]. Ich zdolność do przekształcania cukru do etanolu z wytworzeniem dwutlenku węgla podczas fermentacji używana jest w procesach biotechnologicznych przy produkcji wina, piwa i sake. Te zadziwiające cechy przynoszące znaczne korzyści ekonomiczne traktowane jako naturalne właś­ ciwości drożdży, mimo różnych badań, wciąż nie są do końca wyjaśnione. Niezwykła plastyczność, a także stabilność cech genotypowych i fenotypowych szczepów winiarskich, piwowarskich i piekarskich jest wciąż wyjaśniania. Niewątpliwie związana jest ze specyficzną budową tych drożdży. 2. Historia badań Badania nad rodzajem Saccharomyces rozpoczęły się w 1838 r. Saccharomyces cerevisiae był pierwszym opisanym gatunkiem drożdży. W 1870 r. Reess pierwszy raz wymienił, wśród grzybów zdolnych do fermentacji alkoholowej dwie grupy drożdży. Drożdże fermentujące soki owocowe nazwał Saccharomyces ellipsoideus, a drożdże piwowarskie – Saccharomyces pastorianus. W 1912 r. Guilliermond podał pierwszy system klasyfikacji drożdży, bazujący na morfologii i kilku fizjologicznych testach oceniających zdolność drożdży do fermentacji monosacharydów. W swojej monografii „Les Levures” opisał już 20 gatunków Saccharomyces [76]. Prowadzono wiele badań dotyczących taksonomii * Autor korespondencyjny: Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego im. prof. Wacława Dąbrowskiego, Zakład Mikrobio­ logii, Kolekcja Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych, ul. Rakowiecka 36, 02-532 Warszawa, tel. 22 6063691, e-mail: [email protected] 212 ANNA MISIEWICZ, SYLWIA WRÓBLEWSKA-KABBA Tabela I Zmiany taksonomiczne w rodzaju Saccharomyces w latach 1912–2011 Rok 1912 1952 1970 S. cerevisiae S. ellipsoideus S. turbidans S. ilicis S. vordermanni S. sake S. cartilaginosus S. batatae S. tokyo S. yeddo 1984 S. cerevisiae S. wilianus S. intermedius S. validus S. wiliamus S. coreanus S. coreanus 1998 S. cerevisiae 2000 S. cerevisiae 2008 2011 S. cerevisiae S. cerevisiae S. arboricolus S. arboricolus S. paradoxus S. paradoxus S. paradoxus S. paradoxus S. carlsbergensis S. carlsbergensis S. uvarum S. monacensis S. uvarum S. logos S. pastorianus S. pastorianus S. pastorianus S. pastorianus S. uvarum S. logos S. bayanus S. pastorianus S. bayanus S. bayanus S. bayanus S. bayanus S. heterogenicus S. heterogenicus S. cariocanus S. cariocanus S. cariocanus S. chevalieri S. fructuum S. chevalieri S. mikatae S. mikatae S. mikatae S. italicus S. steineri S. italicus S. kudriavzevii S. kudriavzevii S. kudriavzevii S. globosus S. globosus S. bayanus S. pastorianus S. oviformis S. beticus S. coreanus S. bayanus S. eubayanus S. aceti S. prostoserdovi S. oleaginosus S. olaceus S. capensis S. diastaticus S. hispaniensis S. inusitatus S. norbensis S. abuliensis S. cordubensis S. gaditensis S. hispalensis drożdży [6, 7, 50, 51, 60]. W tabeli I pokazano zróżnicowanie i zmiany nazw drożdży w grupie Saccharomyces sensu stricto między 1912 a 2011 r. Rodzaj Saccharomyces zawierał dwie grupy gatunków: Saccharomyces sensu stricto i Saccharomyces sensu lato. Grupa Saccharomyces sensu stricto zaproponowana przez v a n d e r Wa l t a [86] z 21 gatunków zmniejszyła się w 1998 do czterech różnych taksonów. Ta klasyfikacja nie została ostatecznie zakończona, przede wszystkim w stosunku do drożdży S. bayanus i S. pastorianus. Ostatnio, postulowano utworzenie gatunku S. eubayanus [56]. 3. Występowanie winorośli i drożdży Występowanie szczepów drożdży biorących udział procesach biotechnologicznych, w tym w fermentacji, obserwowane jest tylko w miejscach, które są związane z obecnością człowieka. Potwierdzono tylko jeden przypadek obecności drożdży fermentujących nektar z palmy w dzikich lasach Malezji, co sugerowało, że drożdże te występują niezależnie od bliskości człowieka [93]. Większość scharakteryzowanych szczepów S. cerevisiae izolowano z napojów lub żywności, tylko EWOLUCJA ADAPTATYWNA GENOMÓW DROŻDŻY Z GRUPY SACCHAROMYCES CEREVISIAE SENSU STRICTO nieliczne z ziemi lub drzew. Porównanie „naturalnych” i udomowionych szczepów ujawniło, że naturalnie występujące w środowisku mikroorganizmy charakteryzują się większą różnorodnością genomową, podczas gdy u udomowionych drożdży występuje mniejsze zróżnicowanie genetyczne. Udomowienie drożdży winiarskich wiązane jest z udomowieniem szczepów winorośli w latach 5400 a 5000 r. p.n.e., na obszarze położonym między Morzem Czarnym a Iranem. Kolebką uprawy winorośli i produkcji wina były tereny w górach Zagros, na Taurusie i na Kaukazie, stopniowo uprawy rozszerzały się o następne regiony w kierunku Mezopotamii, doliny Jordanu i dalej do Egiptu, Fenicji, na Kretę i do Grecji [98]. Ok 500 lat p.n.e. wino produkowano we Włoszech, na Sycylii, w południowej Francji i na Półwyspie Iberyjskim. Północna granica uprawy winorośli stanowiła północną granicę imperium rzymskiego (100 lat p.n.e.). Kolonizacja Ameryki w XVI w., południowej Afryki w XVII w., w Australii i Nowej Zelandii w XVIII i XIX w. [72] wpłynęła na opanowanie przez winorośle i drożdże winiarskie nowych terenów. Większość drożdży winiarskich pochodzi z Mezopotamii, drożdże sake z Azji, a analiza markerów mikrosatelitarnych w badaniu populacji drożdży z Nowej Zelandii [38] dowodzi, że drożdże te tworzą odrębną grupę i nie pochodzą ani z Mezopotamii ani z Azji. Nie jest jasne, kiedy zostały tam przyniesione przez człowieka, ptaki lub owady. Z badań L e g r a s a, w których porównywał ze sobą kilkaset szczepów drożdży różnego pochodzenia wynika, że ich historia ewolucyjna jest odbiciem historii/działalności człowieka [55]. 4. Różnicowanie drożdży Saccharomyces sensu stricto W konwencjonalnej taksonomii do identyfikacji drożdży stosowano testy morfologiczne i fizjologiczne. Fenotypowe charakterystyki mikroorganizmu zależne od warunków hodowli i stosowanego substratu często prowadziły do niewłaściwych wyników [85]. Różnicę między dwoma taksonami często określano na podstawie jednej lub dwóch charakterystycznych cech, a większość właściwości typowych mogła być zmieniona przez mutację w pojedynczym genie. Do wczesnych metod molekularnych, dzięki którym udoskonalono zróżnicowanie gatunków i określono między nimi pokrewieństwo należały ocena zawartości GC, hybrydyzacja DNA [87], kariotyping, RFLP mitochondrialnego DNA [82], ITS PCR-RFLP, przypadkowo amplifikowane polimorficzne DNA RAPD [33]; AFLP [5], powtórzenia sekwencji [44], DGGE [62], SSCP [15], analiza sekwencji regionów ITS i domeny D1/D2, analiza multigenowa sekwencji MLSA [52]. Prowadzono też analizy porównawcze sekwencji mikrosatelitarnych [25, 36, 79], mini i mega satelitarnych [78, 80], 213 zróżnicowanie liczby kopii przy zastosowaniu sCGH [16, 31, 46, 53, 70, 94] i polimorfizm wykryty podczas analizy macierzy [81], a także stosowanie wielogatunkowych mikromacierzy taksonomicznych [64] i typowanie MLST [4, 90]. 5. Wyodrębnianie gatunków w grupie Saccharomyces sensu stricto Natura poliploidalna, zdolność do wymiany materiału genetycznego, wysoka zmienność genomowa drożdży Saccharomyces sensu stricto utrudnia standardową identyfikację gatunku. Można przyjąć, że grupa ta reprezentuje ciągłą genomową strukturę [24], w której gatunki nie są wyraźnie rozróżnialne przy zastosowanie metod obecnie stosowanych do ustanowienia gatunków biologicznych. Podstawą definicji biologicznego gatunku jest zdolność do łączenia się i wytwarzania płodnego potomstwa. Drożdże S. cerevisiae sensu stricto są zdolne do procesu płciowego, ale w wielu przypadkach, drożdże selekcjonowane z powodu swoich unikalnych cech i stosowane przemysłowo nie wytwarzają zarodników lub wykazują anomalie ploidalności tzn. są często poliploidami lub aneuploidami. Następuje więc nieprawidłowa lub błędna mejoza. Mimo, iż definicja gatunków oparta na płodności jest obecnie jedynym wiarygodnym kryterium rozróżniania gatunków, na podstawie której ustanowiono gatunki w rodzaju Saccharomyces nie może być zawsze bezwględnie stosowana. Identyfikacja może być spełniona także przez porównanie zgodności gatunkowej szczepów wyrażonej stopniem hybrydyzacji, np. S. cerevisiae i S. bayanus były długo uznawane za najbardziej odległe gatunki w grupie Sac­ charomyces sensu stricto, ich molekularne pokrewieństwo (wyrażone związkiem DNA/DNA) wynosi 20% [87]. Testy konwencjonalne i molekularne, takie jak kariotyping, sekwencjonowanie domeny D1/D2 i PCR-RFLP rejonu ITS rDNA, wyraźnie oddzielają grupę drożdży S. uvarum od S. bayanus, ale po badaniach hybrydyzacyjnych ustalono, że S. uvarum może być zdefiniowany jako gatunek, zgodnie z pojęciem biologicznego gatunku, ponieważ hybrydy między S. bayanus i S. uva­ rum mogą wytwarzać żywe i płodne komórki, chociaż o bardzo niskim stopniu płodności (9–39%). Drożdże Saccharomyces sensu stricto są zwykle diplo­idami, w dobrych warunkach rozmnażającymi się przez pączkowanie. Podczas mejozy generują 4 askospory w workach. Do sporulacji najczęściej dochodzi przy hodowli w ubogich podłożach w nieobecności źródeł węgla wykorzystywanych podczas fermentacji i przy niedostatku azotu. Ich częsta aneuploidalność wpływa na różny wynik procesu mejozy. 214 ANNA MISIEWICZ, SYLWIA WRÓBLEWSKA-KABBA Tabela II Zmiany genomu drożdży z grupy Saccharomyces sensu stricto pod wpływem różnych czynników technologicznych Zastosowanie drożdży Czynnik Zmiany Gen Piśmiennictwo Biopaliwo SNO, SNZ Elementy subtelomerowe Do produkcji win Siarkowane moszcze SSU1 Rearanżacja Do produkcji win Wysoka temperatura FOT 11 [22] Do produkcji win HXT3, zdolność do fermentacji fruktozy Drożdże flor FLO11 Drożdże różnych gatunków biorą udział w spontanicznej fermentacji, lecz gatunki rodzaju Saccharomyces włączając w szczególności Saccharomyces cerevisiae, grają główną rolę w fermentowaniu żywności i napojów. Jednak niektóre winiarskie kultury starterowe mogą należeć do innych gatunków tej grupy takich jak S. bayanus i S. paradoxus znaleziony w winach chorwackich. S. bayanus var. uvarum jest wykorzystywany do produkcji wina i cydru w regionach Europy o chłodniejszym klimacie [25]. Szczepy S. pastorianus są odpowiedzialne za wytwarzanie piwa lager. W trakcie procesów technologicznych występują różne czynniki, które mogą mieć wpływ na strukturę genomu. Do czynników tych należą czynniki stresujące m.in.: siarka używana do siarkowania moszczy, wysokie stężenie alkoholu, wysoka temperatura fermentacji, wysokie ciśnienie osmotyczne [3] (tab. II) 6. Budowa hybrydowa Przemysłowe szczepy drożdży Saccharomyces są w więk­szości hybrydami międzygatunkowymi. Powszechnie akceptowany jest pogląd, że budowa hybrydowa i wynikające z niej cechy obojga rodziców mogą mieć szersze zastosowanie technologiczne niż szczepu niehybrydowego. Tworzenie wewnątrzgatunkowych hybryd jest prawdopodobnie sposobem adaptacji drożdży do różnych środowisk. Hybrydyzacja różnych gatunków Saccharomyces następuje przez koniugację spor haploidalnych lub komórek [74], przez łączenie się wegetatywnych komórek diploidalnych i haploidalnych zarodników lub komórek albo przez łączenie się wegetatywnych komórek diploidalnych [24]. Genom hybrydowy zawiera różne kopie genomu rodzicielskiego. Hybrydy diploidalne są sterylne i mogą być utrzymywane tylko przez rozmnażanie bezpłciowe. Tylko allotetraploidalne lub amfiploidalne hybrydy są płodne, wytwarzając diploidalne hybrydowe spory, lecz winiarskie hybrydy S. cerevisiae × S. kudriavzevii są prawie zawsze diploidalne i sterylne. Segregacja w wyniku mejozy diploidalnych hybryd jest nieefek- [82] [42, 71] [43] [34, 46] tywna, a powstające spory nie są żywe z powodu występowania częstej aneuploidalności. 6.1. Drożdże piwowarskie lager Naturalna hybryda drożdży piwowarskich lager (fermentacja dolna) S. pastorianus (S. carlsbergen­ sis) była najczęściej badanym typem drożdży hybrydowych. V a u g h a n - M a r t i n i i K u r t z m a n pierwsi określili, że typowy szczep S. carlsbergensis obecnie nazywany S. pastorianus, reprezentant drożdży lager, częściowy allotetraploid, był wynikiem międzygatunkowej hybrydyzacji między S. cerevi­ siae i S. baya­nus [87]. W późniejszych badaniach wykazano, że kolejnym rodzicielskim szczepem był S. monacensis (syn. S. pastorianus) [49]. Następnie stwierdzono w wyniku analizy profili białkowych, że S. monacensis jest własną hybrydą. Potwierdził to C a s a r e g o l a i wsp. [19] po analizie sekwencji kilku specyficznych genów i PCR-RFLP. Liczne badania chromosomów i składu genetycznego drożdży lager ujawniły obecność w tych drożdżach materiału genetycznego z S. cerevisiae i nie-S. cerevisiae [19]. Najnowsze badania R a i n i e r i i wsp. [75] potwierdziły obecność w drożdżach piwowarskich materiału genetycznego pochodzącego z S. cerevisiae i S. bayanus, a właściwie S. eubayanus [56]. D e B a r r o s L o p e s i wsp. [24] wykazali, że przemysłowe drożdże piwowarskie są wynikiem wielokrotnej interspecyficznej hybrydyzacji i prawdziwa jest hipoteza, że pierwsze zdarzenie hybrydyzacyjne wystąpiło przy tworzeniu się szczepu S. carlsbergensis i następnie hybrydyzacji ze szczepem ale S. cerevisiae występującym w środowisku piwowarskim. R a i n i e r i określiła badane drożdży jako linie czyste i mieszane w różnym stopniu zapożyczenia [75]. Genomy drożdży piwowarskich są aneupoliploidalne, z dużymi rearanżacjami i ze zwiększoną lub zmniejszoną liczbą chromosomów lub ich części, dlatego też wykazują zadziwiającą intraspecyficzną zmienność. Analizy CGH (Chromosomal Gross Hybridization) potwierdziły te obserwacje. W hybrydowym EWOLUCJA ADAPTATYWNA GENOMÓW DROŻDŻY Z GRUPY SACCHAROMYCES CEREVISIAE SENSU STRICTO szczepie drożdży piwowarskich Weihenstephan 34/70 po zsekwencjonowaniu [66] potwierdzono allopoliploi­ dalną budowę genomu S. pastorianus. Szczepy rodzicielskie zbliżone były bardziej do S. bayanus var. bay­ anus niż do var. uvarum i S. cerevisiae. Te wyniki pozwoliły P u l v u r e n t i e m u i wsp. [73] na utrzymanie epitetu S. bayanus dla szczepów hybrydowych i odzyskanie taksonu S. uvarum dla szczepów nie-hybrydowych. Jednak N a u m o w [67] sugerował rozważenie tych dwóch subgrup, jako odmian (varietes) S. bayanus (var. bayanus i var. uvarum) zgodnie z ich częściową izolacją reprodukcyjną wskazaną przez partialną sterylność ich hybryd. 6.2. Drożdże piwowarskie ale Wydawało się, że szczepy ale (górnej fermentacji) nie są tak zróżnicowane jak drożdże fermentacji dolnej i należą do jednego gatunku S. cerevisiae. W miarę doświadczeń, niektóre także opisano jako hybrydy S. cerevisiae/S. kudriavzevii. Analiza RFLP zamplifikowanych markerów jądrowych ujawniła, że wiele tych szczepów było diploidami ze złożoną strukturą. Budowa taka może prowadzić do niestabilności genomowej. Przyczyną tej niestabilności jest CGH (Chromosomal Gross Hybridization) przypadku S. pastoria­ nus, u którego prawdopodobnie fermentacja wysoko stężonej brzeczki w wysokich temperaturach indukowała zmiany chromosomalne [47]. 6.3. Drożdże winiarskie Niedawno odkryte hybrydy drożdży S. cerevisiae i S. kudriavzevii występują w grupie technologicznej drożdży winiarskich [61] i piwowarskich [41], identyfikowane są nawet potrójne hybrydy S. cerevisiae, S. baya­ nus i S. kudriavzevii [95]. Naturalne hybrydy S. cerevi­ siae × S. kudriavzevii związane z procesem fermentacji znaleziono do tej pory w regionach Europy klimatu oceanicznego i klimatu kontynentalnego, takiego jak występuje w Anglii [41]. Genetyczna charakterystyka drożdży winiarskich, hybryd S. cerevisiae i S. kudrivzevii w wyniku analizy restrykcyjnej 5 genów jądrowych ulokowanych na różnych chromosomach, regionu 5,8S ITS rDNA i genu mitochondrialnego COX2, ujawniła obecność w winach szwajcarskich 3 typów hybryd [40]. W późniejszych badaniach [41] zidentyfikowano 6 nowych typów hybryd S. cerevisiae i S. kudriavzevii wśród drożdży piwowarskich, bazując na analizie RFLP 35 genów kodujących białka. Hybrydy te przypuszczalnie zawierały chromosomy chimeryczne, prawdopodobnie generowane przez rekombinacje między homologicznymi chromosomami z różnych źródeł rodzicielskich [9]. 215 6.4. Drożdże do produkcji cydru Szczepy zawierające materiał genetyczny z różnych źródeł znaleziono także wśród drożdży stosowanych do wytwarzania cydru. Stwierdzono, że drożdże te były hybrydami zawierającymi materiał genetyczny z gatunków S. cerevisiae i drożdży zbliżonych budową do do S. bayanus i do S. kudriavzevii. Dodatkowe zróżnicowanie genomowe było wynikiem międzygatunkowej hybrydyzacji, która występowała między dwoma lub więcej gatunkami Saccharomyces [74]. Tak więc hybrydyzacja, która długo wydawała się, że występuje tylko u drożdży piwowarskich, ostatecznie, okazało się, jest powszechna w rodzaju Saccharomyces, występuje także w drożdżach winiarskich i cydrowych [24, 54]. Obecność hybryd S. cerevisiae × S. bayanus jest łatwo wytłumaczalna, ponieważ oba gatunki koegzy­ stują w tych samych procesach i środowiskach fermentacyjnych (warzenie piwa) [76], produkcja cydru [21, 84]. Jednak w przypadku hybryd S. cerevisiae × S. kudriav­ zevii nie jest łatwo zrozumieć, kiedy nastąpiła hybrydyzacja i jak te hybrydy skolonizowały produkcję wina w centralnej Europie [41], ponieważ S. kudriavzevii jak dotąd, nie znaleziono w środowisku fermentacyjnym. Szczepy S. kudriavzevii izolowano z opadniętych liści i ziemi w Japonii [67]. 7. Zmiany w budowie genomu Stosowanie drożdży przez człowieka prowadziło do selekcji wyspecjalizowanych szczepów w piekarstwie, piwowarstwie i winiarstwie. Te wyspecjalizowane szczepy drożdży S. cerevisiae wykazują specyficzne cechy fenotypowo-technologiczne. Budowa genomowa tych drożdży zmieniła się pod wpływem różnych zdarzeń. Były to: duże rearanżacje chromosomalne (Gross Chromosomal Rearregement GRC), zmienna liczba kopii genów i polimorfizm sekwencji oraz introgresje (transfer DNA) [8, 10]. 7.1. Duże rearanżacje chromosomalne Od dawna wiadomo, że drożdże winiarskie wykazujące wysoki poziom polimorfizmu długości chromosomów powstały w wyniku rearanżacji chromosomalnych. W wyniku tych rearanżacji nastąpiły translokacje, delecje i amplifikacje regionów chromosomalnych [17, 18]. Nastąpiło przemieszczenie między sekwencjami Ty lub zduplikowanymi genami [20]. Z wykorzystaniem analiz porównawczej hybrydyzacji genomowej podkreślono rolę mobilnych retrotranspozonów 216 ANNA MISIEWICZ, SYLWIA WRÓBLEWSKA-KABBA w generowaniu zmienności w genomach szczepów winiarskich [16]. I tak np. sekwencja genomu szczepu winiarskiego EC1118, zawiera wiele bloków chromosomalnych z translokacjami i insercjami nieobecnymi w genomie referencyjnego szczepu S288c. Wiele z tych translokalcji i insercji jest zlokalizowanych w telomerowych regionach chromosomów [91]. Rearanżacje genomowe mogą modyfikować ekspresję genu i zmieniać fenotyp, zwłaszcza jeśli są zlokalizowane wewnątrz ORF lub w regionie regulatorowym genu. W większości przypadków nie udowodniono bezpośredniego związku między tymi rearanżacjami a cechami fenotypowymi. W niektórych jednak przypadkach udało się tę rolę zdefiniować. Wzajemne translokacje między chromosomem VIII i XV, widoczne w drożdżach winiarskich, zwiększają ekspresję genu SSU1, który koduje białko błony komórkowej włączone w transport anionów siarkowych, podwyższając oporność na związki siarki [42, 71]. Prawdopodobnie ta translokacja powstała przez ciągłe stosowanie związków siarki w winiarstwie i udowodniła związek między rearanżacjami chromosomalnymi a adaptacją do warunków przemysłowych. Drożdże flor także zawierają wiele rearanżacji. Ekspozycja drożdży na wysokie stężenia acetylaldehydu i alkoholu, mogła wpływać na pęknięcia podwójnej nici, co faworyzowało występowanie GCR (Gross Chromosome Rearangement) [46]. 7.2. Zmienna liczby kopii genów Amplifikacja genów jest znanym mechanizmem adaptacji przez różne organizmy, służącym przetrwaniu w stresujących środowiskach lub zwiększeniu oporności na wiele toksycznych czynników. Po opartej na mikromacierzach hybrydyzacji całego genomu różnych szczepów S. cerevisiae [81, 83, 94] wykazano obecność powtórzeń sekwencyjnych DNA i podkreślono ich rolę w strukturalnej dywersyfikacji i adaptacji do specyficznych warunków środowiska. Analizy zmienności liczby kopii wykazują duplikacje i delecje genów subtelomerowych [16, 31]. Wiele różnic między szczepami dotyczy genów transporterowych i genów włączonych w odpowiedzi na leki/narkotyki [31]. Zmienność liczby kopii sekwencji obserwowano także w telomerowych lub subtelomerowych regionach chromosomalnych szczepów S. cerevisiae stosowanych w wytwarzaniu etanolu, stosowanego jako biopaliwo. Analiza zmienności liczby kopii pięciu przemysłowo ważnych szczepów drożdży S. cerevisiae biorących udział w procesie wytwarzania biopaliwa potwierdziła amplifikacje w telomerowych genach SNO i SNZ, które są włączone w biosyntezę witaminy B6 i B1 [83]. 7.3. Polimorfizm sekwencji Porównawcza identyfikacja polimorfizmu sekwencji nukleotydowych jest podstawową metodą w badaniu genetycznych różnic szczepów, także w wyjaśnieniu historii ewolucyjnej gatunków [81]. W 63 szczepach drożdży S. cerevisiae izolowanych z różnych środowisk piwowarskich, winiarskich, szpitalnych i środowiska naturalnego, po hybrydyzacji genomowego DNA każdego szczepu z całym genomem szczepu S288c wykryto 1,89 mln polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (Single Nucleotide Polymorphism SNP). Zlokalizowano 3 985 delecji o długości ponad 200 pz w genomach badanych szczepów. Obserwowano zmniejszenie gęstości SNP w odległości 25 pz od centromerów. Kontrastowo, wyższą zmienność sekwencji obserwowano w regionach oddalonych o 15–45 pz od telomerów, także większość zdeletowanych genów znajdowała się w regionach subtelomerowych. Potwierdzono w ten sposób zmienność regionów subtelomerowych umożliwiających adaptację szczepów do asymilacji różnych źrodeł węgla [94]. W kilku przypadkach wykazano wpływ polimor­ fizmu sekwencji na cechy fenotypowe o znaczeniu przemysłowym. Np. szczepy drożdży flor mają dwie mutacje we FLO11, genie kluczowym w formowaniu velum, kodującego mucynę w ścianie komórkowej. Te mutacje w promotorze i regionie kodującym FLO11 wzmacniają ekspresję tego genu i zdolność komórek do przylegania do siebie [34, 46]. Inny przykład podaje G u i l l a u m e [43], który zidentyfikował allel HXT3, odpowiadający za wzmożoną zdolność do fermentowania fruktozy w kilku szczepach drożdżach winiarskich. 7.4. Transfer DNA. Introgresje Pozyskiwanie genów przez transfer DNA długo było spostrzegane jako rzadkie zjawisko u drożdży. Jednak niespodziewanie okazało się, że genom drożdży S. cerevisiae szczepu winiarskiego EC1118 zawiera duże segmenty chromosomów uzyskane w wyniku niezależnego zdarzenia HGT z różnych donorów, włączając gatunki nie-Saccharomyces [69]. Te introgresje zawierały 34 nowe geny związane przede wszystkim z metabolizmem węgla i azotu, co sugerowało ich potencjalną rolę w adaptacji szczepów do środowiska winiarskiego, gdzie istotne są te szlaki metaboliczne. Jeden z nowo badanych genów, homologiczny do FSY1 u S. pastorianus koduje wysoką zdolność do symportu/ transportu fruktozy, wzbogacając podobną funkcję nie znalezioną w S. cerevisiae. Ten gen transporter ma znaczenie przy końcu fermentacji winiarskiej, gdy większość pozostałego cukru występuje w formie fruktozy EWOLUCJA ADAPTATYWNA GENOMÓW DROŻDŻY Z GRUPY SACCHAROMYCES CEREVISIAE SENSU STRICTO [37]. Ostatnio wykazano obecność dwóch zduplikowanych tandemowych genów kodujących transportery oligopeptydów. Te geny należały do nowej rodziny grzybowych transporterów oligopeptydowych (FOT) zidentyfikowanych w wyniku przeprowadzenia analizy metatranskryptomowych populacji eukariotycznych mikroorganizmów glebowych [22]. Obecność tych nośników u drożdży czyni możliwym transport większych oligopeptydów niż zwykle transportowanych przez nośniki Ptr2p i Dal5p [45]. Niskie stężania azotu przy końcu fermentacji i stosowanie dipeptydów może występować w drożdżach winiarskich zawierających transportery FOT zlokalizowane we fragmencie 65-pz DNA znalezionym w subtelomerowym fragmencie regionu chromosomu XV u wielu szczepów drożdży winiarskich. Ten fragment DNA także jest zawarty w genie XDH1 (EC1118_1D0_6623g), który koduje przypuszczalnie dehydrogenazę ksylitolu, ostatnio zidentyfikowaną w przy badaniu „zużywania” ksylozy przez szczepy winiarskie [92]. Donor jednej z innych introgresji znaleziony w genomach drożdży winiarskich pochodzi z mikroorganizmu (Zygosaccharomy­ ces bailli), należącego do flory zakażającej moszcze winne, sugerując, że te zdarzenia mogą być ułatwiane przez ekologiczną bliskość, sąsiedztwo [69]. Wykazano także, że ta introgresja znajdowała się w wielu kopiach w genomach drożdży winiarskich, w różnych lokalizacjach chromosomalnych. Absorpcja, utrzymanie i ekspansja tych obcych genów w genomie szczepów drożdży winiarskich modeluje ewolucję adaptatywną drożdży winiarskich. Introgresję genu DUP240 z chromosomu I S. para­ doxus obserwowaną w drożdżach izolowanych z handlowych preparatów i dzikich szczepach winiarskich, opisano także w klinicznym szczepie YJM789 [91] i izolowanym z fig szczepie EM93, przodka szczepu S288c [32]. Dodatkowo szczep EM93 wykazuje polimorfizm korespondujący z tym samym regionem, jak introgresowany region z MAL chromosomu VII S. paradoxus. To zjawisko obserwowano u szczepu BG2 stosowanego do biopaliwa, wskazując, że ten region może także podlegać introgresji w szczepie EM93 [32]. Znaleziono również introgresje, definiowane jako relatywnie małe regiony różnych gatunków wewnątrz genomu innych gatunków, głównie występujące u blisko spokrewnionych gatunków grupy Saccharomyces sensu stricto [26, 57, 64, 65]. Telomery niosą geny nieortologiczne do S. cerevisiae, dodając specyficzności/oryginalności drożdżom piwowarskim, ponieważ telomery znane są z obecności genów włączonych w proces wytwarzania piwa. Geny transportery maltozy i maltotriozy włączone w proces fermentacji były także obecne w wyższej liczbie kopii w genomie zsekwencjonowanego genomu drożdży piwowarskich, było to spójne z różnymi fizjologicznymi zdolnościami hybryd piwowarskich. 217 Stosowanie sztucznych inter- i intraspecyficznej hybrydyzacji wśród drożdży Saccharomyces sensu stricto jest szeroko stosowane do udoskonalania szczepów drożdży w przemyśle fermentacyjnym [76]. Wiele badań wskazuje, że teoretycznie nie ma granic w wymianie materiału genetycznego w grupie drożdży Saccharomyces sensu stricto. 7.5. Sekwencje powtórzone Tandemowo powtórzone sekwencje DNA są wysoko dynamicznymi składnikami genomów. Większość z nich znajduje się w regionach intergenowych, lecz niektóre w sekwencjach kodujących lub pseudogenach [89]. U ludzi, ekspansja intragenowych pow­ tórzeń tripletowych jest związana z różnymi chorobami, włączając pląsawicę Huntingtona i zespół łamliwego chromosomu X [59]. W genomie Saccharomyces cere­ visiae większość genów zawiera intragenowe powtórzenia kodujące białka ściany komórkowej. Te powtórzenia zapoczątkowują częste zdarzenia rekombinacyjne w genie lub między genem i pseudogenem, będąc przyczyną ekspansji i powiększaniu wielkości genu. Zmiana wielkości wpływa na zmiany w fenotypie tj. adhezję, flokulację lub tworzenie biofilmu. Zróżnicowanie liczby powtórzeń intragenowych prowadzi do funkcjonalnej różnorodności antygenów ściany komórkowej, który pozwala grzybom i innym patogenom, na szybką adap­tację do środowiska i zmiany systemu immunologicznego [89]. 8. Pangenom drożdży Saccharomyces sensu stricto. Różnorodność szczepów w obrębie grupy W większości badań z ostatnich lat, sekwencje nukleotydowe szczepów drożdży porównywano jedynie z sekwencjami pierwszego sekwencjonowanego organizmu eukariotycznego, jakim jest referencyjny szczep laboratoryjny S288c, przez wiele lat jedyny zsekwencjonowany przedstawiciel gatunku Saccharomyces cerevisiae. Od całkowitego zsekwencjonowania genomu drożdży szczepu S288c w 1996 r. [39] nastąpił niedawno gwałtowny wzrost sekwencjonowania innych szczepów S. cerevisiae [11–13, 26, 58, 91], rozszerzając wiedzę zarówno na poziomie SNP i zmienności strukturalnej i ujawniając nieznane kilobazy dodatkowych sekwencji nieobecnych w referencyjnym genomie S288c. Rozwój wiedzy o pangenomie S. cerevisiae możliwy jest po analizie dużej próbki np. powszechnie stosowanych handlowych drożdży winiarskich i porównanie ich z innymi drożdżami przemysłowymi, włączając naturalne, dzikie szczepy drożdży winiarskich, piwowarskich, piekarskich i gorzelniczych. 218 ANNA MISIEWICZ, SYLWIA WRÓBLEWSKA-KABBA Tabela III Niektóre zsekwencjonowane genomy drożdży Saccharomyces cerevisiae Rok sekwencjonowania Szczep 1996 S288c Pochodzenie Charakterystyka Pochodzi od szczepu EM93 (88% genomu), EM126, NRRL YB-210, Yeast Foam, FLD, LK 2005 RM11-1a Haploid Uzyskany ze szczepu Bb32(3) 2007 YM789 Haploid, patogen oportunistyczny od pacjenta Zdolności flokulacyjne, toleruje wysoką temperaturę i wirusy 2008 M22 Włoska winiarnia YPS163 Gleba, dąb Odporny na niską temperaturę, wysoka ekspresja na akwaporynę Uzyskany z przemysłowego szczepu winiarskiego N96 AWRI1631 Australijski szczep winiarski, haploid AWRI796 2009 JAY291 Australijski, haploidalny uzyskany z przemysłowego szczepu N96 Szczep winiarski Nieflokulujący haploid z ze szczepu PE-2 do produkcji bioetanolu Toleruje stres tlenowy i temperaturowy EC1118 Diploidalny, handlowy, powszechnie używany Trzy unikalne regiony od 17 do 65 pz, obecność genów do produkcji wina wskazujących metabolizm i transport cukru i azotu, brak 100 genów w por. z S288c 2010 VIN13 AWRI796 Z Afryki Południowej Toleruje niskie temperatury, wina aromatyczne Z Afryki Południowe, haploidalny uzyskany z przemysłowego szczepu N96 Bardziej przydatny do win czerwonych, fermentacja w wyższych temperaturach CLIB215 Z piekarni z Nowej Zelandii 2011 CBS7960 Cukrownia w Brazylii PW5 Palma, Nigeria CLIB 324 Piekarski szczep z Wietnamu CLIB382 Z piwa , Irlandia EC9-8 Haploid, z Kanionu Ewolucji, Izrael T7 Dąb, USA Odporny na kadm T73 Niskie wymagania azotowe, wysoka tolerancja na alkohol, niskie wytwarzanie lotnych kwasów UC5 Sake, Japonia VL3 aromatyczne białe wina, wysoka zawartosc tiolu K7 Szczep do sake QA23 Vinho Verde, Portugalia Y10 Orzech kokosowy, Filipiny YJM269 Winogrona z Austrii Toleruje niskie temperatury, niskie wymagania składników pokarmowych i tlenu, wysoka aktywność betaglukozydazy Era NGS Rozwijająca się dynamicznie genomika porównawcza, dzięki zsekwencjonowaniu coraz większej liczby szczepów drożdży, pomaga w poszukiwaniu odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób przez tysiące lat następowała adaptacja genomów uprzednio dzikich gatunków, w wyniku której otrzymano zróżnicowane, wyspecjalizowane szczepy, o różnych szlakach metabolicznych, wykorzystywanych przemysłowo przez człowieka. Przykłady takich szczepów podano w tab. III. Większość genów szczepu S288c jest obecnych w winiarskim szczepie T73. Główna różnica między szczepami S288c i T73 polega na obecności w większej liczbie kopii elementów Ty1 i Ty2, obecnych w S288c. W e i i wsp. [91] znalazł ok. 60 000 polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) i ok. 6000 insercji/ delecji w trakcie porównania szczepów YJM789 i S288c. Zmiany występowały zarówno w różnej gęs­tości polimorfizmu między chromosomami i między specyficznymi genami. W szczepie JAU291, o dobrze scharakteryzowanych allelach wielu genów związanych z fermentacją, wykazano znaczne różnice międzyszczepowe w porównaniu do sekwencji szczepów S288c, RM-11 i YJM789. EWOLUCJA ADAPTATYWNA GENOMÓW DROŻDŻY Z GRUPY SACCHAROMYCES CEREVISIAE SENSU STRICTO Wykazano, że sekwencje nukleotydowe genomowego DNA diploidalnego szczepu K7, używanego przy wytwarzaniu sake, są prawie identyczne z sekwencjami laboratoryjnego szczepu S288C oprócz kilku subtelomerowych polimorfizmów i dwóch dużych inwersji obecnych w szczepie K7. Analiza heterozygotycznych nukleotydów między chromosomami homologicznymi ujawniła obecność mozaikowej, nierównomiernie nieparzystej dystrybucji heterozygot w szczepie K7 [1]. Porównawcze badania nad różnorodnością genomów szczepów S. cerevisiae wskazują na obecność unikatowych klastrów szczepów stosowanych do produkcji sake, różnych od winiarskich i laboratoryjnych [58, 81] zgodnie z ich unikatowymi filogenetycznymi pozycjami i wysokim wytwarzaniem etanolu. Występujące różnice wielkości między genami w różnych szczepach S. cerevisiae są istotne, jako że wielkość większości genów jest konserwowana ponad miliony lat w różnych gatunkach drożdży. Porównanie liczby genomowych kopii vs. poziomów transkryptów może prowadzić do charakterystyki konkretnego szczepu drożdży. Szczególnie informacja o elementach Ty i dużych rodzinach genów, takich jak rodziny subtelomerowe, może być stosowana jako czułe narzędzie molekularne stosowane do opisu szczepów przemysłowych, jak sugerował uprzednio P r e t o r i u s [72]. Rearanżacje genomu, szczególnie amplifikacje i de­lecje regularnie obserwowano w odpowiedzi na zastosowaną silną presję selekcyjną w populacji mikroorganizmów w hodowli ciągłej. W warunkach chemostatu, ewolucja mikrobiologiczna występowała przez sekwencyjne nagromadzenie mutacji. Haploidalne i izogeniczne klony, propagowano aseksualnie przez 100–500 generacji w hodowli z ograniczonym dostępem glukozy. Diploidy ewoluowały szybciej niż haploidy Stosując macierz CGH, po stresowaniu drożdży znaleziono dodatkowe charakterystyczne rearanżacje genomowe w 6 z 8 szczepów. Te rearanżacje włączając poprzednio wskazane lokalne amplifikacje genowe, zmieniły liczbę kopii w chromosomie i translokacji wewnątrz i między chromosomami. Przyczyną większości rearanżacji była ektopowa rekombinacja z włączeniem sekwencji związanych z transpozonem [29]. Rodziny genów subtelomerowych ewoluują szybciej niż geny położone bliżej centromeru. Regiony subtelomerowe częściej są miejscami duplikacji genu [2], co potwierdza unikalną rolę subtelomerów jako znaczących miejsc w ewolucji genomu i zmianach innowacyjnych budowy/funkcji genomu [14], np. przypuszczalna adaptatywna amplifikacja subtelomerowych genów SNO/SNZ występuje w szczepach stosowanych w wytwarzaniu etanolu paliwowego [83]. Lokalizacja subtelomerowa genów utylizujących cukier zapewne także podlega adaptacji [14]. Dodatkowo, wiele rodzin elementów transpozonowych wykazuje zróżnicowa- 219 nie liczby lub nie występują w różnych szczepach [59]. Innym źródłem zróżnicowania adaptatywnej ekspansji jest zwielokrotnienie liczby genów, takich jak loci CUP1 [35] i HXT6/7 [29, 48]. 9. Modele ewolucji u drożdży Saccharomyces cerevisiae Badania genomiki porównawczej ostatnio grają więk­szą rolę w objaśnianiu ewolucji drożdży Saccharo­ myces. Ważnym mechanizmem eukariotycznej chromosomalnej ewolucji jest duplikacja segmentowa chro­ mo­ somu, która prowadzi do krótkotrwałego, przemijającego częściowego stanu diploidalnego, który następnie jest zmieniany przez utratę lub duplikację genu albo zróżnicowanie sekwencji. Wg jednych ewolucyjny model S. cerevisiae jest zdegenerowanym tetraploidem, wg innych zdegenerowanym poliploidem. Interesujące porównanie budowy genomów dwóch grup drożdży lager prowadzi do wniosku [30], że pochodzą z dwóch niezależnych zdarzeń intergatunkowej hybrydyzacji między dwoma zarodnikami S. cere­ visiae i S. bayanus var. bayanus i fuzji między diploidem S. cerevisiae i haploidalnym S. bayanus var. bayanus. Prawdopodobnie, po prostym etapie hybrydyzacji, genom hybrydy podlegał ekstensywnej chromosomalnej rearanżacji, włączając ubytki chromosomów i chromosomową generację chimerycznych chromosomów przez niewzajemną, nierównoważną rekombinację między homologicznymi chromosomami [9]. Wo l f e i S h i e l d s [97] początkowo proponowali ewolucyjny model dla Saccharomyces cerevisiae. Ich model wskazywał, że te drożdże są generowane przez całkowitą duplikację genomu ich przodka prowadząc serię chromosomalnych translokacji i delecji frakcji genomowych. Badania nad rearanżacją chromosomalną w S. cerevisiae i S. bayanus wskazują, że takie rearanżacje są zdolne do przyspieszenia dywersyfikacji sekwencji genomu w specjacji, ponieważ one indukują nieżywe spory w kulturach hybrydowych. P e r e z - O r t i n i wsp. [71] wykazał, że duże chromosomowe rearanżacje, zwane zwrotnymi wzajemnymi translokacjami między chromosomem VIII i XVI genu SSU1 i genu ECM34 są włączone w adaptatywną ewolucje S. cerevisiae i wydaje się, że znaleziono je tylko w szczepach winiarskich. Wyjaśnienie drogi, jaką ewoluują drożdże Sac­ cha­ro­­­myces jest fundamentalne do zrozumienia jak następowała specjacja Saccharomyces sensu stricto. Te kon­trowersyjne teorie, pokazują drogę ewolucyjną, prowadzącą do obecnych drożdży Saccharomyces. Szczegółowa charakterystyka szczepu produkcyjnego, prognozowanie właściwości biotechnologicznych na podstawie budowy genomu staje się jednym z krytycznych czynników determinujących wybór szczepu 220 ANNA MISIEWICZ, SYLWIA WRÓBLEWSKA-KABBA i strategię jego stosowania w celu uzyskania powta­ rzalnych i unikalnych walorów smakowych produktów fermentacji. Piśmiennictwo 1. Akao T. i 34 innych: Whole-Genome Sequencing of Sake Yeast Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 7, DNA Research, 18(6) 423–434 (2011) 2.Ames R.M., Rash B.M., Hentges K.E., Robertson D.L., Delneri D., Lovell S.C.: Gene duplication and environmental adaptation within yeast populations. Genome Biol. Evol. 2, 591–601 (2010) 3. Arroyo-Lopez F.N., Orlic S., Querol A., Barrio E.: Effects of temperature, pH and sugar concentration on the growth parameters of Saccharomyces cerevisiae, S. kudriavzevii and their interspecific hybrid. Int. J. Food. Microbiol. 131, 120–127 (2009) 4. Ayoub M.-J., Legras J.-L., Saliba R., Gaillardin C.: Application of Multi Locus Sequence Typing to the analysis of the biodiversity of indigenous Saccharomyces cerevisiae wine yeasts from Lebanon. J. Appl. Microbiol. 100, 699–711 (2006) 5.Azumi Goto-Yamamoto: AFLP analysis of type strains and laboratory and industrial strains of Saccharomyces sensu stricto and its application of phenetic clustering. Yeast, 18, 1145–1154 (2001) 6. Barnett J. A., Payne R. W., Yarrow D. Yeasts: characteristics and identification, 2nd (Eds). Cambridge Univ Press, Cambridge 1990 7. Barnett J. A., Payne R. W., Yarrow D. Yeasts: characteristics and identification, 2nd (Eds). Cambridge Univ. Press, Cambridge 2000 8. Barrio E., Gonzalez S.S., Arias A., Belloch C., Querol A.: Molecular mechanisms involved in the adaptive evolution of industrial yeasts GH Fleet), pp. 153–174. Springer Verlag, Germany, 2006 9.Belloch C., Perez-Torrado R., Gonzalez S.S., Perez-Ortin J.E., Garcia-Martinez J., Querol A., Barrio E.: Chimeric genomes of natural hybrids of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces kudriavzevii. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2534–2544 (2009) 10. Blondin B., Dequin S., Querol A., Legras J.-L. Genome of Sac­ charomyces cerevisiae and related yeasts, in: H. Konig, G. Unden, J. Frohlich (Eds.), Biology of microorganisms on grapes, in must and in wine, Springer Berlin Heidelberg, Heidelberg, Germany, 361–78 (2009) 11.Borneman A.R., Desany B.A., Riches D., Affourtit J.P., Forgan A.H., Pretorius I.S., Egholm M., Chambers P.J.: Whole-genome comparison reveals novel genetic elements that characterize the genome of industrial strains of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7(2), e1001287. doi: 10.1371/ journal. pgen.1001287 (2011a) 12.Borneman A.R., Desany B.A., Riches D., Affourtit J.P., Forgan A.H., Pretorius I.S., Egholm M., Chambers P.J.: The genome sequence of the wine yeast VIN7 reveals an allotriploid hybrid genome with Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces kudriavzevii origins. FEMS Yeast Res. doi: 10.1111/j.1567-1364.2011.00773.x. (2011) 13.Borneman A.R., Forgan A.H., Pretorius I.S., Chambers P.J.: Comparative genome analysis of a Saccharomyces cerevisiae wine strain. FEMS Yeast Res. 8, 1185–1195 (2008) 14. Brown C., Murray A., Verstrepen K.: Rapid expansion and functional divergence of subtelomeric gene families in yeasts. Curr. Biol. 20, 895–903 (2010) 15. Callon C., Delbe’s C., Duthoit F., Montel M.C.: Application of SSCP-PCR fingerprint to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses. Syst. Appl. Microbiol. 29, 172–180 (2006) 16. Carreto L., Eiriz M.F., Gomes A.C., Pereira P.M., Schuller D., Santos M.A.S.: Comparative genomics of wild type yeast strains unveils important genome diversity. BMC Genomics, 9:524. doi: 10.1186/1471-2164-9-524 (2008) 17. Carro D., Bartra E., Pina B.: Karyotype rearrangements in a wine yeast strain by rad52-dependent and rad52-independent mechanisms. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2161–2165 (2003) 18. Carro D., Garcia-Martinez J.E., Perez-Ortin B., Pina B.: Structural characterization of chromosome I size variants from a natural yeast strain. Yeast, 20, 171–183 (2003) 19.Casaregola S., Nguyen H.V., Lapathitis G., Kotyk A., Gaillardin C.: Analysis of the constitution of the beer yeast genome by PCR, sequencing and subtelomeric sequence hybridization. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1607–1618 (2001) 20. Codon A.C., Benitez T., Korhola M.: Chromosomal polymorphism and adaptation to specific industrial environments of Saccharomyces strains. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 154–163 (1998) 21. Coton E., Coton M., Levert D., Casaregola S., Sohier D.: Yeast ecology in French cider and black olive natural fermentations. Int. J. Food Microbiol. 108, 130–135 (2006) 22. Damon C., Vallon L., Zimmermann M., Haider V., Galeote S., Dequin P., Luis L. Fraissinet-Tachet, Marmeisse R.: A novel fungal family of oligopeptide transporters identified by functional metatranscriptomics of soil eukaryotes. ISME J. doi:10.1038/ ismej.2011.67 (2011) 23. de Barros Lopes M., Rainieri S., Henschke P. A., Langridge P.: AFLP fingerprinting for analysis of yeast genetic variation. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 915–924 (1999) 24. De Barros Lopes M., Bellon J.R.,Shirley N.J., Ganter P.F.: Evidence for multiple interspecific hybridization in Saccharomyces sensu stricto species. FEMS Yeast Res. 1(4) 323–331 (2002) 25.Demuyter C., Lollier M., Legras J.-L., Le Jeune C.: Predominance of Saccharomyces uvarum during spontaneous alcoholic fermentation, for three consecutive years, in an Alsatian winery J. Appl. Microbiol. 97, 1140–1148 (2004) 26. Doniger S.W., Kim H.S., Swain D., Corcuera D., Williams M., Yang S-P., Fay J.C.: A catalog of neutral and deleterious polymorphism in yeast. PLoS Genet. 4: e1000183. doi: 10.1371/journal.pgen.1000183. (2008) 27. Dujon B.: Yeasts illustrate the molecular mechanisms of euka­ ryo­tic genome evolution. Trends in Genetics, 22, 375–386 (2006) 28.Dujon B.: Yeast evolutionary genomics. Nat. Rev. Genet. 11, 512–524 (2010) 29.Dunham M.J., Badrane H., Ferea T., Adams J., Brown P.O., Rosenzweig F., Botstein D.: Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16144–16149 (2002) 30.Dunn B., Sherlock G.: Reconstruction of the genome origins and evolution of the hybrid lager yeast Saccharomyces pastoria­ nus. Genome Res. 18, 1610–1623 (2008) Dunn B., Levine R.P., Sherlock G.: Microarray karyotyping of commercial wine yeast strains reveals shared, as well as unique, genomic signatures. BMC Genomics, 6, 53. doi: 10.1186/1471-2164-6-53 (2005) 31. Esberg A., Muller L.A., McCusker J.H.: Genomic structure of and genome-wide recombination in the Saccharomyces cerevi­ siae S288C progenitor isolate EM93. PLoS ONE, 6 (9): e25211. doi: 10.1371/journal.pone.0025211 (2011) 32. Fernandez-Espinar M.T., Barrio E., Querol A.: Analysis of the genetic variability in the species of the Saccharomyces sensu stricto complex. Yeast, 20, 1213–1226 (2003) 33. Fidalgo M., Barrales R.R., JIbeas J.I., Jimenez J.: Adaptive evolution by mutations in the FLO11 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 11228–11233 (2006) EWOLUCJA ADAPTATYWNA GENOMÓW DROŻDŻY Z GRUPY SACCHAROMYCES CEREVISIAE SENSU STRICTO 34. Fogel S., Welch J.W.: Tandem gene amplification mediates copper resistances in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 5342– 5346 (1982) 35. Franco-Duarte R., Umek L., Zupan B., Schuller D.: Computational approaches for the genetic and phenotypic characterization of a Saccharomyces cerevisiae wine yeast collection. Yeast, 26: 675–692 (2009) 36.Galeote V., Novo M., Salema-Oom M., Brion C., Valerio E., Goncalves P., Dequin S.: FSY1, an horizontally transferred gene in the Saccharomyces cerevisiae EC1118 wine yeast strain encodes a high affinity fructose/H+symporter, Microbiology, 156, 3754–3761 (2010) 37. Goddard M.R., Anfang N., Tang R., Gardner R.C., Jun C.: A distinct population of Saccharomyces cerevisiae in New Zealand: evidence for local dispersal by insects and human-aided global dispersal in oak barrels. Environ. Microbiol. 12, 63–73 (2010) 38. Goffeau A, Barrell B.G. Bussey H. Davis R.W., Dujon B., Feldmann H., Galibert F., Hoheisel J.D., Jacq C., Johnston M., Louis E.J., Mewes H.W., Murakami Y., Philippsen P., Tettelin H., Oliver S.G.: Life with 60 000 genes. Science, 274: 546, 563–567 (1996) 39. Gonzalez S.S., Barrio E., Gafner J., Querol A.: Natural hybrids from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and Sac­ charomyces kudriavzevii in wine fermentations, FEMS Yeast Res. 6, 1221–1234 (2006) 40.Gonzalez S.S., Barrio E., Querol A.: Molecular characterization of new natural hybrids of Saccharomyces cerevisiae and S. kudriavzevii in brewing. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2314– 2320 (2008) 41. Goto-Yamamoto N., Kitano K., Shiki K., Yoshida Y., Suzuki T., Iwata T., et al.: SSU1-R, a sulfite resistance gene of wine yeast, is an allele of SSU1 with a different upstream sequence. J. Ferment. Bioeng. 86, 427–433 (1998) 42. Guillaume C., Delobel P., Sablayrolles J.M., Blondin B.: Molecular basis of fructose utilization by the wine yeast Saccharomyces cerevisiae: a mutated HXT3 allele enhances fructose fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2432–2439 (2007) 43.Hennequin C., Thierry A., Richard G.F., Lecointre G., Nguyen H.V., Gaillardin C., Dujon B.: Microsatellite typing as a new tool for identification of Saccharomyces cerevisiae strains. J. Clin. Microbiol. 39, 551–559 (2001) 44. Homann O.R., Cai H., Becker J.M., Lindquist S.L.: Harnessing natural diversity to probe metabolic pathways. PLoS Genet. 1, e80. (2005) 45.Infante J.J., Dombek K.M., Rebordinos L., Cantoral J.M., Young E.T.: Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics, 165, 1745–1759 (2003) 46. James T.C., Usher J., Campbell S., Bond U.: Lager yeasts possess dynamic genomes that undergo rearrangements and gene amplification in response to stress. Curr. Genet. 53, 39–152 (2008) 47.Kao K.C., Sherlock G.: Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499–1504 (2008) 48.Kielland-Brandt M.C., Nilsson-Tillgren T., Gjermansen C., Holmberg S., Pedersen M.B.: Genetics of brewing yeasts, in: A.H. Rose, E. Wheals, J.S. Harrison (Eds.), The yeasts, Academic Press, London, 223–254 (1995) 49.Kreger van Rij N.J.W.: The yeasts, a taxonomic study, 3rd ed. Elsevier Science Publisher, Amsterdam (1984) 50. Kurtzman C. P., Fell J. W.: The yeasts, a taxonomic study, 4th ed. Elsevier Science, Amsterdam (1998) 51. Kurtzman C.P., Robnett C.J.: Phylogenetic relationships among yeasts of the Saccharomyces complex determined from multigene sequence analyses. FEMS Research, 3, 417–432 (2003) 221 52.Kvitek D.J., Will J.L., Gasch A.P.: Variations in stress sensitivity and genomic expression in diverse S. cerevisiae isolates. PLoS Genet. 4: e1000223. doi: 10.1371/journal.pgen.1000223. (2008) 53.Le Jeune C., Lollier M., Demuyter C., Erny C., Legras J.L., Aigle M., Masneuf-Pomarede I.: Characterization of natural hybrids of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus var. uvarum, FEMS Yeast Res. 7, 540–549 (2007) 54. Legras J-L., Ruh O., Merdinoglu D., Karst F.: Selection of hyper­ variable microsatellite loci for the characterization of Saccharo­ myces cerevisiae strains. Int. J. Food Microbiol. 102, 73–83 (2005) 55. Libkind D., Hittinger C.T., Valerio E., Goncxalves C., Dover J., Johnston M., Goncalves P., Sampaio J.P.: Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 35, 14539–14544 (2011) 56. Liti G., Barton D.B.H., Louis E.J.: Sequence diversity, reproductive isolation and species concepts in Saccharomyces. Genetics, 174, 839–850 (2006) 57.Liti G., Carter D.M., Moses A.M., Warringer J., Parts L., James S.A., Davey R.P., Roberts I.N., Burt A., Koufopanou V., et al.: Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature, 458: 337–341 (2009) 58. Liti G., Peruffo A., James S.A., Roberts I.N., Louis E.J.: Inferences of evolutionary relationships from a population survey of LTRretrotransposons and telomeric-associated sequences in the Saccharomyces sensu stricto complex. Yeast, 22, 177–192 (2005) 59. Lodder J.: The yeasts, a taxonomic study, 2nd ed. North Holland Publishing Company, Amsterdam (1970) 60.Lopandic K., Gangl H., Wallner E., Tscheik G., Leitner G., Querol A., Borth N., Breitenbach M., Prillinger H., Tiefenbrunner W.: Genetically different wine yeasts isolated from Austrian vine-growing regions influence wine aroma differently and contain putative hybrids between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces kudriavzevii. FEMS Yeast Res. 7, 953–965 (2007) 61. Manzano M., Medrala D., Giusto C., Bartolomeoli I., Urso R., Comi G.: Classical and molecular analyses to characterize commercial dry yeasts used in wine fermentation. J. App. Microbiol. 100, 3, 599–607 (2006) 62.McGover P.E., Zhang J., Tang Z., Zhang Z., Hall G.R., Moeau R.A., Nunez A., Butrym E.D., Richards M.P., Wang C.S., Cheng G., Zhao Z., Wang C.C.: Fermented beverages of pre- and proto-historic China. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 17593– 17598 (2004) 63. Muller L.A.H., McCusker J.H.: A multispecies-based taxonomic microarray reveals interspecies hybridization and introgression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 9, 143–152 (2009a) 64. Muller L.A.H., McCusker J.H.: Microsatellite analysis of genetic diversity among clinical and nonclinical Saccharomyces cerevi­ siae isolates suggests heterozygote advantage in clinical environments. Mol. Ecol. 18, 2779–2786 (2009b) 65. Nakao Y., Kanamori T., Itoh T., Kodama Y., Rainieri S., Nakamura N., Shimonaga T., Hattori M., Ashikari T.: Genome sequence of the lager brewing yeast, an interspecies hybrid. DNA Res. 16, 115–129 (2009) 66. Naumov G. I.: Saccharomyces bayanus var. uvarum comb. nov., a new variety established by genetic analysis. Microbiology, 69, 338–342 (2000) 67. Naumov G.I., Naumova E.S., Pomarede I.: Genetic Identification of new biological species Saccharomyces arboricolus Wang. Antonie van Leeuwenhoek, 98, 1–7 (2010) 68. Novo M., Bigey F., Beyne E., Galeote V., Gavory F., Mallet S., Cambona B., Legras J-L., Wincker P., Casaregola S. i in. Eukaryote-to-eukaryote gene transfer events revealed by the genome sequence of the wine yeast Saccharomyces cerevisiae EC1118. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 16333–16338 (2009) 222 ANNA MISIEWICZ, SYLWIA WRÓBLEWSKA-KABBA 69. Perez-Ortin J.E., Garcia-Martinez J., Alberola T.M.: DNA chips for yeast biotechnology. The case of wine yeasts. J. Biotechnol. 98, 227–241 (2002) 70. Perez-Ortin J.E., Querol A., Puig S., Barrio E.: Molecular cha­racte­rization of a chromosomal rearangement involved in the adaptive evolution of yeast strains. Genome Res. 12, 1533–1539 (2002) 71. Pretorius I.S. Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking, Yeast, 15, 16(8): 675–729 (2000) 72. Pulvirenti A., Nguyen H-V., Caggia C., Giudici P., Rainieri S., Zambonelli C.: Saccharomyces uvarum, a proper species within Saccharomyces sensu stricto. FEMS Microbiol. Lett. 192, 191–196 (2000) 73.Querol A., Bond U.: The complex and dynamic genomes of industrial yeasts. FEMS Microbiol. Lett. 293, 1–10 (2009) 74. Rainieri S., Kodama Y., Kaneko Y., Mikata K., Nakao Y., Ashikari T.: Pure and mixed genetic lines of Saccharomyces bayanus and Saccharomyces pastorianus and their contribution to the lager brewing strain genome. Appl. Environ. Microbiol. 72, 3968–3974 (2006) 75. Rainieri S., Pretorius I.S.: Selection and improvement of wine yeasts. Ann. Microbiol. 50, 15–31 (2000) 76.Rainieri S., Zambonelli C., Kaneko Y.: Saccharomyces sensu stricto: Systematics, Genetic Diversity and Evolution. J. Biosci. Bioeng. 96, 1–9 (2003) 77. Richard G.-F., Dujon B.: Molecular evolution of minisatellites in hemiascomycetous yeasts. Mol. Biol. Evol. 23, 189–202 (2006) 78.Richards K.D., Goddard M.R., Gardner R.C.: A database of microsatellite genotypes for Saccharomyces cerevisiae. Antonie van Leeuwenhoek, 96, 355–359 (2009) 79. Rolland T., Dujon B., Richard G-F.: Dynamic evolution of megasatellites in yeasts. Nucleic Acids Res. 38, 4731–4739 (2010) 80. Schacherer J., Shapiro J.A., Ruderfer D.M., Kruglyak L.: Comprehensive polymorphism survey elucidates population structure of Saccharomyces cerevisiae. Nature, 458, 342–345 (2009) 81.Soltesova A., Spirek M., Horvsath A., Sulo P.: Mitochondria – tool for taxonomic identification of yeasts from Saccharomyces sensu stricto complex. Microbiol. (Praha), 45(2) 99–106 (2000) 82.Stambuk B.U., Dunn B., Alves S.L., Duval E.H., Sherlock G.: Industrial fuel ethanol yeasts contain adaptive copy number changes in genes involved in vitamin B1 and B6 biosynthesis. Genome Res. 19, 2271–2278 (2009) 83. Suárez Valles B., Pando Bedriñana R.: A molecular genetic study of natural strains of Saccharomyces isolated from Asturian cider fermentations. J. Appl. Microbiol. 103, 4, 778–786 (2007) 84. Tornai-Lehoczki J., Dlauchy D.: An opportunity to distinguish species of Saccharomyces sensu stricto by electrophoretic separation of the larger chromosomes. Lett. Appl. Microbiol. 23 (4) 227–230 (1996) 85.van der Walt J.P.: Genus Saccharomyces Meyen emend. Rees, 555–718. in Lodder J. (ed.), The yeasts, a taxonomic study, 2nd ed. North Holland Publ. Co., Amsterdam (1970) 86.Vaughan-Martini A., Kurtzman C.P.: Deoxyribonucleic acid relatedness among species of the genus Saccharomyces sensu Stricto. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 35, 508–511 (1985) 87.Vaughan-Martini A., Martini A.: Facts, myths and legends on the prime industrial microorganism. J. Ind. Microbiol. 14, 514–522 (1995) 88. Verstrepen K.J., Reynolds T.B., Fink G.R.: Origins of variation in the fungal cell surface (Review) Nature Rev. Microbiol. 2, 7, 533–540 (2004) 89. Vigentini I., Fracassetti D., Picozzi C., Foschino R.: Polymorphisms of Saccharomyces cerevisiae genes involved in wine production. Curr. Microbiol. 58, 211–218 (2009) 90. Wei W., I 20 innych Steinmetz L.M.: Genome sequencing and comparative analysis of Saccharomyces cerevisiae strain YJM789. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 12825–12830 (2007) 91. Wenger J.W., Schwartz K. Sherlock G.: Bulk segregant analysis by high throughput sequencing reveals a novel xylose utilization gene from Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 6 e1000942. (2010) 92. Wiens F., Zitzmann A., Lachance M.A., Yegles M.M., Pragst F., Wurst F.M. Spanagel R.: Chronic intake of fermented floral nectar by wild treesrews. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 10426– 10431 (2008) 93.Winzeler E.A., Castillo-Davis C.I., Oshiro G., Liang D., Richards D.R., Zhou Y., Hartl D.L.: Genetic diversity in yeast assessed with whole-genome oligonucleotide arrays. Genetics, 163, 79–89 (2003) 94.Yamagishi H., Ogata T.: Chromosomal structures of bottom fermenting yeasts. Syst. Appl. Microbiol. 22, 341–353 (1999) 95.Wolfe K.H., Shields D.C.: Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome. Nature, 12, 387, (6634): 708–713 (1997) 96.Wong S, Wolfe K.H.: Birth of a metabolic gene cluster in yeast by adaptive gene relocation. Nat. Genet. 37 (7), 777–782 (2005) 97. Zohary D., Hopf M.: Domestication of plants in the old world, 3rd ed. Oxford Univ. Press, New York, 151–159 (2000) POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 223–228 http://www.pm.microbiology.pl ZRÓŻNICOWANIE KASET SCCmec U METYCYLINOOPORNYCH GRONKOWCÓW KOAGULAZO-UJEMNYCH Ewa Szczuka1*, Adam Kaznowski1 1 Zakład Mikrobiologii, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Wydział Biologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza w Poznaniu, ul. Umultowska 89, 61-614 Poznań Wpłynęło w styczniu 2014 r. 1. Wstęp. 2. Budowa kaset SCCmec. 3. Występowanie kaset SCCmec u gronkowców koagulazo-ujemnych. 3.1. Zróżnicowanie kaset SCCmec u Staphylococcus epidermidis. 3.2. Identyfikacja kaset występujących u szczepów Staphylococcus haemolyticus. 3.3. Charakterystyka kaset u Staphylococcus hominis. 3.4. Występowanie kaset SCCmec u gronkowców sporadycznie izolowanych od chorych ludzi. 3.5. Charakterystyka kaset SCCmec obecnych u szczepów izolowanych od zwierząt. 4. Podsumowanie Differentiation of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci Abstract: Staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec) is a mobile genetic element that harbors the mec genes which encode resistance to methicillin and almost all β-lactam antibiotics. Also resistance genes for aminoglycosides, macrolides, tetracyclines can accrue on SCCmec elements. Coagulase-negative staphylococci are thought to be a reservoir of diverse SCCmec elements that can spread to Staphylococcus aureus or other species of Staphylococcus. A diversity of SCCmec types, with many new combinations of the mec and ccr gene complex as well as nontypeable types were recognized among the MR-CNS strains. 1. Introduction. 2. The structure of SCCmec elements. 3. Distribution of SCCmec types in coagulase-negative staphylococci. 3.1. Differentiation of SCCmec types in Staphylococcus epidermidis. 3.2. Identification of SCCmec in Staphylococcus haemolyticus. 3.3. Characteristics of SCCmec in Staphylococcus hominis. 3.4 Distribution of SCCmec types in sporadic staphylococcal isolates from patients. 3.5 Characteristics of SCCmec types in bacterial strains isolated from animal sources. 4. Summary Słowa kluczowe: Staphylococcus, kasety SCCmec Key words:Staphylococcus, staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) 1. Wstęp Gronkowce koagulazo-ujemne stanową naturalną florę bakteryjną skóry i błon śluzowych człowieka, ale mogą być czynnikiem etiologicznym wielu infekcji głównie u osób z obniżoną odpornością. Za główną przyczynę wirulencji tej grupy bakterii uważa się zdolność wytwarzania biofilmu na powierzchni uszkodzonej tkanki oraz abiotycznej. Uważa się, że gronkowce koagulazo-ujemne stanowią rezerwuar genów warunkujących oporność na antybiotyki [11, 12, 26, 36]. Kasety SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec) są mobilnymi elementami genetycznymi (MGE, mobile genetic elements), które na drodze transferu horyzontalnego mogą być przekazywane między szczepami tego samego lub różnych gatunków [12]. Kaseta SCCmec zawiera zwykle gen mecA, który warunkuje oporność gronkowców na metycylinę, co oznacza oporność na antybiotyki β-laktamowe, czyli penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy i monobaktamy. Wyjątek stanowi cefalosporyna V generacji – ceftobiprol, który jest pierwszym antybiotykiem β-laktamowym aktywnym wobec MRSA (methicillin resistant Staphy­ lococcus aureus) [30]. Gen mecA odpowiedzialny jest za wytwarzanie białka wiążącego penicylinę – PBP2a (penicillin binding protein 2a), które w odróżnieniu od innych białek PBP, wykazuje obniżone powinowactwo do antybiotyków β-laktamowych i przejmuje ich funkcję. Białko PBP2a jest transpeptydazą odpowiedzialną za tworzenie mostków pentaglicynowych w peptydoglikanie, co warunkuje syntezę ściany komórkowej [16, 22]. Pochodzenie kaset SCCmec oraz mechanizm ich nabywania nie jest w pełni poznany. Kaseta jest zintegrowana z chromosomem bakteryjnym w specyficznym miejscu na końcu 3’ genu orfX kodującego metylotrasferazę rybosomalną oraz jest oskrzydlona przez proste i odwrócone sekwencje repetytywne [20, 21, 24]. Kaseta SCCmec zawiera kompleks genów mec oraz rekombinazę ccr, która umożliwia wycinanie i specyficzną integrację kasety z chromosomem bakteryjnym (Rys. 1). W strukturę SCCmec bardzo często wbudowane są mobilne elementy genetyczne tj: plaz­ midy, transpozony, sekwencje inercyjne, w których mogą być zlokalizowane geny warunkujące oporność na antybiotyki. W kasecie mogą się znajdować również geny warunkujące wirulencje, czy też kodujące białka biorące udział w syntezie polisacharydów budujących ścianę komórkową bakterii [12]. Kasety mają wielkość od 21 do 68 tysięcy nukleotydów. Elementy SCCmec odznaczają się zróżnicowaną strukturą i są klasyfikowane na różne typy na podstawie występującego kompleksu genów mec oraz rekombinazy ccr. Dotychczas * Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Wydział Biologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza w Poznaniu, ul. Umultowska 89, 61-614 Poznań, tel. 61 829 59 36, e-mail: [email protected] 224 EWA SZCZUKA, ADAM KAZNOWSKI Rys. 1. Schemat budowy kasety SCCmec. J1, J2, J3 – regiony towarzyszące. Gen mecA koduje oporność na metycylinę, mecR1, mecl – geny regulatorowe, ccrB2, ccrA2 – geny kodujące rekombinazę opisano 11 typów kaset SCCmec, w niektórych z nich wyróżniono podtypy [22, 30, 37]. Warto podkreślić, że pojawiło się dużo niejasności oraz niespójności w klasyfikacji kaset SCCmec jak i nazewnictwie kompleksów genów mec i ccr. W celu rozwiązania tych problemów została powołana Międzynarodowa Grupa Ekspertów ds. Klasyfikacji Kaset SCCmec (IWG-SCC). W wyniku jej prac zostało ujednolicone nazewnictwo kaset SCCmec, określone zostały wymagania, jakie muszą być spełnione, aby został zatwierdzony nowy typ kasety SCCmec oraz ustalono jednolite kryteria stosowane przy definiowaniu kaset SCCmec w badaniach epidemiologicznych. Poszczególne klony MRSA są charakteryzowane poprzez określenie typu kasety SCCmec. Szpitalne szczepy MRSA (HA-MRSA, hospital acquired methicillin resistant Sta­ phylococcus aureus) zawierają zazwyczaj kasety SCCmec typu I, II i III [13, 20, 21, 41]. Kasety typu II i III oprócz genu mecA mają geny kodujące oporność na aminoglikozydy, makrolidy i tetracykliny, co skutkuje wielo­ leko­opornością. Szczepy metycylinooporne gronkowca złocistego występujące w środowisku pozaszpitalnym (CA-MRSA, community acquired methicillin resistant Staphylococcus aureus) zawierają kasety typu IV i V, które mają jedynie gen warunkujący oporność na antybiotyki β-laktamowe [9, 28, 32]. Szczepy CA-MRSA pojawiły się w latach 90-tych XX wieku i powstały de novo w wyniku przekazania elementu SCCmec do wielu metycylino-wrażliwych klonów gronkowca złocistego (MSSA, methicillin-susceptible Staphylococcus aureus). Należy podkreślić, że kasety SCCmec częściej występują u gronkowców koagulazo-ujemnych niż u S. aureus. Pomimo tego, znacznie mniej wiadomo o strukturze tych elementów u tej grupy bakterii. 2. Budowa kaset SCCmec Kompleks genów mec składa się z genu strukturalnego mecA, genów regulatorowych: mecR1, mecI oraz sekwencji insercyjnych. U gronkowców opisano 5 klas regionu mec (A, B, C1, C2, D). Klasy różnią się między sobą występowaniem sekwencji inercyjnych oraz stopniem delecji genów regulatorowych. Klasa A kom- pleksu mec zawiera sekwencję insercyjną IS431, klasa B, IS1272 i IS431, klasa C, IS431, podczas gdy klasa D nie zawiera żadnej sekwencji insercyjnej. W obrębie klasy A wyodrębniono pięć wariantów (A1, A2, A3, A4 i A5), w klasie B i C odpowiednio po cztery warianty (B, B1, B2/B2, B(L), C1, C2, C1-like i C4) [22, 30, 37]. Kompleks ccr składa się z genu kodującego rekombinazę oraz otaczających go otwartych ramek odczytu (ORFs). Dotychczas zostały zidentyfikowane trzy filogenetycznie odmienne rekombinazy: ccrA, ccrB i ccrC. Wykazują one podobieństwo sekwencji nukleotydowej poniżej 50%. W obrębie typu ccrA wyróżniono allotypy: ccrA1-A7, a w obrębie ccrB: allotypy ccrB1-B7. Zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez IWG-SCC do tego samego allotypu ccr zalicza się sekwencje, które wykazują podobieństwo powyżej 85%, natomiast sekwencje ccr wykazujące podobieństwo od 60% do 82% uznawane są jako różne allotypy [22]. Ostatnio zidentyfikowano kolejne allotypy u S. haemolyticus – ccrABshp, a u S. sciuri – ccrA7 [22, 33, 45] W kasecie SCCmec występują trzy regiony towarzyszące: J1, J2 i J3, które mogą zawierać sekwencje niekodujące, pseudogeny oraz sekwencje insercyjne, plazmidy, transpozony, w których często obecne są geny warunkujące oporność na antybiotyki. Różnice w regionach J stanowią podstawę do wyróżnienia podtypów w obrębie tego samego kompleksu mec-ccr [22]. 3. Występowanie kaset SCCmec u gronkowców koagulazo-ujemnych Wśród gronkowców koagulazo-ujemnych największe zróżnicowanie kaset SCCmec obserwuje się u S. epi­ dermidis, S. heamolyticus i S. hominis, czyli gatunków najczęściej powodujących zakażenia u ludzi. Wiele kaset SCCmec występujących u gronkowców koagulazo-ujemnych nie można zaklasyfikować do już istniejących typów, gdyż najprawdopodobniej zawierają do tej pory nieopisane allotypy genu rekombinazy chromosomowej (ccr), kompleksy mec lub w kasetach tych występują nowe kombinacje kompleksów ccr i mec [37]. Wskazuje to na konieczność sekwencjonowania całych struktur SCCmec w celu poznania ich budowy. ZRÓŻNICOWANIE KASET SCCmec U METYCYLINOOPORNYCH GRONKOWCÓW KOAGULAZO-UJEMNYCH Natomiast w większości przypadków badania dotyczące identyfikacji kaset SCCmec są przeprowadzane w oparciu o reakcję PCR, z zastosowaniem starterów zaprojektowanych do znanych sekwencji występujących w opisanych kasetach SCCmec [25, 49]. 3.1. Zróżnicowanie kaset SCCmec u Staphylococcus epidermidis Z danych literaturowych wynika, że kaseta typu IV jest najczęściej występującą u bakterii należących do gatunku S. epidermidis. Na podkreślenie zasługuje fakt, że dominującą pozycję kaseta ta zajmuje w populacjach bakterii pochodzących z różnych obszarów geograficznych: z Francji, Portugalii, Kanady, Japonii i Meksyku [1, 10, 11, 28, 34]. U S. epidermidis stwierdzono również obecność kaset SCCmec typu I, II, III, V, VI i VIII [27, 31, 34, 38, 48, 52]. Badania przeprowadzone przez I b r a h e m i wsp. [19] wykazały bardzo wysoki odsetek szczepów MRSE (methicillin resistant S. epidermi­ dis), u których nie można było zidentyfikować kaset SCCmec. Jedynie u trzech izolatów MRSE stwierdzono występowanie kasety SCCmec typu I, a u dwóch kasetę typu IV. Szczepy te zostały wyizolowane z przedsionka nosa mieszkańców północnych regionów Finlandii. Również wśród populacji szwedzkich szczepów zaobserwowano wysoki odsetek kaset SCCmec, których przynależności do znanych typów nie można było okreś­lić. Ponadto stwierdzono występowanie nietypowych kombinacji kompleksu genu mec i rekombinazy ccr [40]. W innych badaniach wykazano, że szczepy S. epidermi­ dis zawierają w swoim genomie wiele kopii genu ccr jak również różne jego allotypy [13, 19, 26, 35, 40]. Występowanie wielu kopii genów kodujących rekombinazę chromosomalną w genomie bakterii może wynikać z dużej łatwości nabywania ruchomych elementów genetycznych przez szczepy S. epidermidis. Uważa się, że zachodzące częste zdarzenia rekombinacyjne oraz wysoka plastyczność genomu tych bakterii zadecydowały o sukcesie S. epidermidis jako patogena zakażeń szpitalnych [36]. Duże zróżnicowanie kaset SCCmec u bakterii w środowisku szpitalnym upatruje się również w ekspozycji ich na antybiotyki, które w stężeniach subinhibicyjnych mogą nie tylko modulować ekspresję genów, ale również wpływać na horyzontalny transfer kaset SCCmec [34]. Ponadto transfer kaset jest ułatwiony w biofilmie, ze względu na bardzo duże zagęszczenie komórek bakteryjnych w tej strukturze. Znacznie mniejsze zróżnicowanie kaset zaobserwowano wśród szczepów CA-MRSE (community-associated methicillin resistant S. epidermidis), zidentyfikowano jedynie kasety typu IV i V. Liczni autorzy wskazują, że szczepy S. epidermidis stanowią rezerwuar kaset SCCmec dla metycylino­ wrażliwych szczepów gronkowca złocistego [17, 22]. 225 Należy podkreślić, że kasety typu IV, są kasetami najmniejszymi i tym samym najbardziej mobilnymi. Nabycie kaset przez MSSA skutkuje opornoścą na antybiotyki β-laktamowe i powstaniem MRSA [22, 38]. W warunkach in vitro wykazano transfer kasety SCCmec IV ze szczepu S. epidermidis do S. aureus [47]. Również wyniki badań B a r b i e r i wsp. [1] wskazują na możliwość transferu kasety typu IV występującej u S. epidermidis do CA-MRSA, ponieważ wykazano podobieństwo sekwencji SCCmec u tych gatunków. Kolejny przykład międzygatunkowego transferu kasety SCCmec został podany przez B l o e m e n d a a l i wsp. [3]. Szczepy S. epidermidis i S. aureus wyizolowane od hospitalizowanego noworodka miały tą samą kasetę SCCmec typu IVa, a ich sekwencje wykazały > 98% podobieństwa. 3.2. Identyfikacja kaset występujących u szczepów Staphylococcus haemolyticus U bakterii z gatunku S. haemolyticus zidentyfikowano kasety typu IV, V i VII, jednakże występują one u niewielkiej liczby szczepów [5, 8, 35, 45]. U szczepu JCSC1435, którego cały genom został zsekwencjonowany, stwierdzono obecność kasety SCCmec [42]. Analizując wyniki badań można stwierdzić, że w genomie S. haemolyticus najczęściej występuje klasa C kompleksu mec, która jest charakterystyczna dla kasety typu V. Kompleks ten jednak często nie występuje z rekombinazą typu ccrC jak to ma miejsce w kasecie SCCmec typu V, ale z innymi typami rekombinaz ccr [5, 45]. Ponadto wielu autorów wskazuje, że w genomie S. haemolyticus występuje wiele kopii genów rekombinazy ccr, przy czym niektórych nie można przyporządkować do określonego allotypu [13, 26, 35]. Ostatnio u szczepów S. haemolyticus zostały zidentyfikowane nieznane przedtem allotypy genów rekombinazy ccr: ccrA7, ccrA8, ccrABSHP [33, 45]. Niemniej jednak nadal wysoki odsetek szczepów S. haemolyticus ma kasety, których nie można zaklasyfikować do znanych typów [12, 13, 26]. Uważa się, że S. haemolyticus jest rezerwuarem kaset SCCmec typu V dla innych gatunków gronkowców. W literaturze opisano przypadek jej transferu ze szczepu S. haemolyticus do S. aureus [2]. Powstały klon MRSA był odpowiedzialny za epidemie na oddziale noworodkowym w szpitalu uniwersyteckim w Örebro w Szwecji. Hipoteza transferu kasety między tymi gatunkami została poparta wysokim stopniem podobieństwa sekwencji (99%) fragmentu kompleksu mec występującego w kasetach SCCmec typu V u wyżej wymienionych gatunków. Natomiast analiza PFGE wykazała identyczne profile DNA dla tych szczepów. Inne klony MRSA izolowane na terenie tego szpitala nie zawierały kasety SCCmec typu V. 226 EWA SZCZUKA, ADAM KAZNOWSKI 3.3. Charakterystyka kaset SCCmec u Staphylococcus hominis W genomie szczepów S. hominis wykryto kasety SCCmec typu III, VI, VIII oraz o nieokreślonej przynależności [4, 10, 12, 13, 19, 31]. Należy jednak zaznaczyć, że badano pojedyncze izolaty. B o u c h m a n i i wsp. [4] opisali występowanie u S. hominis nowej kasety SCCmec o unikatowej kompozycji kompleksu mec i ccr. Zawiera ona klasę A kompleksu mec i gen rekombinazy typu ccrAB1. Często w genomach szczepów S. hominis występują dwa różne typy genów rekombinazy (ccrAB1, ccrAB4) i jeden kompleks mec (klasa A). Podobne rezultaty uzyskali M e n d o g a - O l a z a r á n i wsp. [29]. Opisali oni szczepy, które w genomie mają jeden kompleks mec oraz dwa typy genów rekombinaz ccr: ccrAB1, ccrC lub ccrAB4, ccrC, jak również szczepy mające jeden kompleks mec oraz trzy typy genów rekombinaz: ccrAB1, ccrAB4 i ccrC. Zdaniem wyżej wymienionych autorów uzyskane dane wskazują na możliwość występowania w jednej kasecie SCCmec kilku genów rekombinaz crr, czy też występowaniu genów ccr w kilku kasetach ułożonych tandemowo. Również wśród szczepów S. hominis nie mających genu mecA stwierdzono występowanie genów rekombinaz: ccrC, ccrAB1, ccrAB4 i ccrAB2. 3.4. Występowanie kaset SCCmec u gronkowców sporadycznie izolowanych od chorych ludzi Budowa kaset SCCmec u gatunków gronkowców rzadko wywołujących zakażenia u ludzi jest słabo poznana. U S. capitis zidentyfikowano kasety typu I, II, III, IV i V, u S. warneri typu III i IV, a u S. sciuri, S. saprophyticus i S. cohnii typu III. U pojedynczych izolatów S. pasteuri, S. pettenkoferi i S. massiliensis wykryto odpowiednio kasety typu I, IV i V [19, 31, 52]. Wśród gronkowców koagulazo-ujemnych występują również kasety, których nie można zidentyfikować w oparciu o przyjęte kryteria. U szczepów S. saprophyticus stwierdzono występowanie kasety SCCmec mającej zidentyfikowany kompleks mec- klasę A i nieznany typ rekombinazy ccr [39]. H i g a s h i d e i wsp. [15] opisali u tego gatunku kasety SCCmec z unikatową kompozycją kompleksu mec (klasa A) i ccr (ccrA1/ccrB3). U S. sciuri zidentyfikowano allotyp – ccrA7, który tworzy kompleks z genem rekombinazy ccrB, co wskazuje na zachodzące rekombinacje między różnymi typami genów ccr [45]. Nieznany wcześniej typ kasety SCCmec o wielkości 35 kpz, został opisany u S. cohnii [51]. Zawiera ona klasę A kompleksu mec i nowo odkryte warianty genów rekombinaz: ccrA5 i ccrB3 oraz dwa geny w rejonie J1. Geny ccrA i ccrB wykazują 89,7% podobieństwa z genami rekombinazy ccrASHP występującymi u S. heamolyticus oraz 90% podobieństwa z genami ccrB3 występującymi u S. pseudintermedius. Do kasety przylega dodatkowy element SCC, w którym obecne są geny kodujące rekombinazę – ccrC. Kaseta SCCmec i element SCC prawdopodobnie zostały wbudowane do genomu bakteryjnego niezależnie od siebie, a nie jako jeden kompleks SCCmec-SCC. 3.5. Charakterystyka kaset SCCmec obecnych u szczepów izolowanych od zwierząt Najwięcej danych zgromadzono dotąd o kasetach SCCmec występujących u szczepów izolowanych z materiałów pobranych od chorych ludzi, natomiast znacznie mniej wiadomo o kasetach występujących u gronkowców izolowanych od zwierząt. Przyjmuje się, że bakterie pochodzące od zwierząt są rezerwuarem kaset SCCmec dla gronkowców zasiedlających organizm człowieka [6, 7, 18]. Hipoteza ta została poparta analizą sekwencyjną, która wykazała bardzo wysoki stopień podobieństwa genu mecA występującego u S. fleurettii (komensalnej bakterii bytującej u zwierząt) i S. aureus [43]. Kaseta SCCmec typu III najczęściej występuje u szczepów S. lentus, S. xylosus, S. pasteueri, S. rosti izolowanych od różnych zwierząt. Na podkreślenie zasługuje fakt, że kaseta ta zawiera geny warunkujące oporności na różne klasy antybiotyków [46, 50]. U gatunków S. pasteuri, S. rosti, S. capitis, S. saprophyticus i S. cohnii odnotowano również występowanie kasety typu IV [44]. Natomiast szczepy zaliczane do gatunku S. sciuri, które często izolowane są od dziko żyjących zwierząt, zawierają w swoich genomach kasety typu I, III i V [14, 44]. U szczepów tych również stwierdzono występowanie kaset SCCmec, których nie sklasyfikowano w oparciu o przedstawione kryteria [44]. Ponadto wykazano obecność kaset nietypowych, mających zidentyfikowany kompleks mec, a nieokreślony typ rekombinazy chromosomalnej, co może sugerować istnienie nowych allotypów u tych gatunków. Co ciekawe, zidentyfikowano również kasetę typu III, w której stwierdzono występowanie genów regulatorowych kompleksu mec oraz genów kodujących rekombinazę chromosomalną przy równoczesnym braku genu mecA. Z kolei I b r a h e n i wsp. [19], stwierdzili występowanie kaset SCCmec, u których występował gen mecA, a nie było genów regulatorowych, co wskazuje, że kompleks mec może podlegać częściowej delecji. 4. Podsumowanie Obserwuje się ogromne zróżnicowanie kaset SCCmec występujących u gronkowców koagulazo-ujemnych. Pomimo intensywnie prowadzonych badań, nadal struktura wielu kaset SCCmec nie została poznana, a obecne w nich kompleksy mec i ccr nie zostały ziden- ZRÓŻNICOWANIE KASET SCCmec U METYCYLINOOPORNYCH GRONKOWCÓW KOAGULAZO-UJEMNYCH tyfikowane. Wyniki wielu analiz świadczą o występowaniu nowych kompozycji kompleksu mec i genu rekombinazy chromosomalnej w tych kasetach. Nie ulega wątpliwości, że ogromne zróżnicowanie elementów SCCmec stwarza konieczność ich sekwencjonowania. Na podstawie przeprowadzonych analiz sekwencyjnych stwierdzono, że geny ccr są znacznie bardziej zróżnicowane niż kompleks mec. Ponadto w genomie komórki bakteryjnej może występować wiele kopi genów ccr i różnych allotypów tych genów, co z kolei wskazuje na duże zdolności rekombinacyjne tych bakterii. Uważa się, że metycylinooporne gronkowce koagulazo-ujemne stanowią rezerwuar kaset SCCmec dla metycylinowrażliwich szczepów S. aureus. Skutkuje to nabyciem przez te bakterie oporności na antybiotyki β-laktamowe, a niekiedy także na inne klasy antybiotyków, co z kolei ogranicza opcje terapeutyczne, jakie mogą być zastosowane w leczeniu infekcji powodowanych przez te bakterie. Zatem poznanie kaset SCCmec u gronkowców koagulazo-ujemnych umożliwi wnios­ kowanie o rozprzestrzenianiu się oporności na antybiotyki nie tylko wśród szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych, ale również S. aureus. Piśmiennictwo 1.Barbier F., Ruppé E., Hernandez D., Lebeaux D., Francois P., Felix B., Desprez A., Maiga A., Woerther P.L., Gaillard K., Jeanrot C., Wolff M., Schrenzel J., Andremont A., Ruimy R.: Methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci in the community: high homology of SCCmec IVa between Staphy­ lococcus epidermidis and major clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Infect. Dis. 202, 270–281 (2010) 2.Berglund C., Söderquist B.: The origin of a methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolate at a neonatal ward in Sweden-possible horizontal transfer of a staphylococcal cassette chromosome mec between methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus aureus. Clin. Microbiol. Infect. 14, 1048–1056 (2008) 3.Bloemendaal A.L., Brouwer E.C., Fluit A.C.: Methicillin resistance transfer from Staphylocccus epidermidis to methicillin-susceptible Staphylococcus aureus in a patient during antibiotic therapy. PLoS One, 5, e11841 (2010) 4.Bouchami O., Ben Hassen A., de Lencastre H., Miragaia M.: Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococ­ cus hominis (MRSHo): low clonality and reservoirs of SCCmec structural elements. PLoS One 6, e21940 (2011) 5.Bouchami O., Ben Hassen A., de Lencastre H., Miragaia M.: High prevalence of mec complex C and ccrC is independent of SCCmec type V in Staphylococcus haemolyticus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31, 605–614 (2011) 6.Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M.: Metycylinooporne szczepy Staphylococcus intermedius występujące u psów jako potencjalny rezerwuar genu mecA. Post. Mikrobiol. 48, 235–242 (2009) 7. Descloux S., Rossano A., Perreten V.: Characterization of new staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) and topoisomerase genes in fluoroquinolone- and methicillin-resistant Sta­ phylococcus pseudintermedius. J. Clin. Microbiol. 46, 1818–1823 (2008) 227 8. Feßler A.T., Billerbeck C., Kadlec K., Schwarz S.: Identification and characterization of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci from bovine mastitis. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1576–1582 (2010) 9. Fey P.D., Saїd-Salim B., Rupp M.E., Hinrichs S.H., Boxrud D.J., Davis C.C., Kreiswirth B.N., Schlievert M.: Comparative molecular analysis of community or hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 196–203 (2003) 10. Garza-Gonzalez E., Lopez D., Pezina C., Muruet W., Bocanegra-Garcia V., Munoz I., Ramirez C., Llaca-Diaz J.M.: Diversity of staphylococcal cassette chromosome mec structures in coagulase-negative staphylococci and relationship to drug resistance. J. Med. Microbiol. 59, 323–329 (2010) 11. Garza-Gonzalez E., Morfin-Otero R., Llaca-Diaz J.M., Rodriguez-Noriega E.: Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci. A review and the experience in a tertiary-care setting. Epidemiol. Infect. 138, 645–654 (2010) 12.Hanssen A.M., Ericson Sollid J.U.: SCCmec in staphylococci: genes on the move. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 46, 8–20 (2006) 13.Hanssen A.M., Ericson Sollid U.: Multiple staphylococcal cassette chromosomem and allelic variants of cassette chromosome recombinases in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci from Norway. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1671–1677 (2007) 14. Hauschild, T., Śliżewski, P., Masiewicz, P.: Species distribution of staphylococci from small wild mammals. Syst. Appl. Microbiol. 33, 457–460 (2010) 15. Higashide M., Kuroda M., Omura C.T., Kumano M., Ohkawa S., et al.: Methicillin-resistant Staphylococcus saprophyticus isolates carrying staphylococcal cassette chromosome mec have emerged in urogenital tract infections. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 2061–2068 (2008) 16. Hiramatsu K., Katayama Y., Yuzawa H., Ito T.: Molecular genetics of methicillin resistant Staphylococcus aureus. Int. J. Med. Microbiol. 292, 67–74 (2002) 17. Hisata K., Kuwahara-Arai K., Yamanoto M., Ito T., Nakatomi Y., Cui L., Baba T., Terasawa M., Sotozono C. et al.: Dissemination of methicillin-resistant staphylococci among healthy Japanese children. J. Clin. Microbiol. 43, 3364–3372 (2005) 18.Huber H., Ziegler D., Pflüger V., Vogel G., Zweifel C., Stephan R.: Prevalence and characteristics of methicillinresistant coagulase-negative staphylococci from livestock, chicken carcasses, bulk tank milk, minced meat, and contact persons. BMC Vet. Res. 7, 6 (2011) 19. Ibrahem S., Salmenlinna S., Virolainen A., Kerttula A.M., Lyyti­ käinen O., Jägerroos H., Broas M. Vuopio-Varkila J.: Carriage of methicillin-resistant staphylococci and their SCCmec types in a long-term-care facility. J. Clin. Microbiol. 47, 32–37 (2009) 20. Ito T., Katayama Y., Asada K., Mori N., Tsutsumimoto K., Tiensasitorn C., Hiramatsu K.: Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 1323–1336 (2001) 21.Ito T., Ma X.X., Takeuchi F., Okuma K., Yuzawa H., Hiramatsu K.: Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrC. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 2637–2651 (2004) 22. International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements. Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 4961–4967 (2009) 228 EWA SZCZUKA, ADAM KAZNOWSKI 23.Jamaluddin T.Z., Kuwahara-Arai K., Hisata K., Terasawa M., Cui L., Baba T., Sotozono C., Kinoshita S., Ito T., Hiramatsu K.: Extreme genetic diversity of methicillin-resistant Staphylococ­ cus epidermidis strains disseminated among healthy Japanese children. J. Clin. Microbiol. 46, 3778–3783 (2008) 24. Katayama Y., Ito T., Hiramatsu K.: Genetic organization of the chromosome region surrounding mecA in clinical staphylococcal strains: role of IS431-mediated mecI deletion in expression of resistance in mecA-carrying, low-level methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 1955–1963 (2001) 25.Kondo Y., Teruyo I., Ma X.X., Watanabe S., Kreiswirth B.N., Etienne J., Hiramatsu K.: Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosomemec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in Jun­kyard regions. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 264–274 (2007) 26. Lebeaux D., Barbier F., Angebault C., Benmahdi L., Ruppé E., Felix B., Gaillard K., Djossou F., Epelboin L., Dupont C., Renard M., Peroz G., Vandenesch F., Wolff M., Andremont A., Ruimy R.: Evolution of nasal carriage of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci in a remote population. Anti­ microb. Agents Chemother. 56, 315–323 (2012) 27. Li M., Wang X., Gao Q., Lu Y.: Molecular characterization of Sta­ phylococcus epidermidis strains isolated from a teaching hospital in Shanghai, China. J. Med. Microbiol. 58, 456–461 (2009) 28. Łuczak-Kadłubowska A., Hryniewicz W.: Zakażenia pozaszpitalne wywołane przez Staphylococcus aureus oporne na metycylinę (CA-MRSA) rola leukocydyny Panton-Valentine. W: Świat człowieka światem drobnoustrojów. Warszawa 2007. 69–74. 29. Mendoza-Olazarán S., Morfin-Otero R., Rodríguez-Noriega E., Llaca-Díaz J., Flores-Treviňo S., Ma González-Gonzálezn G., Villarreal-Treviňo L., Garza-Gonzálezn E.: Microbiological and molecular characterization of Staphylococcus hominis isolates from Blond. PLoS One, 8, e61161 (2013) 30. Młynarczyk A. Młynarczyk G.: Molekularne mechanizmy oporności na leki przeciwbakteryjne u Staphylococcus aureus. Post. Microbiol. 47, 423–429 (2008) 31.Mombach Pinheiro Machado A.B., Reiter K.C., Paiva R.M., Barth A.L.: Distribution of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) types I, II, III and IV in coagulase-negative staphylococci from patients attending a tertiary hospital in southern Brazil. J. Med. Microbiol. 56, 1328–1333 (2007) 32. Otter, J., French, G.L.: Molecular epidemiology of community associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Europe. Lancet Infect. Dis. 10, 227–239 (2010) 33. Pi B., Yu M., Chen Y., Yu Y., Li L.: Distribution of the ACME-arcA gene among meticillin-resistant Staphylococcus haemoly­ ticus and identification of a novel ccr allotype in ACME-arcA­ -positive isolates. J. Med. Microbiol. 58, 731–736 (2009) 34. Rolo J., de Lencastre H., Miragaia M.: Strategies of adaptation of Staphylococcus epidermidis to hospital and community: amplification and diversification of SCCmec. J. Antimicrob. Chemother. 67, 1333–1341 (2012) 35. Ruppé E., Barbier F., Mesli Y., Maiga A., Cojocaru R., Benk­ halfat M., Benchouk S., Hassaine H., Maiga I., Diallo A., Koumaré A.K., Ouattara K., Soumaré S., Dufourcq J.B., Nareth C., Sarthou J.L., Andremont A., Ruimy R.: Diversity of staphylococcal cassette chromosome mec structures in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus strains among outpatients from four countries. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 442–449 (2009) 36. Schoenfelder S.M.K., Lange K., Eckart M., Hennig S., Kozytska S., Ziebuhr W.: Success through diversity – How Staphylo­ coccus epidermidis establishes as a nosocomial pathogen Inter. J. Med. Microbiol. 300, 380–386 (2010) 37. Shore C., Coleman D.C.: Staphylococcal cassette chromosome mec: recent advances and new insights. Int. J. Med. Microb. 303, 350–359 (2013) 38. Smyth D.S., Wong A., Robinson D.A.: Cross-species spread of SCCmec IV sub-types in staphylococci. Infect. Genet. Evol. 11, 446–453 (2010) 39. Söderquist B., Berglund C.: Methicillin-resistant Staphylococcus saprophyticus in Sweden carries various types of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). Clin. Microbiol. Infect. 15, 1176–1178 (2009) 40.Svensson K., Hellmark B. Söderquist B.: Characterization of SCCmec elements in methicillin-resistant Staphylococcus epi­ dermidis isolated from blood cultures from neonates during three decades. APMIS, 119, 885–893 (2011) 41. Szczuka E., Grabska K.., Trawczyński K.., Bosacka K., Kaznowski A.: Characterization of SCCmec types, antibiotic resistance, and toxin gene profiles of Staphylococcus aureus strains. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 60, 261–270 (2013) 42.Takeuchi F., Watanabe S., Baba T., Yuzawa H., Ito T., Morimoto Y. i wsp.: Whole-genome sequencing of Staphylococcus haemolyticus uncovers the extreme plasticity of its genome and the evolution of human-colonizing staphylococcal species. J. Bacteriol. 187, 7292–7308 (2005) 43. Tsubakishita S., Kuwahara-Arai K., Sasaki T., Hiramatsu K.: Origin and molecular evolution of the determinant of methicillin resistance in staphylococci. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4352–4359 (2010) 44.Tulinski P., Fluit A.C., Wagenaar J.A., Mevius D., van de Vijver L., Duim B.: Methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci on pig farms act as a reservoir of heterogeneous SCCmec elements. Appl. Environ. Microbiol. 78, 299–304 (2012) 45.Urushibara N., Paul S.K., Hossain M.A., Kawaguchiya M., Kobayashi N.: Analysis of Staphylococcal cassette chromosome mec in Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus sciuri: identification of a novel ccr gene complex with a newly identified ccrA allotype (ccrA7). Microb. Drug Resist. 17, 291–297 (2011) 46. Vanderhaeghen W., Vandendriessche S., Crombé F., Dispas M., Denis O., Hermans K., Haesebrouck F., Butaye P.: Species and staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) diversity among methicillin-resistant non-Staphylococcus aureus staphylococci isolated from pigs. Vet. Microbiol. 158, 123–128 (2012) 47. Wielders C.L.C., et al.. In-vivo transfer of mecA DNA to Staphy­ lococcus aureus [corrected]. Lancet, 357, 1674–1675 (2001) 48. Wisplinghoff H., Rosato A.E., Enright M.C., Noto M., Craig W., Archer G.L.: Related clones containing SCCmec type IV predominate among clinically significant Staphylococcus epidermidis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 3574–3579 (2003) 49. Zhang K., McClure J., Elsayed S., Louie T., Clony J.M.: Novel PCR Assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec Types I to V in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 43, 5026–5033 (2005) 50.Zhang Y., Agidi S., LeJeune J.T.: Diversity of staphylococcal cassette chromosome in coagulase-negative staphylococci from animal sources. J. Appl. Microbiol. 107, 1375–1383 (2009) 51. Zong Z., Lu X.: Characterization of a new SCCmec element in Staphylococcus cohnii. PLoS One, 5, e14016 (2010) 52. Zong Z., Peng C., Lu X.: Diversity of SCCmec elements in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci clinical isolates. PLoS One, 6, e20191 (2011) POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 229–240 http://www.pm.microbiology.pl PATOGENEZA I LECZENIE ZAKAŻEŃ CANDIDA SPP. Monika Staniszewska1*, Małgorzata Bondaryk1, Marzena Kowalska2, Urszula Magda2, Martyna Łuka3, Zbigniew Ochal3, Wiesław Kurzątkowski1 1 Samodzielna Pracownia Promieniowców i Grzybów Niedoskonałych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny, Chocimska 24, 00-791 Warszawa 2 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Nowoursynowska 166, 02-787, Warszawa, Polska 3 Politechnika Warszawska, Plac Politechniki 1, 00-661 Warszawa, Polska Wpłynęło w lutym 2014 r. 1. Wprowadzenie. 2. Epidemiologia kandydoz. 3. Czynniki zjadliwości Candida albicans. 3.1. Adhezja. 3.2. Proteazy aspartylowe. 3.3. Pleomorfizm. 4. Leczenie zakażeń o etiologii Candida spp. 5. Nowe trendy w poszukiwaniu antymikotyków. 6. Podsumowanie Pathogenesis and treatment of fungal infections by Candida spp. Abstract: Candida albicans normally exists as harmless commensal inhabiting mucosal surfaces of healthy individuals. Yet, this opportunistic pathogen in immunocompromised hosts causes superficial or invasive life treating infections with high mortality rate. The incidence of candidiasis appeared to have several predisposing factors such as immunosuppressant or steroids treatments, long-term catheterization, invasive medical procedures, treatment with broad-spectrum antibiotic, destruction of skin by deep skin burns, local disorders of the gastrointestinal tract, diabetes mellitus, premature very low birth weight infants, immunologically compromised individuals, spread of HIV infection. This serious problem causes a need for better understanding of C. albicans virulence and antifungal treatment. This review features characterization of chosen virulence factors i.e.: adhesion, pleomorphism and enzymatic activity. Currently natural antifungal substances as well as synthetic derivatives are used at broad scale in candidiasis treatment. Recently, an increase of resistance to antifungal agents commonly used in fungal infection management has been observed. This world-scale problem generated a need for a search for novel antifungals. 1. Introduction. 2. Epidemiology of candidiasis. 3. Virulence factors of Candida albicans. 3.1. Adhesion. 3.2. Secreted aspartyl proteases. 3.3. Pleomorphism. 4. Candidiasis management. 5. New trends in the search for novel antifungal agents. 6. Summary Słowa kluczowe:antymikotyki, Candida spp., czynniki wirulencji, infekcje grzybicze Key words: antimycotics, Candida spp., fungal infections, virulence factors 1. Wprowadzenie Candida albicans wchodzi w skład mikroflory błon śluzowych przewodu pokarmowego, oddechowego, moczowo-płciowego oraz skóry nie wywołując objawów chorobowych u około 50–70% populacji ludzkiej [54, 78]. U pacjentów z zaburzeniami immunologicznymi ten oportunistyczny patogen powoduje infekcje o charakterze zarówno powierzchniowym jak i układowym [78]. Przyczyną rozwoju zakażeń wywoływanych przez C. albicans jest: upośledzenie funkcji układu immunologicznego oraz zakłócenie równowagi w składzie mikroflory organizmu ludzkiego [54, 59, 77, 78]. Wśród wielu czynników predysponujących do rozwoju kandydozy należy wymienić: immunosupresję, leczenie steroidami, długotrwałą kaniulację naczyń, inwazyjne procedury medyczne, długotrwałe leczenie antybiotykami o szerokim spektrum przeciwbakteryjnym, uszkodzenie skóry w wyniku oparzeń, zaburzenia funkcji przewodu pokarmowego, cukrzycę, wagę wcześ­niaków poniżej 2000 g, obniżoną odpor- ność immunologiczną, zakażenie HIV [78]. Trudności związane z leczeniem pacjentów z zakażeniami o etiologii C. albicans zmuszają do dokładniejszego poznania czynników zjadliwości tego mikroorganizmu, inter­ akcji patogen – gospodarz, oraz poszukiwania nowych rozwiązań terapeutycznych [77]. Mechanizm rozwoju kandydoz (patogeneza), oprócz układu immunologicznego gospodarza zależy od czynników wirulencji grzyba umożliwiających kolonizację i inwazję tkanek, a także unikanie reakcji immunologicznej gospodarza. Do czynników wirulencji C. albicans zalicza się: złożoność budowy ściany komórkowej, adhezję, pleo­morfizm, aktywność enzymatyczną, mimikrę molekularną, zmienność fenotypową [44, 54]. Wysoka częstość występowania kandydoz i wysoka śmiertelność u chorych z immunosupresją (30–70%) spowodowały dążenie do opracowania czułych i swoistych metod diagnostycznych i odpowiednich strategii leczenia kandydoz. Diagnostyka zakażeń grzybiczych opiera się na badaniach mikroskopowych, posiewach mikrobiologicznych i identyfikacji wyhodowanych gatunków * Autor korespondencyjny: Samodzielna Pracownia Promieniowców i Grzybów Niedoskonałych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy Zakład Higieny, Chocimska 24, 00-791 Warszawa, tel.: +48 22 54 21 228, faks: + 48 22 849 74 84, e-mail: mstaniszewska@ pzh.gov.pl 230 MONIKA STANISZEWSKA I WSP. grzybów, badaniach serologicznych (wykrywanie antygenów i przeciwciał) oraz molekularnych [31, 61]. U chorych z upośledzeniem odpowiedzi immunologicznej rozpoznanie zakażeń grzybiczych przysparza wiele trudności [91]. Przebieg kliniczny jest skąpo-objawowy, w fazie początkowej często ograniczony do gorączki, co powoduje trudności w rozpoznaniu zakażenia grzybiczego na podstawie obrazu klinicznego [89]. Utrzymanie się stanu gorączkowego u chorych z neutropenią, długotrwale leczonych antybiotykami, powinno nasuwać podejrzenie zakażenia grzybiczego [8]. W około 10% przypadków zakażenia grzybicze przebiegają bez gorączki, a u około 10% chorych rozwija się wstrząs septyczny [8]. Materiał do badań mikologicznych należy uzyskiwać w zależności od objawów klinicznych i lokalizacji zakażenia. W większości grzybic inwazyjnych należy pobrać do badania krew, plwocinę, mocz, wymazy z odpowiednich okolic ciała, wycinki tkanek, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelikowe, płyn mózgowo-rdzeniowy lub inny materiał. Próbki do badań należy kolekcjonować w jałowych warunkach, aby nie dopuścić do przypadkowej kontaminacji materiału, co daje fałszywie dodatnie wyniki. U chorych ze znacznego stopnia małopłytkowością pobranie właściwego materiału do badania często nie jest możliwe [8]. Interpretując wyniki badań mikrobiologicznych, należy skorelować je z obecnością objawów klinicznych. Jednocześnie mimo istniejącego zakażenia grzybiczego z posiewów często nie udaje się uzyskać hodowli grzybów. Szacuje się, że dodatnie posiewy uzyskuje się tylko u 25–50% chorych z potwierdzoną grzybicą [24, 31]. Hodowle badanego materiału na obecność grzybów prowadzi się na specjalnych podłożach do kilku tygodni (w przypadku szczepów Candida do 2–4 dni). Identyfikacji grzybów dokonuje się w preparatach mikroskopowych z hodowli oraz przez ocenę ich właściwości biochemicznych. Kolejnym etapem badania jest ocena lekowrażliwości wyhodowanych patogenów przy użyciu komercyjnych testów [8]. Interpretując wyniki badań mikrobiologicznych, należy pamiętać o wszechobecności grzybów w środowisku i możliwości zanieczyszczenia badanego materiału (wyniki fałszywie dodatnie). Obecność grzyba można również wykazać w badaniu histopatologicznym wycinka tkankowego czy bio­ptatu. Pozytywny wynik preparatu bezpośredniego z materiału klinicznego jest jedynym pewnym rozpoznaniem grzybicy [91]. Międzynarodowy konsensus dotyczący kryteriów diagnostycznych grzybic u pacjentów z nowotworami i biorców szpiku (opracowany przez członków Invasive Fungal Infections Cooperative Group of the European Organization for Research and Treatment of Cancer – EORTC/IFCG i Mycoses Study Group of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases – MSG/NIAID) uwzględnia takie pojęcia jak: „potwierdzone”, „prawdopodobne” oraz „moż- liwe” inwazyjne zakażenie grzybami [100]. Terminy te podkreślają znaczenie pewności rozpoznania grzybic narządowych, które jest możliwe do ustalenia jedynie po uwzględnieniu czterech kryteriów diagnostycznych, a mianowicie: obecności czynników ryzyka, manife­sta­ cji klinicznej zakażenia, wyników badań mikologicznych oraz wyników badań histopatologicznych i/lub cytologicznych. Pacjentami dużego ryzyka są osoby, u których: •liczba granulocytów jest mniejsza niż 500 neutrofili/mm3 krwi, co najmniej od 10 dni niezależnie od czynników ją wywołujących; •utrzymuje się gorączka powyżej 38°C trwająca dłużej niż 96 godzin pomimo stosowania szeroko­ widmowej antybiotykoterapii; •zastosowano leki immunosupresyjne obecnie lub w ciągu 30 dni poprzedzających; •wcześniej podejrzewano zakażenia grzybicze (przy poprzednich epizodach neutropenii lub zakażeni HIV); •stosowano kortykosteroidy dłużej niż 3 tygodnie w okresie poprzednich 60 dni; •występują objawy choroby „przeszczep przeciwko gospodarzowi”. Kryteria kliniczne, mikologiczne i histopatologiczne rozpoznania grzybic narządowych obejmują wszystkie objawy i wyniki badań diagnostycznych [100], w tym: •kliniczne objawy uogólnionego zakażenia, rozsiane zmiany skórne, nacieki zapalne w układzie oddechowym, moczowym, w ośrodkowym układzie nerwowym lub w innych narządach, potwierdzone w badaniach obrazowych (badania komputerowe, zdjęcia radiologiczne lub ultrasonograficzne); •dodatnie wyniki posiewów z krwi lub wydzielin (plwocina, mocz, kał i inne), wykrycie grzybni w badaniu mikroskopowym pobranego materiału (plwocina, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz i inne), wykrycie antygenów powierzchniowych grzybów metodą ELISA, lub identyfikacja genotypu znanych gatunków; •diagnostyka histopatologiczna i cytologiczna oparta potwierdzeniem obecności morfologicznych cech grzybów (komórki, spory lub strzępki) w tkankach lub narządach, pobranych drogą bio­ psji aspiracyjnej lub biopsji otwartej. Obecnie medycyna nie dysponuje idealnym antymikotykiem, dlatego też w wielu ośrodkach na świecie prowadzone są intensywne badania dążące do odkrycia skutecznych związków skierowanych przeciw różnorodnym determinantom zjadliwości Candida. Celem niniejszej pracy była charakterystyka głównych czynników wirulencji Candida spp. i mechanizmów działania leków stosowanych w leczeniu grzybic, jak również przedstawiono nowe kierunki w poszukiwaniu antymikotyków. PATOGENEZA I LECZENIE ZAKAŻEŃ CANDIDA SPP. 2. Epidemiologia kandydoz Najczęstszym czynnikiem etiologicznym kandydoz jest C. albicans (50–70% przypadków), w mniejszym zakresie gatunki takie jak C. glabrata, C. krusei, C. para­ psilosis, C. dubliniensis i C. tropicalis. Kandydozy dzielą się na powierzchniowe i układowe. Powierzchniowe zakażenia dotyczą skóry i paznokci oraz błon śluzowych jamy ustnej i gardła (oropharyngeal candidiasis, OPC), przełyku, jelit, pochwy (vulvovaginal candidiasis, VVC) [4, 67]. Przewlekła powierzchniowa kandydoza skóry i błon śluzowych (chronic mucocutaneous candidiasis), paznokci, gardła i przełyku nawraca często bez tendencji do rozwoju rozsianej kandydozy [64]. Przewlekła kandydoza skóry i błon śluzowych (chronic mucocu­ taneous candidiasis) związana jest z występowaniem wielu współistniejących schorzeń tj., zaburzeń hormonalnych, hematologicznych, ale także innych infekcji (grzybiczych, wirusowych i bakteryjnych), nowotworów oraz nieprawidłowości funkcjonowania układu pokarmowego. Przewlekła grzybica skóry dotyczy głównie kobiet z zaburzeniami endokrynologicznymi i zaburzeniami odporności. Na kończynach dolnych i pośladkach stwierdza się wówczas sinoczerwone ogniska z otrębiastym złuszczaniem. Dotychczas wiele kwestii pozostaje niewyjaśnionych w kontekście tej choroby. Wiadomo, że na jej rozwój mają wpływ zaburzenia odpowiedzi komórkowej układu immunologicznego. Choroba jest bardzo rzadka i niemal zawsze powodowana przez C. albicans z tendencją do postaci rozsianej (wynikającej z zaburzonej odpowiedzi immunologicznej). Przewlekła kandydoza płytki paznokciowej najczęściej dotyczy stóp i może przechodzić w postać rozsianą z tendencją do pojawienia się na dłoniach w wyniku przeniesienia z pierwotnego miejsca zakażenia [62, 64]. Candida albicans jest w ponad 85% odpowiedzialna za rozwój kandydozy pochwy i sromu u kobiet [29, 36–37]. Zakażenia pochwy dotyczą ok. 75% wszystkich kobiet w okresie ciąży [75]. U około 5–10% kobiet rozwija się nawracająca postać kandydozy pochwy (recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC). Obecnie istnieją dwie teorie na wyjaśnienie nawracającego zapalenia pochwy u kobiet. Jedną z nich jest częste zasiedlanie pochwy przez C. albicans, wskutek ponownych zakażeń lub też w wyniku niedoleczenia poprzedniej kandydozy. Reinfekcja dotyczy sytuacji, gdy komórki Candida, po całkowitym usunięciu z pochwy są ponownie wprowadzane, na drodze aktu seksualnego lub transmisji z przewodu pokarmowego. Inna teoria głosi, że ponowne wprowadzanie komórek Candida do pochwy wiąże się z naturalnym mechanizmem obronnym gospodarza. W rzeczywistości, przeważa pogląd, że Candida nigdy nie ulega całkowitemu eliminowaniu z pochwy. Powodem tego może być częstsze używanie środków grzybostatycznych niż grzybobój- 231 czych w leczeniu kandydoz [28]. Choroba najczęściej objawia się białą, serowatą wydzieliną oraz świądem sromu i pochwy. Czynnikami predysponującymi do VVC są: cukrzyca, stosowanie antybiotyków, przyjmowanie doustnych środków antykoncepcyjnych, ciąża i terapia hormonalna. Powierzchowne kandydozy choć występują z dużą częstotliwością, nie są śmiertelne. Kliniczne symptomy VVC występują, gdy liczba komórek przekracza 105 jednostek tworzących kolonie na mililitr płynów pochwowych (jtk/ml). VVC mogą być klasyfikowane jako sporadyczne oraz nawracające (skomplikowane i nie-). Klasyfikacja ta opiera się na odpowiedzi na leczenie przeciwgrzybiczne. Nieskomplikowane VVC dotyczą infekcji sporadycznych podatnych na wszelkie formy terapii przeciwgrzybicznej. W leczeniu skomplikowanych VVC brane są pod uwagę czynniki wpływające na gospodarza, mikroorganizmy i farmakoterapię. Głównym czynnikiem etiologicznym zapaleń pochwy jest C. albicans (w ponad 90%). Inne gatunki Candida wywołujące te infekcje to C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis i C. tropicalis [4, 64, 78]. Do rozwoju systemowej kandydozy dochodzi na drodze inwazji grzyba do krwi i rozsiewu do narządów i tkanek. Układowe kandydozy mają częściej charakter endogenny, gdzie źródłem zakażenia jest własna flora Candida spp. [38]. Według danych literaturowych [38, 59], szczepy Candida spp. zajmują czwarte miejsce wśród patogenów wywołujących zakażenia u pacjentów przebywających na oddziałach intensywnej terapii. Liczba przypadków kandydemii w Europie (0.5 epizodu na 10.000 pacjento-dni – inaczej osobodni tj., liczba infekcji na 10.000 pacjento-dni, czyli liczba hospitalizowanych chorych pomnożona przez liczbę dni spędzonych w szpitalu) jest znacznie niższa niż w Stanach Zjednoczonych (2 epizody na 10.000 pacjento-dni), ale proporcje te w ostatnich latach ulegają zmianie z powodu wzrostu przypadków kandydemii w Europie [38]. Candida albicans jest odpowiedzialna za 59% wszystkich kandydemii występujących u pacjentów w czasie hospitalizacji (w tym za 79,4% kandydemii na oddziałach intensywnej terapii i 37,5% kandydemii u pacjentów hematologicznych) oraz 55% infekcji krwiopochodnych [23, 69]. Candida albicans w około 49–55% przypadków jest przyczyną kandydozy inwazyjnej oraz rozsianej zarówno w Stanach Zjednoczonych jak i w Europie [38]. Do czynników sprzyjających rozwojowi rozsianej kandydozy należy zaliczyć: nowotwory (26%), zabiegi chirurgiczne w obrębie jamy brzusznej (14%), cukrzycę (13%) oraz HIV (10%) [38]. Ponadto, przyczyną kandydozy uogólnionej może być rozsiew Candida z układu moczowo-płciowego [35]. Pomimo, że C. albicans pozostaje nadal główną przyczyną kandydoz, to na przestrzeni ostatnich lat liczba infekcji powodowanych przez inne gatunki znacząco wzrosła. Wśród nich szczególne znaczenie 232 MONIKA STANISZEWSKA I WSP. epidemiologiczne mają C. dubliniensis, C. glabrata, C. guil­liermondii, C. kefyr, C. krusei, C. parapsilosis oraz C. tropicalis. Są one często izolowane z błon śluzowych jamy ustnej, przewodu pokarmowego i moczowo-płciowego wraz z C. albicans i mogą wywoływać różnorodne zakażenia – od powierzchniowych schorzeń po ciężkie i zagrażające życiu grzybice układowe [4]. Mimo braku zdolności do produkcji strzępek oraz niskiej produkcji proteinaz C. glabrata jest zaraz po C. albicans najczęstszą przyczyną kandydoz [4, 59]. Z kolei C. tropicalis występuje najczęściej u chorych na białaczkę. W odróżnieniu od dwóch powyższych gatunków C. parapsilosis jest uważana za mniej zjadliwy patogen ze względu na słabszą adhezję i penetrację endotelium [14, 25, 93]. Stosunkowo mniejsza zjadliwość C. parapsilosis nie wpływa na częstotliwość występowania zakażeń i objawia się lżejszym przebiegiem choroby [16]. Według badań przeprowadzonych przez C l e r i h e w’ a i wsp. [16] rozwój układowej kandydozy następuje u 9% chorych noworodków z zakażeniem o etiologii C. parapsilosis, a w przypadku zakażeń o etiologii C. albicans infekcje układowe rozwijają się u 36% chorych w tej grupie wiekowej. Mimo tego wykazano, że niektóre szczepy C. para­ psilosis są zdolne do rozwijania strzępek, produkują biofilmy o zwiększonej masie. Biofilm C. parapsilosis wykazuje wyraźne nagromadzenie blastospor zorganizowanych w nieregularne skupiska oraz otoczony jest mniejszą ilością macierzy zewnątrzkomórkowej (łatwiejszy do eradykacji za pomocą konwencjonalanej terapii przeciwgrzybiczej), w porównaniu do biofilmu C. albicans, stanowiącego barierę dla przenikania związków przeciwgrzybiczych [51]. Candida parapsilosis wywołuje kandydozy towarzyszące długotrwałemu cewnikowaniu lub stosowaniu urządzeń protetycznych [12]. 3. Czynniki zjadliwości Candida albicans 3.1. Adhezja Adhezja Candida spp. do komórek gospodarza stanowi etap poprzedzający kolonizację, penetrację tkanek oraz tworzenie biofilmu. Zjawisko adhezji polega na interakcji ligand-receptor [44, 57]. Przypuszcza się, że napięcie powierzchniowe, oddziaływanie elektrostatyczne, siły van der Waalsa oraz wiązania kowalencyjne i wodorowe mogą odgrywać rolę w początkowym etapie adhezji [44]. Adhezja C. albicans pod względem chemicznym ma charakter oddziaływań białko–białko lub białko–cukier, chociaż dopuszcza się możliwość istnienia również innych rodzajów wiązań [57]. Czynnikami biorącymi udział w adhezji są biocząsteczki nazywane adhezynami, które stymulują przyleganie Candida spp. do komórek gospodarza. Choć adhezyny klasyfikuje się jako polisacharydy, glikopro- teiny i lipidy [44, 50], to wszystkie posiadają wspólne cechy, takie jak: występowanie białkowego peptydu sygnałowego na N-końcu oraz C-terminalnego miejsca, wiążącego w błonie moduł GPI (glikozylofosfatydyloinozytolowy) [50]. Wiązanie ligandu odbywa się przez koniec aminowy-adhezyjny, ponieważ u większości adhezyn w odcinku C-końcowym zachodzi proces glikozylacji, który poszerza strukturę cząsteczki białka [12, 50]. Nie podlegający glikozylacji odcinek N-końcowy białka wystaje do środowiska zewnątrzkomórkowego (kontaktuje się z powierzchnią komórki gospodarza) [12, 50]. Dotąd zidentyfikowano kilka genów kodujących adhezyny, wśród których najlepiej opisano HWP1 oraz rodzinę genów ALS [44]. Hwp1p służy jako substrat dla transglutaminazy w trakcie zakotwiczania komórek C. albicans do nabłonka gospodarza. Mutanty pozbawione HWP1 charakteryzują się obniżoną zjadliwością, gdyż nie są zdolne trwale przylegać do komórek nabłonkowych [34, 74]. Do rodziny ALS należy osiem genów (ALS1-ALS7 oraz ALS9), wśród których do najlepiej opisanych należy ALS3 [47]. Ekspresja ALS3 zachodzi podczas morfogenezy i jest regulowana na poziomie transkrypcyjnym, a mutanty charakteryzują się zmniejszoną adhezyjnością [2, 47]. Badania [34, 57] wykazały, że na zjawisko adhezji mają wpływ liczne czynniki środowiskowe takie jak temperatura, pH, stężenie cukrów, rodzaj komórek gospodarza. Wymienione elementy oddziaływają na przebieg reakcji adhezyna – receptor, indukują morfogenezę, a także ekspresję białek fazowo-specyficznych [57]. Najnowsze doniesienia wskazują, że ładunek powierzchniowy oraz hydrofobowość komórek grzyba zwiększa adhezyjność [22]. Niektóre gatunki Candida spp. wchodzą w interakcje z bakteriami bytującymi w jamie ustnej takimi jak: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Actinomyces spp., oraz Fusobac­ terium spp., tworząc wielogatunkowy biofilm. Międzygatunkowe interakcje ułatwiają Candida spp. bytowanie w zróżnicowanej mikroflorze jamy ustnej [53]. Ostatnie badania przeprowadzone przez L i n i wsp. [45] dowodzą, że dwugatunkowy biofilm C. albicans i S. aureus tworzący się na powierzchni wyrobów medycznych może być źródłem zakażenia i prowadzić do rozwoju rozsianej kandydozy. Nieszkodliwa kolonizacja jamy ustnej przez Candida dotyka większej części populacji, jednak istnieją czynniki, które sprzyjają chorobowemu namnażaniu się grzybów. Należą do nich cukrzyca (jak we wszystkich odmianach kandydozy), a także palenie papierosów czy noszenie protez zębowych jako czynniki oddziałujące w miejscu zakażenia [21, 27, 75]. 3.2. Proteazy aspartylowe Candida albicans wytwarza szeroką gamę enzymów hydrolitycznych, wśród których lipazy, fosfolipazy oraz proteazy aspartylowe (Sap) odgrywają rolę w patogene- PATOGENEZA I LECZENIE ZAKAŻEŃ CANDIDA SPP. zie [4, 54, 79 82, 83, 84]. Enzymy te ułatwiają adhezję i kolonizację błon śluzowych, a także umożliwiają penetrację tkanek oraz trawienie komórek odpornościowych i przeciwciał [54, 82]. Wśród nich, na szczególną uwagę zasługują proteazy aspartylowe, gdyż ekspresja Sap wiąże się z tworzeniem strzępek prawdziwych, adhezją oraz zmiennością fenotypową [82]. Izoenzymy Sap są kodowane przez rodzinę dziesięciu genów (SAP1-10) [54]. Poszczególne izoenzymy różnią się budową i ładunkiem elektrostatycznym, optimum pH oraz preferencjami substratowymi [54, 79, 82, 83]. Podobnie jak inne proteazy, Sap katalizują hydrolizę wiązań peptydowych pomiędzy aminokwasami hydrofobowymi, jednak mogą również hydrolizować wiązania z resztami polarnymi, takimi jak histydyna czy lizyna [54]. Do substratów izoenzymów Sap należą miedzy innymi: kolagen, kreatyna, mucyna, fibronektyna, hemoglobina, albumina, immunoglobulina A, laktoferyna i lakto­preoksydaza czy α-makroglobulina. Ze względu na specyficzność substratową izoenzymy Sap zostały podzielone na trzy grupy: (I) Sap7 i Sap10; (II) Sap4-6; (III) Sap1-3, Sap8, Sap9. Przy czym, w odróżnieniu od pozostałych izoenzymów Sap7 i Sap10 wykazują wysoką specyficzność substratową [5]. W literaturze jest wiele doniesień świadczących o hydrolitycznej roli Sap w patogenezie zakażeń o etiologii C. albicans, co wyjaśniono poniżej [54–55, 68, 79, 84]. Przy czym, funkcja poszczególnych enzymów zależy od etapu i rodzaju infekcji. Ekspresja genów SAP1-3 zachodzi głównie w blastokonidiach, a kodowane przez nie izoenzymy Sap1-3 biorą udział w zakażeniach powierzchniowych (kandydoza jamy ustnej oraz pochwy) [54, 79]. Natomiast ekspresja SAP4-6 jest ściśle związana z wytwarzaniem strzępek prawdziwych. Izoenzymy Sap4-6 odgrywają rolę w rozwoju infekcji systemowych oraz biorą udział w unikaniu odpowiedzi immunologicznej [79, 82, 83]. Jak dotąd w literaturze wciąż brakuje wystarczających danych dotyczących roli Sap7 oraz Sap8 w patogenezie C. albicans. Według doniesień T a y l o r a i wsp. [90] indukcję Sap7 obserwowano podczas kandydemii w modelu mysim. Natomiast nie obserwowano indukcji Sap7 podczas kandydozy pochwy stosując ten sam model badawczy [90]. Z kolei, Sap8 odgrywa rolę w tworzeniu biofilmów [63]. Ponadto, nasze badania własne [88] wskazują na rolę SAP7 i SAP8 w zakażeniach krwi. Dowiedliśmy również zależności pomiędzy procesem morfogenezy (tworzeniem strzępek prawdziwych) i eksprymowaniem genu SAP9 w surowicy ludzkiej [88]. W odróżnieniu od pozostałych izoenzymów, Sap9 i Sap10 są zakotwiczone w błonie lub ścianie komórkowej grzyba za pomocą glikozylofosfatydyloinozytolowego (GPI) ogonka [3]. Izoenzymy Sap9-10 są związane z zachowaniem integralności błony i ściany komórkowej, adhezją i podziałami komórkowymi [3, 82]. 233 Geny kodujące Sap zidentyfikowano u innych gatunków z rodzaju Candida. Jedynie w przypadku C. parapsilosis produkcja Sap wiązała się z wirulencją tego mikroorganizmu. W komórkach C. tropicalis wykazano obecność czterech izoenzymów Sap (Sap1-4), spośród nich najwyższy poziom eksprymowania w warunkach in vitro wykazywał gen SAP1 (nie odgrywa znaczącej roli w wirulencji C. tropicalis). Dowiedziono [95–97], że poziom transkrypcji trzech pozostałych genów (SAP2-4) jest wykrywalny tylko za pomocą czułej reakcji RT-PCR. Candida dubliniensis uważana za gatunek najbardziej podobny do C. albicans pod względem adhezji oraz aktywności enzymatycznej, posiada siedem proteaz aspartylowych Sap1-7 [32], które umożliwiają hydrolizę i penetrację tkanek gospodarza. 3.3. Pleomorfizm Kolejną cechą zjadliwości C. albicans jest zdolność do tworzenia czterech form morfologicznych: bla­sto­ konidiów, form germ tube, pseudostrzępek oraz strzępek prawdziwych. Zjawisko to określane jest jako pleomorfizm [76, 78, 81, 87]. Wśród Candida spp. jedynie C. albicans oraz C. dubliniensis są zdolne do wytworzenia strzępek prawdziwych [44]. Pleomorfizm jest uważany za kluczowy czynnik zjadliwości C. albicans od kiedy wykazano, że mutanty pozbawione regulatorów morfogenezy zdolne do wzrostu jedynie w formie blastokonidialnej (Δcph1/Δefg1) lub wyłącznie w formie micelialnej (Δtup1) tracą właściwości chorobotwórcze [48]. Każdy z czterech morfotypów pełni inną rolę w procesie patogenezy. Blastokonidia pozwalają na kolonizację tkanek gospodarza i są związane z wczesną fazą zakażenia. Wczesnemu obrzękowi towarzyszy wzrost ekspresji genów SAP1 i SAP2 [68, 72, 81]. Natomiast wydłużające się strzępki prawdziwe wywierają ciśnienie na tkanki gospodarza, co w połączeniu z sekrecją enzymów hydrolitycznych (Sap4-6), umożliwia aktywną penetrację w głąb tkanek gospodarza [68, 92]. Przejście z jednej formy morfologicznej do drugiej jest regulowane przez kompleksowy program transkrypcyjny. Moduluje on morfologię i ekspresję wielu genów, związanych ze wzrostem w formie strzępek, kodujących białka powierzchniowe (ALS3, HWP1), proteazy (SAP4-6) lub enzymy detoksykacji takie jak dysmutaza ponadtlenkowa [34, 44, 54, 80]. Poszczególne morfotypy różnią się strukturą ściany komórkowej. Najnowsze badania wykazały, że zawartość węglowodanów w ścianie komórkowej grzyba zależy od morfogenezy, czynników środowiskowych oraz specyficzności szczepowej. W komórkach strzępek stwierdzono kilkakrotnie wyższą zawartość mannozy niż w komórkach drożdżakowych [85–86]. Liczni autorzy [48, 79, 87] wykazali wpływ czynników środowiskowych 234 MONIKA STANISZEWSKA I WSP. na indukcję strzępek, takich jak: temperatura powyżej 35°C, pH powyżej 6.5, niskie stężenie tlenu oraz standardowe podłoża wzrostowe dla drożdży (YEPD, Sabouraud [71]) z dodatkiem proliny, alkoholu oraz surowicy. W ostatnich latach przedmiotem intensywnych badań stały się czynniki transkrypcyjne, regulujące morfogenezę, Efg1, Cph1, Tup1 [11, 46, 48]. Pozytywną regulację morfogenezy zapewniają m.in. Efg1 i Cph1, które promują morfologię strzępkową. Za negatywną regulację odpowiada ekspresja genów kodujących regulatory tłumiące filamentację, tj. Tup1, Hsl1 i Hsl7. Wyciszenie genów kodujących regulatory morfogenezy w różnym stopniu zaburza zdolność C. albicans do filamentacji. Mutanty C. albicans pozbawione genu CPH1 są zdolne do tworzenia strzępek prawdziwych w odpowiedzi na surowicę (jeden z czynników indukujących morfogenezę). Jednak strzępki mutanta Δcph1 są krótsze w porównaniu do strzępek szczepu dzikiego, a sam proces zachodzi z mniejszą efektywnością [87]. Efg1 jest kluczowym regulatorem morfogenezy w surowicy ludzkiej. Wykazano, że mutanty C. albicans pozbawione genu EFG1 są silnie upośledzone pod kątem morfogenezy [48, 87]. Natomiast delecja zarówno EFG1 jak i CPH1 uniemożliwia tworzenie strzępek prawdziwych pod wpływem surowicy, a mutanty są zdolne jedynie do tworzenia pseudostrzępek [48, 87]. Z kolei utrata Tup1 powoduje uwięzienie komórek w formie strzępek [11, 99]. Wykazano również, że utrata innych negatywnych regulatorów morfogenezy (białek Hsl1 i Hsl7) prowadzi do hiperfilamentacji [30]. 4. Leczenie zakażeń o etiologii Candida spp. Grzyby z rodzaju Candida są wiodącymi czynni­ kami etiologicznymi oportunistycznych infekcji u chorych z zaburzeniami odporności. Mimo to liczba skutecznych antymikotyków dostępnych w lecznictwie jest wciąż ograniczona [13, 54]. Wśród powszechnie stosowanych antymikotyków można wyróżnić następujące klasy: polieny, alliloaminy, fluorowe pochodne pirymidyny, echinokandyny oraz azole [13, 15]. Mechanizmy działania antymikotyków, wskazania oraz przeciwwskazania przedstawiono w Tabeli I. Polieny należą do najstarszej grupy leków przeciwgrzybiczych, są to naturalne związki produkowane przez Streptomyces spp. na drodze fermentacji. Należące do polienów nystatyna, natamycyna oraz amfoterycyna B (AMB) są powszechnie stosowane w leczeniu grzybic [9]. Polieny wykazują toksyczne działanie względem komórek gospodarza, ponieważ wiążą się ze sterolami błon komórkowych ssaków [13]. Amfoterycyna B (dezoksycholan) jest najczęściej stosowanym polienem w leczeniu kandydoz [4, 13]. Czynnikiem ograniczającym użycie AMB jest oporność wśród szczepów z gatunku C. lusitaniae i C. guilliermondi. Oporność tych gatunków zależy od zmian w składzie lipidów błony komórkowej (zmniejszonej lub zwiększonej zawartości ergosterolu) [9, 15, 17]. Pomimo znacznego postępu w poszukiwaniu coraz to nowych leków przeciwgrzybiczych, AMB pozostaje lekiem z wyboru w kandydozach układowych i innych zakażeń grzybiczych, ze względu na szerokie spektrum przeciwgrzybicze (obejmujące Candida spp., Aspergil­ lus, Cryptococcus neoformans, Mucor spp., Sporothrix schenckii, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides braziliensie, Penicillium marneffei [49]. Mimo szerokiego spektrum działania, AMB charakteryzuje się wysokim stopniem rozprzestrzeniania w tkankach, długim okresem pół­ trwania oaz znaczącą toksycznością [9]. Mechanizm toksycznego działania amfoterycyny B nie został dokładnie poznany, uważa się że polega on na aktywacji cytokin wraz z sekrecjonowaniem TNFα przez pobudzone makrofagi [6]. Pojawiające się nowe alternatywne formy AMB mają na celu polepszenie jej właściwości farmakologicznych i obniżenie cytotoksyczności. Obecnie prowadzone są badania nad zastosowaniem nano-cząstek jako nośników AMB, rozpoznawanych przez układ immunologiczny jako obce, fagocytowane przez makrofagi i uwalniane stopniowo, co zmniejsza niepożądane działanie toksyczne [52]. Azole (mniej toksyczne od AMB), szybko stały się lekami powszechnie używanymi w zwalczaniu grzybic powierzchniowych i układowych. Azole wykazują działanie grzybobójcze w stosunku do Aspergillus spp. oraz grzybostatyczne w stosunku do Candida spp. [66]. Do najskuteczniejszych azoli, stosowanych w leczeniu inwazyjnych grzybic należą: flukonazol (FLC), itrakonazol (ITR), posakonazol (POS) oraz worikonazol (VTR) [24]. Azole są zwykle lekami pierwszego wyboru w profilaktyce i leczeniu grzybic. Jednak ich grzybostatyczne działanie przeciw Candida spp. przyczyniło się do selekcji w kierunku szczepów opornych na azole [66]. Oporność Candida spp. na azole może wynikać z mutacji punktowych w genie kodującym demetylazę lanosterolu (ERG11), nadmierną ekspresję ERG11, zmniejszone pobieranie azoli ze środowiska, wyrzut azoli z komórki grzyba za pomocą pomp białkowych, mutacje w genie ERG3 (kodującego dysmutazę) umożliwiające tolerancję zmetylowanych steroli, tworzenie biofilmu, pobieranie cholesterolu gospodarza w warunkach niedoboru lub braku ergosterolu [9]. Kolejną grupę antymikotyków stanowią alliloaminy. Należąca do tej grupy leków terbinafina jest używana głównie w przypadku grzybic powierzchniowych [4]. Do efektów ubocznych stosowania alliloamin należy swędzenie, pieczenie oraz zaczerwienienia, występujące zaledwie u 2–3% pacjentów [9]. Z kolei do echinokandyn zalicza się syntetyczne pochodne naturalnych lipopeptydów produkowanych przez Aspergillus 235 PATOGENEZA I LECZENIE ZAKAŻEŃ CANDIDA SPP. Tabela I Leczenie zakażeń o etiologii Candida spp. Mechanizmy działania leków, wskazania oraz przeciwwskazania* Antymikotyk Mechanizm działania Wskazania Przeciwwskazania** Polieny Amfoterycyna B Wiązanie ergosterolu zawartego 1) gorączka neutropeniczna 1) niewydolność nerek (AMB) w błonie komórkowej Candida spp. 2) inwazyjna kandydoza 2) ciężkie uszkodzenia wątroby Zaburzenie integralności błony 3) inne grzybice układowe 3) hypokalcemia komórkowej, zwiększenia jej prze- 4) nerkowa kwasica cewkowa (RTA) puszczalności dla jonów potasu 5) zaburzenie funkcji nerek i aminocukrów, co prowadzi w poł ączeniu z hipokalemią do śmierci komórki grzyba Nystatyna 1) leczenie miejscowe grzybic skóry Brak przeciwwskazań 2) grzybice pochwy 3) grzybice błony śluzowej przewodu pokarmowego Natamycyna 1) miejscowe leczenie kandydoz Brak przeciwwskazań pochwy 2) miejscowe leczenie grzybic wywo łanych przez grzyby filamentujące Alliloaminy Terbinafina Zaburzenie syntezy ergosterolu przez 1) grzybice skóry, paznokci i włosów 1) podawanie ryfampicyny oraz hamowanie epoksydazy skwalenowej. 2) w terapii skojarzonej z flukona- cyklosporyny Kumulacja skwalenu w komórce zolem w leczeniu grzybic jamy grzyba zwiększa przepuszczalność ustnej i gardła błony komórkowej i prowadzi 3) infekcje o etiologii C. parapsilosis do śmierci grzyba oraz C. albicans Azole Flukonazol Wiążą się z układem cytochromu 1) kandydoza błon śluzowych 1) podawanie ryfampicyny, cyklo(FLC) P-450 hamując hydroksylacę i deme- 2) kandydoza układu moczowego sporyny lub antykoagulantów tylację prekursorów ergosterolu. 3) kandydoza układowa 2) zaburzenie czynności wątroby W wyniku zahamowania demetylazy 4) profilaktyka zakażeń grzybiczych lanosterolu w miejscu ergosterolu u osób z immunosupresją powstają zmetylowane sterole, co 5) kandydoza o etiologii w efekcie prowadzi do destabilizacji C. parapsilosis błony komórkowej Candida spp. Itrakonazol 1) oporność na FLC dysfunkcja komór serca (ITR) 2) gorączka neutropeniczna Posakonazol 1) kandydoza jamy ustnej i gardła (POS) 2) profilaktyka chorych poddawa- nych intensywnej terapii immunosupresyjnej podawanie fenytoiny, ryfabutyny, cymetydyny, takrolimusu, astemizolu, pimozydu, chinidyny oraz lowastatyny Worikonazol (VRC) podawanie cyklosporyny, metadonu, takrolimusu i warfaryny 1) inwazyjne kandydozy 2) oporność na FLC 3) kandydoza o etiologii C. krusei Echinokandyny Kaspofungina Zaburzenie biosyntezy ściany komór- 1) kandydozy jamy ustnej i gardła (CAS) kowej grzyba przez blokadę aktyw- 2) oporność na azole ności syntetazy 1,3-beta-D-glukanu, 3) gorączka neutropeniczna enzymu odpowiedzialnego za syntezę mikafungina glukanu 1) inwazyjna kandydoza (MFG) 2) oporność na azole 3) kandydoza o etiologii C. parapsilosis 4) kandydoza przełyku 5) profilaktyka chorych po prze szczepie szpiku Anidulafungina (ANI) Flucytozyna inwazyjna kandydoza Fluorowane pochodne pirymidyny 5-FC Inhibicja kwasów nukleinowych 1) grzybice układowe (w terapii grzyba, zaburzenie syntezy białek skojarzonej z AMB) i śmierć komórki * Opracowano na podstawie [4, 8, 9, 13, 15, 20, 24], ** Inne niż nadwrażliwość na dany antymikotyk podawanie cyklosporyny, takrolimusu, ryfampicyny, newirapiny i karbamazepiny Brak przeciwwskazań neutropenia 1) okres ciąży i karmienia piersią 2) niewydolność nerek 236 MONIKA STANISZEWSKA I WSP. rugulovalvus, Zalerion arboricola, Papularia sphaero­ sperma [9]. W lecznictwie stosowana jest anidulafungina (ANI), kaspofungina (CAS) i mikafungina (MFG) [4, 13]. Echinokandyny są grzybobójcze w stosunku do C. albicans, grzybostatyczne w stosunku do Aspergillus spp. oraz wykazują wysoką aktywność przeciw Pneu­ mocystis carinii [9]. Skutki uboczne przyjmowania echinokandyn występują niezwykle rzadko. Należy do nich ból głowy, wysypka, gorączka, toksyczny wpływ na wątrobę, zapalenie żył, wyrzut histaminy oraz hemoliza [4, 19]. W zwalczaniu grzybic stosuje się również fluo­rowane pochodne pirymidyny. Flucytozyna (5-fluo­rocytozyna, 5-FC) jest fluorowaną pochodną cytozyny powszechnie stosowaną w leczeniu kandydoz. Ten inhibitor kwasów nukleinowych charakteryzuje się wąskim spektrum przeciwgrzybicznym [9]. W warunkach in vitro oporność na flucytozynę zaobserwowano u 3–10% izolatów C. albicans. Natomiast w trakcie terapii flucytozyną około 30% izolatów nabywa oporności na ten antymikotyk [9, 24]. Ze względu na łatwą selekcję szczepów opornych flucytozyna nie jest stosowana w profilaktyce kandydoz. Terapia skojarzona z AMB ma na celu zapobieganie temu zjawisku. W terapii skojarzonej z AMB, flucytozyna znajduje zastosowanie przede wszystkim w zakażeniach układowych z fungemią i zajęciem ośrodkowego układu nerwowego [4, 9, 20]. 5. Nowe trendy w poszukiwaniu antymikotyków Wzrastająca oporność wśród Candida spp. na dostępne antymikotyki, stanowi poważne wyzwanie dla współczesnej medycyny. Z najnowszych badań wynika, że spośród szczepów C. albicans opornych na FLC, jedynie 28% pozostaje wrażliwych na VRC [60]. Z kolei, choć CAS oraz AMB pozostają skuteczne in vitro wobec wszystkich gatunków z rodzaju Candida, to prowadzone w ostatnich latach badania wskazują na gatunkowo-specyficzny wzrost oporności na te antymikotyki [43, 58]. Ponadto, ekspozycja C. albicans na antymikotyki stymuluje zjadliwość grzyba. W odpowiedzi na stymulant patogen zwiększa swoją zdolność do przeżycia poprzez nadprodukcję enzymów hydrolitycznych oraz podwyższoną adhezję, dodatkowo uszkadzając tkanki gospodarza [56]. Zwiększona ekspresja SAP u C. albicans pod wpływem leków została opisana dla głównych grup antymikotyków stosowanych w leczeniu grzybic układowych: azoli (FLC) [18, 94], polienów (AMB) [39] oraz echinokandyn (CAS) [65]. Stwarza to potrzebę poszukiwania nowych związków o działaniu antymikotycznym. Według najnowszych doniesień [73] nowo syntetyzowane związki przeciwgrzybiczne ukierunkowane są głównie na czynniki wirulencji Candida. Wśród nich na uwagę zasługują oksymy, obejmujące tzw. aldoksymy lub ketoksymy w zależności od podstawnika R. Pomimo, że wykazują one wyższe minimalne stężenie hamujące w porównaniu do azoli, to skuteczne hamują produkcję proteazy aspartylowej i fosfolipazy (w ponad 50%). Z kolei estry oksymowe wykazują znacznie niższe wartości w porównaniu do flukonazolu, jednak ich wpływ na czynniki wirulencji C. albi­ cans nie został jeszcze poznany [7]. Zatem, oksymy mogą stanowić, dobrą podstawę do rozwoju nowej grupy związków, skutecznych wobec czynników wirulencji Candida spp. Wykazano również, że naturalne bogate w tryptofan peptydy wykazują aktywność przeciw Candida spp. [41]. Peptydy liniowe bogate w tryptofan, są to związki chemiczne połączone wiązaniem peptydowym zawierające co najmniej 2 reszty aminokwasowe, składające się z pojedynczego łańcucha peptydowego z podstawnikami zawierające 20–50% tryptofanu. Wśród nich, na szczególną uwagę zasługuje indolicydyna, która jest najmniejszym znanym liniowym bogatym w tryptofan peptydem o działaniu antybakteryjnym oraz antymikotycznym. Ten naturalny 13-amionokwasowy peptyd w 39% składa się z tryptofanu i występuje w neutrofilach bydlęcych. Indolicydyna charakteryzuje się szerokim spektrum działania, wykazuje aktywność przeciw grzybom, pierwotniakom, Gram-pozytywnym oraz Gram-negatywnym bakteriom. Ponadto, wykazuje cytotoksyczność wobec limfocytów T oraz lizuje czerwone krwinki. Grzybobójcze właściwości indolicydyny wynikają z bezpośrednich oddziaływań tego peptydu z warstwami lipidowymi błony komórkowej grzyba, które zaburzają integralność błony komórkowej. Inter­ akcje te są zależne od obecności jonów Na+ oraz Mg2+ w środowisku [26, 42]. Nowych substancji o działaniu antymikotycznym poszukuje się również pośród alkaloidów, ekstraktów z kory, olejków oraz terpenoidów [1]. K u m a r i wsp. [40] wykazali znaczące aktywności olejku kokosowego, olejku z trawy cytrynowej, olejku migdałowego oraz olejku z goździków przeciw szczepom Candida wyizolowanych z krwi. Niskie wartości przeciw C. albicans wykazuje również olejek z macierzanki tymianek [1, 33]. Z kolei, naturalny alkaloid tetradryna (TET), wytwarzany przez Stephania tetrandra (Menispermaceae), hamuje morfogenezę, ekspresję adhezyn Als3 i Hwp1 oraz działa synergicznie z ketokonazolem wzmacniając jego aktywność [97, 98]. Nasze dotychczasowe badania dowiodły, że pochodne sulfonowe wykazują znaczącą aktywność przeciw-Candida (dane niepublikowane). Związki te wykazują aktywność wobec wielu kluczowych czynników wirulencji C. albicans. Wśród podstawników halogenowych pierścienia fenylowego znalazły się: fluor, chlor oraz brom, które jak uprzednio wykazano zwiększają aktywność przeciwgrzybiczną pochodnych sulfonowych [10]. PATOGENEZA I LECZENIE ZAKAŻEŃ CANDIDA SPP. 237 Rys. 1. Wpływ pochodnych sulfonowych na morfogenezę Candida albicans. Mikroskop kontrastowo-fazowy (Carl Zeiss Jena, Niemcy). (A) blastokonidia C. albicans (strzałka) po 18 godzinnym traktowaniu pochodną sulfonową w stężeniu 16 µg/ml. Zahamowanie procesu morfogenezy w podłożu hodowlanym RPMI. (B) nie traktowane blastokonidia C. albicans, po 18 godzinnej inkubacji w podłożu RPMI z dodatkiem rozcieńczalnika DMSO (0,09%), tworzą obfite strzępki prawdziwe (strzałka otwarta). Bar 100 µm. Dowiedliśmy, że spośród przetestowanych podstawników chlor najefektywniej zwiększał aktywność przeciwgrzybiczną sulfonów. Ustaliliśmy, że mechanizm działania sulfonów polega min. na hamowaniu aktywności czynników transkrypcyjnych EFG1 oraz CPH1, a co za tym idzie, tworzenia inwazyjnych form strzępek prawdziwych – hyphae (Rys. 1). Istota działania tych związków zależy od aromatycznego sześcioczłonowego pierścienia połączonego z grupą sulfonową, ponadto dodatkowe modyfikacje pierścienia wpływają na zwiększenie aktywności sulfonów. Niektóre z badanych przez nas związków z grupy sulfonów trihalogenometylofenylowych wykazują znaczącą aktywność przeciwgrzybiczną (MIC < 4 μg/ml) w porównaniu do opisanych w literaturze [70] nowo syntetyzowanych związków posiadających aktywność przeciw C. albicans. 6. Podsumowanie Mimo postępów w medycynie, kandydozy wciąż stanowią poważny problem kliniczny o wymiarze światowym. Grzyby z rodzaju Candida posiadają szereg czynników zjadliwości pozwalających na kolonizację, penetrację tkanek i rozprzestrzenianie się w organizmie gospodarza. Do głównych czynników wirulencji Candida spp. należy adhezja, tworzenie biofilmu, pleomorfizm oraz aktywność enzymatyczna. Konsekwencją nadużywania antymikotyków jest pojawienie się selekcji w kierunku szczepów opornych C. albicans oraz zwiększenie częstotliwości występowania kandydoz, których czynnikiem etiologicznym są inne gatunki należące do Candida spp. wykazujące wysoką lub całkowitą oporność na stosowane antymikotyki. Stwarza to potrzebę poszukiwania nowych skutecznych, związków chemicznych o szerokim działaniu przeciwgrzybicznym. Właśnie dlatego tak ważne jest dokładne poznanie budowy, chorobotwórczości oraz czynników zjadliwości Candida spp., co pozwoli w przyszłości na znalezienie skutecznych antymikotyków ukierunkowanych na czynniki wirulencji. Podziękowania Praca jest finansowana z funduszu projektu badawczego Nr DEC-2011/03/D/NZ7/06198 uzyskanego w ramach konkursu SONATA Narodowego Centrum Nauki. Piśmiennictwo 1. Abad M.J., Ansuategui M., Bermejo P.: Active antifungal substances from natural sources. ARKIVOC, 7, 116–147 (2007) 2. Agrimón S., A.J.P. Brown i wsp.: Developmental regulation of an adhesion gene during cellular morphogenesis in the fungal pathogen Candida albicans. Eukaryot. Cell, 6, 682–692 (2007) (cytowana praca jest dziełem 13 autorów) 3.Albrecht A., B. Hube i wsp.: Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteases of Candida albicans target proteins necessary for both cellular processes and host-pathogen interactions. J. Biol. Chem. 281, 688–694 (2006) (cytowana praca jest dziełem 12 autorów) 4. Anaissie E.J., McGinnis M.R., Pfaller M.A.: Clinical mycology. Philadelphia, Churchill Livingstone, New York, 2003 5.Aoki W., Kitahara N., Miura N., Morisaka H., Yamamoto Y., Kuroda K., Ueda M.: Comprehensive characterization of secreted aspartic proteases encoded by a virulence gene family in Candida albicans. J. Biochem. 150, 431–438 (2011) 6. Arning M., Kliche K.O., Heer-Sonderhof A.H., Wehmeier A.: Infusion-related toxicity of three different amphotericin B formulations and its relation to cytokine plasma levels. Mycoses, 38, 459–465 (1995) 7. Attia M.I., Zakaria A.S., Almutairi M.S., Ghoneim S.W.: In vitro anti-Candida activity of certain new 3-(1H-imidazol-1-yl)propan-1-one oxime esters. Molecules, 18, 12208–12221 (2013) 8. Biliński P., Seferyńska I., Warzocha K.: Diagnosis and treatment of fungal infections in oncohematology. Onkol. Prak. Klin. 4, 15–24 (2008) 9.Bondaryk M., Kurzątkowski W., Staniszewska M.: Antifungal agents commonly used in the superficial and mucosal candidiasis treatment: mode of action and resistance development. Post. Derm. Alergol. 30, 293–301 (2013) 238 MONIKA STANISZEWSKA I WSP. 10. Borys K.M., Korzyński M.D., Ochal Z.: A simple and efficient synthesis of trihalomethyl and dihalomethyl aryl sulfones. Tetra­ hedron. Lett. 53, 6606–6610 (2012) 11. Braun B.R., Johnson A.D.: TUP1, CPH1 and EFG1 make independent contributions to filamentation in Candida albicans. Genetics, 155, 57–67 (2000) 12. Calderone R.A.: Taxonomy and biology of Candida (w) Candida and Candidiasis, red. R.A. Calderone, ASM Press, Waszyngton, 2002, s. 15–17. 13. Cannon R.D., Lamping E., Holmes A.R., Niimi K., Baret P.V., Keniya M.V., Tanabe K., Niimi M., Goffeau A., Monk B.C.: Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 22, 291–321 (2009) 14.Chamilos G., Lionakis M.S., Lewis R.E., Lopez-Ribot J.L., Saville S.P., Albert N.D., Halder G., Kontoyiannis D.P.: Droso­ phila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J. Infect. Dis. 193, 1014–1022 (2006) 15.Ciok-Pater E., Biełucha A., Szabelska M., Gospodarek E.: Mechanizmy oporności drożdży na stosowane leki przeciwgrzybicze. Mikol. Lek. 15, 49–53 (2008) 16. Clerihew L., Lamagni T.L., Brocklehurst P., McGuire W.: Can­ dida parapsilosis infection in very low birthweight infants. Arch. Dis. Child Fetal Neonatal Ed. 92, F127–F129 (2007) 17. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for Broth dilution antifungal susceptibility testing standard M27-A2, 2nd ed., red. Wayne, Clinical and Laboratory Standards Institute, USA, 2002, s. 1–29. 18. Costa C.R., Jesuíno R.S., de Aguino Lemos J., de Fátima Lisboa Fernandes O., Hasimoto e Souza L.K., Passos X.S., do Rosário Rodrigues Silva M.: Effects of antifungal agents in Sap activity of Candida albicans isolates. Mycopathologia, 169, 91–98 (2010) 19. Denning D.W.: Echinocandin antifungal drugs. The Lancet, 362, 1142–1151 (2003) 20.Dzierżanowska D., Dzierżanowska-Fangrat K.: Przewodnik terapii inwazyjnych zakażeń grzybiczych. Alfa-medica Press, Bielsko-Biała, 2012 21. Elahi S., Clancy R., Pang G.: A therapeutic vaccine for mucosal candidiasis. Vaccine, 19, 2516–2521 (2001) 22. Emira N., Mejdi S., Dorra K., Amina B., Eulogio V.: Comparison of the adhesion ability of Candida albicans strains to biotic and abiotic surfaces. Afr. J. Biotechnol. 10, 977–985 (2011) 23. Enoch D.A., Ludlam H.A., Brown N.: Invasive fungal infections: a review of epidemiology and management options. J. Med. Microbiol. 55, 809–818 (2006) 24.Espinel-Ingroff A.: Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Rev. Iberoam. Micol. 25, 101–106 (2008) 25. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Anidulafungin: Rationale for the clinical breakpoints, version 2.0, 2013. http://www.eucast.org. 26. Falla T.J., Karunaratne D.N., Hancock R.E.W.: Mode of action of the antimicrobial peptide Indolicidin. J. Biol. Chem. 271, 19298–19303 (1996) 27. Farah C, Ashman R.B., Challacombe S.J.: Oral candidosis. Clin. Dermatol. 18, 553–562 (2000) 28. Fidel P.L., Sobel J.D.: Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Microbiol. Rev. 9, 335–348 (1996) 29.Fischer G., Brandford J.: Vulvovaginal candidiasis in post­ menopausal women: the role of hormone replacement therapy. J. Low Genit. Tract Dis. 15, 263–267 (2011) 30. Franzke S., Calderone R.A., Schaller K.: Isolation of avirulent clones of Candida albicans with reduced ability to recognize the CR2 ligand C3d. Infect. Immun. 61, 2662–2669 (1993) 31. Garczewska B., Kamińska W., Dzierżanowska D.: Phenotype and genotype characterization of Candida albicans strains isolated from patients hospitalized at the Children’s Memorial Health Institute”. Med. Dośw. Mikrobiol. 60, 231–241 (2008) 32.Gilfillan G.D., Sullivan D.J., Haynes K., Parkinson T., Coleman D.C., Gow N.A.R.: Candida dubliniensis: phylogeny and putative virulence factors. Microbiology, 144, 829–838 (1998) 33. Giordani R., Regli P., Kaloustian J., Mikail C., Abou L., Portugal H.: Antifungal effects of various essential oils against Can­ dida albicans. Potentiation of antifungal action of amphotericin B by essential oil from Thymus vulgaris. Phytother. Res. 18, 990–995 (2004) 34. Hiller E., Zavrel M., Hauser N., Sohn K., Burger-Kentischer A., Lemuth K., Rupp S.: Adaptation, adhesion and invasion during interaction of Candida albicans with the host – Focus on the function of cell wall proteins. Int. J. Med. Microbiol. 301, 384–389 (2011) 35.Huang Y.C., Li C.C., Lin T.Y., Lien R.I., Chou Y.H., Wu J.L., Hsueh C.: Association of fungal colonization and invasive disease in very low birth weight infants. Pediatr. Infect. Dis. J. 17, 819–822 (1998) 36. Jombol G.T.A., Opajobi S.O., Egah D.Z., Banat E.B., Denen Akaa P.: Symptomatic vulvovaginal candidiasis and genital colonization by Candida species in Nigeria. J. Public Health Epidemiol. 2, 147–151 37. Kennedy M.A., Sobel J.D.: Vulvovaginal candidiasis caused by non-albicans Candida species: new insights. Curr. Infect. Dis. Rep. 12, 465–470 (2010) 38.Kullberg B.J., Filler S.G.: Candidemia. (w) Candida and candidiasis, red. R.A. Calderone, ASM Press, Washington, 2002, s. 327–340 39.Kumar R., Shukla P.K.: Amphotericin B resistance Leeds to enhanced proteinase activity and phospholipase activity and reduced germ tube formation in Candida albicans. Fungal Biol. 114, 189–197 (2010) 40. Kumar A., Thakur S., Thakur V.C., Kumar A., Patil S., Vohra M.P.: Antifungal activity of some natural essential oils against Can­ dida species isolated from blood stream infection. JKIMSU, 1, 61–66 (2012) 41.Lee D.G., Kim P.I., Park Y., Woo E.R., Choi J.S., Choi C.H., Hahm K.S.: Design of novel peptide analogs with potent fungicidal activity, based on PMAP-23 antimicrobial peptide isolated from porcine myeloid. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 231–238 (2002) 42.Lee D.G., Kim H.K., Kim S.A., Park Y., Park S.C., Jang S.H., Halm K.S.: Fungicidal effect of indolicidin and its interaction with phospholipid membranes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 305, 305–310 (2003) 43.Li F., Wu L., Cao B., Hang Y., Li X., Liu Y.: Surveillance of the prevalence, antibiotic susceptibility, and genotyping characterization of invasive candidiasis in a teaching hospital in China between 2006 to 2011. BMC Infect. Dis. 13, 353. doi:10.1186/1471-2334-13-353 (2013) 44. Lim C.S.Y., Rosli R., Seow H.F., Chong P.P.: Candida and invasive candidiasis: back to basis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31, 21–31 (2012) 45. Lin Y.J., Alkad L., Vogel F., Koppar S., Nevarez L., Auguste F., Seymour J., Syed A., Christoph K., Loomis J.S.: Interactions between Candida albicans and Staphylococcus aureus within mixed species biofilms. BIOS, 84, 30–39 (2013) 46. Liu H., Köhler J., Fink G.: Suppression of hyphal formation in Candida albicans by mutation of a STE12 homolog. Science, 266, 1723–1726 (1994) 47.Liu Y., Filler S.G.: Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell, 10, 168–173 (2011) PATOGENEZA I LECZENIE ZAKAŻEŃ CANDIDA SPP. 48. Lo H.J., Köhler J.R., DiDomenico B., Loebenberg D., Cacciapuoti A., Fink G.R.: Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell, 90, 939–949 (1997) 49. Miceli M.H., Chandrasekar P.: Safety and efficacy of liposomal amphotericin B for the empirical therapy of invasive fungal infections in immunocompromised patients. Infect. Drug. Resist. 5, 9–16 (2012) 50. Mnichowska M., Giedrys-Kalemba S.: Funkcjonalne, strukturalne i molekularne spojrzenie na adhezję Candida spp. Mikol. Lek. 11, 309–316 (2004) 51. Modrzewska B., Kurnatowski P.: Selected pathogenic characteristics of fungi from the genus Candida. Ann. Parasitol. 59, 57–66 (2013) 52. Mora-Duarte J., Betts R., Rotstein C., Colombo A.L., Thompson-Moya L., Smietana J., Lupinacci R., Sable C., Kartsonis N., Pefect J.: Comparison of caspofungin and amphotericin B for invasive candidiasis. N. Engl. J. Med. 347, 2020–2029 (2002) 53. Morales D.K., Hogan D.A.: Candida albicans interactions with bacteria in the context of human Heath and disease. PLoS Pathog. 6, e1000886. doi:10.1371/journal.ppat.1000886 (2010) 54. Naglik J.R., Challacombe S.J., Hube B.: Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Micro­ biol. Mol. Biol. Rev. 67, 400–428 (2003) 55. Naglik J.R., B. Hube i wsp.: Quantitative expression of the Can­ dida albicans secreted aspartyl proteinase gene family in human oral and vaginal candidiasis. Microbiology, 154, 3266–3280 (2008) (cytowana praca jest dziełem 12 autorów) 56. Navarathna D.H.M.L.P., Hornby J.M., Hoerrmann N., Parkhurst A.M., Duhamel G.E., Nickerson K.W.: Enhanced pathogenicity of Candida albicans pre-treated with subinhibitory concentrations of fluconazole in a mouse model of disseminated candidiasis. J. Antimicrob. Chemother. 56, 1156–1159 (2005) 57.Nawrot U., Karpiewska A.: Patogeneza zakażeń wywołanych przez Candida albicans. Mikol. Lek. 9, 137–143 (2002) 58. Papon N., Courdavault V., Clastre M., Bennett R.J.: Emerging and emerged pathogenic Candida species: beyond the Candida albi­ cans paradigm. PLoS Pathog. 9, e1003550. doi:10.1371/journal. ppat.1003550 (2013) 59. Pfaller M.A., Diekema D.J.: Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133–163 (2007) 60. Pfaller M.A., Diekema D.J., Gibbs D.L., Newell V.A., Ellis D., Tullio V., Rodloff A., Fu W., Ling T.A., the Global Antifungal Surveillance Group: Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study, 1997 to 2007: a 10.5-year analysis of susceptibilities of Candida species to fluconazole and vorico­ nazole as determined by CLSI standardized disk diffusion. J. Clin. Microbiol. 48, 1366–1377 (2010) 61. Przyjałkowski W.: Zakażenia grzybicze ośrodkowego układu nerwowego. (w) Zakażenia grzybicze – wybrane zagadnienia, red. D. Dzierżanowska, α-medica Press, Bielsko Biała, 2006, s. 154–165 62. Puel A., J.L. Casanova i wsp.: Chronic mucocutaneous candidiasis in humans with inborn errors of interleukin-17 immunity. Science, 332, 65–68 (2011) (cytowana praca jest dziełem 24 autorów) 63.Ramage G., Coco B., Sherry L., Bagg J., Lappin D.F.: In vitro Candida albicans biofilm induced proteinase activity and SAP8 expression correlates with in vivo denture stomatitis severity. Mycopathol. 174, 11–19 (2012) 64. Raška M.., Běláková J., Křupka M., Weigl E.: Candidiasis – do we need to fight or to tolerate the Candida fungus? Folia Microbiol. 52, 297–312 (2007) 65. Ripeau J.S., Aumont F., Belhumeur P., Ostrosky-Zeichner L., Rex J.H., de Repentigny L.: Effect of the echinocandin caspofungin on expression of Candida albicans secretory aspartyl proteinases 239 and phospholipase in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3096–3100 (2002) 66.Robbins N., Uppuluri P., Nett J., Rajendran R., Ramage G., Lopez-Ribot J.L., Andes D., Cowen L.E.: Hsp90 governs dispersion and drug resistance of fungal biofilms. PLoS Pathog. 7, e1002257. doi:10.1371/journal.ppat.1002257 (2011) 67. Ruhnke M.: Skin and mucous membrane infections. (w) Can­ dida and candidiasis, red. R.A. Calderone, ASM Press, Washington, 2002, s. 307–325 68. Schaller M., Schackert C., Korting H.C., Januschke E., Hube B.: Invasion of Candida albicans correlates with expression of secreted aspartic proteinases during experimental infection of human epidermis. J. Invest. Dermatol. 114, 712–717 (2000) 69.Schelenz S.: Management of candidiasis in the intensive care unit. J. Antimicrob. Chemother. 61, i31–i34 (2008) 70.Sheng C., W. Zhang i wsp.: Design, synthesis and antifungal activity of isosteric analogues of benzoheterocyclic N-myristoyltransferase inhibitors. Eur. J Med. Chem. 45, 3531–3540 (2010) (cytowana praca jest dziełem 11 autorów) 71. Sherman F.: Getting started with yeast. Methods Enzymol. 350, 3–41 (2002) 72. Soll D.R.: Candida commensalism and virulence: the evolution of phenotypic plasticity. Acta Tropica, 81, 101–110 (2002) 73.Souza L.C., Campa A.: Pharmacological parameters of intravenously administered amphotericin B in rats: comparison of the conventional formulation with amphotericin B associated with a triglyceride-rich emulsion. J. Antimicrob. Chemother. 44, 77–84 (1999) 74. Staab J.F., Bradway S.D., Fidel P.L., Sundstrom P.: Adhesive and mammalian transglutaminase substrate properties of Candida albicans Hwp1. Science, 283, 1535–1538 (1999) 75. Staniszewska M.: Search for Candida albicans virulence factors. Ph.D. thesis, NIPH-NIH, Warsaw (2009) 76. Staniszewska M., Bondaryk M., Kurzątkowski W.: Morphotypes of Candida albicans. Phase-contrast microscopy. Mikol. Lek. 18, 5–10 (2011) 77. Staniszewska M., Rabczenko D., Kurzątkowski W.: Discrimination between the enzymatic activities of Candida albicans pleo­ morphic forms determined Rusing the api®Zym test. Mycoses, 54, e744–e750 (2011) 78.Staniszewska M., Bondaryk M., Piłat J., Siennicka K., Madga U., Kurzątkowski W.: Czynniki zjadliwości Candida albicans. Przegl. Epidemiol. 66, 629–633 (2012) 79. Staniszewska M., Bondaryk M., Siennicka K., Kurek A., Orłowski J., Schaller M., Kurzątkowski W.: In vitro study of secreted aspartyl proteinases Sap1 to Sap3 and Sap4 to Sap6 expression in Candida albicans pleomorphic forms. Pol. J. Microbiol. 61, 247–256 (2012) 80. Staniszewska M., Bondaryk M., Siennicka K., Kurzątkowski W.: Ultrastructure of Candida albicans pleomorphic forms: phase-contrast microscopy, scanning and transmission electron microscopy. Pol. J. Microbiol. 61, 129–135 (2012) 81. Staniszewska M., Bondaryk M., Siennicka K., Kurzątkowski W.: Candida albicans morphotypes. Scanning electron microscopy. Candida albicans morphologies. Mikol. Lek. 19, 53–56 (2012) 82.Staniszewska M., Bondaryk M., Siennicka K., Piłat J., Schaller M., Kurzątkowski W.: Role of aspartic proteinases in Can­ dida albicans virulence. Part I. Substrate specificity of aspartic proteinases and Candida albicans pathogenesis. Post. Mikrobiol. 51, 127–135 (2012) 83.Staniszewska M., Bondaryk M., Siennicka K., Piłat J., Schaller M., Kurzątkowski W.: Role of aspartic proteinases in Can­ dida albicans virulence. Part II. Expression of SAP1-10 aspartic proteinase during Candida albicans infections in vivo. Post. Mikrobiol. 51, 137–142 (2012) 240 MONIKA STANISZEWSKA I WSP. 84. Staniszewska M., Bondaryk M., Malewski T., Kurzątkowski W.: The in vitro expression of SAP6 gene in Candida albicans morphogenesis mutants under human serum influence. Biologia, 68, 803–807 (2013) 85.Staniszewska M., Bondaryk M., Rabczenko D., Smoleńska-Sym G., Kurzątkowski W.: Cell wall carbohydrates content of pathogenic Candida albicans strain morphological forms. Med. Dosw. Mikrobiol. 65, 119–128 (2013) 86.Staniszewska M., Bondaryk M., Rabczenko D., Smoleńska-Sym G., Kurzątkowski W.: The cell wall mannose content of Candida albicans morphological forms. Mikol. Lek. 20, 5–8 (2013) 87.Staniszewska M., Bondaryk M., Swoboda-Kopeć E., Siennicka K., Sygitowicz G., Kurzątkowski W.: Candida albicans morphologies revealed by scanning electron microscopy analysis. Braz. J. Microbiol. 44, 813–821 (2013) 88. Staniszewska M., Bondaryk M., Malewski T., Kurzątkowski W.: Quantitative expression of Candida albicans aspartyl proteinase genes SAP7, SAP8, SAP9, SAP10 in human serum in vitro. Pol. J. Microbiol. 63, 15–20 (2014) 89. Stradomska T.J.: Wykrywanie metabolitów w diagnostyce grzybic układowych. (w) Zakażenia grzybicze – wybrane zagadnienia, red. D. Dzierżanowski, α-medica press, Bielsko-Biała, 2006, s. 71–78 90. Taylor B.N., Hannemann H., Sehnal M., Biesemeier A., Schwei­ zer A., Röllinghoff M., Schröppel K.: Induction of SAP7 correlates with virulence in an intravenous infection model of candidiasis but not in a vaginal infection model in mice. Infect. Immun. 73, 7061–7063 (2005) 91. Warzocha K., Seferyńska I.: Zakażenia grzybicze w hematologii. (w) Zakażenia grzybicze – wybrane zagadnienia, red. D. Dzierżanowska, α-medica Press, Bielsko Biała, 2006, s. 137–153 92. Wächtler B., Citiulo F., Jablonowski N., Förster S., Dalle F., Schaller M., Wilson D., Hube B.: Candida albicans-epithelial interactions: dissecting the roles of active penetration, induced endocytosis and host factors on the infection process. PLoS One, 7, e36952. doi:10.1371/journal.pone.0036952 (2 012) 93. Weems J.J.: Candida parapsilosis: epidemiology, pathogenicity, clinical manifestations, and antimicrobial susceptibility. Clin. Infect. Dis. 14, 756–766 (1992) 94. Wu T., Wright K., Hurst S.F., Morrisom C.J.: Enhanced extracellular production of aspartyl proteinase, a virulence factor, by Candida albicans isolates following growth in subinhibitory concentrations of fluconazole. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1200–1208 (2000) 95. Yang Y.L.: Virulence factors of Candida species. J. Microbiol. Immunol. Infect., 36, 223–228 (2003) 96.Zaugg C., Borg-von Zepelin M., Reichard U., Sanglard D., Monod M.: Secreted aspartic proteinase family of Candida tropicalis. Infect. Immun. 69, 405–412 (2001) 97. Zhang H., Wang K., Zhang G., Ho H.I., Gao A.: Synergic anti-candidal activity of tetrandrine on ketoconazole: an experimental study. Planta. Med. 76, 53 (2010) 98.Zhao L.X., Li D.D., Hu D.D., Hu G.H., Yan L., Wang Y., Jiang Y.Y.: Effect of tetrandrine against Candida albicans biofilms. PLoS ONE, 8, e79671. doi:10.1371/journal.pone.0079671 (2013) 99. Zhao R., Lockhart S.R., Daniels K., Soll D.R.: Roles of TUP1 in switching, phase maintenance, and phase-specific gene expression in Candida albicans. Eukaryot. Cell, 3, 353–365 (2002) 100. Zielińska E.: Kontrowersje dotyczące optymalnej profilaktyki i leczenia zakażeń grzybami w stanach obniżonej oporności. Przegl. Epidemiol. 57, 299–307 (2003) POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 241–254 http://www.pm.microbiology.pl MYCOBACTERIUM KANSASII: BIOLOGIA PATOGENU ORAZ CECHY KLINICZNE I EPIDEMIOLOGICZNE ZAKAŻEŃ Zofia Bakuła1, Aleksandra Safianowska2, Magdalena Nowacka-Mazurek3, Jacek Bielecki1, Tomasz Jagielski1* Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. I. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa 2 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul. Żwirki i Wigury 61, 02-091 Warszawa 3 Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny, ul. Stefana Banacha 1A, 02-097 Warszawa 1 Wpłynęło w marcu 2014 r. 1. Wprowadzenie. 2. Prątki niegruźlicze. 3. Charakterystyka Mycobacterium kansasii. 4. Epidemiologia. 5. Diagnostyka laboratoryjna. 6. Patogeneza i obraz kliniczny. 6.1. Interakcje patogen-gospodarz. 6.2. Źródła zakażeń. 6.3. Czynniki ryzyka. 6.4. Rozpoznanie. 6.5. Obraz kliniczny. 7. Leczenie. 8. Podsumowanie Mycobacterium kansasii: pathogen biology and clinical and epidemiological features of infections Abstract: Nontuberculous mycobacteria (NTM) are opportunistic pathogens widely spread in the environment that may produce lifethreatening infections in humans. With the increased number of patients suffering from different forms of immunosuppression, there has been a resurgence in interest in NTM and increase in the prevalence of NTM diseases. Although the incidence of Mycobacterium kansasii infections shows significant geographical variability, in most places, M. kansasii ranks first as a cause of pulmonary NTM syndromes in the HIV-negative population and second as a cause of disseminated infection in HIV-positive patients. In Poland, among cases of NTM disease, the number of which has been remarkably on the rise in recent years, those attributable to M. kansasii are in majority. Many epidemiological aspects of M. kansasii infection, concerning the pathogen’s reservoirs, contagiousness, transmission routes and distribution in different geographic regions and among different human populations, are unknown or only poorly understood. As with other NTM, M. kansasii infections are believed to be acquired from environmental exposures rather than by person-to-person transmission. Rarely M. kansasii has been isolated from soil, natural water systems or animals. Instead it has almost exclusively been recovered from municipal tap water, which is considered to be its major environmental reservoir. Culturing of M. kansasii from human tissues may not necessarily represent true infection but a non-pathogenic colonization or contamination. Thus, a reliable diagnosis of M. kansasii disease relies upon an in-depth clinical and laboratory investigation, requiring integration of symptomatological, radiological, and microbiological data. In thoracic imaging, M. kansasii infections may manifest as cavitations, opacities, small nodules and bronchiectasis, most frequently situated in the upper lobes, but lesions may also be present in other sites of the lungs. Treatment of M. kansasii infections is based on a combined and long lasting (at least 15 months) regimen consisting of ethambutol, isoniazid and rifampicin. 1. Introduction. 2. Non-tuberculous mycobacteria. 3. Characteristics of Mycobacterium kansasii. 4. Epidemiology. 5. Laboratory diagnostics. 6. Pathogenesis and clinical features. 6.1. Host-pathogen interactions. 6.2. Sources of infections. 6.4. Risk factors. 6.4. Diagnosis. 6.5. Clinical picture. 7. Treatment. 8. Summary Słowa kluczowe: Mycobacterium kansasii, mykobakterioza, prątki niegruźlicze Key words: Mycobacterium kansasii, mycobacteriosis, non-tuberculous mycobacteria, NTM 1. Wprowadzenie Prątki (Mycobacterium) to grupa bakterii kwasoopornych, charakteryzujących się małą wrażliwością na działanie niekorzystnych czynników środowiskowych. Bakterie te mają wydłużony, pałeczkowaty kształt, a ich wielkość waha się od 0,2 do 0,4 μm średnicy i od 2 do 10 μm długości. Drobnoustroje należące do tego rodzaju są tlenowe, pozbawione zdolności ruchu, bezotoczkowe i nieprzetrwalnikujace. Charakterystyczną cechą prątków jest specyficzna budowa ściany komórkowej, która zawiera znaczne ilości substancji lipidowych, takich jak kwasy mykolowe, lipoarabinomannan (LAM), czy woski, przy czym różnice dotyczące składu chemicznego ściany obserwowane są zarówno między różnymi gatunkami prątków, jak też między szczepami tego samego gatunku. Do rodzaju Mycobacterium należy obecnie około 165 gatunków bakterii [57]. Przyporządkowano je do trzech grup: [i] Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) – grupa prątków wywołujących gruźlicę u ludzi i zwierząt (do tej grupy należą m.in.: M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum, M. canetti, M. orygis, M. pinnipedii, M. caprae, M. mungi), [ii] prątki wywołujące trąd (M. leprae) [iii] prątki niegruźlicze (NTM, non-tuberculous mycobacteria) [61, 105]. * Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, ul. I. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, e-mail: [email protected] 242 ZOFIA BAKUŁA, ALEKSANDRA SAFIANOWSKA, MAGDALENA NOWACKA-MAZUREK, JACEK BIELECKI, TOMASZ JAGIELSKI 2. Prątki niegruźlicze Prątki niegruźlicze zostały wyodrębnione jako osobna grupa przez P i n n e r’ a [71]. Poza terminem „prątki niegruźlicze – NTM” zatwierdzonym przez American Thoracic Society (ATS) w literaturze funkcjonują obecnie także inne określenia opisujące tę grupę: „prątki inne niż gruźlicze” (MOTT, mycobacteria other than tuberculosis), prątki atypowe, środowiskowe, oportunistyczne [1, 87]. Do grupy NTM należy obecnie około 140 gatunków bakterii [106]. W obrębie NTM wyróżnia się prątki wolnorosnące (SGM, slow growing mycobacteria), których kolonie pojawiają się w hodowlach zwykle po upływie od 1 do 8 tygodni, oraz szybkorosnące (RGM, rapid growing mycobacteria), które na wytworzenie kolonii potrzebują mniej niż 7 dni [29, 36]. Inny podział, zaproponowany przez R u n y o n’ a dzieli prątki na 4 grupy, w zależności od zdolności wytwarzania barwnika i szybkości wzrostu [83]. Wyróżnia on: [i] prątki fotochromogenne – wolnorosnące, wytwarzające barwnik po ekspozycji na światło, [ii] skotochromogenne – wolnorosnące, produkujące barwniki także w ciemności, [iii] niechromo­genne – wolnorosnące, nieprodukujące barwników, oraz [iv] prątki szybkorosnące. Kolejny podział rozróżnia prątki niepatogenne od patogenów oportunistycznych [114]. Prątki niegruźlicze są wolno żyjącymi saprofitami występującymi powszechnie w środowisku, m.in. w zbiornikach wodnych i glebie, i to właśnie te środowiska uważane są za ich naturalny rezerwuar. Izolowane są także z wody pitnej, biofilmów, kurzu, ziemi doniczkowej, tkanek zwierzęcych i produktów spożywczych [27, 30, 117]. Prątki NTM zaobserwowano wkrótce po odkryciu przez Roberta Kocha prątka gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis). Początkowo nie były one uważane za chorobotwórcze, aż do lat 50. ubiegłego wieku [54]. Obecnie znanych jest 25 gatunków prątków atypowych uznawanych za czynniki etiologiczne chorób, tzw. mykobakterioz [106]. Szacuje się jednak, że około 60% wszystkich gatunków prątków może powodować choroby człowieka o zmiennym obrazie klinicznym, przebiegu i rokowaniach [70]. Prątki atypowe mogą powodować zakażenia klinicznie jawne jak i bezobjawowe zarówno u ludzi, jak i u zwierząt. Wśród najczęstszych manifestacji klinicznych mykobakterioz są choroby płuc (około 90% wszystkich przypadków), zapalenia węzłów chłonnych, zakażenia skóry i tkanek miękkich oraz zakażenia uogólnione (szczególnie u pacjentów chorych na AIDS). Diagnostyka zakażeń prątkami NTM jest trudna i często niejednoznaczna. Podobnie, trudne i nieustalone jest leczenie wymagające długotrwałego przyjmowania kombinacji leków, często źle tolerowanych przez pacjentów [36, 40]. Zwykle schorzenia wywołane prątkami niegruźliczymi rozwijają się u osób z upośledzeniem układu odpornościowego, np. w wyniku leczenia nowotworów, terapii preparatami anty-TNF-α (TNF, tumor necrosis factor), terapii immunosupresyjnych (po przeszczepach narządów, u osób z chorobami autoagresywnymi), czy też u chorych z HIV/AIDS. Do rozwoju chorób wywołanych przez NTM mogą przyczyniać się zaburzenia genetyczne dotyczące receptora interferonu γ (IFN-γ) lub mutacje w genie kodującym interleukinę 12 (IL-12) lub w receptorze dla IL-12 [21, 92]. Do innych czynników ryzyka zalicza się m.in. deformacje płuc [44, 50] i przebyte lub współistniejące choroby płuc, np. przebytą gruźlicę płuc, pylicę krzemową, mukowiscydozę [21]. Podatne na zakażenie NTM wydają się też osoby cierpiące na refluks żołądkowo-przełykowy [51]. Inną grupą narażoną na rozwój zakażenia stanowią osoby uzależnione od alkoholu [92] oraz dzieci po zabiegach dentystycznych [96, 113]. Opisywane są także przypadki zakażeń NTM u osób nienależących do żadnej z powyższych grup ryzyka (tj. u osób bez chorób przebytych lub współistniejących). Zwykle są to osoby starsze, częściej mężczyźni niż kobiety [48]. Według ATS zapadalność na mykobakteriozy wynosi 1–1,8 na 100 000 osób [36]. Szacunki te bazują jednak na niepełnych danych, ponieważ zakażenia prątkami niegruźliczymi nie podlegają obowiązkowi rejestracji. Obserwuje się duże zróżnicowanie geograficzne zakażeń NTM, przy czym uwagę zwraca częstsze ich występowanie w krajach wysoko rozwiniętych. W niektórych badaniach częstość zakażeń prątkami NTM jest kilkakrotnie wyższa w stosunku do danych ATS [60], choć różnice te mogą wynikać z odmiennych kryteriów diagnostycznych doboru grup w poszczególnych badaniach. W latach 70. w Polsce przeprowadzono badanie grupy 700 tysięcy chorych zarejestrowanych w poradniach przeciwgruźliczych w województwie katowickim, warszawskim i w Łodzi. Wskaźnik zakażeń prątkami atypowymi ustalono na poziomie 1,4 na 100 000 chorych (1970 r.), a cztery lata później wskaźnik ten wy­niósł już 4,3 na 100 000 chorych [122]. 3. Charakterystyka Mycobacterium kansasii Prątki Mycobacterium kansasii po raz pierwszy opisali B u h l e r i P o l l o c w 1953 roku. Komórki M. kan­sasii charakteryzują się umiarkowaną długością wśród pałeczek kwasoopornych (około 0,2 μm średnicy i 5 µm długości) (Rys. 1B-C). W warunkach laboratoryjnych wzrastają w temperaturze od 32°C do 42°C (nie obserwuje się wzrostu w temperaturze powyżej 45°C). Hodowane na podłożu Löwenstein’a-Jensen’a lub Middlebrook’a w temperaturze 37°C wzrastają po około MYCOBACTERIUM KANSASII: BIOLOGIA PATOGENU ORAZ CECHY KLINICZNE I EPIDEMIOLOGICZNE ZAKAŻEŃ 243 Rys. 1. Prątki M. kansasii na pożywce Löwenstein’a-Jensen’a (A.); szczegóły morfologii w obrazie mikroskopii świetlnej (pow. 40x) (B.) i skaningowej (SEM; pow. 5000x) (C.) 10 dniach. Kolonie mogą przybierać kształt od płaskich do wypukłych, o nieregularnych brzegach i gładkiej lub szorstkiej morfologii (Rys. 1A). Pod wpływem światła widzialnego zazwyczaj zmieniają kolor na pomarańczowy, dzięki produkcji karotenoidów, głównie β-karotenu (ok. 85% wytwarzanych karotenoidów) i likopenu (15%) [23]. Przedłużająca się ekspozycja na światło może indukować wytwarzanie ciemnoczerwonych kryształów β-karotenu na powierzchni i wewnątrz kolonii. Szczepy M. kansasii produkują katalazę i reduktazę azotanową, hydrolizują Tween-80 i mocznik. W tabeli I przedstawiono wybrane cechy biochemiczne i fizjologiczne prątków M. kansa­ sii. Tak jak inne prątki niegruźlicze, prątki M. kansasii wykazują fenotypowe zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe, jednak genetyczne podstawy tego zjawiska nie są znane [46]. Ponieważ prątki M. kansasii oraz niechromogenne, wolnorosnące prątki M. gastrii mają identyczną sekwencję 16S rDNA, dyskutowano czy prątek M. gastrii nie jest podgatunkiem M. kansasii [111]. Ostatecznie, analiza sekwencyjna regionu ITS (internal transcribed spacer) oraz genu hsp65 rozdzieliła te dwa gatunki [81]. Badania przeprowadzone przez R o s s i wsp. [80] oraz późniejsze, poświęcone analizie regionu ITS [3], wykrywaniu sekwencji insercyjnej IS1652 [118], a także analizie PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism) genu hsp65 [25, 101], wykazały Tabela I Wybrane cechy fenotypowe prątków M. kansasii Badana cecha Fenotyp Kolonie Gładkie lub szorstkie, inkubowane bez dostępu do światła w kolorze kości słoniowej Optymalna temperatura inkubacji Czas wzrostu w optymalnej temperaturze 37°C 7–20 dni (wolnorosnący) Klasyfikacja Runyon’a Fotochromogenny, po inkubacji na świetle kolonie żółto-pomarańczowe Redukcja azotanów + Aktywność katalazy + Hydroliza mocznika + Hydroliza Tween-80 + Test redukcji tellurytu – Akumulacja niacyny – Produkcja arylosulfatazy – Aktywność pyrazynamidazy + Pobieranie żelaza – Wzrost na podłożu T2H 1 µg/ml + 5% NaCl 28°C – Agar McConkey’a – 244 ZOFIA BAKUŁA, ALEKSANDRA SAFIANOWSKA, MAGDALENA NOWACKA-MAZUREK, JACEK BIELECKI, TOMASZ JAGIELSKI zróżnicowanie genetyczne w obrębie M. kansasii. Polimorfizm genetyczny tego gatunku potwierdzono w dwóch kompleksowych badaniach, w których wykryto pięć różnych typów genetycznych (I–V). P i c a r d e a u i wsp. badali zarówno szczepy kliniczne jak i środowiskowe stosując analizę reaktywności DNA z sondami wykrywającymi sekwencje IS1652 oraz powtórzone sekwencje typu MPTR (major poly­ morphic tandem repeat; rodzaj powtórzonego DNA, stanowiący serię krótkich powtórzeń o długości 10 pz, występujący w szczepach M. kansasii, ale też M. tuber­ culosis i M. gordonae), a także przy pomocy techniki PFGE (elektroforeza pulsacyjna w zmiennym polu elektrycznym; pulsed-field gel electrophoresis), AFLP (polimorfizm dłu­gości amplifikowanych fragmentów; amplified fragment length polymorphism) oraz hsp65 PCR-RFLP. Wszystkie metody, poza IS1652-RFLP, ujawniły wśród szczepów M. kansasii istnienie 5 różnych grup (klasterów), definiowanych jako typy genetyczne [69]. Dalsze badania wykazały istnienie dwóch dodatkowych typów genetycznych M. kansasii (typ VI i VII) [77, 97]. 4. Epidemiologia Szacowana częstość zachorowań wywołanych przez prątki M. kansasii waha się od 2–3,1 na 1 000 000 [3] do 11,8 na 100 000 osób [52] i wzrasta do nawet 532 na 100 000 osób w populacji chorych na AIDS [61]. Prątki M. kansasii należą, obok prątków kompleksu M. avium, do najczęściej izolowanych prątków niegruźliczych z próbek klinicznych na całym świecie. Prątek M. kansasii jest drugim najczęstszym czynnikiem etiologicznym chorób płuc wywołanych przez NTM w Stanach Zjednoczonych i występuje najczęściej w południowej i centralnej części tego kraju. W latach 1971–1999 prątki M. kansasii były najczęściej izolowanymi prątkami w Veterans Affair Hospital w Omaha. Zaobserwowano, że o ile liczba zakażeń prątkiem gruźliczym w 20-letnim okresie spadała, to liczba zakażeń wywołanych prątkiem M. kansasii była stabilna, wreszcie przewyższając liczbę zakażeń M. tuber­ culosis [10]. W badaniach przeprowadzonych w Wirginii wykazano, że spośród zakażeń prątkami NTM, zakażenia wywołane prątkami M. kansasii, M. xenopi i M. fortuitum były częstsze niż te wywołane prątkami kompleksu M. avium [89]. Analiza przypadków zakażeń NTM z lat 1992–2002 na podstawie danych Koreańskiego Instytutu Gruźlicy pokazała, że liczba zakażeń prątkami M. kan­sasii wzrosła, z jednego przypadku w 1992 roku do 62 w 2002 roku [121]. W Izraelu w latach 2004–2010 zarejestrowano 215 przypadków zakażeń prątkami NTM. Gatunkiem najczęściej izolowanym był M. xenopi (39.1%), kolejnym M. simiae (24.2%). Jednak wśród przypadków istotnych klinicznie najczęściej izolowanymi gatunkami były M. kansasii i M. avium [12]. Analiza 5 497 przypadków z centrów pneumono­ logii w Portugalii wykazała, że u 510 chorych izolowano prątki, w tym prątki niegruźlicze u 58 pacjentów. Izolowano szczepy M. intracellulare (15,5%), M. fortuitum (13,8%), M. gordonae (12,1%) i M. kan­ sasii (10,3%) [8]. W latach 1984–1992 zaobserwowano w Anglii niemal 10-krotny wzrost liczby zakażeń prątkami MAC w porównaniu z zakażeniami prątkami M. kansasii [120]. Badania przeprowadzone w Anglii, Walii i Irlandii Północnej pokazały, że zapadalność na mykobakteriozy wywołane prątkami NTM wzrosła z 0,9 na 100 000 osób w 1995 do 2,9 na 100 000 w 2006 roku. Najczęściej izolowanymi gatunkami były Mycobacterium avium-intracellulare (43%), M. malmo­ ense i M. kansasii [63]. W badaniach retrospektywnych, obejmujących lata 2000–2007, przeprowadzonych w jednym z londyńskich szpitali analizowano przypadki zakażeń wolno­rosnącymi prątkami u pacjentów powyżej 18. roku życia, HIV-seronegatywnych i spełniających kryteria diagnostyczne wg ATS. Prątki M. kansasii reprezentowały najczęściej izolowany gatunek prątków NTM. Przy tym izolacja powiązana była zwykle z chorobą, a nie kolonizacją [24]. W badaniu przeprowadzonym w 29 krajach z pięciu kontynentów przeanalizowano 14 537 przypadków zakażeń NTM. Prątki M. kansasii znalazły się na szós­ tym miejscu wśród najczęściej izolowanych gatunków prątków z 561 przypadkami (4%). W Ameryce Południowej i Francji prątki M. kansasii były po prątkach MAC, najczęściej izolowanymi prątkami niegruźliczymi. Prątki M. kansasii najczęściej izolowano w Polsce, na Słowacji i w Wielkiej Brytanii (odpowiednio 35%, 36% i 11% spośród wszystkich wyizolowanych NTM w danym kraju; średnia dla Europy wynosiła 5%). W Japonii prątki M. kansasii znalazły się na trzecim miejscu po prątkach M. gordonae i M. abscessus [42]. W Polsce obserwuje się wzrost liczby przypadków chorób wywoływanych prątkami NTM. G r u b e k - J a w o r s k a i wsp. szacują zapadalność na poziomie 2,4 na 100 000 osób [37]. Co trzeci wyizolowany od pacjenta z mykobakteriozą płuc prątek niegruźliczy w Polsce to M. kansasii [42, 109]. W badaniu Nowackiej-Mazurek prątki M. kansasii były czynnikiem etiologicznym mykobakteriozy płuc u 68% chorych (74 z grupy 108 chorych) [65]. Podsumowując, chociaż obserwuje się duże zróżnicowanie geograficzne w występowaniu zakażeń prątkami M. kansasii, w wielu regionach zajmują pierwsze miejsce jako przyczyna chorób płuc z powodu prątków niegruźliczych w populacji HIV-seronegatywnej oraz drugie miejsce jako przyczyna zakażenia uogólnionego wśród pacjentów HIV-seropozytywnych [11]. MYCOBACTERIUM KANSASII: BIOLOGIA PATOGENU ORAZ CECHY KLINICZNE I EPIDEMIOLOGICZNE ZAKAŻEŃ 5. Diagnostyka laboratoryjna Identyfikacja prątków niegruźliczych, w tym prątków M. kansasii przez długi czas opierała się jedynie na ocenie cech fenotypowych oraz charakterystyce właściwości biochemicznych. Testy tego typu są czasochłonne (zajmują do 2 miesięcy), a ich wyniki nie zawsze są jednoznaczne. Do niedawna metodą referencyjną w identyfikacji gatunkowej prątków była analiza kwasów mykolowych techniką wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC, high-pressure liquid chromatography) [15]. Prątki M. kansasii charakteryzują się wzorem elucyjnym z jedną grupą szczytów chromatograficznych (Rys. 2.) [85]. Technika HPLC obciążona jest jednak wysokimi kosztami aparaturowymi oraz koniecznością stosowania toksycznych rozpuszczalników organicznych. W ciągu ostatnich dwóch dekad, opracowanych zostało kilka metod identyfikacji opartych na analizie DNA, które z powodzeniem stosowane są w różnicowaniu prątków M. kansasii od innych gatunków prątków. W 1991 roku, H u a n g i wsp. opracowali sondę DNA pMK1-9 specyficzną dla M. kansasii, zarówno szczepów klinicznych, jak i środowiskowych [43]. Jednak w badaniu przeprowadzonym przez Ross i wsp. wykazano, że spośród 105 szczepów M. kansasii, 20 (19%) nie dawało sygnału dla sondy pMK1-9 [80]. Kolejna sonda DNA, opisana przez Ya n g i wsp., obecna na plazmidzie p6123, zdolna była do specyficznej hybrydyzacji z DNA wszystkich badanych szczepów M. kansasii, także tych, które były negatywne w reakcji z sondą pMK1-9 [119]. Obecnie na rynku dostępne są cztery certyfikowane testy diagnostyczne wykorzystywane do identyfikacji prątków M. kansasii (a także innych gatunków należących do grupy NTM). Są to: [i] test AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, USA), wykrywający 16S rRNA, [ii] INNO LiPA MYCOBACTERIA v.2 (Innogenetics, 245 Ghent, Belgia), [iii] Speed-oligo® Mycobacteria (Vircell, Santa Fé Granada, Hiszpania), których celem jest region ITS, między genami kodującymi 16S i 23S rRNA, a także [iv] GenoType Mycobacterium CM/AS (common myco­ bacteria/additional species) (Hain Lifescience, Nehren, Niemcy). Umożliwiający detekcję swoistych gatunkowo regionów w obrębie 23S rDNA. Poza testem AccuProbe, wszystkie pozostałe opierają się na amplifikacji DNA techniką PCR, a następnie hybrydyzacji produktów amplifikacji z odpowiednio zaprojektowanymi oligonukleotydami, związanymi na pasku nitrocelulozowym. Wszystkie te testy okazały się skuteczne w identyfikacji najczęściej występujących gatunków prątków, w tym M. kansasii [53, 78, 84, 86, 102, 104]. System Accuprobe identyfikuje 5 taksonów Mycobacterium, a ściślej prątki kompleksu M. tuberculosis oraz 4 gatunki prątków NTM: M. avium, M. intracellulare, M. kansasii i M. gordonae. Z kolei testy INNO LiPA MYCOBACTERIA i Speed-oligo® Mycobacteria wykrywają odpowiednio 17 i 14 różnych taksonów w oparciu o kombinację sygnałów pochodzących z hybrydyzacji z 14 lub 6 sondami. Test GenoType Mycobacterium CM (common mycobacteria) pozwala na jednoczesną identyfikację M. tuberculosis complex oraz 13 gatunków prątków niegruźliczych, w tym M. kansasii, M. avium complex (MAC), M. xenopi, M. fortuitum, czy M. gordonae. Alternatywną wobec technik opartych o hybrydyzację DNA metodę identyfikacji kilkunastu gatunków prątków NTM zaproponowali P l i k a y t i s i wsp. W metodzie tej, amplifikuje się techniką PCR fragment genu kodującego białko szoku cieplnego (hsp65) o długości ok. 1 380 pz, a następnie otrzymany produkt poddaje się analizie restrykcyjnej (PCR-RFLP) [72]. Metodę tę zmodyfikowali Te l e n t i i wsp. [101], a w oparciu o nią kolejni badacze zaproponowali algorytm identyfikacji umożliwiający różnicowanie 34, a później nawet 54 gatunków prątków [14, 25]. Udaną próbę zastosowania tej metody w diagnostyce podjęto także w Polsce [31]. W identyfikacji gatunkowej prątków NTM, w tym M. kansasii zastosowanie znalazły także inne niż hsp65 geny metabolizmu podstawowego, m.in. dnaJ [99], rpoB [49] oraz tuf [93] kodujące odpowiednio: stresowe białko opiekuńcze, podjednostkę β polimerazy RNA oraz czynnik elongacji Tu (EF-Tu). Na rysunku 3 przedstawiono schemat postępowania w identyfikacji gatunkowej oraz genotypowaniu M. kansasii. 6. Patogeneza i obraz kliniczny 6.1. Interakcje patogen-gospodarz Rys. 2. Wzór elucyjny kwasów mykolowych M. kansasii otrzymany techniką wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) Prątki M. kansasii należą do patogenów oportunistycznych ludzi, chociaż odnotowuje się także przypadki zakażeń wśród różnych gatunków zwierząt, np. 246 ZOFIA BAKUŁA, ALEKSANDRA SAFIANOWSKA, MAGDALENA NOWACKA-MAZUREK, JACEK BIELECKI, TOMASZ JAGIELSKI Rys. 3. Algorytm postępowania przy identyfikacji gatunku M. kansasii (i) oraz ustaleniu typu genetycznego M. kansasii (ii) psów i ostronosów [64, 79]. Patogeneza mykobakterioz, w tym tych wywołanych przez prątki M. kansasii jest mało poznana, a wiedza dotycząca czynników wirulencji M. kansasii jest szczątkowa. Niewiele wiadomo także na temat mechanizmów odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie prątkiem M. kansasii. Można jedynie przypuszczać, że mechanizmy te zbliżone są do tych jakie poznano dla innych prątków, w tym przede wszystkim dla prątka gruźlicy. Ważną rolę w odpowiedzi immunologicznej odgrywa z pewnością tzw. I linia obrony, oparta o mechanizmy niespecyficzne, głównie mechanizmy oczyszczania układu oddechowego. Gdy mykobakterie pokonają tę barierę, pobudzone zostają mechanizmy odpowiedzi komórkowej, a w dalszym etapie, odpowiedzi humoralnej gospodarza. Przy tym największe znaczenie w infekcji prątkowej ma odpowiedź komórkowa [82, 98]. W początkowej fazie zakażenia, prątki wychwytywane są przez makrofagi. Pochłanianie mykobakterii przez makrofagi możliwe jest dzięki zlokalizowanym na ich powierzchni receptorom, rozpoznającym specyficzne ligandy prątkowe – receptorom dopełniacza (CR1, CR3, CR4), receptorom mannozowo-fukozylowym, Toll-podobnym (TLR – Toll like receptors), integrynowym, fibronektyny oraz receptorom zmiataczom [91, 98, 108]. Prątki znajdujące się w makrofagach mogą być zabite i strawione bądź utrzymywać się w fagosomach, indukować apoptozę makrofagów, czy wreszcie namnażać się doprowadzając do niszczenia makrofagów i rozsiewu w organizmie [82]. Zdolność do hamo- wania tworzenia fagolizosomu zaobserowano dla prątków M. tuberculosis, M. avium i M. marinum, ale nie dla M. lepraemurium [19]. W aktywowanych makrofagach dochodzi do produkcji reaktywnych form tlenu i azotu, toksycznych dla prątków. Aktywne makrofagi produkują także cytokiny (między innymi TNF-α) sprzyjające rozwojowi stanu zapalnego, a także wydzielają IL-12, która indukuje różnicowanie limfocytów T w kierunku komórek typu Th1, wspierających odpowiedź komórkową. Makrofagi aktywują też komórki NK (natural killers) wykazujące aktywność cytotoksyczną wobec makrofagów zawierających prątki [74]. Poza makrofagami, w fagocytozę prątków zaangażowane są również komórki dendrytyczne [98], komórki M [73, 100] oraz neutrofile [66]. Zarówno dla prątków M. tuberculosis, jak i M. marinum, wykazano, że makrofagi zaangażowane są w migrację bakterii do głębszych tkanek [19]. W przypadku infekcji M. tuberculosis, około 2 tygodnie po zakażeniu następuje rozwój swoistej odpowiedzi komórkowej. Limfocyty T rozpoznają antygeny prątków i różnicują w efektorowe limfocyty T CD4+ i CD8+ z receptorami α/β. Limfocyty Th1 CD4+, rozpoznają antygeny prezentowane przez komórki prezentujące antygen (APC, antigen presenting cells), w połączeniu z cząsteczkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC, major histocompatibility com­ plex) klasy II, a także wydzielają m.in. IFN-γ, który stymuluje ekspresję antygenów zgodności tkankowej na powierzchni makrofagów oraz indukuje syntezę enzymów lizosomalnych, sprzyjając eliminacji zaka- MYCOBACTERIUM KANSASII: BIOLOGIA PATOGENU ORAZ CECHY KLINICZNE I EPIDEMIOLOGICZNE ZAKAŻEŃ żonych komórek [67]. Limfocyty cytotoksyczne CD8+ indukują apoptozę zakażonych komórek po rozpoznaniu antygenu w kontekście cząsteczek MHC klasy I [115] uwalniając ziarna cytolityczne zawierające perforyny i granzymy. Ponadto, limfocyty CD8+ wydzielają szereg cytokin, w tym tak ważny w odpowiedzi przeciwprątkowej INF-γ [92]. W odpowiedź przeciwprątkową zaangażowane są także limfocyty T γ/δ noszące cechy zarówno limfocytów T, jak i komórek NK. Są one zdolne do rozpoznawania antygenów, nie prezentowanych w cząsteczce MHC [116]. Podsumowując, przebieg zakażenia prątkowego zależy głównie od równowagi pomiędzy rozwojem prątków w makrofagach a odpowiedzią immunologiczną gospodarza, w szczególności niszczeniem prątków przez komórki fagocytarne. Chociaż molekularne aspekty zakażeń M. kansasii nie są prawie w ogóle poznane, wydaje się, że mogą one, przynajmniej w pewnym stopniu, być zbieżne z obserwacjami dla innych prątków atypowych i prątków gruźlicy. Wykazano, że znajdujące się wewnątrz komórki eukariotycznej prątki M. kansasii aktywują kaspazę 1 a następnie sekrecję interleukiny IL-1β na drodze aktywacji kompleksu białek cytoplazmatycznych NLRP-3/ ASC, biorących udział w procesie zapalnym. W aktywacji tego kompleksu istotną rolę odgrywają także pompy potasowe, katepsyna B i produkcja reaktywnych form tlenu [17]. Niewiele wiadomo na temat indukcji apoptozy makrofagów przez prątki M. kansasii. Wykazano, że szczep kliniczny M. kansasii SM-1 indukował śmierć większej liczby komórek makrofagowej linii komórkowej RAW 264.7 aniżeli szczep referencyjny ATCC12478. Wykazano także, że apoptoza indukowana prątkami M. kansasii jest związana ze stresem retikulum endoplazmatycznego, a kliniczny szczep SM-1 indukuje silniejszą odpowiedź stresową w linii RAW 264.7 w porównaniu ze szczepem referencyjnym. Stężenie reaktywnych form tlenu wzrosło tylko w komórkach zakażonych szczepem klinicznym [55]. W innych badaniach wykazano, że za indukcję apoptozy makrofagów może być odpowiedzialny składnik ściany komórkowej Kan-LM, lipomannan M. kansasii [38]. Istotne jest, że apoptoza makrofagów prowadzi do eliminowania sfagocytowanych drobnoustrojów, podczas gdy nekroza jest związana z uwalnianiem wewnątrzkomórkowych patogenów i enzymów lizosomalnych, co w konsekwencji prowadzi do rozprzestrzenienia zakażenia i uszkodzenia tkanek. Wyniki badań wskazują, że ludzkie makrofagi zakażone prątkami mogą prezentować oba typy śmierci komórki. Im wyższa wirulencja szczepu, tym bardziej przeważa mechanizm nekrotyczny makrofagów nad apoptozą [33]. Prątki wykształciły wiele mechanizmów, które chronią je przed działaniem bakteriobójczych czynników 247 ludzkiego organizmu. Na pewno istotną rolę u prątków M. kansasii odgrywa budowa ściany komórkowej. Kwasy mykolowe, które tworzą silnie hydrofobową powierzchnię komórki, chronią prątki przed działaniem lizozymu, proteaz, wolnych rodników i składowych układu dopełniacza. Lipoarabinomannan ogranicza wytwarzanie wolnych rodników tlenowych i ekspresję cząsteczek MHC klasy II oraz powierzchniowych sulfatydów. Wykazano także, że niektóre gatunki prątków dzięki posiadaniu takich enzymów, jak katalaza oraz dysmutaza ponadtlenkowa mogą przeżyć w makrofagach także po wykształceniu fagolizosomu [108]. Może to tłumaczyć wyższą wirulencję szczepów M. kansasii z wysoką aktywnością katalazy [95]. Stosunkowo częste współwystępowanie prątków M. kansasii w habitacie człowieka w zderzeniu z niewielką liczbą infekcji wywoływanych przez ten patogen wskazuje na jego niską wirulencję i inwazyjność. Wyniki przeprowadzonych dotychczas badań sugerują, że typ I M. kansasii jest najbardziej rozpowszechniony wśród szczepów klinicznych na całym świecie, w tym także w Polsce [9] i rzadko izolowany jest ze środowiska. W badaniach przeprowadzonych do tej pory wykazano, że szczepy M. kansasii odpowiedzialne za zakażenia u ludzi należą niemal wyłącznie do typu I i II. Co ciekawe, pacjenci HIV-seropozytywni są szczególnie podatni na zakażenie typem II M. kansasii [69, 97, 103]. Związek między typem II M. kansasii a HIV-seropozytywnością można tłumaczyć niskim potencjałem chorobotwórczym tego genotypu [97]. Genetyczne podstawy zróżnicowanej wirulencji różnych typów genetycznych M. kansasii nie są znane. 6.2. Źródła zakażeń Uważa się, że głównym źródłem zakażeń prątkami M. kansasii, podobnie jak w przypadku innych NTM, jest środowisko. Drobnoustrój ten jest często izolowany z próbek wody, szczególnie wody wodociągowej, którą uważa się za główny rezerwuar patogenu. Rzadziej izolowany jest z próbek gleby i naturalnych zbiorników wodnych. Odnotowano także kilka doniesień dotyczących izolacji prątków M. kansasii z innych typów próbek, jak np. tkanek zwierzęcych. Wykazano także, że prątki M. kansasii nie są izolowane z próbek środowiskowych na niektórych obszarach np. z wody pochodzącej z New Hampshire, Bostonu, Finlandii, Kenii, Zairu, czy próbek gleby z Ugandy [107]. Długoterminowe badania dotyczące izolacji prątków M. kansasii z próbek środowiskowych pokazują, że obecność tego patogenu w próbkach jest niestała i zmienia się w czasie. Badania pokazują także, że prątki M. kansasii częściej izolowane są z obszarów miejskich niż wiejs­kich [4, 114]. Związek między naturalnym rezerwuarem prątków M. kansasii a chorobą u ludzi pozostaje wciąż w dużej 248 ZOFIA BAKUŁA, ALEKSANDRA SAFIANOWSKA, MAGDALENA NOWACKA-MAZUREK, JACEK BIELECKI, TOMASZ JAGIELSKI mierze niejasny. Wykazano, że bakterie te izolowane są z próbek wody wodociągowej w rejonach, z których pochodzą pacjenci z rozpoznaną mykobakteriozą [29]. Do zakażenia prątkiem M. kansasii dochodzi naj­prawdo­podobniej w wyniku bezpośredniego kontaktu ze źródłem patogenu. Wrota infekcji nie są znane, chociaż niektórzy badacze wskazują jako główną drogę wnikania – drogę wziewną [34]. Transmisja zakażeń między ludźmi nie została potwierdzona. sowało kortykosterydy, a blisko 10% przyjmowało inne leki immunosupresyjne [39]. Zakażenie prątkami M. kansasii stwierdza się także z innymi przewlekłymi chorobami, takimi jak: przewlekłe zapalenie wątroby, czy anoreksja [20]. Należy zaznaczyć, że mykobakterioza płuc wywołana przez prątki M. kansasii nawet w około 40% przypadków może przebiegać bez wcześniejszych chorób układu oddechowego [94] 6.3. Czynniki ryzyka 6.4. Rozpoznanie W 1996 roku, F a l k i n h a m i wsp. wskazali jako czynniki ryzyka zakażeń prątkami M. kansasii przewlekłe choroby płuc, takie jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP, COPD, chronic obstructive pul­ monary disease), pylica płuc, a także uzależnienie od nikotyny i alkoholu. Zwiększone ryzyko zachorowania na mykobakteriozę powodowaną przez M. kansasii zaobserwowano także u chorych na nowotwory oraz narażonych na pył w miejscu pracy (kopalnie, zakłady metalowe, huty szkła) [29]. W 2004 roku przeprowadzono analizę 302 przypadków płucnej infekcji prątkami M. kansasii. Wykazano, że 73% pacjentów było palaczami, 65% cierpiało na POChP, a 56% nadużywało alkoholu. Wśród 24 śmiertelnych przypadków, 96% pacjentów cierpiało na POChP [58]. Poza miejscowymi zmianami struktury i funkcji płuc w przebiegu przebytych lub współistniejących chorób kolejna grupa czynników ryzyka zachorowania na mykobakteriozę powodowaną przez M. kan­ sasii związana jest z ogólnoustrojowymi zaburzeniami odporności. Zazwyczaj uogólnione zakażenie wywołane prątkami M. kansasii rozwija się u chorych z upośledzeniem odporności powstałym na przykład w wyniku leczenia nowotworów złośliwych, terapii lekami anty-TNF-α, czy też u zakażonych HIV, szczególnie u chorych na AIDS. W tej ostatniej grupie chorych ryzyko wzrasta wraz z obniżaniem liczby komórek typu CD4+ [13, 111]. Mykobakteriozy występują również częściej u osób z uwarunkowanymi genetycznie nieprawidłowościami receptora IFN-γ, nieprawidłowościami IL-12 oraz podczas długotrwałego leczenia kortykosteroidami. Prątki M. kansasii zajmują pierwsze miejsce pod względem najczęściej izolowanych prątków niegruźliczych u osób po transplantacji serca, a drugie miejsce – u osób po transplantacji nerek, i odpowiadają za blisko czwartą część wszystkich przypadków zakażeń NTM u tych pacjentów [26]. Z przeprowadzonej w 2010 roku analizy piśmiennictwa kazuistycznego, spośród 67 pacjentów HIV-seronegatywnych z uogólnioną postacią mykobakteriozy, u 36% współistniała ona z chorobą układu krwiotwórczego (białaczki, zespoły mielodysplastyczne, nowotwory mieloproliferacyjne), 23% pacjentów w terapii innych chorób sto- Właściwe rozpoznanie choroby wywołanej prątkami M. kansasii oparte jest o wnikliwe badanie kliniczne i laboratoryjne, wymagające syntetycznej oceny danych klinicznych, radiologicznych i mikrobiologicznych. Rozpoznanie mykobakteriozy wywołanej prątkami M. kansasii jest trudne. Zdarzają się rozpoznania fałszywie dodatnie z powodu zanieczyszczenia badanych materiałów biologicznych, np. wodą wodociągową, jednak kontaminacja środowiskowa występuje rzadziej niż w przypadku innych prątków NTM. Często zakażenia M. kansasii diagnozowane są także jako gruźlica, ze względu na bardzo podobną płucną manifestację choroby. Według wytycznych ATS z 2007 roku mykobakteriozę płuc rozpoznać można wyłącznie, gdy chory spełnia odpowiednie kryteria mikrobiologiczne i kliniczne [36]. Musi być to równoczesne spełnienie co najmniej jednego z kryteriów mikrobiologicznych oraz pełnego kryterium klinicznego. Kryteria mikrobiologiczne: (i) pozytywne wyniki posiewów dwóch niezależnych próbek plwociny, (ii) pozytywne wyniki co najmniej jednej hodowli popłuczyn oskrzelowych lub popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF, bronchoalveolar lavage fluid), (iii) wynik badania histopatologicznego wskazujący na obecność zakażenia mykobakteryjnego i równocześnie dodatni wynik hodowli materiału z biopsji płuca, (iv) odpowiedni wynik badania histopatologicznego materiału z biopsji płuca oraz dodatni wynik hodowli co najmniej jednej próbki plwociny, popłuczyn oskrzelowych lub BALF; kryteria kliniczne (i) objawy choroby układu oddechowego (takie jak kaszel, krwioplucie, duszność, stany gorączkowe, utrata masy ciała, poty nocne), z towarzyszącymi zmianami stwierdzanymi w badaniach obrazowych (zmiany guzkowe lub jamy lub rozstrzenia oskrzeli z drobnymi guzkami), (ii) wykluczenie innych chorób. Wytyczne te budzą jednak pewne kontrowersje. U chorych na AIDS, infekcja prątkiem M. kansasii może dość szybko doprowadzić do zgonu, dlatego istotne jest natychmiastowe rozpoczęcie leczenia. Niektórzy badacze sugerują, że już pojedynczy wynik posiewu powinien być wystarczającym wskaźnikiem do rozpoczęcia leczenia [18]. W rozpoznaniu uogólnionej postaci zakażenia prąt- MYCOBACTERIUM KANSASII: BIOLOGIA PATOGENU ORAZ CECHY KLINICZNE I EPIDEMIOLOGICZNE ZAKAŻEŃ kiem M. kansasii wykorzystuje się często próbki krwi i tkanki limfatycznej. Problem stanowią także mykobakteriozy płuc przebiegające w postaci guzków bądź guzów, bez towarzyszących objawów klinicznych. Diagnoza różnicowa zakażeń prątkami M. kansasii obejmuje gruźlicę oraz pozostałe mykobakteriozy (w tym przede wszystkim zakażenia prątkami Mycobacterium avium), aktynomykozę, aspergilozę, histoplazmozę oraz sporotrychozę. 6.5. Obraz kliniczny Najczęstszą postacią kliniczną jaką przybiera zakażenie prątkami M. kansasii jest przewlekła choroba płuc przypominająca gruźlicę (rys. 4). Znacznie rzadziej dochodzi do zakażeń tkanek innych niż płuca, np. węzłów chłonnych (głównie u dzieci; przypadki bardzo rzadkie), układu mięśniowo-szkieletowego, czy skóry (infekcja zajmuję skórę oraz tkankę podskórną, najczęściej towarzyszy chorobie uogólnionej). Prątki M. kansasii mogą być również przyczyną zakażeń sztucznych zastawek serca, zapalenia wsierdzia, a także innych zakażeń związanych z przerwaniem ciągłości tkanek podczas operacji lub innych zabiegów medycznych. Zakażenia prątkami M. kansasii mogą mieć także postać choroby uogólnionej (systemowej), zazwyczaj u chorych z upośledzoną odpornością. W płucnej postaci choroby wywołanej zakażeniem prątkami M. kansasii wśród objawów występują: kaszel (stwierdzany jest u 91% pacjentów), odkrztuszanie plwociny (85%), spadek wagi (53%), duszność (51%), bóle w klatce piersiowej (34%), krwioplucie (32%) oraz Rys. 4. Mykobakterioza płuc wywołana zakażeniem M. kansasii. Na zdjęciu z tomografii komputerowej widoczne zmiany jamiste i guzkowate zagęszczenia w prawym płucu 249 gorączka i pocenie się (17%) [28]. Wyniki badań radiologicznych są podobne do tych uzyskiwanych od osób chorych na gruźlicę. W najczęstszej postaci radiologicznej dominują zmiany jamiste, naciekowo-jamiste lub włóknisto-jamiste, zlokalizowane najczęś­ciej w płatach górnych. Ta postać przypomina zmiany obserwowane u chorych na gruźlicę i określana jest jako typ 1 lub gruźliczopodobny. Wśród chorych z tą postacią mykobakteriozy dominują mężczyźni, prawdo­ podobnie z powodu większego rozpowszechnienia nałogu palenia tytoniu i częstszego występowania POChP [22]. Drugą postać mykobakteriozy płuc stanowią zmiany guzkowo-rozstrzeniowe zlokalizowane najczęściej w środkowych i dolnych płatach. W tym wypadku zalecane jest wykonanie wysokorozdzielczej tomografii komputerowej płuc (HRCT, high resolution computer tomography), w którym to badaniu można uwidocznić: drobne guzki, zacienienia o typie pączkującego drzewa (tree-in-bud) oraz walcowate rozstrzenia oskrzeli [36]. Opisano również przypadki o zupełnie nietypowym przebiegu (zakażenie sekwestru płuca, owrzodzenia w błonie śluzowej oskrzeli, pojedynczy guzek płuca) [2, 56, 59]. U osób z AIDS, u których doszło do zakażenia prątkami M. kansasii płucna postać kliniczna stanowi połowę przypadków [16, 112]. Zakażenie prątkami M. kansasii może zająć skórę oraz tkankę podskórną. Zwykle do zakażenia dochodzi w wyniku urazu bądź po operacjach. Rozpoznanie opiera się na analizie wyniku badania histopatologicznego. Choroba przyjmuje postać zmian guzkowych i nierówności na skórze, z początku małych, wraz z postępem choroby – z tendencją do progresji. W późniejszym obrazie choroby obserwuje się martwicę tkanki. Zakażenia skórne rozwijają się zwykle powoli i nie wykazują skłonności do samorzutnego gojenia się. Zakażenia obejmujące tylko skórę są dość rzadkie [45]. Infekcja może dalej rozprzestrzeniać się powodując zapalenie węzłów chłonnych, oddalonych narządów, a także prowadzić do choroby uogólnionej. Zapalenie węzłów chłonnych, głównie szyjnych, wywołane przez prątki M. kansasii diagnozowane jest zwykle u dzieci oraz u osób chorych na AIDS [32, 75]. Węzły chłonne powiększają się szybko i jednostronnie. Rozpoznanie opiera się na badaniu histopatologicznym oraz uzyskaniu wzrostu prątków M. kansasii w hodowli. Zakażenie uogólnione prątkami M. kansasii występuje głównie u osób z upośledzeniem odporności. U chorych obserwuje się obniżoną liczbą komórek CD4+ [11, 16]. U chorych zakażonych HIV (w tej grupie rozsiana infekcja występuje u około czwartej części zakażonych prątkami M. kansasii) objawy zakażenia rozsianego są niespecyficzne. Zwykle jest to gorączka, poty, utrata masy ciała, ból brzucha, biegunka. U osób HIV-seronegatywnych zakażenie rozsiane prątkiem 250 ZOFIA BAKUŁA, ALEKSANDRA SAFIANOWSKA, MAGDALENA NOWACKA-MAZUREK, JACEK BIELECKI, TOMASZ JAGIELSKI M. kansasii objawia się często podskórnymi guzkami lub ropniami [39]. Analiza retrospektywna 63 przypadków rozsianej infekcji wywołanej prątkami M. kansasii (lata: 1953–2007) wykazała, że częściej dotyczy mężczyzn (czterokrotnie częściej niż kobiet) w wieku od 45,0 ± 22,3 lat. Zakażeniem objęte są głównie płuca, ale także węzły chłonne, śledziona, wątroba, szpik kostny, skóra oraz układ kostny, przewód pokarmowy i moczowy [39]. 7. Leczenie Skuteczne schematy leczenia schorzeń wywoływanych przez prątki M. kansasii są ciągle na etapie opracowywania. Najczęściej stosowana jest antybiotykoterapia, przy czym monoterapia nie przynosi oczekiwanych efektów. W wypadku zakażeń prątkami M. kansasii sporadycznie korzysta się z leczenia chirurgicznego. Większość szczepów M. kansasii w badaniach in vitro jest oporna na izoniazyd (INH) i pyrazynamid (PZA) oraz niskie stężenia streptomycyny (SM) oraz kwasu p-aminosalicylowego (PAS) [110]. Oporność na INH i SM, stwierdzana często w badaniach in vitro, nie znajduje potwierdzenia w obserwacji klinicznej, gdzie surowicze stężenia tych leków są wyższe niż w testach lekowrażliwości. Stąd zalecane jest, aby w zakażeniach prątkami M. kansasii oznaczać wstępnie tylko wrażliwość na ryfampicynę (RMP) – podstawowy lek w leczeniu mykobakteriozy wywołanej przez ten patogen. Dodatkowo wykazano, że oporność szczepów M. kansasii na INH lub etambutol (EMB) zwykle powiązana jest z opornością na RMP [7]. Zgodnie z wytycznymi ATS w leczeniu zakażeń prątkami M. kansasii zaleca się terapię kombinowaną, składającą się z RMP (10 mg/kg/dobę), INH (5 mg/kg/ dobę) i EMB (15 mg/kg/dobę). U chorych z ciężką lub rozległą postacią choroby można rozważyć dołączenie aminoglikozydu (amikacyny (Am) lub SM w dawce 15 mg/kg, 3 razy w tygodniu) przez okres 2–3 miesięcy. Terapia powinna trwać minimum 18 miesięcy, i co najmniej 12 miesięcy od momentu odprątkowania, (tj. negatywizacji wyników posiewu) [36]. Kliniczną poprawę uzyskuje się zwykle po 3–6 miesiącach leczenia. Badania wykazały także skuteczność 3-lekowej terapii RMP+EMB+Am [41]. W sytuacji gdy stwierdzono obecność szczepów opornych na RMP, stosuje się schematy trójlekowe zawierające EMB, SM, klarytromycynę lub azytromycynę, lewofloksacynę, moksifloksacynę lub sulfametoksazol. Stosowanie ryfabutyny, jako leku wykazującego mniejszą interakcję z lekami antyretrowirusowymi, jest preferowane u chorych zakażonych HIV. U osób poddanych terapii antyretrowirusowej zalecana może być także zamiana RMP na moksifloksacynę. Przeprowadzono liczne analizy dotyczące przeszłych i aktualnych schematów leczenia zakażeń prątkami M. kansasii. Badania dotyczące terapii sprzed okresu stosowania RMP, po 6 miesiącach leczenia wykazywały konwersję plwociny na poziomie od 52 do 81%, a odsetek nawrotów na poziomie 10% [68]. Dzięki zastosowaniu RMP, wyniki leczenia farmakologicznego zakażeń prątkami M. kansasii uległy znaczącej poprawie. Konwersja plwociny po 4 miesiącach leczenia w schemacie zawierającym RMP wynosiła 100% u 180 pacjentów z trzech niezależnych badań [5, 6, 68]. Nawroty zaobserwowano jedynie u 0,8% pacjentów. Ponieważ trwające ok. 18 miesięcy leczenie jest kosztowne i wymaga dużej dyscypliny od pacjenta (regularne, systematyczne przyjmowanie leków), trwają badania nad opracowaniem bardziej przyjaznych schematów terapeutycznych. Wykazano np., że dodawanie do klasycznego schematu leczenia SM dwa razy w tygodniu skutkowało wyleczeniem 39 (z 40) pacjentów już po 12 miesiącach trwania terapii [6]. W badaniach przeprowadzonych przez British Medical Research Council, podawano RMP oraz niską dawkę EMB przez 9 miesięcy 155 pacjentom. Konwersję plwociny obserwowano u 99,4% pacjentów, jednak liczba nawrotów po 5 latach od zakończenia leczenia wynosiła 10% [47]. Przeprowadzono także badania nad wyłączeniem EMB ze schematu trójlekowego po 6 miesiącach od rozpoczęcia leczenia. Pacjentów w liczbie 28 podzielono na dwie grupy: przyjmujących leki przez 12 i 18 miesięcy. Zaobserwowano konwersję plwociny u wszystkich pacjentów w obu grupach. Nawrót zaobserwowano tylko u jednej osoby z grupy krócej przyjmującej leki [90]. G r i f f i t h i wsp., badali skuteczność terapii opartej na podawaniu klarytromycyny, RMP i EMB 14 pacjentom z płucną postacią mykobakteriozy 3 razy w tygodniu. Wszyscy pacjenci zostali wyleczeni i u żadnego nie zaobserwowano nawrotów [35]. Powodem długiej terapii jest zapobieganie nawrotom. W badaniu w skróconym okresie 12-miesięcznego schematu leczenia po 4-letniej obserwacji stwierdzono 6,6% nawrotów mykobakteriozy [88]. 8. Podsumowanie Wiedza na temat zakażeń wywołanych przez prątki niegruźlicze, w tym prątki M. kansasii, jest bardzo ograniczona. Jeszcze do niedawna zagadnienie epidemiologii i patogenezy chorób wywołanych zakażeniami M. kansasii rzadko było przedmiotem poważniejszych opracowań w literaturze światowej, zaś krajowe piśmiennictwo w tym zakresie było niemal nieobecne. W ostatnich latach jednak, wraz z rosnącą prewalencją zakażeń NTM w świecie oraz coraz bogatszym zasobem metod badawczych, w tym przede wszystkim metod MYCOBACTERIUM KANSASII: BIOLOGIA PATOGENU ORAZ CECHY KLINICZNE I EPIDEMIOLOGICZNE ZAKAŻEŃ analizy genetycznej, obserwuje się coraz większe zainteresowanie prątkami niegruźliczymi. Pomimo wzrastającej wiedzy na temat zakażeń prątkami M. kansasii, nadal stanowią one poważne wyzwanie diagnostyczne i terapeutyczne. Szczególnie trudne bywa często odróżnienie zakażenia od kontaminacji. Identyfikacja gatunkowa i właściwa diagnoza są kosztowne i długotrwałe. Brakuje też wystandaryzowanych metod oznaczania lekowrażliwości. Niedostateczne są dane dotyczące lekooporności w szczepach M. kansasii czy mechanizmów wirulencji tego patogenu. Nie ustalone są także związki miedzy właściwościami genotypowymi a prezentowanym profilem fenotypowym. Istotne luki w wiedzy na temat prątków M. kansasii powodują, że epidemiologiczne aspekty zakażeń tymi bakteriami, w tym rezerwuar patogenu, zakaźność, drogi transmisji, rozpowszechnienie w różnych regionach geograficznych pozostają niejasne. * * * Artykuł powstał w ramach projektu badawczego «LIDER» realizowanego ze środków przyznanych przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (Nr: LIDER/044/457/L-4/12/NCBR/2013). Piśmiennictwo 1. Abdalla C.M., de Oliveira Z.N., Sotto M.N., Leite K.R., Canavez F.C., de Carvalho C.M.: Polymerase chain reaction compared to other laboratory findings and to clinical evaluation in the diagnosis of cutaneous tuberculosis and atypical mycobacteria skin infection. Int. J. Dermatol. 48, 27–35 (2009) 2.Abe M., Kobashi Y., Mouri K., Obase Y., Miyashita N., Nakata M., Oka M.: Solitary pulmonary nodule due to Myco­ bacterium kansasii. Intern. Med. 50, 775–778 (2011) 3. Abed Y., Bollet C., de Micco P.: Demonstration of Mycobacte­ rium kansasii species heterogeneity by the amplification of the 16S–23S spacer region. J. Med. Microbiol. 42, 112–114 (1995) 4. Ahn C.H., Lowell J.R., Ahn S.S., Ahn S., Hurst G.A.: Chemotherapy for pulmonary disease due to Mycobacterium kansasii: efficacies of some individual drugs. Rev. Infect. Dis. 3, 1028–1034 (1981) 5.Ahn C.H., Lowell J.R., Ahn S.S., Ahn S., Hurst G.A.: Short-course chemotherapy for pulmonary disease caused by Myco­ bacterium kansasii. Am. Rev. Respir. Dis. 128, 1048–1050 (1983) 6. Ahn C.H., Lowell J.R., Onstad G.D., Shuford E.H., Hurst G.A.: A demographic study of disease due to Mycobacterium kansasii or M. intracellulare-avium in Texas. Chest, 75, 120–125 (1979) 7. Ahn C.H., Wallace R.J. , Steele L.C., Murphy D.T.: Sulfonamidecontaining regimens for disease caused by rifampin-resistant Mycobacterium kansasii. Am. Rev. Respir. Dis. 135, 10–16 (1987) 8.Amorim A., Macedo R., Lopes A., Rodrigues I., Pereira E., Scand J.: Non-tuberculous mycobacteria in HIV-negative patients with pulmonary disease in Lisbon, Portugal. Infect. Dis. 42, 626–628 (2010) 9. Bakuła Z., Safianowska A., Nowacka-Mazurek M., Bielecki J., Jagielski T.: Subtyping of Mycobacterium kansasii by PCR-restriction enzyme analysis of the hsp65 gene. Biomed Res. Int. 2013, 178725 (2013) 251 10. Bittner M.J., Horowitz E.A., Safranek T.J., Preheim L.C.: Emergence of Mycobacterium kansasii as the leading mycobacterial pathogen isolated over a 20-year period at a midwestern Veterans Affairs hospital. Clin. Infect. Dis. 22, 1109–1110 (1996) 11. Bloch K.C., Zwerling L., Pletcher M.J., Hahn J.A., Gerberding J.L., Ostroff S.M., Vugia D.J., Reingold A.L.: Incidence and clinical implications of isolation of Mycobacterium kansasii: results of a 5-year, population-based study. Ann. Intern. Med. 129, 698–704 (1998) 12. Braun E., Sprecher H., Davidson S., Kassis I.: Epidemiology and clinical significance of non-tuberculous mycobacteria isolated from pulmonary specimens. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 17, 96–99 (2013) 13.Breathnach A., Levell N., Munro C., Natarajan S., Pedler S.: Cutaneous Mycobacterium kansasii infection: case report and review. Clin. Infect. Dis. 20, 812–817 (1995) 14. Brunello F., Ligozzi M., Cristelli E., Bonora S., Tortoli E., Fontana R.: Identification of 54 mycobacterial species by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene. J. Clin. Microbiol. 39, 2799–2806 (2001) 15. Butler W.R. i Kilburn J.P.: Identification of major slowly growing pathogenic mycobacteria and Mycobacterium gordonae by high-performance liquid chromatography of their mycolic acids. J. Clin. Microbiol. 30, 2402–2407 (1988) 16. Campo R.E., Campo C.E.: Mycobacterium kansasii disease in patients infected with human immunodeficiency virus. Clin. Infect. Dis. 24, 1233–1238 (1997) 17.Chen C.C., Tsai S.H., Lu C.C., Hu S.T., Wu T.S., Huang T.T., Saïd-Sadier N., Ojcius D.M., Lai H.C.: Activation of an NLRP3 inflammasome restricts Mycobacterium kansasii infection. PLoS One, 7, e36293 (2012) 18.Corbett E.L., Blumberg L., Churchyard G.J., Moloi N., Mallory K., Clayton T., Williams B.G., Chaisson R.E., Hayes R.J., De Cock K.M.: Nontuberculous mycobacteria defining disease in a prospective cohort of South African miners. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 160, 15–21 (1999) 19. Cosma C.L., Sherman D.R., Ramakrishnan L.: The secret lives of the pathogenic mycobacteria. Annu. Rev. Microbiol. 57, 641–676 (2003) 20. Cosson M.A., Morand P.C. i wsp.: Temporal interferon-gamma release response to Mycobacterium kansasii infection in an anorexia nervosa patient. J. Med. Microbiol. 61, 1617–1620 (2012) 21. Daley C.L., Griffith D.E.: Pulmonary non-tuberculous mycobacterial infections. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 14, 665–671 (2010) 22. Daley C.L., Heifets L.: Other mycobacteria causing human disease (w) Tuberculosis a comprehensive clinical reference, red. H.S. Schaaf, A. Zumla, Saunders, Philadelphia, 2009, s. 60–74. 23. David H.L.: Carotenoid Pigments of Mycobacterium kansasii. Appl. Microbiol. 28, 696–699 (1974) 24. Davies B.S., Roberts C.H., Kaul S., Klein J.L., Milburn H.J.: Non-tuberculous slow-growing mycobacterial pulmonary infections in non-HIV-infected patients in south London. Scand. J. Infect. Dis. 44, 815–819 (2012) 25. Devallois A., Goh K.S., Rastogi N.: Rapid identification of mycobacteria to species level by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene and proposition of an algorithm to differentiate 34 mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 35, 2969–2973 (1997) 26.Doucette K., Fishman J.A.: Nontuberculous mycobacterial infection in hematopoietic stem cell and solid organ transplant recipients. Clin. Infect. Dis. 38, 1428–1439 (2004) 27.Eaton T., Falkinham III J.O., von Reyn C.F.: Recovery of Mycobacterium avium from cigarettes. J. Clin. Microbiol. 33, 2757–2758 (1995) 252 ZOFIA BAKUŁA, ALEKSANDRA SAFIANOWSKA, MAGDALENA NOWACKA-MAZUREK, JACEK BIELECKI, TOMASZ JAGIELSKI 28. Evans S.A., Colville A., Evans A.J.: Pulmonary Mycobacterium kansasii infection: comparison of the clinical features, treatment and outcome with pulmonary tuberculosis. Thorax, 51, 1248–1252 (1996) 29. Falkinham J.O.: Nontuberculous mycobacteria in the environment. Clin. Chest Med. 23, 529–551 (2002) 30. Falkinham, J.O.: Surrounded by mycobacteria: nontuberculous mycobacteria in the human environment. J. Appl. Microbiol. 107, 356–367 (2009) 31. Fangrat A., Walkiewicz R., Safianowska A., Grubek-Jaworska H., Chazan R.: Identyfikacja gatunkowa prątków z rodzaju Mycobacterium na podstawie analizy polimorfizmu genu hsp65 z użyciem techniki PCR-RFLP. Pneumonol. Alergol. Pol. 74, 95–100 (2006) 32. Flint D., Mahadevan M., Barber C., Grayson D., Small R.: Cervical lymphadenitis due to non-tuberculous mycobacteria: surgical treatment and review. Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 53, 187–194 (2000) 33. Gil D.P., León L.G., Correa L.I., Maya J.R., París S.C., García L.F., Rojas M.: Differential induction of apoptosis and necrosis in monocytes from patients with tuberculosis and healthy control subjects. J. Infect. Dis. 189, 2120–2128 (2004) 34.Griffith D.E., Brown-Elliott B.A., Wallace R.J.: Thrice-weekly clarithromycin-containing regimen for treatment of Mycobac­ terium kansasii lung disease: results of a preliminary study. Clin. Infect. Dis. 37, 1178–1182 (2003) 35.Griffith D.E.: Management of disease due to Mycobacterium kansasii. Clin. Chest Med. 23, 613–621 (2002) 36. Griffith D.E., Winthrop K. i wsp.: ATS Mycobacterial Diseases Subcommittee; American Thoracic Society; Infectious Disease Society of America. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, 367–416 (2007) 37. Grubek-Jaworska H., Walkiewicz R., Safianowska A., Nowacka-Mazurek M., Krenke R., Przybyłowski T., Chazan R.: Nontuberculous mycobacterial infections among patients suspected of pulmonary tuberculosis. Europ. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 739–744 (2009) 38. Guérardel Y., Maes E., Briken V., Chirat F., Leroy Y., Locht C., Strecker G., Kremer L.: Lipomannan and lipoarabinomannan from a clinical isolate of Mycobacterium kansasii: novel structural features and apoptosis-inducing properties. J. Biol. Chem. 278, 36637–36651 (2003) 39. Han S.H., Kim J.M. i wsp.: Disseminated Mycobacterium kansasii infection associated with skin lesions: a case report and comprehensive review of the literature. J. Korean Med. Sci. 25, 304–308 (2010) 40. Heifets L.: Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria. Semin. Respir. Crit. Care Med. 25, 283–295 (2004) 41. Heurlin N., Petrini B.: Treatment of non-tuberculous mycobacterial infections in patients without AIDS. Scand. J. Infect. Dis. 25, 619–623 (1993) 42. Hoefsloot W., Wagner D. i wsp.: A snapshot of the geographic diversity of nontuberculous mycobacteria isolated from pulmonary samples: An NTM-net collaborative study. Eur. Respir. J. 42, 1604–1613 (2013) 43.Huang Z.H., Ross B.C, Dwyer B.: Identification of Mycobac­ terium kansasii by DNA hybridization. J. Clin. Microbiol. 29, 2125–2129 (1991) 44. Iseman M.D., Buschman D.L., Ackerson L.M.: Pectus excavatum and scoliosis: thoracic anomalies associated with pulmonary disease by Mycobacterium avium complex. Am. Rev. Respir. Dis. 144, 914–918 (1991) 45. James W.D., Berger T.G.: Mycobacterial diseases (w) Andrews’ diseases of the skin: clinical dermatology, red. G.R. Saunders, Elsevier, Filadelfia, 2011, rozdział 16. 46. Jenkins P.A., Banks J., Campbell I.A., Smith A.P.: Mycobacterium kansasii pulmonary infection: a prospective study of the results of nine months of treatment with rifampicin and ethambutol. Thorax, 49, 442–445 (1994) 47. Jenkins P.A., Pattyn S.R., Portaels F., Diagnostic bacteriology (w) Nontuberculous Mycobacteria, red. C. Rattledge i J. Stanford, Academic Press Ltd., Londyn, 1982, s. 441–470. 48.Kennedy T.P., Weber D.J.: Nontuberculous mycobacteria. An underappreciated cause of geriatric lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 149, 1654–1658 (1994) 49.Kim B.J., Lee K.H., Park B.N., Kim S.J., Bal G.H., Kim S.J., Kook Y.H.: Differentiation of mycobacterial species by PCR-restriction analysis of DNA (343 base pairs) of the RNA polymerase gene (rpoB). J. Clin. Microbiol. 39, 2102–2109 (2001) 50. Kim R.D., Greenberg D.E., Ehrmantraut M.E.: Pulmonary nontuberculous mycobacterial disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 1066–1074 (2008) 51. Koh W.J., Lee J.H., Kwon Y.S., Lee K.S., Suh G.Y., Chung M.P., Kim H., Kwon O.J.: Prevalence of gastroesophageal reflux disease in patients with nontuberculous mycobacterial lung disease. Chest, 131, 1825–1830 (2007) 52. Kubín M., Svandová E., Medek B., Chobot S., Olsovský Z.: Myco­ bacterium kansasii infection in an endemic area of Czechoslovakia. Tubercle, 61, 207–212 (1980) 53. Lee A.S., Jelfs P., Sintchenko V., Gilbert G.L.: Identification of non-tuberculous mycobacteria: utility of the GenoType Mycobacterium CM/AS assay compared with HPLC and 16S rRNA gene sequencing. J. Med. Microbiol. 58, 900–904 (2009) 54. Lee W.J., Kang S.M., Sung H., Won C.H., Chang S.E., Lee M.W., Kim M.N., Choi J.H., Moon K.C.: Non-tuberculous mycobacterial infections of the skin: a retrospective study of 29 cases. J. Dermatol. 37, 965–972 (2010) 55. Lim J.L., Choi H.H., Choi J.A., Jeong J.A., Cho S.N., Lee J.H., Park J.B., Kim H.J., Song C.H.: Mycobacterium kansasii-induced death of murine macrophages involves endoplasmic reticulum stress responses mediated by reactive oxygen species generation or calpain activation. Apoptosis, 18, 150–159 (2013) 56. Lin S.H., Lee L.N., Chang Y.L., Lee Y.C., Ding L.W., Hsueh P.R.: Infected pulmonary sequestration caused by Mycobacterium kansasii. Thorax, 60, 355 (2005) 57.List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature – Baza LPSN (http://www.bacterio.net/m/mycobacterium.html) 58. Malivan N., Zvetina J.R.: Clinical features and follow up of 302 patients with Mycobacterium kansasii pulmonary infection: a 50 year experience. Postgrad. Med. J. 81, 530–533 (2005) 59. Manali E.D., Tomford W.J., Liao D.W., Farver C., Mehta A.C.: Mycobacterium kansasii endobronchial ulcer in a nonimmunocompromised patient. Respiration, 72, 305–308 (2005) 60. Marras T.K., Chedore P., Ying A.M,. Jamieson F.: Isolation prevalence of pulmonary nontuberculous mycobacteria in Ontario, 1997–2003. Thorax, 62, 661–666 (2007) 61. Marras T.K., Morris A., Gonzalez L.C., Daley C.L.: Mortality prediction in pulmonary Mycobacterium kansasii infection and Human Immunodeficiency Virus. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 793–798 (2004) 62. McMurray D.N., Mycobacteria & Nocaria. (w) Medical microbiology, red. S. Baron. University of Texas Medical Branch at Galveston, Galveston, 1996, rozdział 33. 63.Moore J.E., Kruijshaar M.E., Ormerod L.P., Drobniewski F., Abubakar A.: Increasing reports of non-tuberculous mycobacteria in England, Wales and Northern Ireland, 1995–2006. IBMC Public Health, 10, 612 (2010) 64. Murai A., Maruyama S., Nagata M., Yuki M:. Mastitis caused by Mycobacterium kansasii infection in a dog. Vet. Clin. Pathol. 42, 377–381 (2013) MYCOBACTERIUM KANSASII: BIOLOGIA PATOGENU ORAZ CECHY KLINICZNE I EPIDEMIOLOGICZNE ZAKAŻEŃ 65.Nowacka-Mazurek M.: Prątki gruźlicze jako czynniki etiologiczny choroby płuc. Praca doktorska. Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa, 2012 66.Peters J., Gatfield J.: Hijacking the host: survival of pathogenic mycobacteria inside macrophages. Trends Microbiol. 10, 142–146 (2002) 67. Petrofsky M., Bermudez L.E.: CD4+ T cells but not CD8+ or γδ+ lymphocytes are required for host protection against infection and dissemination through the intestinal route. Infect. Immun. 73, 2621–2627 (2005) 68.Pezzia W., Raleigh J.W., Bailey M.C., Toth E.A., Silverblatt J.: Treatment of pulmonary disease due to Mycobacterium kansasii: recent experience with rifampin. Rev. Infect. Dis. 3, 1035–1039 (1981) 69. Picardeau M., Prod’hom G., Raskine L., LePennec M.P., Vincent V.: Genotypic characterization of five subspecies of Myco­ bacterium kansasii. J. Clin. Microbiol. 35, 25–32 (1997) 70. Piersimoni C., Scarparo C.: Extrapulmonary infections associated with nontuberculous mycobacteria in immunocompetent persons. Emerg. Infect. Dis. 15, 1351–1358 (2009) 71. Pinner M.: Atypical acid-fast microorganisms. Am. Rev. Tuberc. 32, 424–445 (1935) 72. Plikaytis B.B., Plikaytis B.D., Mitchell A., Yakrus W., Butler R., Woodley C.L., Silcox V.A., Shinnick T.M.: Differentiation of slowly growing Mycobacterium species, including Mycobacte­ rium tuberculosis, by gene amplification and restriction fragment length polymorphism analysis. J. Clin. Microbiol. 30, 1815–1822 (1992) 73. Ponnusamy D., Periasamy S., Tripathi B.N., Pal A.: Mycobac­ terium avium subsp. paratuberculosis invades through M cells and enterocytes across ileal and jejunal mucosa of lambs. Res. Vet. Sci. 94, 306–312. 74. Reddy V., Andersen B.: Immunology of tuberculosis (w:) Mycobacteria – basic aspects, red. Gangadharm P.R.J., Jenkins P.A., 1998, s. 235–253. 75. Reddy V.C., Prasad C.E., Aparna S., Gokhale S., Anjeneyulu.: A study of mycobacterial species causing lymphadenitis. Southe­ ast Asian J. Trop. Med. Public Health. 39, 130–135 (2008) 76. Ribón W.: Biochemical isolation and identification of mycobacteria, biochemical testing. (w) InTech, red. J. C. Jimenez-Lopez, 2012, (http://www.intechopen.com/books/biochemical-testing/ biochemical-isolation-and-identification-of-mycobacteria) 77. Richter E., Niemann S., Rüsch-Gerdes S., Hoffner S.: Identification of Mycobacterium kansasii by using a DNA probe (AccuProbe) and molecular techniques. J. Clin. Microbiol. 37, 964–970 (1999) 78. Richter E., Rüsch-Gerdes S., Hillemann D.: Evaluation of the GenoType Mycobacterium assay for identification of mycobacterial species from cultures. J. Clin. Microbiol. 44, 1769–1775 (2006) 79.Rocha V.C., Corrêa S.H., Setzer A.P., Catão-Dias J.L., Ramos M.C., Fiori W., Ikuta C.Y., Ferreira Neto J.S.: Mycobac­ terium kansasii isolation from captive South American coati (Nasua nasua). J. Zoo Wildl. Med. 44, 167–168 (2013) 80. Ross B.C., Jackson K., Yang M., Sievers A., Dwyer B.: Identification of a genetically distinct subspecies of Mycobacterium kansasii. J. Clin. Microbiol. 30, 2930–2933 (1992) 81.Roth A., Fischer M., Hamid M.E., Michalke S., Ludwig W., Mauch H.: Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences J. Clin. Microbiol. 36, 139–147 (1998) 82. Rudnicka W.: Molekularne mechanizmy odporności na gruźlicę. Post. Mikrobiol. 43, 107–127 (2004) 83. Runyon E.H.: Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med. Clin. North Am. 43, 273–290 (1959) 253 84.Russo C., Tortoli E., Menichella D.: Evaluation of the new GenoType Mycobacterium assay for identification of mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 44, 334–339 (2006) 85.Safianowska A., Walkiewicz R., Grubek-Jaworska H., Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E., Glapiński J., Chazan R.: Analiza kwasów mikolowych różnych gatunków z rodzaju Mycobacterium metodą wysokociśnieniowej chromato­grafii cieczowej (HPLC). Pneumonol. Alergol. Pol. 70, 130–138 (2002) 86.Safianowska A., Walkiewicz R., Nejman-Gryz P., Chazan R., Grubek-Jaworska H.: Porównanie dwóch technik typowania prątków niegruźliczych: cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej i molekularnego systemu GenoType Mycobacterium CM/AS. Pneumonol. Alergol. Pol. 78, 363–368 (2010) 87.Salvana E.M., Cooper G.S., Salata R.A.: Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) infection: an emerging disease in infliximab-treated patients. J. Infect. 55, 484–487 (2007) 88.Santin M., Dorca J. i wsp.: Long term relapse after 12-month treatment for Mycobacterium kansasii lung disease. Eur. Respir. 33, 148–152 (2009) 89.Satyanarayana G., Heysell S.K., Scully K.W., Houpt E.R.: Mycobacterial infections in a large Virginia hospital, 2001–2009. BMC Infect. Dis. 5, 111–113 (2011) 90.Sauret J., Hernandez-Flix S., Castro E., Hernandez L., Ausina V., Coll P.: Treatment of pulmonary disease caused by Myco­ bacterium kansasii: results of 18 vs 12 months chemotherapy. Tuber. Lung Dis. 76, 104–108 (1995) 91.Schorey J.S., Carroll M.C., Brown E.J.: A macrophage inva­sion mechanism of pathogenic mycobacteria. Science, 227, 1091–1093 (1997) 92.Sexton P., Harrison A.C.: Susceptibility to nontuberculous mycobacterial lung disease. Eur. Respir. J. 31, 1322–1333 (2008) 93.Shin J.H., Cho E.J., Lee J.Y., Yu J.Y., Kang Y.H.: Novel diagnostic algorithm using tuf gene amplification and restriction fragment length polymorphism is promising tool for identification of nontuberculous mycobacteria. J. Microbiol. Biotechnol. 19, 323–330 (2009) 94.Shitrit D., Baum G.L. i wsp.: Pulmonary Mycobacterium kan­ sasii infection in Israel, 1999–2004: clinical features, drug susceptibility, and outcome. Chest, 129, 771–776 (2006) 95.Steadham, J.E.: High catalase Mycobacterium kansasii isolated from water in Texas. J. Clin. Microbiol. 11, 496–498 (1980) 96.Swanson D.S., Pan X., Kline M.W., McKinney Jr R.E., Yogev R., Lewis L.L.: Genetic diversity among Mycobacterium avium complex strains recovered from children with and without human immunodeficiency virus infection. J. Infect. Dis. 178, 776–782 (1998) 97.Taillard C., Prod’hom G. i wsp.: Clinical implications of Mycobacterium kansasii species heterogeneity: Swiss National Survey. J. Clin. Microbiol. 41, 1240–1244 (2003) 98.Tailleux L., Neyrolles O. i wsp.: DC-SIGN is the major Mycobac­ terium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J. Exp. Med. 197, 121–127 (2003) 99.Takewaki S., Okuzumi K., Manabe I., Tanimura M., Miyamura K., Nakahara K., Mazaki Y., Ohkubo A., Nagai R.: Nucleotide sequence comparison of the mycobacterial dnaJ gene and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacterial species. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 159–166 (1994) 100.Teitelbaum R., Schubert W., Gunther L., Kress Y., Macaluso F., Pollard J.W., McMurray D.N., Bloom B.R.: The M cell as a portal of entry to the lung for the bacterial pathogen Mycobacte­ rium tuberculosis. Immunity, 10, 641–650 (1999) 101.Telenti A., Marchesi F., Balz M., Bally F., Böttger E.C., Bodmer T.: Rapid identification of mycobacteria to the species level 254 ZOFIA BAKUŁA, ALEKSANDRA SAFIANOWSKA, MAGDALENA NOWACKA-MAZUREK, JACEK BIELECKI, TOMASZ JAGIELSKI by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J. Clin. Microbiol. 31, 175–178 (1993) 102.Tortoli E., Brusarosco G. i wsp.: Performance assessment of new multiplex probe assay for identification of mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 39, 1079–1084 (2001) 103.Tortoli E., Simonetti M.T., Lacchini C., Penati V., Urbano P.: Tentative evidence of AIDS-associated biotype of Mycobacte­ rium kansasii. J. Clin. Microbiol. 32, 1779–1782 (1994) 104.Tortoli E., Simonetti M.T., Lavinia F.: Evaluation of reformulated chemiluminescent DNA probe (AccuProbe) for culture identification of Mycobacterium kansasii. J. Clin. Microbiol. 34, 2838–2840 (1996) 105.van Ingen J., van Soolingen D. i wsp.: Characterization of Myco­ bacterium orygis as M. tuberculosis complex subspecies. Emerg. Infect. Dis. 18, 653–655 (2012) 106.van Ingen J.: Diagnosis of nontuberculous mycobacterial infections. Semin. Respir. Crit. Care. Med. 34, 103–109 (2013) 107.von Reyn C.F., Falkinham J.O. i wsp.: Isolation of Mycobacte­ rium avium complex from water in the United States, Finland, Zaire, and Kenya. J. Clin. Microbiol. 31, 3227–3230 (1993) 108.Vrba A., Kwiatkowska S.: Mycobacterium tuberculosis jako przykład patogenu wewnątrzkomórkowego. Wzajemne relacje między mikro- i makroorganizmem. Pol. Merk. Lek. 162, 508 (2009) 109.Walkiewicz R., Safianowska A., Grubek-Jaworska H., Nowacka-Mazurek M., Renke R., Przybyłowski T., Chazan R.: Frequency of mycobacterioses among the patients with positive cultures of nontuberculous mycobacteria (NTM) – 5 year study. Eur. J. Resp. J. Suppl. 48, 190 (2004) 110.Wallace R.J., O’Brien R., Glassroth J., Raleigh J., Dutt A.: Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am. Rev. Respir. Dis. 142, 940–953 (1990) 111.Wayne L.G., Sramek H.A.: Agents of newly recognized or infrequently encountered mycobacterial diseases. Clin. Microbiol. Reviev. 5, 1–25 (1992) 112.Witzig R.S., Fazal B.A., Mera R.M., Mushatt D.M., Dejace P.M., Greer D.L., Hyslop N.E.: Clinical manifestations and implica- tions of coinfection with Mycobacterium kansasii and human immunodeficiency virus type 1. Clin. Infect. Dis. 21, 77–85 (1995) 113.Wolinsky E.: Mycobacterial lymphadenitis in children: a prospective study of 105 nontuberculous cases with long-term follow-up. Clin. Infect. Dis. 20, 954–963 (1995) 114.Wolinsky E.: Nontuberculous mycobacteria and associated disease. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 107–159 (1979) 115.Woodworth J.S., Behar S.M.: Mycobacterium tuberculosis-specific CD8+ T cells and their role in immunity. Crit. Rev. Immu­ nol. 26, 317–352 (2006) 116.Xi X., Han X., Li. L., Zhao Z: γδ T cells response to Mycobac­ terium tuberculosis in pulmonary tuberculosis patients using preponderant complementary determinant region 3 sequence. Indian J. Med. Res. 134, 356–261 (2011) 117.Yajko D.M., Chin D.P., Gonzalez P.C., Nassos P.S., Hopewell P.C., Rheingold A.L.: Mycobacterium avium complex in water, food, and soil samples collected from the environment of HIV-infected individuals. J. AIDS Hum. Retroviruses, 9, 176–182 (1995) 118.Yang M., Ross B.C., Dwyer B.: Identification of an insertion sequence-like element in a subspecies of Mycobacterium kan­ sasii. J. Clin. Microbiol. 31, 2074–2079 (1993) 119.Yang M., Ross B.C., Dwyer B.: Isolation of a DNA probe for identification of Mycobacterium kansasii, including the genetic subgroup. J. Clin. Microbiol. 31, 2769–2772 (1993) 120.Yates M.D., Pozniak A., Grange J.M.: Isolation of mycobacteria from patients seropositive for the human immunodeficiency virus (HIV) in south east England: 1984–1992. Thorax, 48, 990–995 (1993) 121.Yim J.J., Park Y.K., Lew W.J., Bai G.H., Han S.K., Shim Y.S.: Mycobacterium kansasii pulmonary diseases in Korea. J. Korean Med. Sci. 20, 957–960 (2005) 122.Żbikowski H.: Występowanie prątków atypowych u chorych z gruźlicą płucną wybranych terenach kraju w latach 1970–1974. Pneum. Pol. 48, 357–366 (1980) POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 255–263 http://www.pm.microbiology.pl HAMOWANIE WZROSTU BAKTERII PRZEZ PEPTYDOWE KWASY NUKLEINOWE I ICH POTENCJALNA ROLA W BIOTECHNOLOGII Agnieszka Markowska-Zagrajek1, 3, Marcin Równicki2, 3, Joanna Trylska3* Zakład Fizjologii Zwierząt, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski 2 Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski 3 Centrum Nowych Technologii, Uniwersytet Warszawski 1 Wpłynęło w czerwcu 2014 r. 1. Wstęp. 2. Peptydowe kwasy nukleinowe (PNA) 3. Zalety i wady PNA. 4. Sposoby transportu PNA do komórek bakteryjnych. 5. Inhibicja wzrostu bakterii poprzez wiązanie się z bakteryjnym mRNA. 6. Inhibicja wzrostu bakterii poprzez wiązanie się z bakteryjnym rRNA. 7. Zastosowanie PNA w biotechnologii. 8. Podsumowanie Inhibition of bacterial translation and growth by antisense peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology Abstract: The broad use of antibiotics has resulted in the survival and spread of resistant bacterial strains. Bacteria can effectively acquire resistance when exposed to antibiotics. Therefore, it is crucial to find new antimicrobial drugs to combat antibiotic-resistant pathogens. Antisense technology involving targeting or modifying gene expression in a sequence-dependent manner has been applied to distinguish bacterial species, design antibacterials or in diagnostic applications. Typically, the bacterial target is either DNA or mRNA but there exist examples of bacterial ribosomal RNA targets. Natural oligonucleotides are unstable so in the antisense applications most often their modified versions are used. Synthetic nucleic acid analogues include locked nucleic acids, peptide nucleic acids (PNAs), and phosphorodiamidate morpholino oligomers. We will focus on the applications of PNAs, which are neutral DNA analogues containing a pseudo-peptide backbone instead of a charged phosphate one. PNA oligomers are not degraded by proteases and nucleases. Furthermore, PNAs are not recognized by RNases. PNA oligomers can efficiently hybridize with DNA or RNA strands, and form stable duplexes or triplexes. Here, we review the studies on the development of antisense PNA sequences targeting bacterial mRNAs and rRNAs. In addition, the future prospects on the use of PNA in biotechnology are discussed. 1. Introduction. 2. Peptide nucleic acids (PNAs). 3. Advantages and disadvantages of PNA. 4. Transport of PNA into bacterial cells. 5. Inhibition of bacterial growth by targeting bacterial mRNA. 6. Inhibition of bacterial growth by targeting bacterial rRNA. 7. The use of PNA in biotechnology. 8. Summary Słowa klucze:mRNA, peptydowe kwasy nukleinowe, rRNA, rybosom, technologia antysensowna Key words: antisense technology, mRNA, peptide nucleic acids, ribosome, rRNA 1. Wstęp Stosowanie antybiotyków na szeroką skalę w leczeniu ludzi i hodowli zwierząt, przyczyniło się do rozwinięcia oporności u bakterii na konwencjonalne antybiotyki [1]. Dlatego ważne jest znalezienie nowych narzędzi, za pomocą których można będzie zwalczać te drobnoustroje. Technologia antysensowna oparta o kontrolę ekspresji genów obecnie stosowana jest w bioinżynierii, w terapiach antynowotworowych oraz do projektowania nowych klas antybiotyków [24]. Tradycyjne metody antysensowne wykorzystują krótkie oligodeoksynukleotydy, które łączą się do specyficznego mRNA na zasadzie parowania zasad Wa t s o n a - C r i c k a [35]. Oligodeoksynukleotydy są jednak szybko degradowane przez nukleazy, więc możliwości użycia ich w technologii antysensownej są ograniczone. Ponieważ naturalne oligodeoksynukleotydy są niestabilne, dopiero wynalezienie ich zmodyfikowanych strukturalnie i chemicznie wersji przyczyniło się do rozwoju technologii antysensownej. Obecnie używa się syntetycznych analogów kwasów nukleinowych takich jak: (i) RNA zmetylowany w pozycji 2’O – 2’OMeRNA (2’O-methyl RNA), (ii) kwasy nukleinowe o usztywnionej konformacji – LNA (Locked Nucleic Acids), (iii) morfolino – PMO (Phosphorodiamidate Morpho­ lino Oligomers), czy (iv) peptydowe kwasy nukleinowe – PNA (Peptide Nucleic Acids). Przykładowe zmodyfikowane oligonukleotydy wraz z porównaniem do naturalnego DNA są przedstawione na Rysunku 1. Komplementarne oddziaływanie krótkich oligonukleotydów z sekwencjami transkryptu mRNA może zaburzać prawidłową funkcję mRNA na dwa sposoby [50]. Pierwszy sposób to indukowanie degradacji utworzonego dupleksu oligonukleotyd-mRNA przez RNazę H. Enzym ten aktywują na przykład RNA, oligonukleotydy zawierające w łańcuchu fosforanowym siarkę oraz, częściowo, LNA. Drugi sposób to steryczne blokowanie mRNA, które po utworzeniu kompleksu z oligonukleotydem nie może poprawnie oddziaływać * Autor korespondencyjny: Centrum Nowych Technologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Banacha 2c, 02-097 Warszawa; tel. +48 (22) 5543-600; e-mail: [email protected] 256 AGNIESZKA MARKOWSKA-ZAGRAJEK, MARCIN RÓWNICKI, JOANNA TRYLSKA Rys. 1. Porównanie struktur wybranych, syntetycznych analogów kwasów nukleinowych do DNA. Szczegóły w tekście. z rybosomem. Ten mechanizm sterycznego blokowania jest charakterystyczny dla PNA, 2’OMeRNA oraz PMO [50]. PNA nie jest degradowane przez enzymy takie jak proteazy i nukleazy [7]. Oligomery PNA mogą łączyć się z dwu- lub jednoniciowymi DNA lub RNA, tworząc stabilne dupleksy lub tripleksy [50]. Ze względu na biostabilność i wysokie powinowactwo do DNA, PNA znalazło zastosowanie w badaniach, diagnostyce i jako narzędzie terapeutyczne [60]. Antysensowne sekwencje PNA wycelowane w mRNA kluczowych dla bakterii genów prowadzą do zahamowania wzrostu komórek bakteryjnych [20, 33]. Okazało się, że oprócz mRNA, również rybosomowe RNA (rRNA) może być celem dla antysensownych oligonukleotydów [19, 25, 58, 68], które dzięki temu mogą skutecznie blokować wzrost komórek bakteryjnych. Klasyczną i najprostszą metodą w poszukiwaniu nowych substancji antybakteryjnych jest sprawdzenie ich zdolności do hamowania wzrostu komórek bakteryjnych poprzez wyznaczenie tzw. minimalnego stężenia hamującego (Minimal Inhibitory Concentra­ tion, MIC). W poszukiwaniu oligomerów oddziałujących z mRNA stosuje się metody takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (Real-Time Polymerase Chain Reac­ tion, RT-PCR). Wyciszanie mRNA poprzez antysensowne oligonukleotydy powoduje zaburzenia translacji oraz degradację mRNA. Można więc mierzyć poziom mRNA, aby ocenić skuteczność działania antysensownych oligonukleotydów [16]. W celu sprawdzenia skuteczności działania sekwencji antysensownej w konkretnym szczepie bakterii można najpierw zastosować test oparty o ekspresję genów reporterowych [16]. W testowaniu aktywności inhibitorów hamujących syntezę białek ważnym kro- kiem jest sprawdzenie potencjału oligomeru w ekstrakcie komórkowym (tzw. cell-free transcription/translation system). Ekstrakt komórkowy zawiera całą maszynerię niezbędną do syntezy białek, jednak pozbawiony jest ściany komórkowej. Jako wskaźnika efektywności używa się wartości stężenia oligomeru, które hamuje produkcję białka reporterowego w 50% (wartość IC50). Zaletą stosowania tej metody jest możliwość sprawdzenia, czy inhibitor, którego chcemy użyć, celuje specyficznie w proces translacji. Ponieważ metoda ta jest bardziej czuła niż MIC (ze względu na wspomniany brak ściany komórkowej) stosuje się mniejsze stężenia inhibitora. Ostatecznie jednak należy przetestować inhibitor na komórkach bakteryjnych i wyznaczyć wartość MIC, aby upewnić się, że badany związek jest w stanie wniknąć do komórek [58]. Kilka inhibitorów translacji zostało zidentyfikowanych przy użyciu tej metody [3]. Przedmiotem poniższej pracy przeglądowej jest przedstawienie zagadnień dotyczących inhibicji wzrostu bakterii poprzez wiązanie się antysensownych sekwencji PNA z mRNA i rRNA bakterii. 2. Peptydowe kwasu nukleinowe Peptydowe kwasy nukleinowe zostały po raz pierwszy zsyntetyzowane w 1991 roku przez P. E. N i e l s e n a w laboratorium O. B u c h a r d t a [41]. PNA jest syntetycznym analogiem DNA, w którym zasady nukleinowe połączone zostały łańcuchem polipeptydowym zbudowanym z podjednostek N-(2-aminoetylo) glicyny za pomocą wiązań peptydowych (Rys. 1) [26, 42, 53]. Zastąpienie łańcucha fosforanowo-cukrowego szkieletem podobnym do peptydowego spowodowało całkowitą odporność PNA na nukleazy, czyli HAMOWANIE WZROSTU BAKTERII PRZEZ PEPTYDOWE KWASY NUKLEINOWE Rys. 2. Sposoby tworzenia dupleksów PNA z DNA lub RNA enzymy degradujące naturalne kwasy nukleinowe [41, 53, 60]. Ponadto, dzięki usunięciu ujemnie naładowanych reszt kwasu fosforowego i zastąpieniu ich grupami amidowymi, cząsteczki PNA, w odróżnieniu od naturalnych kwasów nukleinowych, mają ładunek obojętny [51]. Dzięki temu PNA może tworzyć wysoce stabilne kompleksy z DNA, RNA oraz PNA [2, 25, 58], np. temperatura topnienia dupleksu PNA-PNA o dłu­ gości 15 merów wynosi 69,5°C, natomiast analogiczny kompleks DNA-DNA posiada temperaturę topnienia 56,1°C [12]. Tworzenie dupleksów z PNA może zachodzić w dwojaki sposób: (i) równolegle, kiedy koniec N cząsteczki PNA skierowany jest w kierunku końca 5’ DNA lub RNA oraz (ii) antyrównolegle, gdy końcowa grupa -NH2 skierowana jest do końca 3’ nici DNA lub RNA (Rys. 2).Uprzywilejowaną jest orientacja antyrównoległa, ponieważ wiązanie antyrównoległej cząsteczki PNA do DNA lub RNA zachodzi zdecydowanie szybciej i z większym powinowactwem niż w przypadku orientacji równoległej [62]. PNA może tworzyć także 257 trójniciowe kompleksy przyłączając się do podwójnej helisy DNA. Przykładowe struktury z udziałem PNA przedstawiono na Rysunku 3. Mechanizm tworzenia kompleksu typu (PNA)2-DNA opiera się na lokalnej dysocjacji wiązań między komplementarnymi nićmi dupleksu DNA, a następnie przyłączeniu komplementarnego odcinka PNA do jednej lub dwóch nici DNA [10, 26, 40, 42]. Tworzenie takich struktur obywa się dzięki wiązaniom wodorowym typu Watsona-Cricka oraz H o o g s t e n a [10]. Takie tripleksy tworzone są przede wszystkim przez oligomery homopirymidynowe lub zawierające znaczną przewagę pirymidyn nad purynami. W przypadku kompleksu typu (PNA)2-DNA oligomer PNA charakteryzuje się wysoką zawartością cytozyny w swojej strukturze [47, 66]. Stabilność tych kompleksów rośnie proporcjonalnie do długości łańcucha oligomeru [51]. Z kolei oligomery PNA zawierające w większości zasady purynowe tworzą z dwuniciowym DNA dupleksy połączone wiązaniami wodorowymi typu Watsona-Cricka. Możliwe jest również utworzenie struktury kwadrupleksu (PNA)2-(DNA)2, z zastosowaniem modyfikowanego dwuniciowego PNA komplementarnego do DNA. Zmiana w PNA dotyczy adeniny i tyminy, na miejsce których wprowadzane są, odpowiednio, diaminopuryna oraz tiouracyl. Taki zmieniony dwuniciowy PNA ulega sterycznej destabilizacji i dzięki temu może utworzyć z dwuniciowym DNA omawianą strukturę [36]. Ponadto, oligomery PNA można połączyć giętkim neutralnym łącznikiem; produkt takiego połączenia nazywany jest bis-PNA. Oligomery bis-PNA mogą łączyć się z kwasami nukleinowymi i tworzyć z nimi formy tripleksowe [10]. Rys. 3. Możliwe sposoby wiązania PNA do dupleksu DNA. Linia pogrubiona – PNA; linia cienka – DNA, linia przerywana – wiązania Watsona-Cricka, ||||||| – wiązania Hoogstena, DAP – diaminopuryna, T’ – tiouracyl 258 AGNIESZKA MARKOWSKA-ZAGRAJEK, MARCIN RÓWNICKI, JOANNA TRYLSKA 3. Zalety i wady oligomerów PNA Zaletą PNA jest jego odporność na działanie nukleaz, proteaz i peptydaz, oraz stabilność w szerokim zakresie pH i temperatury, dzięki czemu może się on znacznie dłużej utrzymywać w środowisku wewnątrzkomórkowym niż naturalne kwasy nukleinowe [10, 30]. Brak ujemnie naładowanych reszt kwasu fosforowego w cząsteczce PNA powoduje brak odpychania elektrostatycznego podczas tworzenia kompleksów z DNA, RNA czy PNA. Monomery PNA syntetyzuje się przy użyciu niedrogich substratów [13]. Oligomery PNA można uzyskać poprzez syntezę na nośniku stałym [67]. PNA nie jest cząsteczką „idealną” i istnieją pewne ograniczenia w jej stosowaniu. Ze względu na hydrofobowy charakter PNA charakteryzuje mniejsza rozpuszczalność w roztworach niż DNA czy RNA [9]. Często do jednego z końców oligomeru PNA przyłącza się dodatnio naładowany aminokwas, na przykład lizynę, co poprawia rozpuszczalność PNA [41]. Istotne trudności sprawia także transport PNA do komórek, zwłaszcza bakteryjnych, w których barierą jest ich ściana komórkowa. Ponadto, PNA nie rozróżnia oligomerów DNA od RNA, a także może wiązać się z nimi w dwóch kierunkach [12, 31] (Rys. 2) co ogranicza jego zdolność do specyficznego rozpoznawania sekwencji. 4. Sposoby transportu PNA do komórek bakteryjnych Osłony komórkowe bakterii stanowią skuteczną barierę dla obcych molekuł, w tym PNA [20]. W przypadku bakterii Gram-ujemnych główną przeszkodę stanowi lipopolisacharyd (LPS) – składnik zewnętrznej błony komórkowej. Aby ułatwić wprowadzanie PNA do wnętrza komórek bakteryjnych, stosuje się krótkie peptydy transportujące np. (KFF)3K, do których przyłączony jest oligomer PNA [17]. Peptyd ten został odkryty przez Va a r a i P o r r o [61], którzy udowodnili skuteczność jego działania, pomimo iż zaproponowany przez nich mechanizm molekularny zwiększenia przepuszczalności ściany komórkowej i poprawy pobierania PNA dzięki zastosowaniu (KFF)3K budzi kontrowersje [17]. Peptyd ten był oryginalnie przeznaczony do poprawy wprowadzania PNA do komórek Escherichia coli, a wydajność transfekcji przy jego użyciu różni się w zależności od badanego gatunku bakterii [48, 57]. Jednakże najnowsze badania pokazują, że również Gram-dodatnie bakterie Bacillus subtilis i Corynebacte­ rium efficiens wykazują zwiększoną podatność na PNA-(KFF)3K [23]. Peptydy penetrujące ścianę komórkową powinny być dodatnio naładowanymi, amfipatycznymi cząsteczkami, ponieważ wówczas charakteryzują się najwyższą wydajnością [37, 39]. Innymi związkami, które mogą pomóc rozwiązać problem dostarczania oligonukleotydów do komórek mogą być na przykład liposomy, polimery kationowe lub dendrymery [6, 14], ale skuteczność tych metod nie została dobrze zweryfikowana w przypadku komórek bakteryjnych. 5.Inhibicja wzrostu bakterii poprzez wiązanie się z bakteryjnym mRNA Liczne publikacje donoszą, że antysensowne sekwencje PNA wycelowane w mRNA powstające w wyniku transkrypcji genów niezbędnych do życia komórki (essential genes) prowadzą do zahamowania wzrostu komórek bakteryjnych. Sekwencje PNA, których używano w opisanych poniżej badaniach, miały długość 10–16 nukleotydów. Jednym z takich genów jest gen kodujący enzym β-laktamazę. Przetestowano 90 antysensownych sekwencji celujących w cały transkrypt mRNA genu β-laktamazy [8]. Jest to gen E. coli, warunkujący oporność na antybiotyki β-laktamowe. Najbardziej wrażliwym na działania PNA był region startowy w mRNA tego genu, zawierający sekwencję Shine-Dalgarno. Sekwencja Shine-Dalgarno występuje w mRNA ko­ mórek prokariotycznych i jest miejscem wiązania mRNA do rybosomu. Jest komplementarna do sekwencji na końcu 3’ 16S rybosomowego RNA w małej podjed­ nostce rybosomu [52]. Sekwencje, które celowały poza region startowy były w dużej mierze nieskuteczne [8]. Antysensowne sekwencje PNA wycelowane poza kodon startowy w mRNA kodującym białko nie wpłynęły na zmiany poziomu ekspresji genów lub wzrost komórek [8, 29]. W innych badaniach zaobserwowano zahamowanie wzrostu wieloopornej bakterii Klebsiella pneumoniae przy użyciu antysensownej sekwencji PNA wycelowanej w dwa geny: gyrA (kodujący podjędnostkę A gyrazy DNA) i ompA (kodujący białko A błony zewnętrznej) [32]. Bakteryjne białko gyraza jest dobrze poznanym celem dla antybiotyków. Brak syntezy podjednostki A gyrazy DNA, potrzebnej w procesie replikacji DNA, powoduje zahamowanie wzrostu komórek bakteryjnych. Zarejestrowano kompletne zahamowanie wzrostu bakterii i ekspresji transkryptu genu gyrA w przypadku, gdy PNA było połączone z peptydem transportującym (KFF)3K. Gdy PNA celujące w transkrypt genu gyrA nie było połączone z peptydem transportującym, nie obserwowano zmiany poziomu ekspresji tego genu ani wpływu PNA na wzrost komórek. PNA nieodpowiadające dokładnie komplementarnej sekwencji w mRNA (różniące się w dwóch pozycjach nukleotydowych) nie hamowało wzrostu komórek bakteryjnych. PNA wycelowane w mRNA genu gyrA doprowadziło do degradacji mRNA, a następnie zablokowania procesu translacji. HAMOWANIE WZROSTU BAKTERII PRZEZ PEPTYDOWE KWASY NUKLEINOWE PNA wycelowane w transkrypt genu ompA również zahamowało wzrost bakterii K. pneumoniae oraz ekspresję genu ompA. Także w tym wypadku niezbędne było przyłączenie do antysensownej sekwencji PNA peptydu transportującego, a peptyd kontrolny (z niekomplementarnymi zasadami) okazał się być nieskuteczny [32]. W badaniach nad Staphylococcus aureus przy użyciu antysensownych PNA obniżono poziom ekspresji genu gyrA i genu fmhB, zaangażowanego w biosyntezę ściany komórkowej [39]. PNA było wycelowane również w mRNA genu hmrB, ortologa genu acpP (46% identycznych aminokwasów) u E. coli, który bierze udział w procesie syntezy kwasów tłuszczowych [39]. Wzrost komórek E. coli został wcześniej z powodzeniem zablokowany przez PNA wycelowane w mRNA genu acpP [17]. Kontrolne sekwencje PNA z dwoma podmienionymi nukleotydami nie miały wpływu na wzrost bak­terii, ani zmiany w ekspresji genów. Obserwacja ta wskazuje, że PNA wycelowane w mRNA kluczowych dla bakterii genów hamuje ekspresję tych genów i wzrost komórek bakteryjnych w sposób specyficzny dla danej sekwencji [23, 39]. Antysensowne sekwencje PNA znalazły również swoje zastosowanie w zahamowaniu aktywności transportera CmeA, komponentu błonowego transportera CmeABC, który pełni istotną funkcję w determinowaniu oporności na antybiotyki u Campylobacter jejuni. PNA wiązało się z mRNA genu cmeA, blokując proces translacji, a tym samym syntezę białka CmeA. Skutkiem tego było zmniejszenie oporności C. jejuni na antybiotyki takie jak erytromycyna i cyproflo­ksacyna [28]. Inne badania [49] wykazały, że PNA wycelowane w geny kodujące enzymy zaangażowane w biosyntezę kwasów nukleinowych, kwasów tłuszczowych, składników ściany komórkowej oraz w przebieg procesu translacji mogą hamować wzrost komórek bakterii Brucella suis. PNA, które zahamowały wzrost B. suis były wycelowane w następujące geny: kdtA (kodujący transferazę zaangażowaną w syntezę lipidu A), tsf (kodujący czynnik elongacji translacji EF-Ts), polA (kodujący polimerazę DNA I) oraz rpoB (kodujący podjednostkę β polimerazy RNA). Ponieważ B. suis infekuje wnętrza komórek fagocytarnych, w tym makrofagów, ważne było sprawdzenie, czy PNA będzie hamować także wzrost B. suis zlokalizowanej wewnątrzkomórkowo. Określono zdolność do hamowania wzrostu B. suis w mysich makrofagach przez PNA i nie odnotowano cytotoksycznego wpływu PNA na eukariotyczną linię komórkową. To badanie wskazuje na potencjalną użyteczność antysensownych sekwencji PNA jako nowych środków terapeutycznych przeciwko wewnątrzkomórkowej bakterii patogennej B. suis. Przy użyciu PNA udało się również znacznie obniżyć poziom ekspresji genu gyrA Streptococcus pyoge­ 259 nes, co pociągnęło za sobą zablokowanie wzrostu komórek [44]. Antysensowna sekwencja wycelowana w mRNA genu gyrA była połączona ze standardowo stosowanym peptydem transportującym (KKF)3K lub, zastosowanym po raz pierwszy w tej roli, peptydem Tat z wirusa HIV-1 (trans-activating transcriptional activator). Wykazano, że sekwencja połączona z peptydem HIV-1 Tat znacznie efektywniej blokuje wzrost komórek bakteryjnych. Sprawdzono również czy antysensowna sekwencja PNA wycelowana w mRNA genu gyrA, w użyciu razem z konwencjonalnymi antybiotykami, doprowadzi do wzmocnienia działania obu komponentów. Zaobserwowano zjawisko synergii pomiędzy antysensowną sekwencją PNA a lewofloksacyną i nowobiocyną (antybiotykami które łączą się z gyrazą DNA), oraz spektynomycyną (antybiotyk, który łączy się z podjednostką 30S rybosomu) [44]. Takie kombinowane terapie mogą się przyczynić do wzmocnienia efektu działania komponentów antybakteryjnych. Mogą być również przydatne w wypadku, gdy dana bakteria jest oporna na jeden z czynników. Wzrost bakterii patogennej Pseudomonas aeru­ ginosa również został zahamowany z użyciem PNA. Celem w tym przypadku był mRNA genu ftsZ, zaangażowanego w podziały komórkowe, oraz genu acpP. PNA był połączony z peptydem o sekwencji H-(R-AhxR)4-Ahx-βala lub H-(R-Ahx)6-βala (Ahx, kwas 6-aminoheksanowy, 6-aminohexanoic acid; βala, β-alanina), gdyż okazało się, że peptyd (KFF)3K nie jest wydajny w wypadku tej Gram-ujemnej bakterii. Antysensowne sekwencje PNA połączone z peptydem zahamowały wzrost trzech szczepów bakterii P. aeruginosa (w tym dwóch wysoce wirulentnych izolatów klinicznych) [15]. PNA okazało się być również skuteczne w badaniach in vivo. PNA wycelowane we wspomniany wcześniej gen acpP bakterii E. coli zahamowało wzrost komórek bakteryjnych. Zaobserwowano wzrost przeżywalności myszy zakażonych bakteriami, a następnie potraktowanych koniugatem PNA i peptydu (KFF)3K, w stosunku do zwierząt nieleczonych [55]. Przedstawione prace wskazują, że celowanie antysensownymi sekwencjami PNA w mRNA bakterii może się okazać w przyszłości skutecznym narzędziem do walki z bakteriami, jednak pod warunkiem znalezienia bardziej efektywnych transporterów oligomerów PNA do komórek bakterii. 6. Inhibicja wzrostu bakterii poprzez wiązanie się z rRNA Oprócz mRNA, również rRNA może być atrakcyjnym celem dla antysensownych oligonukleotydów, skutecznie hamujących proces bakteryjnej translacji. Rybosomowe RNA stanowi 2/3 masy rybosomów 260 AGNIESZKA MARKOWSKA-ZAGRAJEK, MARCIN RÓWNICKI, JOANNA TRYLSKA – kompleksów makromolekularnych, w których zachodzi synteza białek w oparciu o informację zapisaną na nici mRNA [34]. Rybosom bakteryjny składa się z dwóch podjednostek: dużej (50S) i małej (30S) [59]. Podjednostka 30S u E. coli składa się z 21 białek i jednego łańcucha RNA (16S RNA, około 1500 nukleotydów). Podjednostka 50S zbudowana jest z ponad 30 białek i dwóch łańcuchów RNA (5S RNA – około 120 nukleotydów i 23S RNA – około 2900 nukleotydów) [59]. Wiele klasycznych antybiotyków hamuje wzrost bakterii poprzez przyłączenie się do rybosomu, a tym samym zatrzymuje proces syntezy białek, niezbędnych do życia bakterii [46]. Również niektóre kluczowe sekwencje rRNA zostały przetestowane jako cele działania oligomerów PNA. Badania wykazują, że oligomery PNA wycelowane w funkcjonalne miejsce w 23S rRNA dużej podjednostki rybosomu bakteryjnego hamują proces translacji zarówno w systemie pozakomórkowym, jak i w układzie in vivo [18]. W doświadczeniu tym użyto sekwencji PNA wycelowanych w miejsce funkcyjne peptydylotransferazowe rybosomu (peptidyl transferase center) oraz w pętlę α-sarcyny (α-sarcin loop) znajdujących się w 23S rRNA. Sekwencje PNA tworzyły z 23S rRNA zarówno dupleksy jak i kompleksy trójniciowe. Bis-PNA tworzący formy tripleksowe z rRNA zahamował wzrost komórek bakteryjnych szczepu AS19 E. coli, w 10% pożywce LB (Lysogeny Broth), tzn. 10% zawar­ tości składników odżywczych w stosunku do stosowanej standardowej pożywki. Bis-PNA tworzy tripleksy na zasadzie pokazanej na Rysunku 3 (PNA2/DNA). W systemie cell-free proces translacji zablokowano przy użyciu bis-PNA na podobnym poziomie jak w przypadku zastosowania tetracykliny – antybiotyku hamującego wzrost bakterii poprzez przyłączanie się do rybosomu. Natomiast oligomer PNA tworzący dupleks z rRNA nie hamował wzrostu bakterii. Następnie połączono sekwencję PNA wycelowaną w pętlę α-sarcynową 23S rRNA z peptydem transportującym (KFF)3K i zaobserwowano zahamowanie wzrostu komórek szczepu E. coli K12 w pożywce o pełnej zawartości składników odżywczych [17]. Zaprojektowano również PNA wycelowane w region Shine-Dalgarno 16S RNA (fragment 1532–1541, numeracja 16S RNA jak u E. coli) połączony z peptydem (KFF)3K, który skutecznie zablokował proces translacji w ekstrakcie komórkowym z wyznaczoną wartością IC50 = 0,6 μM. Zahamował on także wzrost komórek E. coli K12 z wartością MIC = 10 μM [23]. Inna grupa badawcza zaprojektowała sekwencję bis-PNA połączoną z peptydem transportującym (KFF)3K, wycelowaną w centrum GTPazowe rybosomu (GTPase­ -associated centre) 23S rRNA. Testowano zarówno PNA tworzące formy tripleksowe, jak i dupleksowe. Bis-PNA wycelowany w region nukleotydu G1138 zablokował proces translacji na poziomie podobnym do tetracykliny. PNA zahamowało również wzrost komórek E. coli DH5α w 10% pożywce LB [68]. Wartość MIC dla PNA wyniosła 10 μM, a dla tetracykliny 4 μM. Ze względu na skomplikowaną architekturę rRNA, aby zaprojektować oligonukleotyd, który będzie skutecznie celował w rRNA bakterii, pożądana jest znajomość drugorzędowej i trzeciorzędowej struktury rybosomu. Pozwala to określić dostępność i możliwość „rozerwania” fragmentu rRNA, w który ma być wycelowany oligonukleotyd. Struktura drugorzędowa rRNA jest dobrze poznana u bakterii E. coli [43], która z tego powodu jest świetnym modelem do tego typu badań. Ponadto rRNA jest konserwowane ewolucyjnie [5, 65], co oznacza, że niektóre sekwencje rRNA są niezmienne u niemal wszystkich gatunków bakterii [4, 21]. Rybosomowe RNA jest więc obiecującym celem dla nowych antybiotyków, jednak poszukiwanie nowych miejsc w rRNA nie jest prostym zadaniem, gdyż wymaga zastosowania syntetycznej wiedzy z dziedzin takich jak biologia, bioinformatyka i mikrobiologia. Stawia jednak przed badaczami nowe wyzwania, ponieważ do tej pory zostało zbadanych niewiele miejsc w bakteryjnym rybosomie możliwych do inhibicji poprzez oligonukleotydy [58]. 7. Zastosowanie PNA w biologii molekularnej Badania z użyciem technologii antysensownej z wykorzystaniem PNA skupione są głównie na jego potencjalnym zastosowaniu klinicznym. Oprócz stosowania PNA jako inhibitora translacji poprzez jego komplementarne przyłączanie się do mRNA i rRNA, możliwe jest również jego wykorzystanie do hamowania replikacji przez wiązanie się z DNA. Ponadto, PNA może być wykorzystywane w diagnostyce laboratoryjnej np. do wykrywania obecności Mycobacterium tuberculosis za pomocą hybrydyzacji mRNA ze znakowanym fluorescencyjnie PNA, a także jako narzędzie w biologii molekularnej [24, 54]. Poniżej przedstawiono najważniejsze przykłady zastosowań PNA w biologii molekularnej. Hybrydyzacja PNA jako alternatywa dla metody Southerna. Hybrydyzacja typu Southern to metoda używana do identyfikacji poszukiwanych sekwencji DNA, spośród mieszaniny fragmentów po trawieniu enzymami restrykcyjnymi lub po reakcji PCR z użyciem mało specyficznych starterów. DNA po trawieniu frakcjonuje się w żelu agarozowym, fragmenty zostają rozdzielone proporcjonalnie do ich długości i uszeregowane według wielkości. Hybrydyzacja oligomerów PNA do komplementarnych sekwencji DNA jest niezależna od siły jonowej, ze względu na neutralny ładunek PNA. Zatem oligomery PNA hybrydyzują HAMOWANIE WZROSTU BAKTERII PRZEZ PEPTYDOWE KWASY NUKLEINOWE z komplementarnymi oligomerami DNA w warunkach, w których hybrydyzacja DNA-DNA jest niemożliwa, to znaczy przy niskiej sile jonowej [45]. Ponadto, ponieważ rdzeń PNA jest obojętny, ruchliwość elektroforetyczna oligomerów PNA będzie zależeć od ich wielkości. Na ogół będą migrować znacznie wolniej niż DNA w polu elektrycznym. Aby możliwa była identyfikacja zhybrydyzowanych PNA stosuje się oligomery PNA znakowane fluoroscencyjnie [12]. Wykrywanie związanej sondy PNA jest możliwe bezpośrednio przez detekcję fluorescencyjną w elektroforezie kapilarnej lub przeniesienie dupleksów DNA/PNA na membranę i detekcję za pomocą chemiluminescencji. Technika ta eliminuje żmudne i czasochłonne etapy hybrydyzacji Southern, w tym konieczność kilkukrotnego przepłukania membrany w celu usunięcia niespecyficznie związanej sondy DNA [45]. Określanie wielkości telomerów. Standardowa metoda określania długości telomerów wymaga analizy typu Southern blot genomowego DNA i określa zakres długości telomerów wszystkich obecnych chromosomów. Nowoczesne podejście wykorzystuje oligonukleotydy znakowane fluorescencyjnie i monitorowanie hybrydyzacji in situ dla powtórzeń telomerowych. Jednak znacznie lepsze wyniki ilościowe można uzyskać stosując znakowane fluorescencyjnie PNA, o czym po raz pierwszy donieśli L a n s d o r p i wsp. [33]. Dzięki tej metodzie możliwe jest dokładne oszacowanie długości telomerów, gdyż hybrydyzacja in situ znakowanym PNA jest szybsza i wymaga niższych stężeń sondy PNA w porównaniu do sondy DNA. Niski poziom fotowybielania oraz bardzo dobry stosunek sygnału do szumu pozwalają na ilościowe oznaczenie powtórzeń sekwencji telomerowych na pojedynczym chromosomie. PNA jako sonda do czujnika biologicznego kwasu nukleinowego. PNA może być wykorzystywany w badaniach diagnostycznych dyskryminacji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (Single-Nucleotide Poly­ morphism, SNP) w ludzkim DNA dzięki wykorzystaniu spektroskopii mas MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight). Za pomocą MALDI-TOF można szybko i dokładnie wykrywać sondy PNA zhybrydyzowane do analizowanego DNA. Zapewnia to proste, szybkie, dokładne i specyficzne wykrywanie SNP w amplifikowanym DNA [11]. Wykrywanie wielu mutacji punktowych za pomocą specyficznych dla alleli masowo znakowanych sond PNA jest także możliwe za pomocą bezpośredniej analizy MALDI-TOF-MS [22]. PNA jako sonda kwasów nukleinowych znajduje również zastosowanie w technice BIAcore oraz w badaniu zmian masy za pomocą mikrowagi kwarcowej [27, 64]. Ponadto PNA znalazło zastosowanie w biologii molekularnej i biotechnologii m.in. do wzmacniania sygnału w reakcjach PCR, do wykonywania (w połą- 261 czeniu z endonukleazami) niespecyficznych cięć genomowych (PNA-assisted Rare Cleavage, PARC), a także w wyszukiwaniu mutacji genetycznych za pomocą elektroforezy kapilarnej [5, 38, 63]. 8. Podsumowanie Mimo obiecujących wyników badań, zastosowanie peptydowego kwasu nukleinowego jako leku przeciwnowotworowego, przeciwbakteryjnego czy przeciwwirusowego musi poczekać na rozwój efektywnych i bezpiecznych metod jego dostarczania do komórek. Z drugiej strony zastosowanie PNA jako cząsteczki detekcyjnej znalazło już zastosowanie w chemii i biotechnologii [19, 56]. Aby uzyskać lepsze własności fizykochemiczne tego analogu kwasu nukleinowego szuka się nowych modyfikacji szkieletu i zasad [60]. Oligomery PNA ze względu na ich specyficzne oddziaływanie z DNA oraz RNA, a także wysoką stabilność chemiczną i biologiczną znajdują zastosowanie w wielu dziedzinach biologii. Jednym z nich jest opisana w tym artykule technologia antysensowna w oddziaływaniu oligomerów PNA z mRNA i rRNA bakterii. Podziękowania Autorzy dziękują za wsparcie z Narodowego Centrum Nauki (DEC-2012/05/B/NZ1/00035). Agnieszka Markowska-Zagrajek jest współfinansowana przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki Szczególne podziękowania kierujemy do magistra Roberta Laska za cenne wskazówki i wsparcie merytoryczne. Piśmiennictwo 1. Andersson D.I., Hughes D.: Antibiotic resistance and its cost: is it possible to reverse resistance? Nat. Rev. Microbiol. 8, 260–271 (2010) 2. Armitage B.: The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov. Today, 8, 222–228 (2003) 3. Brandi L. i wsp.: Novel tetrapeptide inhibitors of bacterial protein synthesis produced by a Streptomyces sp. Biochemistry, 45, 3692–3702 (2006) 4. Cannone J.J. i wsp.: The comparative RNA web (CRW) site: an online database of comparative sequence and structure information for ribosomal, intron, and other RNAs. BMC Bioinfor­ matics, 3, 1–31 (2002) 5.Carlsson C., Jonsson M., Norden B., Dulay M., Zare R., Noolandi J., Nielsen P., Tsui L., Zielenski J.: Screening for genetic mutations. Nature, 380, 207 (1996) 6.Choi S.K. i wsp.: Dendrimer-based multivalent vancomycin nanoplatform for targeting the drug-resistant bacterial surface. ACS Nano, 7, 214–228 (2013) 262 AGNIESZKA MARKOWSKA-ZAGRAJEK, MARCIN RÓWNICKI, JOANNA TRYLSKA 7.Demidov V.V, Potaman V.N., Frank-Kamenetskii M.D., Egholm M., Buchard O., Sönnichsen S.H., Nielsen P.E.: Stability of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. Biochem. Pharmacol. 48, 1310–1313 (1994) 8. Dryselius R., Aswasti S.K., Rajarao G.K., Nielsen P. E., Good L.: The translation start codon region is sensitive to antisense PNA inhibition in Escherichia coli. Oligonucleotides, 13, 427–433 (2003) 9.Egholm M., Buchardt O., Nielsen P.E.: Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogs with an achiral peptide backbone. J. Am. Chem. Soc. 114, 1895–1897 (1992) 10.Egholm M., Christensen L., Dueholm,K.L., Buchardtt O., Coull J., Nielsen P.E.: Efficient pH-independent sequence-specific DNA binding by pseudoisocytosine-cintaining bis-PNA. Nucleic Acids Res. 23, 3–8 (1995) 11. Egholm M.: Spectrometry senses more than a small difference. Nat. Biotechnol. 15, 1346 (1997) 12. Egholm, M. i wsp.: PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson–Crick hydrogen-bonding rules. Nature, 365, 566–568 (1993) 13.Falkiewicz B., Wiśniowski W., Kołodziejczyk A.S., Wiśniewski K.: Synthesis of new Chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) Monomers. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20, 1393–1397 (2001). 14. Gao X., Kim K.-S., Liu D.: Nonviral gene delivery: what we know and what is next. AAPS J. 9, 92–104 (2007) 15. Ghosal A., Nielsen P.E.: Potent antibacterial antisense peptide-peptide nucleic acid conjugates against Pseudomonas aeruginosa. Nucleic Acid Ther. 22, 323–334 (2012) 16. Goh S., Stach J., Good L.: Antisense Effects of PNAs in Bacteria. In: ed. Peptide Nucleic Acids. Methods in Molecular Biology; 2014: vol. 1050. 223–236 17. Good L., Awasthi S.K., Dryselius R., Larsson O., Nielsen P.E.: Bactericidal antisense effects of peptide-PNA conjugates. Nat. Biotechnol. 19, 360–364 (2001) 18.Good L., Nielsen P.E.: Inhibition of translation and bacterial growth by peptide nucleic acid targeted to ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2073–2076 (1998) 19. Good L., Nielsen P.E.: Antisense inhibition of gene expression in bacteria by PNA targeted to mRNA. Nat. Biotechnol. 16, 355–358 (1998) 20. Good L., Sandberg R., Larsson O., Nielsen P.E., Wahlestedt C.: Antisense PNA effects in Escherichia coli are limited by the outermembrane LPS layer. Microbiology, 146, 2665–2670 (2000) 21. Górska, A.: Inhibition of bacterial translation by Peptide Nucleic Acid oligomers targeting the ribosomal RNA, Uniwersytet Warszawski; 2013 22. Griffin T., Tang W., Smith L.: Genetic analysis by peptide nucleic acid affinity MALDI-TOF mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 15, 1368–1372 (1997) 23. Hatamoto M., Nakai K., Ohashi A., Imachi H.: Sequence-specific bacterial growth inhibition by peptide nucleic acid targeted to the mRNA binding site of 16S rRNA. Appl. Microbiol. Bio­ technol. 84, 1161–1168 (2009) 24.Hatamoto M., Ohashi A., Imachi H.: Peptide nucleic acids (PNAs) antisense effect to bacterial growth and their application potentiality in biotechnology. Appl. Microbiol. Biotechnol. 86, 397–402 (2010) 25.Hatcher E., Balaeff A., Keinan S., Venkatramani R., Beratan D.N.: PNA versus DNA: effects of structural fluctuations on electronic structure and hole-transport mechanisms. J. Am. Chem. Soc. 130, 11752–11761 (2008) 26. Janson C.G., During M.J.: The Many Faces of PNA. In: ed. Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules. Kluwer Academic/ Plenum Publisher; 2006: 3–17 27.Jensen K.K., Orum H., Nielsen P.E., Nordén B.: Kinetics for hybridization of peptide nucleic acids (PNA) with DNA and RNA studied with the BIAcore technique. Biochemistry, 36, 5072–5077 (1997) 28. Jeon B., Zhang Q.: Sensitization of Campylobacter jejuni to fluo­ roquinolone and macrolide antibiotics by antisense inhibition of the CmeABC multidrug efflux transporter. J. Antimicrob. Chemother. 63, 946–948 (2009) 29. Knudsen H., Nielsen P.E.: Antisense properties of duplex- and triplex-forming PNAs. Nucleic Acids Res. 24, 494–500 (1996) 30.Kosaganov Y.N., Stetsenko D.A., Lubyako E.N., Kvitko N.P., Lazurkin Y.S., Nielsen P.E.: Effect of Temperature and Ionic Strength on the Dissociation Kinetics and Lifetime. 1743, 11742–11747 (2000) 31. Kumar V. a, Ganesh K.N.: Conformationally constrained PNA analogues: structural evolution toward DNA/RNA binding selectivity. Acc. Chem. Res. 38, 404–412 (2005) 32. Kurupati P., Tan K.S.W., Kumarasinghe G., Poh C.L.: Inhibition of gene expression and growth by antisense peptide nucleic acids in a multiresistant beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae strain. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 805–811 (2007) 33. Lansdorp P.M., Verwoerd N.P., van de Rijke F.M., Dragowska V., Little M.T., Dirks R.W.; Raap aK., Tanke H.J.: Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet. 5, 685–91 (1996) 34. Laursen B.S.; Sørensen H.P., Kusk K.; Sperling-petersen H.U., Mortensen K.K.: Initiation of Protein Synthesis in Bacteria Initiation of Protein Synthesis in Bacteria. 69, 101–123 (2005) 35. Lee L.K., Roth C.M.: Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Curr. Opin. Biotechnol. 14, 505–511 (2003) 36. Lohse J., Dahl O., Nielsen P.E.: Double duplex invasion by peptide nucleic acid: a general principle for sequence-specific targeting of double-stranded DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11804–11808 (1999) 37. Mellbye B.L., Puckett S.E., Tilley L.D., Iversen P.L., Geller B.L.: Variations in amino acid composition of antisense peptide-phosphorodiamidate morpholino oligomer affect potency against Escherichia coli in vitro and in vivo. Antimicrob. Agents Chemo­ ther. 53, 525–530 (2009) 38. Misra H.S., Pandey P.K., Modak M.J., Vinayak R., Pandey V. N.: Polyamide nucleic acid-DNA chimera lacking the phosphate backbone are novel primers for polymerase reaction catalyzed by DNA polymerases. Biochemistry, 37, 1917–1925 (1998) 39. Nekhotiaeva N., Awasthi S.K., Nielsen P.E., Good L.: Inhibition of Staphylococcus aureus gene expression and growth using antisense peptide nucleic acids. Mol. Ther. 10, 652–659 (2004) 40. Nielsen P.E., Christensen, L.: Strand Displacement Binding of a Duplex-Forming Homopurine PNA to a Homopyrimidine Duplex DNA Target. J. Am. Chem. Soc. 118, 2287–2288 (1996) 41.Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O.: Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science, 254, 1497–1500 (1991) 42. Nielsen P.E.: An Introduction to PNA. In: ed. Peptide Nucleic Acids. Protocols and Applications. Horizon Bioscience; 2004: 1–36 43. Noller H.F., Woese C.R.: Secondary structure of 16S ribosomal RNA. Science, 212, 403–411 (1981) 44. Patenge N., Pappesch R., Krawack F., Walda C., Mraheil M.A., Jacob A., Hain T., Kreikemeyer B.: Inhibition of Growth and Gene Expression by PNA-peptide Conjugates in Streptococcus pyogenes. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2, e132 (2013) 45. Perry-O’Keefe H., Yao X.W., Coull J.M., Fuchs M., Egholm M.: Peptide nucleic acid pre-gel hybridization: an alternative to southern hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14670– 14675 (1996) HAMOWANIE WZROSTU BAKTERII PRZEZ PEPTYDOWE KWASY NUKLEINOWE 46. Poehlsgaard J., Douthwaite S.: The bacterial ribosome as a target for antibiotics. Nat. Rev. Microbiol. 3, 870–881 (2005) 47.Praseuth D., Grigoriev M., Guieysse A.-L., Pritchard L.L., Harel-Bellan A., Nielsen P.E., Hélène C.: Peptide nucleic acids directed to the promoter of the alpha-chain of the interleukin-2 receptor. Biochim. Biophys. Acta, 1309, 226–238 (1996) 48. Rajarao G.K., Nekhotiaeva N., Good L.: Peptide-mediated delivery of green fluorescent protein into yeasts and bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 215, 267–272 (2002) 49.Rajasekaran P., Alexander J.C., Seleem M.N., Jain N., Sriranganathan N., Wattam A.R., Setubal J.C., Boyle S.M.: Peptide nucleic acids inhibit growth of Brucella suis in pure culture and in infected murine macrophages. Int. J. Antimicrob. Agents. 41, 358–362 (2013) 50.Rasmussen L.C.V., Sperling-Petersen H.U., Mortensen K.K.: Hitting bacteria at the heart of the central dogma: sequence-specific inhibition. Microb. Cell Fact. 6, 1–26 (2007) 51.Ray A., Nordén B.: Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. FASEB J. 14, 1041–1060 (2000) 52. Shine J., Dalgarno L.: The 3’-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: Complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342–1346 (1974) 53. Slaitas A.: Development of a new PNA analogue as a potential antisense drug and tool for life-science studies, Karolinksa University Press; 2004 54.Stender H., Lund K., Petersen K.H., Rasmussen O.F., Hongmanee P., Miörner H., Godtfredsen S.E.: Fluorescence In situ hybridization assay using peptide nucleic acid probes for differentiation between tuberculous and nontuberculous mycobacterium species in smears of mycobacterium cultures. J. Clin. Microbiol. 37, 2760–2765 (1999) 55.Tan X., Actor J.K., Chen Y.: Peptide Nucleic Acid Antisense Oligomer as a Therapeutic Strategy against Bacterial Infection : Proof of Principle Using Mouse Intraperitoneal Infection Peptide Nucleic Acid Antisense Oligomer as a Therapeutic Strategy against Bacterial Infection: Proof. Antimicrob. Agents Chemo­ ther. 49, 3203–3207 (2005) 56. Taylor R.W., Chinnery P.F., Turnbull D.M., Lightowlers R.N.: Selective inhibition of mutant human mitochondrial DNA replica­tion in vitro by peptide nucleic acids. Nat. Genet. 15, 212 – 215 (1997) 263 57. Tilley L.D., Hine O.S., Kellogg J., Hassinger J.N., Weller D.D., Iversen P.L., Geller B.L.: Gene-specific effects of antisense phosphorodiamidate morpholino oligomer-peptide conjugates on Escherichia coli and Salmonella enterica serovar typhimurium in pure culture and in tissue culture. Antimicrob. Agents Che­ mother. 50, 2789–2796 (2006) 58. Trylska J., Thoduka S.G., Dąbrowska Z.: Using Sequence-Specific Oligonucleotides To Inhibit Bacterial rRNA. ACS Chem. Biol. 8, 1101–1109 (2013) 59. Trylska J.: Budowa przestrzenna i działanie rybosomu bakteryjnego. Nagroda Nobla z chemii 2009. Kosmos, 1–2, 9–16 (2010) 60. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D.W.: PNA: Synthetic Polyamide Nucleic Acids with Unusual Binding Properties. Angew. Chemie Int. Ed. 37, 2796–2823 (1998) 61. Vaara M., Porro M.: Group of peptides that act synergistically with hydrophobic antibiotics against gram-negative enteric bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 1801–1805 (1996) 62. Venkatesan N., Kim B.H.: Peptide conjugates of oligonucleo­ tides: synthesis and applications. Chem. Rev. 106, 3712–3761 (2006) 63.Veselkov a G., Demidov V.V, Nielson P.E., Frank-Kamenetskii M.D.: A new class of genome rare cutters. Nucleic Acids Res. 24, 2483–2487 (1996) 64.Wang J., Nielsen P.E., Jiang M., Cai X., Fernandes J.R., Grant D.H., Ozsoz M., Beglieter A., Mowat M.: Mismatch-sensitive hybridization detection by peptide nucleic acids immobilized on a quartz crystal microbalance. Anal. Chem. 69, 5200–5202 (1997) 65. Wang Y., Qian P.-Y.: Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One, 4, 1–9 (2009) 66. Wittung P., Nielsen P., Nordén B.: Extended DNA-recognition repertoire of peptide nucleic acid (PNA): PNA-dsDNA triplex formed with cytosine-rich homopyrimidine PNA. Biochemistry, 36, 7973–7979 (1997) 67.Wojciechowska M., Alenowicz M., Parfinowicz B., Dobkowski M., Ruczyński J., Mucha P., Rekowski P.: PNA – Peptydowe kwasy nukleinowe. Synteza, właściwości i inne zastosowanie. In: ed. Na pograniczu chemii i biologii. 2011: 193–206 68. Xue-Wen H., Jie P., Xian-Yuan A., Hong-Xiang Z.: Inhibition of bacterial translation and growth by peptide nucleic acids targeted to domain II of 23S rRNA. J. Pept. Sci. 13, 220–226 (2007) BIOFILM, POMPY MDR I INNE MECHANIZMY OPORNOŚCI STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA NA ZWIĄZKI PRZECIWBAKTERYJNE POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 264–276 http://www.pm.microbiology.pl Olga Zając1*, Agnieszka E. Laudy1, Stefan Tyski1, 2 1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul. Oczki 3, 02-007 Warszawa 2 Zakład Antybiotyków i Mikrobiologii, Narodowy Instytut Leków, ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa Wpłynęło w kwietniu 2014 r. 1. Wstęp. 2. Leczenie zakażeń S. maltophilia. 3. Oporność na związki przeciwbakteryjne. 3.1. Oporność na antybiotyki i chemioterapeutyki. 3.2. Oporność na środki dezynfekcyjne. 3.3. Oporność na jony metali. 4. Systemy pomp. 4.1. Rodzina RND. 4.2. Rodzina MFS. 4.3. Rodzina ABC. 4.4. Pompa FuaABC. 5. Biofilm bakteryjny i system quorum sensing. 6. Podsumowanie Biofilm, MDR efflux pumps and other mechanisms of Stenotrophomonas maltophilia resistance to antibacterial substances Abstract: Stenotrophomonas maltophilia is a non-fermentative Gram-negative rod, which can cause many infections, including pneumonia and bacteremia, especially in immunocompromised or long-term hospitalized patients. The infections are difficult in therapy, because clinical isolates are usually highly resistant to many classes of antimicrobial agents, moreover, they are able to colonize medical devices and epithelial cells and form biofilm. The several resistance mechanisms of S. maltophilia to antibacterial agents have been described, among them: β-lactamases production, production of other enzymes modifying antibiotics structure and activity of multidrug efflux pumps (MDR). Up to date, eight MDR efflux pumps have been identified in S. maltophilia strains. These pumps belong to three different families of MDR pumps and RND family plays the most important role in multidrug resistance. 1. Introduction. 2. Treatment of S. maltophilia infections. 3. Resistance to antibacterial substances. 3.1. Resistance to antibiotics and chemotherapeutics. 3.2. Resistance to disinfectants. 3.3. Resistance to metals. 4. Efflux systems. 4.1. RND family. 4.2. MFS family. 4.3. ABC family. 4.4. The FuaABC efflux pump. 5. Biofilm and quorum sensing system. 6. Summary Słowa kluczowe: biofilm, pompy MDR, oporność na antybiotyki, QS, Stenotrophomonas maltophilia Key words: biofilm, MDR pumps, antibiotic resistance, QS, Stenotrophomonas maltophilia 1. Wstęp Pałeczki Stenotrophomonas maltophilia zostały po raz pierwszy wyizolowane w 1943 roku jako Bacterium bookeri. W roku 1961 nazwę zmieniono na Pseudo­ monas maltophilia, a następnie w 1983 r. gatunek ten sklasyfikowano jako Xanthomonas maltophilia [45, 89]. Po dokładnych analizach sekwencji genu kodującego 16S rRNA i debatach nad nomenklaturą w 1993 roku zdecydowano się utworzyć nowy rodzaj – Stenotropho­ monas oraz gatunek Stenotrophomonas maltophilia [70]. Według Bergey’s Manual of Systematic Bacterio­ logy rodzaj Stenotrophomonas obejmuje aktualnie 3 gatunki: S. maltophilia, S. africana i S. nitrireducens [30]. W ostatnich latach w światowym piśmiennictwie pojawiły się informacje o wyizolowaniu kolejnych gatunków, wśród których możemy wyróżnić: S. acida­ miniphila [7], S. daejeonensis [54], S. dokdonensis [101], S. ginsengisoli [48], S. rhizophila [98], S. pavanii [77], S. koreensis [100], S. chelatiphaga [47], S. terre i S. humi [38]. Tylko jeden gatunek – S. maltophilia jest chorobotwórczy dla człowieka [79]. Rodzaj Stenotrophomonas charakteryzowano w sze­regu publikacji przeglądowych [14, 35, 62, 65]. Niniej- sza praca natomiast koncentruje się na zebraniu i analizie najbardziej aktualnych informacji dotyczących rozmaitych mechanizmów oporności S. maltophilia na związki przeciwbakteryjne, co może ułatwić walkę z tym drobnoustrojem, którego rola w patogenezie zakażeń bakteryjnych ostatnio uległa zwiększeniu. Stenotrophomonas maltophilia to niefermentujące pałeczki Gram-ujemne należące do grupy bezwzględnych tlenowców. Występują w środowisku naturalnym – w glebie, ryzosferze, u zwierząt, w naturalnych zbiornikach wodnych [14]. Były także izolowane z produktów spożywczych np. mrożonych ryb, mleka, wody butelkowanej [35]. W środowisku szpitalnym mogą stanowić zanieczyszczenie sprzętu medycznego, natrysków szpitalnych, środków dezynfekcyjnych zawierających chlorheksydynę i cetrimid oraz mogą być obecne na dłoniach personelu medycznego [35, 62, 97]. Izolowano je także z płynów do soczewek kontaktowych [14]. S. maltophilia jest patogenem oportunistycznym; najbardziej podatne na zakażenia są osoby z obniżoną odpornością, chorzy na mukowiscydozę, długotrwale hospitalizowani oraz przebywający na oddziałach inten­sywnej opieki medycznej [14, 62, 73, 82]. Pałeczki S. maltophilia wywołują zakażenia układu oddechowego * Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, ul. Oczki 3, 02-007 Warszawa; tel.: 22 628-08-22; tel./fax: 22 621-13-51; e-mail: [email protected] BIOFILM, POMPY MDR I INNE MECHANIZMY OPORNOŚCI STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA (zapalenia płuc) [67], jak również zakażenia oka (głównie zapalenia twardówki, rogówki, wnętrza gałki ocznej) [17, 59], zapalenia wsierdzia [11] i tkanki łącznej [81], infekcje dróg moczowych [92], zapalenia opon mózgowych [42], a także posocznice [71]. Dużą trudnością w diagnostyce i terapii zakażeń jest różnorodność fenotypowa i genotypowa klinicznych szczepów S. maltophilia. W celu analizy czy podobieństwo genetyczne szczepów w obrębie danej grupy wpływa na ich podobieństwo fenotypowe utworzono grupy filogenetyczne. Za punkt odniesienia obrano porównanie sekwencji nukleotydowych genów kodujących β-laktamazy L1 i L2 oraz 16S rRNA i w ten sposób utworzono 3 grupy S. maltophilia. Grupa filogenetyczna A, którą charakteryzuje szczep K279a, grupa B – reprezentowana przez szczep N531 oraz grupa C, której przykładem jest szczep J675a [9, 31]. W późniejszym czasie, po dokładniejszej analizie sekwencji nukleotydowych powstała 4 grupa – D [34]. Najbardziej powszechna jest grupa A zawierająca izolaty o największej homologii. Największa heterogenność występuje w grupie B [33]. Zakażenia S. maltophilia stanowią bardzo poważny problem terapeutyczny. Głównie z uwagi na szeroko występującą oporność tych szczepów na różne rodzaje antybiotyków i chemioterapeutyków, należą one do grupy wielolekoopornych drobnoustrojów MDRO (multi-drug resistant organisms) [14, 35, 65]. 2. Leczenie zakażeń S. maltophilia Lekiem z wyboru stosowanym w zakażeniach S. malt­ ophilia jest trimetoprim-sulfametoksazol. Mimo, iż liczba szczepów opornych na ten związek z każdym rokiem rośnie, obecnie nie przekracza jednak 25% izolatów [13, 20]. W poprzednich latach 1997–1999 w Kanadzie, Ameryce Środkowej i Południowej zaobserwowano oporność u 2% szczepów, w krajach z rejonu Azji u 8%, a w Europie u 10% [29]. Trimetoprim-sulfametoksazol ma działanie bakteriostatyczne wobec bak­terii, w tym S. maltophilia i w związku z tym zaleca się stosowanie wysokich dawek tego leku w terapii ciężkich zakażeń [62]. W przypadku nietolerancji lub nadwrażliwości pacjenta na trimetoprim-sulfametoksazol lekiem drugiego rzutu jest zestawienie tykarcylina/ kwas klawulanowy. Wiadomo, iż β-laktamy wykazują niewielką aktywność wobec szczepów S. maltophilia ze względu na szeroko rozwiniętą naturalną oporność tego gatunku w stosunku do tej grupy leków [18, 62]. Dopiero dodatek inhibitora β-laktamaz, jakim jest kwas klawulanowy może przywracać wrażliwość na antybiotyki β-laktamowe [62]. W latach 90-tych wykazano, że ponad 80% szczepów było wrażliwych na połączenie tykarcylina/kwas klawulanowy [52], w później pro- 265 wadzonych badaniach zaobserwowano już oporność u 55% szczepów [80]. Ponadto w badaniach in vitro wykazano dużą skuteczność zestawienia aztreonamu z kwasem klawulanowym, jednak różna farmakokinetyka tych związków ogranicza możliwość zastosowania powyższego zestawienia w terapii [62]. Cefalosporyny wykazują małą aktywność wobec S. maltophilia zarówno w monoterapii, jak i w zestawieniu z inhibitorami β-laktamaz [65]. Nowsze chemioterapeutyki z grupy fluorochinolonów, takie jak: moksifloksacyna, gatifloksacyna oraz lewofloksacyna wykazują większą skuteczność przeciw szczepom S. maltophilia niż starsze związki z tej rodziny [96]. Niestety, zaobserwowano wśród szczepów klinicznych S. maltophilia bardzo szybkie rozprzestrzenianie się oporności na chinolony, co znacznie ogranicza ich zastosowanie w monoterapii [62]. Pochodne tetracykliny t.j. doksycyklina, minocyklina i tygecyklina wykazują dobrą skuteczność przeciwbakteryjną w odniesieniu do S. maltophilia [20, 62]. Ponadto tygecyklina jest aktywna także wobec szczepów opornych na trimetoprim-sulfametoksazol i może być brana pod uwagę jako alternatywa w lecznictwie, mimo iż doświadczenie kliniczne związane z terapią pochodnymi tetracykliny jest niewielkie [62]. Duże znaczenie w terapii zyskały ostatnio polimy­ ksyny, t.j. polimyksyna B oraz kolistyna. Badania prowadzone przez Nicodemo i wsp. na kolekcji 66 izolatów S. maltophilia wykazały wrażliwość 75,7% szczepów na kolistynę i 77,3% szczepów na polimyksynę B [64]. Niestety ograniczeniem do stosowania polimyksyn jest niewielka liczba badań klinicznych oraz znaczna toksyczność leków zawierających te związki [65]. Chloramfenikol może być stosowany w terapii ciężkich zakażeń S. maltophilia jedynie w postaci maści na skórę. Wymagane jest jednak wcześniejsze potwierdzenie braku oporności danego szczepu in vitro [62]. Strategią terapeutyczną jest również stosowanie terapii kombinowanej, która zakłada użycie wybranych antybiotyków działających synergicznie. Wprowadzenie jej było spowodowane m.in. dużym poziom oporności szczepów oraz szybkim nabywaniem oporności. Badania in vitro wykazały zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną leków działających synergicznie niż stosowanych w monoterapii, nawet w przypadku gdy izolat jest oporny na jeden lub oba badane związki. Terapia kombinowana jest wskazana szczególnie w przypadkach neutropenii, zapalenia wsierdzia, u pacjentów z immunosupresją i bakteriemią. Wśród leków wykazujących największe działanie synergiczne wobec S. mal­ tophilia możemy wyróżnić następujące zestawienia: trimetoprim-sulfametoksazol i tykarcylina z kwasem klawulanowym, trimetoprim-sulfametoksazol i karbenicylina, tykarcylina z kwasem klawulanowym i cyprofloksacyna, ceftazydym i amikacyna, gatyfloksacyna 266 OLGA ZAJĄC, AGNIESZKA E. LAUDY, STEFAN TYSKI i cefepim oraz tykarcylina z kwasem klawulanowym i amikacyna [14, 19, 62, 65]. 3. Oporność na związki przeciwbakteryjne Stenotrophomonas maltophilia charakteryzuje się dużym poziomem oporności na szerokie spektrum związków przeciwbakteryjnych znacznie różniących się pod względem strukturalnym m.in. antybiotyki β-laktamowe, aminoglikozydy, chinolony, tetracyklinę, chloramfenikol, środki dezynfekcyjne (w tym czwartorzędowe sole amoniowe oraz związki fenolowe) czy jony metali. Badania prowadzone w latach 1994–2006 w wielu ośrodkach na świecie wykazały, że odsetek szczepów opornych na karbepenemy wynosił 88–100%, na cefalosporyny – 34–100%, aminoglikozydy – 58–100%, tetracyklinę – 70–86%, a na chloramfenikol – 35–39% [62]. W ciągu ostatnich lat obserwowany jest także wzrost liczby szczepów opornych na lek pierwszego wyboru trimpetoprim-sulfametoksazol [13]. Do głównych mechanizmów oporności S. malto­ philia należą: wytwarzanie różnych β‑laktamaz, a także innych enzymów modyfikujących cząsteczki antybiotyków oraz obecność pomp MDR (multi-drug resistance), usuwających antybiotyki na zewnątrz komórki bakterii. Co jest szczególnie istotne, niektóre z systemów pomp MDR mają zdolność nie tylko aktywnego usuwania z komórek antybiotyków należących do różnych grup chemicznych, ale także środków dezynfekcyjnych. Dodatkowo S. maltophilia, jak wszystkie pałeczki Gram-ujemne, posiada błonę zewnętrzną, która stanowi barierę fizyczną i m.in. chroni komórkę przed wnikaniem antybiotyków do jej wnętrza. Ponadto zdolność wzrostu szczepów S. maltophilia w postaci biofilmu determinuje ich zwiększoną tolerancję na związki przeciwbakteryjne. 3.1. Oporność na antybiotyki i chemioterapeutyki W ostatnich latach zaobserwowano coraz większą liczbę szczepów S. maltophilia opornych na trimetoprim-sulfametoksazol, lek pierwszego rzutu stosowany w leczeniu zakażeń tymi drobnoustrojami. W badaniach prowadzonych w latach 2001–2012 w Wielkiej Brytanii stwierdzono oporność na trimetoprim-sulfametoksazol aż u 24% szczepów S. maltophilia izolowanych od pacjentów z mukowiscydozą [13]. Oporność na trimetoprim-sulfametoksazol jest związana z występowaniem genów sul. Obecność genu sul1, stanowiącego część integronów klasy I, wykazano u szczepów izolowanych m.in. na Tajwanie, w Hiszpanii, we Włoszech oraz Północnej i Południowej Ameryce [62]. Gen sul2 związany jest z sekwencjami insercyjnymi ISCR2 i może występować zarówno w plazmidzie, jak i w chromoso- malnym DNA. Gen sul2, podobnie jak sul1, wykryto u szczepów pochodzących z różnych części świata [62, 90]. Oporność S. maltophilia tylko na trimpetoprim jest warunkowana obecnością genu dfrA kodującego reduktazę kwasu foliowego [40]. Bardzo istotną dużą grupą antybiotyków stosowaną w leczeniu zakażeń pałeczkami Gram-ujemnymi są β-laktamy, zaburzające syntezę peptydoglikanu, głównego składnika ściany komórkowej bakterii. Za jego ostateczną syntezę i prawidłową strukturę odpowiadają białka PBP (penicillin-binding protein), które są charakterystyczne dla danego drobnoustroju. Antybiotyk β-laktamowy wiążąc się z PBP powoduje zmiany w strukturze peptydoglikanu, co często prowadzi do wycieku cytoplazmy i śmierci komórki bakteryjnej. Ponadto antybiotyki β-laktamowe mogą zaburzać równowagę produktów obrotu metabolicznego peptydoglikanu w cytoplazmie, co prowadzi to do indukcji genów kodujących β-laktamazy. S. maltophilia posiada dwie chromosomalnie kodowane β-laktamazy: L1 i L2. Enzym L1 to metalo-βlaktamaza, która zawiera w swoim centrum aktywnym jony cynku. Ma ona strukturę tetrameru, w którym każdy monomer jest zdolny do przyłączenia dwóch jonów Zn2+. β-laktamaza L1 jest kodowana przez chromosomalny gen blaL1, ma zdolność hydrolizy wszystkich klas β-laktamów (penicylin, cefalosporyn, karbapenemów), z wyjątkiem monobaktamów. Nie jest wrażliwa na działanie inhibitorów β-laktamaz serynowych [22, 50]. Wykazano, że nawet tazobaktam stanowi substrat metalo-β-laktamazy obecnej u szczepu S. maltophilia ULA-511 [27]. Enzym L2 należy do grupy β-laktamaz serynowych i jest zbudowany z dwóch podjednostek tworzących dimer. Koduje go chromosomalny gen blaL2. β-laktamaza L2 ma zdolność rozkładania penicylin i cefalosporyn, jak również hydrolizy aztreonamu, a jej aktywność jest hamowana przez kwas klawulanowy [50, 61, 93]. Sekwencja nukleotydowa genów kodujących enzymy L1 i L2 u poszczególnych szczepów S. maltophilia charakteryzuje się dużą zmiennością. Przeprowadzono badania, które wykazały różnice w sekwencji nukleo­ tydowej od 8% do 20% dla genów blaL1 oraz 4–25% dla genów blaL2, co przekłada się na różnice sekwencji aminokwasowych, odpowiednio, 8–19% i 5–32% [9]. Ekspresja genów kodujących β-laktamazy L1 i L2 jest zwykle indukowana ekspozycją komórek na antybiotyki β-laktamowe [8]. U szczepów należących do grupy filogenetycznej A produkcja zarówno enzymu L1, jak i L2 jest indukowana, w grupie B indukowane jest wytwarzanie enzymu L1, natomiast L2 wydzielany jest konstytutywnie na niskim poziomie. W grupie filogenetycznej C oba enzymy są produkowane konstytutywnie w niewielkich ilościach. Izolaty należące do tej grupy charakteryzują się większą wrażliwością na wszystkie BIOFILM, POMPY MDR I INNE MECHANIZMY OPORNOŚCI STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA związki β-laktamowe z wyjątkiem imipenemu niż izolaty pochodzące z grup A i B [33]. U S. maltophilia indukcja genów blaL1 i blaL2 jest zależna od zespołu genów ampR-ampN-ampG-ampDI. Białka AmpG i AmpN tworzą system permeazy. Odpowiadają za transport z peryplazmy do cytoplazmy produktów degradacji ściany komórkowej, które stanowią ligand dla cząsteczki AmpR będącej regulatorem transkrypcji. Białko AmpDI odpowiada za degradację cząsteczek ligandów [58]. Cząsteczki AmpR są niezbędne do konstytutywnej ekspresji genu blaL1, lecz nie blaL2 oraz do indukowanej ekspresji obu genów [57]. W 2012 roku w Chinach wyizolowano szczep S. maltophilia DCPS-01, który oprócz genów blaL1 i blaL2 posiadał także gen kodujący metalo-β-laktamazę New Delhi (NDM-1). Szczep ten charakteryzował się opornością na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, był wrażliwy jedynie na kolistynę i fluorochinolony [60]. Wśród szczepów klinicznych S. maltophilia wykryto dodatkowo takie β-laktamazy jak: TEM-2 kodowana przez gen zlokalizowany w transpozonie Tn1 [10] oraz enzym CTX-M-1 należący do grupy ESβL (extended spectrum β-lactamase) [2]. W oporności S. maltophilia na chinolony główną rolę odgrywają pompy efflux (szczególnie system SmeDEF) oraz niska przepuszczalność błony zewnętrznej komórek bakterii. W 2008 roku w Japonii w obrębie chromosomu bakteryjnego szczepu S. maltophilia CCUG 5866 wykryto gen Smqnr odpowiadający za niski poziom oporności na powyższe związki [87]. Gen ten był także obecny u 24 niespokrewnionych ze sobą izolatów klinicznych S. maltophilia. Koduje on białko uniemożliwiające przyłączenie chinolonów do miejsc ich oddziaływania – gyrazy DNA i topoizomerazy IV. Jak dotąd, nie wykryto obecności genów Smqnr w plaz­ midach szczepów S. maltophilia. Za oporność na chinolony mogą odpowiadać również mutacje w genach kodujących gyrazę i topoizomerazę IV, lecz prawdopodobnie ten mechanizm oporności nie ma większego znaczenia dla szczepów S. maltophilia [62, 103]. Oporność S. maltophilia na aminoglikozydy może być wynikiem działania kilku mechanizmów, wśród których można wyróżnić: występowanie enzymów modyfikujących cząsteczki aminoglikozydów, oporność temperaturo-zależną oraz mechanizm efflux. Modyfikacja enzymatyczna aminoglikozydów zachodzi przy udziale enzymów kodowanych przez geny chromosomalne. Gen aac(6’)-Iz kodujący enzym acetylotransferazę odpowiada za spadek wrażliwości szczepów głównie na tobramycynę. Geny aph(3’)-IIa i aph(3’)-IIc kodują fosfotransferazy. Enzym APH(3’)-IIa przyczynia się do oporności na wszystkie aminoglikozydy z wyjątkiem gentamycyny, natomiast enzym APH(3’)-IIc odpowiada za oporność szczepów na kanamycynę i neomycynę [65, 66]. 267 Oporność na aminoglikozydy związana jest także z modyfikacją struktury błony zewnętrznej komórek. Stanowi ona miejsce wiązania m.in. dla antybiotyków kationowych, jakimi są aminoglikozydy. W zależ­ ności od temperatury szczepy S. maltophilia są zdolne do zmiany rozmiarów cząsteczek O-polisacharydów poprzez zmianę długości jego bocznych łańcuchów oraz zawartości fosforanów w lipopolisacharydzie (LPS) błony zewnętrznej. Obserwowano większą zawartość ujemnie naładowanych grup fosforanowych w LPS, stanowiących miejsce przyłączania aminoglikozydów, w temp. 37°C w porównaniu do temp. 30°C. W związku z tym, szczepy S. maltophilia charakteryzują się zwiększoną opornością na powyższe antybiotyki w temp. 30°C niż w 37°C [62, 65, 76]. 3.2. Oporność na środki dezynfekcyjne Szczepy S. maltophilia są trudno eliminowane przy użyciu powszechnie stosowanych środków dezynfekcyjnych. Podchloryn sodu o stężeniu 0,1%, używany m.in. do dezynfekcji ssaków medycznych, redukuje liczbę komórek bakterii jedynie o 1–2 log10. Procedura dezynfekcji obejmuje wstępne mycie z użyciem bierzącej wody, a następnie zanurzenie ssaków na okres 2 h w 0,1% roztworze podchlorynu sodu [102]. S. maltophilia wykazują tolerancję wobec triklosanu – przedstawiciela związków fenolowych. Triklosan posiada zdolność indukcji genów kodujących pompę SmeDEF, która usuwa jego cząsteczki na zewnątrz komórek bakteryjnych [37, 85]. W związku z tym, po powtarzającej się ekspozycji drobnoustrojów na triklosan obserwowany jest spadek wrażliwości izolatów [53]. Inny powszechnie stosowany środek dezynfekcyjny, jakim jest chlorheksydyna wykazuje zdolność redukcji liczby komórek szczepu klinicznego S. maltophilia G478 o 5 log10 jedynie w stężeniu powyżej 500 mg/l. Wartość MIC tego związku wobec S. maltophilia G478 wynosi 175 mg/l, podczas gdy wartości MIC chlor­ heksydyny dla szczepów klinicznych z innych rodzajów pałeczek Gram-ujemnych mieszczą się w przedziale 10–250 mg/l [39]. W a n g i wsp. [94] wykryli u 10,5% przebadanych szczepów S. maltophilia gen qacE∆1 kodujący oporność na szeroką grupę środków dezynfekcyjnych jaką stanowią czwartorzędowe sole amoniowe (m.in. chlorek benzalkoniowy, cetrimid). Gen qacE∆1 jest związany z integronami klasy 1. 3.3. Oporność na jony metali Szczep S. maltophilia Sm777 jest zdolny do wzrostu w obecności wysokich stężeń toksycznych jonów metali, w szczególności Cd2+, jak również Cu2+, Pb2+, Co2+, Zn2+, Hg2+ i Ag+. Gęstość hodowli bakteryjnych wyrosłych na 268 OLGA ZAJĄC, AGNIESZKA E. LAUDY, STEFAN TYSKI Tabela I Pompy MDR zidentyfikowane u pałeczek S. maltophilia Rodzina Pompa Substraty Regulator Piśmiennictwo RND SmeDEF erytromycyna, chloramfenikol, tetracykliny, fluorochinolony, triklosan SmeT SmeABC aminoglikozydy, β-laktamy, fluorochinolony SmeR SmeS 14, 15, 55 SmeU1VWU2X chloramfenikol, chinolony, tetracykliny SmeRv 16, 21 SmeIJK aminoglikozydy, tetracykliny, cyprofloksacyna Nieznany 21, 32 SmeYZ aminoglikozydy Nieznany 21, 32 ABC SmrA cyprofloksacyna, norfloksacyna, tetracyklina Nieznany 3 36, 37, 51, 65, 83, 84 MFS EmrCABsm kwas nalidyksowy, erytromycyna, karbonylocyjanek EmrRsm 3-chlorofenylohydrazonu, tetrachlorosalicylanilid 44 ? kwas fusydowy 41 FuaABC podłożach zawierających sole powyższych metali jest wysoka, może osiągać wartość 109 cfu/ml [68]. Tolerancja S. maltophilia na związki kadmu jest związana m.in. z obecnością genów cadA i cadC odpowiedzialnych za jego usuwanie z komórek [6]. Gen cadA koduje białko systemu efflux, natomiast produkt białkowy genu cadC pełni funkcję regulatora transkrypcji. Struktura tych genów oraz zawartość par G-C wskazują na to, że wywodzą się one od bakterii Gram-dodatnich. Ich homologi wykryto m.in. u szczepów Staphylococcus aureus, od których prawdopodobnie zostały nabyte przez szczepy S. maltophilia. Transfer genów pomiędzy komórkami bakterii jest możliwy, gdy bytują one w tym samym środowisku, a zarówno S. aureus jak i S. maltophilia są często izolowane z dróg oddechowych pacjentów z mukowiscydozą [6]. Innym mechanizmem pozwalającym komórkom bakterii na detoksykację związków kadmu jest ich przekształcanie do siarczków kadmu. Szczepy S. maltophi­ lia w warunkach tlenowych, na podłożu stałym zawierającym 0,5 mM CdCl2, wyrastają w postaci żółtych kolonii, co wskazuje na wytrącanie związków kadmu w postaci CdS. Dokładny mechanizm tego zjawiska jednak nie jest do końca wyjaśniony [68]. Dodatkowo, u drobnoustrojów rosnących w obecności CdCl2 zaobserwowano wzrost puli cysteiny wewnątrzkomórkowej. Wolna cysteina jest źródłem stresu oksydacyjnego dla komórki, ale posiada ona także zdolność chelatowania jonów kadmu, co chroni komórkę przed toksycznym wpływem tego metalu. Powstanie chelatów powoduje zmniejszenie ilości zarówno wolnej cysteiny, jak i wolnego kadmu w komórce [68]. Szczep S. maltophilia Sm777 charakteryzuje się możliwością wzrostu w obecności toksycznych selenianów i tellurynów. Mechanizm oporności związany jest ze zdolnością drobnoustrojów do redukcji powyższych oksyanionów do wolnego telluru (Te0) i selenu (Se0). Akumulacja Te0 i Se0 następuje wewnątrz komórki bakteryjnej [68]. FuaR Aktywność przeciwdrobnoustrojowa jonów srebra związana jest z ich przyłączaniem do białek obecnych w ścianach komórkowych bakterii. Następuje zachwianie potencjału elektrycznego, co skutkuje zahamowaniem procesów metabolicznych i śmiercią komórek. Ponadto srebro ma zdolność przyłączania się do DNA [88]. H u a n g i wsp. [43] badali aktywność in vitro jonów srebra i miedzi, a także połączenia srebro-miedź w eradykacji szczepów S. maltophilia rosnących w formie planktonowej. Uzyskano redukcję ponad 99,999% bakterii w ciągu 6 h stosując jony miedzi w zakresie stężeń od 200 do 800 μg/l lub używając jony srebra w stężeniach 40 i 80 μg/l. Połączenie jonów srebra i miedzi w stężeniach 200/20 µg/l i 400/40 µg/l charakteryzowało się antagonistycznym działaniem wobec szczepów S. maltophilia [43]. 4. Systemy pomp Jednym z głównych mechanizmów lekooporności bakterii S. maltophilia jest obecność pomp MDR aktywnie usuwających antybiotyki i inne związki przeciwbakteryjne na zewnątrz komórek bakterii. Do tej pory u S. maltophilia wykryto pompy MDR (multi-drug resistance) należące do 3 rodzin: RND, ABC i MFS. Aktywność większości opisanych pomp jest indukowana obecnością antybiotyków. W tabeli I zestawiono pompy odpowiedzialne za zjawisko efflux zidentyfikowane u pałeczek S. maltophilia. 4.1. Rodzina RND (resistance-nodulation-division family) Najważniejszą z punktu widzenia lekooporności jest rodzina pomp RND. Pompy te charakteryzują się szerokim spektrum substratowym, usuwają z komórek bakterii antybiotyki należące do różnych klas, jak również środki dezynfekcyjne i antyseptyczne. Są to pompy BIOFILM, POMPY MDR I INNE MECHANIZMY OPORNOŚCI STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA protonowe – ich działanie jest oparte na antyporcie proton-substrat [46]. Pompy RND zbudowane są z trzech części: białek RND tworzących kanał w błonie cytoplazmatycznej, białek OMF odpowiedzialnych za transport substancji poprzez błonę zewnętrzną i białek MFP łączących białka obecne w błonie cytoplazmatycznej i w błonie zewnętrznej [21, 51]. Białka MFP zwykle są specyficzne dla konkretnych białek RND i obie grupy białek są kodowane w obrębie tego samego operonu. Białka błony zewnętrznej (OMF) mogą być kodowane przez geny zlokalizowane w obrębie tego samego operonu co para RND/MFP, ale mogą również podlegać niezależnej regulacji [21]. Pierwszą pompą należącą do rodziny RND wykrytą u S. maltophilia był system SmeDEF. Został on scharakteryzowany po raz pierwszy przez Alonzo i Martinez w 2000 roku; badali oni sekwencję chromosomalnego DNA S. maltophilia pod kątem mechanizmów odpowiedzialnych za wielolekooporność szczepu [5]. Przesłanką do poszukiwania pomp MDR u S. mal­ tophilia było wykrycie zjawiska efflux u spokrewnionej bakterii Gram-ujemnej Pseudomonas aeruginosa. W obrębie badanego odcinka chromosomalnego DNA S. maltophilia zidentyfikowano 3 geny: smeD, smeE i smeF. Sekwencje aminokwasowe produktów tych genów wykazały podobieństwo do kilku komponentów pomp efflux obecnych u różnych bakterii Gram-ujemnych. Białko SmeD wykazało homologię do białek z grupy MFP, w tym największe podobieństwo (48%) do AcrA i AcrE występujących u E. coli. Wykazało natomiast stosunkowo małe podobieństwo (41%) do białka SmeA z grupy RND, pochodzącego ze szczepu S. maltophilia. Białko SmeE wykazało homologię do białek RND, w tym do AcrB i AcrF z E. coli (odpowiednio w 61% i 58%). Produkt białkowy trzeciej ramki odczytu – SmeF wykazał podobieństwo do białek błony zewnętrznej (OMF), największe do białka SmeC szczepu S. maltophilia [5]. Pompa SmeDEF usuwa z komórek takie antybiotyki jak: erytromycyna, chloramfenikol, tetracykliny, fluorochinolony, a także triklosan [46, 65, 85]. Ekspresja genów smeDEF jest regulowana przez białko SmeT pełniące rolę represora. Gen kodujący SmeT znajduje się powyżej operonu kodującego pompę. Białko SmeT należące do rodziny regulatorów TetR ma strukturę homodimeru, gdzie każda podjednostka składa się z 9 helis tworzących 2 domeny. Białko SmeT wiąże się do obszaru operatora o długości 28 pz zlokalizowanego pomiędzy genami smeT i smeD, który nakłada się na sekwencje promotorów smeT i smeDEF. W wyniku tego represor SmeT hamuje transkrypcję nie tylko genów pompy SmeDEF, ale także genów własnych. SmeT wiąże się z operatorem w dwóch miejscach tworząc dwa kompleksy (dwa homodimery SmeT przypadają na jeden operator). Kluczowe znaczenie dla 269 wiązania represora ma sekwencja TGTATGT obecna w nici kodującej pompę. Drugi homodimer rozpoznaje podobną sekwencję komplementarnej nici. Wykazano, że mutacje w genach kodujących białko SmeT oraz mutacje w sekwencji TGTATGT mogą przyczyniać się do nadekspresji genów operonu smeDEF [36, 83, 84]. Co więcej, składnik past do zębów, domowych środków czyszczących, czy modnych jeszcze niedawno mydeł antyseptycznych – triklosan indukuje nadekspresję systemu SmeDEF poprzez przyłączanie się do cząsteczki represora SmeT, co stymuluje lekooporność szczepów [37, 85]. Kolejną wykrytą pompą RND obecną u S. malto­ philia był system SmeABC [55]. Geny smeA, smeB i smeC kodują odpowiednio białka MFP, RND i OMF. Sekwencje aminokwasowe komponentów systemu SmeABC charakteryzują się dużym podobieństwem m.in. do sekwencji składników systemu MexAB-OprM obecnego u P. aeruginosa oraz SmeDEF u S. maltophilia [55]. Wykazano, że na lekooporność ma wpływ jedynie białko SmeC, które posiada zdolność do współpracy także z innymi systemami efflux. Delecja genu smeC powoduje utratę oporności związaną z obecnością systemu SmeABC [14, 55]. Nadekspresja genów smeABC wiąże się z występowaniem u szczepów oporności na aminoglikozydy, β-laktamy oraz fluorochinolony [15]. Po wprowadzeniu genu smeC do zmutowanego szczepu P. aeruginosa niewytwarzającego własnego białka OprM, gen ten ulegał ekspresji. Białko SmeC przejęło funkcję białka OprM i było zdolne do współpracy jako część systemu MexAB-SmeC [55]. Gen smeC posiada swój własny słaby promotor, co powoduje, że może on ulegać ekspresji samodzielnie lub z całym operonem smeABC. Transkrypcja operonu smeABC jest regulowana przez dwuskładnikowy system regulacyjny, kodowany przez geny smeR i smeS . Geny te prawdopodobnie tworzą osobny operon i ulegają wspólnej transkrypcji niezależnie od genów kodujących pompę. SmeS jest białkiem sensorowym, natomiast SmeR pełni rolę regulatora odpowiedzi. W przypadku braku genu smeR ekspresja smeC zachodzi jedynie przy udziale własnego promotora [55]. System efflux SmeU1VWU2X obecny u S. maltophi­ lia należy do grupy pomp RND [16]. Operon kodujący ten system składa się aż z pięciu genów: smeV (koduje białka MFP), smeW (białka RND), smeX (białka OMF), smeU1 i smeU2. Geny smeU1 i smeU2 kodują krótko łańcuchową dehydrogenazę/reduktazę (SDR) i zlokalizowane są odpowiednio: smeU1 powyżej genu smeV, a smeU2 między genami smeW i smeX . Sekwencja aminokwasowa białek SmeU1 i SmeU2 jest zgodna tylko w 21%. Porównanie SmeU1VWU2X z innymi pompami RND wykazało duże podobieństwo do systemów obecnych u Xanthomonas campestris (DauE-MexEMexF-Xcc1441-OprN) i P. aeruginosa (MexEF-OprN). 270 OLGA ZAJĄC, AGNIESZKA E. LAUDY, STEFAN TYSKI Zgodność sekwencji aminokwasowej poszczególnych białek, w pierwszym przypadku wynosiła 51–81%, a w drugim wahała się w granicach 48–58%. Substratami systemu SmeU1VWU2X są tetracykliny, chloramfenikol i chinolony [16]. Ekspresja operonu smeU1VWU2X jest regulowana przez białko SmeRv należące do rodziny LysR. Gen smeRv zlokalizowany jest w sąsiedztwie operonu smeU­ 1VWU2X, powyżej genu smeU1. SmeRv prawdopodobnie pełni rolę pozytywnego regulatora, czego potwierdzeniem jest 78-krotny wzrost ekspresji kodującego go genu w szczepie wykazującym nadekspresję operonu smeU1VWU2X w porównaniu do szczepu dzikiego. Istnieje również hipoteza, która mówi, że białko SmeRv może funkcjonować jako pozytywny bądź negatywny regulator w zależności od obecności liganda [16, 21]. Natomiast geny kodujące pozostałe dwie pompy – SmeIJK i SmeYZ, obecne u S. maltophilia, ulegają ekspresji na stałym poziomie przyczyniając się do lekooporności tych szczepów. Pompa SmeIJK odpowiada za oporność na aminoglikozydy, tetracykliny i cyprofloksacynę, natomiast pompa SmeYZ usuwa z komórek bakterii aminoglikozydy [32, 75]. Wykazano, że geny smeZ, smeJ i smeK mogą ulegać skoordynowanej nadekspresji, co skutkuje zwiększeniem oporności szczepów na antybiotyki. Nadprodukcja białka SmeZ powoduje wzrost najmniejszego stężenia hamującego (MIC) aminoglikozydów. Zwiększona produkcja białek SmeJ i SmeK przejawia się wzrostem MIC tetracyklin i cyprofloksacyny oraz warunkuje oporność na lewofloksacynę [32]. Wykazano, że mutacje w genach smeJ i/lub smeK szczepów wykazujących nadekspresję powodują obniżenie wartości MIC tetracyklin i cyprofloksacyny oraz przywracają wrażliwość szczepów na lewofloksacynę. Mutacje w genie smeZ przyczyniają się do spadku wartości MIC aminoglikozydów, ale nie przywracają wrażliwości bakterii na ten antybiotyk. Geny smeJ i smeK zlokalizowane są w obrębie jednego operonu, nie wykryto do tej pory żadnych genów regulatorowych położonych w jego sąsiedztwie. W pobliżu genu smeZ zlokalizowane są natomiast geny kodujące system dwuskładnikowy, lecz nieznana jest jak dotąd jego rola w regulacji ekspresji genów kodujących pompy SmeIJK i SmeYZ [21, 32]. 4.2. Rodzina MFS (major facilitator superfamily) Wśród szczepów S. maltophilia wykryto do tej pory tylko jedną pompę z rodziny MSF – EmrCABsm [44]. Jest ona homologiem pompy EmrAB oraz EmrKY obecnych u E. coli, VceAB u Vibrio cholerae oraz FarAB obecnej u Neisseria gonorrhoeae [44]. Energia do pracy tej grupy pomp pochodzi z gradientu elektrochemicznego – cząsteczka antybiotyku transportowana jest na zewnątrz komórki, a do wnętrza wprowadzany jest pro- ton. Pompy MSF zbudowane są zwykle z pojedynczego transportera białkowego znajdującego się w błonie cytoplazmatycznej, który usuwa substancje do przestrzeni peryplazmatycznej [51]. Niektóre pompy, w tym EmrCABsm obecna u S. maltophilia, prawdopodobnie zbudowane są z trzech części [44]. Transkrypcja genów kodujących pompę jest regulowana przez białko EmrRsm, należące do regulatorów typu MarR [44]. Pełni ono rolę represora – wiąże się do sekwencji w obrębie promotora i uniemożliwia zajście transkrypcji. Zjawisko derepresji transkrypcji zachodzi w obecności induktora, który wiąże się do cząsteczki represora i osłabia tym samym powinowactwo represora do promotora umożliwiając transkrypcję genów. W przypadku nieobecności induktora regulator wydzielany jest na stałym poziomie. Substratami dla pompy EmrCABsm są związki hydrofobowe, do których należą m.in.: kwas nalidyksowy, erytromycyna, karbonylocyjanek 3-chlorofenylohydrazonu i tetrachlorosalicylanilid [44]. Ekspresja operonu emrCABsm nie jest indukowana obecnością tych związków. Przypuszcza się, że pompa EmrCABsm pełni fizjologiczną rolę w usuwaniu z komórki naturalnych substancji szkodliwych pochodzących ze środowiska lub będących produktami jej własnego metabolizmu, a nie jest ściśle ukierunkowana na transportowanie na zewnątrz komórki antybiotyków i wyżej wymienionych związków [44]. 4.3. Rodzina ABC (ATP-binding cassette family) U S. maltophilia wykryto jedną pompę z rodziny ABC – SmrA [3]. Pompy należące do tej grupy energię do pracy czerpią z rozpadu cząsteczek ATP, są transporterami białkowymi tworzącymi kanały w błonie cytoplazmatycznej. Kanał pompy SmrA ma strukturę homodimeru, a każdy monomer zbudowany jest z częś­ci hydrofobowej i hydrofilowej. Domenę hydrofobową tworzy 6 transbłonowych helis, których zadaniem jest wiązanie substratu oraz jego transport przez błonę komórkową. Domena hydrofilowa NBD (nucleo­tyde binding domein) obecna jest po wewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej i bierze ona udział w hydrolizie ATP. W obrębie genów kodujących pompy ABC występują liczne sekwencje konserwowane m.in. motywy Walker A i Walker B obecne w domenie wiążącej nukleotydy [51, 95]. Pompa SmrA wykazuje duże podobieństwo do transporterów ABC obecnych u Lacto­coccus lactis (LmrA) i Vibrio cholerae (VcaM) oraz do ludzkiej glikoproteiny P, kodowanej przez gen MDR1. Porównanie sekwencji aminokwasowej SmrA z danymi zawartymi w bazie NCBI (National Center for Biotechnology Information) wskazało na duże podobieństwo tej sekwencji do białek obecnych u wielu gatunków bakterii Gram-ujemnych, w tym P. aerugi­ nosa i Acinetobacter spp. [3]. BIOFILM, POMPY MDR I INNE MECHANIZMY OPORNOŚCI STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA Przeprowadzono badania, w których porównywano wartości MIC dużej grupy antybiotyków dla szczepu E. coli posiadającego wprowadzony gen smrA oraz dla szczepu E. coli nieposiadającego tego genu. Szczepy z obecną pompą SmrA wykazały 8-krotny wzrost wartości MIC cyprofloksacyny, norfloksacyny i tetracykliny. Badano również wewnątrzkomórkowe stężenie norfloksacyny w przypadku obu powyższych szczepów. Wykazano, że ma ono dużo niższą wartość u bakterii E. coli z genem smrA, co świadczy o aktywności pompy [3]. 4.4. Pompa FuaABC Tajwańscy naukowcy zidentyfikowali u S. maltophi­ lia jeszcze jedną pompę odpowiedzialną za zjawisko efflux – FuaABC, usuwającą z komórek bakterii kwas fusydowy [41]. Związek ten jest mykotoksyną wytwarzaną przez grzyby z rodzaju Fusarium bytujące wraz ze S. maltophilia w tej samej niszy ekologicznej w obrębie ryzosfery. Najprawdopodobniej system efflux FuaABC powstał jako mechanizm obrony przed szkodliwym wpływem kwasu fusydowego na komórki drobnoustrojów. Analizy filogenetyczne wykazały, że system FuaABC powinien zostać sklasyfikowany jako podrodzina pomp ABC lub zupełnie nowa rodzina. Energia do pracy pompy jest pozyskiwana z gradientu protonowego. Geny kodujące system FuaABC tworzą operon fuaABC, którego transkrypcja jest regulowana przez gen fuaR zlokalizowany powyżej genów wchodzących w skład operonu. Białko FuaR należy do rodziny AraC, może pełnić zarówno rolę aktywatora, jak i represora – w obecności kwasu fusydowego pracuje jako aktywator, przy jego braku jako represor. W przypadku nieobecności białka FuaR np. w wyniku uszkodzenia genu fuaR, obecność kwasu fusydowego nie powoduje aktywacji transkrypcji. System FuaABC jest odpowiedzialny za usuwanie wyłącznie kwasu fusydowego, żaden z przebadanych do tej pory związków przeciwdrobnoustrojowych nie stanowił substratu tego systemu pomp [41]. 271 sygnałowych tzw. autoinduktorów (AI) wytwarzanych przez bakterie, a następnie wydzielanych na zewnątrz ich komórek. Im większa liczebność populacji bakterii, tym większe jest stężenie autoinduktorów w środowisku. Po osiągnięciu odpowiedniego stężenia AI łączą się z właściwymi receptorami obecnymi wewnątrz komórek bakterii lub w błonie cytoplazmatycznej i prowadzą do równoczesnej aktywacji lub represji genów we wszystkich komórkach danej populacji. QS odgrywa ważną rolę w takich procesach jak: wirulencja, koniugacja, bioluminescencja czy tworzenie biofilmu [1, 49, 63, 91]. Zjawisko quorum sensing występuje zarówno u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. W obu tych grupach przebiega jednak inaczej ze względu na różną budowę ściany komórkowej. U bakterii Gram-ujemnych rolę autoinduktorów pełnią zwykle N-acylowane laktony homoseryny (AHL). Substratami do ich syntezy są S-adenozylometionina (SAM) i białko Acyl-ACP [1, 63, 78]. Gatunek S. maltophilia charakteryzuje się obecnością autoinduktorów, które nie należą do pochodnych laktonów homoseryny. Bakterie te posiadają system komunikacji międzykomórkowej oparty na syntezie cząsteczek DSF (diffusible signal factor). Cząsteczki DSF stanowią grupę kwasów tłuszczowych, w których skład wchodzi kwas cis-11-metylo-2-dodekenowy (Rys. 1) oraz jego 7 pochodnych. Dwie z nich stanowią nasycone kwasy tłuszczowe, a pozostałe to kwasy nienasycone z podwójnym wiązaniem w pozycji 2 [1, 78]. System DSF jest regulowany przez zespół genów rpf (regulation of pathogenicity factors). Najistotniejszym elementem systemu jest gen rpfF kodujący syntazę DSF. Jego transkrypcja jest pozytywnie regulowana przez białko CRP (aktywator transkrypcji), które posiada dwa miejsca wiązania powyżej promotora rpfF [1]. Białka RpfC i RpfG tworzą dwuskładnikowy system regulacyjny odpowiedzialny za odbiór sygnału, gdzie RpfC pełni rolę białka sensorowego, natomiast RpfG jest regulatorem odpowiedzi. Geny rpfC i rpfG zlokalizowane są w obrębie operonu rpfBFCG i podlegają wspólnej regulacji [28]. 5. Biofilm bakteryjny i system quorum sensing Zdolność adhezji szczepów S. maltophilia do wilgotnych powierzchni tworzyw sztucznych – cewników, nebulizatorów, endoskopów, jak i powierzchni biotycznych oraz do tworzenia biofilmu nie jest klasycznym mechanizmem oporności, jednak znacząco przyczynia się do spadku wrażliwości bakterii na związki przeciwdrobnoustrojowe [23]. Powstawanie biofilmu jest silnie związane ze zjawiskiem quorum sensing (QS), które polega na wzajemnej komunikacji populacji komórek bakteryjnych przebiegającej za pośrednictwem specjalnych cząsteczek Rys. 1. Wzór cząsteczki DSF [12] System DSF jest odpowiedzialny za regulację wirulencji drobnoustrojów poprzez wpływ na syntezę pozakomórkowych enzymów i polisacharydów oraz tworzenie biofilmu [4]. Prowadzono badania, w których porównywano wirulencję „dzikiego” szczepu S. malto­ philia 279a oraz tego samego szczepu z mutacją w genie rpfF. Mutant w porównaniu do dzikiego szczepu charakteryzował się obniżoną mobilnością, spadkiem produkcji proteazy, zmianami w LPS, zwiększoną 272 OLGA ZAJĄC, AGNIESZKA E. LAUDY, STEFAN TYSKI wrażliwością na antybiotyki i metale ciężkie, niezdol­ nością do tworzenia mikrokolonii oraz obniżoną zjadliwością. Egzogenny dodatek cząsteczek DSF lub wklonowanie genu rpfF spowodowało przywrócenie zdolności do tworzenia mikrokolonii, mobilność i produkcję proteazy [1, 4, 28]. W związku z dużą opornością na antybiotyki szczepów S. maltophilia poszukiwane są związki będące inhibitorami QS. Zahamowanie tego zjawiska prowadziłoby do osłabienia chorobotwórczości bakterii. Badania wykazały, że emodyna, będąca składnikiem leków tradycyjnej medycyny chińskiej, jest w stanie zahamować QS, a co z tym związane, powstawanie biofilmu u S. maltophilia [1, 26]. Zjawisko wzajemnej komunikacji bakterii jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania biofilmu bakteryjnego. Biofilm jest to wielokomórkowe skupisko drobnoustrojów, jednego bądź wielu gatunków, przylegające do powierzchni abiotycznych lub powierzchni komórek organizmów żywych [49]. Zdolność do tworzenia przez komórki bakterii biofilmu stanowi ważny czynnik ich wirulencji. Biofilm chroni komórki bakteryjne przed działaniem mechanizmów obronnych gospodarza, jak również zwiększa ich oporność na antybiotyki i inne środki przeciwbakteryjne [73]. Szczepy S. maltophilia posiadają zdolność adhezji zarówno do powierzchni biotycznych np. komórek nabłonka dróg oddechowych, jak i abiotycznych – szkła i różnego rodzaju materiałów stosowanych do produkcji wyrobów medycznych (endoskopów, cewników, protez naczyniowych, soczewek kontaktowych) [23, 73]. Biofilm bakteryjny powstaje w kilku etapach, na które mają wpływ zarówno właściwości zasiedlanego materiału lub kolonizowanej powierzchni komórek, jak i cechy komórek zasiedlających [14, 49]. Do najważniejszych cech bakterii S. maltophilia wpływających na tworzenie biofilmu należą: zdolność ruchu, obecność flagelli i fimbrii, hydrofobowość, wydzielanie EPS (extracellular polymeric substances) [74]. P o m p i l i o i wsp. [73] prowadzili badania, w których analizowano tworzenie przez szczepy S. maltophilia biofilmu na linii komórek pochodzących z nabłonka oskrzeli pacjenta z mukowiscydozą (CF – cystic fibrosis). Badane szczepy zostały wyizolowane od chorych cierpiących na mukowiscydozę. Mierzono zdolność szczepów do adhezji do komórek nabłonka oraz tworzenia biofilmu po 2 h i 24 h od inokulacji. Wszystkie szczepy uformowały biofilm, jednak nie wykazano korelacji między zdolnością do adhezji, a ilością wytworzonego biofilmu [73]. Badano również udział flagelli w adhezji S. mal­ tophilia do komórek nabłonka. W tym celu skonstruowano mutanty szczepów S. maltophilia posiadające zablokowany gen kodujący enzym ATP-azę niezbędną do prawidłowej pracy flagelli. Brak enzymu znacznie obniżył zdolność komórek bakteryjnych do adhezji, ale nie została ona całkowicie zablokowana, co świadczy o udziale w tym procesie, oprócz flagelli, także innych czynników. Zdolność ruchu typu „swimming” i „twit­ ching” szczepów S. maltophilia nie wpływa ani na adhezję, ani na proces tworzenia biofilmu na powierzchni komórek nabłonka oskrzeli [73]. Analizowano również powstawanie biofilmu S. maltophilia na powierzchniach abiotycznych hydrofobo­ wych t.j. polistyren, polipropylen oraz hydrofilowych – borokrzemian [23]. Wykazano brak zależności pomiędzy adhezją wybranych szczepów do polistyrenu i komórek nabłonka oskrzeli [73]. Najsilniejszy biofilm został utworzony na powierzchni polistyrenowej, na pozostałych dwóch tworzywach występowały różnice w biofilmie w zależności od badanego szczepu. Wykazano związek pomiędzy występowaniem ruchu „twit­ ching” u szczepów a tworzeniem biofilmu na trzech powyższych powierzchniach, natomiast zdolność do ruchu typu „swimming” nie była związana z tworzeniem biofilmu na polipropylenie, polistyrenie i borokrzemianie. Żaden z badanych szczepów nie wykazywał ruchu typu „swarming” [23]. Sprzeczne w stosunku do powyższych wyniki uzyskali P o m p i l i o i wsp. [74], którzy wykazali brak zależności między ruchami typu „twitching”, a zdolnością do adhezji i wytwarzania na polistyrenie biofilmu przez szczepy S. maltophilia. W związku z zasiedlaniem przez S. maltophilia wyrobów medycznych często stosowanych u pacjentów hospitalizowanych zbadano zdolność adhezji tych drobnoustrojów do powierzchni trzech cewników wykonanych odpowiednio z: PVC, silikonu i gumy. We wszystkich przypadkach otrzymano wysoki współczynnik adhezji [23]. Dobór antybiotyków do terapii zakażeń S. mal­ tophilia jest oparty na testach oceny lekowrażliwości przeprowadzanych na bakteriach rosnących w formie planktonowej. U chorych bakterie te przeważnie tworzą biofilm, znacznie mniej wrażliwy na działanie antybiotyków i innych związków przeciwbakteryjnych [99]. Przebadano wrażliwość na szeroką grupę antybiotyków 125 izolatów rosnących w postaci planktonowej, jak i biofilmu. Następujące związki przeciwbakteryjne: β-laktamy, fluorochinolony, kolistyna, tobramycyna, doksycyklina i trimetoprim-sulfametoksazol wykazały o ok. 20–80% słabsze działanie na szczepy rosnące w postaci biofilmu niż w formie planktonowej. Najbardziej skutecznymi antybiotykami wobec szczepów S. maltophilia rosnących w obydwu badanych formach były lewofloksacyna i kolistyna [99]. Związki powszechnie stosowane jako lek z wyboru w leczeniu zakażeń S. maltophilia – trimetoprim-sulfametoksazol są skuteczne tylko u mniej niż 10% szczepów tworzących biofilm [24, 56, 99]. Niektóre antybiotyki w stężeniach niższych niż wartości MIC są zdolne do zmniejszenia zdolności do BIOFILM, POMPY MDR I INNE MECHANIZMY OPORNOŚCI STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA adhezji i tworzenia biofilmu przez dany szczep, mimo, iż nie powodują śmierci drobnoustrojów. Największą skuteczność wykazała moksyfloksacyna, antybiotyk z grupy fluorochinolonów stosowany w zakażeniach układu oddechowego wywołanych bakteriami S. mal­ tophilia opornymi na trimetoprim-sulfametoksazol [14, 72]. Moksyfloksacyna jest zdolna do hamowania adhezji komórek poprzez m.in. wpływ na syntezę i ekspresję adhezyn, a także poprzez zmniejszenie hydrofobowości przestrzeni międzykomórkowej [72]. Istnieje również szereg czynników środowiskowych, które mogą mieć wpływ na tworzenie biofilmu przez szczepy S. maltophilia. Należą do nich: stężenie fosforanów, pH, temperatura, warunki tlenowe lub beztlenowe, obecność jonów miedzi i srebra. Obecność fosforanu sodu powoduje wzrost biofilmu bakteryjnego, dlatego zaleca się monitorowanie stężenia jonów sodu i fosforanowych w systemach hydraulicznych w szpitalach. Odczyny środowiska o pH 7,5 i 8,5 stwarzają lepsze warunki do rozwoju biofilmu niż pH 5,5. Większy wzrost biofilmu obserwowany był także w temperaturze 32°C niż w 37°C i 18°C, a także w warunkach tlenowych i w obecności 6% CO2, niż w warunkach beztlenowych [14, 25]. Badano także wpływ jonów miedzi i srebra w eradykacji szczepów S. maltophilia rosnących w formie biofilmu [43]. Jony srebra w postaci azotanu srebra o stężeniu 100 µg/l wykazują brak aktywności wobec szczepów tworzących biofilm bakteryjny. Brak aktywności jest spowodowany adsorpcją jonów metalu przez strukturę biofilmu. Inhibicja biofilmu bakteryjnego została osiągnięta przy stężeniu azotanu srebra 10 000 µg/l [14, 88]. Badano również wpływ połączenia srebro-miedź na biofilm bakteryjny obecny w systemie dystrybucji wody. Wszystkie badane stężenia (200/20 µg/l – 800/80 µg/l) wykazały redukcję liczb komórek S. maltophilia tworzących biofilm po 48 h ekspozycji [86]. P a l a n i s a m y i wsp. [69] analizowali wpływ popularnych ostatnio cząstek nanosrebra na biofilm szczepów Pseudomonas aeruginosa. Współczynnik zahamowania wzrostu szczepów opornych wyniósł 56%, co pozwala przypuszczać, że nanocząstki srebra będą także aktywne wobec szczepów S. maltophilia. 6. Podsumowanie Każdego roku odnotowujemy coraz wyższą liczbę zakażeń szczepami S. maltophilia, szczególnie niebezpiecznych dla pacjentów z osłabioną odpornością oraz długotrwale hospitalizowanych. Bakterie te wywołują infekcje zarówno u dzieci, jak i dorosłych, powodują śmierć u 21–69% osób z bakteriemią [65]. Ich zdolność do tworzenia biofilmu na powierzchni komórek nabłonkowych oraz wyrobów medycznych, a także 273 rosnąca oporność na wiele związków przeciwbakteryjnych o szerokim spektrum działania sprawiają, że terapia zakażeń S. maltophilia jest trudnym wyzwaniem i powinna ewoluować. Niezbędne jest prowadzenie badań pozwalających na dokładnie poznanie zjawiska efflux, odpowiedzialnego w dużej mierze za osłabioną wrażliwość na antybiotyki, oraz dalsze poszukiwania nowych środków umożliwiających zahamowanie aktywności pomp MDR oraz zjawiska quorum sensing. Piśmiennictwo 1. AboZahra R.: Quorum sensing and interspecies interactions in Stenotrophomonas maltophilia. Brit. Microbiol. Res. J. 3, 414–422 (2013) 2. Al Naiemi N., Duim B., Bart A.: A CTX-M extender-spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomo­ nas maltophilia. J. Med. Microbiol. 55, 1607–1608 (2006) 3.Al.-Hamad A., Upton M., Burnie J.: Molecular cloning and characterization of SmrA, a novel ABC multidrug efflux pump from Stenotrophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Chemother. 64, 731–734 (2009) 4. Alavi P., Müller H., Cardinale M., Zachow Ch., Sánchez M.B., Martinez J.L., Berg G.: The DSF quorum sensing system controls the positive influence of Stenotophomonas maltophilia on plants. PLoS One, 8, 1–9 (2013) 5. Alonso A., Martinez J.L.: Cloning and characterization of SmeDEF, a novel multidrug efflux pump from Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob. Agents Chempther. 44, 3079–3086 (2000) 6. Alonso A., Sanchez P., Martinez J.L.: Stenotrophomonas malto­ philia D457R contains a cluster of genes from Gram-positive bacteria involved in antibiotic and heavy metal resistance. Anti­ microb. Agents Chemother. 44, 1778–1782 (2000) 7. Assis E.A., Ouattara A.S., Thierry S., Cayol J.L., Labat M., Macarie H.: Stenotrophomonas acidaminiphila sp. nov., a strictly aerobic bacterium isolated from an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactor. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 559–568 (2002) 8.Avison M.B., Higgins C.S., Ford P.J., von Heldreich C.J., Walsh T.R., Bennett P.M.: Differential regulation of L1 and L2 beta-lactamase expression in Stenotrophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Chemother. 49, 387–89 (2002) 9.Avison M.B., Higgins C.S., von Heldreich C.J., Bennett P.M., Walsh T.R.: Plasmid location and molecular heterogeneity of the L1 and L2 β-lactamase genes of Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 413–419 (2001) 10.Avison M.B., von Heldreich C.J., Higgins C.S., Bennett P.M., Walsh T.R.: A TEM-2-beta-lactamase encoded on an active Tn1-like transpozon in the genome of a clinical isolate of Steno­ trophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Chemoth. 46, 879–884 (2000) 11.Aydin K., Kőksal I., Kaygusuz S., Kaklikkaya I., Caylan R., Õzdemir R.: Endocarditis caused by Stenotrophomonas malto­ philia. Scand. J. Infect. Dis. 32, 427–430 (2000) 12.Barber C.E., Tang J.L., Feng J.X., Pan M.Q., Wilson T.J., Slater H., Dow J.M., Williams P., Daniels M.J.: A novel regulatory system required for pathogenicity of Xanthomonas campestris is mediated by a small diffusible signal molecule. Mol. Microbiol. 24, 555–566 (1997) 13. Brooke J.S.: New strategies against Stenotrophomonas maltophi­ lia: a serious worldwide intrinsically drug-resistant opportunistic pathogen. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 12, 1–4 (2014) 274 OLGA ZAJĄC, AGNIESZKA E. LAUDY, STEFAN TYSKI 14. Brooke J.S.: Stenotrophomonas maltophilia: an emerging global opportunistic pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 25, 1–40 (2012) 15. Chang L.L., Chen H.F., Chang Ch.Y., Lee T.M., Wu W.J.: Contribution of integrons, and SmeABC and SmeDEF efflux pumps to multidrug resistance in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Chemother. 53, 518–521 (2004) 16. Chen Ch.H., Huang Ch.Ch., Chung T.Ch., Hu R.m., Huang Y.W., Yang T.Ch.: Contribution of resistance-nodulation-division efflux pump operon smeU1-V-W-U2-X to multidrug resistance of Stenotophomonas maltophilia. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5826–5833 (2011) 17. Chen K.J., Wang N.K., Sum M.H., Chen T.L., Lai C.C., Wu W.C., Tan H.Y.: Endophthalmitis caused by Stenotrophomonas malto­ philia. Ophthalmic Surg. Lasers Imaging, 41, e555–e561 (2010) 18. Cho H.H., Sung J.Y., Kwon K.Ch., Koo S.H.: Expression of Sme efflux pumps and multilocus sequence typing in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia. Ann. Lab. Med. 32, 38–43 (2012) 19.Chung H.S., Hong S.G., Kim Y.R., Shin K.S., Whang D.H., Ahn J.Y., Park Y.J., Uh Y., Chang Ch.L., Shin J.H., Lee H.S., Lee K., Chong Y.: Antimicrobial susceptibility of Stenothopho­ monas maltophilia isolates from Korea, and the activity of antimicrobial combinations against the isolates. J. Korean Med. Sci. 28, 62–66 (2013) 20. Chung H.S., Hong S.G., Lee Y., Kim M., Yong D., Jeong S.H., Lee K., Chong Y.: Antimicrobial susceptibility of Stenotropho­ monas maltophilia isolates from a Korean Tertiary Care Hospital. Yonsei Med. J. 53, 439–441 (2012) 21.Crossman L.C., Gould V.C., Dow J.M., Vernikos G.S., Okazaki A., Sebaihia M., Saunders D., Arrowsmith C., Carver T., Peters N., Adlem D., Kerhornou A., Lord A., Murphy L., Seeger K., Squares R., Rutter S., Quail M.A., Rajandream M.A., Harris D., Churcher C., Bentley S.D., Parkhill J., Thomson N.R., Avison M.B.: The complete genome, comparative and functional analysis of Stenotrophomonas maltophilia reveals an organism heavily shielded by drug resistance determinants. Genome Bio­ logy, 9, 1–13 (2008) 22.Crowder M.W., Walsh T.R., Banovic L., Pettit M., Spencer J.: Overexpression, purification and characterization of the cloned metallo-β-lactamase L1 from Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 921–926 (1998) 23. De Rossi B., Calenda M., Vay C., Franco M.: Biofilm formation by Stenotrophomonas maltophilia isolates from device-associated nosocomial infections. Rev. Argentina Microbiol. 39, 204– 212 (2007) 24. Di Bonaventura G., Spedicato I., D’Antonio D., Robuffo I., Piccolomini R.: Biofilm formation by Stenotrophomonas maltophilia: modulation by qinolones, trimethoprim-sulfamethoxazole, and ceftazidime. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 151–160 (2004) 25.Di Bonaventura G., Stepanović S., Picciani P., Pompilio A., Piccolomini R.: Effect of environmental factors on biofilm formation by clinical Stenotrophomonas maltophilia isolates. Folia Microbiol. 52, 86–90 (2007) 26. Ding X., Yin B., Qian L., Zeng Z., Yang Z., Li H., Lu Y., Zhou S.: Screening for novel quorum-sensing inhibitors to interfere with the formation of Pseudomonas aeruginosa biofilm. J. Med. Microbiol. 60, 1827–1834 (2011) 27. Felici A., Amicosante G.: Kinetic analysis of extension of substrate specifity with Xanthomonas maltophilia, Aeromonas hydrophila and Bacillus cereus metallo-β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 192–199 (1995) 28. Fouhy Y., Scanlon K., Schouest K., Spillane Ch., Crossman L., Avison M.B., Ryan R.P., Dow J.M.: Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964– 4968 (2007) 29.Gales A.C., Jones R.N., Forward K.R., Liñares J., Sader H.S., Verhoef J.: Emerging importance of multidrug-resistant Acine­ tobacter species and Stenotrophomonas maltophilia as pathogens in seriously ill patients: geographic patterns, epidemiological features, and trends in the SENTRY antimicrobial surveillance program (1997–1999). Clin. Infect. Dis. 32, 104–113 (2001) 30. Garrity G. (Ed.): Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2: The Proteobacteria. Springer, Nowy Jork 2005 31.Gould V.C., Avison M.B.: SmeDEF-mediated antimicrobial drug resistance in Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates having defined phylogenetic relationships. J. Antimicrob. Chemother. 57, 1070–1076 (2006) 32. Gould V.C., Okazaki A., Avison M.B.: Coordinate hyperproduction of SmeZ and SmeJK efflux pumps extends drug resistance in Stenotophomonas maltophilia. Antimicrob. Agents Chemother. 57, 655–657 (2013) 33. Gould V.C., Okazaki A., Avison M.B.: β-lactam resistance and β-lactamase expression in clinical Stenotrophomonas maltophilia isolates having defined phylogenetic relationships. J. Antimicrob. Chemother. 57, 199–203 (2006) 34. Gould V.C., Okazaki A., Howe R.A., Avison M.B.: Analysis of sequence variation amongst smeDEF multi-drug efflux pump genes and flanking DNA from defined 16S rRNA sub-groups of clinical Stenotrophomonas maltophilia isolates. J. Antimicrob. Chemother. 54, 348–353 (2004) 35. Hankiewicz-Ziołkowska K., Gospodarek E.: Stenotophomonas maltophilia – charakterystyka i patogeneza zakażeń. Post. Mikro­ biol. 50, 43–50 (2011) 36. Hernandez A., Mate M.J., Sanchez-Díaz P.C., Romero A., Rojo F., Martinez J.L.: Structural and functional analysis of SmeT, the repressor of the Stenotrophomonas maltophilia multidrug efflux pump SmeDEF. J. Biol. Chem. 284, 14428–14438 (2009) 37. Hernández A., Ruiz F.M., Romero A., Martinez J.L.: The binding of triclosan to SmeT, the repressor of the multidrug efflux pump SmeDEF, induces antibiotic resistance in Stenotrophomonas maltophilia. PLoS Pathogens, 7, 1–12 (2011) 38.Heylen K., Vanparys B., Peirsegaele F., Lebbe L., Devos P.: Steno­trophomonas terrae sp. nov. and Stenotrophomonas humi sp. nov., two nitrate-reducing bacteria isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57, 2056–2061 (2007) 39.Higgins C.S., Murtough S.M., Williamson E., Hiom S.J., Payne D.J., Russell A.D., Walsh T.R.: Resistance to antibiotics and biocides among non-fermenting Gram-negative bacteria. Clin. Microbiol. Infect. 7, 308–315 (2001) 40. Hu L.F., Chang X., Ye Y., Wang Z.X., Shao Y.B., Shi W., Li X., Li J.B.: Stenotrophomonas maltophilia resistance to trimethoprim/sulfamethoxazole mediated by acquisition of sul and dfrA genes in a plasmid-mediated class 1 integron. Int. J. Antimicrob. Agents. 37, 230–234 (2011) 41. Hu R.M., Liao S.T., Huang Ch.Ch., Huang Y.W., Yang T.Ch.: An inducible fusaric acid tripartite efflux pump contributes to the fusaric acid resistance in Stenotrophomonas maltophilia. PLoS One, 7, 1–8 (2012) 42.Huang C.R., Chen S.F., Tsai N.W., Chang C.C., Lu C.H., Chuang Y.C., Chien C.C., Chang W.N.: Clinical characteristics of Stenotrophomonas maltophilia meningitis in adults: a high incidence in patients with a postneurosurgical state, long hospital staying and antibiotic use. Clin. Neurol. Neurosurg. 115, 1709–1715 (2013) 43. Huang H.I., Shih H.Y., Lee C.M., Yang T.C., Lay J.J., Lin Y.E.: In vitro efficacy of cooper and silver ions in eradicating Pseudo­ monas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and Acineto­ bacter baumanii: implications for on‑site disinfection for hospital infection control. Water Research, 42, 73–80 (2008) 44.Huang Y.W., Hu R.M., Chu F.Y., Lin H.R., Yang T.Ch.: Characterization of a major facilitator superfamily (MFS) tripartite BIOFILM, POMPY MDR I INNE MECHANIZMY OPORNOŚCI STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA efflux pump EmrCABsm from Stenotrophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Chemother. 68, 2498–2505 (2013) 45. Hugh R., Leifson E.: A description of the type strain of Pseudo­ monas maltophilia. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 13, 133–138 (1963) 46.Jarmuła A., Obłąk E., Wawrzycka D., Gutowicz J.: Oporność wielolekowa związana z aktywnym usuwaniem leków z komórek drobnoustrojów. Post. Hig. Med. Dośw. 65, 216–227 (2011) 47.Kaparullina E., Doronina N. Chistyakova T., Trotsenko Y.: Stenotrophomonas chelatiphaga sp. nov., a new aerobic EDTA-degrading bacterium. Syst. Appl. Microbiol. 32, 157–162 (2009) 48. Kim H.B., Srinivasan S., Sathiyaraj G., Quan L.H., Kim S.H., Bui T.P.N., Liang Z. Kim Y.J., Yang D.C.: Stenotrophomonas ginsengisoli sp. nov., isolated from a ginseng field. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60, 1522–1526 (2010) 49. Kołwzan B.: Analiza zjawiska biofilmu – warunki jego powstawania i funkcjonowania. Ochrona Środowiska, 33, 2–14 (2011) 50.Laudy A.E., Starościak B.J.: β-laktamazy pałeczek z rodziny Pseudomonadaceae. Post. Mikrobiol. 39, 99–132 (2000) 51. Laudy A.E.: Systemy MDR – istotny mechanizm oporności pałeczek Gram-ujemnych na antybiotyki i chemioterapeutyki. Post. Mikrobiol. 47, 415–422 (2008) 52.Lecso-Bornet M., Bergogne-Berezin E.: Susceptibility of 100 strains of Stenotrophomonas maltophilia to three β-lactam and five β-lactam-β-lactamase inhibitor combinations. J. Antmicrob. Chemother. 40, 717–720 (1997) 53. Ledder R.G., Gilbert P., Willis C., McBain A.J.: Effects of chronic triclosan exposure upon the antimicrobial susceptibility of 40 ex-situ environmental and human isolates. J. Appl. Microbiol. 100, 1132–1140 (2006) 54. Lee M., Woo S.G., Chae M., Shin M.C., Jung H.M., Ten L.N.: Stenotrophomonas daejeonesis sp. nov., isolated from sewage. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 598–604 (2011) 55. Li X-Z., Zhang L., Poole K.: SmeC, an outer membrane multi­ drug efflux protein of Stenotrophomonas maltophilia. Anti­ microb. Agents Chemother. 46, 333–343 (2002) 56. Liaw S.J., Lee Y.L., Hsueh P.R.: Multidrug resistance in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia: roles of integrons, efflux pumps, phosphoglucomutase (SpgM), and melanin and biofilm formation. Int. J. Antimicrobial Agents, 35, 126–130 (2010) 57. Lin C.W., Huang Y.W., Hu R.M., Chiang K.H., Yang T.C.: The role of AmpR in regulation of L1 and L2 β-lactamases in Ste­ notrophomonas maltophilia. Research in Microbiology, 160, 152–158 (2009) 58. Lin C.W., Lin H.C., Huang Y.W., Chung T.C., Yang T.C.: Inactivation of mrcA gene derepresses the basal-level expression of L1 and L2 β-lactamases in Stenotrophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Chemother. 66, 2033–2037 (2011) 59. Lin H.C., Ma D.H., Chen Y.F., Yeh L.K., Hsiao C.H.: Late-onset intrascleral dissemination of Stenotrophomonas maltophilia scleritis after pterygium excision. Cornea 30, 712–715 (202) 60.Liu W., Zou D., Wang X., Li X., Zhu L., Yin Z., Yang Z., Wei X., Han L., Wang Y., Shao C., Wang S. He X., Liu D., Liu F., Wang J., Huang L., Yuan J.: Proteomic analysis of clinical isolate of Stenotrophomonas maltophilia with blaNDM-1, blaL1 and blaL2 β-lactamase genes under imipenem treatment. J. Proteome Research, 11, 4024–4033 (2012) 61. Livermore D.M.: β-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microbiol. Rev. 8, 557–584 (1995) 62.Looney W.J., Narita M., Mühlemann K.: Stenotrophomonas maltophilia: an emerging opportunist human pathogen. Lancet Infect. Dis. 9, 312–323 (2009) 63.Matejczyk M., Suchowierska M.: Charakterystyka zjawiska quorum sensing i jego znaczenie w aspekcie formowania i funkcjonowania biofilmu w inżynierii środowiska, budownictwie, 275 medycynie oraz gospodarstwie domowym. Budownictwo i Inży­ nieria Środowiska, 2, 71–75 (2011) 64. Nicodemo A.C., Araujo M.R.E., Riuz A.S., Gales A.C.: In vitro susceptibility of Stenotrophomonas maltophilia isolates: comparison of disc diffusion, E test and agar dilution methods. J. Antimicrob. Chemother. 53, 604–608 (2004) 65.Nicodemo A.C., Garcia Paez J.I.: Antimicrobial therapy for Steno­trophomonas maltophilia infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 26, 229–237 (2007) 66. Okazaki A., Avison M.B.: Aph(3’)-IIc, an aminoglycoside resistance determinant from Stenotrophomonas maltophilia. Anti­ microb. Agents Chemother.51, 359–360 (2007) 67. Paez J.I., Tengan F.M., Barone A.A., Levin A.S., Costa S.F.: Factors associated with mortality in patients with bloodstream infection and pneumonia due to Stenotrophomonas maltophilia. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 901–906 (2008) 68.Pages D., Rose J., Conrod S., Cuine S., Carrier P., Heulin T. Achouak W.: Heavy metal tolerance in Stenotrophomonas mal­ tophilia. PLoS One, 3, 1–6 (2008) 69. Palanisamy N.K., Ferina N., Amirulhusni A.N., Mohd-Zain Z., Hussaini J., Ping L.J., Durairaj R.: Antibiofilm properties of chemically synthesized silver nanoparticles found against Pseudo­ monas aeruginosa. J. Nanobiotechnology, 12, 1–7 (2014) 70. Palleroni N.J., Bradbury J.F.: Stenotrophomonas, a new bacterial genus for Xanthomonas maltophilia (Hugh 1980) Swings i wsp. 1983. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 606–609 (1993) 71. Papadakis K.A., Vartivarian S.E., Vassilaki M.E., Anaissie E.J.: Stenotrophomonas maltophilia an unusual case of biliary sepsis. Clin. Infect. Dis. 21, 1032–1034 (1995) 72.Pompilio A., Catavitello C., Picciani C., Confalone P., Piccolomini R., Savini V., Fiscarelli E., D’Antonio D., Di Bonaventura G.: Subinhibitory concentrations of moxifloxacin decrease adhesion and biofilm formation of Stenotrophomonas malto­ philia from cystic fibrosis. J. Med. Microbiol. 59, 76–81 (2010) 73. Pompilio A., Crocetta V., Confalone P., Nicoletti M., Petrucca A., Guarnieri S., Fiscarelli E., Savini V., Piccolomini R., Di Bonaventura G.: Adhesion to and biofilm formation on IB3-1 bronchial cells by Stenotophomonas maltophilia isolates from cystic fibrosis patients. BMC Microbiology, 10, 1–15 (2010) 74. Pompilio A., Piccolomini R., Picciani C., D’Antonio D., Savini V., Di Bonaventura G.: Factors associated with adherence to and biofilm formation on polystyrene by Stenotrophomonas malto­ philia: the role of cell surface hydrophobicity and motility. FEMS Microbiol. Lett. 287, 41–47 (2008) 75. Poole K.: Efflux-mediated antimicrobial resistance (w) Antibiotic discovery and development. Red. T.J. Dougherty, M.J. Pucci, Springer Science+Business Media, London 2012, 349–395 76.Rahmati-Bahram A., Magee J.T., Jackson S.K.: Effect of temperature on aminoglycoside binding sites in Stenotrophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Chemother. 39, 19–24( 1997) 77.Ramos P.L., Van Trappen S., Thompson F.L., Rocha R.C.S., Barbosa H.R., De Vos P., Moreira-Filho C.A.: Screening for endophytic nitrogen-fixing bacteria in Brazilian sugar cane varieties used in organic farming and description of Steno­ trophomonas pavanii sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61, 926–931 (2011) 78. Ryan R.P., Dow J.M.: Diffusible signals and interspecies communication in bacteria. Microbiology, 154, 1845–1858 (2008) 79. Ryan R.P., Monchy S., Cardinale M., Taghavi S., Crossman L., Avison M.B., Berg G., van der Lelie D., Dow J.M.: The versatility and adaptation of bacteria from the genus Stenotrophomonas. Nature, 7, 514–525 (2009) 80. Sader H.S., Jones R.N.: Antimicrobial susceptibility of uncommonly isolated non-enteric gram-negative bacilli. Int. J. Anti­ microb. Agents 25, 95–109 (2005) 276 OLGA ZAJĄC, AGNIESZKA E. LAUDY, STEFAN TYSKI 81. Sakhnini E., Weissmann A., Oren I.: Fulminant Stenotrophomo­ nas maltophilia soft tissue infection in immunocompromised patients: an outbreak transmitted via tap water. Am. J. Med. Sci. 323, 269–272(2002) 82. Samonis G, Karageorgopoulos D.E., Maraki S., Levis P., Dimopoulou D, Spernovasilis N.A., Kofteridis D.P., Falagas M.E.: Stenotrophomonas maltophilia infections in a general hospital: patient characteristics, antimicrobial susceptibility, and treatment outcome. PLoS One, 7 (5), 1–7 (2012) 83. Sánchez P., Alonso A., Martinez J.L.: Cloning and characterization of SmeT, a repressor of the Stenotrophomonas maltophilia multidrug efflux pump SmeDEF. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3386–3393 (2002) 84.Sanchez P., Alonso A., Martinez J.L.: Regulatory regions of smeDEF in Stenotrophomonas maltophilia strains expressing different amounts of the multidrug efflux pump SmeDEF. Anti­ microb. Agents Chemother. 48, 2274–2276 (2004) 85.Sanchez P., Moreno E., Martinez J.L.: The biocide triclosan selects Stenotrophomonas maltophilia mutants that overproduce the SmeDEF multidrug efflux pump. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 781–782 (2005) 86. Shih H.Y., Lin Y.E.: Efficacy of copper-silver ionization in controlling biofilm- and plankton – associated waterborne pathogens. Sppl. Environ. Microbiol. 76, 2032–2035 (2010) 87. Shimizu K., Kikuchi K., Sasaki T., Takahashi N., Ohtsuka M., Ono Y., Hiramatsu K.: Smqnr, a new chromosome-carried quinolone resistance gene in Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 3823–3825 (2008) 88. Silvestry-Rodriquez N., Bright K.R., Slack D.C., Uhlmann D.R., Gerba C.P.: Silver as a residual disinfectant to prevent biofilm formation in water distribution systems. Appl. Environ. Micro­ biol. 74, 1639–1641 (2008) 89. Swings J., De Vos P., Van den Mooter M., De Ley J.: Transfer of Pseudomonas maltophilia Hugh 1981 to the genus Xanthomonas as Xanthomonas maltophilia (Hugh 1981) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 33, 409–413 (1983) 90.Toleman M.A., Bennett P.M., Bennett D.M.C., Jones R.N., Walsh T.R.: Global emergence of trimethoprim/sulfamethoxazole resistance in Stenotrophomonas maltophilia mediated by acquisition of sul genes. Emerg. Infect. Dis. 13, 559–565 (2007) 91. Trafny E.A.: Microorganisms in metalworking fluids: current issues in research and management. Int. J. Occup. Med. Environ. Health, 26, 4–15 (2013) 92.Vartivarian S.E., Papadakis K.A., Anaissie E.J.: Stenotropho­ monas (Xanthomonas) maltophilia urinary tract infection. A disease that is usually severe and complicated. Arch. Intern. Med. 156, 433–435 (1996) 93.Walsh T.R., MacGowan A.P., Bennett P.M.: Sequence analysis and enzyme kinetics of the L2 serine β-lactamase from Steno­ trophomonas maltophilia. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1460–1464 (1997) 94.Wang C., Zhan Q., Mi Z., Huang Z., Chen G.: Distribution of the antiseptic-resistance gene qacE∆1 in 283 clinical isolates of Gram-negative bacteria in China. J. Hosp. Infect. 69, 394–396 (2008) 95.Wasążnik A., Grinholc M., Bielawski K.P.: Czynne usuwanie leku z komórki jako jeden z mechanizmów oporności bakterii na środki przeciwdrobnoustrojowe i metody jego zwalczania. Post. Hig. Med. Dośw. 63, 123–133 (2009) 96.Weiss K., Restieri C., De Carolis E., Laverdiere M., Guay H.: Comparative activity of new quinolones against 326 clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia. J. Antimicrob. Che­ mother. 45, 363–365 (2000) 97.Wishart M.N., Riley T.V.: Infection with Pseudomonas malto­ philia: hospital outbreak due to contaminated disinfectant. Med. J. Aust. 2, 710–712 (1976) 98.Wolf A., Fritze A., Hagemann M., Berg G.: Stenotrophomonas rhi­ zophila sp. nov., a novel plant-associated bacterium with antifungal properties. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 1937–1944 (2002) 99.Wu K., Yau Y.C.W., Matukas L., Waters V.: Biofilm compared to conventional antimicrobial susceptibility of Stenotophomonas maltophilia isolates from cystic fibrosis patients. Antimicrob. Agents Chemother. 57, 1546–1548 (2013) 100.Yang H.C., Im W.T., Kang M.S., Shin D.Y., Lee S.T.: Stenotro­ phomonas koreensis sp. nov., isolated from compost in South Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 81–84 (2006) 101.Yoon J.H., Kang S.J., Oh H.W., Oh T.K.: Stenotrophomonas dokdonensis sp. nov., isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Micro­ biol. 56, 1363–1367 (2006) 102.Yorioka K., Oie S., Kamiya A.: Microbial contamination of suction tubes attached to suction instruments and preventive methods. Jpn. J. Infect. Dis. 63, 124–127 (2010) 103.Zhang R., Sun Q., Hu Y.J., Yu H., Li Y., Shen Q., Li G.X., Cao J.M., Yang W., Wang Q., Zhou H.W., Hu Y.Y., Chen G.X.: Detection of the Smqnr quinolone protection gene and its prevalence in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia in China. J. Med. Microbiol. 61, 535–539 (2012) ROLA MITOCHONDRIÓW W ODPORNOŚCI PRZECIWWIRUSOWEJ POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 277–287 http://www.pm.microbiology.pl Karolina Paulina Gregorczyk1*, **, Zbigniew Wyżewski1*, Lidia Szulc-Dąbrowska1, Justyna Struzik1*, Joanna Szczepanowska2, Marek Niemiałtowski1 Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie 2 Pracownia Bioenergetyki i Błon Biologicznych, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie 1 Wpłynęło w sierpniu 2014 r. 1. Wstęp. 2. Udział mitochondriów w produkcji IFN typu I oraz cytokin prozapalnych. 3. Wirusowe mechanizmy hamowania zależnej od mitochondriów produkcji IFN typu I oraz cytokin prozapalnych. 4. Apoptoza – proces „pseudoprzeciwwirusowy”. 5. Podsumowanie The role of mitochondria in antiviral immunity Abstract: Mitochondria, which are known as “powerhouse” of the cell, have numerous important functions in cellular metabolism and are involved in cellular innate antiviral immunity in vertebrates. They participate in an intrinsic pathway of apoptosis and production of proinflammatory cytokines and type I interferons (IFNs; α/β). These functions are essential for limiting the spread of viral infection before the stimulation of adaptive immunity. However, viruses have evolved the ability to escape from the mechanisms of immune response including those related to mitochondrial functions. Viruses can exploit these organelles in their replication cycle and/or morphogenesis process, therefore the answer to the question about the exact role of mitochondria during viral infection is not unequivocal. 1. Introduction. 2. Contribution of mitochondria in type I IFN and pro-inflammatory cytokines production. 3. Viral inhibition mechanisms of the mitochondrial-dependent production of type I IFN and pro-inflammatory cytokines. 4. Apoptosis – “pseudoantiviral” process. 5. Summary Słowa kluczowe: odporność przeciwwirusowa, mitochondria, apoptoza, MAVS, IFN-α/β Key words: antiviral immunity, mitochondria, apoptosis, MAVS, IFN-α/β Wstęp Mitochondria to wielofunkcyjne organella komórek eukariotycznych oddychających tlenowo. Zbudowane są z dwóch błon białkowo-lipidowych (zewnętrznej i wewnętrznej), oddzielonych przestrzenią międzybłonową. Cechą charakterystyczną mitochondriów jest posiadanie własnego materiału genetycznego w postaci kolistych cząsteczek DNA (mtDNA, mitochondrial DNA). Zarówno masa mitochondriów, stopień pofałdowania ich wewnętrznej błony, a także liczba cząsteczek mtDNA uzależnione są m.in. od rodzaju narządu bądź tkanki [1]. Komórki wykazujące intensywny metabolizm, takie jak np. neurony, miocyty, czy hepatocyty, charakteryzują się obecnością licznych mitochondriów, w odróżnieniu od erytrocytów, które cechuje brak tych organelli [1]. Obecnie wiadomo, że mitochondria to organella niezwykle zróżnicowane i dynamiczne. Tworzą one sieci mitochondrialne, stale ulegające przebudowie, przez co zmienia się ich liczba, morfologia i rozmieszczenie w komórce [10]. Fuzja, czyli łączenie się mitochondriów, oraz ich rozszczepianie związane jest nie tylko z rodzajem komórki, ale także z jej stanem energetycznym oraz działaniem różnych czynników zewnętrznych, do których zaliczają się patogeny, w tym także wirusy [42]. Zmiany powstałe w sieci mitochondrialnej na drodze zakażenia wirusowego, związane są na ogół z równoczesnym zaburzeniem funkcjonowania tych organelli [6]. Mogą one świadczyć o możliwości „ucieczki” wirusów przed układem odpornościowym gospodarza, jednakże badania wskazują również na sposób wykorzystania przez te patogeny czynności mitochondriów do replikacji lub morfogenezy. Najważniejszą funkcją mitochondriów jest oddychanie wewnątrzkomórkowe, przez co są one okreś­lane jako fabryki bądź centra energetyczne komórek. Dzięki dużej powierzchni błony wewnętrznej, uzyskanej poprzez jej pofałdowanie, możliwe jest bardzo wydajne przeprowadzanie tego procesu, który w wyniku fosforylacji oksydacyjnej dostarcza komórkom energii zmagazynowanej w wiązaniach chemicznych adeno­ zynotrójfosforanu (ATP, adenosine triphosphate). Wirusy nie mają zdolności wytwarzania ATP, niezbędnego w procesie ich replikacji i morfogenezy, dlatego wykorzystują ATP produkowane przez mitochondria. Do innych ważnych funkcji mitochondriów zalicza się m.in. buforowanie jonów wapnia [53], przekazywanie sygnałów [48], udział w cyklu mocznikowym * Doktoranci dziennego studium doktoranckiego „Ksenobiotyki oraz biologia czynników zakaźnych i inwazyjnych” ** Autor korespondencyjny: Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa; e-mail: [email protected] 278 K.P. GREGORCZYK, Z. WYŻEWSKI, L. SZULC-DĄBROWSKA, J. STRUZIK, J. SZCZEPANOWSKA, M. NIEMIAŁTOWSKI w komórkach wątroby a także rola w mechanizmach odporności przeciwwiru­ sowej, takich jak apoptoza [55], czy produkcja interfero­nów (IFN, interferon) typu I oraz cytokin [36]. Ostatnie właściwości tych organelli przyczyniają się do eliminacji wirusa z organizmu oraz ograniczają zasięg zakażenia. Jednakże wirusy w zakażonych komórkach mogą powodować zaburzenia funkcji mitochondriów, prowadząc w rezultacie do hamowania mechanizmów odpornościowych, w które zaangażowane są owe organella. 2.Udział mitochondriów w produkcji IFN typu I oraz cytokin prozapalnych Układ odpornościowy wykształcił szereg mechanizmów pozwalających na skuteczną walkę z różnorodnymi czynnikami zakaźnymi, takimi jak: bakterie, grzyby, pasożyty, czy wirusy. Podczas zakażenia wirusowego najbardziej efektywne działanie wykazują mechanizmy swoistej odpowiedzi immunologicznej. Zalicza się do nich aktywność cytotoksycznych limfocytów T (CTL, cytotoxic T cell) CD8+ oraz syntezę przez limfocyty B przeciwciał wiążących się z obcymi peptydami i białkami. Niektóre wirusy, np. wirus opryszczki (HHV-1, human herpesvirus type 1 / d. HSV-1, herpes simplex type 1) oraz wirus ektromelii (ECTV, ectro­ melia virus) stymulują również, oprócz domi­nujących CTL CD8+, wytwarzanie CTL CD4+ stano­wiących około 30% całej puli CTL. Działanie ww. populacji limfocytów skutkuje ochroną komórek przed wniknięciem wirionów lub prowadzi do zniszczenia komórek już zakażonych. Jednakże uruchomienie swoistych mechanizmów odpornościowych wymaga stosunkowo długiego czasu, w przeciwieństwie do mechanizmów odporności wrodzonej, stanowiących pierwszą linię obrony przed wirusami. Nieswoista odpowiedź immunologiczna związana jest z istnieniem na powierzchni i wewnątrz komórek receptorów PRRs (patterns recognition receptors), które mają zdolność rozpoznawania molekularnych wzorców związanych z patogenami PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) [51]. Do PRRs rozpoznających kwasy nukleinowe pochodzenia wirusowego (ssRNA, dsRNA lub DNA) zalicza się receptory RIG-I-podobne (RIG-I – like receptors, RLRs), receptory Toll-podobne (Toll-like receptor, TLR) oraz receptory NOD-podobne (NOD-like receptors, NLR) [29]. Sygnał przekazywany przez RLR i TLR (TLR3, TLR7, TLR8 oraz TLR9) pozwala na zainicjowanie kaskady zdarzeń, prowadzącej do wytworzenia IFN typu I (α/β) oraz cytokin prozapalnych (w zależności od typu komórki: IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α). Natomiast aktywacja NLR prowadzi do wytworzenia dojrzałej IL-1β [29]. Pobudzenie wymienionych PRRs i wytworzenie IFN typu I i/lub cytokin prozapalnych skutkuje eliminacją wirusa z organizmu [24]. Identyfikacja wirusowego materiału genetycznego przez wewnątrzkomórkowe receptory należące do PRRs jest kluczowym etapem odpowiedzi skierowanej przeciwko tym czynnikom zakaźnym. Mitochondria są bezpośrednio zaangażowane w jeden z etapów odpowiedzi przeciwwirusowej, w którym biorą udział RLR oraz białko DAI (DNA-dependent activator of IFN regulatory factors), należące do grupy PRR. Do IFN typu I zalicza się IFN-α oraz IFN-β, które wykazują działanie przeciwwirusowe, poprzez bezpośrednie oddziaływanie na komórki docelowe, oraz przejawiają aktywność immunomodulacyjną. IFN-α/β hamuje proliferację komórek zakażonych wirusem [20], a także pobudza szlak sygnałów prowadzących do ekspresji genów kodujących różne białka przeciwwirusowe, których zadaniem jest zahamowanie replikacji wirusa, transkrypcji genów i/lub translacji białek wirusowych [16]. Regulacyjne działanie IFN typu I na układ odpornościowy polega, między innymi, na pobudzeniu różnicowania, dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych (DC, dendritic cell) [20] oraz proliferacji komórek NK (natural killer cell) [5], zwiększeniu ekspresji białek MHC klasy I na komórkach zakażonych, a także na inicjowaniu swoistej odpowiedzi immunologicznej [40]. Wskazuje to na szerokie spektrum działania IFN łączące, między innymi, odporność wrodzoną z odpornością nabytą [52]. Podczas odpowiedzi przeciwwirusowej, przy udziale mitochondriów, powstają cytokiny prozapalne: IL-1, IL-2, IL-6, IL-12 oraz TNF-α, a także chemokiny, takie jak: IL-8 (CXCL8), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1; CCL2), czy RANTES (regulated on activation, normal T-cell-expressed and -secreted; CCL5) [2]. Wytwarzane są one przez wiele typów komórek, głównie przez leukocyty, co związane jest z pełnionymi przez nie funkcjami. Zarówno interferony, jak i cytokiny prozapalne oraz chemokiny, powodują stymulację innych komórek układu odpornościowego do działania, w celu eliminacji czynnika zakaźnego. Pobudzenie syntezy tych białek jest uwarunkowane aktywacją jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF-κB (nuclear factor kappa B) [57]. Uwolnienie wirusowego materiału genetycznego do cytoplazmy rozpoczyna serię zdarzeń zachodzących wewnątrz zakażonej komórki, prowadzącą do wytworzenia IFN typu I oraz cytokin prozapalnych. Kaskada działań, angażująca mitochondria, zaczyna się od połączenia specyficznych receptorów wewnątrzkomórkowych z kwasem nukleinowym pochodzenia wirusowego. Zalicza się do nich: białko DAI, które może wiązać się z wirusowym DNA; receptory RLR, w skład których wchodzi białko RIG-I (retinoic acid-inducible gene I), rozpoznające krótkie cząsteczki dsRNA i ssRNA z trifosforanem na końcu 5’ (5’ppp-RNA); oraz MDA-5 (melanoma differentiation-asso- ROLA MITOCHONDRIÓW W ODPORNOŚCI PRZECIWWIRUSOWEJ ciated gene 5), łączące się głównie z długimi cząsteczkami wirusowego dsRNA [50]. Wirusowy dsDNA może także zostać przepisany na cząsteczkę RNA przy udziale polimerazy RNA III zależnej od DNA, w efekcie czego powstaje transkrypt będący ligandem dla RIG-I [11]. Taki mechanizm ma miejsce podczas zakażenia HHV-1 (d. HSV-1), wirusem Epsteina-Barr (EBV, Epstein-Barr virus), adenowirusami oraz wirusem krowianki (VACV, vaccinia virus) [41]. RIG-I jest receptorem wiążącym cząsteczkę 5’ppp-RNA, pochodzącą od paramyksowirusów (wirus choroby Newcastle – NDV, Newcastle disease virus; wirus Sendai – SeV, Sendai virus; wirus syncytium nabłonka oddechowego – RSV, respiratory syncytial virus), rabdowirusów (wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej – VSV, vesicular stomatitis virus; wirus wścieklizny – RABV, rabies virus), ortomyksowirusów (wirus grypy typu A i B – IAV, influenza A virus; IBV, influenza B virus), flawiwirusów (wirus zapalenia wątroby typu C – HCV, hepatitis C virus; wirus japońskiego zapalenia mózgu – JEV, japanese encephalitis virus) oraz filowirusów (wirus Ebola – EBOV, Ebola virus) [41]. MDA-5 stanowi natomiast główny receptor wiążący materiał genetyczny pikornawirusów (wirus zapalenia mózgu – EMCV, encephalomyocarditis virus), koronawirusów (wirus mysiego zapalenia wątroby – MHV, murine hepatitis virus) oraz kaliciwirusów (mysi norowirus – MNV, murine norovirus) [24]. Zarówno RIG-I, jak i MDA-5 mogą rozpoznawać ssRNA flawiwirusów (wirus dengi – DENV, Dengue virus; wirus Zachodniego Nilu – WNV, West Nil virus), a także dsRNA reowirusów (rotawirus) [41]. RIG-I oraz MDA-5 należą do cytozolowych helikaz o aktywności ATPaz. C-końcowa domena regulatorowa RD (regulatory domain) oraz domena helikazowa odpowiadają za wiązanie wirusowego RNA [38], natomiast N-koniec składa się z dwóch tandemowych domen CARD (caspase recruitment domain), łączących się z mitochondrialnym przeciwwirusowym białkiem sygnałowym – MAVS (mitochondrial antiviral signaling protein) [32]. W komórkach niezakażonych receptory RIG-I oraz MDA-5 są nieaktywne. W wyniku przyłączenia wirusowego RNA do wymienionych receptorów, ligazy ubikwityny TRIM25 oraz RIPLET powodują poliubikwitynację RIG-I, co skutkuje uwolnieniem domeny CARD spod hamującego działania domeny RD [61]. Dzięki temu następuje zmiana konformacji receptorów, a w rezultacie ich multimeryzacja, co daje możliwość interakcji z domeną CARD, występującą na mitochondrialnym białku akceptorowym MAVS [24]. Białko MAVS, określane również jako IPS-1 (IFN-β promoter stimulator 1 – białko aktywujące promotor IFN-β1), Cardif (CARD adapter inducing IFN-β – białko adaptorowe stymulujące syntezę IFN-β, zawierające domenę CARD) lub VISA (virus-induced 279 signaling adapter – białko adaptorowe VISA), wykazuje budowę domenową, podobnie jak receptory RIG-I oraz MDA-5. Domena transmembranowa (TM) znajduje się na C-końcu MAVS i odpowiada za jego zakotwiczenie w zewnętrznej błonie mitochondrialnej [45]. Wewnątrz łańcucha polipeptydowego znajduje się region bogaty w prolinę (PRR, proline-rich region), którego funkcja polega na przekazywaniu sygnałów poprzez interakcję z czynnikami związanymi z receptorem TNF (TRAF, tumor necrosis factor receptor-associated factor), w tym TRAF2, TRAF3 [44]. Środkowy fragment białka MAVS oddziałuje z białkiem adaptorowym TRADD (tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein) oraz TRAF6. Na N-końcu MAVS zlokalizowana jest domena CARD łącząca się z dwiema domenami CARD występującymi na RIG-I lub MDA-5 [45]. Do tej interakcji dochodzi w następstwie związania wirusowego RNA przez wymienione RLR, które aktywują oligomeryzację i agregację białka MAVS [7]. Czynniki TRAF2 i TRAF3 oddziałują z TRADD oraz z białkiem TANK (TRAF-family member associated NF-κB activator), co skutkuje rekrutacją kinaz TBK1 (TANK-binding kinase 1) oraz IKKε (inducible IκB kinase) [36]. Dodatkowo na powierzchni mitochondrium znajduje się translokaza błony zewnętrznej 70 – TOM70 (translocase of outer membrane 70), która wchodzi w interakcje z białkiem szoku cieplnego – HSP90 (heat shock protein 90), dzięki czemu odpowiada za lokalizację TBK1 oraz IRF3 (interferon regulatory factor 3) w pobliżu kompleksu białka MAVS [31]. Białko TRAF3 wykazuje aktywność ligazy E3 ubikwityny, przez co ulega ubikwitynacji, powodując aktywację TBK1 oraz IKKε. Wymienione kinazy odpowiadają za fosforylację czynników transkrypcyjnych IRF3 oraz IRF7. W następstwie tego procesu dochodzi do homodimeryzacji i/lub heterodimeryzacji IRF3 i IRF7, które są transportowane do jądra komórkowego, gdzie indukują transkrypcję IFN typu I. Równocześnie białko adaptorowe TRADD może oddziaływać z FADD (FAS-associated death domain protein) oraz białkiem RIP-1 (receptor-interacting protein 1), które przekazuje sygnały pomiędzy FADD, a kinazą IKKα (IκB kinase α) i IKKβ (IκB kinase β) [51]. Przytoczone kinazy fosforylują inhibitor czynnika NF-κB – IκBα (NF-κB inhibitor-α), co prowadzi do jego proteasomalnego rozkładu i uwolnienia NF-κB. Czynnik transkrypcyjny NF-κB przechodzi do jądra komórkowego, gdzie inicjuje ekspresję genów cytokin prozapalnych [57]. Białko MAVS może wchodzić w interakcję z innymi białkami, które biorą udział w jego pozytywnej bądź negatywnej regulacji. Jednym z nich jest białko STING/MITA (stimulator of interferon genes/mediator of IRF-3 activation), znajdujące się na powierzchni siateczki śródplazmatycznej. W miejscu połączenia 280 K.P. GREGORCZYK, Z. WYŻEWSKI, L. SZULC-DĄBROWSKA, J. STRUZIK, J. SZCZEPANOWSKA, M. NIEMIAŁTOWSKI siateczki śródplazmatycznej i mitochondrium tworzy się struktura zwana MAM (mitochondria-associated membrane), która pozwala na wzajemne oddziaływanie MAVS i STING/MITA [8]. Takie połączenie pobudza aktywację zarówno szlaku IRF3, prowadząc do powstania IFN typu I, jak również czynnika NF-κB, skutkując wytworzeniem cytokin prozapalnych [23]. Dla utrzymania homeostazy w komórkach niezakażonych niezbędna jest negatywna regulacja MAVS. Poznano białka hamujące przekazywanie sygnałów za pośrednictwem MAVS, do których należą: NLRX1 (NOD-like receptor X1 – receptor NOD-podobny X1), znajdujące się na zewnętrznej błonie mitochondrialnej i hamujące inter­akcje między domenami CARD białka MAVS i receptorów RLR; receptor gC1qR (receptor for the globular head domain of complement C1q – receptor dla białka dopełniacza gC1q), który wiąże się z MAVS, blokując jego aktywację; kinaza PLK1 (Polo-like kinase 1 – Polo-podobna kinaza, 1) hamująca MAVS poprzez wiązanie się z jego domeną C-końcową; Mfn2 (mitofusin 2 – mitofuzyna 2) w wyniku inter­ akcji z MAVS także zapobiega przekazywaniu sygnałów przez to białko [28, 60]. Dynamika mitochondriów także wpływa na przekazywanie sygnałów ścieżką RLR. Proces fuzji mitochondriów jest zależny od białek znajdujących się na zewnętrznej i wewnętrznej błonie mitochondrialnej [58]. Wspomniana Mfn2, podobnie jak Mfn1 (mitofusin 1 – mitofuzyna 1) jest zlokalizowana na błonie zewnętrznej, w przeciwieństwie do białka Opa1 (optic atrophy 1 – białko 1 zaniku nerwu wzrokowego) umiejs­cowionego na błonie wewnętrznej. Natomiast proces rozszczepiania związany jest zarówno z białkami znajdującymi się na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, takimi jak Fis1 (fission 1 – białko rozszczepiania), Mff (mitochondrial fission factor – czynnik rozszczepiania mitochondriów), a także z białkiem Drp1 (dynamin related protein 1 – białko dynamino-podobne) występującym głównie w cytoplazmie, ale tworzącym również niewielkie skupienia na powierzchni mitochondriów [46, 58]. Badania Ya s u k a w a i wsp. [60] dowodzą wspomnianej już roli Mfn2 w hamowaniu przekazywania sygnałów ścieżką RLR, poprzez wiązanie się z białkiem MAVS. Co ciekawe, nie zauważono tej zależności podczas badania Mfn1, która również wchodzi w interakcje z MAVS [60]. Natomiast okazało się, że łączenie się mitochondriów, związane z obecnoś­ cią Mfn1 i Opa1, jest niezbędne do aktywacji szlaku RLR [9]. Potwierdzeniem tego było zahamowanie fuzji mitochondriów, poprzez wyciszenie genów dla Mfn1 i Opa1, skutkujące zmniejszeniem aktywacji NF-κB i IRF3 podczas zakażenia wirusowego [9]. Dodatkowo komórki pozbawione Drp1 i Fis1 charakteryzowały się wydłużoną siecią mitochondrialną i wzrostem przekazywania sygnałów drogą RLR. Udowodniono, że wydłużona sieć mitochondrialna sprzyja zwiększeniu oddziaływania pomiędzy mitochondriami a siateczką śródplazmatyczną, a konkretnie pomiędzy MAVS i STING/MITA, których połączenie skutkuje aktywacją kolejnych białek ścieżki RLR [9]. Badania z ostatnich lat wskazują na zmiany zachodzące w potencjale wewnętrznej błony mitochondrialnej (ψm) oraz produkcji reaktywnych form tlenu (RFT) podczas aktywacji mechanizmów odpornościowych z udziałem mitochondriów [28]. Przytoczone modyfikacje są ściśle związane z procesami prowadzącymi do powstania IFN typu I bądź wywołania apoptozy. Spadek ψm zaburza przekazywanie sygnałów na szlaku receptorowym RLR, hamując wytwarzanie IFN-α/β i cytokin prozapalnych, jednocześnie inicjując apoptozę zależną od mitochondriów [28]. Odmienny charakter zmian dotyczy reaktywnych form tlenu. Wzrost poziomu RFT pochodzenia mitochondrialnego, powstających podczas oddychania komórkowego, wzmaga produkcję IFN typu I oraz cytokin lub powoduje aktywację apoptozy [28]. Na tej podstawie można stwierdzić, że w zależ­ ności od otrzymanych sygnałów mitochondria doprowadzają do śmierci pojedynczej, zakażonej komórki, bądź też biorą udział w wytwarzaniu odpowiednich cytokin, w tym IFN. Obydwa procesy odgrywają rolę podczas zakażenia wirusowego, poprzez ograniczenie ekspansji patogenu i jego eliminację z organizmu. 3. Wirusowe mechanizmy hamowania zależnej od mitochondriów produkcji IFN typu I oraz cytokin prozapalnych Procesy odpornościowe, w które zaangażowane są mitochondria, takie jak produkcja IFN typu I oraz cytokin prozapalnych, mogą być regulowane przez wiele typów wirusów. Patogeny te ewoluowały w kierunku wytworzenia skutecznej obrony przed powstaniem w organizmie gospodarza mechanizmów mogących zakłócić ich rozprzestrzenianie. Udział mitochondriów w produkcji IFN typu I oraz cytokin prozapalnych jest zależny od szlaku receptoro­wego RLR, dlatego też wirusy wykształciły szereg mechanizmów hamujących jego aktywację, w celu uniknięcia odpowiedzi immunologicznej. Duże znaczenie odgrywają interakcje z RIG-I, MDA-5 oraz białkiem MAVS, które są kluczowe w przebiegu przesyłania sygnałów skutkujących zwiększeniem ekspresji genów IFN. Niektóre wirusy , oprócz genów białek zaangażowa­ nych w replikację, zawierają w swoim materiale genetycznym takie fragmenty, które odpowiadają za transkrypcję produktów, biorących udział w unikaniu odpowiedzi immunologicznej. Do wirusowych białek blokujących przesyłanie sygnałów, prowadzących do zwiększenia ilości IFN typu I oraz cytokin pozapalnych zalicza się: ROLA MITOCHONDRIÓW W ODPORNOŚCI PRZECIWWIRUSOWEJ a) proteazę serynową NS3/4A wirusa zapalenia wątroby (wzw) typu C, powodującą rozszczepianie MAVS, uniemożliwiając jego aktywację [36]; b) proteazę serynową 3ABC wirusa zapalenia wątroby typu A (HAV, hepatitis A virus), której działanie jest zbliżone do NS3/4A, a różnica wynika głównie z miejsca cięcia łańcucha polipeptydowego MAVS [36]; c) białko HBX (hepatitis B virus protein X – białko X wirusa zapalenia wątroby typu B) wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV – hepatitis B virus), które hamuje produkcję IFN typu I i cytokin pozapalnych; powoduje ubikwitynację MAVS, a tym samym jego proteasomalną degradację, uniemożliwiającą dalsze przekazywanie sygnału [28]; d) proteazę 3C pikornawirusów, prowadzącą do degradacji receptorów MDA-5 oraz RIG-I [4]; e)proteinę NS1 (non-structural protein 1) wirusa grypy typu A (IAV, influenza type A virus), która odpowiada za unikanie odpowiedzi immunologicznej, poprzez interakcje z receptorem RIG-I [30]; f) białko V paramyksowirusów, wiążące się z receptorem MDA-5 [51]; g)białko E3L wirusa krowianki, hamujące ekspresję genów dla IFN-α/β poprzez inhibicję aktywacji czynników IRF-3/7; h)białko VP35 wirusa Ebola, g34.5 kodowane przez HHV-1 (d. HSV-1), białko P wirusa wścieklizny oraz G1 hantawirusa, zabezpieczające przed fosforylacją IRF-3/7 zależną od kinazy IKKε i TBK-1 [22, 30]. W przypadku pikornawirusów możliwe jest kowalencyjne przyłączenie do ich genomu wirusowego białka VPg, co zapobiega związaniu przez receptor RIG-I [4]. Podobne właściwości cechują inne białka wirusowe, które mają zdolność do interakcji z dsRNA, dzięki czemu uniemożliwiają połączenie wirusowego RNA z receptorem MDA-5 bądź RIG-I. Takie oddziaływanie dotyczy wymienianych wcześniej białek E3 VACV oraz VP35 wirusa Ebola, a także TRS1 i m142/ m143 kodowanych przez ludzkiego cytomegalowirusa (cytomegalovirus, CMV) [4]. Przykłady różnorodności działania białek wirusowych na zahamowanie produkcji IFN typu I oraz cytokin prozapalnych zostały przedstawione na Rys. 1. Niektóre wirusy, takie jak CMV oraz alfahepes­ wirusy (HHV-1, PRV – pseudorabies virus – wirus wścieklizny rzekomej) wpływają również na zmiany morfologii sieci mitochondrialnej [3, 29, 34]. Co ciekawe, właśnie przeciwko niej skierowane jest jedno z białek proapototycznych CMV, o nazwie vMIA (viral mitochondrion-localized inhibitor of apoptosis – wirusowy inhibitor apoptozy lokalizujący się na mitochondriach) [3, 34]. Powoduje ono fragmentację sieci mitochondrialnej, utrudniając tym samym przekazywanie sygnałów przy udziale MAVS. 281 4. Apoptoza – proces „pseudoprzeciwwirusowy” Apoptoza stanowi rodzaj programowanej śmierci komórki (programmed cel death, PCD), który jest procesem fizjologicznym i ściśle kontrolowanym [12, 39]. Angażuje on wiele białek i organelli komórkowych, ze szczególnym uwzględnieniem mitochondriów, które odgrywają w nim istotną rolę. Biorą one udział zarówno w szlaku wewnętrznym (mitochondrialnym) apoptozy, gdzie są bezpośrednim odbiorcą proapoptotycznych sygnałów z wnętrza komórki, jak i zewnętrznym (receptorowym), w którym pośredniczą w przekazywaniu sygnałów śmierci pochodzących spoza komórki, odbieranych za pośrednictwem receptorów na jej powierzchni [17]. Celem apoptozy jest utrzymanie homeostazy w tkankach, poprzez usuwanie komórek zbędnych lub uszkodzonych, powstałych w trakcie normalnego rozwoju organizmu lub podczas jego starzenia [12]. Dodatkowo, aktywacja apoptozy może zachodzić również w warunkach patologicznych, takich jak narażenie na szkodliwe promieniowanie, zatrucie toksynami, hipo­ksja, hipertermia, obecność wolnych rodników czy też podczas stosowania niektórych leków (np. przeciw­ nowotworowych, hormonalnych) [12]. W tych przypadkach apoptoza również przyczynia się do przy­wróce­nia stanu równowagi w organizmie, bez wywołania zmian zapalnych i nacieku komórek układu odpornościowego. Jest to niezmiernie istotne podczas usuwania pojedynczych, zmienionych komórek, ponieważ zapobiega powstawaniu rozległych uszkodzeń w danej tkance. Istnieją jednak sytuacje, w których dochodzi do zaburzeń w przebiegu apoptozy, doprowadzających do różnych dysfunkcji komórkowych, narządowych, czy też układowych. Nieprawidłowości w regulacji apoptozy stanowią ważną składową zespołu nabytego niedoboru odporności (acquired immunodeficiency syndrome, AIDS), wad rozwojowych, chorób autoimmunologicznych (autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny), nowotworowych (rak), czy też neurodegeneracyjnych (np. choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, choroba Huntingtona, stwardnienie zanikowe boczne) [12]. Do apoptozy dochodzi również w przebiegu zakażeń wirusowych, co stanowi oddzielny temat do rozważań w niniejszej pracy. Usuwanie zakażonych komórek na drodze apoptozy jest uznawane za fundamentalny element odporności przeciwwirusowej [14], jednak rzeczywisty udział programowanej śmierci komórki w ograniczaniu rozprzestrzeniania zakażenia jest kontrowersyjny. Często apoptoza nie tylko nie eliminuje zakażonych komórek, ale dodatkowo potęguje ekspansję wirusa w organizmie, wykazując tym samym działanie prowirusowe. Jest to związane z koewolucją wirusów i mechanizmów odpornościowych gospodarza, 282 K.P. GREGORCZYK, Z. WYŻEWSKI, L. SZULC-DĄBROWSKA, J. STRUZIK, J. SZCZEPANOWSKA, M. NIEMIAŁTOWSKI Rys. 1. Kontrola procesu apoptozy oraz hamowanie produkcji IFN typu I i cytokin prozapalnych przez białka wirusowe. Opis w tekście skutkującą wytworzeniem przez te czynniki zakaźne zdolności unikania odpowiedzi immunologicznej [14]. Wirusowy materiał genetyczny koduje białka pro- i/lub antyapoptotycznych, które kontrolują proces śmierci komórkowej, w zależności od potrzeb patogenu. Wirusy szybko replikujące (większość wirusów RNA) wymagają krótkiego czasu na powielenie swojego materiału genetycznego i złożenie kompletnych wirionów, dlatego też uzyskały zdolność do aktywacji procesu apoptozy, przyśpieszając tym samym rozprzestrzenianie zakażenia, dodatkowo nie wywołując rozwoju odpowiedzi zapalnej. Jest to działanie przeciwstawne do tego, jaki prezentują wirusy, których replikacja ma długotrwały przebieg (większość wirusów DNA), całkowicie uzależniony od długości życia komórki [35]. Potrzebują one znacznie więcej czasu na powielenie materiału genetycznego i morfogenezę, dlatego kodują białka hamujące apoptozę, a tym samym wydłużają życie zaka- ROLA MITOCHONDRIÓW W ODPORNOŚCI PRZECIWWIRUSOWEJ 283 Rys. 2. Schemat przebiegu wewnętrznego i zewnętrznego szlaku apoptozy. Opis w tekście żonych komórek. Zwiększa to szanse tych wirusów na rozprzestrzenienie i zakażenie kolejnych organizmów. Ze względu na szczególny udział mitochondriów w procesie apoptozy, to właśnie one stanowią główny punkt docelowy działania białek wirusowych, kontrolujących śmierć zakażonej komórki. Produkty genów wirusowych niemalże na każdym etapie apoptozy regulują jej przebieg, dlatego też poniżej zostaną przedstawione szlaki sygnałowe doprowadzające do śmierci komórkowej na drodze tego procesu (Rys. 2). Znane są dwa główne szlaki apoptozy, w które zaangażowane są mitochondria – szlak wewnętrzny (mitochondrialny) oraz szlak zewnętrzny (receptorowy). Mitochondrialny szlak apoptozy może być aktywowany różnymi czynnikami, takimi jak uszkodzenia DNA, wzrost stężenia Ca2+ w cytoplazmie, podwyższenie poziomu reaktywnych form tlenu oraz stres oksydacyjny. Podczas zakażenia wirusowego również może dochodzić do zmian w komórce, prowadzących do przerwania ciągłości błony mitochondrialnej, co w konsekwencji skutkuje aktywacją apoptozy [36]. Bezpośrednim sygnałem do zainicjowania wewnętrznego szlaku apoptozy jest zwiększenie przepuszczalności błony mitochondrialnej (mitochondrial membranę permeabilization, MMP), w której biorą udział kanały MAC (mitochondrial apoptosis-induced channel) i MPTP (mitochondrial permeability transition pore) oraz obniżenie potencjału błonowego mitochondrium, co prowadzi do uwolnienia ponad 40 białek z przestrzeni międzybłonowej do cytoplazmy [56]. Do tych białek zalicza się głównie cytochrom c, drugi mitochondrialny aktywator kaspaz Smac/DIABLO (second mitochondrial activator of caspases/direct IAP binding protein with PI), proteazę serynową Omi/HtrA2 (high-temperature requirement serin protease A2), czynnik indukcji apoptozy AIF (apoptosis-inducing factor) oraz endonukleazę G [36]. Powyższe białka mają działanie proapototyczne, jednakże kluczowe dla procesu apoptozy jest uwolnienie cytochromu c do cytoplazmy, który łączy się następnie z czynnikiem Apaf-1, 284 K.P. GREGORCZYK, Z. WYŻEWSKI, L. SZULC-DĄBROWSKA, J. STRUZIK, J. SZCZEPANOWSKA, M. NIEMIAŁTOWSKI zmieniając jego konformację. Powoduje to odsłonięcie miejsc wiązania dATP w białku Apaf-1, umożliwiając tym samym przyłączenie dATP, co indukuje oligomeryzację siedmiu cząsteczek Apaf-1 za pośrednictwem domen CARD na ich N-końcach. Kolejnym zdarzeniem jest związanie siedmiu cząsteczek prokaspazy 9 z Apaf-1, tworząc ostatecznie kompleks zwany apoptosomem. Dzięki takiemu połączeniu, prokaspaza 9 zostaje autokatalitycznie przekształcona do kaspazy 9, co skutkuje aktywacją kaspaz wykonawczych (kaspazy 3 i 7), odpowiedzialnych za charakterystyczne zmiany w komórce, prowadzące ostatecznie do jej śmierci [36]. Drugim omawianym rodzajem apoptozy jest szlak zewnętrzny, w którym sygnały śmierci pochodzą spoza komórki i są odbierane za pośrednictwem receptorów na jej powierzchni, takich jak Fas, TNFR (TNF-receptor) lub TRAIL-R1/R2 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1/2). Połączenie receptora z ligandem, odpowiednio Fas – FasL, TNFR – TNF-α, TRAIL-R1/R2 – TRAIL, doprowadza do przekształcenia prokaspazy 8 w aktywną kaspazę 8, która odpowiada za aktywowanie kaspaz efektorowych, podobnie jak kaspaza 9 w szlaku wewnętrznym [39]. Na tym etapie drogi tych dwóch szlaków się krzyżują. Elementem łączącym obydwa rodzaje apoptotycznej śmierci komórki jest białko Bid (BH3 interacting domain), którego proteolityczne cięcie przez kaspazę 8 prowadzi do uwolnienia fragmentu tBid (truncated Bid) [27]. Powstała w ten sposób cząsteczka tBid przyłącza się do białka Bax lub Bak, znajdujących się na powierzchni mitochondriów, doprowadzając tym samym do zwiększenia przepuszczalności błony tych organelli i rozpoczęcia mechanizmu wewnętrznego szlaku apoptozy [27]. Przeprowadzone badania wykazały też, że tBid może samoistnie, bez udziału innych białek, powodować perforację błon mitochondrialnych w miejscu styku między błoną zewnętrzną a wewnętrzną [33]. Wirusy wykształciły zdolność manipulowania apoptozą między innymi poprzez odziaływanie z białkami, odpowiadającymi za jej kontrolę. Dobrze poznanymi regulatorami mitochondrialnego szlaku apoptozy są białka z rodziny Bcl-2, do której zalicza się zarówno inhibitory (np. Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w), jak i aktywatory (np. Bid, Bax, Bad, Bak) tego procesu. Zbudowane są z czterech domen BH (Bcl-2 homology): BH1, BH2, BH3 oraz BH4, na podstawie których wyróżniono 3 grupy tych białek. Do pierwszej zalicza się inhibitory apoptozy, zawierające prawie zawsze wszystkie 4 domeny; do drugiej grupy należą białka proapoptotyczne, pozbawione domeny BH4, natomiast trzecia grupa również zawiera aktywatory apoptozy, jednakże charakteryzujące się posiadaniem tylko domeny BH3 [43]. Większość białek należących do rodziny Bcl-2 cechuje się obecnością domeny transbłonowej na hydrofobowym C-końcu łańcucha polipeptydowego, umożliwiającej im zakotwiczenie w błonach wewnątrzkomórkowych, m.in. w zewnętrznej błonie mitochondrialnej [43]. Białka pozbawione takiego fragmentu (np. Bad, Bid), mogą przemieszczać się w cytoplazmie i komunikować się z innymi białkami, zapewniając przez to przesyłanie sygnałów wewnątrz komórki [43]. Antyapoptotyczne białka z rodziny Bcl-2 chronią komórkę przed wieloma sygnałami apoptototycznymi, przez co zwiększają jej szanse na przeżycie [18]. Wpływają one na regulację integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej MOM (mitochondrial outer membrane), jednakże mechanizm ich działania nie jest do końca poznany [54]. Prawdopodobnie odpowiadają za hamowanie aktywności Bax poprzez wiązanie tego białka, zapobiegając tym samym jego oligomeryzacji i rozpoczęciu apoptozy [13]. Inne badania wykazały, że białko Bcl-2 może wiązać się z białkami proapoptotycznymi, mającymi jedynie domenę BH3 [54]. W warunkach fizjologicznych obserwuje się nadmiar białek antyapoptotycznych (np. Bcl-2) w stosunku do proapoptotycznych (np. Bax, Bak), co hamuje proces apoptozy [37]. Natomiast podczas stanów patologicznych może dojść do aktywacji białka p53, które pobudza ekspresję genów dla białek proapoptotycznych, a tym samym zwiększa ich poziom. Białko Bax zostaje aktywowane i transportowane do MOM, podczas gdy Bak w normalnych warunkach pozostaje związane z zewnętrzną błoną mitochondrialną, jednak ulega aktywacji dopiero po stymulacji przez odpowiednie czynniki. Zwiększony poziom ekspresji Bax i Bak oraz ich aktywacja pobudza wewnętrzny szlak apoptozy w wyniku wytworzenia mitochondrialnych kanałów MAC indukujących apoptozę [37]. MAC umożliwiają wydostanie się białek (głównie cytochromu c) do cytoplazmy z przestrzeni międzybłonowej [37]. Znanych jest wiele przykładów białek wirusowych pobudzających apoptozę na poziomie regulacji tego procesu. Mogą one powodować wzrost poziomu białek proapototycznych bądź obniżać ilość i/lub aktywność czynników antyapoptotycznych. Przykładem są białka różnych typów wirusów, takich jak: a) 2Apro, 2B, 3A, 3Cpro wirusa polio (PLV, poliovirus), powodujące aktywację Bax; b)E1A, E4orf6 adenowirusa (ADV, adenovirus), zwiększające ekspresję proapoptotycznych białek posiadających jedynie domenę BH3; c)VP1 wirusa pryszczycy (FMDV, foot and mouth disease virus), redukujące poziom Bcl-2; d)EnV, Nef i proteaza kodowana przez HIV-1, obniżające ilość antyapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 [14]. Kolejnym mechanizmem działania wirusowych białek proapoptotycznych jest aktywowanie kaspaz. Do takich wirusowych białek zalicza się np. 2C i VP wirusa zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego ptaków (AEV, avian encephalitis virus), Env i proteaza wirusa ROLA MITOCHONDRIÓW W ODPORNOŚCI PRZECIWWIRUSOWEJ zespołu nabytego niedoboru odporności typu 1 (HIV-1, human immunodeficiency virus), NS3 wirusa zapa­le­ nia wątroby typu C, białko M wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (vesicular stomatitis virus, VSV) oraz białka kapsydu NS2B/NS3 wirusa Zachodniego Nilu [14]. Rolą mitochondriów jest aktywacja procesu apoptozy w odpowiedzi na zmiany zachodzące w komórce, wywołane m.in. obecnością wirusa. W zakażeniach powyższymi wirusami kodującymi białka proapoptotyczne proces śmierci komórkowej jest działaniem pożądanym, umożliwiającym szerzenie się zakażenia. Tym samym apoptoza związana z funkcjami mitochondriów pełni funkcje prowirusowe. Podobnie jest w przypadku wirusów (np. HBV, HCV, HIV-1, HTLV-1 [human T-lymphotropic virus], PLV, WNV) wykazujących zdolność do pobudzania uwalniania cytochromu c do cytoplazmy oraz obniżania potencjału mitochondrialnego za pośrednictwem swoich białek, co również skutkuje aktywacją apoptozy [14]. Obecność wirusa w komórce spowodowałaby zmiany prowadzące ostatecznie do uruchomienia wewnętrznego szlaku apoptozy, bez względu na obecność wirusowych aktywatorów śmierci. Apoptoza będąca potencjalnym elementem ochrony przeciwwirusowej, w tym przypadku również stanowi działanie propagujące zakażenie, a wirusowe mechanizmy proapoptotyczne jedynie przyśpieszają zajście tego procesu. Przeciwną, czyli przeciwwirusową rolę apoptozy, a tym samym mitochondriów obserwuje się w z zakażeniach wirusami blokującymi śmierć komórki. Mogą one zawierać w swoim materiale genetycznym geny dla produktów o podobnej budowie lub funkcjach do białek z rodziny Bcl-2, przez co mają zdolność hamowania procesu apoptozy [14]. Białka wirusowe, będące homologami białek z rodziny Bcl-2 (v-Bcl-2) zostały umieszczone na Rys. 1 (podkreślone). Kolejnym mechanizmem blokowania przebiegu apoptozy przez produkty genów wirusowych jest obniżenie poziomu białek proapoptotycznych jak, na przykład Bim przez białka EBNA3A i EBNA3C kodowanych przez wirusa Epsteina-Barr [14]. Wymienione przykłady antyapoptotycznego działania białek wirusowych wskazują na potencjalnie przeciwwirusową rolę apoptozy z udziałem mitochondriów. Powyższe wirusy potrzebują dłuższego czasu na przeprowadzenie procesu replikacji i morfogenezy. Apoptoza, która zostałby prawdopodobnie wywołana na skutek zmian spowodowanych obecnością wirusa, doprowadziłaby do ograniczenia rozprzestrzeniania zakażenia. Jednakże hamowanie tego procesu przez wirusowe białka antyapoptotyczne, ostatecznie skutkuje brakiem właściwej przeciwwirusowej reakcji mitochondriów i w efekcie propaguje zakażenie. Inne białka wirusowe związane z zahamowaniem apoptozy mogą pełnić funkcje inhibitorów kaspaz, do 285 których zaliczamy m.in. A224L i p35 wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV, African swine fever virus), vIAP bakulowirusa (BCV, baculovirus), U236 (vICA) ludzkiego CMV oraz CvmA VACV [14]. W tym przypadku mitochondria pełnią realne funkcje przeciwwirusowe, ponieważ inicjują zajście apoptozy. Dopiero hamowanie aktywacji kaspaz przez białka wirusowe, czyli etapu niezależnego od mitochondriów, skutkuje inhibicją tego procesu, doprowadzając ostatecznie do ekspansji zakażenia. Co ciekawe, niektóre z wirusów wykazują jednocześ­ nie zdolność do indukowania, jak i hamowania apoptozy. Prawdopodobnie jest to uzależnione od potrzeb wirusa na danym etapie zakażenia. Taki mechanizm działania jest charakterystyczny dla herpeswirusów, które regulują śmierć komórek gospodarza, w zależności od tego, czy ich celem jest przejście w stan latencji, czy też zakażenie kolejnych komórek [35]. Główną ochronę przed apoptozą podczas latencji HHV-1/2 odgrywa gen LAT, który odpowiada za hamowanie proapototycznego Bcl-XS, a w efekcie za nasilenie splicingu Bcl-X w kierunku antyapoptotycznego Bcl-XL [35]. 5. Podsumowanie Mitochondria odgrywają znaczącą rolę w odporności przeciwwirusowej. Pośredniczą w produkcji IFN typu I oraz cytokin prozapalnych, a także uczestniczą w apoptozie. Wymienione procesy mają na celu zahamowanie replikacji wirusa oraz transkrypcji genów i translacji jego białek, a w konsekwencji eliminację patogenu z organizmu. Jednakże w procesie ewolucji wirusy wykształciły mechanizmy unikania odpowiedzi przeciwwirusowej gospodarza, również tej związanej z czynnościami mitochondriów. Przykładem takiego działania są białka wirusowe mogące hamować produkcję IFN typu I i cytokin prozapalnych na różnych jej etapach, co zabezpiecza patogen przed aktywacją układu odpornościowego. Dodatkowo, niektóre wirusy kodują białka hamujące wewnętrzny proces apoptozy, który ma na celu ochronę organizmu przed rozprzestrzenianiem się zakażenia. Apoptoza i aktywujące ją mitochondria pełnią w tym przypadku rolę „pseudoprzeciwwirusową”, ponieważ co prawda pobudzenie śmierci komórkowej ograniczyłoby ekspansję wirusa w organizmie, to jednak hamowanie tego procesu przez wirusy, skutkuje jego nieprzydatnością w walce z patogenem. Z drugiej strony apoptoza może nie tylko nie zabezpieczać przed zakażeniem, ale dodatkowo wykazywać działanie prowirusowe. Takie działanie obserwuje się podczas zakażenia wirusami aktywującymi ten proces. Wykorzystują one apoptozę, a tym samym mitochondria, do propagowania zakażenia i ekspansji patogenu w organizmie. W tym przypadku apoptoza 286 K.P. GREGORCZYK, Z. WYŻEWSKI, L. SZULC-DĄBROWSKA, J. STRUZIK, J. SZCZEPANOWSKA, M. NIEMIAŁTOWSKI ułatwia uwolnienie potomnych cząstek wirusowych, które są w stanie zakażać kolejne komórki, doprowadzając do rozwoju choroby. Powyższe przykłady wskazują, że rzeczywista rola apoptozy z udziałem mitochondriów w odporności przeciwwirusowej jest jedynie teoretyczna. Praca została sfinansowana z grantu Narodowego Centrum Nauki w Krakowie numer UMO-2011/03/B/NZ6/03856 Piśmiennictwo 1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Molecular Biology of the Cell, 4th edition. Garland Publishing Inc. New York (2002) 2. Allen I. C., Ting J. P., wsp.: NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-κB signaling pathways. Immunity, 34, 854–865 (2011) 3. Arnoult D1., Bartle L.M., Skaletskaya A., Poncet D., Zamzami N., Park P.U., Sharpe J., Youle R.J., Goldmacher V.S.: Cytomegalovirus cell death suppressor vMIA blocks Bax- but not Bak-mediated apoptosis by binding and sequestering Bax at mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 7988–7993 (2004) 4.Barral P.M., Sarkar D., Su Z.Z., Barber G.N., De Salle R., Racaniello V.R., Fisher P.B.: Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: key regulators of innate immunity. Pharmacol. Ther. 124, 219–234 (2009) 5.Biron C.A., Nguyen K.B., Pien G.C., Cousens L.P., Salazar-Mather T.P.: Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annu. Rev. Immunol. 17, 189–220 (1999) 6.Boya P., Pauleau A.L., Poncet D., Gonzalez-Polo R.A., Zamzami N., Kroemer G.: Viral proteins targeting mitochondria: Controlling cell death. Biochim. Biophys. 1659, 178–189 (2004) 7.Caamaño J., Hunter C.A.: NF-kappaB family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions. Clin. Microbiol. Rev. 15, 414–429 (2002) 8.Castanier C., Zemirli N., Portier A., Garcin D., Bidère N., Vazquez A., Arnoult D.: MAVS ubiquitination by the E3 ligase TRIM25 and degradation by the proteasome is involved in type I interferon production after activation of the antiviral RIG-I-like receptors. BMC Biol. 10, 44 (2012) 9. Castanier C., Garcin D., Vazquez A., Arnoult D.: Mitochondrial dynamics regulate the RIG-I-like receptor antiviral pathway. EMBO Rep. 11, 133–138 (2010) 10.Chan D.C.: Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79–99 (2006) 11.Chiu Y.H., Macmillan J.B., Chen Z.J.: RNA polymerase III detects cytosolic DNA and induces type I interferons through the RIG-I pathway. Cell, 138, 576–591 (2009) 12.Elmore S.: Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol. Pathol. 35, 495–516 (2007) 13. Fletcher J.I., Meusburger S., Hawkins C.J., Riglar D.T., Lee E.F., Fairliea W.D, Huanga D.C.S, Adams J.M.: Apoptosis is triggered when prosurvival Bcl-2 proteins cannot restrain Bax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 18081–18087 (2008) 14. Galluzzi L., Brenner C., Morselli E., Touat Z., Kroemer G.: Viral Control of Mitochondrial Apoptosis. PLoS Pathog. 4, e1000018 (2008) 15. Génin P., Algarté M., Roof P., Lin R., Hiscott J.: Regulation of RANTES chemokine gene expression requires cooperativity between NF-kappa B and IFN-regulatory factor transcription factors. J. Immunol. 164, 5352–5361 (2000) 16. Goodbourn S., Didcock L., Randall R.E.: Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J. Gen. Virol. 81, 2341–2364 (2000) 17].Guicciardi M.E., Gores G.J.: Life and death by death receptors. FASEB. J. 23, 1625–1637 (2011) 18. Gustafsson A.B., Gottlieb R.A.: Bcl-2 family members and apoptosis, taken to heart. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C45–51 (2007) 19. Henze K, Martin W: Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature, 426, 127–128 (2003) 20. Hervas-Stubbs S., Perez-Gracia J.L., Rouzaut A., Sanmamed M.F., Le Bon A., Melero I.: Direct effects of type I interferons on cells of the immune system. Clin. Cancer Res. 17, 2619–2627 (2011) 21. Hordyjewska A., Pasternak K.: Apoptotyczna śmierć komórki. Adv. Clin. Exp. Med. 14, 545–554 (2005) 22.Irving A., Williams B.R.: Latest advances in innate antiviral defence. F1000 Biol. Rep. 17, 1–22 (2009) 23. Ishikawa H.., Barber G.N.: STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling. Nature, 455, 674–678 (2008) 24. Kato H., Akira S. i wsp.: Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature, 441, 101– 105 (2006) 25. Kawai T., Akira S.: Toll-like receptor and RIG-I-like receptor signaling. Ann. NY Acad. Sci. 1143, 1–20 (2008) 26. Kawai T., Takahashi K., Sato S., Coban C., Kumar H., Kato H., Ishii K.J., Takeuchi O., Akira S.: IP S‑1, an adaptor triggering RIG‑I‑ and Mda5-mediated type I I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981–988 (2005) 27. Kaźmierczuk A., Kiliańska Z.M.: Role of heat shock proteins in cell apoptosis. Postepy Hig. Med. Dosw. (Online), 64, 273–283 (2010) 28. Koshiba T.: Mitochondrial-mediated antiviral immunity. Bio­ chim. Biophys. Acta, 1833, 225–232 (2013) 29. Kramer T., Enquist L.W.: Alphaherpesvirus infection disrupts mitochondrial transport in neurons. Cell Host. Microbe. 11, 504–514 (2012) 30. Leung D.W., Basler C.F., Amarasinghe G.K.: Molecular mechanisms of viral inhibitors of RIG-I-like receptors. Trends Micro­ biol. 20, 139–146 (2012) 31. Liu X.Y., Wei B., Shi H.X., Shan Y.F., Wang C.: Tom70 mediates activation of interferon regulatory factor 3 on mitochondria. Cell Res, 20, 994–1011 (2010) 32. Loo Y.M., Gale Jr. M.: Immune signaling by RIG-I-like receptors. Immunity, 34, 680–692 (2011) 33.Lutter M., Perkins G.A., Wang X.: The pro-apoptotic Bcl-2 family member tBid localizes to mitochondrial contact sites. BMC Cell Biol. 2, 22 (2001) 34. McCormick A.L., Smith V.L., Chow D., Mocarski E.S.: Disruption of mitochondrial networks by the human cytomegalovirus UL37 gene product viral mitochondrion-localized inhibitor of apoptosis. J. Virol. 77, 631–641 (2003) 35. Miszczak D., Słońska A., Golke A., Cymerys J.: Herpesviruses survival strategies-latency and apoptosis. Post. Hig. Med. Dosw. (Online), 67, 276–287 (2013) 36. Ohta A., Nishiyama Y.: Mitochondria and viruses. Mitochon­ drion, 11, 1–12 (2011) 37.Peixoto P.M., Lue J.K., Ryu S.Y., Wroble B.N., Sible J.C., Kinnally K.W.: Mitochondrial apoptosis-induced channel (MAC) function triggers a Bax/Bak-dependent bystander effect. Am. J. Pathol. 178, 48–54 (2011) 38. Pippig D.A., Hellmuth J.C., Cui S., Kirchhofer A., Lammens K., Lammens A., Schmidt A., Rothenfusser S., Hopfner K.P. The ROLA MITOCHONDRIÓW W ODPORNOŚCI PRZECIWWIRUSOWEJ regulatory domain of the RIG-I family ATPase LGP2 senses double-stranded RNA. Nucleic Acids Res. 37, 2014–2025 (2009) 39. Portt L., Norman G., Clapp C., Greenwood M., Greenwood M.T.: Anti-apoptosis and cell survival: a review. Biochim. Biophys. Acta, 1813, 238–259 (2011) 40.Prchal M., Pilz A., Simma O., Lingnau K., von Gabain A., Strobl B., Müller M., Decker T.: Type I interferons as mediators of immune adjuvants for T- and B cell-dependent acquired immunity. Vaccine, 27, G17-G20 (2009) 41. Ramos H.J., Gale M. Jr.: RIG-I like receptors and their signaling crosstalk in the regulation of antiviral immunity. Curr. Opin. Virol. 1, 167–76 (2011) 42. Rojo G., Chamorro M., Salas M.L., Vinuela E., Cuezva J.M., Salas J.: Migration of mitochondria to viral assembly sites in African swine fever virus-infected cells. J. Virol. 72, 7583–7588 (1998) 43.Rupniewska Z., Bojarska-Junak A.: Apoptosis: mitochondrial membrane permeabilization and the role played by Bcl-2 family proteins. Post. Hig. Med. Dosw. (Online), 58, 538–547 (2004) 44. Saha S.K., Cheng G. i wsp.: Regulation of antiviral responses by a direct and specific interaction between TRAF3 and Cardif. EMBO J. 25, 3257–3263 (2006) 45. Seth R.B., Sun L., Ea C.K., Chen Z.J.: Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-κB and IRF3. Cell, 122, 669–682 (2005) 46.Smirnova E., Griparic L., Shurland D.L., van der Bliek A.M.: Dynamin-related protein Drp1 is required for mitochondrial division in mammalian cells. Mol. Biol. Cell. 12, 2245–2256 (2001) 47. Tait S.W., Green D.R.: Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 11, 621–632 (2010) 48. Tait S.W., Green D.R.: Mitochondria and cell signalling. J. Cell Sci. 125, 807–815 (2012) 287 49.Takeuchi O., Akira S.: Innate immunity to virus infection. Immunol. Rev. 227, 75–86 (2009) 50. Takeuchi O., Akira S.: MDA5/RIG-I and virus recognition. Curr. Opin. Immunol. 20, 17–22 (2008) 51.Takeuchi O., Akira S.: Pattern recognition receptors and inflammation. Cell, 140, 805–820 (2010) 52. Theofilopoulos A.N., Baccala R., Beutle B., Kono D.H.: Type I interferons (a/b) in immunity and autoimmunity. Annu. Rev. Immunol. 23, 307–336 (2005) 53. Vandecasteele G., Szabadkai G., Rizzuto R.: Mitochondrial calcium homeostasis: mechanisms and molecules. IUBMB Life, 52, 213–219 (2001) 54. Wallgren M., Lidman M., Pedersen A., Brännström K., Karlsson B.G., Gröbner G.: Reconstitution of the Anti-Apoptotic Bcl-2 Protein into Lipid Membranes and Biophysical Evidence for Its Detergent-Driven Association with the Pro-Apoptotic Bax Protein. PLoS ONE 8, e61452 (2013) 55.Wang C., Youle R.J.: The role of mitochondria in apoptosis. Annu. Rev. Genet. 43, 95–118 (2009) 56.Webster K.A.: Mitochondrial Death Channels. Am. Sci. 97, 384–391 (2009) 57.West A.P., Shadel G.S., Ghosh S.: Mitochondria in innate immune responses. Nat. Rev. Immunol. 11, 389–402 (2011) 58. Westermann B.: Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. J. Biol. Chem. 283, 13501–13505 (2008) 59. Xu L.G., Wang Y.Y., Han K.J., Li L.Y., Zhai Z., Shu H.B.: VISA is an adapter protein required for virus- triggered IFN-β signaling. Mol. Cell, 19, 727–740 (2005) 60. Yasukawa K., Oshiumi H., Takeda M., Ishihara N., Yanagi Y., Seya T., Kawabata S., Koshiba T.: Mitofusin 2 inhibits mitochondrial antiviral signaling. Sci. Signal. 2, ra47 (2009) 61. Zemirli N., Arnoult D.: Mitochondrial anti-viral immunity. Int. J. Biochem. Cell Biol. 44, 1473–1476 (2012) POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 3, 288–298 http://www.pm.microbiology.pl KULTURY STARTEROWE DO PRODUKCJI TWAROGÓW KWASOWYCH – ROLA I OCZEKIWANIA Joanna Żylińska1*, Krzysztof Siemianowski2, Krzysztof Bohdziewicz2, Katarzyna Pawlikowska3, Piotr Kołakowski3, Jerzy Szpendowski2, Jacek Bardowski1 2 1 Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, 02-106 Warszawa, ul. Pawińskiego 5a Katedra Mleczarstwa i Zarządzania Jakością, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, 10-719 Olsztyn, ul. Oczapowskiego 7 3 Danisco Poland, 61-315 Poznań, ul. Wybieg 6 Wpłynęło w marcu 2014 r. 1. Wstęp. 2. Technologia twarogów kwasowych. 3. Rola kultur starterowych w produkcji serów twarogowych. 4. Kultury starterowe w produkcji twarogu kwasowego. 4.1. Oporność na bakteriofagi. 4.2. Produkcja bakteriocyn. 4.3. Aktywność proteolityczna i lipolityczna. 4.4. Produkcja zewnątrzkomórkowych polisacharydów. 5. Podsumowanie Starter cultures for acid curd – role and expectations Abstract: Lactic acid bacteria are industrially important microbes used all over the world in a large variety of industrial food fermentations. Cheese, cottage cheese, especially acid curd cheese, are characteristic dairy products for some Central and Eastern European countries. For production of acid curd cheese, only two components are needed: milk and lactic acid bacteria starter cultures. Starter cultures determine in large extent the technological process, the quality of the resulting quark and its shelf life. The composition of quark acid bacteria cultures is constituted in majority by Lactococcus and Leuconostoc bacteria. Selection of strains and construction of cultures with balanced species and stable composition for acid curd production is still very complex and presents a difficult challenge for producers of dairy cultures. 1. Introduction. 2. Acid curd technology. 3. The role of starter cultures in the production of cottage cheese. 4. Starter cultures for acid curd. 4.1. Bacteriophage resistance. 4.2. Bacteriocin production 4.3. Proteolytic and lipolytic activity. 4.4. Production of extracellular polysaccharides. 5. Summary Słowa kluczowe: kultury starterowe, oczekiwania, rola, twarogi kwasowe Key words: starter cultures, expectations, role, acid curd 1. Wstęp Sery twarogowe są charakterystyczne dla asortymentu wyrobów mleczarskich w krajach Europy Środkowej i Wschodniej. Są też w tej części świata powszechnie znane, dostępne i cenione jako bogata grupa produktów, głównie niedojrzewających, określanych również jako ,,sery świeże” [4, 43]. Polski przemysł mleczarski przeznacza w skali rocznej na ich produkcję ok. 20% z całkowitej ilości mleka jakie trafia do skupów [44, 51]. W 2006 roku prawie 80% zakładów mleczarskich w Polsce deklarowało produkcję wyrobów zaliczanych do grupy serów twarogowych. Świadczy to o atrakcyjności i dużym zapotrzebowaniu rynku na tego rodzaju produkty [6]. Wielkość rocznej krajowej produkcji serów twarogowych ogółem w ostatnich latach utrzymuje się na poziomie powyżej 300 tys. ton i systematycznie wzrasta. Potwierdzeniem wspomnianej tendencji jest wzrost wielkości produkcji z 302,4 tys. ton w 2006 roku [47] do 371,0 tys. ton w 2010 roku [45]. Wartość ta stanowi historyczne maksimum ich krajowej produkcji. Spożycie serów twarogowych w Polsce od wielu lat wynosi powyżej 6 kg na osobę i wyraźnie przewyższa konsumpcję serów dojrzewających oraz topionych. Statystyczny Polak w 2010 roku spożył ich 6,60 kg, co odpo- wiadało 58,5% udziałowi w spożyciu serów ogółem [54]. Duża atrakcyjność tej grupy przetworów mlecznych wynika z długiej tradycji konsumpcji, ukształtowanych przyzwyczajeń żywieniowych oraz dobrej dostępności. Nie bez znaczenia są tu także: bogaty asortyment i stosunkowo niskie ceny [16]. Bardzo ważna w tym aspekcie jest również ich wysoka wartość odżywcza. Sery twarogowe stanowią w codziennej diecie cenne źródło pełnowartościowego białka, pewnych ilości lekkostrawnego tłuszczu, witamin (głównie z grupy B) oraz licznych składników mineralnych [21, 53, 58]. W zależności od zastosowanej metody koagulacji białek mleka w asortymencie serów twarogowych wyróżnia się produkty kwasowe i kwasowo-enzymatyczne, przy czym tradycyjny twaróg prasowany produkowany jest przy zastosowaniu koagulacji kwasowej. Twarogiem kwasowym zgodnie z definicją nazywamy: częściowo odwodniony skrzep mleka, chudego lub o znormalizowanej zawartości tłuszczu, koagulowanego w sposób pośredni (przy udziale bakterii fermentacji mlekowej) lub bezpośredni (przez zastosowanie dodatku kwasu, np. mlekowego, cytrynowego) [4, 17, 36, 38, 44, 53]. W przemysłowej produkcji serów twarogowych, w tym twarogów kwasowych, powszechne zastosowanie znajduje pierwsza metoda, a najważniejszym * Autor korespondencyjny: Zakład Biochemii Drobnoustrojów, Instytut Biochemii i Biofizyki , Polska Akademia Nauk, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa; tel. 22 592 12 23; e-mail: [email protected] KULTURY STARTEROWE DO PRODUKCJI TWAROGÓW KWASOWYCH – ROLA I OCZEKIWANIA dodatkiem technologicznym, w zasadzie niezbędnym, są kultury starterowe zawierające bakterie fermentacji mlekowej. Odpowiedni ich dobór wywiera istotny wpływ na przebieg procesu produkcyjnego, ale warunkuje również kształtowanie pożądanych cech jakościowych i atrakcyjność produktu finalnego [4, 25, 43]. 2. Technologia twarogów kwasowych Przemysłowa produkcja twarogów kwasowych metodą tradycyjną, obejmuje takie czynności technologiczne jak: przygotowanie surowca do przerobu, zaprawianie i koagulacja, obróbka skrzepu, separacja masy twarogowej, formowanie i prasowanie, porcjowanie, chłodzenie oraz pakowanie [17, 36, 44, 52]. Jako surowiec do przemysłowej produkcji twarogów kwasowych metodą tradycyjną wykorzystywane jest najczęś­ ciej odpowiednio przygotowane mleko, ale niekiedy również maślanka lub jej mieszanina z mlekiem. Przygotowanie surowca obejmuje normalizację zawartości tłuszczu, pasteryzację oraz ochłodzenie do temperatury zaprawiania (20–35°C), co stanowi ostatnią czynność przed wprowadzeniem bakterii fermentacji mlekowej w postaci kultur starterowych [17, 36, 44]. W technologii tradycyjnych twarogów stosuje się koagulację kwasową i praktyczne zastosowanie może znajdować tu jej wariant długo- lub krótkotrwały. Metoda długotrwała przewiduje zaprawienie mleka o temperaturze 20–28°C kulturami starterowymi i pozostawienie w tych warunkach na 12–16 godzin w celu uzyskania skrzepu [36]. W metodzie krótkotrwałej do mleka o temperaturze 32–35°C wprowadza się zwiększoną ilość kultur starterowych, tak aby czas koagulacji wynosił 6–8 godzin [44, 53]. Powstanie kwasowego skrzepu mleka jest efektem wzrostu kwasowości. W następstwie ukwaszania przez bakterie kwasu mlekowego, do wartości pH 4, 6, która odpowiada punktowi izoelektrycznemu frakcji białek kazeinowych w temperaturze 20°C [17, 38, 44]. W tych warunkach zewnętrzny ładunek elektryczny tej frakcji białek jest bliski zeru. Micele kazeiny tracą zdolność wiązania wody, i tym samym ochronną powłokę hydratacyjną, w następstwie czego ulegają agregacji. Powstaje wtedy żel, który w wolnych przestrzeniach struktury sieciowej zamyka fazę wodną mleka wraz z rozpuszczonymi w niej składnikami [38, 44]. Dojrzały skrzep kwasowy powinien charakteryzować się kwasowością miareczkową rzędu 30–34°SH (°SH to liczba ml 0,25 M roztworu NaOH zużytego do zobojętnienia 100 ml mleka wobec fenoloftaleiny. 1°SH odpowiada 0,0225% zawartości kwasu mlekowego), konsystencją delikatnej galarety, jednolitym wyglądem, bez pęknięć, szczelin oraz wydzielania serwatki, a przy załamaniu dawać przełom o gładkiej powierzchni ścianek [17, 36, 44]. 289 Obróbka skrzepu obejmuje krojenie na prostopadłościany oraz delikatne mieszanie, przy jednoczesnym podgrzewaniu, w czasie którego zachodzi stopniowe osuszanie powstałego ziarna twarogowego. Oddzielanie serwatki i ociekanie masy twarogowej może być realizowane przy wykorzystaniu tkanin filtracyjnych lub perforowanych form. Po wstępnym odwodnieniu masę twarogową poddaje się prasowaniu i ewentualnemu porcjowaniu. W opisany sposób produkuje się bardzo cenione przez krajowych konsumentów twarogi kwasowe chude, półtłuste i tłuste prasowane o zwartej strukturze, tzw. krajankę i klinki oraz samoprasowane o analogicznym lub innym kształcie, uzyskiwane przy wykorzystywaniu odpowiednich form [17, 36, 44, 52]. Sery twarogowe niedojrzewające powinny odznaczać się czystym, łagodnym, lekko kwaśnym smakiem i zapachem, jednolitą, zwartą strukturą i konsystencją, oraz jednolitą w całej masie barwą od białej do lekko kremowej [40]. Z kwasowej masy twarogowej mogą być również otrzymywane smarowne twarożki: naturalne lub z dodatkiem np. masła, śmietanki, przypraw, warzyw, owoców, oraz twarogi dojrzewające, które obecnie mają znaczenie wyłącznie regionalne [6, 36, 44, 53]. W klasycznych metodach produkcji serów twarogowych wraz z oddzieloną serwatką tracone jest do 60% składników suchej masy mleka przerobowego [3], w tym cenne odżywczo białka serwatkowe, którym przypisuje się również liczne właściwości prozdrowotne [32, 46]. Jednym z najważniejszych kierunków postępu w technologii twarogów jest dążenie do lepszego wykorzystania białek surowca w produkcie. W tym celu opracowano i wdrożono dotychczas metodę termiczno-wapniową, która polega na poddaniu wysokiej pasteryzacji mleka wzbogaconego w wapń. Wymieniona metoda pozwala na zwiększenie retencji związków azotowych białkowych mleka w serach twarogowych z ok. 75% do blisko 90% [51]. Podobne możliwości daje również metoda z wykorzystaniem transglutaminazy [5]. 3. Rola kultur starterowych w produkcji serów twarogowych Mikroflorę starterową w produkcji serów twarogowych stanowią wyłącznie bakterie kwasu mlekowego, których rola polega na [55]: 1) ukwaszaniu mleka i wytworzeniu skrzepu, 2)nadawaniu charakterystycznych cech smakowo-zapachowych, 3) wytwarzaniu lub nie dwutlenku węgla, 4) hamowaniu rozwoju niepożądanej mikroflory. Mając na uwadze różnice w produkcji oraz właściwościach gotowych wyrobów w zależności od typu sera twarogowego, stosuje się kultury starterowe o odpowiedniej charakterystyce technologicznej (tabela I). 290 J. ŻYLIŃSKA, K. SIEMIANOWSKI, K. BOHDZIEWICZ, K. PAWLIKOWSKA, P. KOŁAKOWSKI, J. SZPENDOWSKI, J. BARDOWSKI Tabela I Charakterystyka technologiczna kultur startowych stosowanych w produkcji serów twarogowych [43] Ser twarogowy Właściwości kultur Skład szczepowy kwasowy kwasowo-enzymatyczny ziarnisty (cottage cheese) mieszanina homo- i heterofermentatywnych szczepów mieszanina homo- i heterofermentatywnych szczepów mieszanina homoi heterofermentatywnych szczepów + + (+) + + +++ + + + + (+ +) – + + (+ +) + (+ +) – + + + + + ++ + + (+) + + + + + Szybkość ukwaszania Wytwarzanie gazu Produkcja związków aromatotwórczych Synereza skrzepu Stabilność pH Legenda: – brak zdolności; + umiarkowana zdolność; ++ średnia zdolność; +++ wysoka zdolność; ++++ bardzo wysoka zdolność Tabela II Skład kultur startowych stosowanych w produkcji serów twarogowych Bakterie kwasu mlekowego Ser twarogowy kwasowy kwasowo-enzymatyczny ziarnisty (cottage cheese) Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris +/– Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides +/–+/– – +/ – – Lactococcus lactis subsp. lactis + ++ Lactococcus lactis subsp. cremoris + ++ Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Streptococcus thermophilus ++– +/– +/–+/– Legenda: + niezbędne w produkcji; +/– wykorzystywane w zależności od rodzaju sera twarogowego lub stosowanej technologii w zakładzie; – nie mające zastosowania w produkcji danego typu sera twarogowego Kompozycja szczepowa kultur starterowych do produkcji twarogu kwasowego powinna zapewniać odpowiednią szybkość ukwaszania mleka (czas koagulacji kwasowej), zdolność do tworzenia gazu w skrzepie i syntezę związków aromatotwórczych, a także wysoką podatność skrzepu na osuszanie (wydzielanie serwatki) oraz dobrą stabilność kwasowości czynnej po uzyskaniu pH ze strefy punktu izoelektrycznego frakcji białek kazeinowych (ograniczanie przekwaszania produktu). Zdolność do wytwarzania związków aromatotwórczych i gazu w skrzepie nie jest cechą oczekiwaną w przypadku kultur stosowanych przy produkcji twarogu typu cottage cheese (serek ziarnisty). Kultury starterowe stosowane do produkcji różnych typów serów twarogowych różnią się między sobą składem mikroflory, zarówno pod względem przynależności rodzajowej, jak i gatunkowej (tabela II). Najmniej zróżnicowany skład mają kultury stosowane do produkcji twarogu ziarnistego. Kultury te zawierają homofermentatywne paciorkowce Lactococcus lac­ tis subsp. lactis i L. lactis subsp. cremoris, o wysokiej dynamice produkcji kwasu mlekowego, sporadycznie wspomagane dodatkiem Streptococcus thermophilus głównie w celu zwiększenia oporności fagowej. Skład kultur wykorzystywanych przy produkcji serów twarogowych kwasowych i kwasowo-enzymatycznych jest bardziej zróżnicowany, gdyż poza homofermentatywnymi paciorkowcami mlekowymi zawierają one również szczepy z gatunku L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i L. mesenteroides subsp. mesenteroides zdolne do fermentacji cytrynianów. Funkcją paciorkowców mlekowych fermentujących cytryniany jest wytwarzanie CO2 oraz związków odpowiadających za kształtowanie cech smakowo-zapachowych twarogów [25, 55]. 4. Kultury starterowe w produkcji twarogu kwasowego Oryginalność technologii produkcji twarogu kwa­sowego polega na otrzymaniu skrzepu z mleka w wyniku sterowanego procesu fermentacji, prowadzonego głównie przez mezofilne paciorkowce mlekowe wprowadzone w postaci kultur starterowych, bez udziału enzymów koagulujących i innych dodatków, a następnie poddaniu go obróbce obejmującej krojenie, dogrzewanie i osuszanie. Podczas obróbki ziarno KULTURY STARTEROWE DO PRODUKCJI TWAROGÓW KWASOWYCH – ROLA I OCZEKIWANIA Tabela III Handlowe kultury startowe przeznaczone do produkcji twarogu kwasowego Producent Nazwa handlowa Danisco/DuPont PROBAT 322; PROBAT 505; PROBAT 801; PROBAT 802, Probat 222 Chr. Hansen FLORA DANICA; CHN 11; CHN 19; CHN 22; XT 302; XT 303; XT 601; XT 602; XT 603; XC-X16 CSK Food Enrichment G 500; G 600; G 700; G1000 twarogowe musi utrzymywać się na powierzchni lub tuż pod powierzchnią serwatki, co gwarantuje uzyskanie produktu o prawidłowej strukturze i konsystencji [43]. Atrakcyjność sensoryczna twarogu stanowi wypadkową jakości mleka, przebiegu procesu produkcyjnego oraz właściwości stosowanych kultur starterowych. Utrzymanie wzrostu popytu na twaróg kwasowy jest możliwe poprzez zwiększenie jego atrakcyjności w zakresie cech organoleptycznych, trwałości, opakowania oraz optymalizacji kosztów produkcji. Podążając za tymi wymaganiami coraz więcej zakładów mleczarskich udoskonala technikę i technologię produkcji twarogu kwasowego [43]. W procesie tym doceniana jest również rola kultur starterowych, których koszt stanowi zaledwie od 0,5 do 1,5% wartości przerabianego mleka, ale pomimo to niemal że w równym stopniu z nim decydują o końcowej jakości otrzymywanego twarogu. Firmy biotechnologiczne oferują zakładom mle­ czarskim wiele kultur starterowych do produkcji twarogów kwasowych (tabela III). W kulturach tych homofermentatywne mezofilne paciorkowce mlekowe Lactococcus lactis subsp lactis i L. lactis subsp. cremo­ ris, stanowią od 50 do 85% składu bakterii, natomiast homofermentatywne Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis i heterofermentatywne L. mesenteroides subsp. cremoris i L. mesenteroides subsp. mesenteroides od 15 do 50%. Udział bakterii z rodzaju Leuconostoc nie przekracza z reguły 10% ogólnej populacji kultury. Niektóre handlowe kultury do produkcji twarogu nie zawierają w ogóle w swoim składzie szczepów należących do rodzaju Leuconostoc (np. kultury G500, G600, G700 firmy CSK). Kultury do twarogu kwasowego 291 zawierające Streptococcus thermophilus mają marginalny udział w rynku. Do produkcji twarogów kwasowych stosowane są zwykle kultury wieloszczepowe składające się z od kilkunastu do kilkudziesięciu szczepów o zdefiniowanym lub niezdefiniowanym składzie. W kulturach o zdefiniowanym składzie każdy gatunek bakterii reprezentowany jest przez kilka szczepów różniących się powinowactwem fagowym. Wrażliwość szczepów na częstotliwość i konsekwencje infekcji fagowych jest z reguły monitorowana przez producenta kultur we współpracy z zakładami mleczarskimi. W przypadku wysokiej częstotliwości infekcji fagowych danego szczepu w kulturze jest on zastępowany szczepem niewrażliwym. Takie podejście pozwala w sposób kontrolowany utrzymywać wysoką oporność i jakość kultur, bez konieczności zmiany ich nazwy. W odróżnieniu od wielu innych produktów mleczarskich w produkcji twarogu wciąż dużą popularnością cieszą się kultury o niezdefiniowanym składzie np. Flora Danica (Chr. Hansen), Probat 505 (Danisco/DuPont). Zasada komponowania tego typu kultur polega na wielokrotnym pasażowaniu w mleku często nawet kilkuset szczepów należących do różnych gatunków do momentu wytworzenia trwałych pożądanych w produkcji twarogu proporcji między poszczególnymi gatunkami. W konsekwencji końcowy skład kultury jest nieznany. Należy jednak pamiętać, że zarówno do komponowania kultur zdefiniowanych jak i niezdefiniowanych wybierane są szczepy o pożądanych cechach sensorycznych i technologicznych oraz braku wzajemnego antagonizmu. Kultury niezdefiniowane, z uwagi na ogromną liczbę szczepów, nawet w momencie dużego zagrożenia fagowego, pozwalają na wyprodukowanie twarogu o jakości akceptowalnej przez konsumenta. W zależności od doboru proporcji w kulturze starterowej pomiędzy poszczególnymi gatunkami, a w obrębie gatunków szczepami bakterii fermentacji mlekowej istnieje możliwość sterowania w pewnym zakresie procesem technologicznym i kształtowania jakości twarogu. Wynika to z określonej roli technologicznej jaką spełniają poszczególne bakterie wchodzące w skład kultur starterowych do produkcji twarogu kwasowego (tabela IV). Wielkością udziału oraz odpowiednim Tabela IV Rola technologiczna poszczególnych bakterii wchodzących w skład kultur startowych do produkcji twarogu kwasowego [43] Bakterie kwasu mlekowego Rola w procesie produkcji twarogu Lactococcus lactis subsp. lactis Ukwaszanie mleka celem koagulacji Lactococcus lactis subsp. cremoris Ukwaszanie mleka celem koagulacji, uzyskanie skrzepu o odpowiedniej strukturze i konsystencji Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Synteza związków kształtujących cechy smakowo-zapachowe, wytwarzanie CO2 Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Synteza związków kształtujących cechy smakowo-zapachowe, redukcja aldehydu octowego do etanolu, wytwarzanie CO2 292 J. ŻYLIŃSKA, K. SIEMIANOWSKI, K. BOHDZIEWICZ, K. PAWLIKOWSKA, P. KOŁAKOWSKI, J. SZPENDOWSKI, J. BARDOWSKI Rys. 1. Krzywe ukwaszania mleka przez wybrane szczepy Lactococcus lactis doborem szczepów paciorkowców Lactococcus lac­ tis subsp. lactis i L. lactis subsp. cremoris w kulturze można regulować czas ukwaszania mleka (rys. 1). Do konstrukcji kultur twarogowych selekcjonuje się szczepy L. lactis o wysokiej i średniej dynamice ukwaszania, krótkiej fazie adaptacji w mleku, zdolności do wzrostu w dość szerokim zakresie temperatur (od 22 do 32°C) oraz minimalnej aktywności kwaszącej po osiągnięciu pH odpowiadającego punktowi izoelektrycznemu białek kazeinowych [43]. Aktualnie na rynku jest dostępny asortyment kultur do produkcji twarogu zdolnych do fermentacji mleka w szerokim zakresie czasowym w zależności od stosowanej w zakładzie technologii i organizacji pracy. Bardzo trudnym wyzwaniem jest uzyskanie kultur o wysokiej dynamice ukwaszania mleka przy jednoczesnym wytworzeniu dostatecznej ilości CO2 i związków aromatotwórczych, których nagromadzenie w mleku wymaga stosunkowo długiego czasu fermentacji. Aktualnie granicą maksymalnego kompromisu są kultury do twarogu o czasie fermentacji mleka w granicach 9–10 godzin w temperaturze 29–30°C. Za charakterystyczne cechy sensoryczne twarogu odpowiadają związki aromatotwórcze, syntetyzowane głównie przez szczepy L. lactis subsp. lactis biovar diace­ tylactis oraz w mniejszym stopniu Leuconostoc mesente­ roides [25, 43, 57]. Brak aromatu jest częstym defektem twarogów. Podstawowym składnikiem aromatu twarogu jest diacetyl, a największą akceptacją konsumentów cieszą się produkty zawierające 1–2 mg diacetylu/ kg [25]. Generalnie przyjmuje się, że szczepy L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis wytwarzają podczas namnażania w mleku do 10 mg diacetylu/l, natomiast Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris do ok. 5 mg diacetylu/l. Maksymalną zawartość diacetylu stwierdza się po 14–16 godzinach inkubacji w temperaturze 20–25°C, która jest optymalna dla syntezy tego związku [25, 43]. Wytworzony diacetyl nie pozostaje jednak długo w środowisku i po 2–3 godzinach jego zawartość ulega zmniejszeniu w wyniku reakcji rozkładu katalizowanej przez reduktazę diacetylu do bezwonnej acetoiny, a w kolejnym etapie do 2,3-butandiolu [24]. Dlatego też stosowane w produkcji twarogu kwasowego szczepy powinny charakteryzować się niską aktywnoś­ cią biosyntezy reduktazy diacetylu. Końcowa koncentracja diacetylu zależy również w dużym stopniu m.in. od jakości mikrobiologicznej mleka, zawartości cytrynianu, będącego jego prekursorem i szybkości ukwaszania. Mleko zawiera średnio 0,2% cytrynianu, jednakże w zależności od pory roku, zanieczyszczeń mikrobiologicznych i sposobu żywienia krów jego zawartość waha się w bardzo szerokich granicach od 0,04 do 0,4%. Stwierdzono, że wzrost zawartości cytrynianu w mleku z 0,19 do 0,5% powoduje zwiększenie produkcji diacetylu od 58 do 74%, zależnie od szczepu i nie wpływa na dynamikę produkcji kwasu mlekowego [25]. Ilość cytrynianu w mleku można zwiększyć poprzez jego bezpośredni dodatek wraz z kulturą starterową lub poprzez dodatek cytrynianów do mleka. Przykładowo w Afryce w celu poprawy cech organoleptycznych niektórych produktów mleczarskich do mleka przerobowego dodawany jest kwas cytrynowy lub sok z cytryny. Metabolizm cytrynianu do diacetylu zachodzi przy udziale permeazy cytrynianowej, która zarówno w przypadku szczepów L. lactis jak i Leuconostoc spp. wykazuje najwyższą aktywność przy pH 5,5–6,0 [48]. Poniżej pH 5 aktywność permeazy jest bardzo spowolniona [18]. Dlatego też wolniejsze ukwaszanie mleka w procesie produkcji twarogu sprzyja pobieraniu cytrynianu ze środowiska, a przez to produkcji większej ilości diacetylu. Rolą permeazy jest transport cytrynianu do wnętrza komórki. Enzym ten kodowany jest przez gen citP zlokalizowany na plazmidach. Stwierdzono, że inkubacja mleka w temperaturze równej 28°C i wyższej znacznie zmniejsza ilość diacetylu głównie w wyniku jego przyspieszonej redukcji. Na poziom diacetylu wytworzonego w procesie produkcji twarogu wpływają też zanieczyszczenia mikrobiologiczne. Wyjątkowo silne właściwości redukcji diacetylu posiadają bakterie z rodzaju Pseudomonas i bakterie z grupy coli. Istotnym składnikiem aromatu twarogu jest aldehyd octowy, którego obecność w niewielkim stężeniu wpływa pozytywnie na cechy sensoryczne twarogu, ale z kolei jego nadmiar jest bardzo niepożądany. W stężeniu powyżej 1 mg/kg nadaje on twarogom posmak określany jako „trawiasty” („green flavour”). Prawidłowe cechy organoleptyczne twarogu uzyskuje się, gdy stężenie aldehydu octowego jest około czterokrotnie niższe niż diacetylu [27]. Najwyższą zdolnością produkcji aldehydu octowego w produkcji twarogu charakteryzują się bakterie Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis, w mniejszym stopniu L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris i Leuconostoc spp. 293 KULTURY STARTEROWE DO PRODUKCJI TWAROGÓW KWASOWYCH – ROLA I OCZEKIWANIA [26, 28]. Zawartość aldehydu octowego ulega obniżeniu w wyniku przemiany głównie do etanolu i octanu. Wysoką aktywnością utylizacji aldehydu octowego charakteryzują się bakterie z rodzaju Leuconostoc [28, 20]. Tak więc zdaniem autorów w kulturze do produkcji twarogu celowym jest udział tych bakterii nie tylko z uwagi na zdolność wytwarzania dużych ilości CO2 i produkcji diacetylu. Należy jednak zaznaczyć, że szczepy zarówno z gatunku Leuconostoc mesenteroides jak i podgatunku L. lactis subsp. lactis var. diacetylactis charakteryzują się bardzo wolną dynamiką ukwaszania mleka i nie odgrywają znaczącej roli w produkcji kwasu mlekowego w procesie wyrobu twarogów kwasowych. Szczepy L. lactis subsp. cremoris decydują o zwięz­ łości i strukturze skrzepu ukwaszonego mleka, a w konsekwencji o wydatku twarogu. Odgrywają one szczególnie ważna rolę w produkcji twarogów samoprasowanych. W produkcji fermentowanych napojów mlecznych od bakterii L. lactis subsp. cremoris oczekuje się dobrego wiązania wody w skrzepie i minimalizacji synerezy w trakcie ich chłodniczego przechowywania. Natomiast w produkcji twarogu kwasowego pożądane są szczepy o średnich i wysokich uzdolnieniach do uwalniania wody ze skrzepu podczas jego obróbki. Producenci twarogu kwasowego oczekują kultur o bardzo niskiej aktywności metabolicznej w warunkach chłodniczych. Aktywność bakterii mlekowych (ukwaszanie i proteo­ liza) w procesie przechowywania twarogów w istotny sposób limituje ich termin przydatności do spożycia. Do produkcji twarogu stosowane są kultury skoncentrowane tzn. zawierające w jednym gramie minimum 1 × 1010 jtk (jednostki tworzące kolonie). W produkcji twarogu stosowane są kultury do bezpośredniego zaszczepiania mleka przerobowego DVI (Direct Vat Inoculation) i kultury BS (Bulk Starter) do pro­ dukcji zakwasu w zakładzie mleczarskim, który to zakwas następnie stosowany jest do inokulacji mleka przerobowego. Szacuje się, że około 80% twarogu w Polsce produkuje się przy użyciu kultur DVI. Kultury DVI produkowane są głównie w dwóch formach: liofilizowanej i głęboko mrożonej (w oparach ciekłego azotu tj. w temperaturze około –100°C), w formie granulatu (doskonalonej intensywnie w ostatnich dziesięciu latach). Formę mrożonego granulatu uzyskuje się nalewając płynną biomasę na sito, umieszczone nad oparami ciekłego azotu, o porowatości zapewniającej jej wypływ w postaci kropel. Przed połączeniem się krople ulegają natychmiastowemu zamrożeniu tworząc formę granulatu. W produkcji kultur BS oprócz wymienionych metod wciąż stosowane są kultury, które rozlane do opakowań jednostkowych są bezpośrednio mrożone w ciekłym azocie w temperaturze –196°C. Kultury bakterii mlekowych w formie mrożonego granulatu są stosowane znacznie częściej niż w formie liofilizowanej Rys. 2. Krzywe ukwaszania mleka przez kultury startowe w postaci mrożonej i liofilizowanej głównie z uwagi na szybszą około 20–30 minut fazę adaptacyjną (rys. 2) i związaną z tym optymalizację procesu ukwaszania i mniejsze ryzyko kontaminacji fagowej. Z reguły na tank zawierający 10 000 litrów mleka przerobowego dodaje się około 1 kg kultury mrożonej o koncentracji minimum 1010 jtk/g lub około 100 g kultury liofilizowanej o koncentracji minimum 5 × 1010 jtk/g tak aby na początku fermentacji uzyskać w mleku populację bakterii na poziomie nie niższym niż 106 jtk na ml [7]. Po uzyskaniu kwasowości czynnej na poziomie 32–34°SH (0,7–0,8% kwasu mlekowego), uzyskiwana gęstość w mleku fermentowanym przed krojeniem skrzepu koncentracja bakterii mlekowych wynosi z reguły powyżej 109 jtk/ml. Kultury starterowe stosowane w mleczarstwie muszą spełniać określone wymagania dotyczące zanieczyszczeń mikrobiologicznych (tab. V) [International Dairy Federation 149A, [7]. Tabela V Wymagania dotyczące zanieczyszczeń mikrobiologicznych kultur bakterii kwasu mlekowego dla przemysłu mleczarskiego zgodnie ze standardami IDF [International Dairy Federation 149A, Chr. Hansen Bulletin] Rodzaj zanieczyszczeń Forma kultur do bezpośredniego zaszczepiania mleka (DVI) Mrożone Liofilizowane jtk/g Bakterie z grupy coli < 1 < 10 Enterococcus < 10 < 10 Pleśnie < 1 < 10 < 500 < 500 Ogólna liczba bakterii niemlekowych Drożdże < 1 < 10 Staphylococcus aureus < 1 < 10 Salmonella nieobecne w 25 nieobecne w 25 Listeria nieobecne w 25 nieobecne w 25 294 J. ŻYLIŃSKA, K. SIEMIANOWSKI, K. BOHDZIEWICZ, K. PAWLIKOWSKA, P. KOŁAKOWSKI, J. SZPENDOWSKI, J. BARDOWSKI Wysokie wymogi dotyczące zanieczyszczeń mikrobiologicznych kultur starterowych zmuszają ich producentów do wprowadzania wysokich standardów higieny produkcji coraz bardziej zbliżonych do obowiązujących w firmach farmaceutycznych. Jakość kultur starterowych zapewnia w pełni bezpieczeństwo mikrobiologiczne produktów mleczarskich i nie stanowi krytycznego punktu kontrolnego w systemie HACCP w produkcji twarogów. Poza odpowiednim składem gatunkowym i szczepowym oraz niskim poziomem zanieczyszczeń mikrobiologicznych kolejną bardzo ważną cechą kultur startowych a w szczególności kultur do produkcji twarogu kwasowego jest ich bardzo wysoka oporność na bakteriofagi. 4.1. Oporność na bakteriofagi Bakteriofagi w skrócie fagi, są wirusami atakującymi bakterie i powszechnie bytują w środowisku naturalnym. Infekcje fagowe są niezwykle niebezpieczne dla stabilności procesów biotechnologicznych z wykorzystaniem bakterii, ponieważ mogą powodować ogromne straty ekonomiczne w zakładach przemysłowych [41]. W przemyśle mleczarskim potencjalnym źródłem fagów wirulentnych wobec starterowych bakterii kwasu mlekowego są mleko, mleko w proszku, preparaty białek serwatkowych, wyposażenie linii produkcyjnych, sprzęt laboratoryjny, powietrze, personel oraz kultury starterowe zawierające lizogenne szczepy (fag w formie utajonej; DNA fagowy wbudowany w chromosom bakterii) [30, 50]. Szacuje się, że około dwie trzecie mleka przerobowego jest poddawane fermentacji z udziałem bakterii mlekowych z gatunku Lactococcus lactis i Leuconostoc mesenteroides. Pozostała część jest fermentowana przez bakterie z gatunku Streptococcus thermophilus i rodzaju Lactobacillus. Według danych szacunkowych od 0,1 do 10% procesów fermentacyjnych w zakładach mleczarskich jest zakłócanych infekcjami fagowymi [35]. Wśród technologii mleczarskich najbardziej na infekcje fagowe narażona jest produkcja serów, a w szcze­ gólności serów twarogowych. W polskim przemyśle mleczarskim nawet 60–70% zaburzeń technologicznych w procesie produkcji serów twarogowych może być następstwem infekcji fagowych [22]. Główną przyczyną ich występowania jest brak obiektywnych możliwości całkowitej eliminacji fagów w przetwórstwie mleka, których pierwotnym źródłem jest samo mleko. W dobie postępującej globalizacji produkcji, pomimo stopniowej poprawy jakości surowca i higieny produkcji, problem kontaminacji fagami wskazuje tendencję wzrostową szczególnie w produkcji serów dojrzewających i serów twarogowych [33, 49]. Produkcja napojów fermentowanych (jogurt, kefir, maślanka itp.), w odróżnieniu od serów dojrzewających i serów twa- rogowych, prowadzona jest w zdecydowanie bardziej aseptycznych warunkach i z mleka poddanego często wysokiej obróbce termicznej. Mleko na sery dojrzewające i twarogi poddawane jest niskiej lub krótkotrwałej pasteryzacji, która nie zawsze prowadzi do całkowitej inaktywacji mikroflory mleka a w szczególności z reguły bardziej opornych na temperaturę niż bakterie bakteriofagów. Czas 10-krotnej redukcji fagów w temperaturze 75°C wynosi od 0,5 do 15,9 min. Infekcjom fagowym w produkcji twarogów sprzyja ponadto stosunkowo długi proces fermentacji mleka i obróbka skrzepu często prowadzona w otwartych wannach lub kotłach. Produktem ubocznym w produkcji twarogu jest serwatka, która jest bogatym źródłem starterowych bakterii mlekowych i ich wirulentnych fagów. Wzrost infekcji fagowych występuje też ze zwiększeniem wielkości przerobu mleka w zakładzie. Poza tym w produkcji twarogów kluczową rolę odgrywają bakterie starterowe z gatunku Lactococcus lactis, które wśród bakterii mlekowych obok Streptococcus thermophilus najczęś­ ciej ulegają infekcjom fagowym. Najmniej podatne na infekcje fagowe są bakterie z rodzaju Lactobacillus. Stosowane w mleczarstwie bakterie Lactococcus głównie ulegają infekcji przez trzy grupy bakteriofagów: 936, c2 i P335 [9, 34]. W technologii produkcji twarogów namnażanie się bakteriofagów może powodować: –zmniejszenie zdolności kultur do produkcji kwasu mlekowego (opóźnienie procesu ukwaszania), –rozwarstwienie skrzepu lub jego opadanie na dno wanny lub kotła co powoduje utrudnioną obróbkę, – zmniejszenie wydajności twarogu, –zwiększone ryzyko kontaminacji mikroflorą obcą, w tym również patogenną, –preferowanie rozwoju mikroflory pozostałej po pasteryzacji (z reguły szkodliwej technologicznie), – problemy z wydzielaniem serwatki (znaczne przedłużenie obróbki skrzepu), – utratę cech sensorycznych (brak aromatu) [22]. Nie należy również zapominać, że infekcje fagowe oprócz strat ekonomicznych wywołują również ujemne skutki u pracowników produkcyjnych takie jak: stres, obniżenie motywacji i zaangażowania, poczucie winy, wydłużone i nieregularne godziny pracy [50]. Wysiłki producentów kultur starterowych w mleczarstwie i zakładów przetwórstwa mleka zmierzają do utrzymywania fagów na poziomie gwarantującym bezpieczeństwo produkcji. Dotychczasowe sposoby walki z zakażeniami wirusowymi na poziomie zakładu produkcyjnego mają przede wszystkim charakter prewencyjny i zmierzają w kierunku coraz powszechniejszego stosowania kultur DVI bakterii mlekowych, rotacji fagowej kultur, kontroli mikrobiologicznej stosowanych surowców, mycia i dezynfekcji sprzętu oraz powierzchni produkcyjnych [23, 50]. Wysoka oporność fagowa kul- KULTURY STARTEROWE DO PRODUKCJI TWAROGÓW KWASOWYCH – ROLA I OCZEKIWANIA tur twarogowych jest jednym z najbardziej oczekiwanych najtrudniejszym do zrealizowania wyzwaniem dla producentów kultur mleczarskich. Zakłady mleczarskie dla bezpieczeństwa produkcji i jakości twarogu potrzebują co najmniej trzech kultur starterowych o identycznych cechach technologicznych, o wysokiej oporności fagowej, różniących się powinowactwem fagowym. Kultury te powinny być stosowane naprzemiennie w wypracowanym doświadczalnie systemie rotacyjnym uwzględniającym kolejność i okresy ich używania. Prace badawcze nad bakteriofagami głównie koncentrują się na poznaniu mechanizmów genetycznych zjadliwości fagów, stanowiących poważny problem w przemyśle mleczarskim [11, 49]. Duże nadzieje dla mleczarstwa upatruje się w odkrytym w 2007 roku u bakterii Streptococcus thermophilus obronnym systemie CRISP/Cas, który pozwala na sterowane nadawanie oporności fagowej bakteriom mlekowym [39]. U bakterii mlekowych występują również pozachromosomalne struktury zwane plazmidami, które odgrywają niezwykle istotną rolę w adaptacji do zmieniających się warunków środowiska. Wykazano, że plazmidowy DNA może kodować wiele cech, m.in.: zdolność do metabolizmu laktozy oraz innych disacharydów, metabolizm glukonianu, pentoz, biosyntezę bakteriocyn, oporność na antybiotyki i metale ciężkie, zdolność katabolizmu cytrynianu, mechanizmy oporności na bakteriofagi, aktywność dekstranosacharazy [8, 15]. Niektóre z tych cech mają istotne znaczenie technologiczne m.in. przy produkcji twarogu. Rozwój badań nad genetyką bakterii mlekowych pozwolił na uzyskanie danych, które umożliwiły poznanie szlaków przemian metabolicznych laktozy, enzymatycznej hydrolizy kazeiny, katabolizmu cytrynianu prowadzącego do wytworzenia związków zapachowych, wpływających na właściwości organoleptyczne produktu spożywczego czy też produkcji bakteriocyn, oraz mechanizmów oporności bakterii na bakteriofagi. W wyniku tych badań udało się ustalić mechanizmy regulacyjne, które kontrolują ekspresję genów zaangażowanych w te zjawiska [1, 31]. 4.2. Rola bakteriocyn Również produkcja bakteriocyn przez bakterie jest związana z obecnością plazmidów w komórkach. Bakteriocyny są to niskocząsteczkowe związki chemiczne zbudowane z prostych peptydów lub kompleksów polipeptydów, wykazujące właściwości antybakteryjne, zazwyczaj wobec gatunków blisko spokrewnionych z producentem [19] Produkowane są m.in. przez bakterie Gram-dodatnie, w tym bakterie mlekowe z rodzaju: Lactobacillus, Lactococcus i Leuconostoc. Synteza bakteriocyn zachodzi pod kontrolą genów zlokalizowanych na bakteryjnym chromosomie, na plazmidach lub na 295 transpozonach. Znacznie częściej operony bakteriocyn zlokalizowane są na plazmidach. Taka lokalizacja sprzyja wewnątrz- i międzygatunkowemu rozprzestrzenianiu się genów, kodujących bakteriocyny wśród bakterii fermentacji mlekowej. Produkcja bakteriocyn z jednej strony utrudnia konstruowanie kultur starterowych, ponieważ może dochodzić do wzajemnej inhibicji szczepów w obrębie kultur mieszanych. Z drugiej strony bakteriocyny mogą odgrywać niezmiernie pożądaną rolę w hamowaniu rozwoju mikroflory niepożądanej technologicznie i patogennej w procesie produkcji twarogu. 4.3. Aktywność proteolityczna i lipolityczna Umiarkowana aktywność proteolityczna i lipolityczna bakterii starterowych skutkuje wysoką wydajnością twarogu, poprzez obniżenie stopnia retencji białka i tłuszczu do serwatki, i zapobieganiem zmianom smakowym w produkcie w procesie przechowywania. Do produkcji twarogu powinny być selekcjonowane szczepy bakterii mlekowych o bardzo niskiej aktyw­ ności proteolitycznej. Wysoka aktywność proteolityczna szczepów powoduje zmniejszony wydatek twarogu, związany z nadmiernym uwalnianiem białka do serwatki oraz może powodować niepożądane zmiany organoleptyczne twarogu np. gorzki smak, wyczuwalną proteolizę pod koniec okresu przydatności do spożycia. Bakterie mlekowe stosowane do produkcji twarogu z rodzaju Lactococcus i Leuconostoc z natury charakteryzują się bardzo ograniczona aktywnością lipolityczną, dlatego też przy badaniach przesiewowych szczepów nie bada się z reguły ich aktywności lipolitycznej. 4.4. Produkcja zewnątrzkomórkowych polisacharydów (EPS) Niektóre szczepy bakterii kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus, Streptococcus i Lactoccoccus mają zdolność do biosyntezy zewnątrzkomórkowych polisacharydów. Polimery te lub szczepy je produkujące można wykorzystywać, jako naturalne zagęstniki produktów przemysłu mleczarskiego poprawiające ich cechy organoleptyczne, zwiększające lepkość i zabezpieczające produkt przed zjawiskiem synerezy. Niektóre polisacharydy mogą pozytywnie oddziaływać na zdrowie, ponieważ posiadają właściwości probiotyczne i antynowotworowe [14, 37]. Najważniejszą jednak funkcją, z punktu widzenia konsumenta, jest ich rola w tworzeniu cech organoleptycznych produktów mleczarskich. W mleczarstwie znalazły przede wszystkim zastosowanie szczepy bakterii mlekowych produkujące EPS o wysokiej lepkości, krótkiej strukturze i odporności na niskie pH. Ponadto EPS powinny charakteryzować się wysoką stabilnością na siły ścinające, 296 J. ŻYLIŃSKA, K. SIEMIANOWSKI, K. BOHDZIEWICZ, K. PAWLIKOWSKA, P. KOŁAKOWSKI, J. SZPENDOWSKI, J. BARDOWSKI którym poddawane jest mleko fermentowane w procesie jego obróbki (krojenie i ogrzewanie skrzepu w przypadku serów lub wychładzania, pakowania i transportu w przypadku napojów fermentowanych). Ważną pożądaną cechą EPS powinna być też ich maksymalna zdolność do odbudowy zniszczonej struktury w wyniku stosowanych procesów w mleczarstwie. W produkcji twarogu kwasowego mogą znaleźć zastosowanie szczepy z rodzaju Lactococcus lub S. thermo­ philus produkujące EPS do zwiększenia retencji białek serwatkowych w skrzepie a tym samym wydatku twarogu oraz podwyższenia zawartości wody w twarogu i poprawę jego zwięzłości. Zauważono, że egzopolisacharydy o ładunku neutralnym zbyt słabo oddziaływują z kazeiną. Dlatego też należy mieć na uwadze obecność lub brak ładunku syntetyzowanych egzopolisacharydów (EPS), poziom otrzymanego zakwaszenia i interakcje z innymi szczepami podczas selekcji szczepów starterowych do produkcji serów twarogowych. Istotny wpływ na właściwości EPS ma różnorodność komponentów, ich przestrzenny układ i ładunek. Egzopolisacharydy o ładunku neutralnym polepszają lepkość, ale nie elastyczność, w przypadku zaś EPS naładowanych ujemnie mamy do czynienia ze współdziałaniem z ładunkiem dodatnim kazeiny. Wszystkie wymienione cechy takie jak elastyczność i lepkość mogą zmieniać się w zależności od struktury i obec­ ności EPS. Na uzyskanie odpowiedniej lepkości ma wpływ nie ilość egzopolisacharydów, ale właśnie ich struktura. Rożne rodzaje bakterii kwasu mlekowego syntetyzują swoiste EPS, dzięki temu istnieje szeroka gama struktur tych biopolimerów, które determinują właściwości EPS a tym samym ewentualne zastosowanie. [42].Wiadomo, że egzopolisacharydy o wysokiej masie cząsteczkowej odznaczają się wyższa lepkością. W przypadku niskiej masy molekularnej oznaczają się gorszą lepkością, ale obserwacje wskazują również, że krótsze polisacharydy są w stanie lepiej wchodzić w interakcje z białkami, co dalej prowadzi do wzrostu stabilności mieszaniny białko-EPS. 5. Podsumowanie Sery twarogowe, a w szczególności twarogi kwasowe są charakterystyczne dla asortymentu wyrobów mleczarskich w niektórych krajach Europy Środkowej i Wschodniej. Sery twarogowe w żywieniu człowieka są źródłem pełnowartościowego białka, lekkostrawnego tłuszczu, witamin z grupy B oraz składników mineralnych. Spożycie serów twarogowych w Polsce przekracza wyraźnie konsumpcję serów dojrzewających i topionych. Do produkcji twarogu kwasowego konieczne są tylko dwa składniki: mleko i kultury starterowe bak­terii mlekowych. Kultury starterowe determinują w znaczącym stopniu przebieg procesu technologicznego, jakość uzyskanego twarogu i termin jego przydatności do spożycia. W składzie kultur do twarogu kwasowego decydującą rolę odgrywają bakterie z rodzaju Lactococ­ cus i Leuconostoc. Podstawowymi charakterystycznymi wyróżnikami kultur do produkcji twarogu kwasowego, w stosunku do innych kultur konstruowanych w oparciu o bakterie mlekowego z rodzaju Lactococcus i Leuco­ nostoc (np. do napojów fermentowanych), jest ich: bardzo wysoka oporność i zróżnicowane powinowactwo fagowe; zdolność do tworzenia skrzepu podatnego na wydzielanie serwatki i obkurczanie się (synerezę); wysokiej aktywności wytwarzania związków kształtujących aromat (głównie diacetylu); odpowiedniej zdolności gazowania przez produkcję CO2, zapewniającego utrzymanie ziarna na lub tuż pod powierzchnią serwatki podczas dogrzewania i mieszania skrzepu. Z kolei cechami wspólnymi kultur do produkcji napojów fermentowanych i twarogów kwasowych konstruowanych w oparciu o szczepy z rodzaju Lactococcus i Leucono­ stoc jest: zapewnienie stabilnej kwasowości skrzepu w zakresie pH 4,60–4,45; umiarkowane uzdolnienia proteolityczne i lipolityczne; uzyskanie czasu ukwaszania mleka w granicach 10–16 godzin; antagonistyczne właściwości do mikroflory szkodliwej technologicznie; mała wrażliwość na zmiany składu fizykochemicznego mleka i ograniczone uzdolnienia fermentacyjne w warunkach chłodniczego przechowywania produktów. Dodatkowymi oczekiwaniami producentów twarogu kwasowego wobec kultur jest zwiększenie jego wydatku poprzez ograniczenie przemieszczania składników mleka do serwatki między innymi poprzez zastosowanie szczepów produkujących EPS. Reasumując, selekcja szczepów, a następnie konstruo­wanie kultur o zbalansowanym gatunkowo i stabilnym składzie w procesie wyrobu twarogów kwasowych jest wciąż bardzo złożonym i trudnym wyzwaniem dla producentów kultur mleczarskich. Prace powstała dzięki udziałowi i finansowaniu grantów Narodowego Centrum Nauki NN 312 351539 oraz NN 312 688540 Piśmiennictwo 1.Aleksandrzak-Piekarczyk T., Polak J., Jezierska B., Renault P., Bardowski J.: Genetic characterization of the CcpA-dependent, cellobiose-specific PTS system comprising CelB, PtcB and PtcA that transports lactose in Lactococcus lactis IL1403. Int. J. Food Microbiol. 145, 186–194 (2011) 2. Badel S., Benardi T., Michaud P.,. New perspectives for Lacto­­bacilli exopolisacharides. Biotechnology Advances, 29, 54–66. (2011) 3. Bednarski W.: Doskonalenie technologii oraz organizacji przetwarzania serwatki w Polsce. Przem. Spoż. 2, 32–34 i 44 (2001) KULTURY STARTEROWE DO PRODUKCJI TWAROGÓW KWASOWYCH – ROLA I OCZEKIWANIA 4. Bohdziewicz K.: Twaróg – pierwszy świeży ser świata. Przegl. Mlecz. 2, 4–8 (2009) 5. Bohdziewicz K.: Wpływ transglutaminazy na proces produkcji, wydatek oraz jakość twarogów. Przegl. Mlecz. 2, 4–9 (2010) 6. Bohdziewicz K., Śmietana Z.: Twarogi – teraźniejszość i przyszłość. Kalejdoskop Mlecz. 2, 32–35 (2007) 7. Chr. Hansen Bulletin: Product range: Dairy cultures and enzymes, Copenhagen, Denmark, 2007 8.Davidson B.E., Kordias N., Dobos M., Hillier A.J.: Genomic organization of lactic acid bacteria. Antonie Leeuwenhoek, 70, 161–183 (1996) 9. Deveau H., Labrie S.J., Chopin M.C., Moineau S.: Biodiversity and classification of lactococcal phages. Appl. Environment. Microbiol. 72, 4338–4346 (2006) 10. Drider D, Bekal S, Prévost H.: Genetic organization and expression of citrate permease in lactic acid bacteria. Genet. Mol. Res. 3, 273–281 (2004) 11. Durmaz E., Klaenhammer T.R.: Genetic analysis of chromosomal regions of Lactococcus lactis acquired by recombinant lytic phages. Appl. Environment. Microbiol. 66, 895–903 (2000) 12. Galle S., Schwab C., Anrendt E.K., Ganzle M.G.: Structural and rheological characterization of heteropolysaccharides produced by lactic acid bacteria in wheat and sorghum sourdough. Food Microbiology, 28, 547–553 (2011) 13. Garcı’a-Quinta’ns N., Magni C., de Mendoza, D., Lo’pez P.: The citrate transport system of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis is induced by acid stress. Appl. Environment. Microbiol. 64, 850–857 (1998) 14.Gibson G.R., Robertfroid M.B.: Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutrition, 124, 1401–1412 (1995) 15. Górecki R.K., Koryszewska-Bagińska A., Gołębiewski M., Żylińska J., Grynberg,M., Bardowski J.K.: Adaptative potential of the Lactococcus lactis IL594 strain encoded in its 7 plasmids. PLoS ONE, 6, 1–12 (2011) 16. Górska-Warsewicz H.: Rozwój rynku produktów mleczarskich. Przem. Spoż. 10, 20–23 (2005) 17. Holanowski A.: Twarogi i serki twarogowe. Wyd. Spółdzielcze, Warszawa, 1986 18. Hugenholtz J.: Citrate metabolizm in lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 12, 165–178 (1993) 19.Hugenholtz J., Perdon L., Abee T.: Growth and energy generation by Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylac­ tis during citrate metabolism. Appl. Environ. Microbiol. 59, 4216–4222 (1993) 20. Keenan T.W., Lindsay R.C., Day E.A.: Acetaldehyde utilization by Leuconostoc species. Appl. Microbiol. 14, 802–806 (1966) 21. Kłobukowski J., Cichon R.: Wartość odżywcza wybranych produktów mleczarskich. Część I. Wartość odżywcza twarogów. Przem. Spoż. 12, 26–29 (1999) 22.Kołakowski P., Rybka J.: Przyczyny występowania zaburzeń procesów fermentacyjnych (Sposób zapobiegania infekcjom fagowym w przemyśle mleczarskim). Biul. Inform. Rhodia Food Biolacta, 25, 8–11 (2001) 23. Kołakowski P., Rybka J., Fetliński A.: Przyczyny występowania zaburzeń procesów fermentacyjnych (Bakteriofagi w prze­myśle mleczarskim). Biul. Inform. Rhodia Food Biolacta, 24, 7–8, 13–14 (2001) 24. Levata-Jovanovic M., Sandine W.E.: Citrate utlisation and diacetyl production by various strains of Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris. J. Dairy Sci. 79, 1928–1931 (1996) 25. Libudzisz Z.: Tworzenie związków aromatu przez bakterie fermentacji mlekowej Bakterie fermentacji mlekowej – klasyfikacja, metabolizm, genetyka, wykorzystanie, Wyd. Politechniki Łódzkiej, 1998, s. 110–122 297 26. Libudzisz Z., Piątkiewicz A., Oberman H., Lubnauer M.: Hetero­ geneity of the physiological activity of Lactococcus and Leuco­ nostoc spp. strains. Acta Microbiol. Pol. 42, 181–192 (1993) 27. Lindsay R.C., Day E.A., Sandine W.E.: Green flavor defect in lactic starter cultures. J. Dairy Sci. 48, 863–869 (1965) 28. Liu S.Q., Asmundson R.V., Holland R., Crow V.L.: Acetaldehyde metabolism by Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris under stress conditions. Int. Dairy J. 7, 175–183 (1997) 29. Looijesteijn P.J., Trapet L., de Vries E., Abee T., Hugenholtz J.: Physiological function of exopolysaccharides produced by Lac­ tococcus lactis. Int. J. Food Microbiol. 64, 71–80 (2001) 30. Madera C., Monjardin C., Suarez J.E.: Milk contamination and resistance to processing conditions determine the fate of Lacto­ coccus lactis bacteriophages in dairies. Appl. Environ. Microbiol. 70, 7365–7371 (2004) 31. Mahr K., Hillen W., Titgemeyer H.: Carbon catabolite repression in Lactobacillus pentosus: analysis of the CcpA region. Appl. Environ. Microbiol. 66, 277–283 (2000) 32. Marshall K.: Therapeutic application of whey protein. Altern. Med. Rev. 9, 136–156 (2004) 33.McIntyre K., Heap H.A., Davey G.P., Limsowtin G.K.Y.: The distribution of lactococcal bacteriophage in the environment of a cheese manufacturing plant. Int. Dairy J. 1, 183–197 (1991) 34. Moineau S., Fortier J., Ackermann H.W., Pandian S.: Characterization of lactococcal bacteriophages from Quebec cheese plants. Can. J. Microbiol. 38, 875–882 (1992) 35. Moineau S., Levesque C.: Control of bacteriophages in industrial fermentations Bacteriophages: Biology and Applications, Eds Kutter E., Sulakvelidze A., Boca Raton, USA: CRC Press, 285–296 (2005) 36. Obrusiewicz T.: Technologia mleczarstwa. Cz. 2. Wyd. Szkolne i Pedagogiczne, Warszawa, 1995 37. Oda M., Hasegawa H., Komatsu S., Kambe M., Tsuchiya F.: Antitumor polysaccharide from Lactobacillus sp. Agric. Biol. Chem. 47, 1623–1625 (1983) 38. Oziemkowski P., Cais-Sokolińska D.: Kwas mlekowy w wybranych technologiach mleczarskich. Przegl. Mlecz. 11, 276–279 (1994) 39. Plech M., Kołakowski P.: CRISPR/Cas – naturalny mechanizm obrony LAB przed fagami. Przem. Spoż. 66, 38–41 (2012) 40. Mleko i przetwory mleczarskie. Sery twarogowe niedojrzewające. PN-91/A-86300 41. Rasolofo E.A., St-Gelais D., LaPointe G., Roy D.: Molecular analysis of bacterial population structure and dynamics during cold storage of untreated and treated milk. Int. J. Food Microbiol. 138, 108–118 (2010) 42. Ruas-Madiedo P., Hugenholtz J., Zoon P.: An overview of the functionality of the exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria; Int. Dairy J. 12, 163–171(2002) 43.Rybka J., Kołakowski P., Fetliński A.: Wymagania dla kultur starterowych do produkcji tradycyjnego twarogu kwasowego. Biul. Inform. Rhodia Food Biolacta, 20, 3–6 (2000) 44. Rymaszewski J., Śmietana Z.: Sery dojrzewające i sery twarogowe (w) Mleczarstwo – zagadnienia wybrane. Tom 2, red. S. Ziajka, Wyd. ART, Olsztyn, 1997, s. 151–209 45. Seremak-Bulge J.: Przetwórstwo mleka. Rynek Mleka: stan i per­ spektywy, 41, 10–12 (2011) 46. Smithers G.W.: Whey and whey proteins-from‚ gutter-to-gold’. Int. Dairy J. 18, 695–704 (2008) 47. Smoleński Z., Zdziarska T.: Przetwórstwo mleka. Rynek Mleka: Stan i perspektywy, 37, 9–11 (2009) 48.Starrenburg M.J.C., Hugenholtz, J.: Citrate fermentation by Lactococcus and Leuconostoc spp. Appl. Environ. Microbiol. 57, 3535–3539 (1991) 298 J. ŻYLIŃSKA, K. SIEMIANOWSKI, K. BOHDZIEWICZ, K. PAWLIKOWSKA, P. KOŁAKOWSKI, J. SZPENDOWSKI, J. BARDOWSKI 49. Szczepańska A.K., Hejnowicz M.S., Kołakowski P., Bardowski J.: Biodiversity of Lactococcus lactis bacteriophages in Polish dairy environment. Acta Biochim. Pol. 54,151–158 (2007) 50.Szczepankowska A.K., Górecki R.K., Kołakowski P., Bardowski J.: Lactic acid bacteria resistance to bacteriophage and prevention techniques to lower phage contamination in dairy fermentation (w) Lactic Acid Bacteria – R&D for Food, Health and Livestock Purposes, ed. Marcelino Kongo, ISBN 978-953-51-0955-6, 2, 23–72 (2013) (http://dx.doi.org/ 10.5772/51541). 51.Szpendowski J., Śmietana Z., Płodzień T., Lewandowski K., Owczarzak A., Buczma E.: Technologia serów twarogowych o podwyższonej wartości odżywczej. Przegl. Mlecz. 1, 4–9 (2007) 52.Śmietana Z., Derengiewicz W., Jankowski A., Wojdyński T.: Nowa technika i technologia produkcji twarogów. Przegl. Mlecz. 9, 288–292 (1998) 53. Śmietana Z., Szpendowski J., Bohdziewicz K., Świgoń J.: Ogólne zasady produkcji twarogów i serków twarogowych. Część I. Metoda tradycyjna. Przegl. Mlecz. 1, 7–9 (1994) 54.Świetlik K.: Spożycie mleka i jego przetworów. Rynek Mleka: Stan i perspektywy, 41, 13–15 (2011) 55. Usajewicz I.: Mikrobiologia mleka i jego przetworów (w) Mleczarstwo. Tom 1, red. S. Ziajka, Wyd. UWM, Olsztyn, 2008, s. 152–204 56. Welman A.D., Maddox I.S.: Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges; Trends in Biotechnol. 21, 269–274 (2003) 57. Walsh B., Cogan T.M.: Diacetyl, acetoin, and acetaldehyde production by mixed-species lactic starter cultures. Appl. Microbiol. 26, 820–825 (1973) 58.Żelazna K., Popielarska A.: Mleko i produkty mleczarskie w żywieniu człowieka. Przem. Spoż. 10, 26–31 (2003) SPIS TREŚCI Profesor dr habilitowany Marek Niemiałtowski 1945–2014 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. M i s i e w i c z, S. W r ó b l e w s k a - K a b b a – Ewolucja adaptatywna genomów drożdży z grupy Saccharomyces cerevisiae sensu stricto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. S z c z u k a, A. K a z n o w s k i – Zróżnicowanie kaset SCCmec u metyloopornych gronkowców koagulazo-ujemnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. S t a n i s z e w s k a, M. B o n d a r y k, M. K o w a l s k a, U. M a g d a, M. Ł u k a, Z. O c h a l, W. K u r z ą t k o w s k i – Patogeneza i leczenie zakażeń Candida spp. . . . . . . . Z. B a k u ł a, A. S a f i a n o w s k a, M. N o w a c k a - M a z u r e k, J. B i e l e c k i, T. J a g i e l s k i – Mycobacterium kansasii: biologia patogenu oraz cechy kliniczne i epidemiologiczne zakażeń . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. M a r k o w s k a - Z a g r a j e k, M. R ó w n i c k i , J . T r y l s k a – Hamowanie wzrostu bakterii przez peptydowe kwasy nukleinowe i ich potencjalna rola w biotechnologii . . . . . . . O. Z a j ą c, A. E. L a u d y, S. T y s k i – Biofilm, pompy MDR i inne mechanizmy oporności Stenotrophomonas maltophilia na związki przeciwbakteryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K. P. G r e g o r c z y k, Z. W y ż e w s k i, L. S z u l c - D ą b r o w s k a, J. S t r u z i k, J. S z c z e p a n o w s k a, M. N i e m i a ł t o w s k i – Rola mitochondriów w odporności przeciwwirusowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Ż y l i ń s k a, K. S i e m i a n o w s k i, K. B o h d z i e w i c z, K. P a w l i k o w s k a, P. K o ł a k o w s k i, J. S z p e n d o w s k i, J. B a r d o w s k i – Kultury starterowe do produkcji twarogów kwasowych – rola i oczekiwania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 211 223 229 241 255 264 277 288 CONTENTS Profesor dr habilitowany Marek Niemiałtowski 1945–2014 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. M i s i e w i c z, S. W r ó b l e w s k a - K a b b a – Adaptive evolution of yeasts genomes from Saccharomyces cerevisiae sensu stricto group . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. S z c z u k a, A. K a z n o w s k i – Differentiation of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. S t a n i s z e w s k a, M. B o n d a r y k, M. K o w a l s k a, U. M a g d a, M. Ł u k a, Z. O c h a l, W. K u r z ą t k o w s k i – Pathogenesis and treatment of fungal infections by Candida spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Z. B a k u ł a, A. S a f i a n o w s k a, M. N o w a c k a - M a z u r e k, J. B i e l e c k i, T. J a g i e l s k i – Mycobacterium kansasii: pathogen biology and clinical and epidemiolo gical features of infections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. M a r k o w s k a - Z a g r a j e k, M. R ó w n i c k i , J . T r y l s k a – Inhibition of bacterial translation and growth by antisense peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . O. Z a j ą c, A. E. L a u d y, S. T y s k i – Biofilm, MDR efflux pumps and other mechanisms of Stenotrophomonas maltophilia resistance to antibacterial substances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K. P. G r e g o r c z y k, Z. W y ż e w s k i, L. S z u l c - D ą b r o w s k a, J. S t r u z i k, J. S z c z e p a n o w s k a, M. N i e m i a ł t o w s k i – The role of mitochondria in antiviral immunity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Ż y l i ń s k a, K. S i e m i a n o w s k i, K. B o h d z i e w i c z, K. P a w l i k o w s k a, P. K o ł a k o w s k i, J. S z p e n d o w s k i, J. B a r d o w s k i – Starter cultures for acid curd – role and expectations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 211 223 229 241 255 264 277 288 ERRATA Poprawny angielskojęzyczny tytuł pracy K. Pisarskiej i S.J. Pietra „Bakterie endofityczne – ich pochodzenie i interakcje z roślinami” powinien brzmieć “Bacterial endophytes – their origin and interaction with plants”
