Rośliny – przegląd wybranych zagadnień
advertisement
Rośliny – przegląd wybranych zagadnień Rośliny – przegląd wybranych zagadnień Redakcja: Kinga Kropiwiec Mirosław Szala Lublin 2016 Recenzenci: dr Renata Matraszek dr Agata Święciło dr n. farm. Ewa Gibuła-Bruzda dr hab. Małgorzata Posmyk, prof. nadzw. UŁ dr hab. Grażyna Żukowska dr Aleksandra Seta-Koselska dr Agnieszka Kuźniar dr hab. Katarzyna Kozłowicz dr Anna Serefko dr Marcin Skowronek dr n. o zdr. Mariola Janiszewska dr hab. Krystyna Winiarczyk dr hab. Mirosława Chwil Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje. Skład i łamanie: Ilona Żuchowska Projekt okładki: © Copyright by Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o. ISBN 978-83-65598-13-4 Wydawca: Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o. Głowackiego 35/341 20-060 Lublin Spis treści Magdalena Śmigała, Agnieszka Dąbrowska, Krystyna Winiarczyk Iris sibirica L. we florze Polski .......................................................................... 7 Marcelina Olszak Identyfikacja genetyczna gatunku Septoria tritici z materiału roślinnego ....... 17 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae .... 26 Małgorzata Budzeń Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin ................................................................................................... 44 Joanna Gębura, Olha Budnyk, Krystyna Winiarczyk Etapy rozwoju gametofitu żeńskiego u wybranych przedstawicieli rodziny Commelinaceae ................................................................................................ 54 Olha Budnyk, Piotr Sugier Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania ................................................................. 63 Monika Poniewozik, Marzena Parzymies Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce .......................................................................................................................... 75 Dagmara Migut, Józef Gorzelany, Natalia Matłok Ocena właściwości mechanicznych świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej Daucus carota L. .................................... 87 Magdalena Fujarowicz, Dorota Grabek-Lejko, Maciej Kluz Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) .... 98 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy .................................................. 109 Kamila Nawrocka, Klaudia Kamińska, Anita Wiśniewska Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień .................................................... 123 Klaudia Magierowicz Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców ................................................................................................. 134 Olga Bemowska-Kałabun, Małgorzata Wierzbicka Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska ............. 146 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym ......................................................................................... 160 Monika Staszowska-Karkut, Małgorzata Materska, Barbara Kulik, Robert Waraczewski Określenie wpływu rodzaju wody na potencjał antyoksydacyjny naparów z wybranych roślin ziołowych .......................................................................... 175 Magdalena Kręcisz, Karol Kupryaniuk, Kamila Kasprzak Żurawina – charakterystyka i właściwości funkcjonalne .............................. 185 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic......................................................................................................... 194 Paulina Marczuk, Ewelina Włodarczyk Zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne ....................................................................... 210 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? ......... 219 Paulina Panek, Iga Hołyńska-Iwan, Dorota Olszewska-Słonina Kapsaicyna i jej szerokie zastosowanie terapeutyczne .................................. 243 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia .................................... 253 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska Medyczna marihuana ..................................................................................... 270 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj ABC wpływu nikotyny na transportery leków............................................... 303 Ewelina Cholewińska, Katarzyna Ognik, Anna Stępniowska Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie ..................................... 320 Indeks autorów ............................................................................................... 334 Magdalena Śmigała1, Agnieszka Dąbrowska2, Krystyna Winiarczyk1 Iris sibirica L. we florze Polski 1. Charakterystyka rodzaju Iris Kosaciec, irys (Iris L.) jest jednym z rodzajów podrodziny Iridoideae w rodzinie kosaćcowatych (Iridaceae) należącej do rzędu szparagowców (Asparagales) w obrębie jednoliściennych (Liliopsida) [1]. Ujęcie taksonomiczne gatunków z rodzaju Iris wyróżnia dwa rodzaje: Juno Tratt i Xiphium Mill. System Crescent Bloom [2] włącza te rodzaje do Iris i uznaje je za synonimy. Kosaćce pochodzą z umiarkowanej strefy półkuli północnej. Znanych jest ponad 250 gatunków (Index Kewensis [3]) o bardzo różnych opodobaniach siedliskowych: hydrofity, mezofity, kserofity, psamnofity, kalcyfity i kalcyfoby. W naturalnych stanowiskach na terenie Europy występuje 30 gatunków kosaćców, przy czym w Polsce spotyka się trzy: kosaciec żółty (Iris pseudacorus L.), kosaciec syberyjski (I. sibirica L.) i kosaciec bezlistny (I. aphylla L.) [4]. Kosaciec trawolistny (Iris graminea L.) w naszym kraju jest gatunkiem wymarłym [5]. Kosaćce są bylinami kłączowymi lub cebulowymi z równowąskimi, szablastymi liśćmi. Kwiaty kosaćców są promieniste, a ich długość i średnica waha się odpowiednio w zakresie 5-15 i 8-18 cm. Występują pojedynczo lub zebrane są w wielokwiatowe kwiatostany. Zewnętrzne działki okwiatu są odgięte w dół lub ustawione horyzontalnie. U niektórych gatunków i odmian na działkach okwiatu, wzdłuż nerwu głównego, występują szczotkowato ustawione włoski, zwane bródką – stąd nazwa kosaćce bródkowe. U pozostałych gatunków i odmian zamiast bródki widoczny jest wyraźny pas mniej lub bardziej intensywnie zabarwiony na żółto lub brązowo – stąd też nazywa się je bezbródkowymi. Wewnętrzne działki okwiatu mają zróżnicowaną długość i szerokość, są wzniesione i często nazywane kopułą. Słupek ma trzypłatkowe znamiona zakończone dwiema wargami, z których górna jest barwna, a dolna stanowi właściwe znamię. Pod znamionami słupka ukryte są trzy pręciki [6-8]. 1 [email protected], [email protected], Zakład Anatomii i Cytologii Roślin, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii CurieSkłodowskiej w Lublinie 2 [email protected], Ogród Botaniczny UMCS, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 7 Magdalena Śmigała, Agnieszka Dąbrowska, Krystyna Winiarczyk Rodzaj Iris podzielono na szereg podrodzajów względnie sekcji i serii, przy czym grupy gatunków w obrębie sekcji różną się od siebie w znacznym stopniu i mają odmienne zastosowanie w ogrodnictwie. Jedną z różniących cech jest występowanie kłączy lub cebul [9-11]. Hodowlę irysów zapoczątkowano we Francji i Anglii już w pierwszej połowie XIX wieku, przy czym znaczne nasilenie prac hodowlanych w tych krajach jak również w Niemczech nastąpiło po roku 1918. Niekwestionowanym ekspertem w dziedzinie hodowli kosaćców był William Rickatson Dykes (1877-1925) – brytyjski amator-botanik autor wielu prac naukowych m.in. „The Genus Iris”. Przez kolejne stulecia hodowcy uzyskali tysiące różnobarwnych odmian o dużej wartości ogrodowej. W American Iris Society (AIS) zarejestrowanych jest obecnie około 30 tysięcy odmian w grupie kosaćców bródkowych wysokich (Tall Bearded – TB). Są to przede wszystkim odmiany silnie rosnące, obficie kwitnące, o kwiatach jednobarwnych lub dwubarwnych. Z punktu widzenia projektanta terenów zieleni, kosaćce powinny zajmować główne miejsce w rabatowych bylinowych, bowiem odznaczają się ogromnym bogactwem form i barw, małymi wymaganiami siedliskowymi oraz względnie wysoką odpornością na niskie temperatury, choroby i szkodniki [12-15]. Niektóre gatunki kosaćców takich jak kosaciec niemiecki (Iris×germanica L.), blady (I. pallida Lam.) i różnobarwny (Iris versicolor L.) uprawia się ze względu na kłącza, które po okorowaniu stanowią surowiec zielarski (Rhizoma Iridis). Zawierają one m.in. olejki eteryczne, glikozyd irydynę, garbniki, substancje śluzowe i flawonoidy, które dzięki substancjom śluzowym działają powlekająco na błony śluzowe dróg oddechowych. Flawonoidy zwiększają wydalanie moczu. Z kolei garbniki działają przeciwbakteryjnie i ściągająco na błony śluzowe przewodu pokarmowego. Do niedawna ziele kłącza, pod nazwą korzenia fiołkowego (Radix Iridis), podawano ząbkującym dzieciom. Jednak ze względu na częste przypadki zapalenia jamy ustnej zaprzestano tej praktyki. W homeopatii kłącze kosaćca stosowano W łagodzeniu objawów migreny wywołanej stresem. Z kłączy kosaćca niemieckiego i kosaćca bladego uzyskuje się cenny w przemyśle perfumeryjnym olej irysowy przypominający zapach fiołków. Wykorzystywany jest on również do aromatyzowania likierów, tytoniu i wyrobów cukierniczych. Warto pamiętać, że kwiaty zwilżone octem i wysuszone na słońcu, dostarczały barwnika do skór i papieru [16-19]. Łacińska nazwa rodzajowa Iris, wywodzi się od greckiego Iris, tłumaczonej jako bogini tęczy lub tęcza. Ze względu na swą różnobarwność stały się więc istotnym elementem dekoracyjnym w sztuce. W starożytności symbolem irysa zdobiono berła faraonów, zaś w średniowieczu trumny władców [20]. 8 Iris sibirica L. we florze Polski 2. Iris sibirica L. Kosaciec syberyjski (Iris sibirica L.) przedstawiony na rysunku 1, jest jednym z gatunków podserii Iris subser. Sibiricae w serii Iris ser. Sibiricae i w sekcji I. sect. Limniris należącej do podrodzaju Limniris (I. subg. Limniris) w obrębie rodzaju Iris (Classification System) [1]. Rysunek 1. Iris sibirica L. [autor A. Dąbrowska] 2.1. Morfologia Kosaciec syberyjski jest byliną dorastającą do 120 cm wysokości. Geofit o grubym, płożącym się kłączu. Łodyga jest wzniesiona, obła, pusta w środku, w górnej części słabo rozgałęziona; w nasadzie mogą być obecne resztki zeszłorocznych liści. Liście mają kształt równowąsko lancetowaty o szerokości 2-6 mm, są krótsze od łodygi. Kwiaty na szypułkach do 10 cm długości, niebieskofioletowe, rzadko białe, z błoniastymi, brunatnymi podsadkami, skupione są po 1-3 na łodydze. Wewnętrzne działkach okwiatu osiągają 4-7 cm długości i są wyprostowane, wyraźnie fioletowo żyłkowane; 9 Magdalena Śmigała, Agnieszka Dąbrowska, Krystyna Winiarczyk zewnętrzne jajowate, zwężone poniżej połowy, odgięte, jaśniejsze od wewnętrznych. Słupek jest dolny o znamieniu krótszym i węższym od wewnętrznych działek okwiatu. Kosaciec syberyjski kwitnie w maju i czerwcu. Kwiaty przedprątne, zapylane są przez trzmiele. Torebka jest elipsoidalna 3-4 mm długości, słabo kanciasta, trójgraniasta, poprzecznie pomarszczona [7, 8, 21, 22]. Liczba chromosomów 2n=28 [23]. Wytwarza różnokształtne nasiona, które zostały pokazane na rysunku 2. Rysunek 2. Nasiona Iris sibirica L. [autor M. Śmigała] 2.2. Anatomia Blaszka liściowa kosaćca syberyjskiego pokryta jest z obu stron kutyną i jest rodzaju unifacjalnego. Komórki miękiszowe, zarówno z górnej jak i dolnej strony, mają pogrubione ściany. W epidermie liścia kosaćca obecne są duże, owalne aparaty szparkowe i nieliczne, brodawkowate narośla 10 Iris sibirica L. we florze Polski z zaokrąglonymi końcówkami. Mezofil jest jednorodny z grubościennymi, owalnymi komórkami. Miękisz asymilacyjny jest luźno ułożony na dolnej stronie liścia. W mezofilu można zaobserwować rafidy lub styloidy [24]. 2.3. Rozmieszczenie Jest to gatunek eurosyberyjski o zasięgu obejmującym Europę po południową Skandynawię oraz Kaukaz, Syberię i Daleki Wschód. W Polsce występuje w rozproszonych stanowiskach na całym obszarze niżowym oraz w pasie południowych wyżyn [25]. Rozmieszczenie pokazano na rysunku 3. Rysunek 3. Rozmieszczenie kosaćca syberyjskiego na terenie Europy i Polski [41] Największe zagęszczenie stanowisk występuje m.in. na Dolnym Śląsku [26-29], Wyżynie Lubelskiej i Roztoczu [30]. Przerwy zasięgowe zaznaczają się w środkowej części kraju, na pogórzu Karpat i samych Karpatach [31, 32] oraz na Pomorzu Zachodnim [33]. Poszczególne populacje mają zwykle po kilkadziesiąt osobników [3436]. Do największych należą populacje koło Krakowa oraz w Karczni-cach w okolicach Płocka, liczące po kilka tysięcy osobników [37-39]. 2.4. Warunki siedliska Jest gatunkiem charakterystycznym dla wilgotnych i torfiastych łąk trzęślicowych ze związku Molinion oraz zespołu Molinietum caeruleae. Sporadycznie występuje w mokrej psiarze (zespół Nardo-Juncetum squarrosi) i w ziołoroślach (zespół Filipendulo-Geranietum) [40]. Kosaciec syberyjski rośnie w miejscach otwartych lub częściowo zacienionych takich jak: łąki, śródleśne polany, zarośla czy torfowiska. Preferuje wilgotne i mokre gleby semihygrogeniczne i hydrogeniczne (czarne ziemie, gleby gruntowo-glejowe, murszowe i torfowe) o odczynie obojętnym do 11 Magdalena Śmigała, Agnieszka Dąbrowska, Krystyna Winiarczyk zasadowego. Rzadziej można go spotkać na glebach płowych i brunatnych [7, 32, 41]. Przykładowe stanowisko zostało pokazane na rysunku 4. Rysunek 4. Kosaciec syberyjski w Ogrodzie Botanicznym UMCS w Lublinie [autor A. Dąbrowska] 2.5. Zagrożenie i ochrona Istnieje kilka przyczyn zubożenia liczebności naturalnych stanowisk kosaćca syberyjskiego. Pierwsza z nich jest ściśle powiązana z biologią tego gatunku. Jest to bylina obficie wytwarzająca nasiona, lecz odznaczająca się słabą zdolnością kiełkowania. Dodatkowo, spora część nasion ulega zniszczeniu przez ryjkowca – jednorka kosaćcowego (Mononychus punctumalbum Herbst 1784), który żeruje w torebkach kosaćca. Drugim niezwykle ważnym powodem niewielkiej liczby naturalnych stanowisk kosaćca jest prowadzenie na szeroką skalę osuszanie łąk [38, 42]. Zanikanie stanowisk kosaćca potęguje ekstensywna gospodarka na łąkach trzęślicowych. Ze względu na walory estetyczne, rośliny te są przenoszone z naturalnych stanowisk do przydomowych ogródków [43]. Kosaciec syberyjski podlega ścisłej ochronie prawnej w Polsce, zaliczony jest do kategorii VU, czyli do gatunków narażonych na wyginięcie (Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 9 października 2014 roku w sprawie ochrony gatunkowej roślin poz. 1409). Wpisany jest na „Czerwoną listę roślin naczyniowych w Polsce” z kategorią zagrożenia V – narażony [44]. Zachowanie gatunku możliwe jest dzięki ochronie całego ekosystemu wilgotnych łąk. Pewnym zabezpieczeniem jest również fakt, że część stanowisk znajduje się na obszarach rezerwatów i parków narodowych [38, 42]. 12 Iris sibirica L. we florze Polski 2.6. Wartość użytkowa Podseria Iris subser. Sibiricae zwana potocznie grupą Irysy syberyjskie, skupia cztery gatunki: I. sibirica L., I. sanguinea Donn ex Hornem., I. typhifolia Kitag. i I. phragmitetorum Hand.-Mazz. Wszystkie cztery gatunki mają tę samą liczbę chromosomów 2n=28 i łatwo się ze sobą krzyżują, dając płodne mieszańce. Obecnie większość odmian hodowlanych to mieszańce I. sibirica i I. sanguinea. Rozwój ich hodowli w ostatnich latach pozwolił uzyskać wiele nowych odmian. Przyczyniła się do tego łatwość krzyżowania oraz możliwa wiatropylność. Jeżeli w porę nie usunie się torebek nasiennych, to samosiejki będą się pojawiały w różnych miejscach ogrodu, jednak potomstwo rzadko powtarza cechy roślin matecznych [23, 45]. W ostatnich latach, uzyskano wiele odmian o kwiatach białych, niebieskich, fioletowych i biało-żółtych [45, 46]. Kosaciec syberyjski to ważny przedstawiciel irysów bezbródkowych występujący na stanowiskach naturalnych w Polsce [4]. W uprawie cieszy się coraz większą popularnością. Jest to trwała bylina o małych wymaganiach siedliskowych. Preferuje stanowiska słoneczne i półcieniste, umiarkowanie wilgotne i wilgotne. Wymaga gleby przepuszczalnej, żyznej i próchnicznej. Może rosnąć na jednym stanowisku około 10 lat. Polecany jest na rabaty i grupy bylinowe. Przy tworzeniu rabat w ogrodach skalnych częściej wykorzystuje się niskie odmiany, które wykazują trwalsze wartości dekoracyjne niż odmiany wysokie. Kosaćce syberyjskie mogą być sadzone nad brzegami zbiorników wodnych. Kwitną dość krótko (około 2 tygodnie), ale obficie. Dużą wartością dekoracyjną przez cały sezon wegetacji są również ich równowąskolancetowate liście, które jesienią przebarwiają się na żółto. Kwiaty posiadają przyjemny zapach i nadają się na kwiat cięty do bukietów okolicznościowych i wiązanek [11-15, 21-23, 45, 48-51]. Kosaciec syberyjski był kiedyś szeroko stosowany w medycynie ludowej jako lek przeciwzapalny, moczopędny, przeciwbólowy, a także przyspieszający gojenie ran [24]. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Classification System: APG III. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III, Botanical Journal of Linnean Society, 161 (2009), s. 105-121 Crescent Bloom – www.crescentbloom.com Index Kewensis – www.theplantlist.org Mirek Z., Piękoś-Mirkowa H., Zając A., Zając M. Flowering plants and pteridophytes of Poland – a checklist. Krytyczna lista roślin naczyniowych Polski. Biodiversity of Poland 1 Szafer W. Institute of Botany, Polish Academy of Sciences, Kraków 2002 13 Magdalena Śmigała, Agnieszka Dąbrowska, Krystyna Winiarczyk 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Kaźmierczakowa R., Zarzycki K., Mirek Z. Polska czerwona księga roślin. Paprotniki i rośliny kwiatowe (Polish red data book of plants. Pteridophytes and floweringplants), Wyd. III. uaktualnione i rozszerzone. Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków 2014 Szafer W., Kulczyński S., Pawłowski B. Rośliny polskie, Wyd. 5. s. 1019. PWN, Warszawa 1986 Webb D. A., Chater A. O. Iris L., [W]: Tutin T. G., Heywood V. H., Burges N. A., Moore D. M., Valentine D. H., Walters, S. M., Webb D. A. (red.), Flora Europaea 5. Alismataceae to Orchidaceae (Monocotyledones), s. 87-92, Cambridge University Press, Cambridge, 1980 Rodionienko G. J. Rod iris – Iris L., Izdatielstwo Akademii Nauk CCCP, Moskwa – Leningrad 1961 The Species Group of the British Iris Society (red). A Guide to Species Irises. Their Identification and Cultivation, Cambridge University Press. Cambridge 1977 Mathew B. The iris, Timber Press., Portland 1990 Köhlein F. Iris, Ulmer, Stuttgart 1981 Walters S. M., Brady A., Brickell C. D., Cullen J., Green P. S., Lewis J., et al. The European Garden Flora 1: Pteridophyta, Gymnospermae, Angiospermae – Monocotyledons 1: A manual for the identification of plants cultivated in Europe, both out-of-doors and under glass, Cambridge Univ. Press, Cambridge 1984 Weber S. Iris: die bestenArten und Sortenfür den Garden, Ulmer, Stuttgart 1997 Chmiel H. (red.). Uprawa roślin ozdobnych, PWRiL, Warszawa 2000 Hlava B., Starý F., Pospińil F., Krejčová Z. Rośliny kosmetyczne, PWRiL, Warszawa 1984 Moerman D.E . Native American Ethnobotany, Timber Press, Portland 1998 Podbielkowski Z., Sudnik-Wójcikowska B. Słownik roślin użytkowych, Wyd. VII. PWRiL, Warszawa 2003 Wyk B. E., Wink M. Rośliny lecznicze świata. Ilustrowany przewodnik naukowy po najważniejszych roślinach leczniczych świata i ich wykorzystaniu, MedPharm Polska, Wrocław 2008 Kopaliński W. Słownik mitów i tradycji kultury, Oficyna Wydawnicza RYTM, Warszawa 2003 Warburton B. The world of Irises, The American Iris Society, Witchita, Kansas 1995 Epperson E. R. Basic Iris Culture, The Americam Iris Society, Purcellville, Virginia 2000 Komarnicki L. Irysy bezbródkowe, Wydawnicwo RS DRUK, Rzeszów 2014 Gontova N. T., Zatylnikova O. A. Comparative morphological and anatomical study of leaves and stems of Iris pseudacorus and Iris sibirica, Department of Botany, National University of Pharmancy, Kharkov, Ukraine 2013 Zając A., Zając M. (red.). Atlas rozmieszczenia roślin naczyniowych w Polsce, Nakładem Pracowni Chorologii Komputerowej Instytutu Botaniki Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2001 Pender K. Zagrożone gatunki zbiorowisk trawiastych na Dolnym Śląsku, Instytut Biologii Roślin, Pro Natura, str. 109-130, Wrocław 2003 14 Iris sibirica L. we florze Polski 27. Kopij G. Kosaciec syberyjski Iris sibirica na Śląsku Opolskim nie wyginął, str. 34-37, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 2005 28. Jermaczek M. Stanowisko kosaćca syberyjskiego Irissibirica L. na zmiennowilgotnej łące koło miejscowości Stany pod Nową Solą (woj. lubuskie), str.29-31, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 2007 29. Gorzelak P. Nowe stanowisko kosaćca syberyjskiego Iris sibirica L. (Iridaceae) na Dolnym Śląsku, str. 155-160, Acta Botanica Silesiaca, 8, 2012 30. Franszczak-Być M., Dąbrowska K. Nowe stanowisko kosaćca syberyjskiego Iris sibirica na Lubelszczyznie, str. 21-23, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 2000 31. Stawowczyk K. Nowe stanowisko kosaćca syberyjskiego Irissibiric L. w polskich Karpatach, str. 28-31, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 2005 32. Mirek Z., Pękoś-Mirkowa H. Czerwona Księga Karpat Polskich. Rośliny naczyniowe, Inst. Bot. im. W. Szafera, PAN, Kraków 2008 33. Żukowski W., Jackowiak B. Lista roślin naczyniowych ginących i zagrożonych na Pomorzu Zachodnim i w Wielkopolsce, Prace Zakładu Taksonomii Roślin UAM, Poznań 1995 34. Danielewicz W., Wrońska-Pilarek D. Stanowisko kosaćca syberyjskiego Iris sibirica w Poznaniu, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, str. 27-30, Kraków 2002 35. Podgórska M. Ochrona kosaćca syberyjskiego Iris sibirica na Płaskowyżu Suchedniowskim oraz na Garbie Gieniowskim w gminie Stąporków, str.30-32, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 2005 36. Cuber P. Nowe stanowisko kosaćca syberyjskiego Iris sibirica L. w okolicach zbiornika Kozłowa Góra (Górny Śląsk), str. 19-21, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 2007 37. Zarzycki K. Wilgotne łąki w okolicach Czernichowa i potrzeba ich ochrony, str. 49-68, Ochr. Przyr. 25, 1958 38. Kostrakiewicz K. Aktualny stan populacji kosaćca syberyjskiego Iris sibirica na wybranych stanowiskach w okolicach Krakowa, str. 30-32, Chrońmy Przyrodę ojczystą, Kraków 2001 39. Chełmecki Z., Korzeniak J. Nowe stanowiska kosaćca syberyjskiego Irissibirica L. w Bochni na Pogórzu Wielickim, str. 19-21, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 2008 40. Matuszkiewicz W. Przewodnik do oznaczania zbiorowisk roślinnych Polski, Wyd. Nauk. PWN, Warszawa 2007 41. Pękoś-Mirkowa H., Mirek Z. Flora Polski, Atlas roślin chronionych, MULTICO Oficyna Wydawnicza, Warszawa 2003 42. Denisiuk Z. O ochronę nadwiślańskich łąk w Krakowie, str. 32-34, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 1987 43. Medwecka-Kornaś A. Nasze kosaćce, str. 27-30, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, Kraków 1953 44. Zarzycki K., Szeląg Z. Red list of the vascularplants in Poland (Czerwona lista roślin naczyniowych w Polsce), [W]: Mirek Z., Zarzycki K., Wojewoda W., Szeląg Z. (red.). Red list of plants and fungi in Poland (Czerwona lista roślin i grzybów Polski), Instytut Botaniki im. W. Szafera PAN, Kraków 2006 45. Komarnicki L. Irysy, PWRiL, Warszawa 1993 15 Magdalena Śmigała, Agnieszka Dąbrowska, Krystyna Winiarczyk American Iris Society (AIS) – www.irises.org Middle-European Iris Society (MEIS) – www.euroiris.net Augustynowicz J. Irysy, str. 203-205, Hasło Ogrodn.-Roln. 7, 1964 Mika B. Uroki bylin, Polski Związek Działkowców, Warszawa 1998 Marcinkowski J. Byliny ogrodowe – produkcja i zastosowanie, Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa 2013 51. Pogroszewska E. Przyspieszona uprawa kosaćca syberyjsiego (Iris sibirica L.) w nie ogrzewanym tunelu foliowym, Zesz. Nauk. AR Szczec., 1998 46. 47. 48. 49. 50. Iris sibirica L. we florze Polski Streszczenie Celem niniejszej pracy było przedstawienie dostępnych informacji o kosaćcach, ze szczególnym uwzględnieniem Iris sibirica L. Kosaciec to jeden z rodzajów podrodziny Irioideae wśród rodziny Iridaceae (kosaćcowate), która należy do rzędu Asparagales (szparagowców) w obrębie Liliopsida (jednoliściennych) według Classification System: APG III z 2009 roku. Dzięki Index Kawensis znanych jest ponad 250 gatunków z czego 30 występuje w Europie a w Polsce trzy. Iris zawiera podrodzaje, sekcje i serie, które znacznie różnią się od siebie. Kosaciec syberyjski (Iris sibirica L.) należy do podserii Iris subser. Sibiricae w serii Iris ser. Sibiricae oraz do sekcji Irissect. Limniris, która zawiera się w podrodzaju Limniris w obrębie rodzaju Iris. Bylina ta odznacza się małą zdolnością kiełkowania, co w znacznym stopniu spowodowane jest niszczycielską działalnością ryjkowca (Mononychus punctumalbum). Ochrona kosaćca syberyjskiego jest niezwykle ważna nie tylko ze względu na jego walory estetyczne ale także wartości użytkowe. Łatwość krzyżowania oraz wiatropylność pozwala na uzyskanie coraz to nowych odmian. Słowa kluczowe: Iris sibirica, kosaćce, morfologia, anatomia, ekologia Iris sibirica L. in the Polish flora Abstract The aim of this study was to present the available information about kosaćcach, with particular emphasis on Iris sibirica L. Irisis one of the types of Irioideae subfamily of the family Iridaceae (Iridaceae), whichbelongs to the order Asparagales (szparagowców) within Liliopsida (monocots) according to Classification System: APG III, 2009. Through Index Kawensis we knowmorethan 250 species of which 30 occur in Europe and three in Poland. Iris is divided into subgenera, sections and seriesthatareverydifferent from eachother. Siberian iris (Iris sibirica L.) belongs to the subseries Irissubser. Sibirica series Irischeese. Sibirica esection and Irissect. Limniris which comprises Limniris a subgenus within the genus Iris (Classification System: APG III, 2009). Thisperennialhas a lowgerminationcapacity, which to a largeextentiscaused by the destructive activities of the we evil (Mononychus punctumalbum Herbst, 1784). Protection of siberian Iris is extremely important not only because of its a esthetic value but also the value of utility. Ease of crossingand wind-pollinationallows for more and more new varieties. Keywords: Iris sibirica, iris, morphology, anatomy, ecology 16 Marcelina Olszak1 Identyfikacja genetyczna gatunku Septoria tritici z materiału roślinnego 1. Wstęp Podstawowym celem nowoczesnej produkcji roślinnej jest uzyskanie wysokich i dobrych jakościowo plonów, przy możliwie niskich nakładach ekonomicznych. W Polsce głównym kierunkiem produkcji rolniczej jest uprawa zbóż. Według danych Głównego Urzędu Statystycznego (GUS) w 2012 roku zboża stanowiły blisko 74% ogólnej powierzchni krajowych zasiewów [1]. Popularność tego typu upraw wynika w Polsce przede wszystkim z korzystnych warunków klimatyczno-glebowych, stosunkowo niskiej pracochłonności, względnie prostej technologii produkcji, łatwości przechowywania plonów, jak również ich transportu i sprzedaży. Sytuacja panująca na rynku zbóż ma istotny wpływ dla całej gospodarki żywnościowej kraju. Zboża są podstawowym surowcem do produkcji pasz, co decyduje o opłacalności ekonomicznej produkcji zwierzęcej, szczególnie żywca [1]. O strukturze gatunkowej uprawianych zbóż decydują przede wszystkim warunki klimatyczno-glebowe. W Polsce w produkcji zbóż dominuje pszenica zwyczajna Triticum aestivum ssp. vulgare. W około 4/5 całkowitej powierzchni zasiewów występuje forma ozima, a zaledwie 1/5 to forma jara [2]. Według danych szacunku wynikowego GUS powierzchnia uprawy zbóż ogółem w roku 2015 wyniosła ok. 7,5 mln ha, w tym powierzchnia zasiewu pszenicy ok. 2,4 mln ha. Uprawa zbóż intensywnych (pszenicy, pszenżyta i jęczmienia) stanowiła ok. 70,4% w 2015 roku, a w 2014 roku 66,5% [3, 4]. Ważnym czynnikiem ograniczającym plonowanie zbóż są choroby grzybowe. Szczególnie dotyczy to pszenicy ozimej, która w ciągu całego okresu wegetacji jest atakowana przez wiele patogenów. Podstawową wadą intensywnej uprawy pszenicy ozimej w Polsce jest ograniczenie liczby roślin, które tworzą z nią zmianowanie na polu. Zboża są zbyt często uprawiane po sobie, co powoduje wzrost zagrożenia roślin na patogeny gromadzące się w glebie. Ponadto wysokie nawożenie przedplonów może niekorzystnie wpływać na zdrowotność pszenicy przez wzrost zagrożenia 1 [email protected], Katedra Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności, Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 17 Marcelina Olszak roślin ze strony Puccinia recondita f. sp. tritici, Blumeria graminis, Tapesia yallundae i wielu innych. Znajomość zagrożeń, właściwy dobór przedplonów i zastosowanie nowoczesnych metod identyfikacji grzybów może obniżyć zagrożenie ze strony chorób powodowanych przez te patogeny [5]. 2. Cel pracy Celem pracy jest charakterystyka gatunku Septoria tritici wraz z objawami chorobowymi występującymi na liściach pszenicy ozimej oraz przedstawienie genetycznych metod identyfikacji patogenu opartych na reakcji PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy). 3. Opis zagadnienia Septorioza paskowana liści pszenicy powodowana jest przez grzyby workowe Mycosphaerella graminicola (stadium bezpłciowe: Septoria tritici). Jest to jedna z najważniejszych chorób atakujących liście zbóż. Charakteryzuje się ona występowaniem zmian martwiczych na liściach i łodygach. Obecnie septorioza jest uważana za jedną z najbardziej niszczących plony chorób pszenicy, która znacznie podnosi koszty upraw ze względu na zwiększone stosowanie fungicydów [6, 7]. Septoria tritici jest patogenem mało poznanym, szczególnie ze strony molekularnej. Mała wiedza w zakresie oddziaływania pomiędzy grzybem a rośliną utrudnia dobór odpowiednich strategii zwalczania choroby. Wiele problemów sprawia dimorfizm grzyba, ponieważ wydłuża on fazę utajoną po zainfekowaniu rośliny. Jest to faza, w której grzyb jest związany z powierzchnią liści, ale nie wykazuje żadnych objawów chorobowych. W lecie w warunkach polowych faza ta utrzymuje się około 14 dni, a w chłodniejsze dni nawet do 28 dni. Występuje problem z doborem odpowiedniego fungicydu oraz jego dawki, ponieważ trudno jest oszacować postęp choroby. Ponadto środki grzybobójcze wykazują skuteczność tylko przez około 7 dni w ciągu całego okresu utajonej infekcji. Wtedy po zastosowaniu oprysku pomimo tego, że na liściach nie są obserwowane zmiany chorobowe, rolnik nie ma pewności czy grzyb się nadal rozprzestrzenia. Ważne jest więc wykrycie patogenu już na wczesnych etapach rozwoju choroby, w czym pomocne okazują się nowoczesne techniki biologii molekularnej [8, 9]. 3.1. Biologia grzyba Grzyb Septoria tritici wykazuje dużą różnorodność morfologiczną. Najczęściej hodowaną w laboratorium formą wegetatywną tego grzyba są makropyknidiospory. Są to struktury wielokomórkowe, składające się z 4-8 18 Identyfikacja genetyczna gatunku Septoria tritici z materiału roślinnego wydłużonych komórek o wymiarach 1,5-3,5 µm szerokości i 40-100 µm długości. Ponadto Septoria tritici produkuje również mikropyknidiosposy, małe komórki o wymiarach około 1 µm szerokości i 5-10 µm długości oraz struktury jednokomórkowe. Komórki te wytwarzane są w wyniku pączkowania bocznego i z makropyknidiosporów. Zdolność do wzrostu wegetatywnego w kilku formach jest cechą charakterystyczną dla wielu grzybów chorobotwórczych [10]. 3.1.1. Rozmnażanie bezpłciowe W rozmnażaniu bezpłciowym biorą udział zarodniki lub konidia. Są one przezroczyste (bezbarwne) o nitkowatym kształcie i są wytwarzane w wyspecjalizowanych strukturach piknidiach. Każdy z zarodników posiada od 3-7 niewyraźnych przegród. Kiełkowanie zarodników odbywać się może z komórek bocznych lub pośredniczących. W trakcie okresu wegetacyjnego może wystąpić wiele cykli rozmnażania bezpłciowego. Zarodniki wytwarzane są najczęściej w okresie dużej wilgotności liści, co sprzyja powstawaniu nowych zakażeń [6]. 3.1.2. Rozmnażanie płciowe W obrębie zmian chorobowych produkowane są także owocniki płciowe zwane pseudotecjami. Grzyb Septoria tritici ma dwubiegunowy, heterotaliczny system rozmnażania. Części uczestniczące w procesie rozmnażania płciowego muszą połączyć się ze sobą. Formowane pseudotecja są kształtu kulistego, są ciemnobrązowe i mają około 68-114 µm średnicy. Askospory umieszczone w każdym worku po 8 sztuk są bezbarwne, eliptyczne i złożone są z dwóch komór o zróżnicowanej długości. Askospory są wyrzucane z worków w okresie dojrzałości i duży wpływ mają na to wahania wilgotności [6, 8]. Konidia mogą kiełkować w ciągu 12 godzin po kontakcie z liśćmi pszenicy przy wysokiej wilgotności powietrza. Do pomyślnej infekcji w warunkach wysokiej wilgotności potrzeba co najmniej 20 godzin. Następnie dochodzi do pierwotnej penetracji liścia. Strzępki przedostają się przez szparki i rozmnażają zewnątrzkomórkowo w mezofilu, ale nie penetrują ich ani komórek naskórka. Objawy makroskopowe choroby zazwyczaj nie pojawiają się przed upływem dziewięciu dni po kontakcie z grzybem [7, 9]. Styl życia grzyba jest hemibiotropiczny. We wczesnym etapie zakażenia grzyb żywi się apoplastem co wskazuje na biotropizm, natomiast w późniejszym etapie wykorzystuje martwe tkanki gospodarza, co nazywane jest nekrotrofizmem [6, 10]. 19 Marcelina Olszak 3.1.3. Cykl rozwojowy grzyba Zakażenie grzybem w dużej mierze inicjowane jest zarodniki workowe przenoszone z wiatrem oraz przez zarodniki obecne na resztkach pozostałych po poprzednim sezonie upraw. Do porażenia pierwotnego u pszenicy ozimej dochodzi już jesienią. Askospory przedostają się przez szparki liścia do wnętrza komórek rośliny i rozrastają się wewnątrz komórek z niewielkim przyrostem biomasy. Kolejnym etapem jest faza wzrostu nekrotroficzna. Na liściach widoczne są początkowo małe i żółte plamki. W dalszym etapie plamy te rozszerzają się i zajmują coraz większą powierzchnię liścia, tworząc długie i wąskie plamy nekrotyczne. Nie ma widocznego odgraniczenia pomiędzy zmianami chorobowymi, a zdrową tkanką. Najsilniej porażone są liście w dolnej części rośliny, które w efekcie infekcji zamierają. Ponadto w obrębie szparek rozwijają się piknidia, które rozmieszczone są w rzędach równolegle do unerwienia liści. Zarodniki z nich uwalniane w sprzyjających warunkach wilgotności atakują sąsiednie liście, a nawet inne sąsiednie rośliny [7, 11]. 3.1.4. Metody zapobiegania chorobie Stosowanie odpowiednich zabiegów agrotechnicznych pomaga zapobiegać rozwojowi choroby. Istnieje kilka metod ograniczających rozwój patogenu: stosowanie płodozmianu ograniczającego zbyt duży udział zbóż; przyorywanie resztek pożniwnych i usuwanie samosiewów; odpowiednie przygotowanie gleby do siewu poprzez stosowanie wczesnej podorywki i starannej orki jesiennej; przestrzeganie zasad agrotechniki: ilość wysiewu dostosowana do typu odmiany i warunków siedliskowych; optymalne nawożenie azotem – unikanie przenawożenia, które sprzyja infekcjom liści; terminowe stosowanie orek i podorywek; dobór odpowiednich odmian – o podwyższonej odporności na porażenie grzybem; stosowanie zdrowego, kwalifikowanego materiału siewnego; eliminacja źródeł infekcji poprzez odpowiednie zaprawianie materiału siewnego fungicydami; stosowanie opóźnionego siewu względem terminu optymalnego, co w znacznym stopniu zmniejsza porażenie we wczesnych fazach rozwoju rośliny; 20 Identyfikacja genetyczna gatunku Septoria tritici z materiału roślinnego terminowe wykonanie oprysków fungicydami, gdy porażenie obejmuje 5-10% liści, od końca fazy strzelania w źdźbło do fazy kłoszenia [11, 12]. 4. Genetyczna identyfikacja grzybów W ostatnich latach dużego znaczenia nabrały genetyczne metody identyfikacji grzybów wykorzystujące narzędzia biologii molekularnej. Powszechnie stosowana jest obecnie technika PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy). Analizy molekularne stosowane są zarówno do identyfikacji jak i przy charakteryzowaniu i różnicowaniu szczepów. Dotychczas praktykowane metody morfologiczne identyfikacji w niektórych przypadkach były zawodne, ponieważ poszczególne gatunki są do siebie bardzo podobne fenotypowo. Ponadto ten sam szczep może w różnych temperaturach lub na różnych podłożach laboratoryjnych rosnąć inaczej. Metody molekularne natomiast eliminują te problemy. Wyniki analiz molekularnych otrzymuje się stosunkowo szybko, są one wiarygodne i powtarzalne. Analiza DNA umożliwia nie tylko identyfikację wybranych izolatów, ale również sprawdzenie obecność określonych genów, na przykład odpowiedzialnych za produkcję toksyn grzybowych [13]. Ważną zaletą metod genetycznych jest również to, że ich wyniki nie zależą od stanu fizjologicznego badanych organizmów [14]. Technika PCR została opracowana przez amerykańskiego biochemika Karyego Mullisa w 1984 roku. Polega ona na powieleniu w warunkach laboratoryjnych sekwencji wybranych fragmentów materiału genetycznego [15]. Jest metodą bardzo wydajną, w ciągu kilku godzin możliwe jest uzyskanie 106-109 kopii wyjściowych fragmentów DNA. Mieszanina reakcyjna do reakcji PCR obejmuje: matrycowy DNA (materiał genetyczny przeznaczony do powielenia), pary starterów (fragmentów DNA komplementarnych do sekwencji flankujących badany odcinek DNA), polimerazę DNA (enzym katalizujący syntezę DNA), deoksynukleotydy (dNTP) oraz bufor. W kolejnych etapach mieszanina reakcyjna jest cyklicznie ogrzewana do temperatury charakterystycznej dla fazy cyklu reakcji. Pojedynczy cykl składa się z następujących etapów: denaturacji matrycowego, wyjściowego DNA (rozplecenie dwuniciowego fragmentu DNA na pojedyncze nici na skutek działania wysokiej temperatury), annealingu (hybrydyzacja starterów do nici DNA) oraz elongacji (dobudowywaniu komplementarnych odcinków DNA i wydłużaniu łańcucha z wykorzystaniem termostabilnej polimerazy DNA i dNTP). Te trzy etapy powtarzane są w każdym cyklu reakcji PCR. Cały proces zachodzi w termocyklerze – minicieplarce umożliwiającej zmianę temperatury o kilkadziesiąt stopni w zaledwie kilka sekund. Najczęściej przeprowadzane jest od 25 do 40 cykli reakcji PCR. Najważniejszą zaletą reakcji łańcuchowej polimerazy jest fakt, że z niewielkiej ilości materiału 21 Marcelina Olszak wyjściowego możliwe jest otrzymanie w warunkach laboratoryjnych wielu kopii fragmentów genu. Produkty reakcji PCR są podstawą do dalszych analiz takich jak rozdziały elektroforetyczne i sekwencjonowanie [15; 16]. Wyjściowy materiał genetyczny potrzebny do przeprowadzenia reakcji PCR uzyskuje się poprzez izolację DNA z grzybów. Powszechnie stosowane są dwie metody izolacji: wykorzystująca rozpuszczalniki organiczne oraz kolumienkowa. Powszechniej stosowana jest metoda wykorzystująca rozpuszczalniki organiczne opracowana w 1980 roku przez Murray’a i Thompsona. Istnieje kilka odmian od wyjściowej metody izolacji (np.: według Möller’a), ale w większości wykorzystują one bromek haksadecylotrimetyloamoniowy (CTAB). Izolacja odczynnikami organicznymi może być również wykorzystywana do oczyszczenia DNA z materiału roślinnego, polisacharydów i zanieczyszczeń polifenolowych [17]. Zanieczyszczenia występują bardzo często przy analizie próbek pochodzących ze środowiska. Niektóre związki nieorganiczne i organiczne np.: mocznik, polisacharydy, kwasy humusowe są inhibitorami reakcji PCR. Inhibitory w znacznym stopniu osłabiają lub całkowicie hamują reakcję amplifikacji DNA [15; 16]. Obecnie stosowane są także modyfikacje tej metody izolacji głównie w celu obniżenia kosztów procedury. Przykładem takich modyfikacji jest wykorzystanie promieniowania mikrofalowego, wydłużenie etapu wstępnej denaturacji, zastosowanie wodorotlenku sodu lub głębokiego mrożenia [17]. Na rynku dostępnych jest obecnie wiele gotowych zestawów do izolacji materiału genetycznego grzybów, wykorzystujących izolację DNA metodą kolumienkową. W skład każdego zestawu wchodzą minikolumny ze złożem krzemionkowym, zestaw odczynników umożliwiających oczyszczanie i elucję DNA oraz procedura postępowania. Postępując zgodnie z wytycznymi w krótkim czasie uzyskuje się całkowite DNA komórkowe grzybów, gotowe do dalszych analiz. Przykładem zestawu do izolacji DNA z grzybów jest GeneMATRIX Plant and Fungi DNA Purification Kit produkowany przez firmę EURx. Uzyskane DNA jest pozbawione zanieczyszczeń w postaci RNA, białek, detergentów, barwników, soli, lipidów, kationów dwuwartościowych, związków buforowych oraz organicznych inhibitorów enzymów [17]. Kolejnym etapem po izolacji materiału genetycznego grzyba i nastawieniu reakcji PCR jest przeprowadzenie elektroforezy agarozowej w celu sprawdzenia efektu amplifikacji DNA. Technika ta wykorzystuje zdolność cząsteczek kwasów nukleinowych do migracji w żelu agarozowym. DNA obdarzony jest silnym ładunkiem ujemnym i w polu elektrycznym przemieszcza się w kierunku od anody do katody. Żel natomiast stanowi włóknistą sieć ograniczającą swobodną migrację rozdzielanych fragmentów. Szybkość przemieszczania się fragmentów DNA zależy od ich wielkości, kształtu i ładunku [16]. W praktyce wykrywanie produktów reakcji PCR przeprowadzane jest za pomocą elektroforezy żelowej na żelu agarozowym 22 Identyfikacja genetyczna gatunku Septoria tritici z materiału roślinnego z dodatkiem fluorescencyjnego barwnika DNA – bromku etydyny lub SYBR Green. Cała procedura rozdzielenia produktów trwa około godziny [18]. Obecnie do wykrywania, identyfikacji i klasyfikacji grzybów wykorzystywane są także modyfikacje bazowej reakcji PCR. Powszechnie stosowaną metodą jest SCAR tzw. specyficzny PCR. Technika polega na amplifikacji wyjściowego fragmentu DNA za pomocą pary primerów ściśle zdefiniowanego obszaru genomu. Używane startery mają długość od 17 do 24 nukleotydów i często uzyskane są z badań metodą RAPD. Analiza SCAR jest bardzo przydatna zarówno w identyfikacji jak i charakteryzowaniu grzybów. Bardzo często jest stosowana jako analiza porównawcza genomów organizmów, co pomaga w ustaleniu lub zweryfikowaniu przynależności gatunkowej badanego mikroorganizmu. Inną modyfikacją klasycznej metody PCR jest RT-PCR (reverse-transcription – PCR). RT-PCR jest bardzo przydatny do badań aktywności genów, ich funkcji i działania. Metoda ta wykorzystuje enzym odwrotną transkryptazę, który katalizuje przemianę RNA w cDNA. [14]. Inną bardzo zaawansowaną techniką jest real-time PCR. Jest to nowoczesna metoda, która w czasie rzeczywistym mierzy produkty powstające bezpośrednio po każdym cyklu reakcji. Produkty PCR mogą być monitorowane poprzez użycie fluorescencyjnych, interkalujących barwników DNA np.: SYBR Green lub za pomocą specyficznych sond nukleotydowych np.: sonda TaqMan. Barwniki dodane do mieszaniny reakcyjnej łączą się z kwasami nukleinowymi, a następnie wysyłają sygnał fluorescencyjny proporcjonalny do ilości uzyskanego DNA. Sygnał ten mierzony jest przez specjalnie przygotowany do tego termocykler do Real-Time PCR. Analiza produktu w czasie rzeczywistym umożliwia oszacowanie początkowej ilości DNA. Wszystkie etapy zachodzą w zamkniętych naczyniach, przez co ograniczone jest do minimum ryzyko zanieczyszczenia próby. Metoda ta jest bardzo czuła i szybka, jednak również stosunkowo kosztowna [19]. W dzisiejszych czasach real-time PCR jest najlepszą metodą detekcji grzybów [14]. 5. Podsumowanie Grzyb Septoria tritici stanowi poważne zagrożenie dla rolnictwa poprzez znaczące ograniczenie ilości i jakości plonów. Porażając pszenicę powoduje choroby, pogarsza wzrost i prawidłowy rozwój rośliny [5, 6]. W ostatnich latach odkryto wiele analiz umożliwiającychbadania nad składem biocenozyi rozmieszczeniem przestrzennym mikroorganizmów w środowisku. Analizy bazowane na biologii molekularnej są uzupełnieniem metod klasycznych. Techniki te posiadają wiele zalet takich jak szybkość reakcji i powtarzalność wyników, niezawodność i możliwość zbadania dużej ilości prób jednocześnie. Ponadto techniki te mają znaczną przewagę nad metodami tradycyjnymi, ponieważ są one uniezależnione od hodowli mikroorganizmów na podłożach mikrobiologicznych [16]. Wykorzystanie łańcuchowej reakcji polimerazy z zastosowaniem starterów 23 Marcelina Olszak specyficznych dla gatunku Septoria tritici znacznie ułatwia szybką diagnostykę septoriozy liści pszenicy powodującej duże straty gospodarcze. Wykrycie czynnika chorobotwórczego już we wczesnych stadiach rozwoju ułatwia dobranie odpowiednich metod zapobiegających dalszemu rozprzestrzenianiu się patogenu [8, 9]. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. www.arr.gov.pl/data/00321/rynek_zboz_2013_pl(dostęp 08.08.2016) Gaj R., Grzebisz W., Horoszkiewicz-Janka J., Igras J., Jajor E., Korbas M., Matysiak K., Michalski T., Mrówczyński M., Olejarski P., Paradowski A., Podolska G., Pruszyński G., Pruszyński S., Rutkowska A., Sułek A., TratwalA., Wachowiak H., Zielińska W., Zych J. pod redakcją Korbas M., Mrówczyński M. Integrowana produkcja pszenicy ozimej i jarej, Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy, Poznań 2009, s. 9-20 stat.gov.pl/obszary-tematyczne/rolnictwo-lesnictwo/uprawy-rolne-iogrodnicze/wynikowy-szacunek-produkcji-glownych-ziemioplodow-rolnychi-ogrodniczych-w-2014-r-,5,12. (dostęp 08.08.2016) stat.gov.pl/obszary-tematyczne/rolnictwo-lesnictwo/uprawy-rolne-iogrodnicze/wynikowy-szacunek-produkcji-glownych-ziemioplodow-rolnychi-ogrodniczych-w-2015-r-,5,13. (dostęp 08.08.2016) Kurowski T.P., Marks M., Makowski P. Jaźwińska E. Zdrowotność pszenicy ozimej w stanowiskach po różnych sposobach dwuletniego ugorowania, Fragmenta Agronomica, 26 (3) (2009), s. 102-108 Ponomarenko A., Goodwin S.B., G.H.J. Kema. Septoriatriticiblotch (STB) of wheat, Plant Health Instructor., (2011), DOI:10.1094/PHI-I-2011-0407-01 Eriksen L., Munk L. The occurrence of Mycosphaerellagraminicola and its anamorthSeptoriatritici in winter wheat during the growing season, European Journal of Plant Pathology, 109 (2003), s. 253-259 Fones H., Gurr S. The impact of Septoriatritici Blotch disease on wheat: An EU perspective, Fungal Genetics and Biology, 79 (2015), s. 3-7 O’Driscoll A., Kildea S.,Doohan F., Spink J., Mullins E. The wheat-Septoria conflict: a new front opening up?, Trends in Plant Science, 19, 9 (2014) Steinberg G. Cell biology of Zymoseptoriatritici: Pathogen cell organization and wheat infection, Fungal Genetics and Biology 79 (2015), s. 17-23 www.notatnikrolnika.pl/index.php/rdza-brunatna-pszenicy (dostęp 08.08.2016) Bancal P., Bancal M. O., Collin F., Gouache D. Identifying traits leading to tolerance of wheat to Septoriatritici blotch, Field Crops Research 180 (2015), s. 176-185 Wolny-Koładka K. Grzyby z rodzaju Fusarium – występowanie, charakterystyka i znaczenie w środowisku, Kosmos Problemy nauk biologicznych., 63, 4, 305 (2014), s. 623-633 Suchorzyńska M., Misiewicz A. Mikotoksynotwórcze grzyby fitopatogeniczne z rodzaju Fusarium i ich wykrywanie technikami PCR, Postępy Mikrobiologii., 48,3 (2009), s. 221-230 24 Identyfikacja genetyczna gatunku Septoria tritici z materiału roślinnego 15. Mohini J., Deshpande J. D. Polymerase chain reaction: methods, principles and application, International Journal of Botany and Research 1, 5 (2010), s. 81‐97 16. Raszka A., Ziembińska A., Wiechetek A. Metody i techniki biologii molekularnej w biotechnologii środowiskowej, Environmental Engineering, 2, 106 (2009), s. 101-114 17. Kuzdraliński A., Paterek A., Gierasimiuk N. Charakterystyka grzybów z rodzaju Fusarium oraz nowoczesne metody ich identyfikacji, Nauki Przyrodnicze. 2, 4, s. 4-18 18. Knoll S., Vogel R. F., Niessen L. Identification of Fusarium graminearum in cereal samples by DNA Detection Test StripsTM, Letters in Applied Microbiology, 34 (2002), s. 144-148 19. Chołuj J., Przewodowski W. Technika PCR i jej modyfikacje w identyfikacji patogenów ziemniaka, Ziemniak Polski 3 (2014), s. 40-45 Identyfikacja genetyczna gatunku Septoria tritici z materiału roślinnego Streszczenie W Polsce głównym kierunkiem produkcji rolniczej jest uprawa zbóż. Wynika to przede wszystkim ze sprzyjających warunków klimatyczno-glebowych, stosunkowo niskiej pracochłonności oraz prostej technologii produkcji. W krajowej produkcji zbóż dominującym gatunkiem jest pszenica. Sytuacja na rynku zbóż ma znaczny wpływ na gospodarkę żywnościową kraju. Sektor zbożowy dostarcza bowiem podstawowego surowca wykorzystywanego przy produkcji pasz dla zwierząt. Plonowanie zbóż jest w dużej mierze ograniczane przez choroby grzybowe. Szczególnie dotyczy to pszenicy ozimej, która w ciągu całego okresu wegetacyjnego jest atakowana przez wiele gatunków patogenów. Ważną jednostką chorobową w uprawie pszenicy jest septorioza paskowana liści pszenicy wywoływana przez gatunek Septoria tritici. Straty w plonie pszenicy wynosić mogą od 5 do 30% w zależności od warunków środowiskowych i stopnia rozwoju choroby. Opracowanie obejmuje charakterystykę gatunku Septoria tritici, opis objawów chorobowych obserwowanych na pszenicy oraz genetyczne metody identyfikacji patogenu. Słowa kluczowe: PCR, pszenica ozima, Septoria tritici, septorioza liści pszenicy Genetic identification of the species Septoria tritici from plant material Abstract In Poland, the main direction of agricultural production is the cultivation of cereals. This results primarily from favorable climate and soil conditions, relatively low labor intensity and simple production technology. In the domestic production of cereals wheat is the dominant species. The situation on the cereals market has a significant impact on the food economy of the country. Cereals sector provides the basic stock used in the production of animal feed. Yields of cereals is largely limited by fungal diseases. Especially winter wheat throughout the vegetation period is under attack by many species of pathogens. An important disease entity in the cultivation of wheat is Septoriatritici blotch caused by Septoria tritici species. The losses in the yield of wheat can be from 5 to 30% depending on the environmental conditions and the severity of the disease. The study covers the characteristics of the species Septoriatritici, description of symptoms observed in wheat and genetic methods to identify the pathogen. Keywords: PCR winter wheat, Septoria tritici, Septoria tritici blotch 25 Rafał Marciniec1, Dorota Tchórzewska2 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae 1. Wstęp Rozmnażanie płciowe (generatywne) ma olbrzymie znaczenie nie tylko dla rozwoju i rozprzestrzeniania się organizmów, ale także umożliwia im przystosowywanie się do zmieniających się warunków środowiska naturalnego. U roślin okrytonasiennych (Angiospermae) wszelkie zjawiska związane z rozmnażaniem generatywnym zachodzą w kwiecie, który jest przeważnie zbudowany z działek kielicha, płatków korony, pręcików i słupka, umieszczonych na dnie kwiatowym. Rozmnażanie generatywne odbywa się dzięki żeńskim komórkom rozrodczym (makrosporom), które powstają w słupku, oraz męskim komórkom rozrodczym (mikrosporom) powstającym w pręcikach. Pręciki składają się z nitki i główki utworzonej przez dwa pylniki, zawierające po dwa woreczki pyłkowe, tzw. mikrosporangia. Dojrzałe mikrosporangia są wypełnione pasmami komórek sporogennych, zwanymi macierzystymi komórkami mikrospor (PMC), które otoczone są warstwą komórek tapetum. Komórki tapetum pełnią funkcje odżywcze, wytwarzają liczne materiały budulcowe wykorzystywane przez PMC podczas rozwoju i dojrzewania, szczególnie podczas tworzenia postmejotycznej ściany wokół ziaren pyłkowych. PMC dzieląc się mejotycznie przekształcają się w haploidalne mikrospory (gamety zawierające połowę, w stosunku do komórki macierzystej, liczby chromosomów w jądrze komórkowym). W tym wieloetapowym, skomplikowanym procesie zwanym mikrosporogenezą, zachodzi szereg przemian, charakterystycznych jedynie dla PMC. Podczas podziału mejotycznego następuje podział jądra komórkowego (kariokineza), która zachodzi w dwóch etapach. Pierwszym etapem jest podział redukcyjny chromosomów, a drugim podział zachowawczy – mitotyczny [1]. Podczas pierwszego etapu następuje crossing-over, w wyniku którego dochodzi do wymiany materiału genetycznego pomiędzy 1 [email protected], Zakład Anatomii i Cytologii Roślin, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Akademicka 19, 20-033 Lublin, Polska, www.umcs.pl 2 [email protected], Zakład Anatomii i Cytologii Roślin, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Akademicka 19, 20-033 Lublin, Polska, www.umcs.pl 26 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae chromosomami homologicznymi, co jest niezwykle ważnym procesem, gdyż prowadzi do zwiększenia różnorodności genotypów [2, 3, 4, 5, 6]. W trakcie mejozy oprócz kariokinezy zachodzi także nie mniej istotny proces, jakim jest chondriokineza – przemieszczanie się i rozdział do komórek potomnych organelli komórkowych oraz cytokineza – podział cytoplazmy. Chondriokinezę obserwowano już pod koniec XIX wieku a w 1938 roku została ona usystematyzowana przez Bąkowskiego [7]. Od tego czasu opisywano przemieszczanie się organelli komórkowych podczas podziału mejotycznego u wszystkich grup roślin, zarówno w męskiej jak i żeńskiej linii rozwojowej. W niniejszym opracowaniu przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat tak ważnego procesu zachodzącego podczas mejozy jakim jest przemieszczanie się i rozdział do komórek potomnych organelli komórkowych. Z procesem kariokinezy, chondriokinezy oraz cytokinezy, zarówno funkcjonalnie, jak i strukturalnie, nierozerwalnie związany jest szkielet cytoplazmatyczny komórki. Są to włókna białkowe, które w formie trójwymiarowej sieci przenikają cytoplazmę. Złożone są z polimerów strukturalnych zawierających białko zasadnicze i liczne białka dodatkowe. W skład cytoszkieletu wchodzą trzy klasy włókien, różniące się strukturą i funkcją. Mirkotubule (MT) – zbudowane z tubuliny α i β, filamenty pośrednie – włókna o zróżnicowanym składzie białkowym oraz mirkofialmenty (MF) – zbudowane z białka aktyny [za 8]. 2. Chondriokineza Podczas mejozy w mikrosporognezie organella komórkowe (chondrion) nie przemieszczają się w przypadkowy sposób ale według określonego wzorca. Proces ten jest charakterystyczny dla gatunku i niezwykle ważny, ponieważ dotyczy organelli autonomicznych, takich jak plastydy i mitochondria. Organella te uczestniczą w dziedziczeniu cytoplazmatycznym, dlatego ich precyzyjny rozdział w trakcie mejozy, warunkuje powstanie żywotnych mikrospor, natomiast zaburzenia w rozdziale tych organelli często powodują cytoplazmatyczną męską sterylność [3]. W swojej klasyfikacji Bąkowski wyróżnił u roślin cztery główne typy chondriokinezy: obojętny, otoczkowy, biegunowy oraz równikowy. Oprócz tego opisał typy pośrednie np. obojętno-otoczkowy oraz złożone np. obojętno-równikowy. Opisane przez Bąkowskiego liczne warianty wskazują na to, że istnieje duża różnorodność rodzajów przemieszczeń organelli komórkowych podczas mejozy, które są charakterystyczne dla poszczególnych gatunków roślin. Kluczowym kryterium, które stanowiło o określeniu typu chondriokinezy, było położenie organelli w dwóch fazach mejozy: metafazie I i telofazie I. Bąkowski klasyfikując chondriokinezę opierał się na pracach 27 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska pochodzących z końca XIX i początku XX wieku, dlatego zdarza się, że w późniejszych opracowaniach autorzy, u niektórych gatunków roślin zweryfikowali te dane. Jednak najnowsza literatura dotycząca przemieszczeń organelli komórkowych podczas mikrosporognezy nie jest zbyt obszerna, dlatego w niniejszej pracy szczegółowo opisano jedynie kilka typów chondriokinezy. Opisując typy chondriokinezy przytoczono przykładowe gatunki roślin, ale w związku ze skąpymi danymi, w przykładach tych nie ograniczono się jedynie do Angiospermae. Macierzyste komórki mikrospor przed mejozą zawierają cytoplazmę, bogatą w rybosomy oraz proplastydy, mitochondria, diktiosomy i kanały retikulum endoplazmatycznego (ER). Komórki takie posiadają celulozową ścianę komórkową a także połączone są ze sobą oraz ze ścianą mikrosporangium licznymi plazmodesmami. Dzięki temu procesy zachodzące na początku mikrosporogenezy w mejocytach są zazwyczaj synchroniczne w obrębie worka pyłkowego [9]. We wczesnej profazie I w mejocytach przybywa pęcherzykowatych wakuol, rozbudowują się kanały gładkiego ER i zmniejsza się ilość rybosomów co daje efekt rozrzedzenia cytoplazmy [10]. Na celulozowej ścianie takich komórek odkładana jest kaloza, polisacharyd, który otacza każdy mikrosporocyt i powoduje, że zanikają plazmodesmy [11, 12]. Już od wczesnej profazy I następują przegrupowania organelli komórkowych, które niekiedy są niezwykle dynamiczne. W mikrosporogenezie, zarówno z cytokinezą sukcesywną, jak i równoczesną, opisano różne rodzaje zgrupowań w profazowych komórkach: zgrupowania złożone z plastydów i mitochondriów – jedna lub dwie grupy [13-15]; złożone z plastydów i części mitochondriów, podczas gdy pozostałe mitochondria otaczają jadro komórkowe [14, 16, 17]; osobne zgrupowanie plastydów i osobne złożone z mitochondriów [18]; jedno zgrupowanie złożone z plastydów i mitochondriów oraz drugie po przeciwnej stronie jądra złożone z licznych cystern retikulum endoplazmatycznego [19]. Wyżej wymienione zgrupowania organelli zazwyczaj są krótkotrwałe i pod koniec profazy I lub na początku metafazy I ulegają rozproszeniu i organella przemieszczają się w sposób charakterystyczny dla danego typu chondriokinezy. Jednym z najczęściej opisywanych typów jest chondriokineza równikowa. W tym typie plastydy i mitochondria w profazie I formują dwie grupy, które widoczne są na dwóch biegunach komórki, jak to opisano u Equisetum [13], Onoclea, Stangria i Impatiens [12], a czasami na jednym biegunie np. u Nymphea [14, 15]. Zgrupowania takie obserwowano przez krótki okres profazy I a następnie pod koniec tej fazy u Nymphea organella widoczne były z jednej strony jądra w płaszczyźnie równikowej 28 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae komórki. W zgrupowaniu takim pozostawały aż do telofazy I, w której to fazie przemieszczały się i formowały równikową płytkę organelli między telofazowymi jądrami. Natomiast u Equisetum, Onoclea, Stangria i Impatiens organella komórkowe w płaszczyźnie równikowej komórki grupowały się dopiero w metafazie I gdzie widoczne były po obu stronach metafazowej płytki chromosomów. Następnie w telofazie I chondrion formował płytkę pomiędzy jadrami potomnymi i w takim położeniu organella pozostawały aż do telofazy II, gdzie formowały kolejną płytkę oddzielającą 4 jadra potomne. Można więc powiedzieć, że u gatunków opisanych powyżej, pomimo iż początkowo chondriokineza wskazywała na biegunowy charakter, to ponieważ już pod koniec profazy I lub w metafazie I organella zgrupowane były w płaszczyźnie równikowej komórki, chondriokinezę tę określamy jako równikową. Taki typ chondriokinezy opisywany był również u: Equisetum palustre [20], E. limosum [21], E. variegatum [22], E. hyemale [23], E. fluviatile [24] oraz Cypripedium californicum [25]. Schemat chondriokinezy typu równikowego przedstawia Rysunek 1. Rysunek 1. Rozmieszczenie organelli w chondriokinezie typu równikowego. A – wczesna profaza I, B – (Equisetum, Onoclea, Stangria, Impatins), B`(Nymphaea) – późna profaza I, C (Equisetum, Onoclea, Stangria, Impatins), C`(Nymphaea) metafaza I, D – anafaza I, E – telofaza I, F – telofaza II, [12, zmienione] Niewiele posiadamy doniesień odnośnie obojętnego typu chondriokinezy. Bąkowski opisuje go u mejocytów Orchis latifolius na podstawie pracy Siwickiej-Tarwidowej [26]. Jest to gatunek, u którego podczas mikrosporogenezy zachodzi mejoza z cytokinezą sukcesywną, czyli po pierwszym podziale, w telofazie II, powstaje kalozowa ściana. W tym typie chondriokinezy organella komórkowe podczas wszystkich faz mejozy rozproszone są równomiernie w cytoplazmie mejocytów. Nie tworzą one nawet, często występującego, krótkotrwałego zgrupowania w komórkach profazowych. Schemat obojętnego typu chondriokinezy przedstawia Rysunek 2. 29 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska Rysunek 2. Rozmieszczenie organelli w chondriokinezie typu obojętnego. A – wczesna profaza I, B – metafaza I, C – anafaza I, D – telofaza I, E – metafaza II, F – telofaza II [12, zmienione] Jednym ze złożonych typów jest chondriokineza obojętno-równikowa. W tym typie chondriokinezy, obserwowanej w mikrosporogenezie z cytokinezą równoczesną, organella komórkowe są równomiernie rozmieszczone w cytoplazmie komórek profazowych (Fot. 1a). W takim rozproszeniu pozostają aż do anafazy I, w której to fazie stopniowo, przemieszczają się do płaszczyzny równikowej komórki. W telofazie I powstaje równikowa płytka organelli pomiędzy jądrami potomnymi. Często obserwowano, że w płytce takiej organella ułożone są w charakterystyczne warstwy: plastydy-mitochondria-plastydy (Fot. 1b). W takim ułożeniu pozostają aż do anafazy II gdy przemieszczają się pomiędzy formujące się cztery jądra potomne, aby w telofazie II oddzielić je od siebie (Fot.1c). Pod koniec telofazy II powstaje przegroda pierwotna, następnie ściana komórkowa, a organella komórkowe przemieszczają się w kierunku jąder potomnych (Fot. 1d). Taki typ chondriokinezy opisano u Tropaeolum peregrinum [27], Ginkgo biloba [28], Psilotum nudum [29, 30] oraz Arabidopsis thaliana [31]. Schemat chondriokinezy typu obojętno-równikowego w mikrosporogenezie z cytokinezą równoczesną przedstawia Rysunek 3. Obojętno-równikowa chondriokineza, opisywana była także u Larix decidua i Tradescantia virginica [12, 32], oraz obserwowano ją u Tinantia erecta (obserwacje własne, niepublikowane). U tych gatunków podczas mikrosporogenezy zachodzi cytokineza sukcesywna. W tym przypadku organella komórkowe w pierwszym podziale mejotycznym zachowują się tak samo, jak w wyżej opisanej chondriokinezie. W profazowych mejocytach aż do anafazy I są one równomiernie rozmieszczone w cytoplazmie (Fot. 2a, b) a następnie stopniowo, przemieszczają się do płaszczyzny równikowej komórki. W telofazie I także powstaje równikowa płytka organelli pomiędzy jądrami potomnymi (Fot. 2c). Jednak pod koniec telofazy I, w obrębie płytki organelli, powstaje kalozowa ściana, i drugi podział mejotyczny odbywa się w diadzie – dwukomórkowym mejocycie (Fot. 2d). W diadzie organella komórkowe rozpraszają się w cytoplazmie i tak rozproszone pozostają do późnej anafazy II, kiedy to znowu stop- 30 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae niowo grupują się w płaszczyźnie równikowej komórki. W telofazie II powstaje ściana pomiędzy jądrami potomnymi (Fot. 2e). Można powiedzieć, że uformowanie po pierwszym podziale mejotycznym ściany, warunkuje rozproszenie się oragnelli komórkowych w cytoplazmie mejocytów. Schemat chondriokinezy typu obojętno-równikowego w mikrosporogenezie z cytokinezą sukcesywną przedstawia Rysunek 4. Fot. 1. Dzielące się mejotycznie komórki Psilotum nudum L. a – wczesna profaza I, b – telofaza I (P – plastyd, M – mitochondrium), c – wczesna telofaza II, d – późna telofaza II [a, c, d – 29, b – 30] Rysunek 3. Rozmieszczenie organelli w chondriokinezie typu obojętno-równikowego. A – profaza I, B – metafaza I, C – anafaza I, D – telofaza I, E – metafaza II, F – telofaza II [7, zmienione] 31 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska Rysunek 4. Rozmieszczenie organelli w chondriokinezie typu obojętno-równikowego w mikrosporogenezie z cytokinezą sukcesywną. A – wczesna profaza I, B – anafaza I, C – wczesna telofaza I, D – późna telofaza I, E – metafaza II, F – telofaza II [7, zmienione] Fot. 2. Dzielące się mejotycznie komórki Tinantia erecta. a – wczesna profaza I, b – metafaza I, c – późna anafaza I, d – telofaza I, e – telofaza II [fot. własne, niepublikowane] Jednym z czterech głównych typów wg. klasyfikacji Bąkowskiego jest chondriokineza biegunowa. W tej chondriokinezie organella komórkowe w trakcie późnej profazy I gromadzą się na przeciwległych biegunach komórki. W takich biegunowych skupieniach pozostają aż do telofazy I. W późnej telofazie I, kiedy to uformowana zostaje ściana komórkowa i powstaje diada, następuje rozproszenie organelli komórkowych, i tak równomiernie rozproszone w cytoplazmie mejocytu pozostają one aż do końca mejozy. Chondriokinezę biegunową opisał Bąkowski na podstawie prac: Allen [33] i Motte [34], którzy obserwowali ją u Polytrichum 32 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae juniperinum, poza tym opisano ją u Vicia faba [35] oraz Iris olbiensis [36]. Schemat chondriokinezy typu biegunowego obserwowanej podczas mikrosporogenezy z cytokinezą sukcesywną przedstawia Rysunek 5. Rysunek 5. Rozmieszczenie organelli w chondriokinezie typu biegunowego. A – wczesna profaza I, B – późna profaza I, C – metafaza I, D – wczesna telofaza I, E– późna telofaza I, F – metafaza II, G – wczesna telofaza II, H – późna telofaza II [7, zmienione] Kolejnym rodzajem chondriokinezy jest typ otoczkowy, który charakterystyczny jest dla gatunków z rodziny Malvaceae. Obserwowano go u Malva sylvestris i Lavatera trimestris [37], Lavatera thuringiaca [38, 39] oraz u Gossypium arboreum i Alcea rosea [39]. W tym typie chondriokinezy organella komórkowe wprawdzie na początku profazy I rozproszone są równomiernie w cytoplazmie (Fot. 3a), ale pod koniec tej fazy gromadzą się w formie wyraźnej warstwy otaczającej jądro komórkowe. Od tego momentu kariokineza zarówno w pierwszym, jak i w drugim podziale mejotycznym odbywa się w cytoplazmie ograniczonej przez otoczkę organelli komórkowych. W metafazie I organella otaczają zwartą warstwą wrzeciono kariokinetyczne wraz z metafazowymi chromosomami (Fot. 3b). Podczas anafazy I następuje chwilowe rozproszenie organelli, aż do momentu, gdy w telofazie I formowane są dwa jądra potomne. W tym czasie oragnella ponownie grupują się wokół jąder i otaczają je zwartą warstwą. Drugi podział mejotyczny również zachodzi wewnątrz otoczek złożonych głównie z plastydów i mitochondriów (Fot. 3c). Sytuacja powtarza się w anafazie II i w konsekwencji wokół każdego z czterech nowo powstałych jąder formowana jest otoczka złożona z organelli komórkowych. Okazuje się, że w tym typie chondriokinezy organella nie ulegają rozproszeniu zaraz po zakończeniu mejozy. Nawet po rozpadzie tetrady na pojedyncze mikrospory u gatunków z rodziny Malvaceae obserwowano organella komórkowe 33 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska zgrupowane wokół jądra [38, 39]. Schemat chondriokinezy typu otoczkowego obserwowanej podczas mikrosporogenezy przedstawia Rysunek 6. Fot. 3. Dzielące się mejotycznie komórki Lavatera thuringiaca L., a – wczesna profaza I, b – metafaza I, c – metafaza II [38] Rysunek 6. Rozmieszczenie organelli w chondriokinezie typu otoczkowego. A – wczesna profaza I, B – późna profaza I, C – metafaza I, D – telofaza I, E – metafaza II, F – telofaza II [12, zmienione] Otoczkowo-równikowy typ należy do złożonych rodzajów chondriokinezy. Opisano go u Nephrodium molle [40] oraz Chondrilla juncea [41]. W tym typie chondriokinezy organella komórkowe początkowo rozproszone w cytoplazmie pod koniec profazy I skupiają się w formie otoczki wokół jądra komórkowego. Podobnie jak w otoczkowym typie, pierwszy podział mejotyczny zachodzi w obrębie przestrzeni zamkniętej przez organella komórkowe. Jednak w anafazie I, odmiennie niż w opisanym powyżej typie otoczkowym, organella ulegają rozproszeniu i w telofazie I grupują się 34 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae w formie płytki w płaszczyźnie równikowej komórki, pomiędzy jądrami potomnymi. Od tego momentu chondriokineza przebiega tak jak w typie równikowym. Schemat chondriokinezy typu otoczkowo- równikowego przedstawia Rysunek 7. Rysunek 7. Rozmieszczenie organelli w chondriokinezie typu otoczkowo-równikowego. A – wczesna profaza I, B – późna profaza I, C – metafaza I, D – telofaza I, E – metafaza II, F – telofaza II [7, zmienione] 3. Cytokineza Podczas mejozy w procesie mikrosporogenezy zachodzi również cytokineza – podział cytoplazmy poprzez uformowanie ściany komórkowej. W zależności od fazy mejozy, w której proces ten następuje, wyróżniamy cytokinezę równoczesną lub sukcesywną. Natomiast płaszczyzna podziału komórki zależy od położenia jądra, które definiuje podział cytoplazmy poprzez MT i MF fragmoplastu formujące się od otoczki jądrowej [42, 43, 44, 45]. Cytokineza sukcesywna jest typowa dla większości mszaków, paprotników, nagonasiennych i okrytonasiennych jednoliściennych, natomiast równoczesna cytokineza zachodzi podczas mejozy u większości okrytonasiennych dwuliściennych [46, 47, 48, 49]. W związku z tym, że cytokineza sukcesywna występuje u mszaków Davis [46] sugeruje, że jest ona prymitywniejsza od cytokinezy równoczesnej. W cytokinezie sukcesywnej ściana zakłada się już po pierwszym podziale mejotycznym, w telofazie I. Pomiędzy jądrami potomnymi gromadzone są pęcherzyki pochodzące z aparatu Golgiego i retikulum endoplazmatycznego, zawierające prekursory ściany [50]. Grupowanie tych pęcherzyków może następować od środka mejocytu do jego brzegów – odśrodkowo (centryfugalnie), lub dośrodkowo (centrypetalnie). W telofazowych mejocytach pomiędzy jądrami potomnymi, odśrodkowo formowana jest bogata w kalozę ściana, a drugi podział mejotyczny zachodzi w diadzie, czyli dwukomórkowym mejocycie (Fot. 4a). Następnie pod koniec telofazy II (Fot. 4b), w każdej z komórek diady także odśrodkowo formowana jest ściana pierwotna [41, 51]. W sukcesywnym typie cytokinezy zazwyczaj obie cytokinezy są centryfugalne, co opisywano m. in. u Zea mays, Tradescantia czy Triticum [za 52]. 35 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska Fot. 4. Cytokineza w dzielących się mejotycznie komórkach Allium ampeloprasum L., a – profaza II (diada), b – telofaza II, c – tetrada mikrospor. Mikroskop świetlny z kontrastem Nomarskiego, preparty gniecione, barwione acetokarminem [fot. własne, niepublikowane] W przypadku cytokinezy równoczesnej drugi podział mejotyczny odbywa się w obrębie jednej komórki – w dwujądrowym mejocycie. W takiej komórce organella grupujące się w miejscach przyszłych przegród pierwotnych, zastępują niejako ścianę, rozdzielając przestrzenie, w których zachodzi kariokineza. Ściana komórkowa formowana jest w telofazie II, wzdłuż wewnętrznej warstwy płytki organelli (Fot. 1d). W tym typie cytokinezy kierunek tworzenia ściany komórkowej może następować odśrodkowo co obserwowano u Helleborus i Schisandra [za 52]. Dośrodkowy, centrypetalny kierunek, opisywany był u Magnolia kobus [53]. Schemat cytokinezy sukcesywnej i równoczesnej przedstawia Rysunek 8. Rysunek 8. Schemat przedstawiający cytokinezę: A – sukcesywna, B – równoczesna [52, zmienione] U Angiospermae powstałe tuż po podziale mejotycznym 4 mikrospory, otoczone są wspólną kalozową ścianą i ułożone są względem siebie w charakterystyczny sposób. Wyróżniamy ułożenie tetrad liniowe, romboidalne, czworokątne, krzyżowe, tetraedryczne lub w kształcie litery T. W wyniku cytokinezy sukcesywnej najczęściej powstają tetrady ułożone liniowo, tetragonalnie lub w kształcie litery T. Po cytokinezie równoczesnej występuje ułożenie tetragonalne, romboidalne lub tetraedryczne [54, 55]. Zróżnicowanie ułożenia mikrospor w tetradzie przedstawia Rysunek 9. 36 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae Rysunek 9. Schemat przedstawiający układ komórek w tetradach mikrospor po cytokinezie: A – sukcesywnej, B – równoczesnej. Ułożenie tetrad: c – liniowe, d – w kształcie litery T, e – tetragonalne, f – romboidalne, g – tetraedralne [55, zmienione] 4. Cytoszkielet w mikrosporogenezie Bardzo ważną rolę na każdym etapie mikrosporogenezy odgrywa szkielet cytoplazmatyczny. Zaburzenia w formowaniu prawidłowych konfiguracji cytoszkieletu podczas mikrosporogenezy w konsekwencji prowadzą do powstania niepłodnych ziaren pyłku [56, 57] lub nawet aborcji PMC [30, 38, 58, 59]. Szczegółowe badania z wykorzystaniem nowoczesnych metod immunocytochemicznego znakowania cytoszkieletu, pozwoliły na opisanie wielu konfiguracji mikrotubul i mikrofilamentów, które pojawiają się podczas mejozy i są charakterystyczne dla poszczególnych gatunków roślin. W związku z tym, że cytoszkielet odgrywa bardzo ważną rolę nie tylko w kariokinezie, ale także w chondriokinezie i cytokinezie, poniżej opisano konfiguracje obserwowane podczas mikrosporogenezy. Z konieczności ograniczono się jedynie do głównych i najbardziej typowych konfiguracji. W odróżnieniu od podziału mitotycznego przed mejotyczną profazą I, pod koniec fazy G2 cyklu życiowego komórki, nie powstaje pierścień preprofazowy, który w mitozie wyznacza płaszczyznę podziału komórki [60, 61, 62, 63, 64]. Na początku mejozy, we wczesnej profazie I, następuje rozpad kortykalnej sieci mikrotubul i w cytoplazmie mejocytu pojawia się tubulina w postaci drobnych ziaren i krótkich odcinków. W diplotenie odcinki takie gromadzą się wokół jądra w stycznym i radialnym ułożeniu, a w diakinezie formowane są polarne (biegunowe) włókna wrzeciona kariokinetycznego, znajdujące się pomiędzy grupami chromosomów homologicznych. We wczesnej metafazie I widoczne są całe pęczki mikrotubul, które polimeryzują na kinetochorach biwalentów, tworząc włókna kinetochorowe wrzeciona kariokinetycznego. Dzięki skracaniu poprzez depolimeryzację takich włókien, w anafazie I i II następuje przesuwanie chromosomów homologicznych do przeciwległych biegunów komórki. 37 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska W telofazie I i II MT biegunowe wrzeciona kariokinetycznego także ulegają depolimeryzacji a pomiędzy jądrami potomnymi pojawiają się mikrotubule, które formują tzw. fragmoplast. Mikrotubule fragmoplastu wydłużają się od otoczki jądrowej powstałych jąder i stykają na tzw. „zakładkę” w płaszczyźnie równikowej komórki. Ta konfiguracja cytoszkieletu odpowiada za transport substancji budujących kalozową ścianę w cytokinezie sukcesywnej oraz za formowanie równikowej płytki organelli komórkowych w cytokinezie równoczesnej. W tym ostatnim typie cytokinezy w telofazie II pomiędzy jądrami potomnymi powstaje czterobiegunowy fragmoplast, związany z dystansowaniem jąder potomnych i wytworzeniem przegrody pierwotnej [65]. Formowana jest ściana komórkowa w efekcie czego powstają 4 mikrospory z radialnym okołojądrowym układem mikrotubul. Natomiast w mejozie z cytokinezą sukcesywną w telofazie II nie tworzy się czterobiegunowy fragmoplast, lecz dwa oddzielne uformowane pomiędzy jądrami potomnymi [za 8, 25, 64, 66].Ostatecznie powstaje tetrada mikrospor z centralnie położonym jadrem i radialnie ułożonymi wokół niego mikrotubulami [67]. W dojrzałych mikrosporach, w których centralnie położona jest wakuola, jądro znajduje się w pobliżu plazmolemy a cytoszkielet formuje sieć w cytoplazmie i otacza jądro. Uważa się, że przemieszczanie jądra zależy zarówno od rozwijającej się wakuoli, jak i od mikrotubul okołojądrowych [68, 69]. W trakcie mejozy we wszystkich konfiguracjach mikrotubulom towarzyszą mikrofilamenty. Są one współzależne nie tylko strukturalnie, ale także funkcjonalnie. Wzajemne oddziaływanie MT i MF ma miejsce nawet pomiędzy ich monomerami [70]. Jednakże oprócz typowych dla MT konfiguracji, mikrofilamenty, we wszystkich fazach mejozy, w formie bardzo gęstej sieci przenikają cytoplazmę mejocytu, otaczając organella komórkowe [za 8, 30, 61, 71]. 5. Podsumowanie Podsumowując można stwierdzić, że opisywane przegrupowania organelli komórkowych podczas podziału mejotycznego, przebiegają w sposób uporządkowany. Poszczególne typy chondriokinezy są charakterystyczne dla dużych grup roślin np. dla rodziny. Uważa się, że grupowanie i przemieszczanie się organelli jest niezwykle ważne nie tylko dla precyzyjnego rozdziału ich do komórek potomnych, ale także dla prawidłowego przebiegu mejozy. Takie struktury jak równikowa płytka organelli (w telofazie I i II) oraz otoczka (w chondriokienzie otoczkowej), spełniają podobne funkcje – wyznaczają obszary, w których zachodzi kariokineza. Zgrupowania organelli zapobiegają np. fuzji jąder w telofazie I, a następnie separują wrzeciona kariokinetyczne w metafazie II oraz telofazowe jądra w telofazie II. Hipotezę tą potwierdza fakt, że w mejozie z cytokinezą sukcesywną, organella komórkowe także grupują się i tworzą równikową płytkę w telofazie I, jednak tylko do momentu, gdy pod koniec telofazy I 38 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae powstaje kalozowa ściana. Po utworzeniu ściany, organella ulegają równomiernemu rozproszeniu w cytoplazmie obu komórek diady. W związku z tym można powiedzieć, że istnieje ścisła zależność pomiędzy typem chondriokinezy i rodzajem cytokinezy w mejozie podczas mikrosporogenezy. Ponadto, pragniemy podkreślić, że nie tylko proces kariokinezy, ale także chondriokinezy i cytokinezy, na każdym etapie mejozy, jest ściśle związany z MT i MF formującymi w cytoplazmie mejocytów kolejne konfiguracje [30, 38, 72]. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Villeneuve A. M., Hillers K. J. Whence meiosis?, Cell., 106 (2001), s. 647-650 Olszewska M., Małuszyńska J., Rogalska S. Podstawy cytogenetyki roślin, Warszawa, Wydawnictwo Naukowe PWN, 1999 Majewska-Sawka A., Sadoch Z. Cytoplazmatyczna męska sterylność roślin – mechanizmy biologiczne i molekularne, Kosmos. Problemy Nauk Biologicznych., 52 (4) (2003), s. 413-423 Zienkiewicz K., Bednarska E. Genetyczna i molekularna charakterystyka mikrosporogenezy u roślin okrytonasiennych, Postępy Biologii Komórki., 33 (2006), s. 555-581 Harrison C. J., Alvey E., Henderson I. R. Meiosis in flowering plants and other greenorganisms, Journal of Experimental Botany., 61 (2010), s. 2863-2875 Wijnker E., Schnitter A. Control of the meiotic cell division program in plants, Plant Reproduction., 26 (2013), s.143-158 Bąkowski Z. Versuch einer Klassifizierung der Chondriokinese bei Kormophyten, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 15 (1938), s. 323-369 Schliwa M. The cytoskleleton. An introductory survey, Cell Biology Monographs, 13 (1986), s. 5-130 Heslop-Harrison J. Cytoplasmic connexions between angiosperm meiocytes, Annals of Botany, 30 (1966), s. 221-230 Bednara J., Sokołowska-Kulczycka A. Ultrastruktura tapetum i pyłku Stellaria media L., Societas Scientiarum Lodziensis, 34 (4) (1980), s. 1-4 Giełwanowska I. Przemieszczenia organoidów w sporogenezie Equisetum L., Praca doktorska, UMCS, Lublin 1985 Rodkiewicz B., Duda E. Aggregations of organelles in meiotic cells of higher plants, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 57(4) (1988), s. 637-654 Bednara J., Giełwanowska I., Rodkiewicz B. Regular arrangements of mitochondria and plastids during sporogenesis in Equisetum, Protoplasma., 130 (1986), s. 145-152 Rodkiewicz B., Duda E., Kudlicka K. Organelle aggregations during microsporogenesis in Stangeria, Nymphaea and Malva, [W]: Cresti M., Gori P., Pacini E. (eds)., Sexual Reproduction of Higher Plants, Springer-Verlag, Wien, 1988, s. 175-180 Rodkiewicz B., Duda E., Bednara J. Organelle aggregations during microsporogenesis in Nymphea, Flora, 183 (1988), s. 397-404 Rodkiewicz B., Bednara J., Duda E., Mostowska A. Cytoplasmic organelles during meiosis I in microsporocytes of Stangeria, Annales de l'Université et de l'ARERS Reims, 23 (1988), s. 48-50 39 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska 17. Rodkiewicz B., Bednara J., Kuraś M., Mostowska A. Organelles and cell walls of microsporocytes in a cycad Stangeria during meiosis I, Phytomorphology, 38 (2,3) (1988), s. 99-110 18. Audran J. C. Contribution à l‟étude morphologique et cytologique de la formation du grain de pollen chez le Stangeria paradoxa, Comptes Rendus de l'Académie des Science Paris, 258 (1964), s. 4322-4325 19. Bednara J., Rodkiewicz B. Cytoplasmic organelles in microsporocytes of Larix and sporocytes of Polystichum, Annales de l'Université et de l'ARERS Reims, 23 (1988), s. 51-53 20. Lewitsky G. Die chondriosomen in der Gonogenese bei Equisetum palustre L., Planta, 1 (1926), s. 301-316 21. Jungers V. Mitochondries, chromosomes et fuseau dans les sporocytes de l`Equisetum limosum, La Cellule, 43 (1934), s. 321-340 22. Lenoir M. Étude vitale de la sporogénèse et des phénomènes d'apparence électro-magn étiques concomitants chez l'Equisetum variegatum, La Cellule, 42 (1934), s. 355-408 23. Bednara J., Rodkiewicz B. Distribution of plastids and mitochondria during sporogenesis in Equisetum hyemale, [W]: Sexual reproduction in seed plants, ferns and mosses, Willemse M. T. M., van Went J. L. (eds.) Pudoc, Wageningen, 1985, s. 17-19 24. Lehmann H., Neidhart K. M., Schlenkermann G. Ultrastructural investigations on sporogenesis in Equisetum fluviatile, Protoplasma, 123 (1984), s. 38-47 25. Brown R. C., Lemmon B. E. Nuclear cytoplasmic domains, microtubules and organelles in microsporocytes in slipper orchid Cypripedium californicum A. Gray dividing by simultaneous cytokinesis, Sexual Plant Reproduction, 9 (1996), s. 145-152 26. Siwicka-Tarwidowa H. Sur l'evolution du chondriome pendant le développement du sac embryonnaire de L'orchis latifolius L., Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 11(4) (1934), s. 511-539 27. Sugiura T. Cytological studies on Tropaeolum. II Tropaeolum perigrinum, The Botanical Magazine Tokio, 42 (1928), s. 553-556 28. Wolniak S. M. Organelle distribution and apportionment during meiosis in the microsporocyte of Ginkgo biloba, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 63 (1976), s. 251-258 29. Tchórzewska D., Brukhin V. B., Bednara J. Plastids and mitochondria comportment in dividing meiocytes of Psilotum nudum, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 65 (1-2) (1996), s. 91-96 30. Tchórzewska D., Bednara J. The dynamics of the actin cytoskeleton during sporogenesis in Psilotum nudum L., Protoplasma, 248 (2011), s. 289-298 31. Brownfield L., Yi J., Jiang H., Minina E. A., Twell D., Köhler C. Organelles maintain spindle position in plant meiosis, Nature Communications, 6 (2015), s. 1-9 32. Rodkiewicz B., Kudlicka., Stobiecka H. Patterns of amyloplast distribution during microsporogenesis in Tradescantia, Impatiens and Larix, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 53 (1984), s. 437-441 33. Allen Ch. E. Cell structure, growth and division in the antheridia of Polytrichum juniperinum Willd, Archiv für Zellforschung, 8 (1912), s. 88-121 34. Motte J. Contribution à la connaissance cytologique des Muscinées. Annales des Sciences Naturelles, Botanique 10th., 10 (1928), s. 293-543 40 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae 35. Nĕmec B. Nauka o buñce. Anatomie rostlin – Rostlinopis sv II, Praha Aventinum, 1930 36. Kozłowski A. O powstaniu plastydów z chondriozomów w komórkach roślinnych, Rozprawa Wydziału Matematyczno-Przyrodniczego Polskiej Akademii Umiejętności Dział B, 59 (1919), s. 97-133 37. Kudlicka K., Rodkiewicz B. Organelle coatings of meiotic nuclei during microsporogenesis in Malvaceae, Phytomorphology, 40 (1990), s. 33-41 38. Tchórzewska D., Pietrusiewicz J., Winiarczyk K., Bednara J. A new type of microtubular cytoskeleton in microsporogenesis of Lavatera thuringiaca L., Protoplasma, 232 (2008), s. 223-231 39. Tchórzewska D., Pietrusiewicz J., Winiarczyk K. Organelle aggregations during microsporogenesis with simultaneous cytokinesis in species from the family Malvaceae (Gossypium arboreum, Alcea rosea, Lavatera thuringiaca), Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska, sectio C, LXVIII 2 (2013), s. 35-44 40. Senjaninova M. Chondriokinese bei Nephrodium molle, Zeitschrift für Zellforschung und mikroskopische Anatomie, 6 (1927), s. 493-508 41. Kościńska-Pająk M., Bednara J. Microtubule patterns and organelles during microsporogenesis in apomictic Chondrilla juncea L., Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 45(2) (2003), s. 175-182 42. Brown R. C., Lemmon B. E. Pollen development in orchids 1. Cytoskeleton at the control of division plane in irregular patterns of cytokinesis, Protoplasma, 163 (1991), s. 8-18 43. Brown R. C., Lemmon B. E. Pollen development in orchids 2. The cytokinetic apparatus in simultaneous cytokinesis, Protoplasma, 165 (1991), s. 155-166 44. Brown R. C., Lemmon B. E. Cytoplasmic domain: A model for spatial control of cytokinesis in reproductive cells of plants, Electron Microscopy Society of America Bulletin, 22 (1992), s. 48-53 45. Brown R. C., Lemmon B. E. Nuclear cytoplasmic domains, microtubules and organelles in microsporocytes in slipper orchid Cypripedium californicum A. Gray dividing by simultaneous cytokinesis, Sexual Plant Reproduction, 9 (1996), s. 145-152 46. Davis G. L. Systematic embryology of the Angiosperms New York, John Wileyons, 1966 47. Sheffield E., Bell P. R. Current studies of the Pteridophyte life cycle, The Botanical Review, 53 (1987), s. 242-290 48. Brown R. C., Lemmon B. E. Sporogenesis in Bryophytes, Advances in Bryology, 3 (1988), s. 159-223 49. Kapil R. N., Bhatnagar A. K. Embryological evidence in angiosperm classification and phylogeny, Botanische Jahrbücher fur Systematik, 113 (1991), s. 309-538 50. Verma D. P. S., Gu X. Vesicle diynamics during cell-plate formation in plants, Trends in Plant Science, 6(5) (1996), s. 145-149 51. Furness C. A., Rudall P. J., Microsporogenesis in Monocotyledons, Annals of Botany, 84 (1999), s. 475-499 52. Rodkiewicz B., Śnieżko R., Fyk B., Niewęgłowska B., Tchórzewska D. Embriologia Angiospermae rozwojowa i eksperymentalna, Lublin, Wydawnictwo UMCS, 1996 53. Stoudt H. N. Sporogenesis in Magnolia kobus DC I Microsporogenesis, Proceedings of the Pennsylvania Academy of Science, 33 (1960), s. 29-33 41 Rafał Marciniec, Dorota Tchórzewska 54. Rodkiewicz B., Bednara J., Giełwanowska I. The changing arrangement of plastid and mitochondria in meiotic cells of higher plants, Postępy Biologii Komórki, 12 (1985), s. 129-144 55. De Storme N., Geelen D. Cytokinesis in plant male meiosis, Plant Signaling & Behavior, 8:3 (2013), s. 1-9 56. Lopez-Lavalle L. A., Orjeda G. Occurrence and cytological mechanism of 2n pollen formation in a tetraploid accession of Ipomoea batatas (sweet potato), Journal of Heredity, 93 (2002), s. 185-192 57. Pecrix Y., Rallo G., Folzer H., Cigna M., Gudin S. Le Bris M. Polyploidization mechanisms: temperature environment can induce diploid gamete formation in Rosa sp., Journal of Experimental Botany, 62 (2011), s. 3587-3597 58. Tang Z. H., Zhang L. P., Yang D., Zhao C. P., Zheng Y. L. Cold stresscontributes to aberrant cytokinesis during male meiosis I in a wheat thermosensitive genic male sterile line, Plant, Cell & Environment, 34 (2011), s. 389-405 59. De Storme N., Geelen D. The Impact of environmental stress on male reproductive development in plants: biological processes and molecular mechanisms, Plant, Cell and Environment, 37 (2014), s. 1-18 60. Clapham D.H., Ostergren G. Immunocytochemistry of tubulin at meiosis in Tradescantia by a protein-A gold method, Hereditas, 101 (1984), s. 37-142 61. van Lammeren A. A. M., Bednara J., Willemse M. T. M. Organization of the actin cytoskeleton during pollen development in Gasteria verrucosa (Mill.) H. Duval. visualized with rhodamine-phalloidin, Planta, 178 (1989), s. 531-539 62. Sheldon J. M., Dickinson H. G. Pollen wall formation in Lilium: the effect of chaotropic agents, and the organization of the microtubular cytoskeleton during pattern development, Planta, 168 (1986), s. 11-23 63. Brown R. C., Lemmon B. E. Minispindles and cytoplasmic domains in microsporogenesis of orchids, Protoplasma, 148 (1989), s. 26-32 64. Tanaka I. Microtubule-determined plastid distribution during microsporogenesis in Lilium longiflorum, Journal of Cell Science, 99 (1991), s. 21-31 65. Hogan C. J. Microtubule patterns during meiosis in two higher plant species, Protoplasma, 198 (1987), s. 126-136 66. Sheldon J. M., Hawes C. The actin cytoskeleton during male meiosis in Lilium, Cell Biology International Reports, 12 (1988), s. 471-476 67. Dickinson H. G., Sheldon J. M. A radial system of microtubules extending between the nuclear envelope and the plasma membrane during early male haplophase in flowering plants, Planta, 161(1) (1984), s. 86-90 68. Terasaka O., Niitsu T. Unequal cell division and chromatin differentiation in pollen grain cells. II: microtubule dynamics associated with the unequal cell division, Journal of Plant Research, 103 (1990), s. 133-142 69. Brown R. C., Lemmon B. E. Pollen development in orchids. 3. A novel generative pole microtubule system predicts unequal pollen mitosis, Journal of Cell Science, 99 (1991), s. 273-281 70. Verkhovsky A. B., Surgucheva I. G., Gelfand V. I., Rosenblatt V. A. G-actintubulin interaction, FEBS Letters, 135 (1981), s. 290-294 71. Traas J. A., Burgain S., Dumas de Vaulx R. The organization of the cytoskeleton during meiosis in eggplant (Solanum melongena L.): microtubules and F-actin are both necessary for coordinated meiotic division, Journal of Cell Science, 92 (1989), s. 541-550 42 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae 72. Bednara J., Rodkiewicz B., Szczuka E. The cytoskeleton, organelles and rudimentary cytokinesis I in the sporogenesis of simultaneous type in Equisetum, Nymphaea and Delphinium, Advances in plant reproductive biology, (1995), s. 9-16 Chondriokineza i cytokineza podczas mikrosporogenezy u Angiospermae Streszczenie Rozmnażanie płciowe to nie tylko rozwój i rozprzestrzenianie się organizmów ale także, poprzez nieograniczone fluktuacje genetyczne, możliwość organizmu do szybkiego reagowania na zmiany środowiskowe. U roślin okrytonasiennych (Angiospermae) w pylnikach, z komórek sporogennych zwanych macierzystymi komórkami mikrospor (PMC), powstają męskie komórki rozrodcze (mikrospory). Powstają one w wyniku podziału mejotycznego podczas wieloetapowego, skomplikowanego procesu zwanego mikrosporogenezą. Mejoza, której podlegają PMC, składa się nie tylko z kariokinezy, ale również z chondriokinezy i cytokinezy. Wyróżniono cztery główne typy chondriokinezy u roślin: obojętny, otoczkowy, biegunowy oraz równikowy, a także typy pośrednie np. obojętno-otoczkowy oraz złożone takie jak np. obojętno-równikowy. Grupujące się w sposób charakterystyczny podczas mejozy organella komórkowe, rozdzielają przestrzenie, w których zachodzi kariokineza, warunkując prawidłowy jej przebieg. Ponadto dzięki zgrupowaniom, możliwy jest precyzyjny rozdział organelli do komórek potomnych. Jest to niezwykle ważne, ponieważ dotyczy głównie organelli autonomicznych takich jak plastydy i mitochondria, które uczestniczą w dziedziczeniu cytoplazmatycznym, co warunkuje powstanie żywotnych mikrospor. Cytokineza to podział cytoplazmy. W związku z fazą mejozy, w której powstaje ściana komórkowa możemy wyróżnić cytokinezę sukcesywną i równoczesną. Na każdym etapie mejozy istotną rolę odgrywa szkielet cytoplazmatyczny komórki, złożony głównie z mikrotubul i mikrofilamentów. Stanowi on dynamiczny układ ulegający przekształceniom oraz warunkujący prawidłowy przebieg kariokinezy, chondriokinezy i cytokinezy. Słowa kluczowe: mikrosporogeneza, chondriokineza, cytokineza, Angiospermae Chondriokinesis and cytokinesis during microsporogenesis in Angiospermae Abstract Sexual reproduction ensures not only development and spread of organisms but also, through indiscriminate genetic fluctuations, an ability of the organism to respond quickly to environmental changes. In angiosperms (Angiospermae), male reproductive cells (microspores) develop in anthers from sporogeneous cells referred to as parental microspore cells (PMC). They emerge through meiotic division during a complex multi-step process called microsporogenesis. Meiosis that takes place in PMC consists of not only karyokinesis but also chondriokinesis and cytokinesis. Four main types of chondriokinesis, i.e. neutral, capsular, polar, and equatorial as well as intermediate types, e.g. neutral-equatorial, have been distinguished in plants. Cell organelles clustered in the characteristic manner during meiosis separate spaces where karyokinesis takes place, thereby determining a normal course of the process. Moreover, precise distribution of organelles into daughter cells is possible thanks to the clustering. This is extremely important mainly for autonomous organelles such as plastids and mitochondria, which are involved in cytoplasmic inheritance and determine formation of viable microspores. Cytokinesis is the division of the cytoplasm. In relation to the meiosis phase in which the cell wall is formed, successive and simultaneous cytokinesis are distinguished. In each meiosis stage, the cell cytoplasmic skeleton mainly composed of microtubules and microfilaments plays an important role. It forms a dynamic system undergoing transformations and determining the normal course of karyokinesis, chondriokinesis, and cytokinesis. Key words: microsporogenesis, chondriokinesis, cytokinesis, Angiospermae 43 Małgorzata Budzeń1 Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin 1. Wstęp Proces kiełkowania nasion ma znaczący wpływ na kształtowanie siewek oraz ich późniejszy rozwój. Z tego względu dla przemysłu nasiennego badanie nasion pod kątem żywotności jest podstawą monitorowania ich potencjału fizjologicznego, zarówno podczas etapu składowania, jak i po wysianiu [1]. W celu zwiększenia wydajności produkcji rolnej zachodzi potrzeba stosowania zabiegów uszlachetniających materiał siewny. Do metod, które przyczyniają się do poprawy parametrów kiełkowania, a jednocześnie są bezpieczne dla środowiska, należy stosowanie czynników fizycznych [2, 3], które wpływają na przebieg reakcji fizjologicznych i biochemicznych w nasieniu. Może to skutkować przyspieszeniem procesu kiełkowania [4, 5, 6, 7]. Wielu badaczy podjęło problematykę oceny oddziaływania na materiał siewny różnych czynników fizycznych jak np.: promieniowanie laserowe, stałe i zmienne pole magnetyczne i elektryczne, promieniowanie jonizujące pochodzące ze źródeł promieniotwórczych, mikrofalowe, jak również ultradźwięki, jako metody polepszające materiał siewny. Odpowiedni dla danego gatunku dobór czynników fizycznych może przyczynić się do uzyskania wydajniejszego plonowania roślin [8-12]. 2. Cel pracy W pracy zaprezentowano wyniki badań różnych autorów dotyczące stosowania czynników fizycznych w postaci pola elektrycznego i ultradźwięków, na kiełkowanie nasion i wzrost różnych gatunków roślin. Omawiane czynniki nie są tak powszechnie stosowane jak promieniowanie laserowe czy też pole magnetyczne. Jednakże w literaturze naukowej pojawia się coraz więcej doniesień na temat pozytywnego oddziaływania ultradźwięków i pól elektrycznych na nasiona roślin uprawnych. Stosowanie ich jest zatem alternatywą dla czynników mających negatywny wpływ na środowisko. Wykorzystanie pól elektrycznych [29, 30, 33, 34] oraz ultra1 [email protected], Katedra Fizyki, Wydział Inżynierii Produkcji, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 44 Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin dźwięków [6, 12, 25] w większości przypadków wpływa pozytywnie na proces kiełkowania nasion. Niestety obok rezultatów świadczących o pozytywnym oddziaływaniu pól elektrycznych i ultradźwięków stwierdzono ich niekorzystny wpływ na ontogenezę roślin [7, 28]. Wynika z tego, że nie można jednoznacznie stwierdzić pozytywnego wpływu tego czynnika na nasiona i dalszy rozwój roślin oraz pozyskany plon. W niniejszym opracowaniu dokonano przeglądu wybranych pozycji najnowszej literatury, w celu uzyskania odpowiedzi na pytanie czy można praktycznie zastosować ultradźwięki i pola elektryczne do polepszania kiełkowania i wzrostu roślin. 3. Opis zagadnienia Ultradźwięki należą do fal mechanicznych (dźwiękowych) o zakresie częstości wyższej od 20 kHz, aż do poziomu zwykle uznawanej granicy wynoszącej 1 GHz [14]. Percepcja bodźców mechanicznych w środowisku naturalnym ma zasadnicze znaczenie dla przetrwania wszystkich żywych organizmów. Wrażliwość roślin na ultradźwięki jest związana ze zjawiskiem mechanorecepcji [15]. Dowiedziono, iż traktowanie ultradźwiękami może stymulować reakcje enzymatyczne oraz wpływać korzystnie na przyspieszenie wczesnych faz rozwoju roślin [12]. Ponadto możliwa jest modyfikacja bielma nasion, w tym degradacja skrobi pod wpływem ultradźwięków, co może prowadzić do zwiększenia tempa katalizowania enzymatycznych reakcji hydrolizy w nasionach, a w konsekwencji przyspieszać proces kiełkowania [7]. Zastosowanie ultradźwięków do przerwania spoczynku nasion to metoda, która wzbudza duże zainteresowanie naukowców z całego świata [16]. Wykorzystanie tego czynnika w tym celu jest skuteczne, gdy stymulowane nasiona znajdują się w ciekłym nośniku fal ultradźwiękowych (zwykle w wodzie), co umożliwia jej wchłanianie przez nasiona i w konsekwencji inicjuje proces kiełkowania [16, 17]. Jak podaje Da Silva Venancio i in. [17] ultradźwięki zwiększają szybkość kiełkowania i przyspieszają rozwój siewek m.in. różnych gatunków traw, poprzez wspomaganie absorpcji wody przez nasiona we wczesnych etapach kiełkowania. Autorzy pracy zwracają uwagę na zastosowane dawkowanie, gdzie stwierdzono, że nadmierna ekspozycja nasion na fale ultradźwiękowe może doprowadzić do ciężkiego mechanicznego uszkodzenia, m.in. w wyniku procesu kawitacji i w konsekwencji zahamować kiełkowanie. Rozpatrując działanie pola elektrycznego na rośliny należy zwrócić uwagę na zjawisko elektrotropizmu. Polega ono na reakcji ruchowej stożka wzrostu rośliny pod wpływem pola elektrycznego. Zjawisko to nie jest w pełni wyjaśnione, ale przypuszcza się, że jego bezpośrednią przyczyną jest zmiana 45 Małgorzata Budzeń stężenia hormonu wzrostu – auksyny, po stronie stymulowanego organu, co skutkuje większym przyrostem ilości występujących tam komórek [18]. Nie wszystkie rośliny reagują na pole elektryczne w taki sam sposób. Zarówno intensywność jak i kierunek wzrostu wielu roślin elektrotropowych, czyli takich, które reagują na pole elektryczne, zależy od wielkości i kierunku linii sił pola elektrycznego. Takie rośliny odkształcają się w kierunku dodatnich ładunków tworzących zewnętrzne stałe pole elektryczne. W ich przypadku można wykorzystać pole elektryczne jako czynnik poprawiający wzrost roślin, niezależnie od modyfikacji genetycznych czy intensywniejszego nawożenia [19]. Dymek i in. [20] wykazali, że pola elektryczne o niskim natężeniu i niskiej częstości mogą zmieniać aktywność organów, tkanek i kultur komórkowych poprzez wzrost ich proliferacji, a w konsekwencji szybszego mnożenia się komórek. Podobne efekty wywołane przez pola elektryczne zależą zarówno od parametrów zastosowanych pól elektrycznych jak i stanu fizjologicznego traktowanych komórek [20]. Stwierdzono również iż, pod wpływem pola elektrycznego dochodzi do procesu elektroporacji, czyli powstawania porów w błonie komórkowej [10, 21]. Nasiona stymulowane polem elektrycznym są poddane naprężeniom elektrostrykcyjnym i dlatego mogą cechować się większą zdolnością wchłaniania wody, co może przyczynić się do szybszego kiełkowania i wschodów roślin [22]. 4. Przegląd literatury 4.1. Zastosowanie ultradźwięków w procesie kiełkowania i wzrostu roślin W badaniach Halicz i in. [13], do stymulacji nasion używano generatora ultradźwięków o częstości 800 kHz i maksymalnej gęstości powierzchniowej mocy wynoszącej 4 W·cm-2. Stwierdzono, że ultradźwięki przyspieszają pęcznienie nasion fasoli (Phaseolus vulgaris odm. „Bomba” i „Pinto”), a tym samym stymulują proces ich kiełkowania. Jak podaje autorka, ultradźwięki wpłynęły na zwiększenie pobierania tlenu cząsteczkowego przez nasiona fasoli w początkowym stadium kiełkowania. W siewkach fasoli, dla próbek stymulowanych przez okres 15 i 20 minut, odnotowano również zwiększoną zawartość fosforu całkowitego i ortofosforanów. Podobne rezultaty autorzy uzyskali dla nasion krokoszu (Carthamus tinctorius L.). Pod wpływem ultradźwięków zaobserwowano u tego gatunku 20-40 % spadek aktywności β – glicerofosfatazy w stosunku do kontroli [13]. Należy pamiętać o tym, że fosfor wchodzi w skład związków budujących komórki i w dużym stopniu wpływa na jej części generatywne. Fosfor bierze udział w procesie 46 Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin kształtowania systemu korzeniowego oraz wpływa na obniżanie w roślinach ilości azotu mineralnego (azotanów), co ma bardzo duże znaczenie w uprawie roślin posiadających tendencje do kumulowania tych składników [23].W badaniach Aladjadjiyan [24] poddano stymulacji ultradźwiękami nasiona marchwi (Daucus carota L.) odmiany Nantes. Stosowano fale o częstości 22 kHz, natężeniu 150 W i czasach oddziaływania 1, 5 lub 10 minut. Odnotowano wzrost parametrów zdolności i energii kiełkowania dla czasu ekspozycji 5 minut [24]. W przypadku nasion soczewicy (Lens culinaris Med.) i pszenicy (Triticum aestivum L.), do stymulacji wykorzystano urządzenie ultra-dźwiękowe o częstości 42 kHz i mocy 100 W, stosując czas 1, 2 i 3 minuty [25].W efekcie stymulacji ultradźwiękowej, w przypadku nasion soczewicy odnotowano istotny statystycznie wzrost długości łodyg i korzonków roślin, tym większy im dłuższy był czas ekspozycji. Dla pszenicy również odnotowano zwiększenie długości korzonków w stosunku do kontroli. Poza tym dla obu badanych gatunków zaobserwowano większą masę roślin względem kontroli [25, 12]. Yaldagard i in. [6] przeprowadził badania na nasionach jęczmienia (Hordeum vulgare L. odm. Karon, Kavir), gdzie do stymulacji użyto generatora UP200H o częstości fali ultradźwiękowej 20 kHz i nominalnej mocy 460 W. Zastosowano natężenia o wartości 20, 60 i 100% mocy nastawnej, przez okres 5, 10 i 15 minut w temperaturze 30˚C. Wraz ze wzrostem natężenia ultradźwięków jak i czasów ekspozycji, autorzy odnotowali skrócenie czasu kiełkowania z 7 do 4 i 5 dni oraz wzrost czynności α– amylazy, co jest istotną informacją dla przemysłu browarniczego. Stwierdzono, iż fale ultradźwiękowe mogą wpływać na powstawanie i rozszerzanie porów na powierzchni nasion, co może prowadzić do zwiększenia zdolności pobierania wody i skutkować lepszym nawilżeniem nasion. Stymulacji ultradźwiękami poddano nasiona syntetycznej odmiany słonecznika S473 (Helianthus annuus L.) w celu oceny wpływu tego czynnika na proces kiełkowania oraz na długość korzeni i pędów uzyskanych roślin. Nasiona traktowano ultradźwiękami o częstości 40 kHz, stosując cztery różne natężenia ultradźwięków – 40, 60, 80 i 100% nastawnej mocy generatora przez okres 5, 10, 15 i 20 minut w temperaturze 30˚C [7]. Optymalną skuteczność stymulacji ultradźwiękami nasion słonecznika, wynoszącą odpowiednio 95 i 99% wykiełkowanych nasion, uzyskano dla 40% i 60% mocy wyjściowej urządzenia i czasów ekspozycji 5-20 minut, względem próby kontrolnej wynoszącej 68%. Odnotowano także większy wigor nasion poddanych oddziaływaniu ultradźwięków w stosunku do nasion kontrolnych. Szybsze kiełkowanie nasion wytłumaczono zwiększeniem aktywności enzymów hydrolitycznych. 47 Małgorzata Budzeń Największy wigor charakteryzował siewki poddane działaniu ultradźwięków o czasie stymulacji 10 minut i 40-60% mocy wyjściowej generatora. Dla tych natężeń oraz czasów ekspozycji 5-20 minut zaobserwowano także wzrost długości korzeni i pędów względem kontroli [7]. Machikowa i in. [7] odnotowali również niższy procent wykiełkowanych nasion wynoszący 44-48% względem kontroli (68%), następujący wraz ze wzrostem natężenia ultradźwięków, czyli dla natężenia fal w zakresie od 80-100% mocy generatora. Jak się przypuszcza, w niektórych przypadkach, wydłużona stymulacja ultradźwiękowa przy wysokim natężeniu fal może prowadzić do mechanicznego uszkodzenia zarodka. Goussous i in. [26] poddali oddziaływaniu ultradźwiękami nasiona ciecierzycy (Cicer arietinum) odmiany Jubeiha 2, pszenicy (Triticum aestivum) odmiany Hourani, papryki (Capsium annuum) odmiany Mustang oraz arbuza (Citrullus vulgaris) odmiany Sugar Delicata. Zastosowano generator o mocy wyjściowej 100 W, częstości 40 kHz i czasach ekspozycji 0, 5, 10, 15, 30, 45 i 60 minut. Odnotowano wyższy wskaźnik szybkości kiełkowania dla nasion ciecierzycy, pszenicy i arbuza odpowiednio: 133% dla czasu stymulacji 45 minut, 95% dla czasu 30 minut i 45% dla stymulacji trwającej 5 minut, w stosunku do nasion kontrolnych. Udział wykiełkowanych nasion był wyższy o 59% dla ciecierzycy i 24% dla papryki w odniesieniu do kontroli [26]. Autorzy podają szereg możliwych mechanizmów działania ultradźwięków na poziomie komórkowym, m. in.: lokalny wzrost temperatury w komórkach, co prowadzi do zwiększenia szybkości reakcji katalizowanych enzymatycznie lub przez powstawanie lokalnych naprężeń, powodujących zwiększenie przepuszczalności komórek a zatem wzrostu absorpcji wody. 4.2. Zastosowanie pól elektrycznych w procesie kiełkowania i wzrostu roślin W przypadku stosowania pól elektrycznych jako czynnika stymulującego materiał siewny, Pietruszewski i in. [27] badali nasiona gryki siewnej (Fagopyrum esculentum) odmiany Hruszowska stosując zmienne pole elektryczne o częstości 50 Hz i natężeniu E = 5 kV·cm-1 oraz stałe pole elektryczne o natężeniu E = 10 kV·cm-1 przez okres 30 sekund. Odnotowano pozytywny wpływ na zdolność i energię kiełkowania w początkowym etapie procesu kiełkowania nasion dla obu pól elektrycznych. Wiele wskazuje na to, że oddziaływanie pól elektrycznych na nasiona i rośliny zależy od energii stosowanych pól [27]. W badaniach Kornarzyńskiego i in. [28] oddziaływaniu stałego pola elektrycznego (5 i 12 kV·cm-1 przez 30 sekund), poddano nasiona wybranych roślin kwiatowych, do których należała cynia daliowa (Ziania elegans), łubin trwały (Luzinu spolyphyllus,) goździk pierzasty (Dianthus plumarius) i ostróżka trwała (Delphinium 48 Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin polyphyllus). Uzyskano pozytywny efekt w początkowej fazie procesu kiełkowania, w przypadku stałego pola elektrycznego o natężeniu 5 kV·cm-1 dla cynii daliowej, łubinu trwałego (5 i 12 kV·cm-1) i ostróżki trwałej (12 kV·cm-1) względem kontroli. W dalszych fazach wzrostu siewek stwierdzono wzrost zdolności kiełkowania wyłącznie dla cynii daliowej; w pozostałych przypadkach zaobserwowano spadek tego parametru [28]. W badaniach Sedighi i in. [29] nasiona kukurydzy poddano stymulacji polem elektrycznym o natężeniu 2, 4, 9 i 14 kV·m-1 przez okres 15, 30, 45, 80 i 150 sekund. Stwierdzono istotne statystycznie skrócenie średniego czasu kiełkowania nasion dla pola o natężeniu 9 kV·m-1 oraz wzrost zdolności kiełkowania nasion poddanych oddziaływaniu pól w zakresie od 2 do 9 kV·m-1 [29]. W badaniach Moona i in. [30] stymulowano nasiona pomidorów (Lycopersicun esculentum L.) zmiennym polem elektrycznym o natężeniach leżących w zakresie E = 4 do 12 kV·cm-1, częstości 60 Hz przez okres od 1560 sekund. Uzyskano pozytywny efekt dla zakresu czasów ekspozycji 30-45 sekund, które wpłynęło na wzrost procentowego udziału wykiełkowanych nasion w stosunku do kontroli [30]. Interesujące badania przeprowadził Gut [10], który poddał bulwy ziemniaka działaniu zmiennego pola elektrycznego o częstości 50 Hz, natężeniu: 312,5; 625; 1250 i 2875 V·m-1 i czasach stymulacji 1, 5, 60, 300 i 1800 sekund. Autor stwierdził istotny, blisko 60% przyrost liczby pędów dla prób traktowanych polem o natężeniu 625 V·m-1 przez 60 sekund oraz większe tempo wzrostu roślin dla natężenia pola 2875 V·m-1 przez 1800 sekund względem kontroli [10]. Odnotował również wyższą masę bulw przypadających na jedną uzyskaną roślinę, wynoszącą ponad 600 g dla E = 312,5 V·m-1 i t = 1800 s. Najmniej korzystne było oddziaływanie pola o natężeniu 2875 V·m-1 trwające przez 60 sekund, gdzie masa bulw wyniosła jedynie ok. 390 g [10]. Pozytywny efekt pola elektrycznego wytłumaczono procesem elektroporacji wynikłej z pojawienia się indukowanych polem elektrycznym ładunków w obrębie komórek. Patwardhan i Gandhare [31] badali wpływ stymulacji nasion pomidorów odmiany Rajashri zmiennym polem elektrycznym o częstości 50 Hz, natężeniu 10, 20 i 30 kV·cm-1 i czasie ekspozycji od 10-30 sekund. Stwierdzono, że poddanie nasion działaniu pól elektrycznych o wysokim natężeniu może być skutecznym narzędziem do poprawy zdolności kiełkowania nasion pomidora. W tym przypadku optymalne okazało się zastosowanie pola o natężeniu 20 kV·cm-1 przez okres 20 sekund [31]. W celu pozyskania wiedzy na temat działania, coraz częściej stosowanych impulsowych pól elektrycznych na nasiona, Songnuan i Kirawanich [21] poddali badaniom rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana L.). Roślina ta jest gatunkiem modelowym, często stosowanym w badaniach genetycznych, ze względu na jej specyficzne cechy: niewielkie rozmiary, szybki cykl życiowy i dużą odporność. Nasiona rzodkiewnika pospolitego poddano działaniu impulsowego pola elektrycznego impulsami o czasie 49 Małgorzata Budzeń trwania 10 ns, natężeniu w zakresie od 5 do 20 kV·cm-1. Analiza statystyczna wyników wykazała pozytywny wpływ pola o natężeniu 10 kV·cm-1 na wzrost powierzchni liści na poziomie 80% względem kontroli (P < 0,01), zarówno w pierwszym jak i drugim tygodniu po stymulacji [21]. Autorzy wytłumaczyli, iż impulsowe pola elektryczne mogą powodować stres abiotyczny prowadzący do zmiany przepuszczalności komórek, co skutkuje w niektórych przypadkach efektywniejszym transportem wody lub substancji odżywczych. W badaniach Mahajan i Pandey [32] nasiona ciecierzycy (Cicer arietinum L.) stymulowano polem elektrycznym o natężeniu 233,3; 333,3; 466,6; 600; 766,6; 866,6 V·cm-1 w trzech różnych temperaturach 13˚C, 16˚C i 19˚C przez okres 15 minut. Stwierdzono, że eksponowanie nasion ciecierzycy w polu elektrycznym o natężeniu 466,6 V·cm-1 spowodowało zmianę zdolności wchłaniania wody, a tym samym szybsze kiełkowanie nasion. Nasiona ciecierzycy w prowadzonych badaniach wykazywały właściwości ferroelektryczne, które charakteryzują się występowaniem spontanicznie spolaryzowanych obszarów (domen), zanikających wraz ze wzrostem temperatury [32]. Badaniom poddano nasiona rzodkiewki i rzodkwi, gdzie odnotowano pozytywny wpływ pola elektrycznego na ich kiełkowanie, w przypadku zastosowania pola o natężeniu 10 kV·cm-1 przez okres 4 sekund [33]. Kornarzyński i in. [34] badali nasiona ślazówki turyngskiej (Lavatera thuringiaca L.) rośliny o dużym potencjale gospodarczym. Stymulacji zmiennym polem elektrycznym o częstości sieciowej 50 Hz i natężeniu 4 kV·cm-1 przez okres 60 sekund oraz stałym polem elektrycznym (4 kV·cm-1, 60 sekund) poddano nasiona rodzicielskie odmiany Uleko oraz nasiona potomne ślazówki. W efekcie uzyskano wzrost zdolności i energii kiełkowania dla zmiennego pola elektrycznego zarówno w przypadku nasion rodzicielskich jak i potomnych oraz wzrost zdolności i energii kiełkowania nasion potomnych poddanych oddziaływaniu stałego pola elektrycznego [34]. 5. Podsumowanie Na podstawie przedstawionego przeglądu literatury można wnioskować, iż zastosowanie ultradźwięków i pól elektrycznych do stymulacji nasion roślin uprawnych, w większości analizowanych przypadków wpłynęło na poprawę parametrów kiełkowania nasion i plonowanie różnych gatunków. Stwierdzono wzrost energii i zdolności kiełkowania nasion [24, 26, 31, 34], ich wigoru [7], przyspieszenie procesu kinetyki kiełkowania [6, 29], wcześniejsze dojrzewanie roślin oraz pozytywny wpływ na istotne cechy morfologiczne roślin – wzrost długości korzenia, pędów, powierzchni liści itp. [7, 12, 25]. Zaobserwowano również wzrost suchej masy siewek 50 Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin i roślin [10, 12, 25] oraz większą zdolność wchłaniania wody przez stymulowane nasiona [6, 32]. Wpływ obydwu analizowanych czynników fizycznych na nasiona roślin i ich dalszy rozwój jest zróżnicowany i determinowany takimi czynnikami jak: dawka ekspozycyjna, gatunek i odmiana rośliny, wilgotność nasion itp. [5, 27]. Wykorzystanie pola elektrycznego i ultradźwięków do poprawy jakości siewnej nasion o niskiej zdolności kiełkowania może mieć praktyczne zastosowanie w uszlachetnianiu materiału siewnego. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Marcos-Filho J. Seed vigor testing: an overview of the past, present and future perspective, Scienta Agricola, 7 (4) (2015), s. 363-374 Aladjadjiyan A. The Use of Physical Methods for Plant Growing Stimulation in Bulgaria, Journal of Central European Agriculture, 8 (3) (2007), s. 369-380 Gholami A., Sharafi S., Abbasdokht H. Effect of Magnetic Field on Seed Germination of Two Wheat Cultivars, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, 4 (8) (2010), s. 675-677 Grzesiuk S., Kulka S. Fizjologia i biochemia nasion, Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, (1981), Warszawa Podleśny J. Wpływ stymulacji magnetycznej nasion na wzrost, rozwój i plonowanie roślin uprawnych, Acta Agrophysica, 4 (2) (2004), s. 459-473 Yaldagard M., Mortazavi S. A., Tabatabaie F. The Effectiveness of Ultrasound Treatment on the Germination Stimulation of Barley Seed and its AlphaAmylase Activity, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, 1(10) (2007), s. 123-126 Machikowa T., Kulrattanarak T., Wonprasaid S. Effects of Ultrasonic Treatment on Germination of Synthetic Sunflower Seeds, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, 7(1) (2013), s. 1-3 Kornarzyński K., Pietruszewski S. Wpływ dużych dawek zmiennego pola magnetycznego na kiełkowanie nasion pszenicy twardej, Acta Scientiarum Polonorum Technica Agraria, 4 (2) (2005), s. 11-20 Galland P., Pazur A. Magnetoreception in plants, Journal of Plant Research, 118 (6) (2005), s.371-389 Gut M. Wpływ przemiennego pola elektrycznego na wzrost i plonowanie bulw ziemniaka, Inżynieria Rolnicza, 8(96) (2007), s. 73-79 Hernandez A. C., Dominguez P. A., Cruz O. A. et al. Laser in agriculture, International Agrophysics, 24(4) (2010), s. 407-422 Aladjadjiyan A. Physical Factors for Plant Growth Stimulation Improve Food Quality, Food Production – Approaches, Challenges and Tasks, (2012), s. 145-168 Halicz B., Maciejewska-Potapczykowa W., Zaleska K. Z badań nad mechanizmem działania ultradźwięków, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 33 (2) (1964), s. 285-296 Skorko M. Fizyka – podręcznik dla studentów wyższych technicznych studiów zawodowych dla pracujących, Państwowe Wydawnictwo Naukowe (1981) 51 Małgorzata Budzeń 15. Telewski F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants, American Journal of Botany, 93 (10) (2006), s. 1466-1476 16. Yaldagard M., Mortazavi S. A., Tabatabaie F., Application of Ultrasonic Waves as a Priming Technique for Accelerating and Enhancing the Germination of Barley Seed: Optimization of Method by the Taguchi Approach, Journal of the Institute of Brewing, 114 (1) (2008), s. 14-21 17. Da Silva Venancio R. S., Tonello P. S., Martins A. C. G. Environmental Technology: Applications of Ultrasound, International Journal of Engineering and Applied Sciences, 7 (2) (2015), s. 1-5 18. Samuelsson A. Bioelectromagnetics for improved crop productivity – An introductory review with pilot study of pre-sowing treatment of tomato, (2015), s. 1-49 19. http://forumakad.pl/archiwum/2005/06/26-bnrosliny_w_polu_elektrycznym.htm 20. Dymek K., Dejmek P., Panarese V. et al. Effect of pulsed electric field on the germination of barley seeds, LWT – Food Science and Technology, 47 (2012), s. 161-166 21. Songnuan W., Kirawanich P. Early growth effects on Arabidopsis thaliana by seed exposure of nanosecond pulsed electric field, Journal of Electrostatics, 70 (2012), s. 445-450 22. Pietrzyk W. Standaryzacja badań wpływu pól elektromagnetycznych na materiały pochodzenia biologicznego, Acta Agrophysica, 8(4) (2006), s. 915-921 23. http://www.cdr.gov.pl/pol/wydawnictwa/2012/integrowana_ochr_roslin_2.pdf 24. Aladjadjiyan A. Increasing carrot seeds (Daucus carota L.), cv. Nantes viability through ultrasound treatment, Bulgarian Journal of Agricultural Science, 8(5-6) (2002), s. 469-472 25. Aladjadjiyan A. Ultrasonic stimulation of the development of lentils and wheat seedlings, Romanian Journal of Biophysics, 21(3) (2011), s. 179-188 26. GoussousS. J., Samarah N. H., Alqudah A. M. et al., Enhancing seed germination of four crop species using an ultrasonic technique, Experimental Agriculture,46(2) (2010), s. 231-242 27. Pietruszewski S., Kornarzyński K., Gładyszewska B. Zastosowanie modelu analitycznego do opisu procesu kiełkowania nasion gryki poddanych przedsiewnej biostymulacji polem elektrycznym i magnetycznym, Acta Scientiarum Polonorum Technica Agraria, 2(1) (2003), s. 3-12 28. Kornarzyński K., Łacek R. Wpływ pola magnetycznego i elektrycznego na kiełkowanie nasion wybranych roślin kwiatowych, Inżynieria Rolnicza, 5 (2006), s. 305-312 29. Sedighi N., Abedi M., Hosseini S. H. Effect of electric field intensity and exposing time on some physiological properties of maize seed, European Journal of Experimental Biology, 3(3) (2013), s. 126-134 30. Moon J. D., Chung H. S. Acceleration of germination of tomato seed by applying AC electric and magnetic fields, Journal of Electrostatics, 48 (2000), s. 103-114 31. Patwardhan M. S., Gandhare W. Z. High voltage electric field effects on the germination rate of tomato seeds, Acta Agrophysica, 20(2), (2013), s. 403-413 52 Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin 32. Mahajan T. S., Pandey O. P. Effect of electric field (at different temperatures) on germination of chickpea seed, African Journal of Biotechnology, 13(1) (2014), s. 61-67 33. Prokop M., Pietruszewski S., Kornarzyński K.. Wstępne badania wpływu zmiennych pól magnetycznych i elektrycznych na kiełkowanie oraz cechy mechaniczne korzeni rzodkiewki i rzodkwi, Acta Agrophysica, 62 (2002), s. 83-94 34. Kornarzyński K., Budzeń M., Sujak A. Ocena wpływu pola magnetycznego i elektrycznego oraz wody uzdatnianej magnetycznie na przebieg kiełkowania ślazówki turyngskiej (Lavatera thuringiaca L.), Acta Scientiarum Polonorum, Technica Agraria, 14 (1-2) (2015), s. 23-33 Pola elektryczne i ultradźwięki jako czynniki wpływające na kiełkowanie i wzrost roślin Streszczenie Polityka zrównoważonego rozwoju ukierunkowana jest m.in. na poszukiwanie metod wpływających na zwiększenie plonów oraz poprawę ich jakości. Czynnikiem, który ma duży wpływ na opłacalność danej uprawy jest jakość materiału siewnego. Kiełkowanie nasion jest bardzo ważnym etapem w cyklu życiowym roślin, który determinuje dalszy ich prawidłowy wzrost i rozwój. W artykule przedstawiony został przegląd wyników badań przeprowadzonych przez wielu badaczy dotyczących wpływu pola elektrycznego i ultradźwięków na kiełkowanie oraz wzrost wybranych gatunków roślin. Na podstawie analizy zgromadzonych danych literaturowych można wnioskować o pozytywnym oddziaływaniu powyższych czynników fizycznych na poprawę kiełkowania nasion. Przedsiewna biostymulacja nasion z wykorzystaniem następujących czynników fizycznych – pola elektrycznego i ultradźwięków w wielu przypadkach wpłynęła na wzrost zdolności i energii kiełkowania. Odnotowano również wzrost wigoru nasion. Efekty były zależne od parametrów zastosowanych czynników oraz od materiału roślinnego poddanego stymulacji. Słowa kluczowe: stymulacja nasion, pole elektryczne, ultradźwięki Electric fields and ultrasound as factors affecting the germination and growth of plants Abstract The policy of sustainable development of agriculture is directed, among others, to search for methods resulting in the increase of crop yield and quality. The factor that has a major impact on the profitability of the crop is the quality of the seed. Seed germination is a very important stage in the life cycle of each plant, which determines proper development of plant. The article presents an overview of the results of research carried out by many researchers about the effects of the electric field and ultrasound on the germination and growth of selected plant species. Based on the analysis of the data collected from literature can be concluded the positive impact of these physical factors on the improvement of seed germination. Pre-sowing biostimulation of seeds with the following physical factors – the electric field and ultrasound in many cases contributed to an increase in the capacity and energy of germination. An increase in seed vigor was also observed. The effects were dependent on the parameters used as well as of the species and quality of the plant material subjected to stimulation. Keywords: stimulation of seed, electric field, ultrasound 53 Joanna Gębura1, Olha Budnyk2, Krystyna Winiarczyk1 Etapy rozwoju gametofitu żeńskiego u wybranych przedstawicieli rodziny Commelinaceae 1. Wstęp W trakcie życia roślin okrytonasiennych (Angiospermae) obserwuje się cykliczną przemianę pokoleń. Dominującym pokoleniem jest diploidalny sporofit, który stanowi samodzielny organizm, zdolny do spełniania wszystkich funkcji życiowych. Dojrzałość sporofitu przejawia się wytworzeniem organów generatywnych zebranych w kwiatach, dzięki którym roślina może rozmnażać się płciowo. U roślin okrytonasiennych organami generatywnymi linii męskiej są pręciki, a linii żeńskiej słupki. Organy generatywne zawierają komórki archesporialne zdolne do podziału redukcyjnego. Po mejozie z komórek archesporialnych powstają haploidalne spory (mikro- lub megaspory), zawierające zredukowaną ilość materiału genetycznego w jądrach. Spory w wyniku podziałów mitotycznych tworzą nowe pokolenie roślin – haploidalne gametofity [1]. U roślin okrytonasiennych gametofity to kilkukomórkowe struktury całkowicie uzależnione od sporofitu. Gametofitami męskimi są dwu- lub trzykomórkowe ziarna pyłku, a gametofitami żeńskimi zwykle siedmiokomórkowe woreczki zalążkowe. Rola gametofitów sprowadza się do wytwarzania komórek rozrodczych (gamet). W ziarnach pyłku komórka generatywna produkuje dwie komórki plemnikowe, a komórka wegetatywna wykształca łagiewkę pyłkową, za pomocą której gamety przemieszczają się do zalążków. W woreczkach zalążkowych powstają dwie komórki, które uczestniczą w podwójnym zapłodnieniu, są to komórka jajowa i komórka centralna [2]. Badania etapów rozwoju, a także struktury woreczków zalążkowych jest trudnym zagadnieniem, podejmowanym tylko przez nielicznych embriologów roślin. Do tej pory wyróżniono kilkanaście typów rozwoju woreczka zalążkowego. Ich przebieg zależy głównie od informacji zapisanych w genomie rośliny, jednak czasami na przebieg formowania gametofitów żeńskich wpływają także czynniki środowiskowe [3]. Celem pracy było prześledzenie etapów rozwoju gametofitów żeńskich u wybranych przedstawicieli z rodziny Commelinaceae. 1 [email protected], [email protected], Zakład Anatomii i Cytologii Roślin, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 2 [email protected], Zakład Ekologii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii CurieSkłodowskiej w Lublinie 54 Etapy rozwoju gametofitu żeńskiego u wybranych przedstawicieli rodziny Commelinaceae 2. Etapy rozwoju woreczka zalążkowego – megasporogeneza i megagametogeneza Woreczek zalążkowy powstaje w wyniku dwóch głównych procesów: megasporogenezy oraz megagametogenezy. Pierwszy z nich rozpoczyna się w młodym, nie w pełni uformowanym zalążku. Tuż pod skórką na biegunie mikropylarnym ośrodka (nucellus) różnicuje się komórka archesporialna (rzadziej więcej niż jedna), która oddziela mitotycznie komórkę przykrywkową (parietalną) lub bezpośrednio wchodzi w stadium megasporocytu (macierzystej komórki megaspor). Komórka przykrywkowa dzieli się mitotycznie, formując dodatkową warstwę komórek pomiędzy woreczkiem zalążkowym, a epidermą ośrodka lub zanika [2]. Megasporocyt rośnie, wypełnia się gęstą cytoplazmą i rozpoczyna podział redukcyjny. Najczęściej po pierwszym podziale mejotycznym powstają dwie komórki potomne (diada), a po drugim cztery haploidalne megaspory (tetrada). Liczba komórek pomejotycznych jest uzależniona od zachodzących cytokinez. Jeżeli w trakcie mejozy wystąpią dwie cytokinezy to powstaną cztery jednojądrowe megaspory. Jeśli zajdzie tylko jedna cytokineza to otrzymamy dwie dwujądrowe megaspory, a w przypadku braku cytokinez zaobserwujemy jedną czterojądrową megasporę [3]. Po każdej cytokinezie powstaje ściana kalozowa oddzielająca nowopowstałe komórki. Haploidalne megaspory układają się w linii pionowej wzdłuż głównej, spolaryzowanej osi zalążka – mikropylarno-chalazalnej (oś okienko-sznureczek). Czasami megaspory mogą ułożyć się na kształt litery T. Z powstałych komórek potomnych tylko jedna rozwija się w woreczek zalążkowy, a pozostałe degenerują. U 70% roślin okrytonasiennych megasporą funkcjonalną (MF) zostaje komórka ułożona po chalazalnej stronie zalążka (bliżej sznureczka) (w typie Polygonum) [4]. Niekiedy megasporą funkcjonalną zostaje komórka mikropylarna – typ Oenothera (obserwowany na przykład u rodziny Onagraceae), a bardzo rzadko dowolna megaspora z tetrady (w rodzajach Poa i Rubus). Następnie MF przechodzi cykl podziałów mitotycznych prowadzących do powstania woreczka zalążkowego (megagametogeneza) [1, 2,3]. 3. Typy rozwoju woreczka zalążkowego u Angiospermae W literaturze opisuje się wiele typów rozwoju woreczka zalążkowego, a ich nazwy pochodzą od rodzajów roślin, u których zostały one po raz pierwszy zbadane. Wszystkie typy dzieli się na trzy główne grupy w zależności od rodzaju megaspory funkcjonalnej, z której powstały. Wyróżnia się typy monosporowe powstałe z jednojądrowej megaspory funkcjonalnej, bisporowe powstałe z dwujądrowej MF oraz tetrasporowe powstałe z czterojądrowej MF. Ponadto typy monosporowe i bisporowe dzieli się na dwa rodzaje w zależności od miejsca występowania MF w tetradzie [4, 5]. 55 Joanna Gębura, Olha Budnyk, Krystyna Winiarczyk I Rozwój monosporowy: Polygonum – woreczek zalążkowy rozwija się z megaspory chalazalnej Oenothera – woreczek zalążkowy rozwija się z megaspory mikropylarnej II Rozwój bisporowy: Allium – woreczek zalążkowy rozwija się z dwujądrowej megaspory chalazalnej Endymion – woreczek zalążkowy rozwija się z dwujądrowej megaspory mikropylarnej. III Rozwój tetrasporowy: Woreczki zalążkowe rozwijają się z tetrasporowych MF według różnych planów, a ich klasyfikacja opiera się na liczbie i rozmieszczeniu jader w dojrzałym gametoficie żeńskim [3]. Tabela 1. Przebieg rozwoju gametofitów żeńskich według wybranych typów występujących najczęściej u roślin okrytonasiennych [3] Dojrzały woreczek zalążkowy w typie Polygonum powstaje z megaspory chalazalnej w wyniku trzech podziałów kariokinetycznych, nie sprzężonych z cytokinezami. Po pierwszym podziale dwa jądra potomne przesuwają się do przeciwnych biegunów komórki, a pomiędzy nimi powstaje duża wakuola. Po kolejnych, dwóch podziałach powstaje 8 wolnych jąder komórkowych i wtedy rozpoczyna się proces celularyzacji. Na każdym biegunie powstaje ostatecznie trzy jednojądrowe komórki, a pomiędzy nimi leży siódma komórka z dwoma jądrami tak zwanymi biegunowymi (pochodzącymi z dwóch przeciwległych biegunów komórki) oraz stosun- 56 Etapy rozwoju gametofitu żeńskiego u wybranych przedstawicieli rodziny Commelinaceae kowo dużą wakuolą. Na biegunie mikropylarnym tworzy się aparat jajowy zbudowany z dwóch synergid i komórki jajowej, natomiast na biegunie chalazalnym powstają trzy antypody [2, 4]. W typie Oenothera woreczek zalążkowy powstaje z megaspory mikropylarnej. Po pierwszym podziale kariokinetycznym jądra potomne nie rozsuwają się do przeciwnych biegunów, ale pozostają przy biegunie mikropylarnym. Tam dzielą się powtórnie, dając cztery wolne jądra komórkowe. Z nich w następnym etapie powstaje aparat jajowy oraz jednojądrowa komórka centralna. W typie Oenothera rozwój woreczka zalążkowego jest skrócony o jeden cykl mitoz w porównaniu do typu Polygonum [1, 4]. W bisporowych typach Allium i Endymion woreczek zalążkowy rozwija się w wyniku dwóch cyklów mitoz (z odpowiednio ułożonych megaspor dwujądrowych). Powstaje 8 jąder potomnych, które rozdzielają się do komórek w analogiczny sposób, jak w typie Polygonum [1, 3]. Tetrasporowe woreczki zalążkowe rozwijają się po jednym lub dwóch cyklach mitoz. W typie Adoxa po jednym cyklu mitoz powstaje 8 jąder, które układają się, jak w typie Polygonum. Natomiast w typie Peperomia po dwóch cyklach mitoz powstaje 4 czterojądrowe grupy jąder. Po dwa z nich przesuwają się do środka i tworzą diploidalne, wtórne jądro komórki centralnej. Dwa jądra z bieguna mikropylarnego formują odpowiednio jądro komórki jajowej i jednej synergidy, natomiast pozostałe 6 jąder tworzy 6 komórek luźno rozmieszczonych na ścianie chalazalnej [1, 5]. Zazwyczaj typ rozwoju woreczka zalążkowego jest charakterystyczny dla danego gatunku i jednakowy u przedstawicieli konkretnej grupy roślin. Jednak w rodzinie Commelinaceae obserwuje się znaczne zróżnicowanie w budowie żeńskich gametofitów. 4. Budowa kwiatów u przedstawicieli Commelinaceae Rodzina Commelinaceae to bardzo duża jednostka taksonomiczna, obejmująca około 650 gatunków roślin, zgrupowanych w 41 rodzajach. Rośliny należące do rodziny Commelinaceae zasiedlają strefę tropikalną oraz subtropikalną i występują na większości kontynentów [5]. Przedstawicieli Commelinaceae cechują pochwiaste połączenia liści z łodygą, wierzchotkowate kwiatostany oraz niejednorodna budowa kwiatów [6]. Trójdzielne kwiaty u Commelinaceae mogą posiadać symetrię promienistą lub grzbiecistą, a okwiat jest często zredukowany. Pręcikowie składa się z sześciu pręcików, zebranych w dwa okółki, w których pręciki różnią się między sobą wielkością oraz budową morfologiczną. Zróżnicowanie pręcikowia łączy się ze strategią zapylenia [7]. Słupkowie to najczęściej pojedynczy, trójdzielny słupek. W jego zalążni występuje zwykle 6 zalążków wyprostowanych lub zgiętych [5]. Zalążki są cienko- lub gruboośrodkowe, otoczone dwiema osłonkami (integumentami). Poprzez rozrost integumentów ośrodek zostaje podzielony na mniejszą cześć mikropylarną, w której tworzy się woreczek zalążkowy oraz większą część chalazalną [7]. 57 Joanna Gębura, Olha Budnyk, Krystyna Winiarczyk Osłonki uczestniczą także w tworzeniu kanału mikropylarnego, który u opisywanej rodzinny może być prosty lub zygzakowaty [8]. 4.1. Megasporogeneza u Commelinaceae W początkowej fazie megasporogenezy w ośrodku młodego zalążka różnicuje się pojedyncza komórka archesporialna. Zalążek nie posiada jeszcze wtedy wykształconych integumentów. U niektórych gatunków zaobserwowano tworzenie dwóch komórek archesporialnych (Commelina forskalaei, C. subulata, Cyanotis axillaris) [8]. Komórka archesporialna w następnym etapie oddziela komórkę przykrywkową, która dzieli się peryklinalnie do powierzchni zalążka, formując pojedynczą warstwę komórek potomnych lub szybko degeneruje. Krótkotrwałe występowanie komórki przykrywkowej zaobserwowano u Aneilema paniculata, Commelina stricta, Cyanotis axillaris, C. cristata, Tradescantia paludosa [9] oraz w trakcie badań nad Tinantia anomala (obserwacje własne). Apikalna komórka skórki ośrodka u Commelinaceae zazwyczaj dzieli się peryklinalnie w trakcie megasporogenezy formując 2- lub 3-komórkową ‘czapeczkę’. Natomiast u Murdannia simplex nowopowstałe komórki epidermy wydłużają się, tworząc tak zwane operculum [8]. W ten sposób powstaje szlak komórkowy prowadzący łagiewkę pyłkową do woreczka zalążkowego. Megasporocyt u Commelinaceae początkowo jest izodiametryczny, ale następnie ulega wydłużeniu i dzieli się w trakcie mejozy na cztery komórki potomne. Opóźnienie drugiego podziału mejotycznego w komórce mikropylarnej diady powoduje tworzenie triady megaspor (na przykład u Zebrina pendula) [9]. U przeważającej większości gatunków z rodziny Commelinaceae (70%) po kariokinezie następuje cytokineza, a dominującym typem rozwoju gametofitu żeńskiego jest monosporowy typ Polygonum [8, 9]. Megasporą funkcjonalną zostaje zazwyczaj megaspora chalazalna z układu T-kształtnego, chociaż megaspory mogą układać się także liniowo (u gatunków Commelina benghalensis, C. subulata i innych) [9]. W rodzinie Commelinaceae opisano także liczne przypadki rozwoju woreczka zalążkowego według bisporowego typu Allium (na przykład u Commelina stricta i Rheo discolor) lub tetrasporowego typu Adoxa (na przykład u Commelina angustifolia) [8]. Do rzadkości należał natomiast gametofit żeński rozwijający się według monosporowego typu Oenothera, który został zaobserwowany jedynie u gatunku Tinantia anomala [10]. 4.2. Megagametogeneza i budowa dojrzałego woreczka zalążkowego Woreczki zalążkowe rozwijające się w rodzinie Commelinaceae według typów Polygonum, Allium i Adoxa są 7-komórkowe i 8-jądrowe. Większość z nich posiada prawie kulisty (u Siderasis fuscata) lub jajowato-wydłużony 58 Etapy rozwoju gametofitu żeńskiego u wybranych przedstawicieli rodziny Commelinaceae (u Rheo discolor) kształt [9]. Do momentu zapłodnienia woreczki zalążkowe są położone w mniejszej, mikropylarnej części zalążka. Komórka jajowa u Commelinaceae ma gruszkowaty kształt oraz apikalnie lub centralnie położone jądro. W skład aparatu jajowego wchodzą także dwie gruszkowate synergidy z dobrze rozwiniętym aparatem włókienkowym (szczególnie u gatunków S. fuscata, R. discolor oraz Z. pendula) [8]. Jądra biegunowe komórki centralnej są największe z jąder woreczka zalążkowego i łączą się ze sobą dopiero przed zapłodnieniem. Jest to cecha charakterystyczna dla gametofitu żeńskiego obserwowanego w rodzinie Commelinaceae [11]. W komórce centralnej przed zapłodnieniem gromadzą się liczne substancje zapasowe w postaci ziaren skrobi. Antypody u roślin z rodziny Commelinaceae są efemeryczne i ulegają degeneracji podczas łączenia się jąder biegunowych lub jeszcze wcześniej, co opisano u S. fuscata i R. discolor [8]. Zazwyczaj w dojrzałym woreczku zalążkowym nie można zaobserwować antypod (C. axillaris, C.cucullata, P. fuscata, R.discopor) [9]. Wyjątkiem jest rozwój woreczka zalążkowego u Tinantia fugax (synonim T. erecta), u którego antypody pozostają widoczne długo po zapłodnieniu [12, 13]. W trakcie zapłodnienia łagiewka pyłkowa wrasta do woreczka zalążkowego przez jedną z synergid, w której obserwuje się oznaki degeneracji. Jako pierwsze łączą się ze sobą jądro komórki centralnej oraz jądro komórki plemnikowej, a następnie dochodzi do połączenia jądra komórki jajowej z jądrem drugiej komórki plemnikowej [9]. Zmiany anatomiczne w budowie woreczka zalążkowego obserwuje się już przed zapłodnieniem, a następnie postępują one sukcesywnie w trakcie i po zapłodnieniu. Kształt woreczka zalążkowego wydłuża się w trakcie zapłodnienia, ze względu na znaczny rozrost do chalazalnej części ośrodka [9, 11]. 4.3. Czynniki wpływające na rozwój woreczka zalążkowego Zróżnicowany przebieg rozwoju gametofitu żeńskiego w rodzinie Commelinaceae może być wynikiem zarówno czynników genetycznych, jak i niejednorodnych warunków środowiska [14, 15]. Jednym z ważniejszych czynników klimatycznych regulujących przebieg megasoporgenezy jest średnia temperatura powietrza [14]. Jeżeli mieści się ona w optymalnym zakresie tolerancji temperaturowej danego gatunku to najczęściej występuje rozwój typu Polygonum. Jest to najprymitywniejszy typ rozwoju gametofitów żeńskich. Wraz z rozprzestrzenianiem gatunków na nowe terytoria o innych warunkach klimatycznych, zmiany temperaturowe mogły wpływać na różnicowanie rozwoju woreczków zalążkowych. Przykłady takich modyfikacji opisano u niektórych gatunków z rodzaju Capsicum [14, 15]. Największą rolę w regulacji typu rozwoju woreczków zalążkowych odgrywają jednak czynniki genetyczne. Według Yadegari i Drews [4] mutacje zachodzące w diploidalnym sporoficie wpływają na przebieg formowania macierzystej komórki megaspor, mejozy oraz na regulację polaryzacji megaspor, natomiast mutacje pojawiające się w haploidalnym gametoficie 59 Joanna Gębura, Olha Budnyk, Krystyna Winiarczyk mają wpływ na megagametogenezę oraz funkcjonowanie dojrzałego woreczka zalążkowego w trakcie zapłodnienia. W rodzinie Commelinaceae obserwuje się dużą zmienność w kariotypie osobników należących do jednego rodzaju. Ponadto w trakcie ewolucji opisywanych roślin, u ich przodków kilkukrotnie zachodziła poliploidyzacja, jak również aneuploidyzacja materiału genetycznego [16]. 5. Powstawanie nasion Po podwójnym zapłodnieniu z komórki jajowej rozwija się zarodek, który u Commelinaceae ma niewielkie rozmiary oraz cylindryczny lub hantlowały kształt [17]. Jego embriogeneza zachodzi według typu Asterad. Zarodek w nasionach u Commelinaceae występuje w specjalnej komorze, która stanowi pozostałość po części mikropylarnej ośrodka [18]. Z zapłodnionej komórki centralnej rozwija się triploidalne bielmo w przypadku woreczków 8-jądrowych, a w przypadku woreczków 4-jądrowych bielmo diploidalne. W nasionach Commelinaceae występują także pozostałości po zdegradowanym ośrodku zalążka w postaci kilkuwarstwowego obielma. Rozrośnięty integument zewnętrzny tworzy grubą łupinę nasienną z wyraźnym zagłębieniem po sznureczku (hilum) [19]. Zalążnia słupka przekształca się w owoc typu suchego – torebkę. Rozsiewanie nasion zachodzi poprzez pękanie torebki wzdłuż szwów pod wpływem czynników zewnętrznych takich jak wiatr oraz wilgotność powietrza [17, 18]. 6. Podsumowanie W opisywanej rodzinie występuje duże zróżnicowanie pod względem budowy morfologicznej kwiatów. Jest to wynik rozprzestrzeniania się roślin z rodziny Commelinaceae na rozległe tereny strefy tropikalnej. W nowych warunkach środowiskowych rośliny musiały wykształcić przystosowania adaptacyjne do rozmnażania płciowego (na zasadzie doboru naturalnego oraz doboru płciowego). Zmiany ewolucyjne zachodzące w rodzinie Commelinaceae wpłynęły także na zróżnicowanie rozwoju woreczków zalążkowych zarówno na etapie megasporogenezy, jak i megagametogenezy. Chociaż dominuje u nich pierwotny, monosporowy rozwój typu Polygonum [8, 9], to pewne mutacje genetyczne, jak również wpływ innych czynników na przykład temperaturowych mógł zmodyfikować przebieg rozwoju woreczków zalążkowych [14, 15]. U kilku rodzajów roślin zaobserwowano bisporowy rozwój typu Allium oraz tetrasporowy typ Adoxa [8, 9]. Dojrzałe woreczki zalążkowe Commelinaceae charakteryzują się występowaniem efemerycznych antypod, które degenerują jeszcze przed zapłodnieniem. Wyjątkowy rozwój gametofitu żeńskiego zachodzi jednak u Tinantia erecta, gdzie antypody pozostają widoczne nawet po zapłodnieniu [12, 13]. Ponadto u innej rośliny z rodzaju Tinantia – T. anomala zaobserwowano nietypowy dla Commeli- 60 Etapy rozwoju gametofitu żeńskiego u wybranych przedstawicieli rodziny Commelinaceae naceae, monosporowy typ Oenothera przebiegający bez wykształcania antypod [10]. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Rodkiewicz B., Śnieżko R., Fyk B., Niewęgłowska B., Tchórzewska D. Embriologia Angiospermae rozwojowa i eksperymentalna, Lublin: Wydawnictwo Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej, 1996, s. 67-86 Bednarska E. Zarys embriologii roślin okrytonasiennych, Wydawnictwo Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Toruń 1994, s. 80-84 Raghavan V. Developmental biology of flowering plants, Springer, New York 2000, s. 216-227 Yadegari R, Drews G. N. Female gametophyte development, The Plant Cell, 16 (1) 2004, s. 133-141 Faden R. B. Floral biology of Commelinaceae, [W]: Proceedings of the Second International Conference on the Comparative Biology of the Monocots, eds. Wilson K. L., Morrison D. A. Melbourne CSIRO, 2000, s. 309-317 Faden R. B., Hunt D. R. The classification of the Commelinaceae, Taxon 40 1991, s. 19-31 Heywood V. H., Brummitt R. K., Culham A., Seberg O. Flowering plant families of the world, Ontario, Firely Books, 2007, s. 359 Davis G. L. Systematic embryology of the angiosperms, J. Wiley & Sons 1966, New York, USA Batygina T. B. Comperative embryology of flowering plants, Leningrad, 1983 Tharp B. C. Commelinantia, a new genus of the Commelinaceae, Bulletin of the Torrey Botanical Club, Vol. 49 (9) 1922, s. 269-275 Faden R. B. Commelinaceae, [W] Kubitzki K. (ed.), Flowering Plants Monocotyledons, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1998, s. 109-128 Chikkannaiah P. S. Embryology of some members of the family Commelinaceae; Commelina subulata Roth, Phytomorphology, 13 (1963), s. 174-184 Chikkannaiah P. S. An embryological study of Murdannia simplex (Vahl) Brenan, Journal of the Indian Botanical Society, 43 (1964), s. 238-248 Hjelmqvist H., Grazi F. G. Studies of variation in embryo sac development: second part, Botaniska Notiser, 118 (1965), s. 329-360 Dharamadhaj P., Prakash N. Development of the anther and ovule in Capsicum L., Australian Journal of Botany, 26 (1978), s. 433-439 Faden R. B., Suda Y. Cytotaxonomy of Commelinaceae: chromosome numbers of some African and Asiatic species, Botanical Journal of Linnean Society, 81 (1980), s. 301-325 Hardy C. R., Stevenson D. W. Development of the gametophytes, flower, and floral vasculature in Cochliostema odoratissimum (Commelinaceae), Botanical Journal of Linnaean Society, 134 (2000), s. 131-157 Hardy C. R., Stevenson D. W., Kiss H. G. Development of the flower, gametophytes, and floral vasculature in Dichorisandra thyrsiflora (Commelinaceae), American Journal of Botany, 87 (2000), s. 1228-1239 61 Joanna Gębura, Olha Budnyk, Krystyna Winiarczyk Etapy rozwoju gametofitów żeńskich u wybranych przedstawicieli rodziny Commelinaceae Streszczenie Rozwój gametofitów żeńskich jest bardzo ważnym procesem warunkującym przebieg rozmnażania płciowego u roślin okrytonasiennych. Woreczki zalążkowe wytwarzają gamety żeńskie (komórkę jajową oraz komórkę centralną), które uczestniczą w podwójnym zapłodnieniu. Rozwój woreczków zalążkowych przebiega dwuetapowo. W pierwszym etapie powstaje haploidalna megaspora funkcjonalna, która w drugim etapie dzieli się mitotycznie, dając początek gametom. U roślin okrytonasiennych opisano kilkanaście typów rozwoju woreczków zalążkowych. Rozwój gametofitów żeńskich jest charakterystyczny gatunkowo. W licznej rodzinie Commelinaceae występuje duże zróżnicowanie pod względem sposobu rozwoju woreczków zalążkowych. Najpowszechniejszym typem rozwoju gametofitów żeńskich u roślin z opisywanej rodziny jest monosporowy typ Polygonum, który prowadzi do wytworzenia 7-komórkowego i 8jądrowego woreczka zalążkowego. W rodzinie Commelinaceae 7-komórkowe i 8-jądrowe woreczki zalążkowe rozwijają się także według bisporowego typu Allium oraz tetrasporowego typu Adoxa. Wyjątkowy rozwój woreczka zalążkowego przebiega u gatunku Tinantia anomala, u którego zaobserwowano 4-komórkowy i 4-jądrowy gametofit żeński powstający według typu Oenothera. Słowa kluczowe: woreczek zalążkowy, gametofit żeński, Commelinaceae Stages of female gametophytes development at representatives selected from Commelinaceae family Abstract Development of female gametophytes is a really important process for sexual reproduction at Angiosperms. Embryo sacs produce female gametes (egg cell and central cell), which participate in double fertilization. Embryo sac development is a two-step process. In first stage haploid, functional megaspore is formed. In second stage this megaspore divide mitotically and produce gametes. In angiosperms described several types of embryo sac development. The development of female gametophyte is characteristic to the species. The large family Commelinaceae is very diverse in terms of embryo sac development. The most common type of female gametophytes development of the family is monosporic Polygonum type, that produces the 7-cell and 8- nucleate embryo sac. In the family Commelinaceae 7-cell and 8-nucleate embryo sacs develop also according to the bisporic Allium type and tetrasporic Adoxa type. The unique embryo sac development occurs in the species Tinantia anomala. In this species a 4-cell and 4nucleate female gametophyte were observed. T. anomala embryo sac was formed according to the Oenothera type. Keywords: embryo sac, female gametophyte, Commelinaceae 62 Olha Budnyk1, Piotr Sugier1 Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania 1. Wstęp Rodzaj Chara (Ramienice) z Characeae stanowią wyodrębnioną makroskopową grupę zielenic, występującą w różnych typach wód powierzchniowych, najczęściej jednak w zbiornikach wody słodkiej. Organizmy te znacznie rzadziej pojawiają się w wodach płynących, a specyficzne gatunki zasiedlają także wody słonawe i słone [1-3]. Ramienice mogą się rozmnażać wegetatywnie poprzez na przykład bulbille i generatywnie tworząc diploidalne oospory. Poświęcenie uwagi tej grupie makroglonów jest niezmiernie ważne, ze względu na istotną rolę jaką odgrywają w funkcjonowaniu ekosystemów wodnych [4]. Wiążą biogeny, stabilizują osady, przyczyniają się do występowania tzw. stanu czystowodnego [4-8]. Charofity jako jedne z pierwszych kolonizatorów pełnią istotną rolę w odtwarzaniu roślinności w zbiornikach wodnych [5, 9]. Ponowny powrót ramienic jest czytelnym sygnałem znacznej poprawy statusu ekologicznego, czy też pożądanym efekty renaturyzacji [10-12]. Są one jednak wrażliwe na zmiany przezroczystości wody, szczególnie w jeziorach płytkich, co bardzo często prowadzi do zanikania tych makrolitów i wkraczania innych gatunków konkurencyjnych [13-18]. Bardzo ważnym czynnikiem limitującym wzrost i reprodukcję charofitów [19, 21, 22] oraz niezbędnym do inicjacji kiełkowania uśpionych oospor jest światło [23, 24]. Jego natężenie wpływa na morfologię plech ramienic oraz ich inkrustację [1, 25, 26], a poszczególne gatunki wykazują różną wrażliwość na zmiany wartości tego parametru [26]. Ramienice mogą zmieniać zachowanie reprodukcyjne dostosowaniem się do fluktuacji poziomu wody, a pojawienie się organów rozmnażania płciowego i dojrzewanie diaspor są stymulowane bardzo często w wyniku jego obniżenia [27, 28] i zwiększenia intensywności światła [26]. Kiełkowanie oospor zależy od wielu czynników środowiskowych: temperatury [29, 30, 31], przesuszenia [31-33], zakwaszenia wód [1, 34, 35], zasolenia [36], czy też zmiany potencjału redox [37]. 1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie -Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii i Biotechnologii, Zakład Ekologii, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin 63 Olha Budnyk, Piotr Sugier W badaniach ekologicznych ekosystemów wodnych coraz częściej podejmuje się próby wyjaśnienia roli podwodnego banku diaspor w kolonizacji, dynamice roślinności oraz kształtowaniu różnorodności biologicznej [38-40]. Dla niektórych gatunków Characeae, dyspersja, kolonizacja i utrzymanie populacji zależy wyłącznie od banku oospor [41]. W przypadku wielu badań uwaga skupiona jest na zasobach i strukturze banku oospor, który cechuje się długowiecznością [40, 42, 43]. Okazuje się, że oospory ramienic mogą stanowić źródło regeneracji populacji po kilkudziesięciu, a nawet po stu latach przebywania w osadach dennych [40, 43, 44]. Zdecydowanie mniej uwagi poświęca się kiełkowaniu diaspor stanowiących tzw. „deszcz nasion”. Brak jest wyników badań dotyczących zróżnicowania morfologicznego oospor, które niejednokrotnie odzwierciedla stopień ich dojrzałości, co następnie decyduje o właściwościach podwodnego banku nasion. W niniejszych badaniach zajęto się tym problemem, a przyczynkiem do nich były wyjątkowo niekorzystne warunki siedliskowe, szczególnie dla ramienic występujących w bardzo płytkich zbiornikach wodnych, panujące w okresie lata 2015 roku, w tym przede wszystkim bardzo niski poziom wód oraz przesuszenie, niespotykane we wcześniejszych kilku dekadach. 2. Cel pracy Celem badań było określenie dynamiki i zdolności kiełkowania oospor ramienicy kolczastej Chara intermedia A. Braun, gatunku powszechnie występującego zarówno w jeziorach jak i zbiornikach sztucznych Polski wschodniej. 3. Materiały i metody Badania terenowe przeprowadzono w listopadzie 2015 r. na torfowisku w okolicy miejscowości Strupin Łanowy (51o05’N, 29o07’E), gdzie w przeszłości prowadzono eksploatację torfu. Jest ono zasilane przez wody bogate w wapń, porośnięte przed laty przez roślinność kalcyfilną, a obecnie zbiorowiska łąkowe, których obecność jest rezultatem melioracji i zagospodarowania tego terenu z przeznaczeniem go na łąki i pastwiska. Po wytypowaniu jednego z wyrobisk potorfowych w którym występowała ramienica kolczasta Chara intermedia, pobrano przesuszone w okresie lata plechy i równocześnie osady organiczne z warstwy o głębokości 10 cm. Po pobraniu oospor z plech i obserwacji mikroskopowej w warunkach laboratoryjnych wyróżniono 3 typy morfologiczne: oospory z otoczką wapienną (RG), oospory z otoczką wapienną w resztkach oosporangium (ROO) oraz oospory bez otoczki wapiennej (RO). Czwarty typ stanowiły oospory pobrane z osadów, przemywanych na sicie o średnicy oczek 64 Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania 0,25 mm. Porównawcze badania mikroskopowe wykazały zdecydowaną dominację w osadach oospor z otoczką wapienną (gyrogonitów), podczas gdy oospory bez otoczki występowały sporadycznie. Zebrany materiał (kilka tysięcy oospor) zhomogenizowano w obrębie wyróżnionych typów, a następnie wybrano 7 serii po 100 oospor w trzech powtórzeniach i umieszczono je w naczyniach wypełnionych wodą. Eksperyment przeprowadzono w komorze wegetacyjnej, w ciemności i w temperaturze 10oC. Pierwsze partie materiału analizowano po 25 dniach, a kolejne serie, regularnie w odstępach 10-cio dniowych, przeprowadzając obserwacje mikroskopowe i określając procentowy udział skiełkowanych oospor. Na podstawie uzyskanych danych określono dynamikę kiełkowania wszystkich wyróżnionych typów oospor. Przy identyfikacji oospor pozyskanych z osadów wzięto pod uwagę takie parametry biometryczne jak: długość i szerokość maksymalną, indeks ISI (długość/szerokość*100) oraz liczbę listew i szerokość bruzdy, według zaleceń [45]. Pomiary wykonywano z użyciem mikroskopu stereoskopowego Olympus SZX 16 i programu Stream Motion. Przy identyfikacji i klasyfikacji poszczególnych typów oospor wykorzystano skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) TESCAN VEGA3-LMU. W celu dokonania obserwacji w SEM świeżo pobrany materiał umieszczono na stolikach aluminiowych pokrytych dwustronną węglanową taśmą przewodzącą. Chcąc uzyskać mniej artefaktów na badanych powierzchniach próbki mrożono w temperaturze -35oC w niskiej próżni (15 Pa). Obserwacje wykonano w Pracowni Mikroskopowej Zakładu Botaniki i Mikologii oraz Zakładu Zoologii Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, natomiast eksperyment przeprowadzono w Laboratorium Ekologiczno-Gleboznawczym Zakładu Ekologii. Wyniki opracowano statystycznie wykorzystując statystyki nieparametryczne: test KruskalaWallisa oraz test U Manna-Whitneya. 4. Wyniki Dynamika kiełkowania wyróżnionych typów oospor kształtowała się odmiennie (wykresy 1, 2, 3, 4). W przypadku oospor z otoczką wapienną (gyrogonitów) pobranych z przesuszonych plech, po 25 dniach eksperymentu stwierdzono około 2% skiełkowanych oospor, zaś w kolejnych odstępach czasowych około 6%, a wzrost był istotny statystycznie (wykres 1). Podczas kolejnych obserwacji zarejestrowano wyższe wartości procentowego udziału skiełkowanych oospor, jednak różnice między nimi nie były istotne statystycznie. 65 Olha Budnyk, Piotr Sugier Wykres 1. Dynamika kiełkowania oospor z otoczką wapienną (gyrogonitów) pobranych z przesuszonych plech ramienicy kolczastej Chara intermedia; te same litery oznaczają brak statystycznie istotnych różnic [opracowanie własne] Oospory z otoczką wapienną (gyrogonity) w resztkach oosporangium pobrane z przesuszonych plech charakteryzowały się bardzo małym i bardzo zmiennym udziałem skiełkowanych diaspor (wykres 2). Podczas trwania eksperymentu średni procentowy ich udział nie przekraczał 1%, a różnice między poszczególnym etapami obserwacji nie były istotne statystycznie. Wykres 2. Dynamika kiełkowania oospor z otoczką wapienną (gyrogonitów) w resztkach oosporangium pobranych z przesuszonych plech ramienicy kolczastej Chara intermedia [opracowanie własne] 66 Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania Wykres 3. Dynamika kiełkowania oospor bez otoczki wapiennej pobranych z przesuszonych plech ramienicy kolczastej Chara intermedia; te same litery oznaczają brak statystycznie istotnych różnic [opracowanie własne] W przypadku oospor pozbawionych otoczki wapiennej pobranych z przesuszonych plech, skiełkowane diaspory stwierdzono dopiero po 45 dniach od momentu rozpoczęcia eksperymentu, a procentowy ich udział wynosił około 1% (wykres 3). 10 dni później udział skiełkowanych oospor był statystycznie istotnie wyższy w porównaniu do wyniku poprzedniej obserwacji i wynosił około 3%. W kolejnych terminach rejestrowano wzrost procentowego udziału skiełkowanych oospor do około 5-6%, jednak ze względu na dużą zmienność danych różnice między wartościami tego parametru nie były istotne statystycznie. Wykres 4. Dynamika kiełkowania oospor ramienicy kolczastej Chara intermedia pobranych z osadu [opracowanie własne] Procentowy udział skiełkowanych oospor pobranych z osadu, już po 25 dniach trwania eksperymentu wynosił około 17% (wykres 4). Wartość tego parametru była kilkakrotnie wyższa w porównaniu do równoległych obserwacji trzech pozostałych typów diaspor pobranych z roślin. W kolejnych terminach obserwacji nie stwierdzono statystycznie istotnego wzrostu procentowego udziału skiełkowanych oospor. 67 Olha Budnyk, Piotr Sugier Wykres 5. Porównanie zdolności kiełkowania (%) wyróżnionych typów oospor ramienicy kolczastej Chara intermedia. RG – oospory z otoczką wapienną (gyrogonity) pobrane z plech, ROO – oospory z otoczką wapienną (gyrogonity) w resztkach oosporangium pobrane z plech, RO – oospory bez otoczki wapiennej pobrane z plech, OO – oospory pobrane z osadu; te same litery oznaczają brak statystycznie istotnych różnic [opracowanie własne] Na podstawie przeprowadzonych obserwacji stwierdzono, że najmniejszą zdolnością kiełkowania (przeciętnie 2%) charakteryzowały się oospory z otoczką wapienną w resztkach oosporangium, a największą oospory pochodzące z podwodnego banku diaspor (wykres 5). W ostatnim terminie obserwacji zarejestrowano ponad 20% skiełkowanych oospor pochodzących z osadów, a ich zdolność kiełkowania była ponad trzykrotnie wyższa niż zdolność kiełkowania oospor z otoczką wapienną, ponad czterokrotnie wyższa niż oospor bez otoczki wapiennej i aż ponad 20-krotnie wyższa w relacji do oospor z otoczką wapienną (gyrogonitów) w resztkach oosporangium (wykres 5). 5. Dyskusja Jedną z ważnieszych przyczyn zróżnicowanej zdolności kiełkowania oospor ramienic jest ich spoczynek [46] oraz wiek [47]. W okresie spoczynku oospory nie są zdolne do kiełkowania, czego przyczyną jest obecność w nich inhibitorów wzrostu hamujących kiełkowanie. Ma to duże znaczenie w przypadku przetrwania niekorzystnych okresów pogodowych, np. suszy czy zimy [31, 32]. Wcześniejsze badania dotyczące kiełkowania oospor Characeae wykazują zarówno względny (wymuszony) jak i bezwzględny (głęboki) stan spoczynku, a czynniki wpływające na przełamanie każdego z nich są zróżnicowane w zależności od gatunku, czy też położenia geograficznego [48, 49, 31, 33]. Generalnie świeże oospory, te wytworzone w danym okresie wegetacyjnym, wykazują głębszy, a więc wtórny stan spoczynku, niż te znajdujące się w osadach dennych [50]. Uzyskane w przedstawionej pracy wyniki wskazują, że oospory pobrane 68 Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania z plech roślin, są prawdopodobnie we wtórnym spoczynku. Świadczy o tym fakt bardzo niskiej zdolności kiełkowania w trakcie trwania eksperymentu. Średnia wartość zdolności kiełkowania oospor pobranych z plech była kilkakrotnie, a nawet ponad 20-krotnie mniejsza od średniej zdolności kiełkowania oospor pobranych z osadów, teoretycznie starszych, w porównaniu do oospor wytworzonych na plechach ramienic. Ponadto stwierdzono brak statystycznie istotnych różnic między kiełkowaniem oospor a gyrogonitów. Całkowite usunięcie otoczki wapiennej nie powoduje więc znaczącego wzrostu kiełkowania, co oznacza, że nie ma mechanicznych ograniczeń kiełkowania związanych z występowaniem struktury okrywającej [51]. Kwiatkowska i Godlewski [52, 53] stwierdzili stymulujący wpływ fitohormonu GA3 na dojrzewanie oogoniów i powstanie oospor Chara vulgaris, których liczba wzrastała proporcjonalne do wzrostu srężenia tego hormonu. Można przypuszczać, że mechanizmem blokującym kiełkowanie oospor pobranych z plech w badaniach własnych (kilkakrotnie mniejsza zdolność kiełkowania w relacji do oospor osadowych) mogą być jakieś trwałe substancje o charakterze inhibitorów, bardzo wolno ulegające degradacji. Aby zweryfikować tę tezę, konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań laboratoryjnych. Gyrogonity (oospory pokryte otoczką wapienną) są przede wszystkim obiektem badań paleontologicznych [54, 55], natomiast widoczna jest luka w wiedzy dotyczącej gyrogonitów współcześnie występujących ramienic [56]. Zdaniem badaczy przedmiotu, oprócz morfologicznych aspektów, bardzo istotna jest wiedza dotycząca warunków ekologicznych mających wpływ na powstawanie oospor, kalcyfikację zapłodnionego oogonium i ostatecznie formowanie się gyrogonitu [56]. W przypadku większości gatunków ramienic po wytworzeniu się oospory kontynuowany jest proces dojrzewania i formowania się gyrogonitu [56, 57]. Oospory i gyrogonity są wytwarzane wewnątrz oosporangium i reprezentują różne fazy dojrzewania [56]. Zatem w przypadku prezentowanych badań własnych wyróżnione typy morfologiczne pobrane z plech cechują się różnym stopniem dojrzałości oraz różną zdolnością kiełkowania, a deponowane w osadach dennych mogą mieć wpływ na strukturę i właściwości podwodnego banku diaspor. 6. Podsumowanie Na podstawie przeprowadzonych obserwacji stwierdzono, że najmniejszą zdolnością kiełkowania (przeciętnie 2%) charakteryzowały się oospory z otoczką wapienną w resztkach oosporangium, a największą oospory pochodzące z podwodnego banku diaspor. W ostatnim terminie 69 Olha Budnyk, Piotr Sugier obserwacji zarejestrowano ponad 20% skiełkowanych oospor pochodzących z osadów, a ich zdolność kiełkowania była ponad trzykrotnie wyższa niż zdolność kiełkowania oospor z otoczką wapienną, ponad czterokrotnie wyższa niż oospor bez otoczki wapiennej i aż ponad 20krotnie wyższa w relacji do oospor z otoczką wapienną (gyrogonitów) w resztkach oosporangium. Bardzo niekorzystne warunki siedliskowe panujące w płytkich zbiornikach wodnych mogą mieć istotny wpływ na stopień dojrzałości oospor oraz ich zróżnicowanie morfologiczne. Rezultatem tego jest zróżnicowana zdolność kiełkowania diaspor, która może determinować właściwości podwodnego banku nasion. Literatura Dąmbska I. Charophyta – ramienice. Flora Słodkowodna Polski, Państwowe Wydawnictwo Naukowe, 13 (1964), s. 1-126 2. Coops H. Ecology of charophytes: an introduction, Aquatic Botany, 72 (2002), s. 205-208 3. Pełechaty M., Pukacz A. Klucz do oznaczania ramienic (Characeae) w rzekach i jeziorach [online], Biblioteka Monitoringu Środowiska. Wydanie 1. Warszawa., (2008), Inspekcja Ochrony Środowiska., Dostępny w Internecie: http://www.gios.gov.pl/images/dokumenty/raporty/Ramienice_klucz.pdfWersj a z dnia 02.08.2016 r. 4. Krause W. Characeen als Bioindikatoren für den Gewässerzustand, Limnologica, 13 (1981), s. 399-418 5. van den Berg M. S., Scheffer M., Coops H., Simons J. The role of characean algae in the management of eutrophic shallow lakes, Journal of Phycology, 34 (1998), s. 750-756 6. Casanova M. T., de Winton M. D. Clayton J. S. Do charophytes clear turbid water? Verhandlungen internationale vereiningung für theroretische und angewandte limnologie, 26 (2003), s. 1440-1443 7. Kufel L., Kufel I. Chara beds acting as nutrient sinks in shallow lakes – a review, Aquatic Botany, 72 (2002), s. 249-260 8. van Donk E., van de Bund W. J. Impact of submerged macrophytes including charophytes on phyto- and zooplankton communities: allelopathy versus other mechanisms, Aquatic Botany, 72 (2002), s. 261-274 9. Blindow I. Reasons for the decline of Charophytes in eutrophicated lakes in Scania (Sweden). Extant and Fossil Charophytes, Bulletin de la Société Botanique de France, 138 (1991), s. 95 10. Moss B., Stansfield J., Irvine K., Perrows M., Phillips G. Progressive restoration of a shallow lake: a 12-year experiment in isolation, sediment removal and biomanipulation, Journal of Applied Ecology, 33 (1996), s. 71-86 1. 70 Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania 11. van Nes E. H., Scheffer M., van den Berg M. S., Coops H. Aquatic macrophytes: restore, eradicate or is there a compromise?, Aquatic Botany, 72 (2002 a), s. 387-403 12. Rodrigo M. A., Rojo C, Segura M, José L. Alonso-Guillén J. L, Martín M Pablo Vera P. The role of charophytes in a Mediterranean pond created for restoration purposes, Aquatic Botany, 120 (2015), s. 101-111 13. Blindow I. Decline of charophytes during eutrophication: comparison with angiosperms, Freshwater Biology, 28 (1992), s. 9-14 14. Wells R. D. S., de Winton M. D., Clayton J. S. Impacts of successive macrophyte invasions on the submerged flora of Lake Tarawera, Central North Island, New Zealand, New Zealand journal of marine and fresh water research, 31 (1997), s. 449-459 15. van den Berg M. S., Scheffer M., van Nes E. H., Coops H. Dynamics and stability of Chara sp. and Potamogeton pectinatus in a shallow lake changing in eutrophication level, [W] van den Berg M. S. (Ed.), Charophyte colonization in shallow lakes: processes, ecological effects and implications for lake management, Thesis Vrije Universiteit Amsterdam, RIZA report 99.015, (1999 a), s. 138 16. Sugier P., Pełechaty M., Gąbka M, Owsianny P. M, Pukacz A., Ciecierska H., Kolada A. Lychnothamnus barbatus: global history and distribution in Poland, Charophytes, 2(1) (2009), s. 19-24 17. Pełechaty M., Gąbka M, Sugier P., Pukacz A., Chmiel S., Ciecierska H., Kolada A. Owsianny P. M. Lychnothamnus barbatus in Poland: habitats and associations, Charophytes, 2(1) (2009), s. 13-18 18. Urbaniak J., Sugier P., Gąbka M. Charophytes of the Lubelszczyzna Region (Eastern Poland), Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 80(2) (2011), s. 159-168 19. Corillion R. Flore des Charophytes du Massif Armoricain et des contrées voisines d‟Europe occidentale, Flore et végétation du Massif Armoricain, IV, Jouve Editeurs, 4 (1975), s. 216 20. Spence D. H. N. Light and plant response in fresh water. In: Evans G.C., Bainbridge & Rackham O. (eds.), Light as an ecological factor:II, Blackwell Scientific Publications, Oxford, (1976), s. 93-133 21. Sokol R. C., Stross R. G. Phytochrome mediated germination of very sensitive oospores, Plant Physiology, 100 (1992), s. 1132-1136 22. de Winton M. D., Casanova M. T., Clayton J. S. Charophyte germination and establishment under low irradiance, Aquatic Botany, 79 (2004), s. 175-187 23. Stross R.G. The temporal window of germination in oospores of Chara (Charophyceae) following primary dormancy in the laboratory, New Phytologist, 113 (1989), s. 491-495 24. Sabbatini M. R., Argüello J. A., Fernández O. A., Bottini R. A. Dormancy and growth-inhibitor levels in oospores of Chara contraria A. Braun ex Kütz. (Charophyta), Aquatic Botany, 28 (1987), s. 189-194 25. Schwarz A. M., Hawes I., Howard-Williams C. The role of the photosynthesis/light relationship in determining lower depth limits of Characeae in South Island, New Zealand lakes, Freshwater Biology, 35 (1996), s. 69-80 71 Olha Budnyk, Piotr Sugier 26. Wang H., Yu D., Xiao K., The interactive effects of irradiance and photoperiod on Chara vulgaris L.: concerted responses in morphology, physiology, and reproduction, Hydrobiologia, 610 (2008), s. 33-41 27. Casanova M. T. Vegetative and reproductive responses of charophytes to waterlevel fluctuations in permanent and temporary wetlands in Australia, Australian Journal of Marine and Freshwater Research, 45 (1994), s. 1409-1419 28. Casanova M. T, Brock M. A. Charophyte occurrence, seed banks and establishment in farm dams in New South Wales, Australian Journal of Botany, 47 (1999), s. 437-444 29. Karling J. S. A preliminary account of the influence of light and temperature on growth and reproduction in Chara fragilis, Bulletin of the Torrey Botanical Club, 51 (1924), s. 469-486 30. Hendreson T. Some factors affecting oospore germination in Chara zeylanica Willdenow, (1961), s. 39 31. Casanova M. T., Brock M. A. Can oospore germination patterns explain charophyte distribution in permanent and temporary wetlands?, Aquatic Botany, 54 (1996), s. 297-312 32. Proctor V. W. Storage and germination of Chara oospores, Journal of Phycology, 3 (1967), s. 90-92 33. Sokol R. C., Stross R. G. Annual germination window in oospores of Nitella furcata (Charophyceae), Journal of Phycology, 22 (1986), s. 403-406 34. Olsen S. The vegetation in Praesto Fjord 1. Spermatophyta and charophyta. In K. Hansen (1953). Investigation of the Geography and Natural History of the Praesto Fjord, Zealandia, Folia Geographica Danica, 3 (4) (1945), s. 84-130 35. Corillion R. Les Charophycées de France et d‟Europe Occidentale, Bulletin Society Science Bretagne, 32 (1957), s. 1-259 36. Brock M. A., Lane J. A. K. The aquatic macrophyte flora of saline wetlands in Western Australia in relation to salinity and permanence, Hydrobiologia, 105 (1983), s. 63-76 37. Bonis A., Lepart J. Vertical structure of seed banks and the impact of depth of burial on recruitment in two temporary marshes, Plant Ecology, 112 (1994), s. 127-139 38. Ozimek T. The possibility of submerged macrophyte recovery from a propagule bank in the eutrophic Lake Mikołajskie (North Poland), Hydrobiologia, 570 (2006), s. 27-131 39. Perrow M. R., Meijer M. L., Dawidowicz P., Coops H. Biomanipulation in shallow lakes: state of the art, Hydrobiologia, 342/343 (1997), s. 355-365 40. Rodrigo M. A., Alonso-Guillen J. L., Soulié-Märsche I. Reconstruction of the former charophyte community out of the fructifications identified in Albufera de Valencia lagoon sediments, Aquatic Botany, 92 (2010), s. 14-22 41. Bonis A., Grillas P. Deposition, germination and spatio-temporal patterns of charophyte propagule banks: a review, Aquatic Botany, 72 (2002), s. 235-248 42. Sederias J., Colman B. The interaction of light and low temperature on breaking the dormancy of Chara vulgaris oospores, Aquatic Botany, 87 (2007), s. 234-329 72 Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania 43. Sugier P. Ekological processes and properties of excavated peatlands of Eastern Poland, Towarzystwo Wydawnictw Naukowych LIBROPOLIS, Lublin, (2014), ss. 170 44. Stobbe A, Gregor T., Röpkea A. Long-lived banks of oospores in lake sediments from the Trans-Urals(Russia) indicated by germination in over 300 years old radiocarbondated sediments, Aquatic Botany, 119 (2014), s. 84-90 45. Horn af Rantzien H. Morphological terminology relating to female charophyte gametangia and fructifi cations, Botanical Notebooks, 109 (1956), s. 212-259 46. Silvertown J. M. The demographic and evolutionary consequences of seed dormancy, Plant Population Ecology. Blackwell Scientific, Oxford, (1988), s. 205-220 47. Bonis A., Lepart J. Vertical structure of seed banks and the impact of depth of burial on recruitment in two temporary marshes, Plant Ecology, 112 (1994), s. 127-139 48. Forsberg C. Sterile germination of Chara and seeds of Najas marina, Physiology Plant, 18 (1965), s. 129-137 49. Shen E.Y.F. Oospore germination in two species of Chara, Taiwania., 12 (1966), s. 39-46 50. Takatori S., Imahori K. Light reactions in the control of oospore germination of Chara delicatula, Phycologia, 10 (1971), s. 221-228 51. Sederias J., Colman B. The interaction of light and low temperature on breaking the dormancy of Chara vulgaris oospores, Aquatic Botany, 87 (2007), s. 234-329 52. Kwiatkowska M., Godlewski M. (1980) Effect of gibberellic acid and AMO1618 on the development of vegetative systems in generatively matured thalli of Chara vulgaris L., Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 49 (1980), s. 445-458 53. Kwiatkowska M., Godlewski M. Studies on the role of gibberellins in the regulation of spermatogenesis in Chara vulgaris L., Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 57 (1988), s. 547-553 54. Martín-Closas C., Diéguez C. Charophytes from the Lower Cretaceous of the Iberian Ranges (Spain), Palaeontology, 41 (1998), s. 1133-1152 55. García A., Chivas A. R. Quaternary and extant euryhaline Lamprothamnium Groves (Charales) from Australia: gyrogonite morphology and paleolimnologi calsignificance, Journal of Paleolimnology, (2004), s. 31, 321-341 56. Soulié-Märsche I., Garciá A. Gyrogonites and oospores, complementary viewpoints to improve the study of the charophytes (Charales), Acquatic Botany, 120 (2015), s. 7-17 57. Leitch A.R. Formation and ultra-structure of a complex, multilayered wallaround the oospore of Chara and Lamprothamnium (Characeae), British Journal of Social Psychology, 24 (1989), s. 229-236 73 Olha Budnyk, Piotr Sugier Stopień dojrzałości i wiek oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae) a zdolność i dynamika kiełkowania Streszczenie W pracy przedstawiono wyniki badań dotyczące dynamiki i zdolności kiełkowania oospor Chara intermedia A. Braun (Characeae), dojrzewających w zróżnicowanych warunkach hydrologicznych i termicznych. Materiałem badawczym były oospory pobrane z przesuszonych roślin oraz z powierzchniowej (10 cm) warstwy osadów dennych, występujących w wyrobisku potorfowym, powstałym przed kilkudziesięciu laty na torfowisku węglanowym. Uwzględniając zróżnicowanie morfologiczne i stopień dojrzałości oospor pobranych z plech wyróżniono 3 typy: oospory z otoczką wapienną (gyrogonity), oospory z otoczką wapienną (gyrogonity) otoczone resztkami oosporangium oraz oospory bez otoczki wapiennej. Eksperyment przeprowadzono w warunkach ograniczonego dostępu światła w temperaturze 10oC. Kiełkowanie oospor rejestrowano w odstępach 10-dniowych. Największą zdolnością kiełkowania charakteryzowały się oospory pochodzące z podwodnego banku diaspor. Pod koniec doświadczenia zarejestrowano ponad 20% skiełkowanych diaspor pochodzących z osadów dennych. Wartość tego parametru była ponad trzykrotnie wyższa niż zdolność kiełkowania oospor z otoczką wapienną, ponad czterokrotnie wyższa niż oospor bez otoczki wapiennej i aż ponad 20-krotnie wyższa w relacji do oospor z otoczką wapienną (gyrogonitów) w resztkach zoosporangium Bardzo niekorzystne warunki siedliskowe panujące w płytkich zbiornikach wodnych mogą mieć istotny wpływ na stopień dojrzałości oospor oraz ich zróżnicowanie morfologiczne. Rezultatem tego jest zróżnicowana zdolność kiełkowania diaspor, która może determinować właściwości podwodnego banku nasion. Słowa kluczowe: kiełkowanie, stan spoczynku, Chara intermedia Degree of maturity and age of oospores Chara intermedia A. Braun (Characeae) vs. their ability and dynamics of germination Abstract The paper presents results of research of the dynamics and germinability of oospores of Chara intermedia A. Braun (Characeae), maturing in different hydrological and thermal conditions. The research material included oospores collected from the surface (10cm) layer of bottom sediments and plants growing in a post-excavation pit formed several decades ago in a calcareous fen. Taking into account the morphological differentiation and the degree of maturity of oospores sampled from thalli, three types were distinguished: calcified oospores (gyrogonites), calcified oospores (gyrogonites) present in oosporangium residues, and oospores (uncalcified). The experiment was conducted under reduced light conditions at a temperature of 10oC. Oospore germination was recorded at 10-day intervals. The highest germinability was noted for oospores originating from the underwater diaspore bank. At the end of the experiment, over 20% of oospores sampled from the sediments germinated. The value of this parameter was over 3-fold higher than that of the calcified oospores, over 4-fold higher than that of the uncalcified oospores, and over 20-fold higher than that of calcified oospores (gyrogonites) present in oosporangium residues collected from thalli. The highly unfavourable habitat conditions prevailing in shallow water bodies may have a significant impact on the degree of oospore maturity and morphological diversity. This results in diverse germinability of diaspores, which may determine the properties of the underwater seed bank. Keywords: germination, dormancy, Chara intermedia 74 Monika Poniewozik1, Marzena Parzymies2 Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce 1. Wstęp Albizia julibrissin (albicja jedwabista) należy do rodziny bobowatych (Fabaceae), podrodziny mimozowatych (Mimosoidae) [1]. Albizia julibrissin jest niskim drzewem dorastającym do 12 m wysokości, o parasolowatym pokroju korony, która zapewnia cień w upalne dni. Walorem dekoracyjnym albicji są liście złożone, pierzaste liście, osiągające od 20 do 45 cm długości i 12-25 cm szerokości. Pojedyncze listki, w liczbie 10-30 par są długości 6-12 mm i szerokości 1-4 mm. Walorem dekoracyjnym albicji są różowe kwiaty, zebrane w główki. Tworzą się one na szczycie pędów, od czerwca do końca lipca. Kwiaty są pozbawione płatków, ale zbudowane z licznych pręcików przypominających nitki jedwabiu. Obok kwiatów walorem dekoracyjnym albicji jest też kora. U młodych egzemplarzy ma ona barwę ciemnozieloną, jednak z upływem czasu staje się szara z charakterystycznymi pionowymi pasami [2]. Naturalnym obszarem występowania albicji jedwabistej jest Azja, a ściślej obszar od Iranu do Chin. Uprawiana jest głównie w Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej oraz w Grecji. W warunkach Polski Albizia julibrissin może być wykorzystywana jako roślina doniczkowa, do dekoracji oranżerii i wnętrz, a w okresie letnim balkonów i tarasów. Forma ‘Rosea’ w cieplejszych regionach naszego kraju z powodzeniem może być uprawiana w gruncie. W USA i Japonii gatunek ten zaliczany jest do grupy roślin inwazyjnych. Kultury tkankowe albicji jedwabistej zakłada się głównie z nasion. Nasiona wykorzystywano do rozmnażania in vitro Albizzia chinensis. Dużym problemem u tego gatunku jest porażenie kwiatów i młodych 1 [email protected], Katedra Roślin Ozdobnych i Architektury Krajobrazu, Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, www.up.lublin.pl 2 [email protected], Katedra Roślin Ozdobnych i Architektury Krajobrazu, Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, www.up.lublin.pl 75 Monika Poniewozik, Marzena Parzymies strąków przez wciornastki [3]. Inne gatunki rozmnażane za w kulturach tkankowych za pomocą nasion to: Albizia amara [4], Albiza lebbeck [5], Albizia odoratissima [6-8]. Rajeswari i Paliwal [6] w celu mikrorozmnażania Alizia odoratissima pobierali eksplantaty węzłowe i pachwinowe z 2 letnich roślin uzyskanych z nasion. W kulturach tkankowych dla prawidłowego wzrostu i rozwoju roślin poza odpowiednią koncentracją makro- i mikroelementów oraz regulatorów wzrostu w podłożu duże znaczenie ma stężenie i odpowiedni dobór cukru. Węglowodany stosowane do wzbogacania pożywek stanowią główne źródło węgla, a tym samym są substancją niezbędną do wzrostu i rozwoju roślin oraz wpływają na wytwarzanie potencjału osmotycznego w podłożu [9, 10]. W warunkach naturalnego wzrostu i rozwoju roślin dwutlenek węgla jest pobierany z atmosfery i bierze udział w procesie fotosyntezy [10], natomiast w warunkach laboratoryjnych podstawowym źródłem węgla są cukry. W kulturach Albizia odoratissima [6, 7], Albizia chinensis [3] oraz Albizia lebbeck [5] najczęściej stosowano sacharozę w stężeniu 30 g·dm-3. Na pożywkach z dodatkiem tego węglowodanu tworzyły się rośliny o dużej liczbie pędów. Natomiast w przypadku Albizia amara stosowano 20 g·dm-3 sacharozy, co pozytywie wpływało na liczbę pędów oraz ich wysokość [4]. U Syringa vulgaris obserwowano, że największa liczba pędów z pąków pachwinowych rozwijała się na pożywkach wzbogaconych niskimi dawkami sacharozy (5 g·dm-3), a zwiększenie stężenia powodowało ograniczenie wzrostu pędów [11]. Natomiast fruktoza w ilości 30 g·dm-3 korzystnie wpływała na współczynnik rozmnażania i długość pędów Physocarpus opulifolius 'Diable D'or' [12]. Natomiast zastosowana w stę-żeniu 10 g·dm-3 pozytywnie oddziaływała na wzrost pędu głównego, a w ilości 10 g·dm-3 stymulowała jego rozkrzewianie [13]. 2. Cel pracy Mikrorozmnażanie pozwala na uzyskanie dużej liczby, jednorodnych genetycznie roślin w krótkim czasie. Na ich jakość, w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych, w dużym stopniu wpływa skład pożywki, w tym dostępność węglowodanów. W ostatnich latach prowadzono liczne prace badawcze dotyczące mikrorozmnażania Albizia sp., przede wszystkim Albizia amara [4], Albizia chinensis [3], Albizia lebbeck [5] i Albizia odoratissima [6-8]. Jednak większość z nich koncentrowała się głównie na roli regulatorów wzrostu, tj. cytokinin które wpływają na proliferację pędów i auksyn – na ukorzenianie. W niniejszej pracy przedstawiono wpływ węglowodanów na kultury albicji jedwabistej (Albizia julibrissin). Celem przeprowadzonego doświadczenia było określenie wpływu i przydatności cukrów (sacharoza, glukoza, fruktoza, sorbitol i ksyloza) w róż- 76 Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce nych stężeniach na wzrost i rozkrzewianie pędów oraz wytwarzanie tkanki kalusowej u Albizia julibrissin. Uzyskane wyniki pozwolą na optymalizację mikrorozmnażania albicji jedwabistej w kulturach in vitro. 3. Materiały i metody Doświadczenie założono w laboratorium Katedry Roślin Ozdobnych i Architektury Krajobrazu Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Materiał roślinny stanowiły fragmenty wierzchołkowe pędów o długości 20 mm z 1 liściem, pochodzące z ustabilizowanej kultury in vitro Albizia julibrissin. Eksplantaty wyłożono na pożywkę podstawową Murashige i Skooga (MS) [14] zawierającą zestaw makro- i mikroelementów oraz wit. B1 – 0,1 mg·dm-3, wit. B6 – 0,5 mg·dm-3, wit. PP – 0,5 mg·dm-3, glicynę – 2,0 mg·dm-3 i inozytol – 100 mg·dm-3. Pożywkę uzupełniono regulatorami wzrostu: benzyloadeniną (BA) – 0,5 mg·dm-3 oraz kwasem indolilomaslowym (IBA) – 0,05 mg·dm-3. Źródło węgla stanowiły następujące rodzaje węglowodanów: sacharoza, glukoza, fruktoza, sorbitol i ksyloza w stężeniach 10, 20, 30,40 g·dm-3. Kontrolę stanowiła pożywkę bez dodatku cukru. PH podłoża ustalono na poziomie 5,7 przy użyciu 1M NaOH i 1M KCl. Pożywkę zestalono agarem (6,75 g·dm-3), rozlano do kolb Elenmayer'a o pojemności 300 ml. Do każdej kolby wlano 50 ml pożywki. Naczynia z podłożem autoklawowano w temperaturze 121oC pod ciśnieniem 1 atmosfery przez 21 min. Doświadczenie obejmowało 21 kombinacji, z których każda liczyła po 3 powtórzenia (kolby). W sterylnych warunkach, pod komorą z laminarnym przepływem powietrza wyłożono pędy na pożywki. Do każdej kolby wyłożono po 7 eksplantatów wierzchołkowych długości 20 mm, z 1 liściem. Kolby z pędami umieszczono w fitotronie w warunkach 16-godzinnego fotoperiodu i w temperaturze 28oC±2oC. Jako źródło światła zastosowano lampy fluorescencyjne typu Fluora o intensywności 30 μmol·m-2·s-1. Doświadczenie zakończono po 8 tygodniach. Oceniono następujące parametry: liczbę wytworzonych pędów (szt.), długość pędów (mm), świeżą masa pędów (mg), liczbę liści na pędach (szt.), średnicę tkanki kalusowej (mm) oraz świeżą masę tkanki kalusowej (mg). Uzyskane dane liczbowe zweryfikowano statystycznie za pomocą analizy wariancji dla ortagonalnej i nieortagonalnej klasyfikacji jednoczynnikowej. Dla oceny istotności różnic pomiędzy średnimi zastosowano przedział ufności Tukey’a na poziomie istotności α=0,05. 77 Monika Poniewozik, Marzena Parzymies 4. Wyniki Stwierdzono, że wzrost pędów Albizia julibrissin w kulturach in vitro był uzależniony od rodzaju oraz stężenia cukru dodanego do pożywki. Spośród 5 rodzajów węglowodanów dodanych do podłożą wzrost i rozwój pędów następował na pożywkachach uzupełnionych sacharozą, glukozą i fruktozą. W obecności alkoholi cukrowych: sorbitolu i ksylozy obserwowano nekrozy i w konsekwencji zamieranie eksplantatów. Najwięcej nowych pędów formowało się na pożywkach zawierających 10 g·dm-3 (8,3 szt.) sacharozy, a nieznacznie mniej w obecności 10 g·dm-3 glukozy (7,1 szt.). Najmniejszą liczbę pędów uzyskano w kombinacji kontrolnej nie zawierającej cukrów w podłożu (1 szt.) [tabela 1.] [Rysunek 1.]. Otrzymane wyniki pozwalają stwierdzić, wzbogacenie podłoża niskimi dawkami sacharozy i glukozy pozwala na uzyskanie dobrych jakościowo roślin o dużej liczbie pędów. Ponadto wykazano, że eksplantaty Albizia julibrissin w kombinacji kontrolnej, wytworzył średnio tylko po 1 pędzie. Zastosowanie cukru jest konieczne i znacząco wpływa na proliferację pędów, a jego brak w podłożu znacząco ogranicza ich liczbę. Stwierdzono, że wysokie stężenia sacharozy (40 g·dm-3) zwiększyło wzrost elongacyjny pędów. Na podłożach uzupełnionych wysokimi dawkami tego cukru średnia długość pędów wynosiła 24,7 mm. Najmniejszą długość obserwowano na podłożach uzupełnionych 10 g·dm-3 sacharozy (14,6mm), 10 g·dm-3 glukozy (15,4 mm) oraz 30 g·dm-3 (15,0 mm) i 40 g·dm-3 fruktozy (14,7mm). W przeprowadzonym doświadczeniu stwierdzono różnice w świeżej masie pędów na skutek wzbogacenia podłoża różnymi rodzajami węglowodanów. Największą masą charakteryzowały się rośliny uzyskane na pożywce uzupełnionej sacharozą w stężeniu 40 g·dm-3 (47,2 mg). Najsłabszy przyrost masy wykazano na podłożu kontrolnym pozbawionym obecności węglowodanów (11,2 mg). W doświadczeniu wykazano istotny wpływ cukrów na liczbę liści Albizia julibrissin. Stwierdzono, że najwięcej liści wytwarzały rośliny wyłożone na pożywkę uzupełnioną wysokimi dawkami sacharozy tj. 30 g·dm-3 i 40 g·dm-3 (2,7 szt.), glukozą w stężeniu 20 g·dm-3 (2,6 szt.) i 30 g·dm-3 (2,7 szt.) oraz 30 g·dm-3 fruktozy (2,6 szt.). Tym samym stwierdzono, że obecność cukru jest niezbędna do prawidłowego wzrostu i rozwoju liści, a najmniejszą liczbę liści obserwowano na pożywce kontrolnej (1 szt.). W niniejszej pracy wykazano, że obecność cukrów w podłożu warunkuje wzrost tkanki kalusowej [Tabela 2.] [Rysunek 1.]. Przy czym dowiedziono, że rodzaj i stężenie cukru wpływa na średnicę i świeżą masę tkanki kalusowej. Tkankę kalusową o największej średnicy uzyskano na pożywce wzbogaconej 30 g·dm-3 glukozy (12,9 mm) i przy niskich stężeniach sacharozy tj. 20 g·dm-3 (12,3mm) oraz 10 g·dm-3 (12,2 mm). Na pożywkach z dodatkiem glukozy w stężeniach 20 g·dm-3 (1334,8 mg) oraz 30 g·dm-3 (1004,8 mg) eksplantaty 78 Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce wytwarzały tkankę kalusową o największej świeżej masie. Wysokie stężenia glukozy (40 g·dm-3) i fruktozy (40g·dm-3) były nieprzydatne w kulturach in vitro Albizia julibrissin, gdyż powodowały wytwarzanie tkanki kalusowej o małej średnicy (odpowiednio 7,9mm oraz 7,0mm) oraz niewielkiej świeżej masie odpowiednio (485,5 mg i 353,8 mg). Na pożywce kontrolnej (bez cukru) nie obserwowano tworzenia się tej tkanki. Niskie stężenia sacharozy (10 g·dm-3) korzystnie wpływały na proliferację pędów. Zastosowanie sacharozy w stężeniu 40 g·dm-3 powodowało, że uzyskano rośliny o najdłuższych pędach, największej świeżej masie oraz dużej liczbie liści w porównaniu do pozostałych stężeń i rodzajów cukrów. W celu uzyskania tkanki kalusowej Albizia julbibrissin polecane jest uzupełnienie pożywki 30 g·dm-3 glukozy, w obecności której uzyskano tkankę kalusową o dużej średnicy i świeżej masie. Natomiast brak cukrów w podłożu istotnie wpływał na ograniczenie liczby pędów wytwarzanych przez rośliny, ich świeżą masę i liczbę liści, a także powodował, że w kulturach Albizia julibrissin nie powstawała tkanka kalusowa. Tabela 1. Wpływ węglowodanów i ich stężenia na wzrost i rozwój pędów Albizia julibrissin Durazz w kulturach in vitro [opracowanie własne] Rodzaju cukru Kontrola* Sacharoza Fruktoza Glukoza Stężenie (g·dm-3) Liczba pędów (szt) Długość pędów (mm) Świeża masa pędów (mg) Liczba liści (szt) 0 1 g* 17,6 b 11,2 d 1,0 b 10 8,3 a 14,6 c 29,4 b 2,1 b 20 4,3 c-e 18,7 b 31,3 b 3,1 a 30 2,9 c-f 19,8 ab 34,9 ab 2,7 a 40 4,0 c-f 24,7a 47,2 a 2,7 a 10 5,1 a-c 17,4 b 26,9 bc 2,0 b 20 4,5 c-e 19,6 ab 34,4 ab 2,4 ab 30 2,4 ef 15,0 c 21,0 cd 2,6 a 40 2,4 ef 14,7 c 21,3 c 2,3 ab 10 7,1 ab 15,4 c 21,2 c 1,8 b 20 4,7 cd 19,7 ab 34,0 b 2,6 a 30 2,1 ef 21,3 ab 35,7 ab 2,7 a 40 1,8 ef 18,7 b 28,3 bc 2,1 b dane dla sorbitolu i mannitolu nie zostały poddane analizie statystycznej (rośliny zamarły) *średnie oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie przy poziomie istotności α=0,05 ** kontrolę stanowiła pożywka MS bez dodatku cukru 79 Monika Poniewozik, Marzena Parzymies Tabela 2. Wpływ węglowodanów i ich stężenia na wzrost tkanki kalusowej Albizia julibrissin Durazz w kulturach in vitro [opracowanie własne] Rodzaju cukru Kontrola* Sacharoza Fruktoza Glukoza Stężenie (g·dm-3) Średnica (mm) Świeżą masa (mg) 0 0 d* 0d 10 12,2 a 652,5 b 20 12,3 a 789,1 ab 30 11,1 bc 532,8 c 40 11,6 bc 680,4 b 10 11,5 bc 562,7 bc 20 10,6 bc 732,3 ab 30 11,9 ab 618,1 b 40 7,0 c 353,8 c 10 12,0 ab 312,1 c 20 12,0 ab 1334,8 a 30 12,9 a 1004.8 a 40 7,9 c 485,5 c dane dla sorbitolu i mannitolu nie zostały poddane analizie statystycznej (rośliny zamarły) *średnie oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie przy poziomie istotności α=0,05 ** kontrolę stanowiła pożywka MS bez dodatku cukru 80 Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce Rysunek 1. Wpływ cukru w zależności od rodzaju i stężenia na wzrost i rozwój pędów i tkanki kalusowej Albizia julibrissin w kulturach in vitro; Kontrolę stanowiła pożywka MS bez dodatku cukru [opracowanie własne] 5. Dyskusja Wyniki uzyskane w przeprowadzonym doświadczeniu potwierdzają wpływ węglowodanów na wzrost i rozwój pędów oraz tkanki kalusowej w kulturach in vitro Albizia julibrissin. Analizując wyniki stwierdzono, że największy wpływ na liczbę pędów badanego gatunku ma glukoza w stężeniu 10 g·dm-3. W opublikowanych pracach najczęściej stosowanym węglowodanem mającym wpływ na proliferację pędów jest sacharoza [3, 5-7]. Jest ona głównym źródłem energii w kulturach tkankowych, które mają niewystarczającą zdolność autotroficzną. Ponadto sacharoza przy81 Monika Poniewozik, Marzena Parzymies czynia się do wytwarzania potencjału osmotycznego w pożywce i na skutek powstawania gradientu stężeń przenika do tkanek roślinnych [9]. Wysokie stężenia cukrów w podłożu mogą wykazywać korzystny wpływ na wzrost eksplantatów, ponieważ wywołują wysokie ciśnienie osmotyczne. Natomiast niskie mogą skutkować małymi ilościami węgla i energii niezbędnej dla wzrostu i rozwoju roślin w kulturach tkankowych [15].W badaniach nad mikrorozmnażaniem Albizia amara wykazano, że dużą liczbę pędów uzyskano na podłożach uzupełnionych 20 g·dm-3 sacharozy [4]. W przypadku kultur tkankowych Jacaranda decurrens lepszą proliferację pędów obserwowano na pożywce ½ MS oraz ½ WP z dodatkiem 20 g·dm-3 sacharozy oraz 2% sorbitolu, 2% dekstrozy, oraz różnymi stężeniami spermidyny (2; 4; 6 mg·dm-3). Dla porównania wzbogacenie pożywki MS oraz ½ MS tylko 20 g·dm-3 sacharozy powodowało, że proliferacja wynosiła odpowiednio 15 i 43,3% [16]. Sacharoza w stężeniu 30 g·dm-3 korzystnie oddziaływała na kultury liścieni Albizia lebbeck [5] oraz Acacia auriculiformis [17]. Na pożywce MS wzbogaconej identycznym stężeniem tego cukru uzyskano maksymalną proliferację pędów u Albizia chinensis przy użyciu pąków wierzchołkowych z 7-dniowych siewek in vitro [3]. Natomiast na podłożach MS wzbogaconych 30 g·dm-3 sacharozy u Gleditshia amorphoides obserwowano powstawanie kalusa, a u Acacia caven – regenerację pędów i korzeni [18]. Natomiast West i Jahnake [19] stosowali 3% stężenie do rozmnażania Wisteria frutescens var. macrostachya ‘Blue Moon’ przy użyciu pąków pachwinowych. Ponadto sacharoza w stężeniu 30 g·dm-3 indukowała wzrost wydłużeniowy oraz powstawanie największej liczby pędów Bauchnia purpurea. Pozostałe badane węglowodany (maltoza, galaktoza, glukoza, fruktoza i lakotoza) nie powodowały intensywnego wydłużania się pędów [20]. W przedstawionej pracy wykazano, że alkohole cukrowe tj.: sorbitol i ksyloza powodowały negatywny wpływ na regenerację Albizia julibrissin. Wyniki uzyskane przez Kawa – Miszczak i in. [21] potwierdzają, że sorbitol hamował wzrost pędów w kulturach liliowca ogrodowego. W literaturze dostępne doniesienia o jednoczesnym dodawaniu do pożywki dwóch rodzajów węglowodanów. W kulturach tkankowych Leucaena leucocephala, drzewa z podrodziny mimozowatych stosowano jednocześnie 20 g·dm-3 sacharozy oraz 15 g·dm-3 glukozy w celu uzyskania maksymalnej liczby pędów [22]. Znaczne różnice w budowie morfologicznej obserwowano wzbogacając podłoża różnymi koncentracjami glukozy i sacharozy u Acacia seyal var. Seyal. Najdłuższe pędy, o największej liczbie liści wytwarzały rośliny na skutek jednoczesnego zastosowania dwóch rodzajów cukru w ilości 20 i 30 g·dm-3 [15]. W niniejszej pracy wykazano, że wzrost stężenia sacharozy w pożywce z 10 do 40 g·dm-3 powoduje ograniczenie liczby pędów powstających 82 Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce z eksplantatów wierzchołkowych. Odmienne rezultaty uzyskano u Acacia mearnsii gdzie zwiększenie koncentracji tego cukru z 20 do 30 g·dm-3 wpływało korzystnie na wzrost produkcji pędów [23]. Wyniki badań dotyczących mikrorozmnażania Acacia chundra dowiodły, że wzbogacenie pożywki ½ MS sacharozą w ilości 30 g·dm-3 powodowało, iż z jednego eksplantatu wierzchołkowego uzyskiwano od 3 do 6 pędów. Jednak autorzy wyraźnie podkreślają, że u badanego gatunku istotny wpływ na proliferację pędów miały regulatory wzrostu dodane do podłoża [24]. Innym czynnikiem decydującym o liczbie uzyskanych pędów wytwarzanych przez eksplantaty jest rodzaj zastosowanych regulatorów. U Albizia odoratissima przy stężeniu 30 g·dm-3sacharozy zaobserwowano, ich największa ich ilość tworzyła się z części epikotylowej ułożonej horyzontalnie na pożywce [7]. Uzyskane wyniki pokazują, że wzbogacenie wysokim stężeniem sacharozy (40 g·dm-3) wpływało pozytywnie na wysokość i masę pędów oraz liczbę liści Albizia jublibrissin. Zdrowe i mocne pędy, o intensywnym wzroście elongacyjnym uzyskano u Albizia amara na skutek zastosowania niższych dawek sacharozy (20 g·dm-3) [4]. Wyższe stężenia (30 g·dm-3) z powodzeniem stosowano w Acacia auriculiformis [17]. W przeprowadzonym doświadczeniu wykazano, że glukoza w stężeniu 30 g·dm-3 stymulowała wzrost tkanki kalusowej. Natomiast na podłożach bez dodatku węglowodanów nie obserwowano powstawania tej tkanki. U Acacia sinuata stwierdzono, że kalus wytwarzał się z liścieni na pożywce uzupełnionej 30 g·dm-3 sacharozy [25]. Natomiast w przypadku Acacia aurifuliformis organogeniczna zdolność tkanki kalusowej znacznie spadała gdy stężenie sacharozy w podłożu przekraczało 30 g·dm-3, a przy stężeniu 60 g·dm-3 eksplantaty nie wytwarzały tkanki kalusowej i zamierały [26]. W skład pożywki oprócz cukrów wchodzą inne substancje takie jak witaminy, makro- i mikroskładniki, a także regulatory wzrostu. Ponadto innym istotnym czynnikiem wpływającym na jakość regenerantów może być rodzaj eksplantatu, a także sposób jego wyłożenia na pożywkę. W opublikowanych pracach badawczych wykazano, że istotny wpływ na wzrost Albizia sp. mają hormony roślinne. Na proliferację pędów w dużej mierze wpływają cytokininy, główne benzyloaminopuryna (BAP). U Albizia odoratissima korzystną proliferację pędów uzyskano na skutek zastosowania tej substancji w stężeniu 1,125 mg·dm-3 z części epikotylowych wyłożonych horyzontalnie na pożywkę, oraz 0,562 mg·dm-3 BAP łącznie z 0,093 mg·dm-3 NAA [7]. Natomiast eksplantaty wierzchołkowe wyszczepiano na podłoże z dodatkiem 0,75 mg·dm-3 BAP [8]. W kulturach Albizia julibrissin stwierdzono, że rodzaj i stężenie cukrów wpływa na wytwarzanie tkanki kalusowej, a najlepsze rezultaty uzyskano stosując glukozę w ilości 30 g·dm-3. W przeprowadzonym doświadczeniu 83 Monika Poniewozik, Marzena Parzymies nie obserwowano tej tkanki na pożywkach kontrolnych bez dodatku cukru. Odimienne wyniki uzyskano u Bauchnia purpurea. Wytwarzanie tkanki kalusowej u badanego gatunku następowało w obecności maltozy w stężeniu 30 g·dm-3, natomiast zastosowanie alkoholi cukrowych tj. sorbitol i ksyloza nie wpływało na indukcję kalusa [20]. Literatura 1. Wang F. Q., Wang E. T., Zhang Y. F., Chen W. X. Characterization of rhizobiaisolated from Albizia spp. in comparison with microsymbionts of Acacia spp. and Leucaena leucocephala grown in China, Systematic Application Microbiology, 29 (2006), s. 502-517 2. Zheng H., Wu Y., Ding J., Binion D., Fu W., Reardon R. Invasive plants of Asian origin established in the United States and their natural enemies, United States Department of Agriculture Forest Service, FHTET, 1 (2004), s. 15-18 3. Borthakur A., Das S. C., Kalita M. C., Sen P. An in vitro plant regeneration system for conservation of the leguminous tree Albizzia chinensis (Osbeck) Merr., Advances in Applied Science Research, 3 (2012), s. 1727-1723 4. Indravathi G., Pullaiah T. In vitro propagation studies of Albizia amara (Roxb.) Boiv., African Jurnal of Plant Science, 7 (2013), s. 1-8 5. Chakravarthy V. S. K., Negi P. S. Enhanced in vitro regeneration from seedling explants of meddicinally important leguminous tree (Albizia lebbeck Benth.), International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 9 (2014), s. 65-73 6. Chakravarthy V. S. K., Negi P. S. Enhanced in vitro regeneration from seedling explants of meddicinally important leguminous tree (Albizia lebbeck Benth.), International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 9 (2014), s. 65-73 7. Rajeswari V., Paliwal K. In vitro adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from seedling explants of Albizia odoratissima L.f. (Benth.), In Vitro Cellular and Developmental Biology, 44 (2008), s. 78-83 8. Borthakur A., Das S. C., Kalita M. C., Sen P. In vitro plant regeneration from apical buds of Albizzia odoratissima (L.f.) Benth., Advances in Applied Science Research, 2 (2011), s. 457-464 9. Nowak B., Miczyński K., Hudy L. Sugar uptake and utilization during adventitious bud differentiation on in vitro leaf explant of Węgierka Zwykła plum (Prunus domestica), Plant Cell Tissue and Organ Culture, 76 (2004), s. 255-260 10. George E. F., Hall M. A., De Klerk G. J. The components of plant tissue culture media I: macro- and micro-nutrients, Plant Propagation Tissue Culture. Springer Netherlands, (2008), s. 65-113 11. Gabryszewska E. Effect of various levels of sucrose, nitrogen salts and temeperature on the growth and decelopment of Syninga vilgaris L. shoots in vitro, Journal of Fruit and Ornamental Plant Research., 19(2011), s. 133-148 12. Ilczuk A., Jagiełło-Kostubiec K., Jacygrad E. The effect of carbon source in culture medium on micropropagation of common ninebark (physocarpus 84 Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. opulifolius (L.) Maxim.) 'Diable d'or', Acta Scientiarum Polonorum, Hortum Cultus, 12 (2013), s. 23-33 Dąbski M., Parzymięs M. The influence of type and concentration of carbohydrates on growth and branching of Clematis integrifolia in vitro, Annales Universitas Mariae Curie – Skłodowska Lublin – Polonia Sectio EEE, XVIII (2007), s. 51-55 Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum, 15 (1962), s. 473-479 Altayeb G. S. Micropropagation of Acacia seyal var. seyal Del. using nodale explants, Doctoral dissertation, UOFK, 2015 Malosso M. G., Bertoni B. W., Coppede J. S. Micropropagation and in vitro conservation of Jacaranda decurrens Cham, Journal of Medicinal Plants Research, 6 (2012), s. 1147-1154 Girijashankar V. Micropropagation of multipurpose medicinal tree Acacia auricuiformis, Journal of Medicinal Plants Research, 5 (2011), s. 462-266 Marinucci L., Ruscitti M., Abedini W. Morfogėnesis in vitro de leguminosas forestales nativas de la Republica Argentina, Revista de la Facultad de Agronomia, La Plata, 105 (2014), s. 27-36 West T. P., Jahnke N. J. Micropropagation of „Blue Moon‟ Wisteria, Propagation of Ornamental Plants, 15 (2015), s. 29-34 Singh B. M. Effects of sugars on in vitro culture Bauhinia purpurea L., Nepal Journal of Science and Technology, 15 (2014), s. 47-50 Kawa-Miszczak L., Węgrzynowicz-Lesiak E., Gabryszewska E., Góraj J., Saniewski M. Wpływ różnych węglowodanów na wzrost i rozwój liliowca in vitro, Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 534 (2009): 83-94 Shaik N. M., Arha M., Nookaraju S., Gupta S. K., Srivastava S., Yadaw A., Kulkarini P. S., Abhilash O. U., Vishwakarma R. K., Singh S., Tatkare R., Chinnathambi K., Rawl S. K., Khan B. M. Improved method of in vitro regeneration in Leucaena leucocephala – a leguminous pulpwood tree species, Physiology and Molecular Biology of Plants, 15 (2009), s. 312-318 Beck S. L., Dunlop R., Staden J. Rejuvenation and micropropagation of adult Acacia mearnsii using coppice material, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 26 (1998), s. 149-153 Rout G. R., Senapati S. K., Aparajeta S. Micropropagation of Acacia chundra (Roxb.) DC., Hort Science, 35 (2008), s. 22-26 Vangadesan G., Gnapathi A., Amutha S., Selvaraj N. High-frequency plant regeneration from cotyledon callus of Acacia sinuata (Lour.) Merr., In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 39 (2003), s. 28-33 Ranga Rao G. V., Prasad M. N. V. Plant regeneration from the hypocotyl callus of Acacia auriculiforis/multipurpose tree legume, Journal Plant Physiology, 137 (1991), s. 625-627 85 Monika Poniewozik, Marzena Parzymies Wzrost i rozwój pędów albicji jedwabistej (Albizia julibrissin (Durazz)) w kulturach tkankowych w zależności od rodzaju i stężenia cukru w pożywce Streszczenie Badano wpływ rodzaju i stężenia węglowodanów na wzrost i rozwój Albizia julibrissin w kulturach in vitro. W doświadczeniu wykorzystano eksplantaty wierzchołkowe pobrane z ustabilizowanej kultury. Wyłożono je na pożywkę MS [14] uzupełnioną BA – 0,5 mg·dm-3 oraz IBA – 0,05 mg·dm-3. Określano przydatność sacharozy, glukozy, fruktozy, sorbitolu i ksylozy w stężeniach 0, 10, 20, 30, 40 g·dm-3 do mikrorozmnażania albicji jedwabistej w kulturach tkankowych. Wykazano, że sacharoza w stężeniu 10 g·dm-3 oddziaływała korzystnie na proliferację pędów (7,1 szt.), natomiast w ilości 40 g·dm-3 znacznie wpływała na jakość – rośliny wytwarzały dłuższe pędy (24,7 mm), o większej liczbie liści (2,7 szt.) i świeżej masie (47,2 mg). W doświadczeniu wykazano, że pozytywny wpływ na wzrost tkanki kalusowej mają cukry. Zaobserwowano, że na pożywkach bez dodatku węglowodanów eksplantaty Albizia julibrissin nie wytwarzały tej tkanki. Glukoza w stężeniu 30 g·dm-3 stymulowała wzrost tkanki kalusowej, wpływając na zwiększenie świeżej masy (1334,8 mg) i średnicy (12,9 mg). W obecności alkoholi cukrowych tj. sorbitolu i ksylozy obserowowano nekrozy i zamieranie eksplantatów. Słowa kluczowe: mikrorozmnażanie, glukoza, fruktoza, sacharoza, węglowodany The growth and development of Albizia julibrissin (Durazz) stems in tissue culture depending on the type and concentration of sugar in the medium Abstract The influence of the type and concentration of carbohydrates on the growth and development of in vitro shoot cultures of Albizia julibrissin Durazz was studied. The shoot tips used in this experiment were excised from an aseptic culture. The explants were placed on MS [14] basal medium supplemented with BA – 0.5 mg·dm-3 and IBA – 0.05 mg·dm-3. Then the usefulness of sucrose, fructose, glucose, sorbitol and xylose in concentrations of 0; 10; 20; 30; 40 g·dm-3 was examined. It has been shown that the sucrose in concentration of 10 g·dm-3 positively affected the shoot proliferation (7.1 pcs), while 40 g·dm-3 significantly affected the shoots quality – length (24.7mm), number of leaves (2.7 pcs) and fresh weight (47.2 mg). The experiment demonstrated that the effect of sugar on the growth of callus tissue. It was observed that on the media without carbohydrate Albizia jublissini explants did not produce callus. Glucose at 30 g·dm-3 stimulated growth of callus tissue, promoting it is fresh weight (1334.8 mg) and a diameter (12.9 mg). In the presence of sugar alcohols such as sorbitol and xylose observed necrose and dying of explants. Keywords: micropropagation, glucose, fructose, sucrose, carbohydrates 86 Dagmara Migut1, Józef Gorzelany2, Natalia Matłok3 Ocena właściwości mechanicznych świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej Daucus carota L. 1. Wstęp Marchew zwyczajna (łac. Daucus carota L.) zaliczana jest do grupy warzyw korzeniowych, których część jadalną stanowi korzeń [1]. Surowiec ten stanowi jeden z podstawowych elementów przetwórstwa warzyw w Polsce ze względu na znaczenie prozdrowotne wynikające z zawartości związków biologicznie czynnych, których obecność w surowcu wynika z uwarunkowań genetycznych, sposobu nawożenia i uprawy, warunków klimatycznych, stopnia dojrzałości oraz warunków przechowalniczych i przetwórczych [2-4]. Spożycie marchwi ma zasadniczy wpływ na zdrowie i prawidłowe odżywianie człowieka. Może przyczynić się do przeciwdziałania licznym chorobom, takim jak: miażdżyca, nadciśnienie, zaburzenia sercowonaczyniowe, podwyższenie cholesterolu, choroby skóry, czy też zaburzeń przemiany materii [5, 6]. Wykorzystywana jest w produkcji preparatów witaminowych, stosowanych w chorobach układu sercowo-naczyniowego, a także w zaburzeniach trawienia u niemowląt i dzieci [7]. Ważne znaczenie dla człowieka ma zawartość karotenoidów w marchwi. Główne związki występującej w tej grupie to β-karoten (50%) i α-karoten (20%). Prócz roli prowitaminy witaminy A w organizmie, β-karoten odgrywa ważną funkcję jako antyoksydant [8-10]. Oznaką wysokiej zawartości karotenoidów jest kolor korzeni. Większa intensywność czerwieni oznacza wyższą ich zawartość. Wraz ze wzrostem rośliny zmienia się zabarwienie korzenia pod wpływem syntezy związków karotenoidowych, głównie β-karotenu i α-karotenu. Akumulacja karotenoidów przebiega w szybszym tempie we wczesnych odmianach, o wyższym tempie wzrostu w porównaniu 1 [email protected] Katedra Inżynierii Produkcji Rolno-Spożywczej, Wydział Biologiczno- Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl 2 [email protected] Katedra Inżynierii Produkcji Rolno-Spożywczej, Wydział Biologiczno- Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl 3 natalia.matlok.onet.pl Katedra Inżynierii Produkcji Rolno-Spożywczej, Wydział BiologicznoRolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl 87 Dagmara Migut, Józef Gorzelany, Natalia Matłok do odmian późnych. W części korowej znajduje się więcej karotenoidów, aniżeli w rdzeniu [11]. Ponadto marchew, ze względu na zawartość witamin i minerałów, niską wartość energetyczną wynosząca średnio od 30-55 kcal/100g oraz występowanie nierozpuszczalnych frakcji błonnika pokarmowego i innych składników korzystnie wpływających na funkcjonowanie organizmu, stanowi ważny składnik diety człowieka [12, 13]. W 100 g marchwi znajduje się również 6-10 mg kwasu askorbinowego (witaminy C), posiadającego zdolności rozkładu nadtlenków lipidów, a także usuwania wolnych rodników z organizmu [14, 15]. Pomimo bogatego składu chemicznego, korzystnie wpływającego na fizjologię organizmu ludzkiego, marchew może zawierać różnorodne zanieczyszczenia. Związkami, które obniżają wartość odżywczą marchwi są: NO3-, NO2- metale ciężkie takie jak Cd i Pb. Akumulacja składników szkodliwych dla zdrowia, zwłaszcza azotanów w dużej mierze zależy od poprawności nawożenia. Toksyczność azotanów wynika z faktu, że ulegają w przewodzie pokarmowym redukcji do azotynów. Dopuszczalna zawartość azotanów w marchwi wynosi 400 mg NO3/kg, a w marchwi przeznaczonej na przetwory dla dzieci – do 200 mg NO3/kg [5, 16, 17]. Prowadzone są badania, których celem jest analiza wpływu przechowywania na cechy chemiczne i mechaniczne warzyw. Marchew, ze względu na swoje właściwości, jest obiektem badań wielu naukowców. Prowadzone są obserwacje pozwalające pozytywnie wpłynąć na okres przechowywania, przy jednoczesnym zachowaniu jak najlepszych parametrów jakościowych [18]. Badania właściwości mechanicznych pozwalają na usystematyzowanie oraz innowacyjność w procesach zbioru, transportu czy sortowaniu. Udoskonalenie tych procesów prowadzi do uzyskania surowca o wysokiej technologicznej jakości, minimalnie uszkodzonego. Dzięki temu surowiec dłużej zachowuje swoje właściwości oraz takie działanie pozwala na dłuższe jego przechowywanie. 2. Cel pracy Celem badań było określenie odporności wybranych odmian korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej (Daucus carota L. var. stivia) na uszkodzenia mechaniczne powstałe w wyniku przebicia stemplem o średnicy 8 mm oraz w procesie jednoosiowego ściskania kory i rdzenia korzeni marchwi (walcowa próbka wolna). Na podstawie uzyskanych wyników określono wpływ przebicia na zawartość wody w korzeniach oraz wartości siły przebicia kory i naprężenia niszczącego kory i rdzenia marchwi świeżej oraz w wybranych terminach pomiaru, po 25 i 40 dniach przechowywania w odpowiednich warunkach. 88 Ocena właściwości mechanicznych świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej Daucus carota L. 3. Materiały i metody Materiał badawczy stanowiły trzy odmiany marchwi zwyczajnej (Daucus carota L. var. stivia): Nerac F1, Volcano F1 oraz Morelia F1, pobrane z gospodarstwa rolnego specjalizującego się w produkcji warzyw. Gospodarstwo to znajduje się w miejscowości Klęczany, powiat rop-czyckosędziszowski, województwo podkarpackie (50°04′29″N 21°47′50″E). Próbki reprezentatywne do badań zostały pobrane w identyczny sposób dla trzech odmian. Korzenie marchwi pobrano bezpośrednio z pola; z trzech rzędów po przekątnej pola w liczbie 100 sztuk z każdej odmiany. Po zbiorze korzenie spichrzowe marchwi zostały częściowo oczyszczone z gleby i umieszczone w workach jutowych. Następnie zostały przetransportowane na miejsce badań laboratoryjnych, gdzie zostały złożone w pomieszczeniu w temperaturze około 6 C. Kolejnego dnia próbki do badań zostały przeniesione do laboratorium. Dokonano podstawowych badań dotyczących właściwości sprężystości, kory i rdzenia marchwi. Przed pomiarami siły przebicia kory oraz siły ściskania kory i rdzenia marchew została umyta. Pomiar siły niszczącej, odkształcenia do momentu zniszczenia próbki, energii potrzebnej do zniszczenia próbki oraz współczynnika sprężystości kory i rdzenia korzeni marchwi wykonano na próbkach w postaci wyciętych walców o wymiarach Ø 8 mm i wysokości 10 mm.Próbki wycięto z korzeni spichrzowych marchwi z 3 miejsc, to jest: części górnej (około 2,0 cm od końca korzenia spichrzowego), środkowej (w połowie korzenia spichrzowego marchwi) i dolnej (około 2,0 cm od części górnej korzenia) w kierunku osi podłużnej. Oznaczenie siły przebicia kory odbywało się na całych korzeniach spichrzowych marchwi w trzech miejscach pomiaru:części górnej, części środkowej i dolnej części korzenia przy użyciu stempla o średnicy 8 mm. Pomiary oporności kory oraz rdzenia marchwi na uszkodzenia mechaniczne wykonano na maszynie wytrzymałościowej Zwick/Roell. Maszyna ta jest zbudowana z głowicy pomiarowej, w której jest zamontowany przetwornik tensometryczny, postawy oraz czytnika cyfrowego. Rejestracja wyników dokonywana była automatycznie na komputerze współpracującym z maszyną. Badania przeprowadzono przy ustalonych parametrach: Fv = 2 N (siła wstępna) V1 = 40mm/min (prędkość dochodzenia i powrotu belki z czujnikiem) V2 = 20mm/min (prędkość belki z czujnikiem w czasie pomiaru) Parametry zarejestrowane na komputerze były następujące: Fmax = maksymalna siła przebicia skórki rdzenia [N] Lmax= maksymalne odkształcenia [mm] X = wartość średnia maksymalnej siły odkształcenia z jednej serii pomiarów 89 Dagmara Migut, Józef Gorzelany, Natalia Matłok S = odchylenie standardowe V = współczynnik wariancji Badania wykonano na świeżym materiale biologicznym po zbiorze oraz w czasie przechowywania. Każda seria pomiarów jednoosiowego ściskania składała się z 7 pomiarów przeprowadzonych na wyciętych walcach z kory i rdzenia. Pomiar przebicia kory odbywał się w 15 powtórzeniach w trzech miejscach pomiaru dla korzeni świeżych oraz przechowywanych w 25 oraz 40 dniu składowania. Po każdej serii pomiarów wyniki były rejestrowane na dysku komputera, z obliczeniami średnich wartości: maksymalnej siły niszczącej, odkształcenia do momentu zniszczenia próbki oraz energii potrzebnej do zniszczenia. Zawartość wody zarówno w świeżych jak i przechowywanych korzeniach spichrzowych marchwi określono metodą suszarkową. Wycięte próbki z korzeni marchwi o masie około 25 g umieszczono na tackach w suszarce o temperaturze 70˚C a następnie dosuszane w wago-suszarce. Zawartość wody w próbkach obliczano ze wzoru: 𝑚1 × 𝑚2 𝑊= × 100% 𝑚1 Gdzie: m1- masa próbki świeżej [g] m2- masa próbki po wysuszeniu [g] 4. Analiza wyników Zawartość wody Zawartość wody w świeżych jak i w przechowywanych korzeniach spichrzowych marchwi w 25 oraz 40 dniu przechowywania dla górnej, środkowej oraz końcowej części korzenia spichrzowego przedstawia tabela 1. Stwierdzono zbliżone średnie zawartości wody w poszczególnych częściach badanych świeżych korzeni spichrzowych marchwi. Wyniosły one odpowiednio 87,1% u nasady, 87,3% w środkowej części oraz 88,1% dla końcowej części korzenia spichrzowego. Średnia zawartość wody ogółem w świeżych korzeniach spichrzowych badanych odmianach marchwi wynosiła 87,6%. W analizowanych odmianach najwyższą średnią zawartością wody charakteryzowała się końcowa część korzenia spichrzowego marchwi. Po 25 dniach przechowywania najwyższą ogólną zawartością wody charakteryzowała się odmiana Volcano F1. W poszczególnych częściach korzeni spichrzowych badanych odmian marchwi zwyczajnej zawartość wody wynosiła odpowiednio: 70,6% dla nasady korzenia, 87,5% dla części środkowej oraz 74,6% dla końcowej części korzenia. W 40 dniu przechowywania odnotowano spadek zawartości wody w analizowanych odmianach korzeni spichrzowych marchwi. Wartości te wynosiły: 61,6% – nasada korzenia, 62,6% – środek korzenia, 66,8% końcowa 90 Ocena właściwości mechanicznych świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej Daucus carota L. część korzenia. Najwyższą ogólną zawartością wody charakteryzowała się odmiana Volcano F1, której średnia ogólna zawartość wody wynosiła 76,3% (tab.1.). Tabela 1. Średnia zawartość wody w świeżych korzeniach marchwi oraz w czasie przechowywania w zależności od części korzenia spichrzowego Źródło: opracowanie własne Analiza siły przebicia kory korzenia spichrzowego marchwi Na podstawie uzyskanych wyników zamieszczonych w tabeli 2, stwierdzono zróżnicowane wartości wybranych właściwości fizycznych badanych odmian marchwi pod względem odporności na uszkodzenia mechaniczne. Średnia wartość siły przebicia kory świeżych oraz przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi w pierwszym terminie pomiaru wynosiła od 70,7 N dla odmiany Nerac F1 do 76,7 N dla odmiany Morelia F1. W analizowanych odmianach częścią najbardziej odporną na uszkodzenia mechaniczne okazała się górna część korzenia spichrzowego, najmniej odporną zaś jego końcowa część. W 25 dniu pomiaru odnotowano zbliżone wartości siły przebicia kory i rdzenia analizowanych odmian korzeni spichrzowych marchwi, natomiast w 40 dniu pomiaru odnotowano spadek wartości parametru dla analizowanych odmian w stosunku do wcześniejszego terminu pomiaru. Wartości odkształcenia do momentu przebicia kory były zróżnicowane. Dla świeżych korzeni marchwi odkształcenie było w zakresie od 2,6 do 3,1 mm. W 25 dniu pomiaru odnotowano wzrost wartości parametru. Wynosił on od 4,3 mm dla odmiany Volcano F1 do 5,3 mm dla odmiany Morelia F1. W 40 dniu przechowywania odnotowano spadek wartości 91 Dagmara Migut, Józef Gorzelany, Natalia Matłok odkształcenia powstałego w wyniku przebicia stemplem. Wynosiło ono od 3,8 mm dla odmiany Nerac F1 do 4,3 mm dla pozostałych odmian. W obrębie analizowanych odmian świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej średnie naprężenie niszczące mieściło się w przedziale 3,4-4,3 MPa. Tabela 2. Średnie wartości siły przebicia, odkształcenia, zużytej energii do momentu przebicia stemplem oraz naprężenie niszcząceświeżych korzeni spichrzowych marchwi oraz w czasie przechowywania Źródło: opracowanie własne Ocena właściwości mechanicznych podczas ściskania jednoosiowego kory i rdzenia korzeni marchwi W procesie jednoosiowego ściskania próbek wolnych marchwi świeżej stwierdzono zróżnicowane wartości mierzonych i obliczonych parametrów mechanicznych w zależności od miejsca wycięcia próbki. Analizując wyniki badań zawarte w tabeli 3 największą średnią odpornością na uszkodzenia mechaniczne charakteryzuje się odmiana Volcano F 1,128,6 N. Najniższą odpornością na uszkodzenia mechaniczne charakteryzowała się odmiana NeracF1,110,6 N. Najwyższe średnie wartości sił niszczących odnotowano w górnej części korzeni spichrzowych badanych odmian marchwi zwyczajnej. Największą średnią wartość energii niszczącej próbkę zaobserwowano dla odmiany Volcano F1,184,3 Nmm, a najniższą dla odmiany Morelia F1, 159,1 Nmm. Najwyższą wartość naprężenia niszczącego odnotowano dla odmiany Volcano F1, 4,2 MPa. 92 Ocena właściwości mechanicznych świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej Daucus carota L. Po 25 dniach przechowywania korzeni na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że największą średnią odpornością na uszkodzenia mechaniczne charakteryzuje się odmiana Volcano F1, 125,6 N. Najniższą odpornością na uszkodzenia mechaniczne charakteryzowała się odmiana Nerac F1, 102,6 N. Największą średnią wartość energii potrzebnej do zniszczenia kory marchwi zaobserwowano dla odmiany Volcano F1, 174,2 Nmm, a najniższą dla odmiany Morelia F1, 157,1 Nmm. Najwyższą wartość naprężenia niszczącego stwierdzono u odmiany Volcano F1, 3,5 MPa. W 40 dniu pomiaru największą odpornością na uszkodzenia mechaniczne (siła niszcząca F max [N]) charakteryzowała się odmiana Volcano F1, dla której średnia wartość siły przebicia wyniosła 77,7 N. Najmniejszą odpornością na uszkodzenia mechaniczne charakteryzowała się odmiana Morelia F1, dla której średnia wartość siły przebicia wyniosła 59,3 N. Największą wartość energii niszczącej próbkę odnotowano dla odmiany Volcano F1, 74,3 Nmm, a najniższą dla odmiany Nerac F1,47,6 Nmm. Najwyższą wartość naprężenia niszczącego odnotowano dla odmiany Volcano F1, 3,8 MPa. Tabela 3. Średnie wartości maksymalnej siły niszczącej,odkształcenia, pracy oraz naprężenia niszczącego badanych odmian świeżych oraz przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej w procesie jednoosiowego ściskania kory Źródło: opracowanie własne Tabela 4. Średnie wartości maksymalnej siły niszczącej,odkształcenia, pracy oraz naprężenia niszczącego badanych odmian świeżych oraz przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej w procesie jednoosiowego ściskania rdzenia 93 Dagmara Migut, Józef Gorzelany, Natalia Matłok Źródło: opracowanie własne Analizując wyniki pomiarów oraz obliczeń jednoosiowego ściskania rdzenia świeżych korzeni marchwi przedstawione w tabeli 4, stwierdzono zróżnicowane wartości mierzonych parametrów w zależności od odmiany oraz miejsca wycięcia próbki. Największą średnią odpornością na uszkodzenia mechaniczne (siła niszcząca F max [N]) charakteryzowała się odmiana Volcano F1, 91,7N, najniższą odmiana Morelia F1, 83,4 N. Największą średnią wartość energii potrzebnej do zniszczenia próbki zaobserwowano dla odmiany Morelia F1, 101,2 Nmm, a najniższą dla odmiany Volcano F1, 84,3 Nmm. Najwyższą wartość naprężenia niszczącego odnotowano dla odmiany Nerac F1, 3,8 MPa a najniższą dla odmiany Morelia F1, 3,4 MPa. Po 25 dniach przechowywania odnotowano nieznaczny spadek odporności na uszkodzenia mechaniczne. Największą odpornością charakteryzowała się odmiana Volcano F1, 85,7 N, a najniższą odmiana Morelia F1, 75,4 N. Największą średnią energię niszczącą próbkę zaobserwowano dla odmiany Morelia F1, 92,8 Nmm, a najniższą dla odmiany Volcano F1, 76,1 Nmm. Najwyższą wartość naprężenia niszczącego próbkę rdzenia marchwi zaobserwowano dla odmiany Volcano F1, 7,4 MPa. Uzyskane wartości parametrów badanych próbek po 25 dniach przechowywania były niższe w porównaniu do uzyskanych parametrów dla próbek marchwi świeżej. Analizując wyniki pomiarów oraz obliczeń jednoosiowego ściskania rdzenia korzeni spichrzowych marchwi w 40 dniu przechowywania, stwierdzono, że największą średnią odpornością na uszkodzenia mechaniczne charakteryzowała się odmiana Nerac F 1, 75,7 N, natomiast najniższą odmiana Morelia F1, 55,4 N. Największe średnie wartości energii niszczącej oraz naprężenia niszczącego zaobserwowano dla odmiany Nerac F 1 i wynosiły one odpowiednio: 75,4 Nmm i 2,4 MPa. 94 Ocena właściwości mechanicznych świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej Daucus carota L. 5. Wnioski 1. Średnia zawartość wody w korzeniach badanych odmianach marchwi świeżej kształtowała się na poziomie 87,6%. Natomiast po 25 dniach przechowywania wynosiła 72,1%. Po 40 dniach przechowywania zawartość wody była w zakresie od 55,7% dla korzeni marchwi odmiany Nerac F1, do 76,3% dla korzeni marchwi odmiany Volcano F1. 2. Średnie wartości siły przebicia kory świeżych korzeni marchwi Fmax [N] były w zakresie: od 70,7 N dla odmiany Nerac F 1, do 76,6 N dla odmiany Morelia F1. 3. Stwierdzono zróżnicowane średnie wartości naprężenia niszczącego w procesie przebicia stemplem zarówno w przypadku korzeni marchwi świeżych jak i w trakcie przechowywania. Najwyższą średnią wartość naprężenia niszczącego odnotowano dla świeżych korzeni spichrzowych marchwi odmiany Volcano F 1 i Morelia F1, 4,1 MPa, natomiast najniższą dla świeżych korzeni marchwi odmiany Nerac F1 i po 40 dniach przechowywania – 3,4 MPa. 4. Średnie wartości siły niszczącej w procesie jednoosiowego ściskania próbek wolnych korzeni marchwi były zróżnicowane w zależności od odmiany, miejsca wycięcia próbek oraz terminu pomiaru. Najwyższą wartość siły niszczącej odnotowano dla próbek kory wyciętych z górnej części świeżych korzeni marchwi odmiany Volcano F 1, 143,2 N, natomiast najniższą wynoszącą 42,8 N dla próbek wyciętych z górnej części korzeni marchwi odmiany Volcano F 1 po 40 dniach przechowywania. 5. Stwierdzono zróżnicowane wartości dotyczące zapotrzebowania energii do momentu zniszczenia próbki oraz naprężenia niszczącego w procesie jednoosiowego ściskania próbek świeżych korzeni marchwi i w czasie przechowywania. Wartości zapotrzebowania energii były w zakresie od 84,3 Nmm dla próbek rdzenia korzeni marchwi odmiany Volcano F1 do 177,5 Nmm dla próbek kory korzeni marchwi odmiany Nerac F1. Natomiast dla próbek korzeni marchwi po 40 dniach przechowywania wartości zapotrzebowania na energii mieściły się w zakresie od 57,1 Nmm dla próbek rdzenia korzeni marchwi odmiany Volcano F1 do 77,7 dla próbek kory korzeni marchwi odmiany Volcano F1. 6. Średnie naprężenie niszczące dla świeżych korzeni marchwi wynosiło 3,9 MPa, po 25 i 40 dniach przechowywania- 3,5MPa. 7. Prowadzenie badań dotyczących właściwości mechanicznych zarówno świeżych, jak i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej pozwala na udoskonalenie procesu jej zbioru i transportu, jak również na ustalenie optymalnych parametrów oraz maksymalnego czasu przechowywania surowca. 95 Dagmara Migut, Józef Gorzelany, Natalia Matłok Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Adamicki F, Nawrocka B. Metodyka produkcji marchwi, Państwowa Inspekcja Ochrony Roślin i Nasiennictwa – Główny Inspektorat (2005), Warszawa Czerwińska E., Zagórska K. Zmiany jakości minimalnie przetworzonej marchwi pakowanej próżniowo w czasie przechowywania, Rocznik Ochrona Środowiska, 13 (2011), s. 845-858 Czapski J., Olejnik A., Witkowa-Rajchert D. Marchew purpurowa jako surowiec dla przetwórstwa owocowo- warzywnego, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 53(1) (2009), s. 31-33 Barańska M., Barański R., Schulz H., Nothnagel T. Tissue-specific accumulation of carotenoids in carrot roots, Planta, 224 (2006), s. 1028-1037 Gajewski M. Czynniki wpływające na jakość marchwi przeznaczonej do przetwórstwa, Katedra Roślin Warzywnych i Leczniczych SGGW (2010), Warszawa Domaradzki P., Malik A., Wójcik W. Zawartość β-karotenu i witaminy C w wybranych produktach z marchwi, Bromat. Chem. Toksykol. XLIII (2), s. 118-123 Kibler M. Uprawa marchwi w gospodarstwie ekologicznym, Centrum Doradztwa Rolniczego w Brwinowie Oddział w Radomiu (2011) Nowacka M., Janiak G., Kidoń M., Czapski J., Witrowa-Rajchel D. Zastosowanie modeli matematycznych do opisu izoterm adsorpcji pary wodnej suszonej marchwi purpurowej i pomarańczowej żywności, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość., 5 (84) (2012), s. 60-72 Dobrowolska A., Tuszyński T. Preferencje wybranej grupy młodzieży dotyczące spożycia soków marchwiowych, Przem. Ferm. i Owoc.-Warzyw. 9 (2008), s. 32-33 Witrowa-Rajchert D. Ekspertyza. Nowe trendy w suszeniu żywności, Wydział Nauk o Żywności, SGGW, (2009), Warszawa Suvarnakuta S., Devevahastin S., Mujumdar A. S. Drying kinetics and carotene degradation in carrot undergoing different drying processes, Journal of Food Engineering, 81 (3) (2005), s. 624-633 Grajek W. (red.), Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne, WNT, Warszawa 2007 Kaniszewski S., Dyśko J., Babik J. Wpływ nawadniania i fertygacji kroplowej azotem na plonowanie warzyw korzeniowych, Komisja Technicznej Infrastruktury Wsi, Polska Akademia Nauk, 3(2009), s. 43-45 Zadernowski R., Oszmiański J. Wybrane zagadnienia z przetwórstwa owoców i warzyw, Wydawnictwo ART, Olsztyn 1994 Borowska J. Owoce i warzywa jako źródło naturalnych przeciwutleniaczy (2). Przemysł fermentacyjny i owocowo-warzywny, 6 (2003), s. 42-57 Talcott S.T., Howard L.R., Brenes C.H. Antioxidantchanges and sesnoryproperties of carrot puree processed with without periderm tissue, Agric. Food Chem., 48 (2000), s.1315-1321 Kondratowicz-Pietruszka E. Charakterystyka składu chemicznego i wartości odżywczej soków wzbogacanych karotenem, Zeszyty Naukowe Akademii Ekonomicznej w Krakowie, 710 (2006), s. 43-58 96 Ocena właściwości mechanicznych świeżych i przechowywanych korzeni spichrzowych marchwi zwyczajnej Daucus carota L. 18. Bohdziewicz J. Wpływ zróżnicowania morfologicznego na zmianę parametrów modeli reologicznych miąższu wybranych warzyw korzeniowych, Acta Agrophysica, 2 (3) (2003), s. 499-508 Ocena właściwości mechanicznych świeżych korzeni marchwi oraz w czasie przechowywania Streszczenie Marchew zwyczajna (Daucus carota L.) jest jednym z najczęściej uprawianych warzyw w Polsce. Znajduje szerokie zastosowanie w przetwórstwie żywności, między innymi jako składnik soków, surówek, mrożonek czy przecierów. Możliwość długiego przechowywania pozwala na jej wykorzystanie w wielu branżach oraz gwarantuje ciągłą dostępność surowca. Marchew i inne materiały biologiczne poddawane są różnorodnym obciążeniom statycznym i dynamicznym, które związane są ze zbiorem, przeładunkiem, transportem, sortowaniem oraz przechowywaniem, w wyniku których warzywa ulegają uszkodzeniom. Poznanie właściwości mechanicznych materiałów biologicznych ma bardzo ważne znaczenie praktyczne umożliwiające rozwiązywanie istotnych problemów związanych np. z oceną stopnia odporności na uszkodzenia, określeniem warunków przechowywania, czy oceną stopnia dojrzałości, pozwalają również na udoskonalanie procesów przetwórczych. Badania właściwości mechanicznych są uzupełnieniem badań biochemicznych pozwalających na ocenę jakości przechowywanych produktów jak również jakość konkretnych wyrobów gotowych. Celem badań było określenie odporności wybranych odmian korzeni spichrzowych marchwi na uszkodzenia mechaniczne powstałe w wyniku przebicia stemplem o średnicy8 mm oraz w procesie jednoosiowego ściskania kory i rdzenia korzeni marchwi (walcowa próbka wolna). Na podstawie uzyskanych wyników określono wpływ przebicia na zawartość wody w korzeniach oraz wartości siły przebicia kory i naprężenia niszczącego kory i rdzenia marchwi świeżej oraz w wybranych terminach pomiaru, po 25 i 40 dniach przechowywania w odpowiednich warunkach. Słowa kluczowe: marchew zwyczajna, korzeń spichrzowy, właściwości mechaniczne, zawartość wody Evaluation of mechanical properties of fresh carrot root and during storage Abstract Carrots (Daucus carota L.) are one of the most widely cultivated vegetables in Poland. It is widely used in food processing, among other things, as a component of juices, salads, frozen and purees. Possibility of long storage allows its use in many industries and guarantees continuous availability of raw material. Carrots and other biological materials are subjected to various static loads and dynamic, are associated with the collection, handling, transport, sorting, and storage, as a result of which the vegetables are damaged.Understanding the mechanical properties of biological materials has a very important practical significance to allow solving important issues such. The assessment of the degree of fault tolerance, specifying terms of storage, the assessment of the degree of maturity, they also allow for improvement Process. The study of the mechanical properties are complementary biochemical tests allow an assessment of the quality of stored products as well as the specific quality of finished products. The aim of the study was to determine the resistance of selected varieties of carrot roots to mechanical damage caused by piercing punch with a diameter of 8 mm and in the uniaxial compression cortex and medulla carrot roots (cylindrical sample slow). Based on these results, the effect of piercing the water content in the roots and bark of puncture force and the breaking strength of the cortex and medulla of fresh carrots at selected dates and measurement after 25 and 40 days of storage under appropriate conditions. Keywords: carrot (Daucus carota L.),carrot roots, mechanical properties, water content 97 Magdalena Fujarowicz1, Dorota Grabek-Lejko2*, Maciej Kluz3 Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) 1. Wprowadzenie Zmiany środowiskowe, niewłaściwy styl życia, złe nawyki żywieniowe, stres to czynniki prowadzące do rozwoju wielu chorób, zwanych cywilizacyjnymi. Badania naukowe dowodzą, że w patogenezie tych chorób, a również innych, istotną rolę odgrywają wolne rodniki. Nie sposób uniknąć kontaktu z nimi, gdyż ich źródłem jest nie tylko przemysł, czy zjawiska atmosferyczne, ale powstają one również podczas podstawowych procesów fizjologicznych organizmów tlenowych [1-3]. Wzrost produkcji wolnych rodników w komórce może powodować liczne zniszczenia prowadzące do rozwoju przewlekłych schorzeń [3].Wiedza na temat szkodliwości wolnych rodników skłania do poszukiwania substancji wspomagających naturalną obronę antyoksydacyjną organizmu. Antyoksydanty, czyli przeciwutleniacze to związki chemiczne, przeciwdziałające niekontrolowanym procesom utleniania. Hamują one reakcje oksydacyjne mające miejsce w komórkach oraz normalizują potencjał oksydoredukcyjny [4]. Ważnymegzogennym źródłem antyoksydantów są owoce i warzywa [1]. Przeciwutleniaczom zawartym w roślinach przypisuje się istotną rolę w systemie obrony organizmu przed negatywnymi skutkami tworzenia się nadmiernej ilości wolnych rodników tlenowych. Badania dowodzą, ze naturalne antyoksydanty, zawarte w wielu owocach i warzywach odgrywają istotną rolę w profilaktyce i leczeniu różnych chorób, w tym chorób cywilizacyjnych, takich jak: cukrzyca, nowotwory, miażdżyca, choroby serca 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Technologów Żywności „Ferment”, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii, Wydział Biologiczno-Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl *2Corresponding author – [email protected],Studenckie Koło Naukowe Technologów Żywności „Ferment”, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii, Wydział Biologiczno-Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl 3 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Technologów Żywności „Ferment”, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii, Wydział Biologiczno-Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl 98 Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) [1, 5-7], dlatego też w ostatnich latach zintensyfikowano badania nad potencjalnymi właściwościami antyoksydacyjnymi związków chemicznych występujących w owocach i warzywach, w tym w buraku ćwikłowym. Burak ćwikłowy uprawiany jest na szeroką skalę w naszej strefie klimatycznej, ze względu na małe wymagania glebowe, wysoki plon (nawet do 40 ton z ha) oraz możliwość długiego przechowywania [8]. W strukturze spożycia warzyw w Europie stanowi 8% [9]. Obecnie w Rejestrze Krajowym widnieją 23 odmiany m.in. Rubin, Egipski, Zeus, Czerwona Kula, Detroit, Opolska, Polko, Okrągły Ciemnoczerwony [8]. Jednakże to nie łatwość uprawy i wysoki plon sprawiają, że roślina ta w ostatnim czasie zyskuje coraz powszechniejsze uznanie. Mianowicie uwagę przyciąga niezwykle bogaty i korzystny dla organizmu ludzkiego skład chemiczny.Wśród związków o właściwościach prozdrowotnych należy wymienić przede wszystkim barwniki betalainowe, związki mineralne (potas, żelazo, wapń), foliany, polifenole i betainę. Ponadto buraki ćwikłowe stanowią źródło łatwo przyswajalnych sacharydów oraz błonnika pokarmowego [10-12]. Burak ćwikłowy należy do grupy 10 warzyw o najwyższej aktywności przeciwutleniającej [13, 14]. Za właściwości antyoksydacyjne buraka ćwikłowego odpowiedzialne są głównie barwniki betalainowe, którym burak zawdzięcza swą charakterystyczną barwę. W skład tych barwników wchodzą betacyjaniny o barwie czerwonej i betaksantyny o barwie żółtej. Do betacyjanin należy betanina stanowiąca 74-95% barwników czerwonych buraka. Betanina nazywana jest „wschodząca gwiazdą wśród antyoksydantów”. Jej zdolność do wychwytywania wolnych rodników jest znacznie większa niż antocyjanów, natomiast łatwiej wchłaniana jest z przewodu pokarmowego [13, 15, 16]. Liczne walory zdrowotne oraz powszechność uprawy buraka w naszej strefie klimatycznej sprawia, że wykorzystywany jest onw tradycyjnym przetwórstwie na konserwy, susze, zagęszczane soki, sałatki, koncentraty obiadowe, jak również stanowi składnik pitnych soków wielowarzywnych i owocowo-warzywnych [10]. Zarówno barwniki betalainowe, jak i antyoksydanty ulegają przemianom degradacyjnym w wyniku obróbki termicznej podczas przetwarzania buraków ćwikłowych [10]. 2. Cel pracy Burak ćwikłowy spożywany jest bardzo często w postaci przetworzonej, głównie po długotrwałym gotowaniu, dlatego przeprowadzono badania mające na celu ocenę wpływu długotrwałej obróbki termicznej na właściwości przeciwutleniające, zawartość związków fenolowych oraz 99 Magdalena Fujarowicz, Dorota Grabek-Lejko, Maciej Kluz stabilność barwników betalainowych soków z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris). 3. Materiały i metody Materiał do badań stanowiły dwie odmiany korzenia buraka ćwikłowego Czerwona Kula oraz Zeus, które zostały zakupione w 2015 roku w okresie jesiennym na terenie Rzeszowa. Korzenie buraków ćwikłowych obrano ze skórki, zhomogenizowano i metodą filtracji próżniowej wyciśnięto sok. Sok poddawano ogrzewaniu w łaźni wodnej w temperaturze 100ºC przez okres 5,5 h i co 0,5 godziny odbierano próby. Próby chłodzono i analizowano. Kontrolę stanowiła próba soku nie poddanego ogrzewaniu. Do analizy właściwości antyoksydacyjnych wykorzystano metodę FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) [17]. Polega ona na określeniu zdolności badanych substancji do redukcji jonów Fe3+ do Fe2+, które są kompleksowane przez TPTZ (2,4,6-tripirydylo-S-triazyna) z wytworzeniem intensywnego, niebieskiego zabarwienia o maksimum absorbancji przy 593 nm. W tym celu do 200 µl odpowiednio rozcieńczonej próby dodawano 1800 µl odczynnika TPTZ. Próby inkubowano przez 10 min. w temperaturze pokojowej, następnie mierzono absorbancję przy długości fali 593 nm. Wyniki wyrażano w µM Troloksu. Zawartość związków fenolowych oznaczono metodą kolorymetryczną z wykorzystaniem odczynnika Folina-Ciocalteu’a [18]. Zawartość związków fenolowych wyrażano w mg kwasu gallusowego/ml soku. Zawartość barwników betalainowych określono metodą spektrofotometryczną przy długości fal 480 nm oraz 538nm odpowiednio dla betaksantyn i betacyjanin [19, 20]. Stężenie barwników betalainowych obliczono według wzoru: Bc/Bx [mg/L] = (A x B x MW x 1000) / (Ɛ x C) (1) gdzie: Bc – betacyjaniny, Bx – betaksantyny, A – średnia wartość absorbancji przy 538 nm dla Bc oraz 480 nm dla Bx;B – współczynnik rozcieńczenia próby;MW – masa molowa (550g/mol dla Bc oraz 339 g/mol dla Bx); Ɛ – molowy współczynnik absorpcji (60 000 l/mol/cm dla Bc oraz 48 000 l/mol/cm; C – długość drogi optycznej kuwety. Wszystkie oznaczenia wykonano co najmniej w trzech powtórzeniach. Wyniki podano jako średnie z trzech pomiarów uwzględniając odchylenie standardowe (SD). Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu Statistica. Korelację pomiędzy czasem ogrzewania prób, a wartościami badanych związków obliczono na podstawie współczynnika korelacji rang Spearmana, dla poziomów istotności p < 0,05. 100 Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) 4. Wyniki 4.1. Badanie właściwości antyoksydacyjnych Zawartość związków o właściwościach antyoksydacyjnych oznaczonych metodą FRAP była najwyższa w niepodgrzewanych sokach obu odmian buraka ćwikłowego (Wykres 1). Jednakże w odmianie Zeus zawartość antyoksydantów była o około 10% wyższa niż w odmianie Czerwona Kula i wynosiła ona 982 µM Troloksu. Wraz ze wzrostem czasu ogrzewania aktywność antyoksydantów spadała w soku obu odmian. W odmianie Zeus największy spadek (około 10%) zaobserwowano po pierwszych 30 minutach ogrzewania. Natomiast w odmianie Czerwona Kula zawartość antyoksydantów utrzymywała się na podobnym poziomie przez pierwszą godzinę ogrzewania i wynosiła około 913µM Troloksu. Dopiero po tym czasie poziom antyoksydantów w soku z odmiany Czerwona Kula zaczął sukcesywnie spadać. Zdolność antyoksydacyjna obu soków po 5,5 godzinach ogrzewania spadła odpowiednio o 16% i 9,6% dla odmiany Zeus i Czerwona Kula. Wykazano, że odmiany te posiadają różne ilości związków o właściwościach antyoksydacyjnych i charakteryzują się nieco inną wrażliwością na temperaturę. W tym przypadku odmiana Czerwona Kula charakteryzowała się mniejszą początkową aktywnością przeciwutleniającą niż odmiana Zeus, ale odznaczyła się mniejszym spadkiem zawartości antyoksydantów. Stężenie Troloksu [µM] 1050,00 1000,00 950,00 900,00 850,00 Zeus 800,00 Czerwona Kula 750,00 700,00 0 1 2 3 4 5 Czas [godz] Wykres 1. Wpływ ogrzewania na zawartość antyoksydantów w sokach z dwóch odmian buraka czerwonego [opracowanie własne] 101 Magdalena Fujarowicz, Dorota Grabek-Lejko, Maciej Kluz 12,00 11,50 11,00 10,50 10,00 9,50 Zeus 9,00 Czerwona Kula 8,50 8,00 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 Stężenie kwasu gallusowego mg/ml Ilość polifenoli w próbach kontrolnych, niepoddanych działaniu wysokiej temperatury była w obu przypadkach największa, jednak nie identyczna (Wykres 2). W przypadku odmiany Zeus wartość ta, w przeliczeniu na kwas gallusowy wyniosła 11,60 mg/ml soku i była wyższa od zawartości tych związków w odmianie Czerwona Kula, gdzie stwierdzono 10,82 mg/ml. Na podstawie analizy wyników zauważono zdecydowaną tendencje spadkową analizowanych związków w ciągu całego czasu ogrzewania. W obu odmianach ich ilość była najmniejsza w końcowym etapie, wyniosła około 9,6 mg/ml kwasu gallusowego. Zmiany stężenia związków polifenolowych w przypadku odmiany Czerwona Kula miały łagodny charakter spadkowy, natomiast w przypadku Odmiany Zeus zanotowano największy spadek w pierwszych 30minutach ogrzewania. Po tym czasie ilość polifenoli spadła o 1,64 mg/ml, tj., około 10%. Dla odmiany Czerwona Kula różnica między największym i najmniejszym stężeniem polifenoli wyniosła 1,5mg/ml, co daje spadek o 13,7%, natomiast w przypadku odmiany Zeus było to 2,34 mg/ml, czyli 20,2%. Czas [godz] Wykres 2. Wpływ ogrzewania na zawartość związków fenolowych w sokach z dwóch odmian buraka czerwonego [opracowanie własne] 4.2. Analiza barwników betalainowych W ocenie wpływu ogrzewania na zawartość barwników betalainowych w sokach dokonano podziału na barwniki betaksantynowe i betacyjaninowe. Pigmenty te, w obu odmianach występowały w największym stężeniu w próbach kontrolnych i było to odpowiednio w odmianie Zeus: 267,18 mg/L i 365,48 mg/L, a w odmianie Czerwona Kula: 299,9mg/L i 394,5 mg/L 102 Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) (Wykres 3, 4). Odmiana Czerwona Kula zawierała więcej barwników betaksantynowych, jak i betacyjaninowych niż odmiana Zeus. W przypadku betacyjanin najbardziej gwałtowny spadek ich ilości wystąpił w ciągu początkowych 30 minut ogrzewania, natomiast betaksantyn w czasie pierwszych dwóch godzin. W późniejszych godzinach zaobserwowano tendencje spadkowe, ale o znacznie mniej gwałtownym charakterze. Po upływie 5,5 godziny w obu odmianach stężenie barwników było na niemal identycznym poziomie: betacyjaniny – 34mg/L, betaksantyny – 40mg/L. Spadek zawartości barwników w odmianie Czerwona Kula wyniósł dla betacyjanin 90,62%, a dla betaksantyn 86,2%. W odmianie Zeus było to odpowiednio 90,63 i 85,44%. Sttężenie betaksantyn [mg/L] 350 300 250 200 150 Czerwona Kula Zeus 100 50 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 Czas [godz] Wykres 3. Wpływ ogrzewania na zawartość barwników betaksantynowych w sokach z dwóch odmian buraka ćwikłowego [opracowanie własne] 103 Magdalena Fujarowicz, Dorota Grabek-Lejko, Maciej Kluz Stężenie betacyjanin [mg/L] 450 400 350 300 250 200 Czerwona Kula 150 Zeus 100 50 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 Czas [godz] Wykres 4. Wpływ ogrzewania na zawartość barwników betacyjaninowych w sokach z dwóch odmian buraka ćwikłowego [opracowanie własne] 4.3. Analiza statystyczna Dzięki określeniu współczynnika korelacji rang Spearmana, pomiędzy czasem ogrzewania soków, a stężeniem polifenoli, antyoksydantów i barwników stwierdzono istnienie istotnych statystycznie ujemnych zależności. Oznacza to, że wraz ze wzrostem czasu ogrzewania prób w temperaturze 100ºC maleje stężenie badanych związków. Korelacja najsłabsza, na tle pozostałych wyników, dotyczyła zawartości polifenoli w odmianie Zeus, było to -0,623895. Najsilniejsza z nich dotyczyła zdolności antyoksydacyjnej w odmianie Czerwona Kula, która wyniosła -0,956166. Korelacja dotycząca stężenia barwników betalainowych w sokach, była bardzo silna i zbliżona w obu odmianach. 5. Dyskusja Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że zabieg ogrzewania soków z buraków ćwikłowych w temperaturze 100ºC miał istotny wpływ na zmniejszenie zawartości wszystkich analizowanych związków, szczególnie w pierwszym etapie ogrzewania. Stabilność barwników betalainowych zależy od wielu czynników wewnętrznych, takich jak: zawartość barwnika, wody czy pH, a również 104 Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) zewnętrznych, jak: temperatura, światło, tlen, które trzeba uwzględnić aby zachować maksymalne ich stężenie w produktach spożywczych [21]. Temperatura jest istotnym czynnikiem wpływającym na stabilność betalain. W badaniach przedstawionych w tej pracy zawartość barwników betalainowych (zarówno betaksantynowych, jak i betacyjaninowych) spada wraz ze wzrostem czasu ogrzewania w temp. 100ºC. Podobne wyniki uzyskali inni naukowcy. Naukowcy stwierdzili, że wraz ze wzrostem temperatury wzrasta degradacja betalain [22]. Jiratanan i Liu [23]wykazali, że ogrzewanie buraków w temperaturze 105, 115 i 125ºC przez 30 minut wpływa na spadek zawartości betacyjanin odpowiednio o 24%, 62% i 81%, natomiast betaksantyn o 13%, 60% i 73%. Ravichandran i in. [21] również zaobserwowali spadek zawartości zarówno barwników betacyjaninowych, jak i betaksantynowych podczas ogrzewania. Wykazali oni, że gotowanie prób przez 60,120, 180 sekund wpływa na spadek betacyjanin o 6%, 22% i 51%, natomiast betaksantyn o 18%, 23% i 33%. Podobnie w naszych badaniach stężenie betacyjanin po 30 minutach gotowania spada o 44-47% (w zależności od odmiany buraka), natomiast betaksantyn o 22-25%. Kilkugodzinne ogrzewanie prowadzi do obniżenia stężenia barwników o 8290%. Podobny spadek betacyjanin o 44% po 120 minutach ogrzewania zaobserwowali Gościnna i in. [24]. Kidoń i Czapski [25]również wykazali, że zabieg blanszowania przyczynia się do zmniejszenia ilości barwników czerwonych zwłaszcza w początkowej fazie z 4,73 do 3,52 mg/g suchej masy, jednakże zawartość barwników żółtych nie uległa znaczącemu spadkowi. Spadek stężenia barwników betacyjaninowych podczas ogrzewania może być związany z ich wrażliwością na temperaturę. Podczas ogrzewania betaniny mogą być degradowane przez izomeryzację, dekarboksylację czy też rozpad pod wpływem temperatury i kwasów [26]. W naszych badaniach wykazano, że wraz ze wzrostem czasu ogrzewania w temp. 100ºC spada ilość antyoksydantów i polifenoli w analizowanych sokach z buraków. Podobny spadek aktywności antyoksydantów zaobserwowali Gościnna i in. [24] wykazując, że po 2 godzinach ogrzewania prób w temp. 90 ºC zdolność antyoksydacyjna i zawartość polifenoli spada o około 3-5%. W naszych badaniach zawartość antyoksydantów po dwóch godzinach ogrzewania prób w nieco wyższej temperaturze 100ºC spada o 3-8% (odpowiednio dla odmiany Czerwona Kula i Zeus), natomiast polifenoli o 12%.10% spadek aktywności antyoksydacyjnej wykazano również podczas 20 minutowego gotowania buraków w wodzie [27]. Slavov i in. [28] wyka-zali, że sok z buraka ćwikłowego poddanego gotowaniu (100°С, 15 min) i blanszowaniu (100ºС, 5 min) wykazuje niższą aktywność antyoksydacyjną i niższą zawartość barwników (betacyjanin i betaksantyn) niż świeżo wyciśnięty. Przyczyną różnic pomiędzy autorami może być zastosowanie innych odmian buraków, nieco innej temperatury ogrzewania, sposobu przygotowywania prób czy też zastosowanych metod analitycznych. 105 Magdalena Fujarowicz, Dorota Grabek-Lejko, Maciej Kluz 6. Podsumowanie Powyższe dane świadczą o niekorzystnym wpływie długotrwałej obróbki termicznej w temperaturze 100ºC na stężenie związków polifenolowych, antyoksydantów oraz barwników betaksantynowych oraz betacyjaninowych w sokach z obu odmian buraka ćwikłowego. Dla otrzymania produktu o najlepszych właściwościach bioaktywnych należy ograniczyć czas obróbki soku z buraka ćwikłowego w wysokiej temperaturze. Należy również zaznaczyć, ze pomimo długotrwałego ogrzewania analizowanych soków z buraka, wciąż pozostaje w nich znaczna ilość związków o charakterze antyoksydacyjnym. Dietetycy podkreślają istotność suplementacji naszej diety w antyoksydanty. Ponieważ przebadane soki buraka ćwikłowego posiadają tak wysoką zawartość tych związków, powinny na stałe znaleźć miejsce w naszym jadłospisie i powinny być jak najmniej przetworzone, aby zachować jak najwięcej właściwości prozdrowotnych. Literatura Olędzki R. Potencjał antyoksydacyjny owoców i warzyw oraz jego wpływ na zdrowie człowieka, Nauki inżynierskie i technologie, 1 (4) (2012), s. 44-55 2. Cybul M., Nowak R. Przegląd metod stosowanych w analizie właściwości antyoksydacyjnych wyciągów roślinnych, Herba Polonica, 54 (1) (2008), s. 68-78 3. Ligor M. Polifenole. Badanie substancji biologicznie aktywnych w surowcach roślinnych i produktach naturalnych z zastosowaniem łączonych technik chromatograficznych, Wydawnictwo Naukowe Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Toruń 2013, s. 55-60 4. Piszcz P., Wantusiak P., Głód B., Kubiak S. Antyoksydanty w produktach spożywczych, ich rola i właściwości, Postępy Techniki Przetwórstwa Spożywczego, 2 (2010), s. 82-85 5. Middleton E., Kandaswamy C., Theoharides T. C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer, Pharmacology Reviews, 5 (2) (2000), s. 673-751 6. Rosicka-Kaczmarek J. Polifenole jako naturalne antyoksydanty w żywności, Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 6 (2004), s. 12-16 7. Kałędkiewicz E., Lange E. Znaczenie wybranych związków pochodzenia roślinnego w diecie zapobiegającej chorobom nowotworowym, Postępy Fitoterapii, 1 (2013), s. 42-47 8. Borowiak J. Buraki ćwikłowe dla Przetwórstwa, Owoce Warzywa Kwiaty, 9 (2011), s. 19-20 9. Klewicka E., Czyżowska A. Biological stability oflactofermented beetroot juice during refrigerated storage, Polish Journal of Food Nutrition Sciences, 61(4) (2011), s. 251-256 10. Gościnna K., Czapski J. Wpływ odmiany na zawartość barwników betalainowych, betainy, azotanów i cechy sensoryczne soków z buraka ćwikłowego, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 11 (2013), s. 9-11 1. 106 Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) 11. Kondratowicz-Pietruszka E. Dynamika wzrostu kwasowości fermentowanych soków warzywnych, Zeszyty naukowe Wydawnictwa Uniwersytetu Ekonomicznego w Krakowie, 833 (2010), s. 71-82 12. Czerwińska D. Wszechstronny jak burak, Przegląd Gastronomiczny, 11(2005), s. 10-11 13. Nowak D., Kidoń M., Syta M. Ocena zmian właściwości przeciwutleniających suszy buraka ćwikłowego i selera w zależności od zastosowanych operacji jednostkowych, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 4 (59) (2008), s. 227-235 14. Czyżowska A., Klewicka E., Libudzisz Z. The influence of lactic acid fermentation process of red beet juice on the stability of biologically active colorants, European Food Research and Technology, 223 (2006), s. 110-116 15. Mosiewicz R. Polski paradoks, PrzemysłFermentacyjny i OwocowoWarzywny, 47 (4) (2003), s. 4 16. Neagu C., Barbu V. Principal component analysis of the factors involved in the extraction of beetroot betalains, Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, 20 (4) (2014), s. 311-318 17. Benzie F. F., Strain J. J. Ferric reducing/antioxidant power assay: Direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration, Methods in Enzymology, 299 (1999), s. 15-27 18. Singleton V. L., Rossi J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, American Society of Enology and Viticulture, 16 (1965), s. 144-158 19. Koubaier H. B. H., Essaidi I., Snoussi A., Zgoulli S., Chaabouni M. M., Thonart P., Bouzouita N. Effect of Saccharomyces cerevisiae fermentation on the colorants of head red beetroot extracts, African Journal of Biotechnology, 12 (7) (2013), s. 728-734 20. Stintzing F. C., Herbach K. M., Mosshammer M. R., Carle R., Yi W., Sellappan S., Akoh C. C., Bunch R., Felker P. Color, betalain pattern, and antioxidant properties of cactus pear (Opuntia spp.) clones. Journal of Agriculture Food and Chemistry, 53 (2005), s. 442-451 21. Ravichandran K., Saw N. M. M. T., Mohdaly A. A. A., Gabr A. M. M., Kastell A., Riedel H., Cai Z., Knorr D., Smetanska I. Impact of processing of red beet on betalain content and antioxidant activity, Food Research International, 50 (2013), s. 670-675 22. Herbach K. M., Stintzing F. C., Carle R. Betalain stability and degradation –Structural and chromatic aspects, Journal of Food Science, 71(2006), s. R41-R50 23. Jiratanan T., Liu R. H. Antioxidant activity of processed table beets (Beta vulgaris var, conditiva) and green beans (Phaseolus vulgaris L.), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (2004), s. 2659-2670 24. Gościnna K., Czapski J., Walkowiak-Tomczak D. Zmiany aktywności przeciwutleniającej, zawartości barwników betalainowych i polifenoli w roztworach koncentratu soku z buraka ćwikłowego podczas ogrzewania, Aparatura badawcza i dydaktyczna, 4 (2013), s. 373-379 25. Kidoń M., Czapski J. Wpływ obróbki termicznej na zawartość barwników betalainowych i zdolność przeciwutleniającą buraka ćwikłowego, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 1 (50) (2007), s. 124-131 107 Magdalena Fujarowicz, Dorota Grabek-Lejko, Maciej Kluz 26. Herbach K. M., Stintzing F. C., Carle R. Impact of thermal treatment on color and pigment pattern of red beet (Beta vulgaris L.) preparations, Journal of Food Science, 69 (2004), s. C491-C498 27. Jiménez-Monreal A., García-Diz L., Martínez-Tomé M., Mariscal M., Murcia M. Influence of cooking methods on antioxidant activity of vegetables, Journal of Food Science, 74 (2009), s. 97-103 28. Slavov A., Karagyozuv V., Denev P., Kratchanova M., Kratchanov C. Antioxidant activity of red beet juices obtained after microwave and thermal pretreatments, Czech Journal of Food Science, 31(2) (2013), s. 139-147 Wpływ ogrzewania na potencjał antyoksydacyjny, stabilność barwników betalainowych soku z dwóch odmian buraka ćwikłowego (Beta vulgaris) Streszczenie Cel pracy stanowiło określenie wpływu obróbki termicznej na zawartość substancji bioaktywnych takich jak antyoksydanty, polifenole oraz barwniki betalainowe w soku z buraka ćwikłowego odmiany Czerwona Kula i Zeus.Burak ćwikłowy to bogate źródło antyoksydantów. Buraki spożywane są głównie w formie przetworzonej. Procesy te mogą mieć wpływ na zawartość substancji biologicznie aktywnych. Do analiz wykorzystano soki z dwóch odmian buraka, które poddawano ogrzewaniu w temperaturze 100ºC przez 5,5 godziny. Zdolność antyoksydacyjną oznaczono metodą FRAP, zawartość polifenoli metodą Folina-Ciocalteu’a, natomiast barwników betacyjaninowych metodą spektrofotometryczną. Wykazano, że w obu odmianach w trakcie ogrzewania spada stężenie wszystkich analizowanych związków. W odmianie Czerwona Kula po 5,5h ogrzewaniaw 100ºC stężenie antyoksydantów wyrażone w µM Troloksu, zmniejszyło się z 910 do 836, natomiast ilość polifenoli, wyrażona w mg kwasu gallusowego spadła z 10,82 do 9,73. W odmianie Zeus wartości te zmniejszały się odpowiednio z 982,67 do 826,5 oraz z 11,6 do 9,45.W czasie ogrzewania następowała znacząca degradacja betaksantyn i betacyjanin, tym większa im dłuższy był czas ogrzewania soków. Słowa kluczowe: burak ćwikłowy, Beta vulgaris, FRAP, antyoksydanty, polifenole, betalainy Effect of heating on the antioxidant activity and betalainsstability in juice of two varieties of red beet (Beta vulgaris) Abstract The aim of this study was to determine the effect of heating on the content of bioactive substances, i.e. antioxidants, polyphenols and betalain pigments in two varieties of red beet juices:Czerwona Kula and Zeus.There is increasing interest in the use of natural foods, which provide health benefits like antioxidant activity. Red beetroot is a rich source of antioxidants. It is consumed mainly in a processed form, in which concentration of antioxidants may change. Antioxidant activities in juices of two varieties were analyzed by FRAP method, polyphenols content by Folin-Ciocalteu’s method and betalains content was determined spectrophotometrically. It was shown that during heating concentration of all analyzed substances decreased. In Czerwona Kula variety after 5.5h of heatingin 100ºC content of antioxidantsexpressed in µM of Trolox, decreased from 910 to 836, while the amount of polyphenols expressed in mg gallic acid, declinedfrom 10.82 to 9.73. In Zeus variety these values were from 982.67 to 826.5 and from 11.6 to 9.45, respectively. Concentration of betaxantins and betacyanins decreased gradually with increasing heating time. Keywords: red beetroot, Beta vulgaris, FRAP, antioxidants, polyphenols, betalains 108 Łukasz Iwanowski1, Damian Zgórski2, Agata Karwan3, Adam Kłembokowski4, Magdalena Skowronek5, Natalia Liszewska6, Justyna Bohacz7 Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy 1. Wstęp Stosowanie dużej ilości nawozów mineralnych i środków ochrony roślin w systemie konwencjonalnym mogą skutkować negatywnym wpływem na właściwości biologiczne i fizykochemiczne gleb [1]. Natomiast stosowanie organicznych nawozów i rezygnacja ze stosowania oprysków w systemie ekologicznym skutkuje wyższą aktywność biochemiczną gleby, jednak wiąże się z większym ryzykiem zakażenia bakteriami fekalnymi lub mykotoksynami wytwarzanymi przez grzyby pleśniowe [2]. Obecne w glebie pleśnie rozkładają złożoną materię organiczną. Są one silnie wyspecjalizowane w rozkładzie polisacharydów budujących ściany komórkowe roślin. Używają one w tym celu szerokiego wachlarza enzymów pozakomórkowych rozkładających wielocukry do monosacharydów, które następnie wykorzystują do procesów życiowych. Skład wytwarzanych przez mikrogrzyby enzymów znacząco się różni pomiędzy gatunkami. Dotyczy to także enzymów pektynolitycznych [3]. Do grzybów strzępkowych o zdolnościach pektynolitycznych należą grzyby z rodzajów Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus, Penicillium, Alternaria i Fusarium [3]. Niektóre mikroorganizmy pasożytujące na roślinie mają zdolność do rozkładu pektyn jeszcze w czasie życia rośliny np.: bakterie z rodzaju Erwinia, a także 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Mikrobios”, Wydział Agrobioinżynierii, Uniwersystet Przyrodniczy w Lublinie 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Mikrobios”, Wydział Agrobioinżynierii, Uniwersystet Przyrodniczy w Lublinie 3 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Mikrobios”, Wydział Agrobioinżynierii, Uniwersystet Przyrodniczy w Lublinie 4 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Mikrobios”, Wydział Agrobioinżynierii, Uniwersystet Przyrodniczy w Lublinie 5 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Mikrobios”, Wydział Agrobioinżynierii, Uniwersystet Przyrodniczy w Lublinie 6 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Mikrobios”, Wydział Agrobioinżynierii, Uniwersystet Przyrodniczy w Lublinie 7 [email protected], Katedra Mikrobiologii Środowiskowej, Wydział Agrobioinżynierii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 109 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz saprofityczne bakterie (np. Bacillus), czy też promieniowce z rodzaju Streptomyces, ale przede wszystkim grzyby strzępkowe [1]. Ważnym aspektem aktywności pektynolitycznej mikroorganizmów zasiedlających glebę i powierzchnię warzyw jest szybkość psucia surowców. Niektóre pleśnie są w stanie rozwijać się w trakcie przechowywania w niskiej temperaturze [4]. Zwiększona aktywność enzymatyczna pleśni stanowi poważny problem w przechowywaniu zbiorów, które psują się szybciej, a dodatkowo płody rolne mogą zostać skażone mykotoksynami wydzielanymi przez pleśnie jeszcze przed pojawieniem się pierwszych oznak psucia, co jest poważnym zagrożeniem dla zdrowia i życia ludzi oraz zwierząt skarmianych roślinami pastewnymi [5]. Marchew (Daucus carota L.), jest jednym z najpowszechniej uprawianych warzyw w Polsce (13,4% powierzchni upraw) [6]. Zapewnienie ciągłego dostępu do dobrej jakości marchwi przez cały rok jest kluczowe dla produkcji warzywnej w wielu krajach, gdzie poważną przeszkodą są mikroorganizmy bytujące w glebie i na częściach użytkowych rośliny, odpowiedzialne za ich psucie w trakcie przechowywania [7]. Marchew, jako warzywo, ceniona jest szczególnie za swoje walory zdrowotne i smakowe, co w połączeniu z łatwą dostępnością tego warzywa czyni z niej bardzo popularny składnik diety. Bogata jest ona w związki z grupy karotenów i luteinę, które znane są ze swoich właściwości antyoksydacyjnych i antynowotworowych oraz duże ilości włókien pokarmowych w postaci pektyn [8]. Zawartość pektyn w marchwi mieści się w przedziale od 0,7% do 1%masy surowca [9]. Charakterystyczny smak marchwi zależny jest głównie od zawartości cukrów i nadających typową im goryczkę, terpenów [8]. Średnio marchew zawiera 12% suchej masy, 4,5% cukrów i 2% błonnika pokarmowego. Zawartość β-karotenu wynosi średnio 5,7 mg na 100 g suchej masy, a witaminy C 5,9 mg na 100g suchej masy [10]. Pektyny należą do strukturalnych polisacharydów budujących ściany komórkowe warzyw i owoców [11]. Zbudowane są one z nierozgałęzionych łańcuchów kwasu D-galakturonowego połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Stanowią one jedno z podstawowych organicznych źródeł węgla będącego w obiegu w przyrodzie. Za rozkład pektyn odpowiedzialne są głównie procesy enzymatyczne wywołane przez mikroorganizmy bytujące w glebie [1]. Enzymy pektynolityczne, zwane pektynazami, należą do klasyenzymów hydrolitycznych, pełniących funkcje esteraz i depolimeraz. Enzymy pektynolityczne podzielone są na trzy szersze grupy: (I) proto-pektynazy, które degradują nierozpuszczalne protopektyny do rozpuszczalnych pektyn; (II) pektynoesterazy (PE) katalizujące deestryfikację wiązań metyloestrowych uwalniając metanol; (III) depolimerazy, które katalizują hydrolizę wiązań α-1,4-glikozydowych w pozostających kwasach poli-galakturonowych z uwolnieniem mono- i oligomerów kwasu 110 Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy D-galakturo-nowego [12, 13]. Mechanizm enzymatycznego rozkładu pektyn polega więc głównie na hydrolizie metylowych estrów karboksylowych do kwasu galakturonowego i metanolu oraz na rozszczepianiu wiązań α-1,4-glikozydowych w łańcuchach pektyn. Jednym z ważniejszych enzymów należących do grupy pektynaz jest poligalakturonaza, która katalizuje hydrolizę wiązania α-1,4-glikozydowego w łańcuchach kwasu poligalaktu-ronowego [12, 14]. Enzym ten jest również jednym z głównych wskaź-ników chorobotwórczości grzybów takich jak Aspergillus flavus, Alternaria citri czy Fusarium oxysporum [15], gdyż uważany on jest za główną przyczynę uszkodzeń roślin. Większość roślin wytwarza białka będące inhibitorami poligalakturonazy, co prowadzi do akumulacji oligosacha-rydów w komórkach rośliny. Proces ten indukuje reakcje obronne rośliny przeciwko infekcjom [16]. Jak podają Namasivayam i in. [17] mikro-biologiczne pektynazy stanowią 25% ogółu sprzedawanych globalnie enzymów. Z uwagi na swoje unikalne właściwości pektyny są szeroko wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako zagęstniki, stabilizatory lub czynnik żelujący [18]. Dodatkowo enzymy pektynolityczne używane są m. in. w procesie pozyskiwania soku z owoców, w przetwórstwie włókien bawełnianych, pozyskiwaniu włókien łykowych, roszeniu włókien roślinnych, przetwórstwie ścieków, fermentacji kawy i herbaty, przemyśle papierniczym, karmieniu zwierząt, izolacji wirusów roślinnych, pozyskiwaniu olejów, czy też do poprawy barwy win czerwonych [13]. 2. Cel pracy Przedmiotem niniejszych badań był wpływ metod uprawy na aktywność pektynolityczną pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi odmiany ‘Nerac’ pochodzących z dwóch różnych systemów uprawy: konwencjonalnej i ekologicznej. Przed przystąpieniem do realizacji przedmiotu badań postawiono hipotezę badawczą: Czy metoda uprawy ma wpływ na aktywność pektynolityczną mikroorganizmów? W celu zweryfikowania tej hipotezy, założono hodowlę wyizolowanych grzybów z poszczególnych upraw i analizowano aktywności enzymów pektynolitycznych. 3. Materiały i metody 3.1. Materiał Materiał do badań stanowiły wybrane szczepy grzybów strzępkowych wyizolowanych z korzeni marchwi (Daucus carota L.) odmiany ‘Nerac’. Warzywa pochodziły z gospodarstwa ekologicznego i z uprawy konwencjonalnej prowadzonych w okolicach Lublina (Dys, 51°18′57″N 22°35′06″E). 111 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz Marchew do badań pobierana była po 8 miesiącach przechowywania. Próbki pobierano losowo z kilku miejsc kopca. 3.2. Izolacja i identyfikacja pleśni Izolację i identyfikację pleśni przeprowadzono według metody podanej w pracy Igras i Bohacz [10]. Do badań wytypowano szczepy z rodzaju Penicillium sp., oznakowane jako I i III, Trichoderma sp. II oraz Fusarium sp. IV, które wyizolowano z korzeni marchwi z uprawy ekologicznej oraz Penicillium sp. V, Alterniaria sp. VI, Gliocladium sp. VII i VIII z uprawy konwencjonalnej (Tab. 1). 3.3. Badanie aktywności pektynolitycznej wyselekcjonowanych szczepów W celu oznaczenia zewnątrzkomórkowej aktywności pektynolitycznej hodowle grzybów pleśniowych prowadzono na podłożu płynnym Parka i Robinsona, o składzie g/dm3: glukoza – 0,7; MgSO4×7H2O – 0,5; 4H2PO4 – 0,2; NH4NO3 – 0,1; H2O – 1000 ml, z dodatkiem 1% pektyny jako jedynym źródłem węgla i energii. Inokulum stanowił krążek grzybni (ø = 1 cm) z 7 dniowej hodowli na zestalonym agarem podłożu glukozowo-ziemniaczanym (PDA). Hodowle pleśni prowadzono przez 28 dni w trzech powtórzeniach w temperaturze 28˚C. W celu oznaczenia aktywności pektyno litycznej mikrogrzybów pochodzących z uprawy ekologicznej i konwencjonalnej podłoże zaszczepiono szczepami oznaczonymi numerami I-IV – uprawa ekologiczna oraz V-VIII – dla uprawy konwencjonalnej (Tab. 1). Tabela 1. Wybrane rodzaje szczepów grzybów strzępkowych wyizolowanych z korzenia marchwi Uprawa ekologiczna I – Penicillium sp. II – Trichoderma sp. III – Penicillium sp. IV – Fusarium sp. Uprawa konwencjonalna V – Penicillium sp. VI – Alternaria sp. VII – Gliocladium sp. VIII – Gliocladium sp. Źródło: opracowanie własne 3.4. Otrzymywanie płynów pohodowlanych Płyn pohodowlany oddzielono od grzybni poprzez wirowanie (600 obr./min). Otrzymany w ten sposób supernatant był poddawany analizie biochemicznej. 112 Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy 3.5. Metody analityczne Analizy biochemiczne w płynach pohodowlanych prowadzono po 4, 8, 12, 16, 20, 24 oraz 28 dniach hodowli. Obejmowały one oznaczenie aktywności poligalakturonazy (PG), pektynazy (PE) i wartości pH. 3.5.1. Oznaczanie aktywności poligalakturonazy (PG) Aktywność poligalakturonazy (PG) oraz pektynazy (PE) oznaczono metodą Fiedurka [19] w modyfikacji własnej. Do 1,5 cm3 roztworu kwasu poligalakturonowego dodano 0,5 cm3 płynu pohodowlanego w obecności 0,05 M buforu cytrynianowego o pH 4,5. Roztwór inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 30˚C. Następnie mieszaninę ogrzewano przez 5 minut w temperaturze 100˚C w celu inaktywacji enzymu. Ilość uwolnionych cukrów redukujących oznaczano metodą Somogyi-Nelsona [20, 21]. Do 1 cm3 odpowiednio rozcieńczonej próby, w stosunku 1:4, dodawano 1 cm3 odczynnika miedziowego, sporządzonego tuż przed rozpoczęciem analizy, i całość ogrzewano w łaźni wodnej przez 20 minut. Po oziębieniu dodawano odczynnik arseno-molibdenowy w ilości 1 cm3. Roztwór wytrząsano aż do momentu ustania wydzielania pęcherzyków gazu. Następnie dodawano 2 cm3 wody destylowanej. Pomiar absorbancji gotowego roztworu, wobec próby zerowej, wykonano na spektrofotometrze przy długości fali λ=520 nm. Aktywność wyrażano w μkatalach. 3.5.2. Oznaczanie aktywności pektynazy (PE) Do 1,5 cm3 roztworu pektyny w 0,05 M buforze cytrynianowym o pH równym 4,5 dodawano 0,5 cm3 płynu pohodowlanego i postępowano dalej tak, jak przy oznaczaniu poligalakturonazy. 3.5.3. Oznaczanie pH Pomiar pH płynu pohodowlanego przeprowadzono metodą potencjometryczną. 4. Wyniki 4.1. Aktywność pektynolityczna pleśni wyizolowanych z marchwi pochodzącej z uprawy ekologicznej Dynamikę zmian aktywności poligalakturonazy (PG) i pektynazy (PE) przedstawiono na Rys. 1. Aktywność zewnątrzkomórkowej pektynoesterazy (PE) wydzielanej przez szczepy z rodzaju Penicillium sp. (I), Trichoderma sp. (II) i Penicillium sp. (III) wyizolowanych z uprawy ekologicznej miała podobny przebieg 113 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz w trakcie dwudziestoośmiodniowej hodowli i na ogół miała tendencje spadkową. Pomiędzy 4 a 8 dniem aktywność pektynazy rosła, następnie od 8 do 16 dnia hodowli odnotowano spadek aktywności, a później jej kolejny wzrost, który utrzymywał się do 20 dnia. Po tym czasie aktywność pektynazy w hodowlach szczepów Penicillium sp. I i III spadała aż do ostatniego dnia hodowli, a szczep z rodzaju Trichoderma sp. II charakteryzował się uwalnianiem aktywnego enzymu. Szczep Fusarium sp. IV wyróżniał się odmienną aktywnością pektynolityczną. Utrzymywała się ona przez cały czas trwania hodowli na podobnym poziomie. Jedynie w 12 i 24 dniu hodowli odnotowano nieznacznie niższą aktywność w porów-naniu z innymi terminami. Aktywność poligalakturonazy (PG) w trakcie hodowli pleśni zmieniała się dynamicznie i na ogół była najwyższa w 12 dniu hodowli u wszystkich szczepów, po czym spadała aż do 20 dnia. Po tym czasie ponownie wzrosła w hodowlach szczepów Trichoderma sp. II i Fusarium sp. IV, a spadła w hodowlach dwóch pozostałych szczepów. Największą aktywność poligalakturonazy, w trakcie trwania hodowli, odnotowano u szczepu Fusarium sp. IV w 12 dniu, a najmniejszą u szczepu Penicillium sp. I w 28 dniu hodowli. Na podstawie uzyskanych wyników (Tab. 2.), stwierdzono, że pH płynu pohodowlanego (supernatant) w przypadku szczepów Trichoderma sp. II i Fusarium sp. IV było stosunkowo stabilne przez cały okres hodowli i oscylowało w przedziałach 3,16-3,53 dla szczepu II i 3,47-4,77 dla szczepu IV. Szczepy I oraz III uwalniały związki podwyższające odczyn podłoża co charakteryzowało się wzrostem wartości pH od 16 dnia hodowli aż do końca trwania badań, do poziomu odpowiednio 7,84 i 7,75. 4.2. Aktywność pektynolityczna pleśni wyizolowanych z marchwi pochodzącej z uprawy konwencjonalnej Dynamikę zmian aktywności poligalakturonazy (PG) i pektynazy (PE) przedstawiono na Rys. 2. Aktywność poligalakturonazy (PG) zmieniała się dynamicznie przez cały okres hodowli pleśni w zależności od szczepu. Najwyższa była w 4 dniu hodowli Penicillium sp. V; w 16 dniu hodowli szczepów Alternaria sp. VI oraz Gliocladium sp. VII a w 28 dniu hodowli szczepu Gliocladium sp. VIII. Aktywność tego enzymu wahała się w granicach od 8,34 μkat/l do 138,38 μkat/l. W hodowlach Penicillium sp. V i Gliocladium sp. VII wykazano tendencję spadkową, natomiast w hodowlach Alternaria sp. VI i Gliocladium sp. VIII od 20 dnia aktywność rosła. 114 Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy Rysunek 1. Dynamika zmian aktywności poligalakturonazy (PG) i pektynazy (PE) pleśni wyizolowanych z marchwi pochodzącej z uprawy ekologicznej. Odchylenie standardowe (±) dla wartości średnich z trzech powtórzeń [Opracowanie własne] Przebieg aktywności pektynazy (PE) miał podobny charakter do aktywności tego enzymu zaobserwowanego u marchwi pochodzącej z uprawy ekologicznej. Różnica polegała jedynie na wyższym ogólnym 115 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz poziomie aktywności pektynolitycznej. Najwyższą aktywność pektynaz zanotowano u szczepu z rodzaju Alternaria sp. VI w 12 dniu, a najniższą aktywnością na ogół charakteryzowały się szczepy Penicillium sp. V i Gliocladium sp. VII w trakcie całego czasu doświadczenia. Zmiany pH podłoża w trakcie hodowli pleśni (Tab. 2.) wskazują, że, podobnie jak w przypadku uprawy ekologicznej, szczep Penicillium sp. V powodował alkalizację podłoża z kwaśnego do lekko zasadowego. Również w hodowli szczepu Gliocladium sp. oznaczonego jako VII pod koniec trwania hodowli zanotowano gwałtowny wzrostodczynu płynu pohodowlanego. Pozostałe badane pleśnie nie powodowały istotnych zmian odczynu podłoża hodowlanego. Utrzymywało sie ono w granicach od 3,28 do 4,21. Za istotne należy uznać fakt, że podczas wzrostu pH podłoża w hodowlach szczepów z rodzaju Penicilium sp. I, III i V aktywność poligalakutronazy i pektynazy spadała. Tabela 2. Zmiany pH płynu pohodowlanego w trakcie trwania hodowli Dzień hodowli Penicillium sp. I Trichoderma sp. II Penicillium sp. III Fusarium sp. IV Penicillium sp. V Alternaria sp. VI Gliocladium sp. VII Gliocladium sp. VIII 4 8 12 16 Uprawa ekologiczna 3,32 3,38 3,53 5,17 3,42 3,16 3,24 3,33 3,40 3,32 3,69 6,87 3,48 3,47 3,50 3,68 Uprawa konwencjonalna 3,51 3,43 3,73 6,98 3,58 3,35 3,31 3,28 3,57 3,38 3,45 3,52 ––– 3,40 3,37 3,41 Źródło: Opracowanie własne 116 20 24 28 7,21 3,23 7,52 3,63 7,63 3,35 7,87 3,76 7,84 3,53 7,75 4,77 7,63 3,31 3,64 3,30 7,93 3,40 4,22 3,54 8,15 4,21 7,63 3,75 Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy Rysunek 2. Dynamika zmian aktywności poligalakturonazy (PG) i pektynazy (PE) pleśni wyizolowanych z marchwi pochodzącej z uprawy konwencjonalnej. Odchylenie standardowe (±) dla wartości średnich z trzech powtórzeń [Opracowanie własne] 117 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz 5. Dyskusja Uprawa ekologiczna oparta na wprowadzaniu dużej ilości substancji organicznej do gleby wzbogaca ilościowo i jakościowo mikroflorę gleby w stosunku do uprawy konwencjonalnej [22]. Jak podają Igras i Bohacz [10] system uprawy i czas przechowywania ma wpływ na skład ilościowy mikroorganizmów bytujących na marchwi. Barth i Hankinson [23] podają, że mikroorganizmy wytwarzające zewnątrzkomórkowe enzymy lityczne, powodują uwolnienie wody oraz innych składników wewnątrzkomórkowych a to poprawia dostępność składników odżywczych dla rozwoju mikroorganizmów. Do mikroorganizmów wydzielających pektynazy należą m. in. Ervinia carotovora, Saccharomyces fragilis, Bacillus pumilus, Rhizotonia fragariae [24]. Wśród grzybów strzępkowych pektynazy wydzielają Aspergillus niger, A. flavus, Penicillium chrysogenum, Trichoderma reesei, Fusarium moniliforme, F. oxysporum, Alternaria alternata oraz Cladosporium cladosporioides [25]. W prezentowanej pracy sprawdzano aktywność pektynolityczną pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi odmiany ‘Nerac’ pochodzącej z uprawy ekologicznej i konwencjonalnej. Analiza wykazała, że wszystkie badane szczepy posiadały zdolność do rozkładu pektyn. Generalnie z korzeni marchwi uprawianej w systemie konwencjonalnym wyizolowane pleśnie wykazały wyższą aktywność pektynolityczną niż pleśnie z uprawy ekologicznej. Najwyższą aktywnością pektynazy i poligalakturonazy charakteryzował się szczep Alternaria sp. wyizolowany z marchwi pochodzącej z systemu konwencjonalnego. Uzyskane w trakcie badań wyniki stoją w sprzeczności z wynikami i stwierdzeniami innych autorów. Jak podaje Breza-Boruta [1] zastosowanie organicznych nawozów w postaci obornika czy kompostu zapewnia dostęp łatwo przyswajalnych makro- i mikroelementów, co sprzyja wzrostowi mikroorganizmów w glebie, przekładając się też na aktywność enzymatyczną pleśni a używanie nawozów mineralnych i chemicznych środków ochrony roślin w systemie konwencjonalnym, w znacznym stopniu ogranicza wzrost i aktywność grzybów strzępkowych. Tezę tę potwierdzają także badania Szczech i Kowalskiej [5] na różnych warzywach pochodzących z wielu gospodarstw. Badania tych autorów wykazują większą ilość mikroorganizmów – zarówno bakterii jak i grzybów – na warzywach z upraw ekologicznych. Jednakże Wrzodak i in. podają [8], że ilość mikroorganizmów zależy od składu chemicznego roślin. Zmienia się on bowiem w zależności od systemu uprawy. W uprawie ekologicznej na glebie ubogiej w azot, rośliny jako pierwsze syntetyzują cukry proste i złożone, kwasy organiczne, witaminy i kwasy fenolowe. Natomiast w glebie bogatej w azot jak podczas stosowania nawozów sztucznych w pierwszej kolejności w roślinach syntetyzowane są aminokwasy, peptydy, białka i alkaloidy. W związku z tym zróżnicowana i na ogół wyższa aktywność pektynolityczna wybranych pleśni z uprawy konwencjonalnej może być związana ze zróżnicowanym składem chemicznym marchwi pochodzącej 118 Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy z uprawy konwencjonalnej niż z systemu ekologicznego. Ponadto Igras i Bohacz [10] podają, że podczas dłuższego czasu magazynowania marchwi ‘Nerac’ z uprawy konwencjonalnej w porównaniu z uprawą ekologiczną dochodzi do istotnego wzrostu drobnoustrojów powodujących psucie. Podczas mikrobiologicznego rozkładu pektyn dochodzi do uszkadzania tkanek roślin, co przyspiesza proces psucia [26]. Według Bhardwaj [27] mikroorganizmy zdolne produkować poligalakturonazę mogą rosnąć w różnej temperaturze i zakresie pH. Badania prowadzone w niniejszej pracy wykazały, że alkalizację podłoża hodowlanego powodują pleśnie głównie z rodzaju Penicillium sp. o czym także donoszą Pavei [28] a także pleśnie z rodzaju Gliocladium sp. VII. Jednakże aktywność enzymów pektynolitycznych w hodowlach tych pleśni spadała pomimo, że grzyby z rodzaju Gliocladium sp. należą do grupy grzybów alkilotolerancyjnych [29]. Pozostałe badane pleśnie wytwarzały aktywne enzymy pektynolityczne w niskim pH podłoża. 6. Wnioski 1. Wszystkie badane szczepy grzybów strzępkowych z rodzaju Penicillium, Trichoderma, Fusarium wyizolowane z korzeni marchwi z uprawy ekologicznej oraz mikrogrzyby z rodzaju Penicillium, Alternariai Gliocladium z uprawy konwencjonalnej wykazywały zdolności pektynolityczne. 2. W hodowlach badanych pleśni wydzielanie zewnątrzkomórkowych poligalakturonaz (PG) i pektynaz (PE) zmieniało się dynamicznie. 3. Na ogół wyższą aktywnością poligalakturonazy i pektynazy charakteryzowały się szczepy wyizolowane z uprawy konwencjonalnej niż z uprawy ekologicznej. 4. Wśród tych szczepów grzybów najwyższą aktywnością pektynolityczną charakteryzował się szczep z rodzaju Alternaria oznaczony jako VI. 5. Natomiast spośród grzybów wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z uprawy ekologicznej najwyższą aktywność poligalakturonazy i pektynazy wykazywał szczep z rodzaju Fusarium oznaczony jako IV i Trichoderma II zwłaszcza po dłuższym czasie hodowli. 6. Stwierdzono ponadto, że pH płynów pohodowlanych było kwaśne w trakcie hodowli badanych mikrogrzybów. Jedynie w hodowlach szczepów z rodzaju Penicillium oznaczonych jako I, III i V oraz Glioclacdium VII wzrosło do obojętnego i lekko alkalicznego pod koniec hodowli. 7. Podziękowania Autorzy dziękują Pani/Panu mgr inż. Patrykowi Igrasowi, mgr inż. Radosławowi Kmieć i mgr inż. Paulinie Karwackiej, inż. Patrycji Duziak, 119 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz inż. Monice Piszczek, inż. Łukaszowi Zawada za rozpoczęcie badań w ramach przedstawionego tematu w Studenckim Kole Naukowym Towaroznawstwa sekcja Mikrobiologia (SKNTM). Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Breza-Boruta B. Występowanie drobnoustrojów pektynolitycnych w glebie w systemie ekologicznym i konwencjonalnym, Polish Journal of Agronomy, 15 (2013), s. 32-37 Martyniuk S., Księżniak A., Jończyk K., Kuś J. Charakterystyka mikrobiologiczna gleby pod pszenicą ozimą uprawianą w systemie ekologicznym i konwencjonalnym, Journal of Research and Applications in Agricultural Engineering, 3 (2007), s. 113-116 Benoit I., Coutinho P. M., Schols H. A., Gerlach J. P., Henrissat B., de Vries R. P. Degradation of different pectins by fungi: correlation and contrasts between the pectinolytic enzyme sets identified in genomes and the growth on pectins of different origin, BMC Genomics, 13 (2012), s. 321 Piotrowska M. Grzyby pleśniowe w żywności przechowywanej w obniżonej temperaturze, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 10 (2012), s. 24-25 Szczech M., Kowalska B. Mikroflora warzyw ekologicznych, Nowości Warzywnicze, 51 (2010), s. 65-72 Główny Urząd Statystyczny Rocznik Statystyczny Rolnictwa, (2014), s. 204 Kora C., McDonald M. R., Boland G. J. Occurrence of fungal pathogens of carrots on wooden boxes used for storage, Plant Pathology, 54 (2005), s. 665-670 Wrzodak A., Szwejda-Grzybowska J., Elkner K., Babik I. Comparison of the nutritional value and storage life of carrot roots from organic and conventional cultivation, Vegetable Crops Research Bulletin, 76 (2012), s. 137-150 Baker R. A. Reassessment of Some Fruit and Vegetable Pectin Levels, Journal of Food and Science, 62 (1997), s. 225-229 Igras P., Bohacz J. Wpływ metod uprawy oraz okresu przechowywania odmian marchwi na liczebność drobnoustrojów i właściwości hydrolityczne zasiedlających je pleśni [w:] Rośliny: fizjologia, uprawa i ich interdyscyplinarne wykorzystanie, (2015), s. 194-206 Favela-Torres E., Volke-Sepúlveda T., Viniegra-González G. Production of Hydrolytic Depolymerising Pectinases, Food Technology and Biotechnology, 44 (2006), s. 221-227 Kashyap D. R., Vohra P. K., Chopra S., Tewari R. Applications of pectinases in the commercial sector: a review, Bioresource Technology, 77 (2001), s. 215-227 Jayani R. S., Saxena S., Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review, Process Biochemistry, 40 (2005), s. 2931-2944 Okafor U. A., Okochi V. I., Chinedu S. N., Ebuehi O. A. T., Onygeme-Okerenta B. M. Pectinolytic activity of wild-type filamentous fungi fermented on agrowastes, African Journal of Microbiology Research, 4 (2010), s. 2729-2734 120 Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy 15. Mohsen L. Y., Al-Janabi J. K. A., Jebor M. A. Production and Characterization of Exopolygalacturonase for Fusarium oxysporum and F. sacchari, International Journal of Science and Research, 5 (2016), s. 1315-1321 16. Di Matteo A., Bonivento D., Tsernoglou D., Federici L., Cervone F. Polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) in plant defence: structural view, Phytochemistry 67 (2006), s. 528-533 17. Namasivayam E., Rovindar J. D., Mariappan K., Akil J., Kumar M., Jayaraj R. L. Production of Extracellular Pectinase by Bacillus Cereus Isolated From Market Solid Waste, Journal of Bioanalysis & Biomedicine, 3 (2011), s. 70-75 18. May C. D. Industrial pectins: Sources, production and applications, Carbohydrates Polymers, 12 (1990), s. 79-99 19. Rogalski J. Badania nad biotransformacją ligninocelulozy z grzybów białej zgnilizny drewna na przykładzie Phlebiaradiata, Rozprawa habilitacyjna XLI UMCS, (1992) 20. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose, The Journal of Biological Chemistry, 153 (1944), s. 375-380. 21. Somogyi M. Notes on sugar determination, The Journal of Biological Chemistry, 195 (1952), s. 19-23 22. Flis-Bujak M., Dąbek-Szreniawska M., Żukowska G. Wpływ systemu produkcji roślinnej na substancję organiczną oraz aktywność enzymatyczną asparaginazy i ureazy gleby płowej, Acta Agrophysica, 8 (2006), s. 559-568 23. Barth M., Hankinson T. R., Zhuang H., Breidt F. Microbiological spoilage of fruits and vegetables, Compedium of the Microbiological Spoilage of Foods and Beverages, (2009), s. 135-183 24. de Lima Damásio A. R., Mallerf’b A., Cabral H., Polizeli A. M., Rai M. Pectinases Produced by Microorganisms: Properties and Applications, Fungal Enzymes, (2013), s. 316 25. Saranraj P. Microbial pectinases: a review, Global Journal of Traditional Medicinal Systems, 3 (2014), s. 1-9 26. Parthiban V. K., Prakasam V., Prabakar K. Enzymatic changes in carrot roots induced by Erwinia carotovora var. carotovora, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 3 (2012), s. 246-252 27. Bhardwaj V. Exploitation of micro-organisms for isolation and screening of pectinase from environment, [W]: Globelics 2010. 8th International Conference „Making Innovation Work for Society: Linking, Leveraging and Learning 1-3 November 2010 28. Paveia M. H. Culture medium alkalization by dermatophytes (Influence of time and temperature of incubation), Mycopathologia, 55 (1975), s. 35-40 29. Nagai K., Sakai T., Rantiatmodjo R. M., Suzuki K., Gams W., Okada G. Studies on the distribution of alkalophilic and alkali-tolerant soil fungi, Mycoscience, 36 (1995), s. 247-256 121 Łukasz Iwanowski, Damian Zgórski, Agata Karwan, Adam Kłembokowski, Magdalena Skowronek, Natalia Liszewska, Justyna Bohacz Ocena aktywności pektynolitycznej pleśni wyizolowanych z korzeni marchwi pochodzących z różnych systemów uprawy Streszczenie Obecnie rolnictwo ekologiczne zyskuje coraz więcej zwolenników, ze względu na wykluczenie z zabiegów agrotechnicznych nawozów mineralnych czy chemicznych środków ochrony roślin, których użycie budzi coraz większe kontrowersje. Zaprzestanie korzystania z tych środków może jednak powodować większy wzrost mikroorganizmów, które odpowiedzialne są za psucie się surowców żywnościowych oraz mogą powodować różnego rodzaju zatrucia. Przeprowadzone badania miały na celu określenie wpływu systemu uprawy marchwi, po 8 miesięcznym przechowywaniu, na aktywność pektynolityczną pleśni bytujących na korzeniach marchwi. W tym celu z korzeni marchwi odmiany ‘Nerac’ pochodzących z systemu ekologicznego i konwencjonalnego wybrano po cztery szczepy pleśni, odpowiednio Penicillium sp. I, Trichoderma sp. II, Penicillium sp. III, Fusarium sp. IV oraz Penicillium sp. V, Alternaria sp. VI, Gliocladium sp. oznaczone jako VII i VIII. Hodowle w kierunku wydzielania aktywnej pektynazy i poligalakturonazy prowadzono w hodowlach płynnych tych pleśni, zawierających odpowiednio pektynę oraz kwas poligalakturonowy jako jedyne źródło węgla i energii. Na podstawie uzyskanych danych stwierdzono, że większą aktywność pektynolityczną wykazały grzyby pochodzące z uprawy konwencjonalnej niż z ekologicznej.Dodatkowo wzrostowi szczepów I, III, V i VII towarzyszyła alkalizacja podłoża od płowy trwania doświadczenia i spadek aktywności pektynazy i poligalaturonazy. Słowa kluczowe: aktywność pektynolityczna, pleśnie, marchew Pectinolytic activity evaluation of filamentousfungi isolated from carrot root acquired from different cultivation systems Abstract Increasingly, organic farming is getting popular due to excluding of artificial fertilizers and pesticides from use in agriculture which some people find controversial. Ceased using of these agents, however, may cause faster spoiling of crops and lead to serious food poisoning. This research objective was to evaluate influence of farming system of carrot, which were stored for 8 months, on pectynolytic activity of filamentous fungi living on a surface of carrot roots. For this purpose eight cultures of fungi were isolated from the roots of carrot cultivar Nerac, four acquired from ecological and four from conventional cultivation system. Cultures isolated respectively: Penicillium sp. I, Trichoderma sp. II, Penicillium sp. III, Fusarium sp. IV and Penicillium sp. V, Alternaria sp. VI, Gliocladium sp. marked as VII and VIII. For evaluation of pectinase and poligalacturonase activity mold cultures were grown on liquid medium which contained respectively pectin and polygalacturonic acid as a sole source of carbon and energy.Based on obtained data it is concluded that filamentous fungi from conventional system have higher pectinolytic activity than molds gathered from ecological one, furthermore, growth of cultures marked as I, III, V and VII led to alkalization of a medium and gradually decreasing of pectinase and poligacturonase activity since 14th day of growth. Keywords: pectinolytic activity, molds, carrot 122 Kamila Nawrocka1, Klaudia Kamińska2, Anita Wiśniewska3 Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień 1. Wprowadzenie Ekspansyny to białka odpowiedzialne za rozluźnianie struktury ściany komórkowej, umożliwiające jej przebudowę i wzrost komórki. Li i wsp. [1] wykazali, że ekspansyny występują u wszystkich przebadanych gatunków roślin od mszaków po rośliny okrytonasienne. Po raz pierwszy ekspansyny zostały opisane u ogórka jako białkowe czynniki o masie około 30 kDa, które rozluźniają ścianę komórkową pod wpływem niskiego pH [2]. Ekspansyny są białkami strukturalnymi ściany komórkowej zakotwiczonymi w jej matriks [3]. Aktywacja ekspansyn in vivo następuje pod wpływem obniżenia pH ściany komórkowej na skutek aktywacji pomp protonowych (H+-ATP-az) w plazmalemmie. Aktywność pomp protonowych jest regulowana fitohormonami w czasie ontogenezy, jak również w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne [4]. Ekspansyny rozrywają wiązania niekowalencyjne między mikrofibrylami celulozowymi w specyficznych miejscach (ang. Biomechanical Hotspots), w których mikrofibryle celulozowe pozostają ze sobą w bliskim kontakcie [5]. W budowie ekspansyn roślinnych wyróżnia się dwie domeny: domenę I, zlokalizowaną na końcu aminowym białka oraz domenę II mieszczącą się na końcu karboksylowym. Domena I, posiadająca strukturę baryłki (ang. six-stranded Double-Psi Beta-Barrel, DPBB), jest podobna do katalitycznej domeny charakterystycznej dla rodziny hydrolaz glikozydowych GH45 (określana więc bywa również jako domena GH45-like). Natomiast domena II, posiadająca strukturę kanapki (ang. β-Sandwich), wykazuje podobieństwo do grupy 2 alergenów pyłków traw (ang. 63 Carbohydrate Binding Module, CBM63) [5]. Domenę podobną do GH45 zidentyfikowano również w białkach innych organizmów niż roślinne, na przykład grzybów, nicieni czy małż, a także w białkach bakterii. Pomimo podobieństwa domeny DPBB do GH45, ekspansyny nie posiadają aktywności β-1,4-glukanazy. Domena CBM63 jest bezpośrednio odpowiedzialna za 1 [email protected], Katedra Fizjologii Roślin, Wydział Rolnictwa i Biologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, www.sggw.pl 2 [email protected], Katedra Fizjologii Roślin, Wydział Rolnictwa i Biologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, www.sggw.pl 3 [email protected], Katedra Fizjologii Roślin, Wydział Rolnictwa i Biologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, www.sggw.pl 123 Kamila Nawrocka, Klaudia Kamińska, Anita Wiśniewska wiązanie się białka do ściany komórkowej (do celulozy oraz do pektyn), jednak aby doszło do rozluźnienia elementów ściany komórkowej muszą być obecne obie domeny [5]. Sposób przemieszczania się ekspansyn wewnątrz ściany komórkowej wciąż nie jest poznany. Ekspansyny tworzą nadrodzinę białek, w której, w oparciu o powiązania filogenetyczne, wyróżniono: EXPA (ekspansyny A, α-ekspansyny), EXPB (ekspansyny B, β-ekspansyny) oraz białka podobne do ekspansyn (ang. Expansin-like proteins, EXL): rodzinę białek EXLA (podobnych do ekspansyn A) oraz EXLB (podobnych do ekspansyn B). Białka podobne do ekspansyn posiadają domeny I i II, ale w znacznym stopniu różnią się one od ekspansyn A i B sekwencją aminokwasów. Białka należące do nadrodziny ekspansyn wykazują wzajemne podobieństwo sekwencji aminokwasów na poziomie 20-40%, przy czym bardziej konserwowana pozostaje domena I [5]. Na podstawie analizy genomów Arabidopsisthaliana i ryżu ustalono, że rodzina genów kodujących ekspansyny wywodzi się od 12 pragenów EXPA, 2 pragenów EXPB oraz 1-3 pragenów EXLA/EXLB, które prawdopodobnie występowały u ostatniego wspólnego przodka tych dwóch gatunków [5]. Funkcją ekspansyn może być ułatwianie dostępu celulazom do łańcuchów celulozy, gdyż stwierdzono wzrost aktywności hydrolitycznej celulaz w obecności ekspansyn [5]. Ekspresja różnych genów należących do rodziny ekspansyn jest została stwierdzona w każdym procesie związanym ze wzrostem lub modyfikacją ścian komórkowych, stąd różne geny ekspansyn charakteryzują się odmiennym wzorem ekspresji. Przebudowa ściany komórkowej występuje również w przypadku infekcji roślin patogenami bakteryjnymi lub grzybowymi, czy ataku szkodników. Konstytutywna ekspresja niektórych genów ekspansyn może prowadzić do spadku podatności roślin na dany patogen, jednakże podłoże takiej „odpornościowej” roli ekspansyn nie jest jeszcze wyjaśnione. Należałoby zbadać w jaki sposób naruszenie integralności ścian komórkowych roślin uruchamia ich ścieżki odpowiedzi obronnej [5]. 2. Udział ekspansyn roślinnych w odpowiedzi na atak nicieni pasożytniczych roślin Podstawy odpowiedzi obronnej roślin oraz charakterystyka nicieni osiadłych (mątwików i guzaków) pasożytujących na roślinach zostały opisane we wcześniejszej pracy [6]. Warunkiem przeżycia i rozwoju mątwików (Globodera spp. i Heterodera spp.) jest utworzenie w korzeniu gospodarza struktury odżywiającej – syncytium. Natomiast guzaki (Meloidogyne spp.) indukują rozwój komórek olbrzymich, które tworzą tzw. galasy. W powstawaniu struktur odżywiających duże znaczenie mają zmiany struktury ścian komórkowych oraz ich modyfikacje. Podczas 124 Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień migracji w korzeniu nicienie wykorzystują, do zainicjowania rozwoju struktury odżywiającej, własny „koktajl” białek degradujących i modyfikujących ściany komórkowe, produkowany w trzech gruczołach: dwóch brzusznych i jednym grzbietowym. Białka te również uczestniczą w przeprowadzaniu zmian w strukturze ściany komórkowej w trakcie tzw. fazy osiadłej cyklu życiowego nicieni. Podczas rozwoju syncytium ściana komórkowa podlega zarówno procesom degradującym ją, jak i reorganizującym jej strukturę [7]. Wieczorek i wsp. [8] badali rolę ekspansyn w odpowiedzi A. thaliana na atak mątwika burakowego (H. schachtii). Analizowali oni ekspresję genów kodujących 23 ekspansyny A i 3 ekspansyny B u A. thaliana, przed i po porażeniu roślin nicieniem. Ekspresja trzech genów AtEXPA3, AtEXPA5 i AtEXPA16 została stwierdzona tylko w pędach, natomiast ekspresja AtEXPA18 tylko w korzeniach niezainfekowanych roślin. Pozostałe geny ekspansyn ulegały ekspresji zarówno w pędach i korzeniach lub w żadnym z wymienionych organów. Podwyższony poziom ekspresji w syncytiach stwierdzono dla jedenastu badanych genów ekspansyn: AtEXPA1, AtEXPA3, AtEXPA4, AtEXPA5, AtEXPA6, AtEXPA8, AtEXPA10, AtEXPA15, AtEXPA16, AtEXPA20 oraz AtEXPB3. Z kolei geny AtEXPA7 i AtEXPA18 wykazywały obniżony poziom ekspresji w syncytiach. Aktywność promotorów w syncytiach stwierdzono dla następujących genów ekspansyn: AtEXPA1, AtEXPA3, AtEXPA4, AtEXPA6, AtEXPA10, AtEXPA15 i AtEXPA16, przy czym dla linii transgenicznych z promotorami genów AtEXPA1, AtEXPA4 i AtEXPA15 stwierdzono bardzo silne niebieskie wybarwienie w syncytiach, będące rezultatem aktywności β-glukuronidazy znajdującej się pod kontrolą wymienionych promotorów [8]. Wykazano również, że ekspresja genów ekspansyn zmienia się podczas rozwoju syncytium. Podobne wyniki uzyskano w innej pracy dotyczącej ekspresji genów ekspansyn w rozwijających się galasach w korzeniach A. thaliana zainfekowanych guzakiem (Meloidogyne javanica) [9]. W galasach stwierdzono podwyższoną ekspresję siedmiu genów EXPA i dwóch EXPB. Mutacje w poszczególnych genach ekspansyn u A. thaliana nie miały wpływu na poziom infekcji i rozwój mątwika burakowego [10]. Gal i wsp. [11] stwierdzili podwyższony poziom ekspresji ekspansyny A5 u pomidora (LeEXPA5) w komórkach olbrzymich zaindukowanych przez guzaka jawajskiego (M. javanica). W korzeniach transgenicznego pomidora z wyciszonym genem LeEXPA5, po zakażeniu guzakiem, stwierdzono zmniejszenie średnicy komórek olbrzymich oraz mniejszą liczbę składanych przez nicienia jaj w stosunku do nietransgenicznej kontroli [11]. U roślin pomidora infekowanych mątwikiem ziemniaczanym (Globodera rostochiensis) również wykazano podwyższony poziom ekspresji genu LeEXPA5 w syncytiach [12]. Kolejne badania przepro125 Kamila Nawrocka, Klaudia Kamińska, Anita Wiśniewska wadzone przez Fudali i wsp. [13] na pomidorze zainfekowanym mątwikiem ziemniaczanym wykazały, że podczas rozwoju syncytiów, spośród dziesięciu badanych genów ekspansyn, trzy geny LeEXPA2, LeEXPA4 oraz LeEXPA5 charakteryzowały się podwyższonym poziomem ekspresji. Gen LeEXPA5 był eksprymowany w rozrastających się syncytiach, a immunolokalizacja jego produktu ujawniła obecność białka ekspansyny A5 w ścianach komórek syncytiów. Z kolei transkrypty genu LeEXPA4 zostały zlokalizowane głównie w komórkach miękiszowych tkanki przewodzącej otaczających syncytia, a także w peryferycznych częściach syncytiów (3- i 5-dniowych) oraz w niektórych komórkach parenchymatycznych tkanki przewodzącej sąsiadujących z syncytiami. W starszych syncytiach (7-, 10- i 14-dniowych) transkrypty były obecne jedynie w komórkach sąsiadujących z syncytiami. Natomiast wzrost poziomu akumulacji transkryptów LeEXPA5 stwierdzono już na bardzo wczesnym etapie tworzenia się struktury odżywiającej – w tzw. komórce inicjalnej syncytium oraz we wczesnych (3- i 5-dniowych) syncytiach. W centralnej części starszych syncytiów (7- i 10-dniowych) w pobliżu części głowowej nicienia poziom akumulacji transkryptów LeEXPA5 był obniżony, lecz w nowych komórkach włączanych do syncytium wciąż utrzymywał się na podwyższonym poziomie. Autorzy pracy sugerują, że produkt genu LeEXPA5 może odgrywać ważną rolę podczas włączania się nowych komórek do syncytium, natomiast białko LeEXPA4 przypuszczalnie pełni rolę pomocniczą w tym procesie poprzez rozluźnianie ścian komórkowych w tkance otaczającej syncytium [13]. Podobne wyniki dotyczące poziomu ekspresji genów ekspansyn u pomidora zostały również uzyskane po infekcji guzakiem (M. incognita) [14]. Guimaraes i wsp. [15] analizowali transkryptom komórek korzeni dzikiego gatunku orzecha ziemnego (Arachis stenosperma), zainfekowanych guzakiem Meloidogyne arenaria, w początkowej fazie interakcji roślina-patogen. A. stenosperma jest odporny na guzaka M. arenaria. Odporność ta charakteryzuje się silną reakcją nadwrażliwości (ang. Hypersensitive Reaction, HR). W tę interakcję roślina-nicień zaangażowana jest ścieżka transdukcji sygnału auksyn, a lokalne stężenie tego fitohormonu jest również istotne dla rozwoju struktur odżywiających nicienia. Guimaraes i wsp. [15] stwierdzili, że poziom ekspresji genu AsAUX/IAA (AUXIN RESPONSIVE PROTEIN) był obniżony w 6 dniu po infekcji (ang. Days After Infection, DAI). We wcześniejszych badaniach tego zespołu wykazano, że poziom ekspresji innego genu AsARP (AUXIN REPRESSED PROTEIN) był silnie podwyższony w korzeniach A. stenosperma po infekcji M. arenaria. Wzory ekspresji obu tych genów potwierdzają słuszność hipotezy tych autorów, stanowiącej że brak akumulacji auksyn może prowadzić do zahamowania rozwoju komórek olbrzymich w układzie 126 Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień niekompatybilnym (odporny gospodarz/awirulentny nicień). Auksyna odpowiada, między innymi, za aktywację pomp protonowych w błonie komórkowej, powodując zakwaszenie ściany komórkowej, aktywację ekspansyn, i w efekcie prowadząc do rozluźnienia ściany komórkowej [16]. Innym genem, będącym elementem ścieżki sygnałowej auksyn i regulującym proces adaptacji roślin do stresu, jest GH3. Gen ten koduje syntazę IAA-amidu (IAA-AMIDO SYNTHASE), która odpowiada za powstawanie konjugatów IAA z aminokwasami, utrzymując dzięki temu odpowiednie stężenie wolnych auksyn w komórce. Od genu GH3 zależy również synteza ekspansyn, zależna od auksyn. Nadekspresja genu GH3 może powodować zahamowanie transdukcji sygnału auksyny, co ma związek z zahamowaniem ekspresji genów ekspansyn, i w efekcie może sprzyjać uruchomieniu reakcji obronnej rośliny [17]. Guimaraes i wsp. [15] stwierdzili wzrost poziomu ekspresji genu AsGH3.1 w korzeniach orzecha ziemnego po infekcji M. arenaria w 3-6 DAI. W tym samym czasie gen ekspansyny AsEXLB wykazywał zauważalny spadek poziomu ekspresji, szczególnie w 6 DAI, w którym już pierwsze symptomy HR są widoczne w interakcji A. stenosperma i M. arenaria. Według autorów oba geny mogą mieć duże znaczenie w uruchomieniu odpowiedzi odpornościowej roślin. Według ich hipotezy, M. arenaria już w 3 DAI indukuje syntezę auksyn w komórkach roślinnych celem osłabienia ścian komórkowych oraz zwiększenia szansy zaindukowania rozwoju komórek olbrzymich. Jednak odporne rośliny A. stenosperma uruchamiają reakcję obronną polegającą na zapobieganiu rozluźnianiu ściany komórkowej, poprzez zmniejszenie poziomu akumulacji auksyn (o czym świadczą zmiany poziomu ekspresji genów AsAUX/IAA i AsARP), będącego skutkiem wzrostu poziomu ekspresji genu AsGH3.1. Ponadto, poziom ekspresji genu AsEXLB różnił się pomiędzy genotypami odpornym (A. stenosperma) a podatnym (A. hypogaea), mianowicie był statystycznie istotnie obniżony w genotypie odpornym po infekcji M. arenaria. Pozytywny wpływ auksyny na indukcję i rozwój struktur odżywiających nicieni jest znany od dawna [18, 19]. W ostatnich latach udało się też częściowo poznać regulację transkrypcji genów kodujących ekspansyny. Udowodniono, że czynnik transkrypcyjny LBD18/ASL20 (ang. Lateral Organ Boundaries Domain (LBD)/Asymmetric Leaves2-Like (ASL)) wiąże się bezpośrednio do promotorów genów AtEXPA14 i AtEXPA17 aktywując ich ekspresję. Gen LBD18 znajduje się natomiast pod kontrolą receptora auksyn TIR1 oraz czynników transkrypcyjnych ARF7 (ang. Auxin Response Factor) i ARF19 [20-22]. 127 Kamila Nawrocka, Klaudia Kamińska, Anita Wiśniewska 3. Rola ekspansyn nicieni w infekcji roślin Nicienie pasożytujące na roślinach napotykają na swej drodze barierę, którą stanowi ściana komórki roślinnej. Ominięciu tej przeszkody sprzyja ich zdolność do wytwarzania enzymów i białek pozwalających na degradację lub przekształcenia ściany komórkowej. W genomach nicieni pasożytujących na roślinach zidentyfikowano między innymi geny kodujące ekspansyny. Białka te są wydzielane przez infekcyjne stadia nicieni. Odpowiadają również za rozluźnianie ścian komórek roślinnych, co ułatwia dostęp innym enzymom odpowiedzialnym za degradację ścian komórkowych [23-26]. Gen zwierzęcy Gr-Exp1 kodujący ekspansynę został po raz pierwszy odkryty u G. rostochiensis. Charakteryzował się on podwyższonym poziomem ekspresji w gruczołach brzusznych larw infekcyjnych J2. W białku Gr-Exp1 zidentyfikowano dwie domeny: wykazującą podobieństwo do domeny występującej w endoglukanazach oraz domenę podobną do występującej w białkach podobnych do ekspansyn β u tytoniu i A. thaliana. Aktywność typowa dla ekspansyn białka Gr-Exp1 została potwierdzona poprzez analizę jego wpływu na wzrost koleoptyli pszenicy [23, 24]. Wydaje się, że ekspansyny tworzą obszerną rodzinę białek w genomach nicieni pasożytujących na roślinach. W genomie M. incognita zostało zidentyfikowanych 20 genów kodujących potencjalne ekspansyny, wśród których tylko dwie ekspansyny posiadają domenę CBM na końcu aminowym, pozostałe białka zawierają tylko domenę ekspansyny [27]. Geny kodujące białka podobne do ekspansyn zostały również scharakteryzowane u pasożytującego na sośnie nicienia – węgorka sosnowca (Bursaphelenchus xylophilus oraz B. mucronatus). Białka te wykazały największe podobieństwo do ekspansyn lub białek podobnych do ekspansyn z mątwika ziemniaczanego i guzaków. Geny kodujące białka podobne do ekspansyn u Bursaphelenchus ulegały podwyższonej ekspresji wyłącznie w gruczołach brzusznych nicienia, co wskazuje na ich udział w interakcji pasożytgospodarz. W białkach podobnych do ekspansyn u Bursaphelenchus stwierdzono obecność tylko domeny ekspansyny [25]. W kolekcji fragmentów ESTs (ang. Expressed Sequence Tags) pochodzących z Ditylenchus destructor zidentyfikowano również dwa geny kodujące ekspansyny: DdExp-1 i Dd-Exp-2 [28]. Dd-Exp-1 wykazała największe podobieństwo do genu ekspansyny z D. africanus, natomiast Dd-Exp-2 do genu ekspansyny z B. xylophilus [28]. Akumulacja transkryptów genów Dd-EXP-1 oraz Dd-EXP-2 została stwierdzona w komórkach gruczołowych brzusznych u D. destructor. Podobny wzór ekspresji ekspansyn stwierdzono u innych nicieni pasożytniczych roślin, co prawdopodobnie świadczy o tym, że ekspansyny z nicieni mogą pełnić podobną funkcję podczas infekowania roślin [28]. 128 Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień Znane ekspansyny syntetyzowane przez nicienie pasożytujące na roślinach zostały podzielone na trzy grupy w zależności od posiadanych domen [28]. Do grupy I zaliczono ekspansyny posiadające na końcu karboksylowym sekwencję łącznikową (ang. Linker Sequence) oraz domenę wiążącą celulozę (ang. Cellulose Binding Domain, CBD). Domeny w białkach z grupy I występują w następującej kolejności: sygnał peptydowy, domena ekspansyny, łącznik i CBD. Dd-EXP-1, Dd-EXP-2 i Da-EXP-1 należą do grupy I. Do grupy II zalicza się ekspansyny posiadające sygnał peptydowy i domenę ekspansyny, ale nieposiadające CBD. Do grupy II należą Bx-EXPB-1, Bx-EXPB-2, Bx-EXPB-3, Bm-EXB1 i Bm-EXB-2. Do grupy III zaliczane są białka posiadające domeny ułożone w kolejności: sygnał peptydowy, CBD, sekwencja łącznikowa i domena ekspansyny. Należą tu: Hg-EXP-1 (z Heterodera glycines), Ha-EXP-1 (z H. avenae), Gr-EXP-1, Gr-EXPB-1, Mh-EXP (z M. hapla) i Mi-EXP [28]. Porównanie sekwencji białkowych ekspansyn pochodzących z nicieni pasożytniczych roślin oraz z roślin wykazało obecność konserwowanych reszt cysteinowych. Trzy z sześciu cystein występowały zarówno w ekspansynach u roślin jak i u nicieni. Dwie inne cysteiny były konserwowane we wszystkich ekspansynach z nicieni. Peng i wsp. [28] wykonali również analizę filogenetyczną ekspansyn pochodzących z nicieni, roślin, bakterii i grzybów. Dd-EXP-1 i Dd-EXP-2 znalazły się w grupie ekspansyn, w której znalazły się również ekspansyny pochodzące z D. africanus i Bursaphelenchus spp. Ekspansyny guzaków i mątwików znalazły się w innej grupie tych białek. Analiza filogenetyczna oraz identyczne położenie intronów w genach kodujących ekspansyny u nicieni sugerują wspólne pochodzenie tych białek [28], którego źródłem u nicieni mógł być horyzontalny transfer genów z bakterii [24, 29]. Natomiast geny kodujące ekspansyny występujące w genomach bakterii zostały tam horyzontalnie transferowane z genomów roślinnych [30]. Patogeny roślin wytwarzają efektory – białka (lub inne substancje) ułatwiające infekcję gospodarza i modulujące odpowiedź odpornościową. Ostatnio u G. rostochiensis zidentyfikowano kilkanaście przypuszczalnych apoplastycznych efektorów [31]. Po zaindukowaniu ich ekspresji przejściowej w komórkach kilku gatunków psiankowatych połowa z badanych efektorów inicjowała śmierć komórkową, chlorozy, karłowacenie i zaburzenia rozwoju. Wśród nich zidentyfikowano dwa efektory, które kodują przypuszczalne białka podobne do ekspansyny, GrEXPB1 i GrEXPB2. Przy czym w białku GrEXPB2 nie zidentyfikowano domeny wiążącej węglowodany (ang. Carbohydrate Binding Domain, CBD II), powszechnej dla białek podobnych do ekspansyny. GrEXPB2 odpowiadało za hamowanie śmierci komórkowej związanej z odpowiedzią obronną u Nicotiana benthamiana, N. tabacum, pomidora i ziemniaka. GrEXPB2 129 Kamila Nawrocka, Klaudia Kamińska, Anita Wiśniewska było również związane z indukcją chlorozy i karłowacenia u N. benthamiana, a także hamowało transdukcję sygnałów indukowaną przez białka odporności N i Rx u N. benthamiana. Poziom ekspresji genu GrExpB2 ulegał silnemu podwyższeniu u larw J2 w stadium przedinwazyjnym, natomiast gwałtownie zmniejszał się po rozpoczęciu pasożytnictwa. Przypuszczalnie GrEXPB2 może być zaangażowane w hamowanie wczesnej odpowiedzi typu PTI i/lub ETI lub może odgrywać podwójną rolę hamowania i wywoływania odpowiedzi obronnej roślin. Na podstawie uzyskanych wyników zasugerowano, że apoplastyczne efektory mogą wpływać na wewnątrzkomórkowe ścieżki sygnalne. Świadczy to o nowej funkcji białek podobnych do ekspansyn w interakcji roślina – nicień [31]. 4. Podsumowanie Ekspansyny, rozluźniając ścianę komórkową, umożliwiają wzrost komórki i organizmu, co stanowi fundament prawidłowego rozwoju rośliny. Białka te uczestniczą także w odpowiedzi roślin na stresy biotyczne i mogą wpływać na ich podatność bądź odporność na dany czynnik stresowy. W interakcji roślina-nicień biorą udział zarówno ekspansyny syntetyzowane przez roślinę, jak i białka podobne do ekspansyn nicienia. W toku ewolucji nastąpiło wiele zdarzeń na poziomie molekularnym, prowadzących do przystosowania się pasożytniczych nicieni do właściwych im gatunków roślin-gospodarzy. Infekcja rośliny przez nicienia jest złożonym procesem, w którym kluczową rolę odgrywa przebudowa ścian komórkowych. Nicień oddziałuje na gospodarza stymulując roślinę do produkcji ekspansyn uczestniczących w tym procesie, jak również sam wytwarza białka o budowie i funkcji podobnej do ekspansyn. Roślinne ekspansyny są potrzebne do utworzenia przez nicienia struktury odżywiającej w korzeniu rośliny, natomiast ekspansyny nicieni, oprócz rozluźniania ścian komórkowych podczas infekcji, prawdopodobnie pełnią również rolę apoplastycznych efektorów sterujących wewnątrzkomórkowymi ścieżkami sygnalnymi. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Li Y., Jones L., McQueen-Mason S. Expansins and cell growth, Current Opinion in Plant Biology, 6 (2003), s. 603-610 McQueen-Mason S.J., Durachko D.M., Cosgrove D.J. Two endogenous proteins that induce cell-wall extension in plants, Plant Cell, 4 (1992), s. 1425-1433 Sampedro J., Cosgrove D.J. The expansin superfamily, Genome Biology, 6 (2005), s. 242 Cosgrove D. J. Growth of the plant cell wall, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6 (2005), s. 850-861 Cogrove D. J. Plant expansins: diversity and interactions with plant cell walls, Current Opinion in Plant Biology, 25 (2015), s. 162-172 130 Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Wiśniewska A., Kamińska K., Nawrocka K., Sobczak M. Rola kwasów salicylowego i jasmonowego w odpowiedzi roślin na mątwiki i guzaki, Postępy Biologii Komórki, 4 (2015), s. 743-764 Bohlmann H., Sobczak M. The plant cell wall in the feeding sites of cyst nematodes, Frontiers in Plant Science, 5 (2014), s. 89 Wieczorek K., Gołecki B., Gerdes L., Heinen P., Szakasits D., Durachko D. M., Cosgrove D. J., Kreil D. P., Puzio P. S., Bohlmann H., Grundler F. M. W. Expansins are involved in the formation of nematode-induced syncytia in roots of Arabidopsis thaliana, Plant Journal, 48 (2006), s. 98-112 Jammes F., Lecomte P., De Almeida-Engler J., Bitton F., Martin-Magniette M. L., Renou J. P., Abad P., Favery B. Genome-wide expression profiling of the host response to root-knot nematode infection in Arabidopsis, Plant Journal, 44 (2005), s. 447-458 Wieczorek K., Grundler F. M. W. Expanding nematode-induced syncytia: the role of expansins, Plant Signaling & Behavior, 1 (2006), s. 223-224 Gal T. Z., Aussenberg E. R., Burdman S., Kapulnik Y., Koltai H. Expression of a plant expansin is involved in the establishment of root knot nematode parasitism in tomato, Planta, 224 (2006), s. 155-162 Gołecki B., Fudali S., Wieczorek K., Grundler F. M. W. Identification and localisation of tomato expansin gene expression in nematode-induced syncytia, Nematology, 4 (2002), s. 219 Fudali S., Janakowski S., Sobczak M., Griesser M., Grundler F. M. W., Golinowski W. Two tomato α-expansins show distinct spatial and temporal expression patterns during development of nematode-induced syncytia, Physiologia Plantarum, 132 (2008), s. 370-383 Griesser M., Grundler F. M. W. Quantification of tomato expansins in nematode feeding sites of cyst and root-knot nematodes, Journal of Plant Diseases and Protection, 115 (2008), s.263-272 Guimaraes P. M., Guimaraes L. A., Morgante C. V., Silva O. B. Jr., Araujo A. C., Martins A. C., Saraiva M. A., Oliveira T. N., Togawa R. C., Leal-Bertioli S. C., Bertioli D. J., Brasileiro A. C. Root transcriptome analysis of wild peanut reveals candidate genes for nematode resistance, PLOS One 21;10(10):e0140937 (2015) Durachko D. M., Cosgrove D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin, Journal of Visualized Experiments, 25 (2009), s. 1263 Ding X., Cao Y., Huang L., Zhao J., Xu C., Li X., Wang S. Activation of the indole-3-aceticacid-amidosynthetase GH3-8 suppresses expansin expression and promotes salicylate- and jasmonate-independent basal immunity in rice, Plant Cell, 20 (2008), s. 228-240 Goverse A., Overmars H., Engelbertink J., Schots A., Bakker J., Helder J. Both induction and morphogenesis of cystnematodefeedingcells are mediated by auxin, Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (2000), s. 1121-1129 Dąbrowska-Bronk J., Czarny M., Wiśniewska A., Fudali S., Baranowski Ł., Sobczak M., Święcicka M., Matuszkiewicz M., Brzyżek G., Wroblewski T., Dobosz R., Bartoszewski G., Filipecki M. Suppression of NGB and 131 Kamila Nawrocka, Klaudia Kamińska, Anita Wiśniewska 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. NAB/ERabp1 in tomato modifies root responses to potato cyst nematode infestation, Molecular Plant Pathology, 16 (2015), s. 334-348 Kang N. Y., Lee H. W., Kim J. The AP2/EREBP gene PUCHI Co-Acts with LBD16/ASL18 and LBD18/ASL20 downstream of ARF7 and ARF19 to regulate lateral root development in Arabidopsis, Plant and Cell Physiology., 54 (2013), s. 1326-1334 Lee H. W., Kim J. EXPANSINA17 up-regulated by LBD18/ASL20 promotes lateral root formation during the auxin response, Plant and Cell Physiology, 54 (2013), s. 1600-1611 Lee H. W., Kim M. J., Kim N. Y., Lee S. H., Kim J. LBD18 acts as a transcriptional activator that directly binds to the EXPANSIN14 promoter in promoting lateral root emergence of Arabidopsis, Plant Journal., 73 (2013), s. 212-224 Qin L., Kudla U., Roze E. H., Goverse A., Popeijus H., Nieuwland J., Overmars H., Jones J. T., Schots A., Smant G., Bakker J., Helder J. Plantdegradation: a nematodeexpansin acting on plants, Nature, 427 (2004), s. 30 Kudla U., Qin L., Milac A., Kielak A., Maissen C., Overmars H., Popeijus H., Roze E., Petrescu A., Smant G., Bakker J., Helder J. Origin, distribution and 3D-modeling of Gr-EXPB1, an expansin from the potato cyst nematode Globodera rostochiensis, FEBS Letter, 579 (2005), s. 2451-2457 Kikuchi T., Li H., Karim N., Kennedy M. W., Moens M., Jones J. T. Identification of putative expansin-like genes from the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, and evolution of the expansin gene family within the Nematoda, Nematology, 11 (2009), s. 355-364 Long H., Peng D., Huang W., Liu Y., Peng H. Identification of a putative expansin gene expressed in the subventral glands of the cereal cyst nematode Heterodera avenae, Nematology, 14 (2012), s. 571-577 Abad P., Gouzy J., Aury J. M., Castagnone-Sereno P., Danchin E. G., Deleury E., Perfus-Barbeoch L., Anthouard V., Artiguenave F., Blok V.C., Caillaud M. C., Coutinho P. M., Dasilva C., De Luca F., Deau F., Esquibet M., Flutre T., Goldstone J. V., Hamamouch N., Hewezi T., Jaillon O., Jubin C., Leonetti P., Magliano M., Maier T. R., Markov G. V., McVeigh P., Pesole G., Poulain J., Robinson-Rechavi M., Sallet E., Ségurens B., Steinbach D., Tytgat T., Ugarte E., van Ghelder C., Veronico P., Baum T. J., Blaxter M., Bleve-Zacheo T., Davis E. L., Ewbank J. J., Favery B., Grenier E., Henrissat B., Jones J. T., Laudet V., Maule A. G., Quesneville H., Rosso M. N., Schiex T., Smant G., Weissenbach J., Wincker P. Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita, Nature Biotechnology, 26 (2008), s. 909-915 Peng H., Gao B. L., Kong L. A., Yu Q., Huang W. K., He X. F., Long H. B., Peng D. L. Exploring the host parasitism of the migratory plant-parasitic nematode Ditylenchus destuctor by expressed sequence tags analysis, PLOS One, 8(7):e69579 (2013) Haegeman A., Kyndt T., Gheysen G. The role of pseudo-endoglucanases in the evolution of nematode cell wall modifying proteins, Journal of Molecular Evolution, 70 (2010), s. 441-452 132 Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień 30. Nikolaidis N., Doran N., Cosgrove D. J. Plant expansins in bacteria and fungi: evolution by horizontal gene transfer and independent domain fusion, Molecular Biology and Evolution, 31 (2014), s. 376-386 31. Ali S., Magne M., Chen S., Côté O., Stare B. G., Obradovic N., Jamshaid L., Wang X., Bélair G., Moffett P. Analysis of putative apoplastic effectors from the nematode, Globodera rostochiensis, and identification of an expansin-like protein that can induce and suppress host defenses, PLOS One, 10(1):e0115042 (2015) Rola ekspansyn w interakcji roślina-nicień Streszczenie Celem artykułu było przedstawienie najnowszych danych literaturowych dotyczących roli ekspansyn podczas infestacji roślin przez pasożytnicze nicienie. Nicienie pasożytnicze roślin powodują wysokie straty w plonach roślin i stanowią poważny problem w rolnictwie, a także leśnictwie. Ekspansyny to białka, które mają zdolność rozluźniania struktury ściany komórkowej. Nicienie podczas migracji wewnątrz tkanek roślinnych korzystają z własnych wydzielin, które zawierają specyficzny koktajl białek i innych substancji ułatwiających ich pasożytowanie. W wydzielinie znajdują się między innymi enzymy modyfikujące ścianę komórkową roślin, a także ekspansyny. Interesującym wydaje się fakt, że same nicienie pasożytujące na roślinach posiadają w swym genomie geny kodujące ekspansyny lub białka podobne do ekspansyn. Do tej pory genów kodujących ekspansyny nie zidentyfikowano w innej grupie zwierząt. Mechanizm interakcji roślina-nicień jest nadal słabo poznany, a badania na poziomie molekularnym mogą przyczynić się w przyszłości do zwiększenia poziomu tolerancji roślin uprawnych na te pasożyty. Słowa kluczowe: ekspansyny, nicienie roślinne The role of expanins in the plant-nematode interaction Abstract The aim of the article was to present the most recent data in the literature regarding the role of expansins during the infestation of plants by parasitic nematodes. Plant parasitic nematodes cause significant losses in crop plants and are a major problem in agriculture and forestry. Expansins are proteins that are capable of loosening the cell wall structure. Nematodes, during their migration inside the plant tissues, use their own secretions that contain a specific cocktail of proteins and other substances to facilitate their parasitism. The secretions contain, among others, plant cell wall modifying enzymes and expansins. It is interesting that plant parasitic nematodes have genes in their genomes encoding expansins or expansin like proteins. So far, genes encoding expansins were not identified in another group of animals. The mechanism of plant-nematode interactions is still poorly understood, and research at the molecular level can contribute in the future to increase the level of tolerance of crops to these parasites. Keywords: expasins, plant nematodes 133 Klaudia Magierowicz1 Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców 1. Wstęp Wielkoobszarowe i monokulturowe gospodarstwa narażone są na negatywny wpływ agrofagów. Wzrost produkcji roślinnej na tych obszarach powoduje, że organizmy te szybko się rozmnażają zwiększając liczebność swoich populacji, co w konsekwencji prowadzi do obniżenia jakości i ilości plonów oraz staje się powodem ogromnych strat w produkcji [1]. Rośliny są narażone na kontakt z licznymi agrofagami, których przedstawiciele należą do różnych jednostek taksonomicznych takich jak:bakterie, wirusy, grzyby, chwasty, owady i nicienie. Największe zmiany w procesach fizjologicznych roślindokonują się pod wpływem żerowania fitofagów – głównie owadów [2]. Gatunki roślinożerneuszkadzają zarówno nadziemne, jak i podziemne części roślin. Najczęściej obserwowanymi objawami żerowania szkodników są wygryzione otwory w blaszkach liściowych, przebarwienia, zwijanie, zasychanie i przedwczesne opadanie liści, wyżerki na pędach i korzeniach, niewykształcenie pąków kwiatowych [3]. Fitofagi nie uszkadzają wyłącznie żywych roślin. W magazynach zbóż, przechowalniach surowców roślinnych i zakładach przetwórczych występują tzw. szkodniki magazynowe. Skutkiem ich żerowania jest przede wszystkim zjadanie i uszkadzanie ziarna. Ponadto, szkodniki te zanieczyszczają produkty wylinkami i odchodami powodując wzrost temperatury i wilgotności, który sprzyja rozwojowi drobnoustrojów [4]. Wiadomym jest, że niektóre gatunki/odmiany roślin chętniej są zasiedlane i uszkadzane przez fitofagi. Dlatego interakcje między roślinożercami i ich żywicielami od wielu lat sąprzedmiotem intensywnych badań. Wybór rośliny żywicielskiej przez fitofaga uzależniony jest od wielu czynników, które decydują m.in. o tym czy roślina zostanie zasiedlona przez roślinożercę bądź o stopniu intensywności żerowania danego fitofaga [5]. Przy wyborze rośliny żywicielskiej, owady kierują się różnymi bodźcami m.in. wzrokowymi, węchowymi i dotykowymi. Dlatego budowa morfologiczna i anatomiczna roślin odgrywa szczególną rolę w momencie zasiedlenia roślin przez szkodniki.Jednak jednym z najważniejszych czyn1 [email protected], Katedra Entomologii, Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, www.up.lublin.pl 134 Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców ników, który wpływa na interakcje pomiędzy fitofagiem a jego żywicielem jest skład chemiczny roślin [6].Występujące w roślinach metabolity podstawowe, tj. białka, cukrowce i wolne aminokwasy określają wartość odżywczą tkanek roślinnych dla roślinożercy. Obecność w roślinie tych substancji decyduje o zaspokojeniu podstawowych składników pokarmowych, które są niezbędne dla prawidłowego wzrostu i rozwoju owadów. Natomiast roślinne metabolity wtórne warunkują naturalną odporność roślin na roślinożerców [7]. Ze względu na ich zwykle negatywne oddziaływanie na fizjologię owadów, związki te wykorzystywane są do walki z fitofagami, jako biologicznie aktywne substancje w środkach ochrony roślin [8, 9]. Celem pracy było przedstawienie mechanizmów oddziaływania roślin na roślinożerców oraz wykazanie, że związki obecne w tkankach roślinnych, głównie metabolity wtórne mogą pełnić rolę naturalnych biopestycydów. 2. Kryteria wyboru roślin żywicielskich przez owady uskrzydlone Pierwszym etapem wyboru rośliny żywicielskiej przez owady jest tzw. lot inwazyjny, oparty przede wszystkim na bodźcach wzrokowych i zapachowych. W tym czasie owady wykonują krótkie i aktywne loty kilka metrów nad powierzchnią danej rośliny. Jeśli żywiciel jest atrakcyjny dla roślinożercy, spełnia jego wymagania, fitofag decyduje się na lądowanie na roślinie. Znajdując się na powierzchni wybranej części rośliny, owad zaczyna odbierać bodźce dotykowe. Następnie przemieszcza się po danej powierzchni, poszukując właściwego miejsca do złożenia jaj, ukrycia się lub do żerowania. Roślinożerca poznaje smak rośliny poprzez próbne nagryzanie lub nakłucie tkanek roślinnych. Wybierając żywiciela, owady kierują się nie tylko zaspokojeniem swoich potrzeb pokarmowych, ale także poszukują dogodnych miejsc w celu rozmnażania i bytowania [8]. W przypadku samic, wybór żywiciela opiera się na zapachowych związkach lotnych. Olejki eteryczne w swoim składzie chemicznym posiadają m.in. mono- i seskwiterpeny, aldehydy, ketony oraz estry. Zapachowe związki lotne wpływają na fizjologię owadów oraz na ich zachowanie związane ze zdobywaniem pokarmu. Samice do złożenia jaj, a tym samym do dalszego rozwoju potomstwa, wybierają najbardziej odpowiedniego żywiciela. Natomiast w przypadku nie odnalezienia preferowanego żywiciela, samice akceptują inne gatunki roślin. Oddziaływanie związków lotnych zależy od ich stężenia znajdującego się w tkankach rośliny żywicielskiej. W wyborze swojego żywiciela roślinożercy mogą reagować zarówno na pojedyncze substancje, jak i połączenia kilku z nich. Nie zawsze związek występujący w roślinie w największych ilościach 135 Klaudia Magierowicz odrywa najważniejszą rolę.Samice przy znalezieniu gospodarza kierują się ich składem jakościowym [10]. 3. Odporność roślin na żerowanie szkodników Rośliny wykształciły szereg mechanizmów obronnych pozwalających pokonywaćstres biotyczny – atak patogenów i fitofagów. Broniąc się przed szkodnikami, rośliny dysponują odpornością konstytutywną i indukowaną [11, 12]. Odporność konstytutywna (statyczna, bierna), w przypadku której mechanizmy obronne przed szkodnikami występują stale w roślinach, obejmuje cechy anatomiczno-morfologiczne oraz biochemiczne roślin. Odporność ta warunkowana jest przez trzy mechanizmy, do których należy: brak akceptacji, antybioza i tolerancja [13, 14]. Brak akceptacji (antyksenoza) określa wszystkie cechy morfologiczne roślin, które sprawiają, że roślinożercajuż przy wstępnej ocenie rośliny jest zniechęcony do jej zasiedlenia i żerowania. Natomiast zjawisko antybiozy to szkodliwe działanie pokarmu roślinnego na szkodniki. Mechanizm ten wpływa niekorzystnie na procesy życiowe owada. Powoduje m.in. redukcję płodności, zmniejszenie ciężaru i wielkości ciała oraz wzrost śmiertelności. Mechanizm tolerancji występuje u roślin, które posiadają zdolność do regeneracji uszkodzeń oraz są mniej podatne na działanie szkodników [8, 13]. Odporność indukowana (czynna) polega na zmianach strukturalnych i biochemicznych, które zachodzą w tkankach rośliny pod wpływem żerowania szkodnika. W wyniku interakcji owad-roślina zostają zakłócane reakcje fizjologiczne [14, 15, 16].Odpowiedź roślin na atak fitofagów występuje zarówno w miejscu żerowania, jak i może być obserwowana w całym roślinnym organizmie. Odporność czynna może rozpocząć się w przeciągu kilku godzin, dni a nawet lat od żerowania szkodników [13, 17]. 3.1. Wpływ właściwości fizycznych roślin na roślinożerców O wyborze rośliny żywicielskiej przez roślinożerców decydują cechy morfologiczne i anatomiczne roślin. Wśród najważniejszych cech morfologicznych należy wymienić: wysokość, kształt i barwę roślin, wielkość liści, łodyg, owoców i kwiatów, ich rozmieszczenie oraz występowanie na powierzchni kolców, igieł, cierni, włosków powierzchniowych czy nalotu woskowego. Do właściwości anatomicznych, znacznie utrudniających żerowanie szkodników należy: grubość i nasycenie woskiem kutikuli, liczba i wielkość aparatów szparkowych oraz twardość ścian komórkowych [5, 13, 18]. Duże rośliny są zwykle bardziej preferowane. Im większa bowiem jest roślina i powierzchnia jej organów, tym ilość zawartego w niej pokarmu także jest większa. Również rośliny silne rozkrzewione, o rozłożystym pokroju 136 Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców stanowią doskonałe miejsce do składania jaj i sądoskonałym miejscem do ukrycia się np. przed wrogiem [13]. Rośliny posiadające ciemnozielone liście o wysokiej zawartości chlorofilu a i b oraz niskiej zawartości barwników żółtopomarańczowych są zdecydowanie mniej preferowane przez owady niż rośliny o jaśniejszym zabarwieniu.Czerwona barwa jest dla fitofagów znakiem ostrzegawczym. Liście intensywnie zabarwione na kolor czerwony świadczą o wysokiej zawartości antocyjanów, których przemiany są związane z metabolizmem związków fenolowych, a więc substancji obronnych roślin. Dodatkowo kolor czerwony lub żółty może być sygnałem informującym o niskiej zawartości składników odżywczych [16]. Obecność dużej ilości włosków na powierzchni organów lub silnie omszone liście znacznie ograniczają, a tym samym uniemożliwiają poruszanie się roślinożerców po ich powierzchni.Włoski gruczołowe różnią się długością, kształtem czy składem chemicznym. Ponadto, włoski produkują specjalną wydzielinę, która oblepia odnóża owadów uniemożliwiając im poruszanie się po powierzchni [19, 20]. Kutikula, która pokrywa organy roślinne, przede wszystkim liście, odgrywa bardzo istotną rolę w interakcji owad-roślina.Podstawowymi składnikami kutikuli są: kutyna, celuloza, pektyny oraz woski. Ponadto, substancje te w swoim składzie zawierają m.in.estry, węglowodory, alkohole, ketony i związki aromatyczne [21, 22]. Grubość warstwy kutykularnej znacznie utrudnia fitofagom dostęp do tkanek przewodzących. Dotyczy to przede wszystkim roślinożerców posiadających kłująco-ssący narząd gębowy, dla których przekłucie wszystkich warstw kutikuli jest bardzo trudne [5]. Budowa warstwy woskowej jest silnie związana ze składem chemicznym substancji, które je tworzą. Skład chemiczny kutikuli wpływa negatywnie na płodność, co w efekcie powoduje zmniejszenie liczebności populacji roślinożercy na danej roślinie. W związku z tym, owady zasiedlając roślinę wybierają takie gatunki, u których warstwa kutikuli jest znaczniej mniej wysycona związkami organicznymi [23]. Ściany komórkowe roślin w swoim składzie, zawierają znaczną ilość celulozy, pektyn oraz ligniny. Substancje te powodują, że roślina posiada twarde i grube tkanki, bardziej wytrzymałena uszkodzenia mechaniczne. Właściwości te sprawiają, że owady mimo wyspecjalizowanych narządów gębowych nie są w stanie przebić się przez tak zbudowane ściany komórkowe [8]. 3.2. Wpływ właściwości biochemicznych roślin na roślinożerców Owady poza bodźcami dotykowymi odbierają także bodźce węchowe i smakowe. W momencie wstępnego żerowania, z roślin uwalniają się substancje lotne oddziaływujące na receptory owadów.Związki lotne stanowią grupę ponad 20 000 niskocząsteczkowych substancji, które mogą emitować ponad 100 różnych składników w tym samym czasie. Mogą one pełnić rolę tzw. atraktantów, które zachęcają owady do zasiedlenia rośliny. 137 Klaudia Magierowicz Natomiast inne zadanie pełnią repelenty, któreswoim działaniem odstraszają roślinożerców [24, 25]. Oddziaływanie tych substancji może być uzależnione od ich stężenia w tkankach żywiciela. Atrakcyjność związków lotnych danej rośliny zależy od gatunku owada. Ta sama substancja wobec jednego gatunku może działać jak atraktant, a w stosunku do innego jako repelent [24]. Ilościowy i jakościowy skład związków lotnych może ulegać zmianom w wyniku działania czynników abiotycznych, takich jak temperatura, zmiana natężenia światła, wilgotność, dostępność azotu i fosforu [5, 26]. 3.2.1. Metabolity podstawowe Wartość odżywcza pokarmu jest czynnikiem determinującym interakcje roślina-fitofag. Roślinożerca przy wyborze żywiciela kieruje się składem chemicznym rośliny, która ma mu zapewnić dostęp do podstawowych składników pokarmowych pozwalających utrzymać funkcje życiowe. Metabolity podstawowe (pierwotne) to związki chemiczne, które zawierają substancje niezbędne do prawidłowego wzrostu i rozwoju fitofagów. Pełnią funkcje budulcowe, zapasowe i energetyczne, nie tylko w komórce roślinnej, ale także dla owadów. Należą do nich: białka, cukrowce, wolne aminokwasy i tłuszcze [27]. Skład chemiczny i wartość spożywanego pokarmu determinuje wzrost, rozwój, płodność i przeżywalność owadów. Jeśli roślinożerca nie pobiera określonych składników pokarmowych i ich odpowiedniej ilości, nie jest w stanie prawidłowo się rozwijać [27]. Cukrowce są jednym z najważniejszych składników odżywczych. Szczególne znaczenie ma glukoza i sacharoza, które pełnią główną rolę w czasie wyboru rośliny żywicielskiej przez fitofaga.Ponadto sacharoza wpływa na płodność i rozwój owadów [27, 28]. Białka i aminokwasy stanowią podstawowe źródło składników odżywczych. Największe znaczenie odgrywają aminokwasy egzogenne, które muszą być pobierane wraz z pokarmem ponieważ nie są syntetyzowane w organizmie fitofaga. Z tego powodu, pluskwiaki różnoskrzydłe (Hemiptera: Heteroptera) i mszyce (Hemiptera: Sternorrhyncha: Aphidoidea) posiadają w swoim przewodzie pokarmowym symbiotyczne bakterie z rodzaju Buchnera, które są odpowiedzialne za produkowanie wszystkich egzogennych aminokwasów [27]. Szczególne znaczenie w interakcji roślina-owad mają związki azotowe. Ilość aminokwasów w tkankach roślinnych jest warunkowana przez pobieranie azotu oraz włączanie go w struktury związków azotowych roślin. Wysoka zawartość aminokwasów w roślinach wpływa korzystnie na bionomię owadów oraz na ich żerowanie.Znaczna ilość aminokwasów występuje w soku floemowym roślin. Właściwość ta jest istotna dla owadów o kłująco-ssącym narządzie gębowym. Wartość odżywcza tkanek roślinnych decyduje o żerowaniu, rozwojuoraz płodności szkodników [29]. 138 Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców Sok floemowy, poza cukrami i aminokwasami, zawiera w swoim składzie białka. Składnik ten warunkuje wzrost i rozwój owadów. W zależności od gatunku rośliny, jej wieku oraz stanu składników pokarmowych w glebie, zawartość białek w roślinie może być różna [27]. Białka regulują takżeprocesy obronne roślin, ponieważ pod wpływem zranienia zostaje aktywowana biosynteza szkodliwych dla fitofagów metabolitów wtórnych. Ponadto, powstają zmiany w strukturach tkanek roślinnych, które zdecydowanie wpływają na ograniczenie żerowania szkodników [30]. Tłuszcze zawarte w pokarmie roślinnym są źródłem energii dla roślinożerców i stanowią materiał zapasowy. Kwas linolowy, należący do lipidów, jest niezbędny do prawidłowego rozwoju i wzrostu larw motyli. Inne związki, takie jak sterole wpływają pozytywnie na rozwój wszystkich gatunków owadów [31]. 3.2.2. Metabolity wtórne Najważniejszymi substancjami chemicznymi hamującymi żerowanie i rozwój szkodników oraz warunkującymi naturalną odporność roślin są metabolity wtórne [7, 32].Związki te występują zarówno na powierzchni roślin, jak i wewnątrz ich tkanek [33]. Ze względu na miejsce gromadzenia się tych substancji, owady o gryzącym narządzie gębowym są bardziej narażone na szkodliwe działanie metabolitów wtórnych niż owady, które docierają w głąb tkanek roślinnych. Dotyczy to fitofagów o kłująco-ssącym narządzie gębowym, do których należą m.in. mszyce [8]. Metabolity wtórne wpływają głównie na procesy fizjologiczne owadów. Ich oddziaływanie na fitofagi związane jest z metabolizmem i regulacją enzymów biorących udział w oddychaniu, pobieraniu pokarmu, trawieniu czy neutralizowaniu związków toksycznych [13]. Wśród najważniejszych metabolitów wtórnych wyróżnia się: terpenoidy, związki fenolowe oraz niebiałkowe związki azotowe [34]. Terpenoidy to związki zróżnicowane pod względem zarówno strukturalnym, jak i funkcjonalnym. Wśród nich sąsubstancje, które mogą być atrakcyjne dla niektórych gatunków owadów. Ze względu na barwę kwiatów, związki te zwabiają przede wszystkim przedstawicieli gatunków należących do owadów zapylających. Inne terpenoidy posiadają właściwości odstraszające, dzięki którym pełnią funkcję ochronną przed atakiem szkodników [25]. Wiele substancji należących do terpenoidów wchodzi w skład olejków eterycznych. Związki te nadają gorzki smak roślinom dzięki czemu fitofagi decydują się na zaprzestanie żerowania [34]. Jedną z najbardziej aktywnych grup związków występującą w tkankach roślin, są związki fenolowe. Głównym ich zadaniem jest hamowanie aktywności enzymów i toksyczne oddziaływanie na szkodniki [13]. Flawonoidy, należące do związków fenolowych, tworzą ich najważniejszą grupę pochodnych. Wśród nich występują taniny, których najwyższe stężenie stwierdza się u liści roślin drzewiastych. Substancje te, wiążą się 139 Klaudia Magierowicz z tkankami jelita roślinożercy, doprowadzając w ten sposób do uszkodzenia jelita środkowego. Ponadto posiadają także silne właściwości odstraszające, ze względu na charakterystyczny gorzki smak i działanie ściągające [13, 35]. Wysokie stężenie tanin w tkankach roślin wpływa na wzrost śmiertelności danej populacji fitofagów. Natomiast niska zawartość tanin wpływa stymulująco na żerowanie szkodników. Zależność ta może wynikać zarówno z biochemicznych, jak i fizycznych reakcji obronnych w jelitach owada, wysokiego pH lub ilości przeciwutleniaczy [30]. Związki cyjanogenne należą do niebiałkowych związków azotowych, odpowiedzialnych za wytwarzanie cyjanowodoru (HCN). Jedynie w momencie uszkodzenia tkanki roślinnej dochodzi do procesu cyjanogenezy. Wówczas w połączeniu enzymu β-glukozydazy z glikozydem cyjanogennym dochodzi do uwolnienia cyjanowodoru. HCN jest silnym związkiem toksycznym ponieważ powoduje blokadę aktywności oksydazy cytochromowej w łańcuchu oddechowym. W efekcie uwolnienia HCN następuje zablokowanie procesu oddychania owadów [13, 27]. Inną grupę niebiałkowych związków azotowych stanowią alkaloidy. Zdecydowana ich większość wykazuje aktywność biologiczną, dlatego odgrywają one rolę repelentów w stosunku do roślinożerców. Dodatkowo, ich właściwości toksyczne nasilają się wraz ze wzrostem stężenia [27]. 3.2.3. Wykorzystanie metabolitów wtórnych do ograniczenia liczebności szkodników Obecnie za najbardziej efektywną metodę zwalczania szkodników uważa się metodę chemiczną. Pestycydy stwarzają jednak ogromne zagrożenie dla zdrowia człowieka i zwierząt. Dlatego coraz częściej poszukuje się alternatywnych sposobów ograniczenia liczebności szkodników. Jedną z niechemicznych metod zwalczania agrofagów jest wykorzystanie substancji biologicznie czynnych pochodzenia roślinnego [1, 36]. Substancje te, dzięki swoim właściwością mogą pełnić rolę naturalnych biopestycydów. Wtórne metabolity roślinne wpływają znacząco na fizjologię owadów. Opryskiwanie roślin wyciągami roślinnymi powoduje zniechęcenie lub zahamowanie żerowania fitofagów.Rośliny żywicielskie stają się wówczas mniej atrakcyjne dla roślinożerców, a w związku z tym liczebność ich populacji może zostać znacznie ograniczona [38]. Najbardziej popularnymi naturalnymi biopestycydami są środki zwierające w swoim składzie olejki eteryczne. Substancje te uzyskiwane są ze wszystkich organów roślin, które stanowią esencję danego zapachu. Olejki eteryczne mogą oddziaływać na roślinożerców repelentnie lub toksycznie. Oddziaływanie to zazwyczaj uzależnione jest od stężenia oraz od gatunku fitofaga. Stwierdzono, że po zastosowaniu olejku lawendowego o stężeniu 0,05% na mszyce ziemniaczaną (Aulacorthum solani L.) 140 Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców żerującą na liściach tytoniu, śmiertelność osobników wyniosła 100%[38]. Do najczęściej stosowanych i wykorzystywanych w walce ze szkodnikami należą olejki: lawendowy, geraniowy, konopny, tymiankowy, cynamonowy oraz mięty pieprzowej [39, 40, 41]. Powszechnie znaną substancją aktywną, dopuszczoną do stosowania w krajach europejskich jest azadyrachtyna. Pozyskuje się ją z nasion drzewa miodlii indyjskiej (Azadirachta indic L.).Substancja ta wykazuje działanie owadobójcze, antyfidantne, repelentne oraz hamujące rozwój w stosunku do 400 gatunków owadów. Jej toksyczne działanie zaobserwowano w stosunku do powszechnie występujących szkodników jabłoni (kwieciak jabłkowiec – Anthonomus pomorum L., mszyca jabłoniowo-babkowa – Dysaphis plantaginea Pass.), maliny (kwieciak malinowiec –Anthonomus rubi Herbst), czereśni (nasionnica trześniówka – Rhagoletis cerasi L.) i wiśni (mszyca czereśniowa – Myzus cerasi F.) [44]. Preparaty uzyskane zmiodlii indyjskiej wykorzystywane są obecnie na całym świecie ze względu na szerokie spektrum działania. Badania potwierdzają, że użycie środków z azadyrachtyną obniża płodność, hamuje rozwój jaj oraz powoduje zaburzenia rozwoju larw [42]. Badania dowodzą, że stosowanie wyciągów z miodlii indyjskiej zmniejsza populację stonki ziemniaczanej (Leptinotar sadecemlineata Say) o 50% [42, 43].Natomiast działanie toksyczne w stosunku do larw korowódki pniówki (Thaumetopoea pityocampa Den. & Schiff.) wykazały wyciągi z krwawnika (Achillea wilhelmsii Koch), kocimiętki (Nepeta meyeri Benth.), cząbru ogrodowego (Satureja hortensis L.), wrotyczu (Tanacetum argyrophyllum Koch) oraz dwóch gatunków lebiodki (Origanum onites L., Origanum rotundifolium Boiss.) [45]. Przykładów negatywnego oddziaływania substancji pochodzenia naturalnego na szkodniki jest wiele. W licznych ośrodkach w Polsce i na świecie prowadzone są pod tym kątem szeroko zakrojone badania, a ich wynikami zainteresowane są nie tylko firmy fitofarmaceutyczne, ale również sami producenci roślin. 4. Podsumowanie Przy wyborze rośliny żywicielskiej roślinożercy kierują się bodźcami wzrokowymi, węchowymi, dotykowymi oraz smakowymi. Na wybór swojego żywiciela oraz intensywność żerowania fitofagów wpływają cechy morfologiczne i anatomiczne roślin. Pokrycie roślin dużą ilością włosków, nalotu woskowego, obecność grubej warstwy kutikuli czy ciemnozielone zabarwienie liści zniechęca roślinożerców do żerowania. Zawarte w roślinach związki lotne mogą pełnić istotną funkcję w pośredniej odporności roślin. Sygnalizują fitofagom, że w danym pokarmie roślinnym, znajdują się związki chemiczne o znaczeniu toksycznym. W wyborze rośliny żywicielskiej istotną rolę odgrywa wartość odżywcza i smak pokarmu. Zaspokojenie potrzeb pokarmowychwiąże się zarówno ze 141 Klaudia Magierowicz składem ilościowym, jak i jakościowym spożywanego pokarmu. Substancje chemiczne wytwarzane przez rośliny, jakimi są metabolity wtórne, wpływają negatywnie na rozwój owadów. Gatunki posiadające gryzący narząd gębowy są bardziej narażone na oddziałanie metabolitów wtórnych niż owady o kłująco-ssącym narządzie gębowym, które są przystosowane do penetrowania tkanek położonych znacznie głębiej. Zaprzestanie żerowania szkodników może być wywołane na skutek uszkodzenia ich układu trawiennego i oddechowego. Spośród związków lotnych, szczególne znaczenie odgrywają olejki eteryczne, które oddziaływują w różnym stopniu na owady. Wyróżnia się działanie odstraszające (repelentne), hamujące rozwój i żerowanie (antyfidantne) lub toksyczne. Wyciągi roślinne, zawierające w swoim składzie metabolity wtórne, zdecydowanie ograniczają żerowanie szkodników. Z tego względu mogą spełniać rolę naturalnych biopestycydów. Literatura Burgieł Z. J. Czy preparaty roślinne zastąpią syntetyczne pestycydy? [w:] Ochrona środowiska naturalnego XXI wieku – nowe wyzwania i zagrożenia, Fundacja na Rzecz Wspierania Badań Naukowych, Wydział Ogrodniczy Akademii Rolniczej w Krakowie, 2008, s. 116-125 2. Piesik D. „Priming”, gotowość roślin do obrony przed szkodnikami i patogenami, Progress in PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 55 (2) (2015), s. 183-188 3. Boczek J., Lewandowski M. Nauka o szkodnikach roślin uprawnych, Wydawnictwo SGGW, Warszawa 2016 4. Olejarski P., Węgorek P., Zamojska J. Monitoring i zwalczanie szkodników w obiektach magazynowych w Polsce, Progress In PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 53, 3 (2013), s. 455-461 5. Sempruch C. Interakcje między mszycami a roślinami we wstępnych etapach wyboru żywiciela, Kosmos problemy nauk Biologicznych, Polskie Towarzystwo Przyrodników im. Kopernika, 61, 4 (2012), s. 573-586 6. Ryan C. A The systemin signaling pathway: differential activation of plant defensive genes, Biochimica et Biophysica Acta, 1477 (2000), s. 112-127 7. Gantner M., Najda A., Janiuk M. Atrakcyjność odmian borówki wysokiej (Vacciniumcorymbosum L.) dla zwójkówek liściowych w zależności od zawartościwybranych metabolitów wtórnych, Progress in PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 52, 4 (2012), s. 820-825 8. Leszczyński B. Naturalna odporność roślin na szkodniki [W:] Biochemiczne Oddziaływania Środowiskowe (Oleszek W., Głowniak K., Leszczyński B. red), Akademia Medyczna, Lublin 2001, s. 87-108 9. Oleszek W., Głowniak K., Leszczyński B. Biochemiczne Oddziaływania Środowiskowe, Wydawnictwo Akademii Medycznej w Lublinie, 2001 10. Górska-Drabik E. Występowanie Acrobasisadvenella (Zinck.) (Lepidoptera, Pyralidae, Phycitinae) na aronii czarnoowocowej w Polsce i jego biochemiczne powiązania z roślinami żywicielskimi, Rozprawy Naukowe Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie, 382 (2013) 1. 142 Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców 11. Pospieszny H. Nabyta odporność systemiczna roślin na patogeny – od nauki do praktyki, Postępy Nauk Rolniczych, 47, 5 (2000), 27-42 12. Złotek U., Wójcik W. Wybrane aspekty nabywania u roślin odporności typu SAR, Acta ScientiarumPolonorum – Biotechnologia, 6, 2 (2007), s. 3-12 13. Malinowski H. Strategie obronne roślin drzewiastych przed szkodliwymi owadami, Leśne Prace Badawcze., 69, 2 (2008), s. 165-173 14. Kiełkiewicz M., Godzina M., Czapla A. Aktywacja mechanizmów obronnych roślin przez szkodniki, Progress in PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 50, 2 (2010), s. 885-896 15. Król P., Kępczyńska E. Rola jasmonianów w indukowanej systemicznej odporności roślin przeciwko patogenom, Biotechnologia, 1, 80 (2008), s. 122-135 16. Das A., Lee S. H., Hyun T. K., Kim S. W., Kim J. Y. Plant volatiles as method of communication, Plant Biotechnology Reports, 1 (2013), p. 9-26 17. Conrath U. Systemic acquired resistance, Plant Signaling & Behavior, 1, 4 (2006), s. 179-184 18. Sharma H. C., Sujana G., Rao D. M., Morphological and chemical components of resistance to pod borer Helicoverpaarmigera in wild relatives of pigeonpea, Arthropod-Plant Interactions, 3 (2009), s. 151-161 19. Kozłowska M., Konieczny G. Biologia odporności roślin na patogeny i szkodniki, Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego, Poznań 2003 20. Hanley M. E., Lamont B. B., Fairbanks M. M., Rafferty C. M. Plant structural traits and their role in antiherbivore defense, Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics., 8 (2007), s. 157-178 21. Tomaszewski D. Czym pokryte są rośliny? O kutykuli i warstwie wosków epikutykularnych, Kosmos problemy nauk Biologicznych, Polskie Towarzystwo Przyrodników im. Kopernik, 56, 1-2 (2007), s. 167-174 22. Reina-Pinto J. J., Jephremov A. Surface lipids and plant defences, Plant Physiology and Biochemistry, 47 (2009), s. 540-549 23. Wójcicka A. Woski powierzchniowe roślin i ich interakcje z owadami, Progress in PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 53, 3 (2013), s. 627-632 24. Boczek J., Kiełkiewicz M., Kaczmarczyk A. Lotne związki emitowane z roślin zasiedlonych przez fitofag i ich znaczenie w integrowanej ochronie, Progress in PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 53, 4 (2013), s. 661-667 25. Szakiel A. Roślinne substancje lotne – budowa, biosynteza i rola w oddziaływaniach środowiskowych, Kosmos problemy nauk Biologicznych, Polskie Towarzystwo Przyrodników im. Kopernik, 64, 3 (2015), s. 501-511 26. Sassi C., Müller C.B., Krauss J. Fungal plant endosymbionts alter life history and reproductive success of aphid predators, Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 273 (2006), s. 1301-1306 27. Sempruch C. Rola związków azotowych w interakcjach między roślinami a roślinożernymi owadami, Kosmos problemy nauk Biologicznych, Polskie Towarzystwo Przyrodników im. Kopernika, 59, 1-2 (2010), s. 199-209 28. Golan K., Najda A. Differences in the sugar composition of the honeydew of polyphagous brownsoft scale Coccus hesperidumL. (Hemiptera: Sternorrhyncha: Coccoidea) feeding on various host plants, European Journal of Entomology, 108, 4 (2011), s. 705-709 143 Klaudia Magierowicz 29. Sempruch C. Znaczenie aminokwasów w interakcjach mszyce – rośliny żywicielskie, Postępy Nauk Rolniczych, 338 (2009), s. 89-101 30. Golan K. Interactions between host plants and Coccus hesperidum L. (Hemiptera: Sternorrhyncha: Coccoidea), Rozprawy Naukowe Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie., 381 (2013) 31. Dąbrowski Z. T. Podstawy odporności roślin na szkodniki, Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa 1988 32. Rattan R. S. Mechanism of action of insecticidal secondary metabolites of plant origin, Crop Ptotection, 29, 9 (2010), s. 913-320 33. Jasiński M., Mazurkiweicz E., Rodziewicz P., Figlerowicz M. Flawonoidy – budowa, właściwości i funkcja ze szczególnym uwzględnieniem roślin motylkowatych, Biotechnologia, 2, 85 (2009), s. 81-94 34. Strzałka K. Procesy anaboliczne [W:] Fizjologia roślin (Kopcewicz J., Lewak S. red), Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa, 2012, s. 365-389 35. Wojcieszyńska D., Wilczek A. Związki fenolowe pochodzenia naturalnego, Nauka i Technika, 6 (2006), s. 6-12 36. Łabanowski G. Metodyka integrowanej ochrony roślin ozdobnych w ogrodach przydomowych, Instytut Ogrodnictwa, Skierniewice, 2014, s. 5-10 37. Zydlik P. Wykorzystanie preparatów pochodzenia naturalnego w zwalczaniu niektórych chorób roślin sadowniczych, Nauka Przyroda Technologie, 2, 1 (2008), s. 1-6 38. Dutka A. Zastosowanie olejków eterycznych w ochronie roślin przed szkodnikami w świetle najnowszej literatury, Progress in PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 53, 1 (2013), s. 36-42 39. Fiedler Ż., Sosnowska D., Kaniewski R., Władyka-Przybylak M. Wykorzystanie kompozycji z olejku konopnego do ograniczenia liczebności przędziorków (Tetranychidae), Progress in PlantProtection/Postępy w Ochronie Roślin, 53, 4 (2013), s. 679-682 40. Kishore G. K., Pande S. Evaluation of essential oils and their components for broad – spectrum antifungal activity and control of late leaf spot and crown rot diseases in peanut, Plant Disease Journal, 91, 4 (2007), s. 375-379 41. Koul O., Walia S., Dhaliwal G. S. Essential oils as green pesticides: potential and constraints,Biopesticides International, 4, 1 (2008), s. 63-84 42. Kowalska J. Zastosowanie azadyrachtyny do ograniczenia szkodliwości stonki ziemniaczanej, Journal of Research and Applications in Agricultural Engineering, 52, 3 (2007), s. 78-81 43. Nawrocka B. The influence of spinosad and azadirachtin on beneficial fauna naturally occurring on cabbage crops, Vegetable CropsResearch Bulletin, 39 (2008), s. 115-124 44. Danelski W., Badowska-Czubik T., Rozpara E. Możliwość zwalczania kwieciaka jabłkowca Aanthonomuspomorum L. w ekologicznym systemie uprawy jabłoni, of Research and Applications in Agricultural Engneering, 57, 3 (2012), s. 58-62 45. Kesdek M., Kordali S., Coban K., Usanmaz A., Ercisli K. Larvicidal effect of some plant extracts on the pine processionary moth, Thaumeto poeapityocampa (Denis & Schiffermüller) in laboratory conditions, Acta Scientiarum Polonorum Hortorum Cultus, 13, 5 (2014), s. 145-162 144 Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców Znaczenie budowy morfologicznej i składu biochemicznego roślin dla roślinożerców Streszczenie Od wielu lat interakcje między roślinożercami i ich żywicielami są przedmiotem intensywnych badań. Już przy wyborze rośliny żywicielskiej fitofagi kierują się różnymibodźcami np. wzrokowymi, dlatego budowa morfologiczna rośliny lub ich zabarwienie mogą decydować o tym czy roślina zostanie zasiedlona, a tym samym uszkodzona przez fitofaga. Jednym z najważniejszych czynników regulujących interakcje między fitofagami i ich żywicielami jest skład chemiczny roślin. Dotychczas wyizolowano około 200 tysięcy metabolitów. Podczas wyboru żywiciela istotną rolę odgrywają metabolity pierwotne – białka, cukrowce i wolne aminokwasy, które określają wartość odżywczą tkanek roślinnych. Metabolity wtórne pełnią najważniejszą rolę w mechanizmach obronnych roślin przed szkodnikami. Mogą one mieć działanie odstraszające, toksyczne lub antyfidantne. Bardzo duże znaczenie mają również zawarte w roślinach związki lotne, które mogą pełnić funkcje informujące owady np. o obecności związków toksycznych w tkankach rośliny. Substancje te mogą działać wobec jednego gatunku fitofaga jako atraktanty, a w stosunku do innego jako repelenty. Celem pracy było przedstawienie mechanizmów oddziaływania roślin na roślinożerców oraz wykazanie, że związki obecne w tkankach roślinnych, głównie metabolity wtórne mogą pełnić rolę naturalnych biopestycydów. Słowa kluczowe: interakcje roślina-owad, metabolity pierwotne, metabolity wtórne The role of morphological and biochemical components in the interaction between host plants and herbivores Abstract For many years, the interaction between host plants and herbivores has been the subject of intensive research. In host selection, herbivorous insects perceive different information provided by a host plant. Insects usevarious of sensory including visual, olfactory and gustatory. However, plants have developed all range of defense abilities resulting from an contact with pests. For this reason, plants produce specialized morphological structures to counter the herbivore attack. Morphological structures are the first line of defense against herbivores through the formation hairs, spines, thorns and prickles. Plant chemical composition is an important determinant of host plant-insect interactions. In plant tissues, there are about 200000 metabolites. The primary metabolites comprisesugars, lipids and proteins. The secondary metabolites have a negative effect, acting in a deterrent, toxic or inhibiting manner. The secondary metabolites may have a negative effect on the insect growth and development mainly on the an increase in mortality and a prolongation of their life cycle. The aim of the study was to understand the mechanisms of defense between host plants and herbivores, detailed knowledge using of secondary metabolites can be used as biopesticides in agricultural practice. Keywords: plant-insect interactions, primary metabolites, secondary metabolites 145 Olga Bemowska-Kałabun1, Małgorzata Wierzbicka2 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska 1. Wprowadzenie Substancje zanieczyszczające środowisko mogą stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia i życia ludzi. Zależnością między ilością związku chemicznego, na który narażony jest organizm, a rodzajem i stopniem szkodliwych następstw zajmuje się m.in. ekotoksykologia [1]. Ekotoksykologia zajmuje się skutkami działania substancji toksycznych na człowieka i inne organizmy. Badania ekotoksykologiczne odzwierciedlają, jak pojedyncza substancja toksyczna lub cała ich pula wpływają na rozrodczość, śmiertelność, długość życia i czas dojrzewania organizmów żywych [3-5]. Substancje toksyczne, czyli po prostu trucizny, są szkodliwe dla organizmów żywych, ponieważ wywierają niekorzystny wpływ na tkanki, organy lub na procesy biologiczne [2]. Związek między dawką a reakcją organizmu daje podstawy do oceny zagrożeń i ryzyka powodowanego przez substancje zanieczyszczające środowisko [1]. Badania toksyczności próbek środowiskowych mogą pomóc w ocenie ryzyka wystąpienia negatywnego oddziaływania danego czynnika na żywy organizm, określeniu toksyczności poprzez wyznaczenie dawki wywołującej efekt toksyczny oraz wykryciu odległych skutków pojawiających się na skutek ekspozycji organizmu na czynniki toksyczne [6]. Już Paracelsus stwierdził, że to dawka tworzy truciznę. Dlatego żaden związek chemiczny nie jest trujący jeśli jego dawka jest zbyt mała, by wpłynąć szkodliwie na organizm. Jeśli jednak dawka jest wystarczająco duża to nawet pozornie nieszkodliwe substancje mogą oddziaływać toksycznie na rośliny, zwierzęta i ludzi. Jedną z najstarszych metod oceny stanu środowiska, a jednocześnie podstawową metodą monitoringu przyrodniczego jest bioindykacja [7]. Metody biologiczne (bioindykacyjne) są bardziej obiektywne w określaniu warunków środowiska przyrodniczego niż metody fizykochemiczne. 1 [email protected], Pracownia Ekotoksykologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, http://www.biol.uw.edu.pl 2 [email protected], Pracownia Ekotoksykologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, http://www.biol.uw.edu.pl 146 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska Pozwalają ocenić realny stan zagrożenia organizmów żywych, w przeciwieństwie do metod fizykochemicznych, które informują nas jedynie o rodzaju i stężeniu substancji zanieczyszczającej oraz o przekroczeniu norm ustalonych dla danych parametrów. Normy te są zaś tylko pewną wypadkową dla różnych organizmów, z uwzględnieniem organizmu ludzkiego. Warto jednak pamiętać, że środowisko rzadko kiedy jest zanieczyszczone przez pojedynczą substancję. Zwykle zanieczyszczenia dotyczą całej puli różnych związków. Opierając się zatem jedynie na parametrach fizykochemicznych środowiska trudno jest w pełni przewidzieć reakcję organizmów żywych, populacji, czy biocenoz. Wynika to głównie z tego, że organizmy żywe w sposób kompleksowy odbierają czynniki fizyczne i chemiczne a ich reakcje mogą dotyczyć zarówno poszczególnych związków, jak i synergistycznego działania wszystkich substancji zanieczyszczających dany obszar [1, 3,7,8]. Do metod bioindykacyjnych możemy zaliczyć mi.in. biotesty, czyli próby biologiczne, których celem jest zarówno wykazanie obecności substancji toksycznych w środowisku, jak również ocena ich szkodliwości poprzez ilościowe oszacowanie wpływu różnych substancji na organizmy żywe. Uzyskane wyniki porównuje się następnie z odpowiednią próbą kontrolną. Biotesty można przeprowadzać zarówno in situ, jak i w warunkach laboratoryjnych. Do badań wykorzystuje się organizmy z różnych poziomów troficznych: bakterie, rośliny i zwierzęta. Biotesty pomagają w ustaleniu stopnia deformacji środowiska przyrodniczego oraz jego poszczególnych elementów. Wraz z pomiarami chemicznymi stanowią niezbędną podstawę do uzyskania pełnego obrazu badanego problemu [3, 5, 6, 8-15]. Biotesty doskonale wpisują się także w dział badań ekotoksykologicznych, obejmujący badania organizmów, populacji, zespołów, biocenoz i całych ekosystemów pod względem dróg narażenia na czynniki chemiczne, ich przenikania ze środowiska do organizmów oraz analizy pojawiających się efektów toksycznych [3, 5]. Biotesty są coraz częściej stosowane jako skuteczne narzędzie do oceny stanu różnych elementów środowiska. Dowodem tego są liczne badania wykorzystujące biotesty, jak chociażby prace: Hund-Rinke i in. 2002 [11], Põllumaa i in. 2004 [14], Davoren i in. 2005 [16], Płaza i in. 2005, 2010 [17, 18], Czerniawska-Kusza i in. 2006 [19], Aelion i Davis 2007 [20], Oleszczuk 2008 [21], Sekutowski i Sadowski 2009 [22], Abratowska i in. 2014 [23], czy wreszcie badania Wierzbickiej i in. 2015 [8], które zostaną szerzej omówione w niniejszym opracowaniu. 147 Olga Bemowska-Kałabun, Małgorzata Wierzbicka 2. Biotesty – podstawowe informacje, przykłady Biotestystanowią kompleksowe źródło informacji o wpływie substancji zanieczyszczających środowisko przyrodnicze. Pomagają w ustaleniu stopnia deformacji środowiska przyrodniczego oraz jego poszczególnych elementów. Biotesty mogą służyć w badaniu obszarów przekształconych i wykorzystywanych przez człowieka, takich jak tereny zurbanizowane, tereny uprzemysłowione, czy tereny wzdłuż dróg samochodowych i linii kolejowych. Poszczególne biotesty spełniają szereg norm takich, jak np. ISO (International Organization for Standardization), OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), DIN (Deutsches Institut für Normung), USEPA/EPA (United States Environmental Protection Agency), AFNOR (Association Francaise de Normalisation), czy ASTM (American Society for Testing and Materials) [5, 24], dzięki czemu stanowią doskonałe narzędzie badawcze. Warto pamiętać, że badania toksyczności próbek środowiskowych pomagają m.in. w: ocenie ryzyka wystąpienia negatywnego oddziaływania danego czynnika na żywy organizm, określeniu toksyczności poprzez wyznaczenie dawki wywołującej efekt toksyczny oraz wykryciu odległych skutków pojawiających się na skutek ekspozycji organizmu na czynniki toksyczne [3, 5, 6]. Dzięki testom toksyczności [1, 3] można wyznaczyć m.in.: LD50 (ang. lethal dose) – dawka substancji, przy której umiera 50% osobników; LC50(ang. lethal concentration) – stężenie substancji, przy którym umiera 50% osobników; NOED (ang. no observable effect dose) – dawka substancji, przy której nie obserwuje się statystycznie istotnych szkodliwych zmian; NOEC (ang. no observed effect concentration) – stężenie substancji chemicznej, przy którym nie można zaobserwować istotnych skutków; ED50(ang. effective dose) – dawka, która powoduje mierzalny efekt, inny niż śmierć u 50% osobników z populacji; EC50(ang. effective concentration) – stężenie, które powoduje mierzalny efekt, inny niż śmierć u 50% osobników z populacji. Wyznaczenie poziomu tych charakterystycznych dawek i stężeń ma duże znaczenie dla określenia stopnia zagrożenia jakie dana substancja zanieczyszczająca środowisko możewywierać na organizmy żywe. Można wyróżnić trzy główne sposoby przeprowadzenia biotestów [6]: Testy toksyczności, przeprowadzane w laboratorium, podczas których badana substancja toksyczna jest w sposób sztuczny wprowadzana 148 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska do czystej wody lub osadu. Tego typu testy często służą do przeprowadzenia wzorcowania biotestu w kontrolowanych warunkach. Testy toksyczności, przeprowadzane w laboratorium, na bazie pobranych próbek rzeczywistych (woda, gleba i osady), których toksyczność jest porównywana z toksycznością próbek wzorcowych. Testy przeprowadzone in situ, z wykorzystaniem populacji organizmów żyjących w warunkach naturalnych. Ze względu na czas kontaktu organizmów testowych z badaną substancją, zanieczyszczoną próbką środowiskową itp. biotesty można podzielić na testy badające toksyczność ostrą i testy badające toksyczność chroniczną. Szybkie testy toksyczności opracowano do oceny szkodliwego wpływu substancji chemicznej w różnych stężeniach na wybrane organizmy w czasie do 96 godzin ekspozycji, natomiast długotrwałe testy toksyczności służą do oceny niekorzystnych oddziaływań czynników, czy związków chemicznych na osobniki i populacje w warunkach przedłużonej ekspozycji na subletalne stężenia lub dawki [5]. Biotesty często klasyfikuje się ze względu na rodzaj organizmu, który jest aktywnym elementem testu. W biotestach najczęściej wykorzystuje się rośliny, bakterie i zwierzęta [6], dzięki czemu reprezentowane są wszystkie poziomy troficzne.Przykłady stosowanych organizmów w biotestach przedstawiono na Rysunku 1. A F B C G H D E I Rysunek 1. Przykładowe organizmy testowe stosowane w biotestach:(a) Microtox – bakterie Vibrio fischeri; (b)Algaltoxkit F – glony Pseudokirchnerielle subcapitata; (c) Phytotoxkit F – rośliny np.Lepidium sativum; (d)Protoxkit F – pierwotniaki Tetrahymena thermophila; (e) Rotoxkit F – wrotki Brachionus calyciflorus; (f) Ostracodtoxkit F – skorupiaki Heterocypris incongruens; (g) Daphtoxkit F magna– skorupiaki Daphnia magna; (h)Artoxkit M– skorupiaki Artemia franciscana; (i) Thamnotoxkit F– skorupiaki Thamnocephalus platyurus. Opracowanie własne na podstawie [24] W kolejnych podrozdziałach przedstawiono przykładowe biotesty dostępne na rynku, wraz z ich krótką charakterystyką. 149 Olga Bemowska-Kałabun, Małgorzata Wierzbicka 2.1. Testy bakteryjne W testach bakteryjnych bardzo często wykorzystywane jest zjawisko bioluminescencji morskich bakterii Vibrio fischeri. Biotesty tego typu znalazły zastosowanie w ocenie stopnia zanieczyszczenia wód, osadów dennych i gleb. Toksyczność badanych prób ocenia się za pomocą pomiaru bioluminescencji bakterii, która zmniejsza się na skutek działania substancji toksycznych [6]. Biotestami opartymi na bioluminescencji bakterii Vibrio fischeri są np. [5, 6, 24]: Microtox System Testów Ostrych; Microtox Test Toksyczności chronicznej; Microtox SOLO – pojedynczy test uzupełniający system toksyczności Microtox; Microtox Test FazyStałej (Microtox Solid Phase Test – SPT oraz Basic Solid Phase Test – BSPT); TOXI – SCREENING (test terenowy) – zawiera organizmy zgodne z normą ISO 11348 – 3; LUMIStox, ToxAlert 10 i ToxAlert 100. Istnieją także inne sposoby szacowania toksycznych właściwości substancji chemicznych, które opierają się głównie na mechanizmie działania tych substancji. Na przykład testy oceniające mutagenność bakterii [1]. Do testów wykrywających substancje genotoksyczne należą m.in. [24]: Mikropłytkowy test Ames MPF Fluctuation Assay – organizmy stosowane w teście (i jego wariantach) to szczepy bakterii Salmonella typhimurium oraz Escherichia coli. Test ten jest zgodny z wytycznymi OECD 471 dla testów chemicznych; MUTATOX – test oceny mutagenności; UmuC – pozwala na wykrywania potencjalnie genotoksycznych związków poprzez indukowanie odpowiedzi SOS bakterii Salmonella typhimurium TA1535 [pSK1002]. Test ten służy do badania wody (np. wody przeznaczonej do spożycia, wód powierzchniowych i ścieków), fazy stałej (osadów, gleby), czy wreszcie powietrza (emisji gazów). Inne stosowane testy bakteryjne to na przykład test MARA (Mikrobiologiczny test oceny ryzyka).Jest to wielogatunkowy test toksyczności wykorzystujący 11 mikroorganizmów (10 szczepów bakterii oraz 1 szczep drożdży) umieszczonych na jednej płytce testowej [5, 24]. 150 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska 2.2. Testy roślinne W testach roślinnych (fitotestach) wykorzystuje się glony (zielenice, sinice, okrzemki), rzęsę wodną, inne rośliny wodne oraz rośliny lądowe [3, 5, 6]. W testach wykorzystujących glony często stosuje się glony jednokomórkowe. Najczęściej są to Selenastrum capricornutum oraz Scenedes musquadricauda i Scenedes mussubspicatus, które należą do zielenic [6]. Fitotesty wykorzystujące glony to m.in. [5, 24]: AlgaltoxkitFTM – biotest toksyczności chronicznej, wykorzystujący glony Selenastrum capricornutum. Test ten jest zgodny z normami OECD i ISO; MARINE AlgaltoxkitTM – biotest toksyczności chronicznej, wykorzystujący morskie okrzemki Phaeodactylum tricornutum. Test ten jest zgodny z normą ISO. Makrofity są rzadziej stosowane w biotestach, jeśli jednak stosuje się tę grupę roślin to najczęściej jest to rzęsa wodna (Lemna minor i L. gibba) [6]. Do oceny toksyczności gleb stosuje się różne rośliny lądowe. Szkodliwe działanie danej substancji na rośliny zależy od rodzaju tej substancji oraz jej stężenia. Podczas oceny zawartości szkodliwych substancji w glebie należy brać pod uwagę gatunek rośliny ponieważ z licznych obserwacji wynika, że tolerancja roślin na szkodliwe substancje jest różna. Na przykład rośliny rosnące na hałdzie galmanowej w Bolesławiu koło Olkusza tolerują wyższe stężenia metali ciężkich. Są to m.in. lepnica rozdęta (Silene vulgaris), goździk kartuzek (Dianthus carthusianorum) oraz pleszczotka górska (Biscutella laevigata) [3, 25]. Przykładem dobrego bioindykatora jest na przykład rzeżucha (Lepidium sativum) ze względu na szybki wzrost i dużą wrażliwość [8].Test prowadzony na roślinach lądowych to np. [5, 24]: Phytotoxkit – biotest fitotoksyczności oparty na kiełkowaniu nasion i wczesnym wzroście roślin. Zalecanymi roślinami są w nim rzeżucha (Lepidium sativum), gorczyca (Sinapsis alba) i sorgo (Sorghum saccharatum). Test jest analogiczny do normy ISO 11269 – 1. 2.3. Testy zwierzęce Testy toksyczności ostrej z wykorzystaniem organizmów zwierzęcych stosuje się dużo częściej niż testy wykorzystujące rośliny. Jest to spowodowane przekonaniem, że rośliny są mniej wrażliwe w stosunku do substancji chemicznych niż zwierzęta. Jednak jak dotąd stanowisko to nie zostało poparte żadnymi badaniami [6].Ustalono natomiast, że względna wrażliwość roślin i zwierząt zależy istotnie od: materii organicznej, pH, temperatury, zasadowości, twardości, obecności ligandów oraz wzajemnych oddziaływań substancji toksycznych [3, 6]. Co więcej, istnieje wiele 151 Olga Bemowska-Kałabun, Małgorzata Wierzbicka prac porównawczych opisujących działanie różnych związków chemicznych z wykorzystaniem testów roślinnych, zwierzęcych i ludzkich, a uzyskane wyniki są ze sobą kompatybilne [8, 23, 26, 27]. Dość popularne są mikrobiotesty, które wykorzystują na przykład skorupiaki, wrotki, czy pierwotniaki. Do takich testów należą m.in. [5, 24]: Artoxkit MTM – biotest toksyczności ostrej wód słonych. Wykorzystuje skorupiaki morskie Artemia salina; Ceriodaphtoxkit FTM – biotest toksyczności ostrej. Wykorzystuje skorupiaki Ceriodaphnia dubia. Test zgodny z normą USEPA; Daphtoxkit FTMmagna i Daphtoxkit FTMpulex – mikrobiotesty toksyczności ostrej. Wykorzystują skorupiaki Daphnia magna i Daphnia pulex. Testy zgodne z normami ISO i OECD; Ostracodtoxkit FTM – mikrobiotest toksyczności chronicznej osadów. Wykorzystuje skorupiaki Heterocypris incongruens; Protoxkit FTM – biotest toksyczności chronicznej. Wykorzystuje pierwotniaki z grupy orzęsków Tetrahymena thermophila. Test zgodny z normą ASTM; RapidtoxkitTM – biotest toksyczności ostrej. Wykorzystuje skorupiaki Thamnocephalus platyurus. Test szybkiej oceny jakości wody pitnej i ścieków; Rotoxkit FTM – biotest toksyczności ostrej. Wykorzystuje wrotki Brachinious calyciflorus. Test zgodny z normą ASTM; Rotoxkit MTM – biotest toksyczności ostrej wód słonych. Wykorzystuje wrotki Brachinious plicatilis. Test zgodny z normą ASTM; Rotoxkit FTMshort-chronic – biotest chronicznej toksyczności krótkoterminowej. Wykorzystuje wrotki Brachinious calyciflorus. Test zgodny z normą AFNOR; Thamnotoxkit FTM – biotest toksyczności ostrej. Wykorzystuje skorupiaki Thamnocephalus platyurus. Test odpowiadający innym testom w wielu krajach. Warto zauważyć, że biotesty takie jak: Ostracodtoxkit i Daphtoxkit mogą służyć zarówno do oceny stanu wód, jak również oceny zanieczyszczenia osadów oraz gleb po przeprowadzeniu próbek w ekstrakty glebowe [8, 11, 14, 17, 18,21]. W biotestach wykorzystuje się także m.in. dżdżownice, pszczoły, skoczogonki, czy stonogi. Często w testach toksyczności używa się szkodliwych dla rolnictwa gatunków owadów (najczęściej z rzędów Lepidoptera, Diptera, Hemiptera i Coleoptera), by oszacować skuteczność działania insektycydów. W biotestach można stosować również kręgowce, przy czym toksyczność substancji chemicznych dla ptaków, ssaków i innych kręgowców mierzona jest zwykle jako LD50 [1]. 152 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska 3. Zastosowanie biotestów w praktyce Praktycznym przykładem wykorzystania biotestów w badaniach środowiskowych jest praca Wierzbickiej i in. 2015 [8], przedstawiająca wielowymiarową ocenę toksyczności i zanieczyszczenia gleb z torów kolejowychza pomocą szeregu biotestów oraz analiz chemicznych (Tabela 1). W niniejszym rozdziale pokrótce zostaną omówione najważniejsze założenia i wyniki tej pracy. W pracy Wierzbicka i in. 2015 [8] przeprowadzono badania gleb z torów kolejowych położonych w północno-wschodniej Polsce. Próbki glebowe pochodziły z torów kolejowych ze stacji Białystok Fabryczny, Waliły, Hajnówka, Siemianówka – region podlaski oraz z dużej stacji Iława Główna – zachodnia część regionu mazurskiego (próbki pobrane z obszaru myjni i bocznicy). Praca ta jest kontynuacją wcześniejszych badań dotyczących zanieczyszczeń obszarów kolejowych w rejonie północno-wschodniej Polski [28-32]. Różnorodne wykorzystanie obszarów kolejowych wiąże się z dużym zróżnicowaniem substancji zanieczyszczających glebę i rośliny w otoczeniu szlaków kolejowych. Do ich grupy można zaliczyć m.in.: WWA, PCB, herbicydy, substancje ropopochodne (np. oleje mineralne) oraz metale ciężkie [8, 30, 31]. Do badania próbek glebowychzostały wykorzystane następujące biotesty: Krótkotrwały test chroniczny Phytotoxkit, mierzący inhibicję przyrostu korzeni [33]. Jako organizmy testowe zostały wykorzystane Lepidium sativum L., Sinapis alba L. i Sorghumsac charatum (L. emend. L.) Moench. Skuteczność tych gatunków jako bioindykatorów potwierdza literatura [5, 19]. Ostracodtoxkit F TM, test zwierzęcy chroniczny, wykorzystujący jako organizm testowy Heterocypris incongruens (Ramdohr, 1808). Punktami końcowymi testu są śmiertelność oraz hamowanie wzrostu [34]. Daphtoxkit F TM to test zwierzęcy mierzący toksyczność ostrą i wykorzystujący jako organizm testowy Daphnia magna (Straus, 1820). Punktem końcowym pomiaru toksyczności jest śmiertelność organizmów [35]. Microtox Basic Solid Test (test skriningowy) oraz Microtox Solid Phase Test (test rozcieńczeń), które wykorzystują ekstrakty glebowe. Oba testy Microtox to bardzo czułe testy toksyczności ostrej, wykorzystujące jako organizm testowy morskie bakterie Vibrio fischeri. Punktem końcowym testu Microtox jest hamowanie bioluminescencji bakterii [36, 37]. W przypadku biotestu Phytotoxkit wszystkie zastosowane gatunki roślin charakteryzował najniższy przyrost korzeni na podłożach z Białegostoku Fabrycznego oraz Siemianówki (Tabela 1). Co więcej, gatunki roślin 153 Olga Bemowska-Kałabun, Małgorzata Wierzbicka hodowane na tych podłożach, wykazały identyczne zjawisko geotropizmu ujemnego korzeni, najbardziej nasilone w przypadku korzeni L. sativum a najmniej w przypadku S. saccharatum. Korzenie te wyginały się na boki i do góry [8]. W teście Ostracodtoxkit, po 6 dniach inkubacji skorupiaków H. incongruens z badanymi podłożami, największą śmiertelność organizmów testowych stwierdzono dla gleb z torów kolejowych ze stacji Białystok Fabryczny i Siemianówka. Zaś najwyższe średnie procentowe hamowanie wzrostu wystąpiło u organizmów testowych inkubowanych w glebie z torów kolejowych ze stacji Siemianówka. Również w przypadku testów Daphtoxkit najwyższą śmiertelność obserwowano wśród organizmów D. magna inkubowanych w ekstraktach glebowych z próbek z Białegostoku Fabrycznego (100% śmiertelność) i Siemianówki (w wariancie tym odnotowano ponadto zmniejszoną aktywność ruchową organizmów testowych) (Tabela 1) [8]. Ostatni a zarazem najczulszy z przeprowadzonych biotestów – Microtox, wykazał, żenajwyższe hamowanie intensywności świecenia bakterii V. fischeri (powyżej wartości EC50) wystąpiło dla próbek ze stacji Białystok Fabryczny (~100%) i Siemianówka (63%) (Tabela 1) [8]. Badania Wierzbickiej i in. 2015 [8] wyraźnie pokazały iż najbardziej toksyczne gleby pochodziły z torów kolejowych ze stacji Białystok Fabryczny i Siemianówka. Wykazywały one znaczący negatywny wpływ na organizmy testowe z różnych poziomów troficznych. Ponadto, wyniki wszystkich przeprowadzonych biotestów były ze sobą kompatybilne (Tabela 1). Tabela 1. Zestawienie wyników biotestów dla badanych gleb z torów kolejowych ze stacji w północno-wschodniej Polsce. Symbolami oznaczono: gleby oddziałujące bardzo toksycznie (+), gleby o średnim działaniu toksycznym (±), gleby nie wykazujące działania toksycznego (–) wobec organizmów testowych, użytych w poszczególnych biotestach: 1 – L. sativum, 2 –S. alba; 3 –S. saccharatum; 4 –H. incongruens; 5 –D. magna; 6 – V.fischeri Stacja Phytotoxkit 1 2 3 Białystok Fabryczny Siemianówka Hajnówka Iława Główna, bocznica Iława Główna, myjnia Waliły + + + ± ± ± + + – – – – Ostracodtoxkit 4 Daphtoxkit 5 Microtox 6 + + – – ± – + + – ± – – + + – – ± – + + – ± – ± Źródło: Opracowanie własne na podstawie [8] Na podstawie przeprowadzonych biotestów wytypowano trzy gleby do dalszych analiz chemicznych (dwie najbardziej toksyczne ze stacji 154 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska Białystok Fabryczny i Siemianówka oraz dodatkowo glebę ze stacji Waliły jako materiał odniesienia). Próbki glebowe przebadano pod kątem obecności: Wielopierściniowych Węglowodorów Aromatycznych, tzw. WWA; wykorzystano chromatografię gazową z detekcją płomieniowo – jonizacyjną (Gas chromatography – Flame Ionization detektor, GC-FID); Polichlorowanych bifenyli, tzw. PCB; wykorzystano chromatografię gazową z detektorem wychwytu elektronów (Gas chromatography – Electron capture detektor, GC-ECD); Węglowodorów ropopochodnych (sumy benzyn C 6-C12 i olejów mineralnych C12-C35); wykorzystano chromatografię gazową z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (GC-FID); Metali ciężkich: Cu, Pb, Cd, Zn, Cr, Ni i Hg; wykorzystano płomieniową absorpcyjną spektrometrię atomową(Flame atomic absorbtion spectroscopy, FAAS); Pozostałości środków ochrony roślin; wykorzystano chromatografię gazową ze spektrometrem mas (Gas chromatography – Mass spectrometer, GC-MS). We wszystkich badanych przypadkach wykryte zanieczyszczenia nie przekroczyły dopuszczalnych poziomów zanieczyszczeńprzewidzianych dla terenów komunikacyjnych [8, 38]. Najwyższe zawartości substancji ropopochodnych, WWA i PCB stwierdzono w próbce glebowej z torów ze stacji Białystok Fabryczny, średnie natomiast w glebie ze stacji Siemianówka – jednak żadna z tych wartości nie przekroczyła norm [8]. Analizy chemiczne pokazały jakie zanieczyszczenia i jakie ich zawartości występowały w badanych próbkach. Biotesty natomiast pokazały, jak na pulę zanieczyszczeń reagują organizmy testowe z różnych poziomów troficznych. Dzięki zastosowaniu biotestów wykazano większe zagrożenie transportem kolejowym, niż by na to wskazywały analizy chemiczne. Chociaż wykryte w glebach z torów kolejowych zanieczyszczenia nie przekroczyły dopuszczalnych norm to jednak powodowały one toksyczne działanie na szereg organizmów testowych z różnych poziomów troficznych. Wykazano synergistyczne działanie niskich dawek (w zakresie norm) kilku zanieczyszczeń razem, co w efekcie spowodowało działanie toksyczne na organizmy. Fakt ten, wyraźnie wskazuje na potrzebę prowadzania badań ekotoksykologicznych, a nie tylko chemicznych, podczas oceny stanu środowiska. Na podstawie danych uzyskanych z badań biologicznych i chemicznych stwierdzono iż transport kolejowy stanowi większe zagrożenie dla środowiska przyrodniczego niż się tego spodziewano [8]. 155 Olga Bemowska-Kałabun, Małgorzata Wierzbicka 4. Podsumowanie Przedstawione w niniejszym opracowaniu dane pokazują, że biotesty znajdują praktyczne zastosowanie w ocenie zanieczyszczenia różnych elementów środowiska, np. gleb. Warto zapamiętać, że prowadzenie jedynie badań chemicznych jest niewystarczające i nie oddaje w pełni możliwych zagrożeń dla środowiska przyrodniczego. Dopiero przeprowadzenie zarówno badań ekotoksykologicznych, pozwalających na ocenę reakcji organizmów na zanieczyszczenia, jak i chemicznych – informujących o rodzaju i poziomie zanieczyszczeń pozwala uzyskać pełen obraz możliwych zagrożeń. Biotesty stanowią doskonałe narzędzie badawcze, które jest łatwe w zastosowaniu i daje powtarzalne wyniki. 5. Podziękowania Projekt sfinansowano z funduszy Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego na badania naukowe służące rozwojowi młodych naukowców oraz uczestników studiów doktoranckich finansowane w wewnętrznym trybie konkursowym dla Wydziału Biologii UW, DSM nr501/86-110106. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Walker C. H., Hopkin S. P., Sibly R. M., Peakall D. B. Podstawy ekotoksykologii, PWN, Warszawa 2002 Manahan S.E. Toksykologia środowiska. Aspekty chemiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa 2006 Wierzbicka M. Ekotoksykologia. Rośliny, gleby, metale, Wydawnictwo Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa 2015 Newman M. C., Unger M. A. Fundamentals of ecotoxicology, 2nd Ed. Lewis Publisher A, CRC Press Company, 2003 Traczewska T. M. Biologiczne metody oceny skażenia środowiska, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2011 Kuczyńska A., Wolska L., Namieśnik J. Zastosowanie biotestów w badaniach środowiskowych, [w:] Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu środowiskowym, Red.: Namieśnik J., Chrzanowski W., Szpinek P. Wydawnictwo Centrum Doskonałości Analityki i Monitoringu Środowiskowego, Gdańsk 2003, s. 667-698 Zimny H. Ekologiczna ocena stanu środowiska. Bioindykacja i biomonitoring, Agencja Reklamowo-Wydawnicza Arkadiusz Grzegorczyk, Warszawa (2006) Wierzbicka M., Bemowska-Kałabun O., Gworek B. Multidimensional evaluation of soil pollution from railway tracks, Ecotoxicology, 24 (2015), s. 805-822 Keddy C., Greene J., Bonnell M. Review of Whole-Organism Bioassays: Soil, Freshwater Sediment, and Freshwater Assessment in Canada, Ecotoxicology and Environmental Safety, 30 (1995), s. 221-251 156 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska 10. Rojíčková-Padrtová R., Marńálek B., Holoubek I. Evaluation of alternative and standard toxicity assays for screening of environmental samples: selection of optimal test battery, Chemosphere, 37(3)(1998), s. 495-507 11. Hund-Rinke K., Kördel W., Hennecke D., Eisenträger A., Heiden S. Bioassays for the ecotoxicological and genotoxicological assessment of contaminated soils (results of a round robin test), Journal of Soils and Sediments, 2(1) (2002), s. 43-50 12. Kuczyńska A., Wolska L., Namieśnik J. Application of biotests in environmental research, Critical Reviews in Analytical Chemistry, 35(2005), s. 135-154 13. Persoone G., Marsalek B., Blinova I., Törökne A., Zarina D., Manusadzianas L., Nalecz-Jawecki G., Tofan L., Stepanova N., Tothova L., Kolar B. A practical and user-friendly toxicity classification system with microbiotests for natural waters and wastewaters, Environmental Toxicology, 18(6)(2003), s. 395-402 14. Põllumaa L., Kahru A., Manusadzianas L. Biotest- and chemistry- based hazard assessment of soils, sediments and solid wastes, Journal of Soils and Sediments, 4(4) (2004), s. 267-275 15. Wolska L., Sagajdakow A., Kuczyńska A., Namieśnik J. Application of ecotoxicological studies in integrated environmental monitoring: Possibilities and problems, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 26 (4)(2007), s. 332-344 16. Davoren M., Shúilleabháin S.N., O'Halloran J., Hartl M. G. J., Sheehan D., O'Brien N. M., van Pelt F. N., Mothersill C. A Test Battery Approach for the Ecotoxicological Evaluation of Estuarine Sediments, Ecotoxicology, 14(2005), s. 741-55 17. Płaza G., Nałęcz-Jawecki G., Ulfig K., Brigmon R. L. The application of bioassays as indicators of petroleum-contaminated soil remediation, Chemosphere, 59 (2005), s. 289-296 18. Płaza G., Nałęcz-Jawecki G., Pinyakong O., Illmer P., Margesin R. Ecotoxicological and microbiological characterization of soils from heavymetal- and hydrocarboncontaminated sites, Environmental Monitoring and Assessment, 163 (2010), s. 477-488 19. Czerniawska-Kusza I., Ciesielczuk T., Kusza G., Cichoń A. Comparison of the Phytotoxkit Microbiotest and Chemical Variables for Toxicity Evaluation of Sediments, Environmental Toxicology, 21 (2006), s. 367-372 20. Aelion A. M., Davis H. T. Use of a general toxicity test to predict heavy metal concentrations in residential soils, Chemosphere, 67 (2007), s. 1043-1049 21. Oleszczuk P. The toxicity of composts from sewage sludges evaluated by the direct contact tests phytotoxkit and ostracodtoxkit, Waste Management, 28 (2008), s. 1645-1653 22. Sekutowski T., Sadowski J. Phytotoxkit TMmicrobiotest used in detecting herbicide residue in soil, Environment Protection Engineering, 35 (1) (2009), s. 105-110 23. Abratowska A., Szczypior S., Wierzbicka M. Plant tests as a tool to assess toxicity of soils from the OlkuszRegion, Acta biologica Cracoviensia, Series Botanica, Supplement 56 (2) (2014), s. 49 157 Olga Bemowska-Kałabun, Małgorzata Wierzbicka 24. http://www.tigret.eu 25. Wierzbicka M. Przystosowania roślin do wzrostu na hałdach cynkowoołowiowych okolic Olkusza, Kosmos, 51 (2002), s. 139-150 26. Nilan R. A. Potential of plant genetic systems for monitoring and screening mutagens, Environ. Environmental health perspectives, 27 (1978), s. 181-196 27. Grant W. F. The present status of higher plant bioassays for the detection of environmental mutagens, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 310 (2) (1994), s. 175-185 28. Galera H., Sudnik-Wójcikowska B., Wierzbicka M., Wiłkomirski B. Encroachment of forest species into operating and abandoned railway areas in north-eastern Poland, Plant Biosystems, 145 (2011), s. 23-36 29. Galera H., Sudnik-Wójcikowska B., Wierzbicka M., Wiłkomirski B. Directions of changes in the flora structure in the abandoned railway areas, Ecological Questions,16 (2012), s. 29-39. doi:10.2478/v10090-012-0003-5 30. Wiłkomirski B., Sudnik-Wójcikowska B., Galera H., Wierzbicka M., Malawska M. Railway transportation as a serious source of organic and inorganic pollution, Water, Air, and Soil Pollution, 218 (2011), s. 333-345 31. Wiłkomirski B., Galera H., Sudnik-Wojcikowska B., Staszewski T., Malawska M. Railway Tracks – Habitat Conditions, Contamination, Floristic Settlement – A Review, Environment and Natural Resources Research, 2 (2012), s. 86-95 32. Wierzbicka M., Galera H., Sudnik-Wójcikowska B., Wiłkomirski B. Geranium robertianum L., plant form adapted to the specific conditions along railways: “railway-wandering plant”, Plant Systematics and Evolution, 300 (2014), s. 973-985 33. Phytotoxkit. Seed germination and early growth mikrobiotest with higher plants. Standard operational procedure. http://www.microbiotests.be/SOPs/Phytotoxkit%20SOP%20-%20A5.pdf 34. Ostracodtoxkit F. ”Direct contact” Toxicity Test for Freshwater Sediments. Standard operational procedure. http://www.microbiotests.be/SOPs/Ostracodtoxkit%20F%20SOP%20%20A5.pdf 35. Daphtoxkit F TMMagna. Crustacean Toxicity Screening Test for Freshwater. Standard operational procedure. http://www.microbiotests.be/SOPs/Daphtoxkit%20magna%20F%20SOP%20%20A5.pdf 36. Microtox® M500. Industry-leading toxicity detection. http://www.modernwater.co.uk/assets/downloads/Brochures/MW_Factsheet_ MicroM500_LOWRES.pdf 37. Ghirardini A. V., Girardini M., Marchetto D., Pantani C.Microtox® solid phase test: Effect of diluent used in toxicity test, Ecotoxicology and EnvironmentalSafety, 72 (2009), s. 851-861 38. Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 9 września 2002 r. w sprawie standardów jakości gleby oraz standardów jakości ziemi (Dz. U. z 2002 Nr 165, poz. 1359) 158 Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska Biotesty – dobre narzędzie do oceny zanieczyszczenia środowiska Streszczenie Biotesty to jedna z metod bioindykacyjnych. Celem biotestów jest wykazanie obecności substancji toksycznych w środowisku i ilościowe oszacowanie ich wpływu na organizmy żywe. W ten sposób biotesty znajdują praktyczne zastosowanie, a w połączeniu z badaniami chemicznymi pozwalają uzyskać pełną ocenę stanu środowiska. Biotesty spełniają szereg norm (np. ISO, OECD), dzięki czemu stanowią doskonałe narzędzie badawcze. Przykładem wykorzystania biotestów są badania dotyczące oceny stopnia toksyczności gleb z nasypów kolejowych. Wykorzystując biotesty oparte na organizmach z różnych poziomów troficznych (rośliny, zwierzęta, bakterie) wykazano synergistyczne działanie kilku zanieczyszczeń razem, co w efekcie powodowało działanie toksyczne na organizmy. Łączny wpływ zanieczyszczeń na organizmy testowe wywołał silniejszy efekt toksyczny, niż oddziaływania pojedynczych związków na organizmy. Na tej podstawie stwierdzono iż transport kolejowy może stanowić zagrożenie dla środowiska przyrodniczego w większym stopniu niż się tego spodziewano. Przykład ten dobrze pokazuje, że przeprowadzenie jedynie badań chemicznych jest niewystarczające i nie oddaje w pełni możliwych zagrożeń dla środowiska. Nasza Pracownia oferuje możliwość współpracy, w ramach której wykonujemy badania ekotoksykologiczne wykorzystujące różne biotesty. Słowa kluczowe:biotesty,ekotoksykologia, tory kolejowe,gleba,zanieczyszczenia Biotests – a good tool for the evaluation of environmental pollution Abstract Biotestsare one of thebioindication-based methods. The aim of the biotests is to demonstrate the presence of toxic substances in the environment and quantitative estimation of their impact on living organisms. Thereby, thebiotests are practically applied, and combined with chemical analysis allow a full assessment of the condtion of the environment. Thebioassays meet a number of standards (eg. ISO, OECD), making it a perfect research tool.An example of using thebiotests are studies to determine the degree of toxicity of soil from the railway tracks. Studies with use ofthebiotests based on the organisms of various trophic levels (plants, animals, bacteria) showed a synergistic effect of some pollutants together, which resulted in toxic effect on organisms. The combined impact of pollutants on the test organisms caused a toxic effect stronger than the effects of individual compounds on organisms. On this basis, it was found that the railway transport could pose a threat to the natural environment to a greater extent than expected.This example shows well that simply performing chemical analyzes is inadequate and does not reflect the possible risks to the environment. Our laboratory offers the possibility of cooperation in which we perform ecotoxicological studies using various biotests. Keywords:biotests, ecotoxicology, railway tracks,soil,pollutants 159 Alicja Kapuścińska1, Izabela Nowak2 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym 1. Wstęp Ostatnimi czasy obserwuje się coraz większe zainteresowanie wykorzystaniem naturalnych substancji kosmetycznych oraz leczniczych w produktach komercyjnych. Substancje naturalne o ukierunkowanej aktywności biologicznej umożliwiają obniżenie stężenia lub całkowitą substytucję stosowanych dotychczas substancji chemicznych. Związki te mogą także wykazywać synergizm z określoną substancją chemiczną, dlatego mogą być wykorzystane w celu intensyfikacji jej działania. Nowością na rynku kosmetycznym oraz farmaceutycznym są fitohormony – związki pochodzenia roślinnego, wykazujące interesującą aktywność biologiczną na organizm ludzki. Dokonano przeglądu literatury dotyczącej aktywności farmaceutycznej oraz kosmetycznej wybranych fitohormonów. 2. Definicja i klasyfikacja fitohormonów Fitohormony (hormony roślinne) definiuje się jako związki organiczne, które regulują wzrost i rozwój roślin. Substancje te nie muszą wykazywać działania poza miejscem ich wytwarzania, a miejsce wytwarzania może być jednocześnie miejscem reakcji. Hormony roślinne wykazują aktywność biologiczną w niewielkich stężeniach rzędu 10 -6 mol/dm3 bądź mniejszych [1]. Każdy fitohormon jest roślinnym regulatorem wzrostu, natomiast nie każdy regulator jest fitohormonem. Regulatory, które nie spełniają kryteriów fitohormonów nazywane są substancjami wzrostowymi roślin. W przeciwieństwie do fitohormonów, substancje wzrostowe mają zwykle działanie ogólnoustrojowe i wywołują w tkankach roślinnych efekt fizjologiczny w stężeniach przekraczających 10-4 mol/dm3 [2]. Do grupy fitohormonów zaliczane są auksyny, cytokininy, gibereliny, brasinosteroidy, etylen, kwas abscysynowy, a także strigolaktony, poliaminy, kwas salicylowy oraz jasmonidy. Hormony roślinne regulują ekspresję genów, oraz podziały komórkowe. Biorą również udział w odpowiedzi 1 [email protected], Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, Wydział Chemii, Pracownia Chemii Stosowanej, www.chemia.amu.edu.pl 2 [email protected], Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, Wydział Chemii, Pracownia Chemii Stosowanej, www.chemia.amu.edu.pl 160 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym roślinnej na stres (Tabela 1). Związki te kontrolują również wzrost liści i łodyg, proces rozwoju i dojrzewania owoców [3]. Nie należy mylić pojęć,,fitohormony” oraz,,fitoestrogeny”, bowiem fitoestrogeny są to związki niesteroidowe pochodzenia roślinnego, które pełnią w roślinach zupełnie inne funkcje, aniżeli fitohormony. Mają one bowiem działanie grzybobójcze, antyutleniające, budulcowe, sygnalizujące stres, ponadto chronią roślinę przed szkodliwym działaniem promieniowania ultrafioletowego [4]. Tabela 1. Wybrane rodzaje stresu roślinnego, w których fitohormony pełnią kluczową rolę w ekspresji genowej. Proces Cząsteczka sygnałowa Literatura (przykłady) Atak patogenów jasmonidy, kwas salicylowy Infekcje grzybicze jasmonidy, etylen Epple P et al., 1995 [5] Ellard-Ivey M and Douglas CJ, 1996 [6] Stres osmotyczny Stres solny Stres wywołany obecnością jonów kadmu Stres wywołany obecnością jonów miedzi Stres wywołany wysoką temperaturą Stres wywołany niską temperaturą jasmonidy, kwas abscysynowy jasmonidy, kwas abscysynowy, etylen Lehmann J et al., 1995 [7] Xu YI et al., 1994 [8] jasmonian metylu Maksymiek W and Krupa Z, 2002 [16] Chen J et al., 2014 [9] jasmonian metylu Poonam S et al., 2013 [10] jasmonian metylu Gonzalez-Aguilar GA et al. 2000 [11] jasmonian metylu Gonzalez-Aguilar GA et al., 2000 [11] Stres wywołany dotykiem jasmonidy Abel S et al., 1996 [12] Stres wywołany zranieniem Jasmonidy, kwas abscysynowy, etylen, systemina Pena-Cortes H et al., 1995 [13] 3. Wykorzystanie wybranych fitohormonów w dermatologii oraz przemyśle kosmetycznym W celu nadania produktowi kosmetycznemu pożądanego działania, do podłoża preparatu dodaje się substancje o ukierunkowanej aktywności kosmetycznej. Substancje te nazywane są składnikami aktywnymi kosmetyków i wykazują określone działanie fizyczne, chemiczne lub biochemiczne na fizjologię oraz/lub funkcje skóry [14]. 161 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak Nowym zagadnieniem na rynku kosmetycznym są fitohormony, nazywane także kosmetycznymi substancjami aktywnymi przyszłości. Ze względu na naturalne pochodzenie oraz różnorodność aktywności biologicznej, hormony roślinne mogą zastąpić syntetyczne komponenty produktów pielęgnacyjnych. Do fitohormonów wykazujących najbardziej interesujące działanie pielęgnacyjne zalicza się jasmonidy oraz cytokininy. 3.1. Kwas jasmonowy i jego pochodne Przykładem fitohormonów stosowanych w kosmetyce jest kwas jasmonowy (ang. jasmonic acid, JA) i jego pochodne, nazywane jasmonidami. Do jasmonidów zaliczane są między innymi jasmonian metylu (ang. methyl jasmonate, MeJ), dihydrojasmonian metylu (ang. methyl dihydrojasmonate, MeDHJ) (Rys. 1), kwas 9,10-dihydrojasmonowy, kwas 12-hydroksyjasmonowy, a także kwas kukurbinowy [15]. Kwas jasmonowy jest biosyntetyzowany w błonie komórkowej roślin w wieloetapowym procesie z kwasu α-linolenowego. Związki jasmonowe wykazują aktywność optyczną. Jasmonidy są analogami strukturalnymi kwasu cyklopentanooctowego, a kwas jasmonowy zgodnie z nomenklaturą genewską określa się jako kwas 3-tleno-2(2-cis-pentenyl)-cyklopentanooctowy [16]. Rysunek 1. Wzory strukturalne kwasu jasmonowego, jasmonianu metylu oraz dihydrojasmonianu metylu [opracowanie własne z wykorzystaniem programu ChemSketch] Aktywność biologiczna związków jasmonowych wynika z ich struktury, głównie obecności dwóch centrów chiralności przy atomach węgla C3 i C7 (Rys. 2) [15]. Możliwe są cztery stereoizomery, natomiast forma (-) jest łatwo epimeryzowana do formy (+), która charakteryzuje się wyraźnie mniejszą aktywnością biologiczną [17]. 162 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym Rysunek 2. Właściwości strukturalne jasmonidów warunkujące ich aktywność biologiczną [opracowanie własne z wykorzystaniem programu ChemSketch] Kwas (+)-7-izojasmonowy o konfiguracji (3R, 7S) oraz kwas (-)-7-izojasmonowy o konfiguracji (3S, 7 R) mają łańcuchy boczne w położeniu cis i stanowią parę izomerów lustrzanych. Ze względów stereochemicznych są one mniej trwałe aniżeli ich odpowiedniki z łańcuchem bocznym w położeniu trans (enancjomery 3S, 7S oraz 3R, 7R), dlatego też konformery trans wykazują większą aktywność biologiczną i występują w przyrodzie częściej, niż konformery cis [17]. Ponadto, obserwuje się zjawisko tautomerii keto-enolowej, w wyniku której związki cis przekształcają się w związki trans [15]. Dotychczas jasmonidy zostały wykryte w ponad 160 gatunkach roślin w pyłku kwiatowym, kwiatach, nasionach, owocach, bulwach, korzeniach oraz łodygach. Zawartość jasmonidów w materiale roślinnym mieści się w granicach od 10 ng do 3 μg na 1 gram suchej masy surowca i zależy głównie od wieku i gatunku rośliny [17]. Jako przykładowe źródło roślinne kwasu jasmonowego i jego pochodnych podać można bób, skrzyp leśny oraz pszenicę. Jasmonidy można także znaleźć w niektórych gatunkach grzybów, np. tych z gatunku Gibberella fujikuroi. 3.1.1. Rola jasmonidów w organizmie roślinnym Jasmonidy biorą udział w odpowiedzi roślin na uszkodzenia mechaniczne oraz działanie innych czynników zewnętrznych [18]. W dojrzałych, zdrowych liściach rośliny kwas jasmonowy występuje w niewielkim stężeniu. Dopiero pod wpływem działania danego czynnika stresowego, np. urazu mechanicznego czy obecności pasożyta, informacja o zagrożeniu jest przekazywana do plastydów. Jako skutek obserwuje się natychmiastową syntezę kwasu jasmonowego w liściach [19]. Schmidt i in. [20] przepro- 163 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak wadzili badanie wpływu stresu roślinnego wywoływanego czynnikami egzogennymi na stężenie kwasu jasmonowego w tkankach. W tym celu potraktowano liście pszenicy 1M roztworem sorbitolu, a następnie przeprowadzono ich ekstrakcję odpowiednio dobraną mieszaniną rozpuszczalników organicznych. Zaobserwowano znaczny wzrost stężenia kwasu jasmonowego na skutek działania egzogennego czynnika stresowego. Kwas jasmonowy i jego ester metylowy hamują także procesy związane ze wzrostem roślin, stymulują natomiast dojrzewanie owoców, starzenie i opadanie liści. Jasmonidy mogą wykazywać synergizm lub antagonizm aktywności biologicznej z innymi regulatorami wzrostu roślin [21]. Przykładowo kwas jasmonowy i gibereliny działają synergistycznie w stymulowaniu kiełkowania nasion Malus Domestica, natomiast w połączeniu z kwasem abscysynowym wykazują synergizm w stymulowaniu wzrostu rośliny, a antagonizm w stymulowaniu kiełkowania nasion (JA stymuluje, kwas abscysynowy hamuje) [1]. Aktywność biologiczna kwasu jasmonowego i jego pochodnych wiąże się z występowaniem tych związków w wolnej formie. W organizmie roślinnym zidentyfikowano także jasmonidy w formie koniugatów z glukozą i gentobiozą, jak również z różnymi aminokwasami. Koniugat JA i tryptofanu (Trp) został oznaczony w tkankach Arabidopsis thaliana [22]. Ponadto, koniugaty kwasu jasmonowego i tyrozyny (Tyr) oraz fenyloalaniny (Phe) zostały zidentyfikowane w kwiatach bobu. Zaobserwowano, że koniugat JA-Phe stymuluje syntezę fitoaleksyny – flawonoidu wytwarzanego w dużej ilości w roślinie w odpowiedzi na atak patogenów (bakterii i grzybów). Związek ten wykazał się największą aktywnością biologiczną spośród innych koniugatów występujących w tkankach ryżu siewnego (Oriza sativa) [23]. Wyniki przeprowadzonych badań [24] dowiodły, że mechaniczne uszkodzenie liści ziemniaka spowodowało wzrost stężenia koniugatów w zranionej tkance. Zaobserwowano również wzmożoną syntezę oraz akumulację koniugatow kwasu jasmonowego oraz waliny (Val), leucyny (Leu) i izoleucyny (Ile) w tkankach jęczmienia, poddanych stresowi osmotycznemu. Według Tamogami i in. [25], koniugaty JA z aminokwasami, takimi jak izoleucyna, leucyna, walina, tyrozyna, alanina i fenyloalanina, mogą odgrywać istotną rolę w szlaku transdukcji sygnału w tak zwanej,,odpowiedzi jasmonowej”. Przykładem takiej,,odpowiedzi” jest emisja lotnych substancji czynnych, które biorą udział w aktywacji układów obronnych sąsiednich roślin. Reakcja sprzęgania JA i aminokwasów zachodzi przy węglu C-1 jasmonidów i ma charakter dwuetapowej reakcji enzymatycznej z użyciem jonów magnezu i ATP [22]. Koniugaty kwasu jasmonowego i L-aminokwasów charakteryzują się wysoką aktywnością biologiczną, podczas gdy koniugaty z D-aminokwasami nie wykazują aktywności biologicznej [26]. Cząsteczka 164 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym kwasu jasmonowego może również ulegać modyfikacji na skutek reakcji estryfikacji z glukozą i gencjobiozą, wskutek czego otrzymuje się następujące produkty: JA-1-β-glukoza i JA-1-β-gencjobioza. Modyfikacja ta ma na celu zmniejszenie aktywności kwasu jasmonowego i przyczynia się do regulacji stężenia jasmonidów w tkankach roślinnych [27]. 3.1.2. Zastosowanie jasmonidów w przemyśle kosmetycznym Kosmetyczne działanie jasmonidów nie zostało jeszcze całkowicie poznane. Dotychczas stwierdzono, że związki te łagodzą podrażnienia skóry [28] oraz stymulują złuszczanie i odnowę naskórka [29]. Ponadto, jasmonidy wykazują zdolność regulowania aktywności gruczołów łojowych skóry [30]. Badacze naukowi firmy L’Oreal otrzymali nową pochodną kwasu jasmonowego – kwas tetrahydrojasmonowy (nazwa handlowa LR2412). Związek ten znalazł zastosowanie między innymi w kosmetykach pielęgnacyjnych marki Lancome (Visionnaire Advanced Skin Corrector) oraz Vichy (Idealia Serum). LR2412 wykazuje działanie przeciw starzeniu się skóry, bowiem stymuluje syntezę enzymów biorących udział w produkcji kwasu hialuronowego (tzw. syntaz hialuronowych) [31]. Efektywność działania przeciwstarzeniowego cząsteczki LR2412 została udowodniona za pomocą badań in vitro wycinków ludzkiej skóry, pozyskanych z operacji plastycznych powłok brzusznych. Stwierdzono, że cząsteczka kwasu tetrahydrojasmonowego ma zdolność przenikania naskórka oraz penetracji wierzchnich warstw skóry właściwej. Przeprowadzono także ocenę zdolności LR2412 do złuszczania naskórka z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej oraz promieniowania rentgenowskiego. Do badań użyto modelu zrekonstruowanej skóry ludzkiej EpiskinTM. Stwierdzono wzrost złuszczania naskórka oraz poprawę jego właściwości mechanicznych jako efekt stosowania preparatu zawierającego kwas tetrahydrojasmonowy [31, 32]. Wyniki badań zaprezentowane przez Bouloc i in. [33] dowodzą, że kwas tetrahydrojasmonowy w połączeniu z retinolem dają dobre efekty w terapii oznak fotostarzenia. Stwierdzono także, że kompozycja zawierająca 0,2% wag. retinolu oraz 2% wag. LR2412 jest lepiej tolerowana przez skórę pacjentów w porównaniu z preparatem zawierającym 0,025% wag. tretynoiny [34]. Zbadano także skuteczność działania kompleksu LR2412-Cx (Visionnaire, Lancome, L’Oreal USA), zawierającego w swoim składzie m.in. sól sodową kwasu tetrahydrojasmonowego oraz hialuronian sodu. Zaobserwowano, że stosowanie LR2412-Cx pozytywnie wpłynęło na stan i wygląd skóry. Stwierdzono redukcję zmarszczek i przebarwień oraz zwężenie porów skóry [35]. 165 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak Pochodne jasmonidów znalazły także zastosowanie w perfumiarstwie. Jasmonian metylu jest jednym z głównych składników olejku pozyskiwanego z kwiatów jaśminu, bowiem stanowi 2-3% wag. jego składu [36]. Jeden, średniej wielkości kwiat jaśminu zawiera około 10-4 gramów olejku zapachowego. Aby otrzymać 1 gram produktu, należy zebrać dziesięć tysięcy kwiatów. Ten fakt przyczynia się do wysokiej ceny olejku jaśminowego [37]. Uważa się, że za zapach olejku jaśminowego odpowiada w dużej mierze (1R,2S)-(+)-Z-metyloepijasmonian o silnym zapachu jaśminu i progu wyczuwalności już od 3 ppb (ang. parts per bilion, cząstki na 1 miliard) [38]. Ekstrakt z kwiatów jaśminu wykazuje działanie łagodzące oraz antyseptyczne [39]. Ekstraktowi z kwiatów Jasminum sambac L. przypisuje się także działanie przeciwbakteryjne. Olejek jaśminowy wykazał skuteczność w redukcji liczby komórek Escherichia coli (szczep MTCC–443), prawdopodobnie inhibitując syntezę błon komórkowych tej bakterii [40]. Ponadto uważa się, że cis-jasmonidy zwiększają zdolność koncentracji i sprawność umysłu [41]. 3.1.3. Zastosowanie jasmonidów w przemyśle farmaceutycznym Kwas jasmonowy i jego pochodne znalazły również zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym. Jasmonidom przypisuje się działanie przeciwnowotworowe. Udowodniono, że związki te mają zdolność hamowania proliferacji oraz indukowania apoptozy komórek nowotworowych w takich chorobach jak neuroblastoma, leukemia, czerniak oraz nowotwór płuc, piersi oraz prostaty [42, 43]. Uważa się, że jasmonian metylu wykazuje największą spośród wszystkich jasmonidów, skuteczność w terapii nowotworów [44]. Przeprowadzone badania in vivo oraz in vitro wykazały dużą skuteczność terapii antynowotworowej łączącej aplikację jasmonianu metylu z powszechnie stosowanymi chemioterapeutykami (adriamycyna, cisplatyna, taksol) [34]. Wyniki badań przeprowadzonych przez Yeruva i in. [45] dowodzą skuteczności działania jasmonianu metylu na skutek inhibicji wzrostu linii komórkowych nowotworu piersi (MDAMB-435 oraz MCF-7). Inna pochodna kwasu jasmonowego, dihydrojasmonian metylu, również znalazła zastosowanie w terapii nowotworów prostaty, piersi a także czerniaka oraz leukemii. Udowodniono, że MeDHJ był w stanie hamować angiogenezę tkanek nowotworowych, a tym samym opóźniać progresję choroby przerzutowej [46]. W Tabeli 2 przedstawiono aktywność przeciwnowotworową kwasu jasmonowego i jego pochodnych w połączeniu z wybranymi chemioterapeutykami. 166 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym Tabela 2. Aktywność przeciwnowotworowa wybranych jasmonidów oraz ich kombinacji z lekami o synergicznym działaniu. Substancja aktywna Aktywność przeciwnowotworowa MeJ + peptyd Smac (SmacN7) MeDHJ nowotwór prostaty Guosong J et al., 2011 [48] MeJ + PI3K/regulacja aktywności Kinazy Akt3 sarcoma Elia U and Flescher E, 2008 [49] MeJ, bromoi chloropochodne MeJ, MeDHJ czerniak JA, MeJ chłoniak Fingrut O et al., 2005 [51] MeJ neuroblastoma Tong QS et al., 2008 [52] JA, MeJ leukemia limfoblastyczna Literatura (przykłady) Lopes, 2013[47] Reischer D et al., 2009 [50] Lopes, 2013 [47] Rotem R et al., 2005 [44] Fingrut O and Flesher E, 2002 [53] Adriamycyna + MeJ Heyfets and Flescher, 2007 [54] Cisplatyna + MeJ leukemia Lopes, 2013 [47] MeDHJ MeJ MeJ + BCNU (1,3–bis(2–chloroetylo) –1–nitrozomocznik) nowotwór szyjki macicy nowotwór trzustki 3 Milrot E et al., 2012 [55] Kniazhanski T et al., 2008 [56] Heyfets and Flescher, 2007 [54] Serynowo-treoninowa kinaza białkowa Akt, będąca głównym przekaźnikiem sygnału w szlaku 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3K) 167 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak Jasmonidy wykazują także działanie przeciwzapalne. Przeprowadzono badania in vivo, które dowodzą, że aktywność przeciwzapalna MeJ pozyskanego z algi Gracilaria verrucosa jest porównywalna, bądź większa, niż aktywność pochodnych prostaglandyny [57]. Ponadto, w efekcie modyfikacji atomu węgla α jasmonianu metylu za pomocą atomów chloru lub bromu otrzymano związki charakteryzujące się większą skutecznością działania w porównaniu do naturalnie występujących prostaglandyn. Stwierdzono jednak, że chlorowe pochodne są wykazują większe bezpieczeństwo w stosowaniu w porównaniu z bromopochodnymi jasmonianu metylu [57, 58]. Badania nad aktywnością biologiczną jasmonidów wykazały, że związki te mają również działanie przeciwpasożytnicze. Badania in vitro, przeprowadzone przez Gold i in. [59] udowodniły skuteczność działania jasmonidów w zwalczaniu dwóch ludzkich pasożytów: Schistosoma mansoni wywołującego schizostomozę, oraz Plasmodium falciparum, wywołującego malarię [60, 61]. Wspomniane drobnoustroje pasożytują w krwi człowieka, należało więc dokonać oceny cytotoksyczności jasmonidów względem erytrocytów. W oparciu o wyniki badań nie stwierdzono uszkodzenia krwinek czerwonych w efekcie aplikacji jasmonidów. Vilela i in. [62] przeprowadzili także badania, które dowodzą o skuteczności działania przeciwpasożytniczego jasmonianu metylu na komórki Trichomonas vaginalis, powodującego rzęsistkowicę pochwową. 3.2. Cytokininy Jest to grupa hormonów roślinnych, których obecność została stwierdzona przez Jabłońskiego i Skooga w 1954 roku w układach przewodzących łodygi tytoniu [63]. Przedstawicielami cytokinin są między innymi zeatyna ((E)-2-metylo-4-(7H-puryn-6-yloamino)but-2-en-1-ol) (Rys. 3) oraz kinetyna (N-(furan-2-ylometylo)-7H-puryno-6-amina) [64]. NH N NH OH N N CH3 Rysunek 3. Wzór strukturalny zeatyny [opracowanie własne z wykorzystaniem programu ChemSketch] Głównym miejscem syntezy cytokinin jest korzeń. Gotowe produkty są transportowane z korzenia do innych części roślin za pomocą jej elementów przewodzących. Mniejsze ilości tych związków są także syntetyzowane w nasionach, owocach i młodych liściach. Na produkcję cytokinin 168 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym mają wpływ warunki świetlne [65]. Kinetyna została wyodrębniona z DNA grasicy cielęcej, natomiast zeatyna – z niedojrzałych nasion kukurydzy [64]. Jako fitohormony, cytokininy mają znaczący wpływ na regulację wzrostu i rozwoju roślin, bowiem regulują tempo podziałów komórkowych oraz indukują różnicowanie się pędów rośliny. Ponadto, związki te wykazują aktywność stymulującą różnicowanie się chloroplastów i wzrost objętości komórek roślinnych. Cytokininy uczestniczą także w kiełkowaniu nasion, powodują bowiem zakończenie fazy ich spoczynku [65, 66]. Uważa się, że cytokininy są roślinnym odpowiednikiem cytokin, białkowych substancji wydzielanych przez komórki zwierzęce i pośredniczących w intercelularnym przekazywaniu informacji. Słabo poznany mechanizm działania na poszczególne enzymy oraz złożona struktura cytokin spowodowały, że związki te nie mogą być stosowane w transdermalnych systemach terapeutycznych bez uprzedniego przeprowadzenia odpowiednich badań klinicznych. Z tego względu roślinne cytokininy powinny stanowić substytut cytokin w formulacjach kosmetycznych. Ich niewielka dawka i słabsza intensywność działania zmniejszają ryzyko powstawania zaburzeń hormonalnych, co może mieć miejsce w wyniku stosowania miejscowego cytokin [67]. Kosmetyczne działanie tych fitohormonów polega na opóźnieniu procesów starzenia, dlatego mogą być stosowane do pielęgnacji skóry dojrzałej. Ponadto, kosmetyki oparte na bazie kinetyny mają działanie nawilżające i regenerujące [65-67]. 4. Podsumowanie i wnioski Ze względu na naturalne pochodzenie, fitohormony mogą stanowić ciekawą grupę kosmetycznych oraz farmaceutycznych substancji aktywnych. Związki te wykazują interesującą aktywność biologiczną na organizm ludzki. Przeprowadzone badania dowodzą, że jasmonidy są potencjalną grupą chemioterapeutyków pochodzenia roślinnego i mogą być stosowane samodzielnie, lub w połączeniu z innymi lekami w terapii wielu rodzajów nowotworów. Substancje te mogą być również stosowane jako naturalne terapeutyki stanów zapalnych skóry oraz błon śluzowych, a także w przypadku infekcji poszczególnymi pasożytami. Ze względu na zdolność stymulacji złuszczania naskórka, usuwania przebarwień, regulacji pracy gruczołów łojowych oraz redukcji widocznych oznak starzenia się skóry, jasmonidy stanowią niezwykle ciekawe zagadnienie dla dermatologii oraz przemysłu kosmetycznego. Inna grupa fitohormonów to cytokininy, którym przypisuje się zdolność opóźniania procesów starzenia się skóry, dzięki czemu mogą być stosowane w pielęgnacji skóry dojrzałej. Podsumowując, fitohormony charakteryzują się wielokierunkowym działaniem na organizm człowieka i stanowią kosmetyczne i farmaceutyczne substancje aktywne przyszłości, które umożliwią substytucję lub obniżenie stężenia stosowanych dotychczas związków leczniczych oraz pielęgnacyjnych. 169 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Kopcewicz J, Lewak S. Fizjologia roślin, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007 Szweykowska A. Fizjologia roślin, Wydawnictwo Naukowe Uniwersytetu im Adama Mickiewicza, Poznań 1999 Davies P. J. The plant hormones: their nature occurrence and functions, [W:] Davies P. J. (ed.) Plant hormones, Springer: Biosynthesis, Signal Transduction, Action! Springer, Netherlands 2010 Kraszewska, Nynca A, Kaminska B, Ciereszko R. Fitoestrogeny I. Występowanie, metabolizm i znaczenie biologiczne u samic. Post. Biol. Kom., 2007, 34(1): 189-205 Epple P. i in. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins, Plant Physiol, 1995,109: 813-820 Ellard-Ivey M., Douglas C. J. Role of jasmonates in the elicitor-and woundinducible expression of defense genes in parsley and transgenic tobacco, Plant Physiol, 1996, 112: 183-192 Lehmann J. i in. Accumulation of jasmonate, abscisic acid, specific transcripts and proteins in osmotically stressed barley leaf segments, Planta, 1995, 197: 156-162 Xu Y. I. Plant defense genes are synergistically induced by ethylene and methyl jasmonate, The Plant Cell, 1994, 6: 1077-1085 Maksymiek W., Krupa Z. Acid and heavy metals in Arabidopsis plants – A similar physiological response to both stressors?, J. Plant. Physiol., 2002, Jasmonic 159: 509-515 Chen J. Effect of methyl jasmonate on cadmium uptake and antioxidative capacity in Kandelia obovata seedlings under cadmium stress, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2014, 104: 349-356 Poonam S. Effect of jasmonic acid on photosyntheticpigments and stress markers in Cajanus cajan (L.) Mill sp. seedlings under copper stress, Am. J Plant Sci, 2013, 4: 817-823 Gonzalez-Aguilar G. A. Methyl jasmonate reduces chilling injury and maintains postharvest quality of mango fruit, J. Agri. Food Chem., 48 (2000), s. 515-519 Abel S. DNA elements responsive to auxin, Bioessays, 1996, 18: 647-654 Pena-Cortes H. Signals involved in wound-induced proteinase inhibitor II gene expression in tomato and potato plants, P.N.A.S., 1995, 92: 4106-4113 Martini M. C. Kosmetologia i farmakologia skóry, Wyd. Lekarskie PZWL, Warszawa 2008 Creelman R. A., Mullet J. E. Jasmonic acid distribution and action in plants: Regulation during development and response to biotic and abiotic stress, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 4114-19 Vick B. A., Zimmerman D. C. Biosynthesis of Jasmonic Acid by Several Plant Species, Plant Physiol., 1984, 75(2): 458-461 170 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym 18. Białecka B., Kępczyński J. Rola kwasu jasmonowego i jego estru metylowego we wzroście i rozwoju roślin, Wiadomości Botaniczne, 1998, 42 (3/4): 61-78 19. Wasternack C. Jasmonates: an update on biosynthesis signal transduction and action in plant stress response growth and development, Ann. Bot., 2007, 100(4): 681-697 20. Ślesak H., Ślesak I. Odpowiedź roślin na zranienie, Kosmos. Problemy Nauk Biologicznych, 2011, 60, 3-4:445-457 21. Schmidt J., Kramell R., Brückner C., Schneider G., Sembdner G., Schreiber K., Jensen E. Gas Chromatographic/ Mass Spectrometric and Tandem Mass Spectrometric Investigations of Synthetic Amino Acid Conjugates of Jasmonic Acid and Endogenously Occuring Related Compounds from Vicia faba L., Biomed. Environ. Mass Spectrom., 1990, 19: 327-338 22. Erb M., Meldau S., Howe G. A. Role of phytohormones in insect-specific plant reactions, Trends Plant. Sci., 2012, 17(5): 250-259 23. Staswick P. E., Tiryaki I. The oxylipin signal jasmonic acid is activated by an enzyme that conjugates it to isoleucine in Arabidopsis, The Plant Cell, 2004, 16(8): 2117-2127 24. Tamogami S., Rakwal R., Kodama O. Phytoalexin production elicited by exogenously applied jasmonic acid in rice leaves (Oryza sativa L.) is under the control of cytokinins and ascorbic acid, FEBS Lett., 1997, 412(1): 61-64 25. Kramell R., Miersch O., Hause B., Ortel B., Parthier B., Wasternack C. Amino acid conjugates of jasmonic acid induce jasmonate-responsive gene expression in barley (Hordeum vulgare L.) leaves, FEBS Lett., 1997, 414(2): 197-202 26. Tamogami S., Rakwal R., Agrawal G. K. Interplant communication: airborne methyl jasmonate is essentially converted into JA and JA-Ile activating jasmonate signaling pathway and VOCs emission, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, 376(4): 723-727 27. Piotrowska A., Bajguz A. Conjugates of abscisic acid, brassinosteroids, ethylene, gibberellins, and jasmonates, Phytochemistry, 2011, 72(17), 2097-2112 28. Świątek A., Van Dongen W., Esmans E. L., Van Onckelen H. Metabolic fate of jasmonates in tobacco bright yellow-2 cells, Plant Physiol., 2004, 135(1): 161-172 29. Fagot D., L’Oreal. Use of jasmonic acid derivative as a soothing agent, WO2011010075 A1, 2011 30. Boulle C., Dalko M., Leveque J. L., Simonetti L. Compositions comprising jasmonic acid derivatives and use of these derivatives, US8603502 B2, 2013 31. Dalko M. Use of a (dihydro)jasmonic acid derivative for dry skin treatment, EP1442737 B1, 2006 32. Michelet J. F., Olive C., Rieux E., Fagot D., Simonetti L., Galey J. B., Pereira R. The anti-ageing potential of a new jasmonic acid derivative (LR2412): in vitro evaluation using reconstructed epidermis Episkin™, Exp. Dermatol., 2012, 21(5): 398-400 33. Tran C., Michelet J. F., Simonetti L., Fiat F., Garrigues A., Potter A., Lacharrière O. In vitro and in vivo studies with tetrahydrojasmonic acid 171 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. (LR2412) reveal its potential to correct signs of skin ageing, J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., 2014, 28(4): 415-423 Bouloc A., Vergnanini A. L., Issa M. C. A double‐blind randomized study comparing the association of Retinol and LR2412 with tretinoin 0.025% in photoaged skin, J. Cosmet. Dermatol., 2015, 14(1): 40-46 Alexiades M. Jasmonates and Tetrahydrojasmonic Acid: A Novel Class of Anti-Aging Molecules, J. Drugs Dermatol.: JDD 2016, 15 (2):206-207 Alexiades M. Clinical Assessment of a Novel Jasmonate Cosmeceutical, LR2412-Cx, for the Treatment of Skin Aging, J. Drugs Dermatol.: JDD 2016, 15(2):209-215 Vainstein A., Lewinsohn E., Pichersky E., Weiss D. Floral fragrance. New inroads into an old commodity, Plant physiol., 2001, 127(4): 1383-1389 Meyer-Warnod B. Natural essential oils: extraction processes and application to some major oils, Perfumer & flavorist, 1984, 9(2):93-104 Acree T. A., Nishida R., Fukima H. Odor thresholds of the stereoisomers of methyl jasmonate, J. Agric. Food Chem., 1985, 33:425-427 Rath C., Devi S., Dash S. K., Mishra R. K. Antibacterial potential assessment of Jasmine essential oil against E. coli, Indian J. Med. Res. Pharm. Sci., 2008, 70(2):238 Scognamiglio J., Jones L., Letizia C. S., Api A. M. Fragrance material review on methyl dihydrojasmonate, Food Chem. Toxicol., 2012, 50:562-571 Pawełczyk A., Zaprutko L. Microwave assisted synthesis of fragrant jasmone heterocyclic analogues, J. Med. Chem., 2006, 41(5):586-591 Flescher E. Jasmonates in cancer therapy, Cancer lett., 2007, 245(1):1-10 Rotem R., Heyfets A., Fingrut O., Blickstein D., Shaklai M., Flescher E. Jasmonates: novel anticancer agents acting directly and selectively on human cancer cell mitochondria, Cancer Res., 2005, 65(5):1984-1993 Cohen S., Flescher E. Methyl jasmonate: a plant stress hormone as an anticancer drug, Phytochemistry, 2009, 70(13):1600-1609 Yeruva L., Elegbede J. A., Carper S. W. Methyl jasmonate decreases membrane fluidity and induces apoptosis through tumor necrosis factor receptor 1 in breast cancer cells, Anticancer Drug, 2008a, 19:766-776 Fehr Pereira Lopes J. E. Compositions of jasmonate compounds and methods of use, US20130089615, 2013 Guosong J., Zhao J., Xiao X., Tao D., Gu C., Tong Q., Zeng F. N-terminal Smac peptide sensitizes human prostatecarcinoma cells to methyl jasmonateinduced apoptosis, Cancer Lett., 2011, 302: 37-46 Elia U., Flescher E. PI3K/Akt pathway activation attenuates the cytotoxic effect of methyl jasmonate toward sarcoma cells, Neoplasia, 2008, 10(11): 1303-1313 Reischer D., Heyfets A., Shimony S., Nordenberg J., Kashman Y., Flescher E. Effects of natural and novel synthetic jasmonates in experimental metastatic melanoma, Br. J. Pharmacol., 2007, 150(6): 738-749 Fingrut O., Reischer D., Rotem R., Goldin N., Altboum I., Zan‐Bar I., Flescher E. Jasmonates induce nonapoptotic death in high-resistance mutant p53-expressing B-lymphoma cells, Br. J. Pharmacol., 2005, 146(6): 800-808 172 Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym 52. Tong Q. S., Jiang G. S., Zheng L. D., Tang S. T., Cai J. B., Liu Y., Dong J. H. Methyl jasmonate downregulates expression of proliferating cell nuclear antigen and induces apoptosis in human neuroblastoma cell lines, AntiCancer Drug, 2008, 19(6): 573-581 53. Fingrut O., Flescher E. Plant stress hormones suppress the proliferation and induce apoptosis in human cancer cells, Leukemia, 2002, 16(4): 608-616 54. Heyfets A., Flescher E. Cooperative cytotoxicity of methyl jasmonate with anti-cancer drugs and 2-deoxy-D-glucose, Cancer lett., 2007, 250(2): 300-310 55. Milrot E., Jackman A., Kniazhanski T., Gonen P., Flescher E., Sherman L. Methyl jasmonate reduces the survival of cervical cancer cells and downregulates HPV E6 and E7, and survivin, Cancer lett., 2012, 319(1): 31-38 56. Kniazhanski T., Jackman A., Heyfets A., Gonen P., Flescher E., Sherman L. Methyl jasmonate induces cell death with mixed characteristics of apoptosis and necrosis in cervical cancer cells, Cancer lett., 2008, 271(1): 34-46 57. Dang H. T., Lee H. J., Yoo E. S., Hong J., Bao B., Choi J. S., Jung J. H. New jasmonate analogues as potential anti-inflammatory agents, Bioorg. Med. Chem. 2008, 16(24):10228-10235 58. Dang H. T., Lee Y. M., Kang G. J., Yoo E. S., Hong J., Lee S. M., Lee S. K., Pyee Y., Chung H. J., Moon H. R., Kim H. S., Jung J. H. In vitro stability and in vivo anti-inflammatory efficacy of synthetic jasmonates, Bioorg. Med. Chem., 2012, 20(13):4109-4116 59. Gold D., Pankova-Kholmyansky I., Fingrut O., Flescher E. The Antiparasitic Actions of Plant Jasmonates, J Parasitol. 2003, 89(6):1242-1244 60. Snow R. W., Guerra C. A., Noor A. M., Myint H. Y., Hay S. I. The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria, Nature, 2005, 434(7030):214-217 61. Stelma F., Talla I., Sow S., Kongs A., Niang M., Polman K., Gryseels B. Efficacy and side effects of praziquantel in an epidemic focus of Schistosoma mansoni, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1995, 53(2):167-170 62. Vilela R., Menna-Barreto R. F. S., Benchimol M. Methyl jasmonate induces cell death and loss of hydrogenosomal membrane potential in Trichomonas vaginalis, Parasitol. Int., 2010, 59(3):387-393 63. Jablonski J. R., Skoog F. Cell enlargement and cell division in excised tobacco pith tissue,. Physiol. Plant., 1954, 7(1):16-24 64. Schäfer M., Brütting C., Meza-Canales I. D., Großkinsky D. K., Vankova R., Baldwin I. T., Meldau S. The role of cis-zeatin-type cytokinins in plant growth regulation and mediating responses to environmental interactions, J. Exp. Bot. 2015, 66(16):4873-4884 65. Czerpak R., Piotrowska A. Cytokininy, ich struktura, metabolizm i aktywność metaboliczna, Kosmos, 2003, 52: 203-215 66. Czerpak R., Jabłońska A. Zastosowanie cytokinin i izoflawonoidów w kosmetyce i terapii (I), Medycyna estetyczna i przeciwstarzeniowa, 2005, 2(11) 67. Sarpotdar P., Basu S., Bhatt V. D., Chang Y., Dow G. J. Kinetin/zeatin topical formulation, US20140271826 A1, 2014 173 Alicja Kapuścińska, Izabela Nowak Wykorzystanie wybranych fitohormonów w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym Streszczenie Fitohormony to związki pochodzenia roślinnego, które regulują wzrost i rozwój roślin [1]. Niektóre z nich wykazują interesujące działanie na organizm człowieka, dzięki czemu znalazły zastosowanie w przemyśle kosmetycznym oraz farmaceutycznym. Kwas jasmonowy i jego pochodne, zwane także jasmonidami są stosowane w preparatach pielęgnacyjnych redukujących widoczne oznaki starzenia się skóry, ponieważ stymulują syntezę kwasu hialuronowego, złuszczanie naskórka oraz redukują przebarwienia [28-35]. Jasmonidy znalazły również zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, ponieważ wykazują m.in. działanie przeciwnowotworowe [43-56] oraz przeciwpasożytnicze [59-62]. Inną klasą fitohormonów o ciekawej aktywności biologicznej są cytokininy, będące potencjalnym roślinnym odpowiednikiem cytokin, białkowych substancji wydzielanych przez komórki zwierzęce i pośredniczących w intercelularnym przekazywaniu informacji. Uważa się, że związki te spowalniają procesy starzenia się skóry. W bieżącym rozdziale przedstawiono przegląd literatury dotyczącej aktywności farmaceutycznej oraz kosmetycznej wybranych fitohormonów. Słowa kluczowe: fitohormony, jasmonidy, cytokininy, preparaty przeciwstarzeniowe, terapia nowotworów The use of selected phytohormones in cosmetic and pharmaceutical industry Abstract Phytohormones are phytochemicals that regulate plant growth and development [1]. Some of them have interesting activity on human organism so they found application in cosmetic and pharmaceutical industry. The jasmonic acid and its derivatives, called also jasmonates are used in the products that reduce visible signs of skin aging, because they stimulate hyaluronic acid synthesis, epidermis desquamation and reduce skin discolorations [28‚35]. Jasmonates are also used in the pharmaceutical industry, because they have i.a. antitumour [43‚56] and antiparasitic [59‚62] activity. Another class of plant hormones having interesting biological activity are cytokinins. These compounds are potential plant counterparts of cytokines, protein substances secreted by the animal cells and mediating the intracellular transmission of information. It is believed that cytokinins delay the process of skin aging [46‚48]. In this chapter a literature review on pharmaceutical and cosmetic activity of selected phytohormones was presented. Key words: phytohormones, jasmonates, cytokinins, anti-aging products, tumor therapy 174 Monika Staszowska-Karkut1, Małgorzata Materska2, Barbara Kulik3, Robert Waraczewski4 Określenie wpływu rodzaju wody na potencjał antyoksydacyjny naparów z wybranych roślin ziołowych 1. Wprowadzenie Od tysięcy lat człowiek poszukując środków leczniczych korzysta zdobrodziejstw natury. Powszechnie wiadomo, że rośliny są cennym źródłem substancji działających na różne dolegliwości. Wpływ diety bogatej wwarzywa iowoce został powiązany ze zmniejszonym ryzykiem występowania chorób, takich jak stany zapalne, choroby układu krążenia ichoroby neurodegeneracyjne [1]. Fitoterapia jest dziedziną medycyny wywodzącą się zziołolecznictwa, która wykorzystuje substancje pochodzenia naturalnego. Coraz częściej pacjenci wybierają terapie roślinne w leczeniu i profilaktyce. Wostatnich latach zaobserwowano intensywny rozwój badań nad substancjami fitochemicznymi oraz wzrost produkcji preparatów leczniczych na bazie naturalnych ekstraktów roślinnych. Związki fenolowe występujące wroślinach tworzą jedną znajbardziej znanych grup substancji pokarmowych zaliczanych do fitozwiązków. Coraz większe zainteresowanie tymi substancjami wynika zich potencjalnych właściwości przeciwnowotworowych. Pod kątem chemioprewencji schorzeń nowotworowych istotne znaczenie pośród związków polifenolowych wykazują glukozynolany, które są prekursorami biologicznie aktywnych izotiocyjanianów oraz indoli. Poza tym zwraca się uwagę na ochronne właściwości antocyjanów, fitoestrogenów, między innymi izoflawonów, lignanów oraz resweratrolu. Ze znanych karotenoidów istotne prozdrowotne właściwości wykazuje likopen, dzięki czemu jest zaliczany do grupy związków opotencjalnym zastosowaniu wprofilaktyce wielu 1 [email protected],Pracowania Fitochemii, Katedra Chemii. Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, www.up.lublin.pl 2 [email protected], Pracownia Fitochemii, Katedra Chemii. Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, www.up.lublin.pl 3 [email protected], SKN Fitochemiczne przy Katedrze Chemii, Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, www.up.lublin.pl 4 [email protected], SKN Fitochemiczne przy Katedrze Chemii, Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, www.up.lublin.pl 175 Monika Staszowska-Karkut, Małgorzata Materska, Barbara Kulik, Robert Waraczewski chorób przewlekłych, wtym schorzeń nowotworowych [2]. Popularnym sposobem wspomagania układu odpornościowego jest spożywanie naparów z różnego rodzaju ziół. Działanie tego typu napojów było przekazywane zpokolenia na pokolenie. Obecnie taka wiedza jest niewystarczająca, dlatego prowadzi się szereg badań nad składnikami naparów ziołowych. Wodpowiedzi uzyskuje się coraz więcej informacji na temat działania poszczególnych substancji zawartych wwarzywach, owocach czy ziołach. Do grupy roślin ziołowych o potwierdzonych właściwościach fizjologicznych należy kozłek lekarski, liść pokrzywy, także owoce dzikiej róży oraz płatki jej kwiatów. Kozłek lekarski jest rośliną znaną od wielu lat, ale pomimo tego, żewiele związków zostało wyizolowanych izidentyfikowanych wposzukiwaniu substancji czynnych zawartych wtej roślinie, to nadal nie ma pewności, które znich są odpowiedzialne za znane jej działania prozdrowotne. Ekstrakt z kozłka lekarskiego (Valeriana officinalis) wykazuje działanie przeciwlękowe iantydepresyjne. Stosuje się go do leczenia łagodnych zaburzeń snu inapięcia nerwowego. Do celów leczniczych, używany jest cały system korzeniowy [3]. Pomimo intensywnych wysiłków badawczych, nie stwierdzono jednoznaczne mechanizmu farmakologicznego działania ekstraktu z kozłka lekarskiego [4]. Stwierdzono, że zawiera on walepotriaty mono- i dienowe – związki z grupy irydoidów, monoterpeny – borneol i eugenol, izowalerianian i octan bornylu, waleranonorazkwasy cyklopentano-seskwiterpenowe: walerenowy, acetoksywalerenowy i hydroksywalerenowy. Analiza fitochemiczna prowadzona przez Circosta i współ. wykazała iż ekstrakty zarówno alkoholowe, jak iwodne zkorzenia kozłka lekarskiego zawierają przede wszystkim kwas walerianowy [5]. Owoce dzikiej róży cechuje duża zawartość różnorodnych związków biologicznie aktywnych. Zawierają znaczną ilość witaminy C, tokoferoli ikarotenoidów. Są one również źródłem makroelementów, np.: P, K, Ca, Mg oraz cukrów prostych (fruktozy, glukozy, trehalozy) iwielocukrów – pektyn. Pozostałe związki występujące wowocach to m.in. kwasy fenolowe (galusowy igenistynowy), które wykazują właściwości przeciwgrzybicze iprzeciwwirusowe. Owoce dzikiej róży wykorzystywane są wprzemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym, spożywczym, wziołolecznictwie oraz aromaterapii. Stosuje się jewspomagająco w leczeniu dolegliwości wątroby, pęcherzyka żółciowego, nerek, przeziębieniach, nadkwasocie ichorobie wrzodowej. Wostatnich latach badania nad właściwościami róży pozwoliły odkryć specyficzny galaktolipid, który wykazuje działanie przeciwzapalne [6]. Badania prowadzone przez Demir i współ. [7] wykazały iż gatunek róży wpływa znacząco na zawartość różnych substancji, wtym związków fenolowych, kwasów organicznych, związków lotnych czy też cukrów. Wszystkie wykorzystane ekstrakty wanalizie charakteryzowały się wysokim działaniem przeciwutleniającym i przeciwrodnikowym. Widoczna była 176 Określenie wpływu rodzaju wody na potencjał antyoksydacyjny naparów z wybranych roślin ziołowych również zależność pomiędzy gatunkiem rośliny a zawartością kwasów organicznych icukrów wprzygotowanych ekstraktach.Zidentyfikowano wsumie osiemnaście różnych związków fenolowych wbadanym materiale za pomocąwysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie odwróconych faz z detekcją fotodiodową (RP-HPLC-DAD) m.in. kwas galusowy, katechiny, procyanidiny-B2 i pochodne kwasu hydroksycynamonowego (chlorogenowy, t-kawowy, p-kumarowy, ferulowy oraz kwas synapowy, który był głównym składnikiem wszystkich gatunków róży). Natomiast przy zastosowaniu technikimikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME) orazchromatografii gazowej połączonej ze spektrometrem mas (GC/MS) oznaczono 52 związki lotne, głównie alkohole ialdehydy, wniektórych gatunkach wykryto również monoterpeny i seskwiterpeny. Lecznicze właściwości płatków róży znane są od wielu lat, jednak w literaturze naukowej jest niewiele prac dotyczących analizy związków występujących w tej roślinie. Liście pokrzywy zawierają stosunkowo szeroką gamę składników chemicznych, ale tylko kilka związków należących do różnych klas substancji naturalnych, zostało zidentyfikowanych. Odpowiedzialność za kłucie, pieczenie oraz korzystne działanie na włosy przypisuje się acetylocholinie, histaminie oraz w mniejszym stopniu leukotrienom. Natomiast posmak kwaśny pochodzi od kwasu szikimowego, kawowego oraz estrów kwasów chlorogenowego i kawoilo-jabłkowego. Inne badania potwierdzają obecność flawonoidów, kwasów tłuszczowych, terpenów, białek, witamin iminerałów [8]. Podczas badań nad właściwościami przeciwbólowymi, przeciwutleniającymi iprzeciwbakteryjnymi wodnego ekstraktu pokrzywy (Urtica dioica L.) prowadzonych przez Gülçin i współ. [9] dowiedziono ich silnych właściwości antyoksydacyjnych. Potencjał przeciwutleniający ekstraktu wyrażono jako procent odbarwienia roztworu DPPH (1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl) w stosunku do próby kontrolnej (roztwór DPPH). Im roztwór był bardziej odbarwiony, tym ekstrakt posiadał większe właściwości antyoksydacyjne. Naważki 50, 100 i 250 µg wykazały odpowiednio 39, 66 i 98% odbarwienia, podczas gdy α-tokoferol o stężeniu 60 µg/mlspowodował tylko 30% odbarwienie. Na wyniki badań właściwości przeciwutleniających roślin wpływa zarówno jakość badanego materiału, pochodzenie, jak również metoda oznaczenia. Wliteraturze często można spotkać informacje dotyczące wpływu różnego rodzaju rozpuszczalnika i czasu ekstrakcjinazawartość wyodrębnionych związków.Dzięki znajomości właściwości ekstrahowanych składników irozpuszczalników, jak również ich interakcji, możliwe jest uzyskanie wysokiej wydajności pozyskiwania związków aktywnych. Badania dotyczące optymalizacji ekstrakcji niektórych związków fenolowych zliści pietruszki, dowiodły, że najlepszym rozpuszczalnikiem dla wyizolowania polifenoli był aceton, natomiast dla katechin woda destylowana [10]. 177 Monika Staszowska-Karkut, Małgorzata Materska, Barbara Kulik, Robert Waraczewski Zhou iwspół. [11] dowiedli wswojej pracy, iż zawartość polifenoli wekstrakcie zzielonej herbaty jest wyższa dla wody destylowanej wstosunku do wody filtrowanej, natomiast najniższą wartość zaobserwowano dla wody wodociągowej. Zbadano również wpływ rodzaju wody użytej do sporządzenia naparów kaw na ich aktywność antyoksydacyjną i zawartość polifenoli. Badania wykazały, że zawartość polifenoli była wyższa przy zastosowaniu wody destylowanej jako ekstrahentu w porównaniu do wody wodociągowej, a najniższą wartość odnotowano dla wody mineralnej. Tłumaczy się to bogatym składem wody mineralnej w jony wapnia imagnezu, które mogą wiązać polifenole. Ponadto woda mineralna, ma odczyn alkaliczny po wygotowaniu CO2, co może sprzyjać rozkładowi związków polifenolowych [12]. Zdolność przeciwutleniająca roślin związana jest z obecnością w ich tkankach m.in. związków fenolowych. Związki te, wchodzą w reakcję zwolnymi rodnikami tlenowymi (RFT) powodując przerwanie reakcji wolnorodnikowych, zapobiegają tworzeniu się RFT oraz usuwają skutki reakcji RFT z DNA. Najczęściej spotykaną w literaturze metodą oznaczania właściwości przeciwutleniających jest metoda z użyciem wolnego stabilnego rodnika DPPH (1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl) [13]. Oznaczenie metodą DPPH jest szybkim, prostym i ekonomicznym sposobem stabilnego pomiaru zdolności przeciwutleniającej produktów spożywczych lub ekstraktów roślinnych [14]. W analiziestosuje się główniemetanolowe roztwory DPPH, ponieważ substancja ta nie rozpuszcza się wwodzie. Podczas reakcji redukcji następuje zmiana barwy roztworu z purpurowej w kierunku żółtej. Im jaśniejszy kolor tym badana substancja posiada większe właściwości antyoksydacyjne. Zmianę tę monitoruje się spektrofotometrycznie przy długości fali λ=517nm. W celu przedstawienia wyników korzysta się z parametru EC50 (ang. efficient concentration), który określa stężenie antyoksydantu powodujące spadek początkowego stężenia rodnika DPPH o 50%. Wliteraturze można spotkać również symbol IC50. Innym parametrem jest procent odbarwienia roztworu DPPH w porównaniu do próby kontrolnej (%AA). Wyznacza się go na podstawie wzoru (wz.1): %AA=[(Ac-As)/Ac]×100% (1) gdzie: %AA – aktywność wygaszania rodników, DPPH Ac – absorbancja próby kontrolnej, As – absorbancja próbki, Oszacowanie działania przeciwutleniającego DPPH prowadzi się zwykle od momentu osiągnięcia plateau-wykresu zależności zmiany absorbancji badanych próbek w czasie. W większości przypadków czas inkubacji nie jest jednakowy [15]. Jest on zależny od różnego czasu reakcji 178 Określenie wpływu rodzaju wody na potencjał antyoksydacyjny naparów z wybranych roślin ziołowych pomiędzy rodnikiem a danym związkiem. Dlatego w celu wyznaczenia momentu po jakim następuje stabilizacja reakcji, wyznacza się krzywą absorbancji w funkcji czasu. Z dostępnych danych literaturowych wynika, że plateau osiąga się już po 10-15 minutach [16, 17, 18]. 2. Cel pracy Celem pracy była ocena wpływu rodzaju wody użytej do sporządzenia naparów zwybranych ziół: płatki iowoc dzikiej róży, korzeń kozłka lekarskiego iliść pokrzywy oraz wpływu gatunkui części rośliny na potencjał antyoksydacyjny otrzymanych ekstraktów. 3. Materiał i metoda 3.1. Materiał badawczy Przedmiotem badań były różne rodzaje ziół oraz ich części anatomiczne. Korzeń kozłka lekarskiego (Valeriana officinalis) – materiał pochodził z prywatnej uprawy. Przed rozpoczęciem analizy został oczyszczony i wysuszony w temperaturze pokojowej. Liść pokrzywy (Urticae folium), płatki róży (Petalae rosae) oraz owoce róży (Rosae fructus) – zioła zostały zakupione w sklepie zielarskim w Lublinie. Różnorodność materiału badawczego wynikała z próby oceny wpływu części anatomicznej rośliny oraz jej gatunku na aktywność antyoksydacyjną przygotowanych z nich ekstraktów. 3.2. Oznaczenie aktywności antyoksydacyjnych Właściwości antyoksydacyjne ekstraktów oznaczano przy użyciu metody z rodnikiem DPPH. Roztwór DPPH(SIGMA) przygotowano przez rozpuszczenie 0,02 g DPPH w 50 ml MeOH (POCH), następnie do pomiarów używano 10 krotnie rozcieńczonego roztworu. W badaniach jako ekstrahenta użyto trzy rodzaje wody: wodę destylowaną, filtrowaną oraz wodociągową. Wodę filtrowaną otrzymano przez oczyszczenie wody wodociągowej w dzbanku filtrującym (Sana Tek). W celu uzyskania reprezentatywnej próbki do analizywysuszone zioła roztarto wmoździerzu. Następnie odważono 0,5 g próbki na wadze analitycznej iprzygotowano napary zalewając próbkę 50 ml odpowiedniej wody otemperaturze 90°C. Po 10 minutach ekstrakt przesączono na sączkach miękkich (typu MUKTEL 3w, Alfa Chem) do kolby miarowej 100ml ipo ostudzeniu uzupełniono do kreski wodą destylowaną. Rozcieńczenia przygotowano zekstraktu wyjściowego w wodzie destylowanej. Kalibrację spektrofotometru przeprowadzono na pustej kuwecie kwarcowej. Zmierzono absorbancjępróby ślepej dodając 3 ml roztworu 179 Monika Staszowska-Karkut, Małgorzata Materska, Barbara Kulik, Robert Waraczewski DPPH i1 ml metanolu. Z każdej rośliny zaparzono 4 równoległe ekstrakty, z których następnie wykonano odpowiednie rozcieńczenia wstępne. Do szklanych probówek nastrzyknięto po 3ml roztworu DPPH, 1ml badanego ekstraktu iwymieszano. Po 15 minutach od zainicjowania reakcji mierzono absorbancję za pomocą spektrofotometru firmy Schimadzu UV-160A w kuwetach kwarcowych o d=1 cm przy długości fali 517 nm. Dla każdego z rozcieńczeń zmierzono absorbancje w dwóch seriach pomiarowych. W otrzymanych próbach oznaczono potencjał przeciwutleniający określony poprzez aktywność wygaszania rodników DPPH, którą wyrażono jako procent odbarwienia roztworu DPPH w porównaniu do próby kontrolnej (%AA) (rys.1) oraz stężenie przy którym uzyskuje się 50% aktywności (IC50) (rys.2). 3.3. Analiza statystyczna wyników Porównania statystyczne między rodzajami użytej wody do powyższych oznaczeń przeprowadzono przy użyciu programu Excel. Wszystkie dane wyrażano jako średnie wyników ± odchylenie standardowe (SD) zczterech powtórzeń i przedstawiono wformie wykresów (rys.1). 4. Wyniki badań Wszystkie ekstrakty (c=100%) charakteryzowały się stosunkowo wysoką aktywnością antyoksydacyjną, dlatego konieczne było przeprowadzenie analizy rozcieńczeń wstępnych, na podstawie których zostały oszacowane rozcieńczenia dające dopuszczalne wartości absorbancji. Z danych wynika, iż procent inhibicji dla ekstraktów przygotowanych zwody destylowanej osiąga wyższe wartości wporównaniu zekstraktami zwody filtrowanej i wodociągowej. Stosunkowo najmniejszy wpływ rodzaju użytej wody odnotowanodla ekstraktów zliści pokrzywy, natomiast największy dla naparów zkorzenia kozłka lekarskiego (rys.1). Spośród analizowanych próbek roślinnych najwyższą aktywność antyrodnikową odnotowano dla ekstraktów przygotowanych z płatków róży, dla których nawet w rozcieńczeniu 200-krotnym notowano nadal istotny potencjał antyoksydacyjny (rys.1). Podobnie wysoką aktywność stwierdzono dla ekstraktów z owoców dzikiej róży. Zróżnicowanie materiału badawczego wynikało zzamiaruzbadania wpływu zarówno gatunku rośliny na wartość potencjału antyoksydacyjnego(róża, pokrzywa, kozłek) jak również części anatomicznej rośliny (płatki iowoc róży). Zprzeprowadzonych badań wynika, iż część anatomiczna rośliny również wpływa na aktywność antyoksydacyjna przygotowanych z niej ekstraktów. Najniższą aktywnością charakteryzował się ekstrakt z korzenia kozłka lekarskiego, natomiast zdecydowanie wyższą aktywność odnotowano dla ekstraktów sporządzo- 180 Określenie wpływu rodzaju wody na potencjał antyoksydacyjny naparów z wybranych roślin ziołowych nych z naziemnych części roślin. Uzyskane wyniki dowodzą faktu, że naziemne części roślin, które narażone są na działanie promieni słonecznych wyposażone są w system ochronny przed szkodliwym promieniowaniem. Rysunek1.Wartości %AA dla ekstraktów zanalizowanych ziół wzależności od rodzaju wody oraz stężenia ekstraktu(c)[opracowanie własne] W dalszej części oceny uzyskanych wyników, wyznaczono wartości IC50 (rys.2). Parametr ten określa taką masę próbki, z której można otrzymać ekstrakt zawierający ilość antyoksydantów powodujących spadek początkowego stężenia rodnika DPPH o 50%. 181 Monika Staszowska-Karkut, Małgorzata Materska, Barbara Kulik, Robert Waraczewski Rysunek 2.Wartości IC50 dla poszczególnych ziół wzależności od rodzajuwody dla wybranych stężeń ekstraktów [opracowanie własne] Wartości IC50 uzyskane dla poszczególnych ekstraktów wskazują na najwyższą aktywność ekstraktów zpłatków róży, które niezależnie od rodzaju użytego rozpuszczalnika już przy naważce ok. 9mg powodowały spadek stężenia rodnika opołowę. W przedstawionych badaniach istotnie zaznaczył się wpływ użytej wody do ekstrakcji. W przypadku wody wodociągowej, potencjał antyoksydacyjny był na tyle niski, że należałoby zwiększyć naważkę wcelu otrzymania odpowiedniej wartości IC 50 dla badanego układu. Widoczna różnica pomiędzy otrzymanymi wynikami dla wody wodociągowej wodniesieniu do poszczególnych ziół może wynikać z różnorodności związków występujących wdanej roślinie, które mogą w odmienny sposób reagować zjonami zawartymi w wodzie. Należy także mieć na uwadze fakt, że jakość wody wodociągowej wprzeciągu czasu prowadzenia badań jest zmienna. 5. Podsumowanie Badania wpływu jakości rozpuszczalnika na wartość potencjału antyoksydacyjnego wskazują na zależność pomiędzy rodzajem użytej wody, z której otrzymano ekstrakty tych samych ziół. Stwierdzono również różnice pomiędzy częścią anatomiczną irodzajem analizowanych roślin ziołowych, a aktywnością antyoksydacyjną uzyskanych naparów. Najwydajniejszym ekstrahentem okazała się woda destylowana, natomiast części nadziemne roślin były bogatsze wzwiązki fenolowe. Najlepszym sposobem na otrzymanie wysoko aktywnych naparów wwarunkach domowych jest użycie wody przefiltrowanej. 182 Określenie wpływu rodzaju wody na potencjał antyoksydacyjny naparów z wybranych roślin ziołowych Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Ahmad N., Zuo Y., Lu X., Anwar F., Hameed S. Characterization of free and conjugated phenolic compounds in fruits of selected wild plants, Food Chemistry, 190 (2016), s. 80-89 Tete S., Nicoletti M., Saggini A., Maccauro G., Rosati M., Conti F., Cianchetti E., Tripodi' D., Toniato E., Fulcheri M., Salvini V., Caraffa A., Antinolfi P., Frydas S., Pandolfi F., Conti P., Potalivo G., Theoharides T. C. Nutrition and cancer prevention, International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 25/3 (2012), s. 573-581 Penzkofera M., Zieglerb E., Heuberger H. Contents of essential oil, valerenic acids and extractives indifferent parts of the rootstock of medicinal valerian(Valeriana officinalis L. s.l.), Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, 1 (2014), s. 98-106 Hattesohla M., Feistelb B., Sieversc H., Lehnfeld R., Heggera M., Winterhoff H. Extracts of Valeriana officinalis L. s.l. show anxiolytic and antidepressant effects but neither sedative nor myorelaxant properties, Phytomedicine, 15 (2008), s. 2-15 Circosta C., De Pasquale R., Samperi S., Pino A., Occhiuto F. Biological and analytical characterization of two extracts from Valeriana officinalis, Journal of Ethnopharmacology, 112 (2007), s. 361-367 Rutkowska J., Adamska A., Pielat M., Białek M. Porównanie składu iwłaściwości owoców dzikiej róży (rosa rugosa) utrwalanych metodami liofilizacji i suszenia konwencjonalnego, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 4/83 (2012), s.32-43 Demir N., O. Yildiz O., Alpaslan M., Hayaloglu A. A. Evaluation of volatiles, phenolic compounds and antioxidant activities of rose hip (Rosa L.) fruits in Turkey, LWT – Food Science and Technology, 57 (2014), s. 126-133 Upton R. Stinging nettles leaf (Urticadioica L.): Extraordinary vegetable medicine, Journal of herbal medicine, 3 (2013), s. 9-38 Gülçin Ì., Küfrevioˇglu Ö. Ì., Oktay M., Büyükokuroˇglu M. E. Antioxidant, antimicrobial, antiulcer and analgesic activities of nettle (Urtica dioica L.), Journal of Ethnopharmacology, 90 (2004), s. 205-215 Kuźma P., Drużyńska B., Obiedziński M. Optimization of extraction conditions of some polyphenolic compounds from parsley leaves (Petroselinum crispum), ActaSci Pol Technol Aliment, 13/2 (2014), s. 145-154 Zhou D., Chen Y., Ni D. Effect of water quality on the nutritional components and antioxidant activity of green tea extracts, Food Chemistry, 113 (2009), s. 110-114 Hallmann E., Ożga M., Rembiałkowska E. The content ofbioactive compounds in selected kind of coffee from organic and conventional production, Journal of Research and Applications in Agricultural Engineering, 55/3 (2010), s. 99-104 Zych I., Krzepiłko A. Measurement of total antioxidant capacity of selected antioxidants and infusions using DPPH radical reduction, ChemistryDidactics-Ecology-Metrology, 15/1 (2010), s.51-54 Grajeda-Iglesias C., Salas E., Barouh N., Baréa B., PanyaA., FigueroaEspinoza M. C. Antioxidant activity of protocatechuates evaluated by DPPH, ORAC, and CAT methods, Food Chemistry, 194 (2016), s. 749-757 Fadda A., Serra M., Molinu M.G., Azara E., Barberis A., Sanna D. Reaction time and DPPH concentration influence antioxidant activity and kinetic 183 Monika Staszowska-Karkut, Małgorzata Materska, Barbara Kulik, Robert Waraczewski parameters of bioactive molecules and plant extracts in the reaction with the DPPH radical, Journal of Food Composition and Analysis, 35 (2014), s. 112-119 16. Friaa O., Chaleix V., Lecouvey M., Brault D. Reaction between the anesthetic agent propofol and the free radical DPPH˙ in semiaqueous media: Kinetics and characterization of the products, Free Radical Biology and Medicine, 45 (2008), s. 1011-1018 17. Zhang Y., Shen Y., ZhuY., Xu Z. Assessment of the correlations between reducing power, scavenging DPPH activity and anti-lipid-oxidation capability of phenolic antioxidants, LWT – Food Science and Technology, 63 (2015), s. 569-574 18. Jabbari M., Jabbari A. Antioxidant potential and DPPH radical scavenging kinetics of water-insoluble flavonoid naringenin in aqueous solution of micelles, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 489 (2016) s. 392-399 Określenie wpływu rodzaju wody na potencjał antyoksydacyjny naparów zwybranych roślin ziołowych Streszczenie Rośliny ziołowe są bogatym źródłem naturalnych związków przeciwutleniających, które charakteryzują się wysoką aktywnością biochemiczną. Powszechnie wiadomo, że uzyskanie wysokiej efektywności ekstrakcji zależne jest od właściwości ekstrahowanych składników iużytych rozpuszczalników, oraz ich wzajemnej interakcji. Celem pracy było zbadanie wpływu jakości rozpuszczalnika na potencjał antyoksydacyjny ekstraktów przygotowanych zowoców ipłatków dzikiej róży, liści pokrzywy oraz korzenia kozłka lekarskiego. Wbadaniach użyto wody destylowanej, filtrowanej oraz wodociągowej. Do oceny aktywności przeciwutleniającej otrzymanych ekstraktów zastosowano metodę zużyciem wolnego stabilnego rodnika DPPH (1,1-difenylo-2pikrylohydrazyl). Otrzymane wyniki wskazują na zależność pomiędzy rodzajem wody, zktórej otrzymano ekstrakty tych samych ziół. Stwierdzono również różnice pomiędzy częścią anatomiczną irodzajem analizowanych roślin ziołowych, a aktywnością antyoksydacyjną uzyskanych naparów. Najwydajniejszym ekstrahentem okazała się woda destylowana, natomiast części nadziemne roślin były bogatsze wzwiązki fenolowe. Najlepszym sposobem na otrzymanie wysoko aktywnych naparów wwarunkach domowych jest użycie wody przefiltrowanej. Słowa kluczowe:potencjał antyoksydacyjny, jakość wody, ekstrakty ziołowe Determination of the effect of the type of water on the antioxidant capacity of selected herbal plant infusions Abstract Herbaceous plants are rich in natural antioxidant compounds which have a high biochemical activity. It is well known that the high efficiency of extraction depends on the properties of the extracted ingredients and solvents used, and their mutual interactions. The aim of the study was to investigate the effect of solvent quality on the antioxidant potential of extracts prepared from fruit and petals of wild rose, nettle leaves and valerian root. In the studydistilled water, tap water and filtered water were used. For the evaluation of the antioxidant activity ofobtained extracts the stable free radical DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) method were applied.Results indicate the relationship between the type of water which was used for extract preparation. The differences between the anatomy and the type of the analyzed herbaceous plants, and the antioxidant activity of obtained infusions were found.Additionally, the most efficient extractant was distilled water, and the above-ground parts of plants were enriched in phenolic compounds. Moreover, the best way to obtain highly active infusions inhome conditions is to use filtered water. Keywords: antioxidant potential, the quality of water, herbal extracts 184 Magdalena Kręcisz1, Karol Kupryaniuk2, Kamila Kasprzak3 Żurawina – charakterystyka i właściwości funkcjonalne 1. Wprowadzenie Owoce i warzywa stanowią istotny składnik codziennej diety. Zaliczają się one do grupy produktów charakteryzujących się niską kalorycznością, dużą zawartością witamin, składników mineralnych, węglowodanów, w tym włókna pokarmowego. Składniki te regulują procesy przemiany materii, które zachodzą w organizmie człowieka, a także chronią przed działaniem stresu oksydacyjnego. Zarówno owoce, jak i warzywa są źródłem tzw. „fitamin”, związków roślinnych, które, tak jak witaminy, nie są wytwarzane przez organizm człowieka i powinny być dostarczane wraz z pożywieniem [1]. Celem pracy jest przedstawienie charakterystyki oraz właściwości funkcjonalnych owoców żurawiny. Od wieków Indianie używali soku z żurawiny, jako środka odkażającego do przemywania ran oraz wyciągania toksyn pozostałych po zatrutych strzałach. Ponadto żurawinę wykorzystywano, jako środek leczniczy przy przeziębieniu, anginie, zapaleniach śluzówki jamy ustnej oraz problemach żołądkowo-jelitowych. Medycyna niekonwencjonalna wykorzystuje różne rodzaje roślin, aby chronić to co najcenniejsze – zdrowie człowieka. Wierząc w ogromną moc leków, często zapominamy o tym i nie doceniamy tego, co daje nam matka natura. Początek XX wieku to czas, gdy naukowcy rozpoczęli prace badawcze chcąc potwierdzić, bądź zaprzeczyć filozofii medycyny niekonwencjonalnej. Wyniki licznych badań naukowych, potwierdzają fakt, iż spożycie owoców i warzyw w codziennej diecie może zapobiegać chorobom serca, udarom, zawałom, a nawet powstaniu nowotworów [2, 3]. 1 [email protected], Katedra Inżynierii Procesowej, Wydział Inżynierii Produkcji, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie,www.up.lublin.pl 2 [email protected], Katedra Inżynierii Procesowej, Wydział Inżynierii Produkcji, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie,www.up.lublin.pl 3 [email protected], Zakład Chemii Nieorganicznej, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 185 Magdalena Kręcisz, Karol Kupryaniuk, Kamila Kasprzak 2. Pochodzenie oraz charakterystyka owoców żurawiny Żurawina jest wieloletnią, wiecznie zieloną krzewinką niskopienną z rodziny wrzosowatych (Ericaceae). Najdokładniej poznane są dwa z czterech gatunków tej rośliny: amerykańska żurawina wieloowocowa (Vaccinum macrocarpon) występującą na terenach kwaśnych Ameryki Północnej, Syberii i Europy oraz żurawina błotna (Vaccinum oxycoccus), występująca w Polsce na terenach podmokłych i bagiennych. Dziko rosnącą można spotkać na Pomorzu Zachodnim oraz w Puszczy Białowieskiej i Knyszyńskiej [4, 5, 6, 7]. Dopiero w XIX wieku, na dużą skalę zaczęto uprawiać żurawinę w Kanadzie (Quebec, British Columbia) i USA (Oregon, New Jersey, Massachusetts, Wisconsin, Washington) [4]. Doniesienia literaturowe wskazują, iż uprawa żurawiny w USA zajmuje ponad 16 000 ha, natomiast w 2004 roku zebrano ponad 300 000 ton owoców [8]. Rys. 1. Owoce żurawiny [9] Owoce żurawiny są kuliste, drobne, o cienkiej i gładkiej skórce (Rys.1). Mają czerwony lub czerwono-czarny kolor i charakteryzują się cierpkim i kwaśnym smakiem. Kwiaty żurawiny podobne są do dzioba żurawia (ang. crane), dlatego też Holenderscy i Niemieccy osadnicy nazwali owoc żurawiny „cran berry” (żurawia jagoda) [4, 6, 7]. Skład chemiczny jagód zależy od sposobu przechowywania, warunków pogodowych, rejonu uprawy oraz odmiany. Dojrzałe i świeże owoce zawierają około 88% wody, kwasy organiczne (cytrynowy, chinowy, ben-zoesowy, hipurynowy, jabłkowy, szikimowy, p-antyzowy, p-kumarowy), triterpeny (kwas ursolowy i oleanolowy), 4,2% cukru, 1,2% pektyn, składniki mineralne (sód – 20 ppm, wapń – 130 ppm, potas – 530 ppm, selen), witaminy A, B1, B2, C, E, antocyjaniny (malwidynę, cyjanidynę, peonidynę, glikozydynę, delfinidynę), flawonoidy (kemferol, kwercytynę), katechiny oraz cykliczne proantocyjanidy. W tabeli nr 1 przedstawiono podstawowy skład chemiczny różnych odmian żurawiny wielkoowocowej [3, 4, 6, 7]. 186 Żurawina – charakterystyka i właściwości funkcjonalne Tabela. 1. Skład chemiczny owoców 4 odmian żurawiny wielkoowocowej [7] Skład chemiczny Sucha masa [%] Kwasowość ogólna [g/100g] Ekstrakt [ºBrix] Cukry ogółem [%] Pektyny [%] Witamina C [mg/100g] Odmiana Bain Favourite 10,36 ± 0,08 Drewer Bean Lear Earli Richard 10,04 ± 0,06 13,71 ± 0,07 11,93 ± 0,25 2,66 ± 0,01 2,59 ± 0,01 2,18 ± 0,01 2,42 ± 0,01 7,25 ± 0,07 7,00 ± 0,00 9,40 ± 0,00 8,80 ± 0,00 3,41 ± 0,09 3,34 ± 0,07 5,72 ± 0,10 5,00 ± 0,06 0,83 ± 0,04 0,62 ± 0,06 1,37 ± 0,13 0,81 ± 0,19 5,46 ± 0,03 6,65 ± 0,18 14,35 ± 0,01 9,43 ± 0,18 Pektyny – estry metylowe kwasu poligalakturonowego – tworzą rozpuszczalną frakcję błonnika pokarmowego. Wywierają pozytywny wpływ na procesy metaboliczne oraz fizjologiczne organizmu, m.in. wykorzystując wiązanie metali. Doniesienia literaturowe wykazują, że pektyny posiadają indukcyjne zdolności wobec obniżenia dolegliwości występujących u osób chorujących na refluks żołądkowo-przełykowy czy apoptozy komórek nowotworowych. Z innych badań wynika, że pektyny zawarte w żurawinie Vaccinium oxtcoccos L. ujawniają przeciwzapalne właściwości w badaniach przeprowadzonych na myszach z zapaleniem jelita grubego [7]. 3. Zbiór owoców Żurawina jest wyjątkową rośliną, nie tylko pod względem właściwości zdrowotnych oraz smakowych, ale również z powodu, iż zbiory tej rośliny mogą odbywać się mokro (Rys.2). Tą techniką zbieranych jest około 95% owoców żurawiny. Metoda ta polega na zalaniu wodą upraw znajdujących się w zagłębieniu do wysokości około 45 cm. Kolejnego dnia jagody są odrywane od łodyg przy wykorzystaniu urządzenia water reel (trzepaczki do jaj). Owoce posiadają kieszenie powietrzne, dzięki temu wypływają na powierzchnię. Kolejnym etapem jest zgarnianie ich przy użyciu płaskiej taśmy tworzącej obręcz, a następnie przepompowywanie na przyczepę. Owoce zbierane tą metodą wykorzystywane są do produkcji suszonych owoców, soków oraz sosów [4, 5]. Termin zbiorów owoców rozpoczyna się w drugiej połowie sierpnia i trwa do pierwszej połowy listopada, zależny jest od warunków klimatycznych występujących w danym roku, które mają istotny wpływ na dojrzałość owoców – ich smak oraz barwę [4]. 187 Magdalena Kręcisz, Karol Kupryaniuk, Kamila Kasprzak Rys.2. Mokre zbiory żurawiny [10] Zbiór żurawiny zmieniał się na przestrzeni lat, początkowo owoce zbierano ręcznie. Następnie zaczęto używać narzędzi m.in. drewnianych łopatek, które przypominały duże grzebienie i służyły do zbioru jagód z łodyg. Obecnie przy suchym zbiorze owoców wykorzystuje się minikombajny posiadające zbiorniki na zebrane jagody. Uprawy tych owoców występują na dużych i zwartych powierzchniach, jednak owoce są bardzo delikatne, dlatego często są transportowane helikopterem, gdyż transport ciężarówkami mógłby powodować zniszczenie owoców. Żurawina zbierana tą metodą przeznaczona jest do sprzedaży jako świeże owoce [4]. Po zbiorze owoce oceniane są pod względem świeżości, wielkości oraz sprężystości. W celu usunięcia jagód o gorszej jakości wykorzystuje się separator żurawin pozwalający ocenić stopień ich sprężystości. Cechę tę odkrył John „Peg-Led” z New Jersy, który przypadkowo wysypał owoce na schody. Zauważył on, że po schodach odbijają się jagody tylko najbardziej jędrne [4]. 4. Właściwości prozdrowotne owoców żurawiny Owoce żurawiny stanowią wartościowy składnik diety, od wieków znane są przez Indian i stosowane w medycynie ludowej m.in. na przeziębienie, jako lekarstwo na koklusz, szkorbut, gościec, schorzenia takie jak problemy żołądkowo-jelitowe, zapalenie śluzówki jamy ustnej, anginę, zapalenie układu moczowego i wiele innych chorób [4, 6]. 4.1. Działanie przeciwbakteryjne 188 Żurawina – charakterystyka i właściwości funkcjonalne Infekcje dróg moczowych, zazwyczaj cewki moczowej i pęcherza moczowego to dolegliwości objawiające się wzmożonym parciem na pęcherz, bólem oraz pieczeniem w czasie oddawania moczu. Na to zakażenie najbardziej narażone są kobiety, mężczyznom przypadłość na to schorzenie zdarza się o ok. 8 razy rzadziej. Według statystyk co trzecia kobieta chociaż raz w życiu przechodzi infekcję dróg rodnych, spowodowane jest to poprzez kolonizację nabłonka przez bakterie Escherichia coli. Szczepy wyposażone są w rzęski typu P, które umożliwiają adhezję tych bakterii do komórek nabłonka dróg moczowych [2]. Wpływ owoców żurawiny na infekcje układu moczowego wg. Blatherwicka powiązany jest ze zdolnością jagód do zakwaszania moczu, co prowadzi do śmierci bakterii. Inne źródła zakładają, że proantocyjanidyny oraz inne związki chemiczne występujące w żurawinie mają właściwości antyseptyczne, które powodują degradację bakterii [3]. W pierwszej połowie XX w. przeprowadzono badania moczu dwóch zdrowych pacjentów, którzy spożywali suszoną żurawinę oraz śliwki. Wykazano, że spożycie tych owoców powoduje obniżenie pH moczu, ma nieistotny wpływ na zawartość fosforanów, powoduje znaczne zwiększenie poziomu kwasu hipurowego oraz kwasów organicznych, zmniejszenie zawartości azotu oraz większe wydalanie amoniaku. Inne badania, przeprowadzone na grupie sześciu mężczyzn (22-27 lat) spożywających od 100 do 300 g żurawiny wykazują wzrost zawartości kwasu hipurowego, kwasów organicznych, jonu amonowego, jonów wodorowych oraz kwasowości w moczu. Dodatkowo zaobserwowano, że ilość spożywanych owoców jest proporcjonalna do zawartości kwasu hipurowego występującego w moczu. Spożycie do 4 litrów koktajlu z żurawin składającego się z soku oraz wody w proporcji 1:2 wpływało na zmiany w pH moczu od +0,1 do -0,5. Próby moczu nie wykazywały aktywności w stosunku do E. coli. Nierozcieńczony świeży koktajl z żurawiny zawierający sok, witaminę C oraz fruktozę obniżał adherencję bakterii min. w 97%, natomiast rozcieńczony w stosunku 1:100 do około 30%. Poszczególne składniki wchodzące w skład koktajlu żurawinowego badano ze względu na ich aktywność wobec bakterii. Witamina C, askorbinian sodu oraz kwas askorbinowy nie miały istotnego przeciwdziałania adherencyjnego. Fruktoza o stężeniu 0,02-0,20 g/ml posiadała minimalne właściwości. Świeży koktajl powodował zmniejszenie przyczepności bakterii o około 75%. Badania wykazały, że sok z żurawiny może wpływać na zmniejszenie adherencji bakterii do komórek nabłonka [3]. Infekcja dróg moczowych jest schorzeniem cechującym się częstymi nawrotami. Z doniesień literaturowych wynika, że spożycie dzienne 300 ml soku żurawinowego zmniejsza częstotliwość nawrotów zakażenia nawet o 42%. Systematyczne spożycie owoców żurawiny zmniejsza konieczność stosowania antybiotyków przy infekcji dróg moczowych. Na rynku występuje wiele produktów farmaceutycznych zawierających proszek, 189 Magdalena Kręcisz, Karol Kupryaniuk, Kamila Kasprzak ekstrakt bądź zagęszczony sok żurawinowy. Preparaty te wykazują dużą skuteczność w leczeniu zakażenia dróg moczowych [2]. 4.2. Terapia infekcji Helicobacter pylori Infekcja Helicobacter pylori jest istotnym czynnikiem związanym z ryzykiem choroby wrzodowej, a także stanowi zagrożenie rozwoju nowotworów żołądka. Z doniesień literaturowych wynika, że w klasycznym leczeniu pacjentów z Hp (amoksycylina, klarytromycyna i omeprazol) spożycie dwa razy w ciągu dnia 250 ml soku żurawinowego przyczynia się, wprawdzie tylko u kobiet do zwiększenia o około 15% znamiennej częstości eradykacji porównując do pacjentów nie spożywających soku. Zostało potwierdzone, że zawarte w żurawinie związki proantocyjanidynowe zmniejszają zdolność mikroorganizmów Candida albicans, Helicobacter pylori, Porphyromonas gingivalis, Campylobacter jejuni do przyczepności i zagnieżdżania w nabłonkach błon śluzowych narządów efektorowych. Informacje te wymagają kolejnych badań, podobnie jak obserwacje o zapobieganiu chorobom przyzębia oraz formowania się płytki nazębnej pod wpływem proantocyjanidyn [11]. 4.3. Działanie przeciwwirusowe Z doniesień literaturowych wynika, że spożycie soku żurawinowego wpływa na bakteriofagi T4 i T2 oraz małpiego wirusa SA-11. Sok z owoców żurawiny V. macrocarpon zmniejszał zakażalność bakteriofagu T4 w T0 (jest to czas po wymieszaniu próbki) w ok. 92%, natomiast bakteriofagu T2 w 100%. Szybkie hamowanie sugeruje, iż badany sok obniża replikację wirusa w początkowym jego stadium. Zależność ta widoczna jest zarówno w wyższej (23ºC), jak i niższej (4ºC) temperaturze (dla bakteriofagu T4). Obserwacje te były przeprowadzone dla różnych poziomów rozcieńczonego soku z żurawiny. Hamowanie zakażalności jest widoczne jedynie do poziomu rozcieńczenia soku wynoszącego 0,01%. Użycie mikroskopu elektronowego pozwoliło zaobserwować hamowanie przyłączenia fagów do E.coli (bakterii-żywicieli). Doniesienia literaturowe wykazują również wpływ soku z żurawiny na rotawirusa. Nie zaobserwowano u wirusa charakterystycznych okrągłych cząstek na komórkach MA104, co świadczyło o zmniejszeniu replikacji i wnikania wirusów do komórek żywiciela. Aktywność ta została potwierdzona stopniem inhibicji hemaglutynacji czerwonych krwinek. Całkowite zahamowanie hemaglutynacji występowało w przypadku stosowania soku o stężeniu min. 20%. Inne badania przedstawiają wpływ NDM (ang. nondialyzable material) na aktywność wirusa grypy, w których wystąpiło obniżenie hemaglutynacji czerwonych krwinek przez wszystkie zbadane szczepy wirusa [11]. 190 Żurawina – charakterystyka i właściwości funkcjonalne 4.4. Działanie antyoksydacyjne Liczne badania wykazały, że flawonoidy zawarte w owocach żurawiny posiadają właściwości antyoksydacyjne. Redukują stężenie molekuł adhezyjnych, zmniejszają tworzenie krążących oksydowanych lipoprotein, zapobiegają utlenianiu cholesterolu, w wyniku czego zmniejszają ryzyko powstania zmian miażdżycowych w naczyniach, a przez to występowanie choroby wieńcowej. Inne badania wskazują pozytywny wpływ na rozszerzanie naczyń krwionośnych w wyniku zwiększonej syntezy NO. Kolejni badacze wykazali, że antocyjanidyny pochodzące m.in. z żurawiny działają hamująco na stres antyoksydacyjny w komórkach dopaminergicznych, który związany jest z zagrożeniem rozwoju chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona [11, 12, 13]. Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym u kobiet. Z doniesień literaturowych wynika, że ekstrakty otrzymane z żurawiny hamują wzrost linii komórkowych raka piersi MCF-7 przy dawkach 2,5-30 mg/ml. Związki bioaktywne zawarte w owocach żurawiny hamują wzrost raka prostaty, a także linii komórkowych androgenozależnych typu LNCaP oraz androgen niezależnych typu DU145 [14, 15]. Inne badania dowiodły występowanie w żurawinie estrów triterpenoidowych (izomerów cis-1- i trans-2- kwasu 3-O-p-hydroksycynamonowoursolowego). Związek ten w badaniach in vitro charakteryzował się wysoką aktywnością przeciwnowotworową. Sam kwas ursolowy posiada liczne właściwości biologiczne, m.in. działanie przeciwbakteryjne, przeciwbólowe, przeciwwirusowe, grzybobójcze, przeciwcukrzycowe, przeciwnowotworowe, a także moduluje układ krwionośny i immunologiczny oraz zmniejsza stężenie cholesterolu we krwi. Doniesienia literaturowe podają, że żurawina może korzystnie wpływać w profilaktyce i leczeniu raka prostaty, piersi, a także często spotykanych i groźnych linii nowotworowych, m.in. raka płuc, jamy ustnej, jelita czy białaczki [2]. 5. Wzbogacanie żywności Owoce żurawiny są popularnym surowcem stosowanym w przetwórstwie żywności, wytwarza się z nich m.in. soki, syropy, susze, dżemy, konfitury i galaretki [16, 17]. Rosnąca świadomość konsumentów o spożywaniu większej ilości warzyw i owoców oraz zwiększone zapotrzebowanie na żywność funkcjonalną skłaniają producentów żywności dociągłego poszukiwania nowych i atrakcyjnych produktów [18]. Coraz większą popularnością cieszą się przekąski warzywne oraz owocowe, które nie są smażone, lecz suszone, ekstrudowane, pieczone, ekspandowane oraz zawierają składniki prozdrowotne [18]. 191 Magdalena Kręcisz, Karol Kupryaniuk, Kamila Kasprzak 6. Podsumowanie Owoce żurawiny są kuliste, drobne o cienkiej i gładkiej skórce. Mają czerwony lub czerwono-czarny kolor i charakteryzują się cierpkim i kwaśnym smakiem. Skład chemiczny jagód zależy od sposobu przechowywania, warunków pogodowych, rejonu uprawy oraz odmiany. Dojrzałe i świeże owoce zawierają około 88% wody, kwasy organiczne, triterpeny, cukier, pektyny, składniki mineralne (sód, wapń, potas, selen), witaminy A, B1, B2, C, E, antocyjaniny, flawonoidy. Dzięki temu owoce żurawiny są idealnym surowcem do produkcji tzw. żywności funkcjonalnej i mogą być stosowane w profilaktyce infekcji dróg moczowych, przeciwnowotworowej, przeciwzapalnej. Konsumenci coraz większą uwagę poświęcają żywności, wybierają produkty nie tylko zaspokajające głód, lecz także wnoszące cenne składniki odżywcze i pozytywnie wpływające na zdrowie. Racjonalne odżywianie pozwala na zapobieganiewielu chorobom cywilizacyjnym. Zwiększające się potrzeby konsumentów oraz trendy w spożyciu żywności zmuszają producentów oraz naukowców do poszukiwania i wprowadzania nowych wartościowych owoców, które zawierają substancje zwiększające wartość odżywczą wytworzonej żywności. Literatura Gheribi E. Związki polifenolowe w owocach i warzywach, Medycyna Rodzinna, 4 (2011), s. 111-115 2. Stobnicka A., Gniewosz M. Możliwość wykorzystania właściwości żurawiny (Oxycoccus) we współczesnej medycynie, Postęp Fizjoterapii, 3 (2010), s. 170-175 3. Gryszczyńska A., Żurawina amerykanska (Vacciniummacrocarpon) – lek na problemy urologiczne. Urologia – nauka i praktyka, 11/5 (63) (2010), s. 31-40 4. Górecka A., Amerykańska żurawina unikalne zbiory i właściwości zdrowotne, Przemysł Spożywczy, 12 (2006), s. 35-37 5. Bogacz K., Żurawina dla smaku i zdrowia, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 4 (2010), s. 22-24 6. Stobnicka A., Gniewosz M., Miętuszewska A. Przeciwbakteryjne działanie soków owocowych z żurawiny, rokitnika, noni i goji, Bromat. Chem. Toksykol., XLIV 3 (2011), s. 650-655 7. Teleszko M., Żurawina wielkoowocowa – możliwości wykorzystania do produkcji biożywności, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (79) (2011), s. 132-141 8. Wolski J. K., Wykorzystanie właściwości żurawiny w zakażeniach układu moczowego, Przegląd Urologiczny, 36, 7/2 (2006), s. 96-98 9. http://www.dobra-rada.pl/miesiac-zurawiny-jak-swietuja-go-amerykanie_2544 [29.03.2016] 10. http://www.crazynauka.pl/wygladaja-zbiory-zurawiny/zurawiny12/[29.03.2016] 11. Bazylko A., Kozłowska-Wojciechowska M. Wpływ polifenoli z żurawiny na zdrowie człowieka, Czynniki Ryzyka, 4 (2007), s. 57-61 12. Duthie S. J., Jenkinson A. M., Crozier A., Mullen W., Pirie L., Kyle J., Yap L.S ., Christen P., Duthie G. G. The effects of cranberry juice consumption on 1. 192 Żurawina – charakterystyka i właściwości funkcjonalne 13. 14. 15. 16. 17. 18. antioxidant status and biomarkers relating to heart disease and cancer in healthy human volunteers, Eur. J. Nutr., 45 (2) (2006), s. 113-122 Ruel G., Pomerleau S., Couture P., Lamarche B., Couillard C. Changes in plasma antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men after shortterm cranberry juice consumption, Metabolism, 54 (2005), s. 856-861 Sun J., Liu R. H. Cranberry phytochemical extracts induce cell cycle arrest and apoptosis in human MCF-7 breast cancer cells, Cancer Letters, 241 (2006), s. 124-34 Ferguson P. J, Kurowska E., Freeman D. i wsp. Cranberry constituents and prostate cancer cell growth, J Nutr.,133 (2003), s.3843-50 Krzewińska D., Jóźwiak Z., Smolarz K. Wstępne wyniki badań z przechowywania owoców żurawiny wielkoowocowej (Viccinium mascrocarpon Ait.) nawożonych różnymi dawkami azotu, Zeszyty Naukowe Instytutu Sadownictwa i Kwiaciarstwa, 15 (2007), s. 55-62 Michalczyk M., Macura R., Złobiecki A. Zmiany jakości przechowywanych syropów z owoców żurawiny (Vaccinium oxycoccus L.) i brusznicy (Vaccinium vitis-idea L.) otrzymanych różnymi metodami, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (55) (2007), s. 116-126 Janowicz M., Kowalska H., Lenart A. Przyszłość przekąsek owocowych i warzywnych, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 2 (2012), s. 9-10 Żurawina – charakterystyka i właściwości funkcjonalne Streszczenie Żurawina jest wieloletnią, zimozieloną rośliną z rodziny wrzosowatych. Owoce żurawiny są kuliste, drobne o cienkiej i gładkiej skórce. Ze względu na atrakcyjną barwę oraz charakterystyczny lekko cierpki smak, znalazły zastosowanie w potrawach i produktach spożywczych. Z żurawiny przygotowuje się m.in. soki, dżemy, konfitury, sosy, napoje. Przetwory z tych owoców są doskonałym i wykwintnym dodatkiem do mięs i pasztetów. W sklepach dostępne są zarówno owoce świeże, suszone, mrożone, a także szeroka gama produktów spożywczych, w których żurawina jest głównym bądź dodatkowym składnikiem. Owoce żurawiny wykorzystywane są jako środek leczniczy przy zapaleniach śluzówki jamy ustnej, anginie, przeziębieniu, reumatyzmie, bólach głowy oraz problemach żołądkowo-jelitowych. Słowa kluczowe:żurawina, żywnośćfunkcjonalna Cranberry – characteristics and functional properties Abstract Cranberry is a perennial evergreen plant of the heath family.Cranberries are spherical, small, thin and smooth-peel.Due to the attractive color and characteristic slightly bitter taste, have been used in the food and food products.Cranberriesare the main component for preparation drinks and many others e.g. juices, jams, preserves, sauces, drinks.Preserves made with these fruits are excellent and exquisite addition to meats and pates.Cranberries are available in both fresh fruits, dried, frozen, and a wide range of food products, in which the cranberry is the main or additional component.Cranberries are used as a therapeutic agent in inflammation of the oral mucosa, colds, rheumatism, headache and gastrointestinal problems. Keywords: Cranberry, functional food 193 Joanna Fabrowska1, Bogusława Łęska Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic 1. Wstęp Związki biologicznie czynne pochodzenia naturalnego są obecnie bardzo cenionym surowcem w przemyśle medycznym, farmaceutycznym, kosmetycznym, jak również spożywczym. W dobie szybkiego życia, stresu i niebezpiecznych chorób cywilizacyjnych jest to związane ze wzrastającą świadomością społeczeństwa w zakresie dbania o swoje zdrowie, a także o wygląd zewnętrzny. Ponadto, surowce naturalne przeżywają aktualnie swój renesans, gdyż są powszechnie uważane za bardziej bezpieczne i skuteczne. Z tego względu stale poszukiwane są nowe substancje bioaktywne o wielokierunkowym, coraz efektywniejszymdziałaniu. Jednymi z powszechnie wykorzystywanych związków biologicznie czynnych we współczesnej medycynie, czy też kosmetologii, są siarczanowe polisacharydy występujące w glonach. Do tej grupy związków należą również ulvany – polisacharydy siarczanowe, charakterystyczne dla zielenic, wykazujące szeroki wachlarz aktywności biologicznej. Ich działanie obejmuje m.in. właściwości antyoksydacyjne, immunostymulujące, antykoagulacyjne, przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe i wiele innych. Ulvany są w najmniejszym stopniu przebadane i wykorzystywane spośród innych siarczanowych polisacharydów glonowych, takich jak fukoidany i karageniany. Praca ta ma na celu scharakteryzowanie ulvanów, począwszy od ich budowy, poprzez metody ekstrakcji i analizy, aż do aktywności biologicznej i potencjalnego zastosowania. Przybliżenie informacji na temat tej grupy polisacharydów siarczanowych, które są jeszcze mało poznanymi substancjami, pozwoli na wskazanie ich potencjału jako nowych, skutecznych surowców biologicznie czynnych, o szerokich możliwościach wykorzystania. 2. Siarczanowe polisacharydy Polisacharydy (poliwęglowodany, wielocukry) są bardzo obszerną grupą związków organicznych powstających w procesach metabolicznych organizmów żywych. Jako metabolity pierwotne pełnią wiele istotnych 1 [email protected], Zakład Chemii Supramolekularnej, Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu 194 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic funkcji w organizmach, przede wszystkich stanowią główne substancje budulcowe i zapasowe komórek roślinnych i zwierzęcych. Zbudowane są z wielu (od 10 do 30000) jednostek cukrów prostych, tworzą rozbudowane struktury o wysokiej masie cząsteczkowej zwane biopolimerami [1]. Poszczególne jednostki cukrowe w obrębie polisacharydów są połączone wiązaniami glikozydowymi. Łańcuchy poliwęglowodanów mogą być proste lub rozgałęzione [2]. Wyróżnia się polisacharydy obojętne oraz kwaśne gdy w ich skład wchodzą reszty kwasowe, takie jak grupy siarczanowe i kwasy uronowe [1]. Właściwości fizykochemiczne polisacharydów są znacząco odmienne od właściwości cukrów prostych i oligosacharydów (cukrów złożonych z 2 do 10 cząsteczek cukrów prostych). Wielocukry wykazują znacznie mniejszą rozpuszczalność w wodzie w stosunku do cukrów prostych, ponieważ wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej maleje ich rozpuszczalność. Związki te nie wykazują również tak słodkiego smaku, jak ma to miejsce w przypadku węglowodanów prostych [1]. Ponadto polisacharydy są higroskopijne i tworzą z wodą koloidy (hydrozole) [2]. Za właściwości higroskopijne tych substancji odpowiedzialne są międzycząsteczkowe i wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe. Im więcej wiązań wodorowych w cząsteczkach policukrów, tym słabsza jest ich higroskopijność, a także rozpuszczalność w wodzie [3]. Siarczanowe polisacharydy (ang. sulfated polysaccharides – SPs) należą do wspomnianej grupy polisacharydów kwaśnych, zawierających grupy siarczanowe w swoich cząsteczkach. Substancje te występują w dużych ilościach w ścianach komórkowych glonów, przez co często są także nazywane kwaśnymi polisacharydami glonowymi [1]. Jest to bardzo złożona grupa związków o skomplikowanej budowie, wykazująca różnorodną aktywność biologiczną. Biorąc pod uwagę trzy grupy glonów, tj. brunatnice (Phaeophyceae), krasnorosty (Rhodophyta) i zielenice (Chlorophyta), wyróżnia się siarczanowe polisacharydy specyficzne dla każdej z tych grup. Brunatnice charakteryzują się wysoką zawartością fukoidanów,należących do grupy SPs. Fukoidanyzbudowane są najczęściej z merów fukozy, jak również ramnozy, galaktozy, ksylozy, glukozy i kwasów uronowych [4]. Związki te zbudowane są przede wszystkim z reszt 4-O-siarczanu fukopiranozy połączonych wiązaniami(1→2) [5]. Do fukoidanów zaliczane są fukany występujące w gatunku Fucusvesiculosus, galaktofukany obecne w Sargassum sp.,czy też laminarany izolowane z Laminaria sp. Fukany są zbudowane m.in. z cząsteczek fukozy, ksylozy i galaktozy w połączeniach (1,3)- lub (1,4)-α-L-fukozy. Galaktofukany najczęściej zawierają cząsteczki galaktozy, ramnozy i fukozy oraz wiązania (1,6)-β-D-galaktozy. Natomiast laminarany są polimerami zbudowanymi zwykle z glukozy i fukozy z charakterystycznym wiązaniem (1,3)- i (1,6)-β-glukozy. Budowa przykładowego fukoidanu jest przedstawiona na Rysunku 1. Fukoidany są 195 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska związkami biologicznie czynnymi o szerokim spektrum działania. Działają m.in. przeciwzapalnie, antyoksydacyjnie, przeciwzakrzepowo, antyproliferacyjnie, immunostymulująco i przeciwnowotworowo [4]. W kosmetyce wykorzystywane jest działanie antycellulitowe tych substancji, z uwagi na stymulację komórkowej przemiany materii i ukrwienia skóry, a także właściwości lipolityczne [2]. Fukoidany poprawiają również wchłanianie makro- i mikroelementów, witamin i peptydów przez naskórek [1]. W porównaniu z innymi siarczanowymi polisacharydami fukoidany są najbardziej rozpowszechnione na rynku jako surowce wykorzystywane w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, jak również w medycynie [6]. Rysunek 1. Budowa fukoidanu wyizolowanego z Fucusvesiculosus [5] Galaktany, a wśród nich karageniany i agarany, są z kolei siarczanowymi polisacharydami charakterystycznymi dla alg czerwonych (krasnorostów). Związki te są zbudowane z galaktopiranoz, tj. cyklicznych form D- i L-galaktozy. Karageniany występują w postaci α-glikozydowych połączeń 4-siarczanu-D-galaktozy (jako λ-karagenina) oraz β-glikozydowych połączeń 4-siarczanu-D-galaktozy i α-glikozydowych 3,6-anhydro-Dgalaktozy (χ-karagenina) [2]. Istnieje jeszcze wiele innych rodzajów karagenianów, jak np.: λ (Rysunek 2), µ, θ i κ [5]. Polisacharydy z grupy karagenianów charakteryzują się specyficznymi właściwościami reologicznymi. Jako naturalne hydrokoloidy ulegają w wodzie hydratacji i pęcznieniu, tworząc roztwory koloidalne i żele [1]. Źródłem karagenianów są m.in. krasnorosty Chondrus crispus [4]. Natomiast charakterystycznym cukrem budującym agarany jest galaktoza, częściowo zestryfikowana kwasem siarkowym. Do tej grupy zaliczany jest agar izolowany z glonów Euchemua sp., Gracilaria sp. i Gelidium sp. [2], a także porfyran występujący m.in. w gatunku Porphyra capensis [5]. Typowy porfyran jest zbudowany z połączeń 3-β-D-galaktozy oraz 6-siarczanu-α-L-galaktozy lub 196 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic 3,6-anhydro-α-L-galaktozy występujących naprzemiennie [5]. Agarany podobnie jak karageniany wykazują zdolność do tworzenia żeli. Galaktany cechują się różnorodną aktywnością biologiczną, np. przeciwwirusową, przeciwbakteryjną, immunostymulującą, przeciwzakrzepową i przeciwnowotworową [4]. Związki z tej grupy są cenionymi surowcami kosmetycznymi przede wszystkim z uwagi na ich właściwości żelotwórcze. Karageniany i agarany sąpowszechnie wykorzystywane jako środki emulgujące, zagęszczające i stabilizatory, zarówno w przemyśle kosmetycznym jak i spożywczym [6]. Dodatkowo karageniany są stosowane w kosmetyce jako substancje nawilżające, ochronne i łagodzące podrażnienia [1]. Rysunek 2. Budowa λ-karagenianu [5] Ulvany są natomiast siarczanowymi polisacharydami izolowanymi z zielenic. W porównaniu do innych SPs, ulvany są najsłabiej poznaną tego typu grupą związków. Według bazy Web of ScienceTM w ostatnim dziesięcioleciu (dane z dnia 11.03.2016 r.) ukazały się 122 artykuły na temat ulvanów, podczas gdy odnośnie fukoidanów jest dostępnych 1576 publikacji, natomiast o karagenianach – aż 20144 [7]. Brakuje także handlowo dostępnych surowców na bazie ulvanów, a jeśli już takowe występują, to jest ich bardzo mało w stosunku do fukoidanów i galaktanów. Okazuje się jednak, że ulvany stanowią równie interesującą grupę związków bioaktywnych. Głównymi składnikami ulvanów są glukoza, ramnoza, ksyloza, jak również kwas glukuronowy i iduronowy. W swoich cząsteczkach ulvany zawierają w mniejszych ilościach mannozę, arabinozę, czy też galaktozę [8]. Jak dotąd ulvanybyły izolowane wyłącznie z morskich gatunków Ulva sp. [9, 10]. Przeprowadzone w ostatnim czasie badania wskazują także na obecność ulvanów w słodkowodnych zielenicach Ulva flexuosa, a także Cladophora glomerata [11]. Podobnie jak inne związki z grupy SPs ulvany charakteryzują się różnorodnymi właściwościami jako substancje bioaktywne. Wykazano m.in. aktywność antyoksydacyjną, antyadhezyjną, antyproliferacyjną i przeciwnowotworową ulvanów [4-6]. Ulvany stanowią obiecującą grupę substancji bioaktywnych, nad którą warto prowadzić badania. 197 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska 3. Budowa i właściwości ulvanów Nazwa „ulvany” została po raz pierwszy zaproponowana przez Lahaye i Axelos w 1993 roku [12]. Związki te były jak dotąd izolowane z różnych morskich gatunków Ulva, takich jak: U. lactuca [13], U. rigida [14], U. armoricana, U. rotundata, U. scandinavica, U.olivascens, U. gigantea [15], U. clathrata [9], U. conglobate [10], U. fasciata [16], U. pertusa [13], czy też U. flexuosa [17]. Budowa ulvanów jest niezwykle złożona i jak dotąd nie określono jej jeszcze w sposób jednoznaczny. Jedne z pierwszych badań nad strukturą ulvanów wyizolowanych z Ulva lactuca przeprowadzono w 1954 roku, stwierdzono wówczas, że ulvany są siarczanowymi polisacharydami zbudowanymi z cząsteczek glukozy i ramnozy [13]. Kolejne prace kontynuowane nad ulvanami wykazały, że także kwasy uronowe, arabinoza, ksyloza i kwasy glukuronowe mogą być składnikami tych polisacharydów [14]. Dziś wiadomo, że ulvany są głównie zbudowane z powtarzających się merów 3-siarczanu ramnozy połączonychwiązaniem (1,4)-α-glikozydowymz kwasem glukuronowym, bądź też iduronowym [12] (Rysunek 3). Skład monosacharydów i sposób ich połączenia w ulvanach jest bardzo różnorodny i zmienny w zależności od wielu czynników: gatunku glonów [15, 18], środowiska występowania [15], warunków środowiskowych i pory roku [18], a także od zastosowanej metody ekstrakcji [19]. Fakt ten znacząco utrudnia analizę ulvanów i wymaga ciągłej kontroli jakości tych związków. Rysunek 3. Budowa ulvanów (R-ramnoza, G-kwas glukuronowy, I-kwas iduronowy) [opracowanie własne] Właściwości fizykochemiczne ulvanów są podobne jak większości polisacharydów. Są to substancje półkrystaliczne barwy białej, o właściwościach higroskopijnych [20], rozpuszczalne w gorącej wodzie i w roztworach alkaliów [21]. Po ostudzeniu w wodzie pęcznieją tworząc żele. Mechanizm tworzenia żelu przez ulvany jest bardzo złożony i nie do końca 198 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic poznany. Niemniej jednak określono pewne warunki, w których powstaje żel: obecność kwasu borowego i dwuwartościowego kationu, np. Ca2+, oraz pH o wartości od 7,5 do 8 [22]. W normalnych warunkach ulvany posiadają strukturę liniową. Natomiast w obecności kwasu borowego i dwuwartościowego kationu tworzą struktury sferyczne o średnicy ok. 10 nm. Poszczególne struktury sferyczne mogą ze sobą asocjować tworząc agregaty przypominające wyglądem owoc maliny o średnicy od 500 do 1200 nm. Następnie zgrupowania agregatów łączą się poprzez liniowe włókna, którymi mogą być łańcuchy białek, glukuronian lub ulvany, które nie utworzyły form sferycznych. W ten sposób powstaje trójwymiarowa struktura, w obrębie której możliwe jest osadzenie kationu metalu i jego skompleksowanie pomiędzy poszczególnymi strukturami sferycznymi ulvanów [23]. Za chelatowanie jonów metali są odpowiedzialne oddziaływania pochodzące od grup siarczanowych i karboksylowych obecnych w tego rodzaju polisacharydach siarczanowych [8]. 4. Metody ekstrakcji ulvanów Niezależnie od rodzaju rozpuszczalnika wybranego do ekstrakcji ulvanów, wstępnym etapem procesu izolacji jest wyodrębnieniesubstancji lipidowych oraz barwników asymilacyjnych (chlorofile, karotenoidy) z biomasy glonów. Do tego celu wykorzystywane są różne rozpuszczalniki organiczne, takie jak: aceton, dichlorometan, etanol, metanol, czy chloroform [20, 21, 24, 25]. Etap ten pozwala na wstępne oczyszczenie biomasy z substancji hydrofobowych oraz pigmentów, aby następnie przejść do ekstrakcji substancji hydrofilowych, jakimi są polisacharydy. Wykorzystując fakt, że ulvany są związkami dobrze rozpuszczalnymi w wodzie, najczęściej stosowaną metodą izolacji tych związków jest ekstrakcja gorącą wodą [20, 24]. Proces ten jest przeprowadzany w wodzie o temperaturze 75-85 ºC przez kilka godzin [20, 25]. Ulvany mogą być również ekstrahowane roztworami alkaliów, jak np. węglanem sodu [21], a także kwasów [24]. Inną metodą izolacji ulvanów jest ekstrakcja z dodatkiem substancji chelatujących jony wapnia, takich jak EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) i szczawian amonu [9, 24]. Zastosowanie środków chelatujących jony wapnia ułatwia ekstrakcję ulvanów poprzez niszczenie wiązań chemicznych utworzonych przez ulvany w obecności jonów Ca2+ wewnątrz ściany komórkowej glonów [24]. Kolejnym etapem po ekstrakcji ulvanów jest ich oczyszczanie z innych substancji rozpuszczalnych w wodzie, które mogły zostać wyekstrahowane razem z ulvanami. Do tych związków należą m.in. aminokwasy, proteiny i peptydy. Ekstrakt po izolacji ulvanów może zawierać również inne polisacharydy, takie jak skrobia, ponieważ zarówno ulvany, jak i substancje skrobiowe są składnikiem ścian komórkowych glonów [21]. W celu usunięcia substancji zanieczyszczających ulvany stosuje się hydrolizę enzymatyczną z wykorzystaniem α-amylazy, która hydrolizuje skrobię oraz 199 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska proteinazy K, która z kolei hydrolizuje proteiny [20, 25, 26]. Inne kontaminanty, jak np. barwniki asymilacyjne, czy związki lotne odpowiadające za specyficzny zapach glonów, mogą być efektywnie usuwane z użyciem węgla aktywnego [21]. W celu wytrącenia ulvanów z roztworu wodnego stosowane są rozpuszczalniki organiczne, najczęściej jest to etanol lub aceton [21, 25]. Jednocześnie czynność ta pozwala na oddzielenie ulvanów od niskocząsteczkowych związków rozpuszczalnych w etanolu, jak również pozostałości pigmentów [21]. Ostatnim etapem jest suszenie wytrąconych ulvanów. Efektywną metodą w tym przypadku jest liofilizacja, a także suszenie w niskiej temperaturze lub w próżni [27]. Niska temperatura stosowana w tych metodach zapewnia zachowanie stabilności ulvanów, a co za tym idzie – pozwala na utrzymanie cennych właściwości tych substancji. 5. Metody analizy ulvanów Analiza ulvanów stanowi bardzo ważny aspekt w ich badaniach. Jako, że budowa tych związków nie została jeszcze dokładnie sprecyzowana ze względu na jej zmienność w zależności od wielu czynników [15, 18, 19], analiza ulvanów jest bardzo trudnym zagadnieniem i wymaga wiele pracy. Jednak jest to niezbędny etap w toku procesu analitycznego pozyskiwania ulvanów z zielenic. W analizie ulvanów wykorzystywane są różne techniki instrumentalne. Jedną z najbardziej użytecznych i najczęściej wykorzystywanych metod jest technika NMR, czyli spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego. W badaniach polisacharydów wykorzystywana jest zarówno analiza 1 H NMR, jak i 13C NMR. Metoda ta jest stosowana zarówno do identyfikacji ulvanów, jak i do badania ich struktury poprzez określenie sposobu rozmieszczenia atomów w cząsteczce. Dlatego też analiza NMR jest jedną z najczęściej wymienianych metod w literaturze w zakresie badania ulvanów [11, 14, 15, 20, 23, 24]. Inną ważną techniką służącą do analizy ulvanów jest spektroskopia w podczerwieni FT-IR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy), która pozwala na identyfikację grup funkcyjnych charakterystycznych dla tych substancji. Za pomocą FT-IR można określić obecność grup funkcyjnych obecnych w ulvanach, takich jak: grupa hydroksylowa, karboksylowa, siarczanowa, ketonowa, czy też mostek glikozydowy. Z uwagi na prostotę wykonania tej analizy, a także łatwość interpretacji wyników jest ona bardzo często stosowana w badaniach ulvanów [11, 20, 28]. Również metody chromatograficzne są szeroko wykorzystywane w przypadku analizy siarczanowych polisacharydów. Największe zastosowanie w przypadku ulvanów znajduje chromatografia wykluczania molekularnego [18, 25, 29], nazywana także chromatografią żelową, sitową lub sączeniem molekularnym. Konkretny przykład stanowi wysokosprawna chromatografia wykluczania molekularnego (ang. high pressure size exclusion chromato200 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic graphy HPSEC). Technika ta pozwala na określenie rozkładu masy cząsteczkowej ulvanów, a dzięki uprzednio przeprowadzonej hydrolizie kwasowej – na identyfikację monosacharydów budujących ulvany, również na podstawie ich masy cząsteczkowej. Rozdzielanie substancji w tym rodzaju chromatografii zachodzi bowiem na skutek różnicy mas cząsteczkowych badanych związków. Także inne metody chromatograficzne, jak np.: HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) [30], GC (chromatografia gazowa) [14, 25], czy też połączenie HPLC z chromatografią jonowymienną [31] znajdują zastosowanie w analizie ulvanów. Wymienione metodyanalityczne służą do jakościowego i ilościowego oznaczania cukrów obojętnych i kwaśnych budujących ulvany. Istnieje jeszcze wiele technik analitycznych, które z powodzeniem można stosować do badań ulvanów. Spośród tych najczęściej używanych należy wymienić analizę elementarną [11, 20], analizę termograwimetryczną (TGA) [20], fluorescencję rentgenowską (XRF) [11], czy też badania dichroizmu kołowego (CD) [26]. 6. Aktywność biologiczna ulvanów Ulvany wykazują szereg różnorodnych właściwości jako substancje biologicznie czynne, jednakże ich właściwości na tle innych siarczanowych polisacharydów izolowanych z glonów są słabo poznane. Dotychczas przeprowadzone badania wskazują na wiele unikalnych właściwości ulvanów, a zatem na szerokie możliwości wykorzystania tych związków w różnych gałęziach przemysłu. Poniżej opisane rodzaje aktywności biologicznej ulvanów pokazują jak bardzo złożone i wielokierunkowe działanie wykazują te związki. Warto więc kontynuować badania nad ulvanami jako substancjami bioaktywnymi, dzięki czemu mogą one zostać w przyszłości wykorzystane w medycynie, farmacji, kosmetyce i branży spożywczej. 6.1. Aktywność antyoksydacyjna Jedną z właściwości, jaką wykazują ulvany jest aktywność antyoksydacyjna, która została potwierdzona wynikami wielu badań [32†38]. Oznacza to, że ulvany są zdolne do inaktywacji wolnych rodników, które przyczyniają się do starzenia się organizmu, a także są powodem wielu chorób. Działanie przeciwutleniające ulvanów opiera się na różnych mechanizmach. W badaniach in vitro wykazano zdolność ulvanów do inaktywacji rodników nadtlenkowych i hydroksylowych, jak również do chelatowania metali ciężkich odpowiedzialnych za katalizowanie reakcji rodnikowych [32, 35, 36, 38]. Nie jest do końca znana zależność między budową ulvanów, a ich aktywnością antyoksydacyjną. Niektóre prace dowodzą, że im więcej grup siarczanowych zawierają ulvany, tym silniejsze są ich właściwości przeciwutleniające [37]. Natomiast w badaniach prowadzonych przez Shao i in. wykazano zupełnie odwrotną tendencję 201 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska – frakcje ulvanów o mniejszej zawartości grup siarczanowych wykazywały silniejszą aktywność antyoksydacyjną [36]. Mimo, iż mechanizm działania ulvanów jako antyoksydantów nie został jeszcze jednoznacznie określony, niewątpliwy jest fakt, że zdolność ulvanów do zmiatania wolnych rodników czyni je atrakcyjnym surowcem bioaktywnym. Działanie antyoksydacyjne sprawia, że ulvany można wykorzystać zarówno w przemyśle kosmetycznym, spożywczym, jak i farmaceutycznym. Dodane do kosmetyków ulvany chroniłyby przed wolnymi rodnikami zarówno skórę, jak i sam kosmetyk. Ulvany mogą w przyszłości znaleźć zastosowanie w preparatach typu anti-aging i chronić skórę przed starzeniem się, jak również w innych typach kosmetyków,aby wykazywać działanie ochronne i zapobiegać utlenianiu innych składników masy kosmetycznej. W podobny sposób ulvany można wykorzystać jako dodatek do produktów spożywczych i suplementów diety. Stosowane doustnie zapewniałyby dodatkową porcję antyoksydantów w diecie, jednocześnie chroniąc substancje spożywcze przed zepsuciem spowodowanym działaniem wolnych rodników. 6.2. Aktywność przeciwnowotworowa Aktywność przeciwnowotworowa to inny przykład właściwości biologicznej ulavnów, która była szeroko badana w ciągu ostatnich kilku lat [6, 39, 40]. Substancje aktywne przeciwnowotworowo mogą działać zasadzie różnych mechanizmów, np. wykazywać aktywność antyoksydacyjną (wolne rodniki niszczą DNA, białka i inne struktury w organizmie powodując jego starzenie się, a więc pośrednio mogą być przyczyną chorób nowotworowych), antyproliferacyjną (tj. zapobiegającą namnażaniu się komórek nowotworowych), jak również apoptotyczną (niszczącą komórki nowotworowe). Ulvany działają zarówno jako antyoksydanty [32-38], jak i substancje antyproliferacyjne oraz apoptotyczne [39]. Badania wykazały działanie antyproliferacyjne i cytotoksyczne ulvanów wobec komórek raka wątroby (HepG2), raka okrężnicy (HCT116) [39], a także raka piersi [40]. W czasach, gdy rak stał się jedną z najbardziej niebezpiecznych chorób cywilizacyjnych stale poszukiwane są nowe, skuteczne źródła leków przeciwnowotworowych. Ulvany mogą stać się alternatywą lub też uzupełnieniem aktualnie stosowanych leków w terapii raka. Na korzyść ulvanów jako potencjalnych substancji przeciwnowotworowych dodatkowo wpływa ich naturalne pochodzenie. 6.3. Aktywność immunostymulująca Ulvany charakteryzują się także właściwościami immunostymulującymi [41, 42], co oznacza, że aktywują one działanie układu odpornościowego. Aktywność immunostymulująca ulvanów opiera się na ich oddziaływaniu na makrofagi, czyli komórki układu odpornościowego uczestniczące 202 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic w mechanizmach obronnych organizmu w przypadku infekcji drobnoustrojami. Wykazano, że ulvany mogą stymulować wydzielanie prostaglandyny E2 (PGE2) makrofagów i wywołać wzrost ekspresji cyklooksygenazy-2 (COX-2) oraz syntazy-2 tlenku azotu (2-NOS) [42], co warunkuje zdolność ulvanów do regulacji aktywności makrofagów. Substancje te mogą znaleźć zastosowanie w terapii chorób, w których system immunologiczny działa nieprawidłowo i jest osłabiony, jak np. AIDS i choroby nowotworowe. 6.4. Aktywność antykoagulacyjna Działanie antykoagulacyjne (przeciwzakrzepowe) ulvanów jest przykładem innej ważnej z punktu widzenia medycznego aktywności tych związków [10, 40]. Aktywność antykoagulacyjna polega na spowalnianiu, utrudnianiu lub uniemożliwianiu krzepnięcia krwi. Ulvany działają jako substancje heparynopodobne poprzez hamowanie fazy przejścia protrombiny w trombinę, jak również zapobieganie agregacji trombocytów oraz ich adhezji do ścian naczyń krwionośnych [6]. To wskazuje na możliwość zastosowania ulvanów jako leków przeciwzakrzepowych w leczeniu zakrzepic różnego pochodzenia, takich jak choroby sercowo-naczyniowe i mózgowo-naczyniowe. 6.5. Aktywność antyhiperlipidemiczna Zdolność do obniżania poziomu cholesterolu we krwi, czyli aktywność antyhiperlipidemicznato kolejna cenna właściwość ulvanów. Stwierdzono, że te polisacharydy siarczanowesą zdolne do regulowania metabolizmu lipidów przez obniżanie zawartości lipoprotein o małej gęstości (ang. low density lipoprotein LDL) w osoczu [43, 44].Ulvany można poddawać różnego typu modyfikacjom w celu polepszenia ich właściwości. Qi i in. dowiedli, że acetylowane pochodne ulvanów posiadają silniejsze zdolności w zakresie obniżania poziomu LDL, niż ich niemodyfikowane, naturalne odpowiedniki [45].Ulvany mogą być zatem w przyszłości wykorzystane w leczeniu hipercholesterolemii, która z kolei stanowi jeden z podstawowych czynników ryzyka wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego. 6.6. Aktywność przeciwbakteryjna i przeciwwirusowa Inną właściwością ulvanów jest aktywność przeciwbakteryjna i przeciwwirusowa. Działanie przeciwbakteryjne tych związków polega na ich aktywności antyadhezyjnej, czyli zapobiegającej przyleganiu bakterii do komórek zakażonego organizmu. W badaniach wykazano działanie antyadhezyjne ulvanów wobec szczepów bakterii Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus epidermidis [46]. Działanie przeciwbakteryjne ulvanów wykazano także w przypadku Staphylococcus aureus [47]. Natomiast aktywność przeciwwirusowa ulvanów obejmuje działanie wobec wirusa 203 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska opryszczki Herpes simplex typu 1 (HSV-1) [48], a także paramyksowirusów (Paramyxo viridae), takich jak: Human parainfluenza virus (HPIV) wirus paragrypy, Mumps virus (MuV) wirus świnki i Measles virus (MEV) wirus odry [49]. Jak widać aktywność przeciwdrobnoustrojowa ulvanów stwarza możliwość ich wykorzystania w leczeniu chorób spowodowanych zakażeniami bakteryjnymi i wirusowymi, a także jako dodatków do kosmetyków, czy też produktów spożywczych o działaniu konserwującym. 6.7. Inne właściwości i perspektywy zastosowań Opisane powyżej przykłady pokazują jak bardzo różnorodne właściwości wykazują ulvanyw zakresie aktywności biologicznej. Fakt ten wskazuje na szerokie perspektywy zastosowań ulvanów w medycynie i innych dziedzinach. Ważnym aspektem jest stwierdzenie, że ulvany są związkami cytokompatybilnymi i nietoksycznymi [50], czyli są one bezpieczne dla naszego zdrowia i mogą być w przyszłości z powodzeniem wykorzystywane, np. jako dodatki do leków. Ulvany charakteryzują się jeszcze wieloma innymi unikalnymi właściwościami. Zdolność tych związków do tworzenia żelu oraz do pochłaniania wody [8, 22, 23] czyni ulvany potencjalnym surowcem do zastosowań biomedycznych, takich jak opatrunki i systemy kontrolowanego uwalniania leków [51, 52]. Istnieje również wiele obszarów zastosowań ulvanów w kosmetyce. Ze względu na zdolność tych substancji do regeneracji tkanek skóry [52] mogą być one wykorzystywane jako składniki aktywne kosmetyków typu anti-aging oraz preparatów regenerujących skórę, np. po oparzeniach i peelingach chemicznych. Natomiast właściwości higroskopijne ulvanów warunkują ich działanie nawilżające po aplikacji na skórę [53]. Wysoka zawartość cząsteczek ramnozy w ulvanach sprawia, że związki te mogą indukować syntezę kolagenu w skórze [54]. Ponieważ ulvany są naturalnymi anionowymi polimerami cukrowymi mają one szansę zostać wykorzystane jako naturalne surfaktanty [55]. Oprócz działania leczniczego i pielęgnacyjnego na skórę ulvany mogą także stabilizować sam produkt kosmetyczny. Ich działanie jako stabilizatorów opiera się na właściwościach antyoksydacyjnych [32-38], jak również żelotwórczych [8, 22, 23], dzięki czemu ulvany dodane np. do kremu działają jak zagęstniki zapobiegając rozwarstwianiu się emulsji kosmetycznych. 7. Podsumowanie Poszukiwanie nowych substancji biologicznie czynnych, a także ich naturalnych źródeł stanowi obecnie jeden z najważniejszych kierunków badań. Jednymi z takich związków są ulvany, czyli siarczanowe polisacharydy występujące w morskich zielenicach Ulva sp. Te nowe bioaktywne surowce charakteryzują się zróżnicowaną budową oraz właściwościami. Przede wszystkim jednak ulvany wykazują różnorodną aktywność biolo- 204 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic giczną, która obejmuje m.in. działanie antyoksydacyjne, immunostymulujące, przeciwbakteryjne i przeciwnowotworowe. To sprawia, że ulvany stanowią atrakcyjny naturalny surowiec o wielokierunkowym działaniu i szerokich perspektywach ich zastosowania w medycynie, farmacji, kosmetyce i przemyśle spożywczym. Ponieważ właściwości ulvanów nie zostały jeszcze do końca poznane warto kontynuować badania nad tymi związkami, aby w pełni móc korzystać z ich pozytywnych własności. 8. Podziękowania Projekt jest częściowo finansowany w ramach grantu 2014/13/B /NZ8/04690 pt.: „Fizykochemiczne i biologiczne przyczyny ekologicznej dominacji zielenic nitkowatych glonów w ekosystemach słodkowodnych” przyznany przez Narodowe Centrum Nauki w Polsce. Literatura Lamer-Zarawska E., Chwała C., Gwardys A. Rośliny w kosmetyce i kosmetologii przeciwstarzeniowej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2012, s. 101-110 2. Molski M. Chemia piękna, , Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2010, s. 153-159 3. Kołodziejczyk A. Naturalne związki organiczne, , Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006, s. 236 4. De Jesus Raposo M. F., Bernardo de Morais A. M., Santos Costa de Morais R. M. Marine polysaccharides from algae with potential biomedical applications, Marine Drugs, 13 (2015), s. 2967-302 5. Jiao G., Yu G., Zhang J., Ewart H. S. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae, Marine Drugs, 9 (2011), s. 196-223 6. Wijesekara I., Pangestuti R., KimS. K. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae, Carbohydrate Polymers, 84 (2011), s. 14-21 7. https://webofknowledge.com 8. Robic A., Lahaye M. Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds, Biomacromolecules, 6 (2007), s. 1765-1774 9. Hernández-Garibay E., Zertuche-González J., Pacheco-Ruíz I. Isolation and chemical characterization of algal polysaccharides, from the green seaweed Ulva clathrata (Roth) C. Agardh, Journal of Applied Phycology, 23 (2010) s. 537-542 10. Mao W., Zang X., Li Y., ZhangH. Sulfated polysaccharides from marine green algae Ulva conglobata and their anticoagulant activity, Journal of Applied Phycology, 18 (2006), s. 9-14 11. Pankiewicz R., Łęska B., Messyasz B., Fabrowska J., Sołoducha M., Pikosz M. First isolation of polysaccharidiculvans from cell wall of freshwater algae, Algal Research, (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.algal.2016.02.025 1. 205 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska 12. Lahaye M., Axelos M. A. V. Gelling properties of water-soluble polysaccharides from proliferating marine green seaweeds (Ulva spp.), Carbohydrate Polymers, 22 (1993), s. 261-265 13. Pengzhan Y., Ning L., Xiguang L., Gefei Z., Quanbin Z., Pengcheng L. Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta), Pharmacological Research, 48 (2003), s. 543-549 14. Lahaye M., Ray B. Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva ”rigida” (Ulvales, Chlorophyta) – NMR analysis of ulvan oligosaccharides, Carbohydrate Research, 283 (1996), s. 161-173 15. Lahaye M., Alvarez-Cabal Cimadevilla E., Kuhlenkamp R.,Quemener B., LognoneV., Dion P.Chemical composition and 13C NMR spectroscopic characterisation of ulvans from Ulva (Ulvales, Chlorophyta), Journal of Applied Phycology, 11 (1999), s. 1-7 16. Paulert R., Talamini V., Cassolato J. E. F., Duarte M. E. R., Noseda M. D., Smania A., Stadnik M. J. Effects of sulfated polysaccharide and alcoholic extracts from green seaweed Ulva fasciata on anthracnose severity and growth of common bean (Phaseolus vulgaris L.), Journal of Plant Diseases and Protection, 116 (2009), s. 263-270 17. Castelar B., Reis R. P., Carolina dos Santos Calheiros A. Ulva lactuca and U. flexuosa (Chlorophyta, Ulvophyceae) cultivation in Brazilian tropical waters: recruitment, growth, and ulvan yield, Journal of Applied Phycology, 26 (2014), s. 1989-1999 18. Robic A., Sassi J. F., Dion P., Lerat Y., Lahaye M. Seasonal variability of physicochemical and rheological properties of ulvan in two Ulva species (Chlorophyta) from the Brittany Coast, Journal ofPhycology, 45 (2009), s. 962-973 19. Siddhanta A. K., Goswami A. M., Ramavat B. K.,Mody K. H., Mairh O. P. Water soluble polysaccharides of marine algal species of Ulva (Ulvales, Chlorophyta) of Indian waters, Indian Journal of Geo-Marine Sciences, 30 (2001), s. 166-172 20. Alves A.Caridade S. G., Mano J. F., Sousa R. A., Reis R. L. Extraction and physico-chemical characterization of a versatile biodegradable polysaccharide obtained from green algae, Carbohydrate Research, 345 (2010), s. 2194-2200 21. Alves A., Sousa R. A., Reis R. L. A practical perspective on ulvan extracted from green algae, Journal of Applied Phycology, 25 (2013), s. 407-424 22. Haug A. The influence of borate and calcium on the gel formation of a sulphated polysaccharide from Ulva lactuca, Acta Chemica Scandinavica B., 30 (1979), s.562-566 23. Robic A., Gaillard C., Sassi J. F., Lerat Y., Lahaye M., Ultrastructure of Ulvan: a polysaccharide from green seaweeds, Biopolymers, 8 (2009), s. 654-664 24. Robic A., Rondeau-Mouro C., Sassi J. F., Lerat Y., Lahaye M. Structure and interactions of ulvan in the cell wall of the marine green algae Ulva rotundata (Ulvales, Chlorophyceae), Carbohydrate Polymers, 77 (2009), s. 206-216 206 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic 25. Costa C., Alves A., Pinto P., Sousa R.A., Silva E., Reis R. L., Rodrigues A., Characterization of ulvan extracts to assess the effect of different steps in the extraction procedure, Carbohydrate Polymers, 88 (2012), s. 537-546 26. Paradossi G., Cavalieri F., Pizzoferrato L., Liquori A. M., A physico-chemical study on the polysaccharide ulvan from hot water extraction of the macroalga Ulva, International Journal of Biological Macromolecules, 25 (1999), s. 309-315 27. Jani G. K., Shah D. P., Prajapati V. D., Jain V. C. Gums and mucilages:versatile excipients for pharmaceutical formulations, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 4 (2009), s. 309-323 28. Robic A., Bertrand D., Sassi J. F., Lerat Y., Lahaye M. Determination of the chemical composition of ulvan, a cell wall polysaccharide from Ulva spp. (Ulvales, Chlorophyta) by FT-IR and chemometrics, Journal of Applied Phycology, 21 (2009), s. 451-456 29. Yaich H., Garna H., Besbes S., Barthélemy J. P., Paquot M., Blecker C., Attia H. Impact of extraction procedures on the chemical, rheological and textural properties of ulvan from Ulva lactuca of Tunisia coast, Food Hydrocolloids, 40 (2014), s. 53-63 30. Robic A., Sassi J. F., Lahaye M. Impact of stabilization treatments of the green seaweed Ulva rotundata (Chlorophyta) on the extraction yield, the physico-chemical and rheological properties of ulvan, Carbohydrate Polymers, 74 (2008), s. 344-352 31. Quemener B., Lahaye M., Bobin-Dubigeon C. Sugar determination in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high performance anion exchange chromatography, Journal of Applied Phycology, 9 (1997), s. 179-188 32. Qi H., Zhang Q., Zhao T., Chen R., Zhang H., Niu X., et al. Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta) in vitro, International Journal of Biological Macromolecules, 37 (2005), s. 195-199 33. Qi H., Zhao T., Zhang Q., Li Z., Zhao Z., Xing R. Antioxidant activity of different molecular weight sulphated polysaccharides from Ulva pertusaKjellm (Chlorophyta), Journal of Applied Phycology, 17 (2005), s. 527-534 34. Qi H., Zhang Q., Zhao T., Hu R., Zhang K., Li Z. In vitro antioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta),Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters., 16 (2006), s. 2441-2445 35. Qi H., Liu X., Ma J., Zhang Q., Li Z. In vitro antioxidant activity of acetylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Cholorophta), Journal of Medicinal Plants Research, 4 (2010), s. 2445-2451 36. Shao P., Chen M., Pei Y., Sun P. In intro antioxidant activities of different sulfated polysaccharides from chlorophytan seaweeds Ulva fasciata, International Journal of Biological Macromolecules, 59 (2013), s. 295-300 37. Qi H., Sun Y. Antioxidant activity of high sulfate content derivative of ulvan in hyperlipidemic rats, International Journal of Biological Macromolecules, 76 (2015), s. 326-329 38. Costa L. S., Fidelis G. P., Codeiro S. L., Oliveira R. M., Sabry D. A., Câmara R. B. G., Nobre L. T. D. B., Costa M. S. S. P., Almeida-Lima J., Farias E. H. C., Leite E. L., Rocha H. A. O. Biological activities of sulphated 207 Joanna Fabrowska, Bogusława Łęska 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. polysaccharides from tropical seaweeds, Biomedical and Pharmacology Journal, 64 (2010), s. 21-28 Ahmed O. M., Ahmed R. R. Anti-proliferative and apoptotic efficacies of ulvan polysaccharides against different types of carcinoma cells in vitro and in vivo, Journal of Cancer Science & Therapy, 6 (2014), s. 2002-2008 El-Baky H. H. A., Baz F. K. E., Baroty G. S. E. Potential biological properties of sulphated polysaccharides extracted from the macroalgae Ulva lactuca L., Academic Journal of Cancer Research, 2 (2009), s. 1-11 Castro R., Piazzon M. C., Zarra I., Leiro J., Noya M., Lamas J. Stimulation of turbot phagocytes by Ulva rigida C. Agardh polysaccharides, Aquaculture, 254 (2006), s. 9-20 Leiro J. M., Castro R., Arranz J. A., Lamas J. Immunomodulating activities of acidic sulphated polysaccharides obtained from the seaweed Ulva rigida C. Agardh, International Immunopharmacology, 7 (2007), s. 879-888 Yu P. Z., Zhang Q. B., Li N., Xu Z. H., Wang Y .M., Li Z. E. Polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta) and preliminary studies on their antihyperlipidemia activity, Journal of Applied Phycology, 15 (2003), s. 21-27 Qi H., HuangL., Liu X., Liu D., Zhang Q., Liu S. Antihyperlipidemic activity of high sulfate content derivative of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta), Carbohydrate Polymers, 87 (2012), s. 1637-1640 Qi H., Liuc X., Zhang J., Duana Y., Wanga X., Zhang Q. Synthesis and antihyperlipidemic activity of acetylated derivative of ulvan from Ulva pertusa, International Journal of Biological Macromolecules, 50 (2012), s. 270-272 Gadenne V., Lebrun L., Jouenne T., Thebault P. Antiadhesive activity of ulvan polysaccharides covalently immobilized onto titanium surface, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 112 (2013), s. 229-236 Gadenne V., Lebrun L., Jouenne T., Thebault T. Role of molecular properties of ulvans on their ability to elaborate antiadhesive surfaces, Journal of Biomedical Materials Research A, 103 (2015), s. 1021-1028 Lee J. B., Hayashi K., Maeda M., Hayashi T. Antiherpetic activities of sulphated polysaccharides from green algae, Planta Medica. 70 (2004), s. 813-817 Aguilar-Briseño J. A., Cruz-Suarez L. E., Sassi J. F., Ricque-Marie D., ZapataBenavides P., Mendoza-Gamboa E., Rodríguez-Padilla C., Trejo-Avila L. M. Sulphated Polysaccharides from Ulva clathrata and Cladosiphonokamuranus Seaweeds both Inhibit Viral Attachment/Entry and Cell-Cell Fusion, in NDV Infection, Marine Drugs, 13 (2015), s. 697-712 Alves A., Sousa R. A., Reis R. L. In vitro cytotoxicity assessment of ulvan, a polysaccharides extracted from green algae, Phytotherapy Research, 27 (2013), s. 1143-1148 Alves A., Pinho E. D., Neves N. M., Sousa R. A., Reis R. L. Processing ulvan into 2D structures: Cross-linked ulvan membranes as new biomaterials for drug delivery applications, International Journal of Pharmaceutics, 426 (2012), s. 76-81 Chandika P., Ko S. C., Jung W. K. Marine-derived biological macromoleculebased biomaterials for wound healing and skin tissue regeneration, International Journal of Biological Macromolecules, 77 (2015), s. 24-35 208 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic 53. Kim S. K., Ravichandran Y. D., Khan S. B., Kim Y. T. Prospective of the cosmeceuticals derived from marine organisms, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 13 (2008), s. 511-523 54. Andrès E., Molinari J., Péterszegi G., Mariko B., Ruszova E., VelebnyV., Faury G., Robert L. Pharmacological properties of rhamnose-rich polysaccharides, potential interest in agedependent alterations of connectives tissues, Pathologie Biologie, 54 (2006), s. 420-425 55. Covis R., Vives T., Gaillard C., Benoit M., Benvegnu T. Interactions and hybrid complex formation of anionic algal polysaccharides with a cationic glycine betaine-derived surfactant, Carbohydrate Polymers, 121 (2015), s. 436-448 Ulvany – biologicznie czynne siarczanowe polisacharydy izolowane z zielenic Streszczenie Ulvany są siarczanowymi polisacharydami zbudowanymi głównie z kwasu glukuronowego, kwasu iduronowego, ramnozy, glukozy i ksylozy. Jak dotąd związki te zostały odkryte i wyizolowane z morskich gatunków zielenic Ulva, takich jak: U. lactuca, U. armoricana, U. rigida, U. pertusa, U. clathrata, U. flexuosa, czy też U. fasciata. Skład jednostek cukrowych w ulvanach może się różnić w zależności od gatunku zielenic i warunków środowiskowych. Izolacja ulvanów polega na ekstrakcji gorącą wodą, roztworami alkalicznymi lub z dodatkiem środków chelatujących. Są to substancje higroskopijne, półkrystaliczne, posiadające zdolność do tworzenia trwałych żeli o zwartej, sztywnej strukturze. Ulvany posiadają wiele interesujących właściwości w zakresie aktywności biologicznej, m.in.: antyoksydacyjne, antyproliferacyjne, immunostymulujące, przeciwzakrzepowe, przeciwbakteryjne i przeciwwirusowe To sprawia, że ulvany mogą znaleźć wiele zastosowań w medycynie i przemyśle farmaceutycznym jako produkty lecznicze w terapii przeciwnowotworowej, leczeniu zakrzepicy, miażdżycy i innych schorzeń, a także w przemyśle kosmetycznym jako surowce nawilżające, przeciwstarzeniowe, regeneracyjne i stabilizatory emulsji. Słowa kluczowe:ulvany, siarczanowe polisacharydy, zielenice, aktywność biologiczna Ulvans – sulfated polysaccharides isolated from green algae Abstract Ulvans are sulfated polysaccharides mainly composed of glucuronic acid, iduronic acid, rhamnose, glucose and xylose. So far, these compounds have been discovered and isolated from marine green algae Ulva species, such as U. lactuca, U. armorica, U. rigida, U. pertusa, U. clathrata, U. flexuosa andU. fasciata. Composition of the sugar units in ulvans may vary depending on the species of green algae and environmental conditions. Isolation of ulvans based on the extraction with hot water or alkaline solution with the addition of chelating agents. They are hygroscopic materials, semi-crystalline, having the ability to create stable gels about compact, rigid structure. Ulvans possess many interesting properties in terms of their biological activity, e.g.: antioxidant, antiproliferative, immuno-stimulating, anticoagulant, antibacterial and antiviral This makes ulvans may find many applications in medicine and in the pharmaceutical industry as medicinal products for the treatment of cancer, thrombosis. atherosclerosis and other diseases, as well as in cosmetic industry as moisturizing, anti-aging and regenerating agents, and emulsion stabilizers. Keywords: ulvans, sulfated polysaccharides, green algae, biological activity 209 Paulina Marczuk1, Ewelina Włodarczyk2 Zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne 1. Wstęp Dotychczas wszelkie starania technologów żywności skierowane były ku wprowadzaniu nowych produktów spełniających potrzebny smakowe konsumentów. Obecnie lista potrzeb została wydłużona o prozdrowotne właściwości żywności. Wynikiem tych zmian jest prężnie rozwijający się rynek żywności funkcjonalnej. Termin żywności funkcjonalnej został po raz pierwszy zdefiniowany w 1991 roku przez Japończyków. Komisja Europejska (Functional Food Science in Europe) w 1998 roku przedstawiła dokładny opis, na czym polega jej funkcjonalność. Aby dana żywność uzyskała miano funkcjonalnej należy naukowo udowodnić efekty zdrowotne, czy wyróżnia się obecnością składników działających korzystnie na stan zdrowia, samopoczucia, a nawet czy przyczynia się do zmniejszenia ryzyko wystąpienia chorób [1]. Poruszając temat żywności funkcjonalnej należy wspomnieć o jej klasyfikacji. Wyróżnia się podział ze względu na możliwość oddziaływania na fizjologię organizmu, na żywność minimalizującą ryzyko wystąpienia chorób cywilizacyjnych, na żywność regulującą prawidłowe funkcjonowanie przewodu pokarmowego, żywność przeznaczoną dla osób narażonych na stres. Istnieje również podział uwzględniający klasyfikację na różne grupy społeczne: sportowców, kobiety w ciąży, niemowlęta, młodzież w wieku dojrzewania, osoby starsze. Żywność pochodzenia roślinnego stanowi bogate źródło bioaktywnych składników, wywołujących korzystne efekty w organizmie człowieka. Szczególnie ważne są związki fenolowe z uwagi na ich właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne oraz przeciwnowotworowe [2]. Związki polifenolowe są naturalnymi i biologicznie aktywnymi substancjami chemicznymi. Działanie przeciwutleniające stanowi istotną rolę w walce ze szkodliwymi dla zdrowia wolnymi rodnikami. Powstawanie tych związków zależy również od przemian tlenowych tj. oddychania tlenowego czy uprawiania sportu. Działanie na organizm szkodliwego dymu papieroso1 2 [email protected]; [email protected] 210 Zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne wego czy zanieczyszczonego powietrza może powodować wzrost obecności reaktywnych form tlenu w organizmie. Według badań naukowych wolne rodniki stanowią induktor rozwoju chorób cywilizacyjnych, takich jak: miażdżyca, choroba Parkinsona, cukrzyca [3]. Polifenole znajdują się w głównej grupie wtórnych metabolitów roślin. Należą do największej grupy wśród naturalnych przeciwutleniaczy i występują w formie glikozydów lub estrów. Tworzone są z metabolitów pierwotnych – węglowodanów. Oznaczają się różnicowaną masą cząsteczkową, budową, oprócz tego właściwościami chemicznymi i fizycznymi [4]. Związki polifenolowe charakteryzują się występowanie w cząsteczkach grup fenolowych, w których grupy hydroksylowe (-OH) połączone są z atomami węgla pierścienia aromatycznego [5]. Ważne jest spożywanie produktów spożywczych pochodzenia roślinnego, gdyż za sprawą ich właściwości przeciwutleniających, zyskuje się zdolność do neutralizowania negatywnych dla zdrowia reaktywnych form tlenu (RFT). Za ich generowanie w odpowiedzialne są różne procesy biochemiczne. Zbyt duże skumulowanie się RFT w ustroju może doprowadzić do uszkodzenia błon biologicznych, a nawet przyczynić się do uszkodzenia naruszenia materiału genetycznego komórki. Jak podaje źródło [6] traktujące o aktywności antyoksydacyjnej, włączenie w codzienną dietę produktów spożywczych bogatych w związki polifenolowe powinno stanowić nieodłączny element racjonalnej diety, ku poprawie funkcjonowania organizmu. Odkąd coraz częściej przekonujemy się, iż za sprawą odpowiedniej diety jesteśmy w stanie wpłynąć na poprawienie samopoczucia, zaczynamy patrzeć na produkty spożywcze pod kątem ich właściwości prozdrowotnych. Na liście produktów nie zbędnych w codziennym jadłospisie powinny znaleźć się te bogate w przeciwutleniacze. Wspomniane związki zapobiegają niekontrolowanym reakcjom utleniania, optymalizują potencjał oksydoredukcyjny. Wyróżnia się dwa rodzaje przeciwutleniaczy – prewentywne i interwentywne. Pierwsze z nich odpowiedzialne są za rozpoznawanie aktywnych form tlenu, a następnie prowadzenia wolnych rodników na drodze terminacji. Drugie z nich działają, zatrzymując reakcje utleniania zapoczątkowane przez reaktywne postacie tlenu, kolejno włączając się w reakcje z pośrednimi produktami utleniania. Warto również wspomnieć o ich zdolności do chelatowania jonów metali, zapobiegając ich oddziaływaniu z aktywnymi formami tlenu. Za istotną rolą przeciwutleniaczy uważa się zdolność do usuwania wolnych rodników i reaktywnych form tlenu, które w destrukcyjny sposób wpływają na struktury komórkowe. Wolne rodniki atakują cząsteczki lipidów, białek i węglowodanów, zapoczątkowując w ten sposób szereg reakcji łańcuchowych, potęgując efekt zniszczenia. Według źródła [7] obecność wolnych rodników w organizmie, które nie zostały wychwycone przez system obronny, inicjują rozwój wielu chorób cywilizacyjnych. 211 Paulina Marczuk, Ewelina Włodarczyk W obliczu powyżej przedstawionych faktów, spożywanie żywności bogatej w związki o działaniu antyoksydacyjnym, neutralizującej wolne rodniki stanowi sposób na zachowanie prawidłowego funkcjonowania organizmu człowieka. Polifenole jako największa grupa wśród związków o właściwościach antyoksydacyjnych należą do grupy wtórnych metabolitów roślin. Oznaczają się różnicowaną masą cząsteczkową, budową, a także właściwościami fizycznymi i chemicznymi [4]. Poza zdolnością wymiatania wolnych rodników i reaktywnych form tlenu, wykazują również zdolność wiązania związków nitrozowych. Według źródła [8] posiadają również właściwości antykancerogenne, przeciwwirusowe, przeciwzapalne oraz wspomagają działanie witaminy C. Zdaniem [7], chcąc znaleźć naturalne źródło związków przeciwutleniających najlepiej zaopatrzyć się w owoce i przetworzone produkty roślinne. Z naukowego punktu widzenia, polifenole posiadają zdolność wychwytywania reaktywnych form tlenu na drodze oddawania elektronu, przyczyniając się do powstania względnie trwałego rodnika fenoksylowego, w konsekwencji czego związki te mogą zapobiegać uszkodzeniom oksydacyjnym makrocząsteczek [9]. Do produktów roślinnych bogatych w związki fenolowe zalicza się między innymi: herbaty – zieloną, czerwoną, białą i czarną, owoce i warzywa, soki owocowe, susze owocowe, niektóre zioła i przyprawy [10, 2]. Herbata należy do najbardziej znanych napojów i najczęściej kupowanych przez konsumentów na świecie [11]. W tym procesie polifenole ulegają kondensacji enzymatycznej, tworzą się wieloczęściowe związki, które nadają charakterystyczną czerwoną barwę naparu herbaty czarnej [12]. Tematem niniejszej pracy jest czarna herbata, która na rynku spożywczym dostępna jest w formie liściastej, granulowanej i ekspresowej (w torebkach). Cykl produkcyjny czarnej herbaty obejmuje proces utleniania oraz fermentacji liści. Żywność bogata w związki o aktywności przeciwutleniającej jest szczególnie ważna, gdyż bierze udział w profilaktyce wielu chorób. Często samo dostarczenie cennych roślinnych związków bioaktywnych może się przyczynić do poprawy zdrowia i ogólnego samopoczucia. Związki polifenolowe pełnią różne funkcje w roślinie. Skład ilościowy i jakościowy związków o działaniu przeciwutleniającym jest ściśle uzależniony od wielu czynników, takich jak: genotyp rośliny, gatunek, stopień dojrzałości, a także od sposobu uprawy, okresu zbioru oraz warunków składowania. Związki bioaktywne zawarte w czarnej herbacie wywołują korzystne efekty w organizmie człowieka. Wszystkie herbaty posiadają zdolności antyoksydacyjne związane obecnością związków polifenolowych. Regularne i długotrwałe spożywanie herbaty czarnej zapobiega lub opóźnia rozwój wielu chorób, których patogeneza związana jest z zakłóceniem równowagi redoks [12]. Związki polifenolowe oznaczają się wielokierunkowym działaniem biologicznym czyli zwiększają elastyczność ścian naczyń krwionośnych 212 Zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne w wyniku sieciowania kolagenu. Ochraniają organizm przed niekorzystnym działaniem nadtlenków i rodników, które inicjują procesy oksydacyjne poprzez usuwanie rodników nadtlenkowych i uniemożliwienie łańcuchowych reakcji rodnikowych. Działają na zasadzie wiązania metali katalizujących procesy utleniania, a także inhibicji enzymów katalizujących procesy utleniania [4]. Przypisywane są im właściwości przeciwzapalne, antyhepatotoksyczne, przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe i przeciwbakteryjne [13]. Polifenole przeciwdziałają powstawaniu zmian miażdżycowych. Zapobiegają zapaleniu naczyń krwionośnych, agregacji płytek krwi, a także dysfunkcji śródbłonka naczyń [9]. Przeciwdziałają chorobom wieńcowym i arterosklerozie. Skutecznie opóźniają rozwój chorób wywołanych przez stres oksydacyjny [4]. Polifenole zawarte w herbacie hamują procesy nowotworowe na drodze różnych mechanizmów, m.in. działając antyoksydacyjnie, modyfikując aktywność enzymów detoksykacyjnych, wychwytując aktywnych metabolitów kancerogenów, zapobiegając mutagenności i genotoksyczności różnych związków poprzez ich deaktywację [12]. Związki polifenolowe obecne w herbacie efektywnie zwalczają wirusy i bakterie, dzięki czemu herbaty mogą być stosowane także profilaktycznie jak i do leczenia chorób infekcyjnych, np. grypy, przeziębienia, biegunki czy stawów zapalnych śluzówki jamy ustnej lub dziąseł. Herbata chroni przed próchnicą i wzmacnia zęby, dzięki wysokiej zawartości fluoru. Działanie to uzupełnia przeciwbakteryjne działanie polifenoli, ograniczające powstawanie płytki nazębnej [12]. Herbata działa również pobudzająco, dzięki zawartej w niej kofeinie. Kofeina w herbacie działa inaczej niż kofeina w kawie, ponieważ kofeina w kawie wchłaniana jest już w żołądku, więc działa bardzo szybko. Natomiast ten sam związek w zawarty herbacie przyswajana jest dopiero w jelitach, to oznacza że znacznie wolniej przedostaje się do krwiobiegu [12]. Herbata posida również zastosowanie w przemyśle farmaceutyczny i kosmetycznym. Jest składnikiem suplementów, dzięki zawartości w niej głównie związków polifenolwych. Dodawana jest do produkcji pielęgnacyjnych środków kosmetycznych, takich jak kremy, toniki, szampony, odżywki, mydła, płyny, żele do mycia ciała [12]. 213 Paulina Marczuk, Ewelina Włodarczyk Rys. 1. Budowa podstawowych polifenoli czarnej herbaty [12] Źródło: Ostrowska, J., Herbaty – naturalne źródło antyoksydantów, Gazeta Farmaceutyczna, 2008, 1, 47 [12]. 2. Cel pracy Celem pracy było analiza wybranych pozycji piśmiennictwa dotyczących zawartości polifenoli ogółem w trzech rodzajach herbat czarnych (liściastych, granulowanych i ekspresowych) dwóch marek różniących się ceną i pozycją rynkową. Dane liczbowe, które przedstawiono w pracy zostały zaczerpnięte ze źródła [10]. Na podstawie licznych badań naukowych poruszanych w literaturze polskiej i zagranicznej podjęto również próbę ustalenia prozdrowotnych właściwości herbat. 214 Zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne 3. Materiały i metody Materiałem poddawanym analizie były herbaty czarne – liściaste, granulowane i ekspresowe dwóch marek, znacznie różniących się ceną. Chcąc zyskać na czytelności, materiał doświadczalny oznaczono następującymi symbolami: L1, L2 – herbaty liściaste; G1,G2 – herbaty granulowane; E1, E2 – herbaty ekspresowe. Produkty o wyższej jakości zostały oznaczone cyfrą 1, z kolei produkty o niższej cyfrą 2. Do analizy przygotowano napary z herbat, tak aby wszystkie próby zawierały 1 g herbaty/100 cm3. W przypadku herbat liściastych i granulowanych zastosowano naważkę, z kolei w przypadku herbat ekspresowych torebkę. Przygotowane produkty zalano odpowiednią ilością wody destylowanej w temperaturze 100°C. Następnie parzono pod przykryciem 3 minuty, kolejno napar przesączono i ostudzono do temperatury pokojowej. Celem tej pracy było określenie zawartości polifenoli ogółem, która została oznaczona metodą spektrofotometryczną przy 700 nm z wykorzystaniem odczynnika Folina-Ciocalteu’a wyniki wyrażono w przeliczeniu na kwas galusowy. Zastosowana metoda stanowi jeden ze sposobów stosowanych na badanie zawartości związków polifenolowych w roślinach, owocach czy ziołach [14]. Wspomniana metoda oparta jest na właściwościach redukujących związków polifenolowych. Do wykonania analizy stosuje się odczynnik, zawierający kompleks związków wolframowo-molibdenowych (H3PW12O40 i H3PMo12O40). Polifenole znajdujące się w próbie ulegają utlenieniu, z kolei składniki odczynnika Folina ulegają redukcji w środowisku zasadowym. Stąd powstają niebiesko zabarwione formy tlenowe (W8O23 i Mo8O23). Jest to metoda spektrofotometryczna, w której absorbancja jest mierzona przy długości fali 760 nm, ponieważ powstaje barwny kompleks można również wizualnie ocenić zawartość związków polifenolowych. Im ciemniejsze zabarwienie tym wyższa zawartość substancji fenolowych [15]. 3.1. Wyniki oraz ich omówienie Wyniki zawartości polifenoli pochodzące ze źródła [10] zostały umieszczone w tabeli 1. Różnorodne źródła poddają w publikacjach wartości różniące się między sobą, różnice mogą wynikać z różnych przyczyn takich jak kraj pochodzenia herbaty, warunki pogodowe w trakcie wzrostu roślinny, obróbki liści [16]. 215 Paulina Marczuk, Ewelina Włodarczyk Na podstawie badań stwierdzono, iż najwięcej związków polifenolowych oznaczono w naparach herbat liściastych i granulowanych marek wiodących na rynku oraz w herbacie liściastej marki o niższej pozycji rynkowej, kształtując się w zakresie 66,75-68,22 mg/100 cm3. Najniższą obecność polifenoli posiadała herbata ekspresowa obu marek oraz herbata granulowana o niższej pozycji rynkowej, mieszcząc się w zakresie około 58,2-60,8 mg/100 cm3. Tabela 1. Zawartość związków fenolowych w naparach badanych herbat czarnych [10] Zawartość polifenoli ogółem [mg/100 ml naparu] 68,22 ± 0,64 64,07 ± 0,39 66,75 ± 3,96 58,16 ± 2,01 60,57 ± 2,21 60,77 ± 0,78 Rodzaj herbaty Herbata liściasta L1 Herbata liściasta L2 Herbata granulowana G1 Herbata granulowana G2 Herbata ekspresowa E1 Herbata ekspresowa E2 Źródło: Worobiej E., Tyszka K.:Właściwości przeciutleniające róznych rodzajów herbat czarnych, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, XIV, 2012, 659-664 [10]. Porównując wyniki uzyskane w grupie produktów poszczególnych marek można stwierdzić, że najniższą zawartością polifenoli charakteryzują się napary z herbat ekspresowych. 4. Wnioski 1. Badane herbaty charakteryzowały się zróżnicowaną zawartością związków polifenolowych. 2. Napary herbat liściastych obu marek wykazywały najwyższą zawartość polifenoli w porównaniu do naparów herbat granulowanych i ekspresowych. Zawartość polifenoli ogółem w naparze herbat liściastych wynosiła 64,07-68,22 mg/100 ml. 3. Wolne rodniki występujące w zbyt dużej ilości przyczyniają się do zapoczątkowania wielu chorób cywilizacyjnych, takich jak miażdżyca czy cukrzyca. 4. Przeciwutleniacze zawarte w herbacie wykazują zdolność do usuwania wolnych rodników i reaktywnych form tlenu, czynników destrukcyjnie wpływających na struktury komórkowe i tkankowe. 216 Zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Pieszka M., Pietras M. P. Nowe kierunki w badaniach żywieniowych – nutrigenomika, Roczniki Naukowe Zootechniki, 2010, 37, 2, s. 83-103 Szlachta M., Małecka M. Właściwości przeciwutleniające herbatek owocowych, Żywność Nauka Technologia Jakość, 2008, 1 (56), s. 96-102 Gliczyńska-Świgło A. Przeciwutleniające i proutleniające właściwości wybranych składników żywności jako wyróżniki jej jakości, Wydawnictwo Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu, Poznań 2010 Sikorski Z. E. Chemia żywności praca zbiorowa – praca zbiorowa, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2007 Moon J. K., Shibamoto T. Antioxidant assays for plant and food components, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57, s. 1655-1666 Witkowska A., Zujko M. E. Aktywność antyoksydacyjna owoców leśnych, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 2009, XLII, s. 900-903 Borowska J. Owoce i warzywa jako źródło naturalnych przeciwutleniaczy, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 2003, 5, s. 11-12 Markowski J., Mieszczakowska M., Fastyn M., Płocharski W. Aktywność antyoksydacyjna owoców i przetworów z jabłek, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 2008, 4, s. 25-26 Grajek W. Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne – praca zbiorowa, Wydawnictwo NaukowoTechniczne, Warszawa 2007 Worobiej E., Tyszka K. Właściwości przeciutleniające róznych rodzajów herbat czarnych, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, XIV, 2012, s. 659-664 Wołosiak R., Mazurkiewicz M., Drużyńska B., Worobiej E. Aktywność przeciwutleniająca wybranych herbat zielonych, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2008, 4 (59), s. 290-297 Ostrowska J. Herbaty – naturalne źródło antyoksydantów. Gazeta farmaceutyczna, 2008, 1, s. 46-50 Oszmiański J. Soki owocowe o wysokiej aktywności biologicznej. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 2007, 4, s. 12-15 Pieszko C., Zaremba A. Zawartość związków fenolowych w ekstraktach z próbek materiału roślinnego, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, XLVI, 2013, 4, s. 434-439 Bordonaba J. G., Terry L. A. Biochemical profiling and chemometric analysis of seventeen UK-grown black currant cultivars, Journal of Agricultural Food Chemistry, 2008, 56, s. 7422-7430 Kółdka D., Bońkowski M., Telesiński A. Zawartość wybranych metyloksantyn i związków fenolowych w naparach różnych rodzajów herbat rozdrobnionych (Dust i Jannings) w zależności od czasu parzenia, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2008, 1(56), s. 103-113 217 Paulina Marczuk, Ewelina Włodarczyk Zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne Streszczenie W pracy poddano analizie zawartość związków polifenolowych różnych rodzajów herbat czarnych oraz ich właściwości prozdrowotne. Na podstawie pozycji piśmiennictwa stwierdzono, iż związki fenolowe posiadają właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne oraz przeciwnowotworowe. Ważny jest fakt, iż każdego dnia podczas wdychania zanieczyszczonego powietrza, dymu papierosowego czy uprawiania sportu jesteśmy narażeni na wnikniecie do organizmu niebezpiecznych wolnych rodników. Produkty roślinne stanowią naturalne źródło związków przeciwutleniających. Stwierdzono również, iż spożywając żywność bogatą w polifenole jesteśmy w stanie zminimalizować ryzyko rozwoju chorób cywilizacyjnych. W pracy przedstawiono analizę wybranej pozycji piśmiennictwa dotyczącej zawartości polifenoli ogółem w trzech rodzajach herbat czarnych (liściastych, granulowanych i ekspresowych) dwóch marek różniących się ceną i pozycją rynkową. Zawartość polifenoli ogółem została oznaczona metodą spektrofotometryczną przy 700 nm z wykorzystaniem odczynnika Folina-Ciocalteu’a. wyniki wyrażono w przeliczeniu na kwas galusowy. Celem pracy było również przedstawienie prozdrowotnych właściwości czarnych herbat. Poddane zostały analizie napary z rodzajów herbat czarnych – liściastych, granulowanych i ekspresowych. Pochodziły one z dwóch marek zróżnicowanych pod względem ceny oraz pozycji rynkowej. Stwierdzono duże zróżnicowanie zawartości polifenoli w uzyskanych naparach. Herbata liściastych pochodząca od marki o wyższej i niższej pozycji rynkowej wykazała najwyższą zawartość związków polifenolowych w porównaniu do naparów herbat granulowanych i ekspresowych obu marek. Analiza ta ukazuje, iż z badanych rodzajów herbat czarnych najwyższe właściwości przeciwutleniające posiada herbata liściasta. Słowa kluczowe: herbata czarna, polifenole, antyoksydanty, produkty roślinne The content of polyphenolic compounds of various types of black teas, wolne rodniki Abstract The objective of the study was a analysis of polyphenolic compounds of different types of black tea and its health benefits. On the basis of the position of the literature, it was found that the phenolic compounds have antioxidant properties, anti-inflammatory and anticancer activities. What is important is the fact that every day while inhaling polluted air, cigarette smoke or sport we are exposed to you penetrate into the body of dangerous free radicals. Plant products are a natural source of antioxidant compounds. It was also found that eating foods rich in polyphenols are able to minimize the risk of developing lifestyle diseases. The paper presents an analysis of the selected item of the literature on the content of total polyphenols in three types of black tea (leaf, granulated and express) the two brands with different price and market position. The content of total polyphenols was determined by spectrophotometry at 700 nm using the Folin-Ciocalteu'a. Results are expressed based on gallic acid. The aim was also to present health-promoting properties of black tea. They have been analyzed infusions of the types of black tea – leaf, granulated and expressways. They came from two different brands in terms of price and market position. It was found big differences in the content of polyphenols in the obtained infusions. Tea leaf derived from the brand of higher and lower positions of the market showed the highest content of polyphenolic compounds compared to infusions of tea granulated and express both brands. This analysis shows that the tested types of black tea has the highest antioxidant properties of tea leaf. Keywords: black tea, polyphenols, antioxidant, plant products, free radicals 218 Małgorzata Sieradzka1, Gabriela Stawieraj2, Joanna Kołodziejczyk-Czepas3, Paweł Nowak4 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? 1. Wstęp W ciągu ostatnich lat obserwuje się wzrost częstości przyjmowania leków przeciwzapalnych, zarówno produktów na receptę, jaki i wydawanych bez recepty (środki lecznicze OTC, ang. over-the-counterdrugs). Leki przeciwzapalne codziennie zażywa ponad 30 milionów ludzi na całym świecie [1]. Wyniki sondaży przeprowadzonych przez Centrum Badań Opinii Publicznej z 2010 roku wskazują, że w ciągu miesiąca poprzedzającego badania, aż 50% ankietowanych stosowało lek przeciwzapalny/przeciwbólowy OTC [1]. Szczególnie ważnym problemem staje się nasilenie niekontrolowanego zażywania leków dostępnych bez recepty oraz brak stosowania środków osłonowych, zwłaszcza z grupy inhibitorów pomp protonowych. Wyniki badania przeprowadzonego w Polsce 2015 roku wykazały, że spośród leków przeciwbólowych najczęściej wybierany był ibuprofen (34,3% ankietowanych), ale jedynie 16,7% osób objętych badaniem kierowało się poradą lekarza, natomiast aż 49,1% ankietowanych samodzielnie podjęło decyzję o wyborze leku [2]. Pojawia się coraz więcej alarmujących danych wskazujących na skutki uboczne długotrwałego przyjmowania niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), takie jak stany zapalne błony śluzowej żołądka oraz choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy, a także zwiększenie ryzyka wystąpienia powikłań ze strony układu sercowo-naczyniowego lub niewydolności nerek [3, 4, 5]. Dlatego też, rośnie zainteresowanie poszukiwaniem nowych związków o właściwościach przeciwzapalnych, zwłaszcza substancji pochodzenianaturalnego, charakteryzujących się większym bezpieczeństwem stosowania. 1 [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl 2 [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl 3 [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl 4 [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl 219 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak W dostępnej literaturze dotyczącej przeciwzapalnych właściwości substancji roślinnych pojawia się coraz więcej danych na temat działania kwasu rozmarynowego. Już na przełomie lat 80 i 90 XX w., kwas rozmarynowy (Ryc.1) uznano za naturalny czynnik o silnym działaniu przeciwzapalnym. Obecnie wiadomo, że jego aktywność jest wynikiem kilku uzupełniających się mechanizmów działania farmakologicznego, których efekt końcowy porównywalny jest ze skutecznością działania niesteroidowych leków przeciwzapalnych [6]. Fenolokwas ten jest m.in. inhibitorem cyklooksygenaz (COX-1 i COX-2). Wykazano na przykład, że zastosowany w stężeniach 0,01-0,1 µM hamuje aktywność COX-2 w stopniu porównywalnym do efektywności działania NS-398 – specyficznego inhibitora tego enzymu. Ponadto, pomiary aktywności COX-1 wykazały jej zahamowanie przez kwas rozmarynowy (0,01-1 µM) w stopniu silniejszym od działania ibuprofenu [7]. 2. Cel pracy Przedmiotem prezentowanej pracy jest omówienie aktualnego stanu wiedzy (ze szczególnym uwzględnieniem piśmiennictwa z ostatnich 5 lat) na temat przeciwzapalnych właściwości kwasu rozmarynowego, a także perspektyw wykorzystania tego naturalnego związku w celach leczniczych. 3. Charakterystyka i źródła kwasu rozmarynowego COOH O HO O OH OH HO Ryc. 1. Wzór strukturalny kwasu rozmarynowego Kwas rozmarynowy (α-O-kawoilo-3,4-dihydroksyfenylomlekowy) jest estrem (depsydem) kwasu kawowego i 3,4-dihydroksyfenylomlekowego, powszechnie występującym w roślinach z rodziny Boraginaceae, a także Lamiaceae oraz jej podrodziny Nepetoideae. Obecność kwasu rozmarynowego wykryto w ponad stu gatunkach roślin, ale największą jego zawartość stwierdzono m.in. w melisie lekarskiej, szałwii lekarskiej, mięcie pieprzowej i rozmarynie lekarskim (Tab. 1) [6, 8, 9, 10]. W organizmach roślinnych kwas rozmarynowy obecny jest w formie wolnej, zestryfikowanej lub pochodnych o charakterze oligomerów.Występowanie oligomerów kwasu rozmarynowego (1 dimer i 2 trimery) wykryto m.in. w liściach Celastrus 220 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? hindsii Benth [11]. W formie glikozydów związek ten występuje bardzo rzadko, tworząc głównie połączenia z glukozą [6], takie jak 4’-O--Dglukopiranozyd [12] lub 3-O-glukopiranozyd [13] kwasu rozmarynowego. Tabela 1.Zawartość kwasu rozmarynowego w wybranych gatunkach roślin Gatunek Ekstrahent [mg/g suchej masy ekstraktu] Mięta nadwodna Mentha aquatica L. H2O: metanol: 2-propanol (80:10:10) 24,6 Mięta długolistna Mentha longifoliaL. etanol/H2O (4:1) 2,08 Mięta pieprzowa Mentha piperitaL. etanol/H2O (4:1) H2O: metanol: 2-propanol (80:10:10) 1,43 28,2 Mięta zielona Mentha spicata L. Melisa lekarska Melissa officinalis L. Lebiodka pospolita Origanum vulgare L. Pachnotka zwyczajna Perilla frutescensL. Rozmaryn lekarski Rosmarinus officinalisL. Szałwia lekarska Salvia officinalisL. Macierzanka cytrynowa Thymus citriodorus L. Macierzanka tymianek Thymus vulgaris L. H2O: metanol: 2-propanol (80:10:10) izopropanol/H2O (39:61) H2O H2O: metanol: 2-propanol (80:10:10) 72,31 13,0 metanol 1,9 etanol H2O 9,1-16,7 8,6-14,1 etanol/H2O 45-55 H2O: metanol: 2-propanol (80:10:10) H2O: metanol: 2-propanol (80:10:10) 58,5 25,0 31,5 23,5 Źródło: kompilacja danych, na podstawie [9, 10] Synteza kwasu rozmarynowego (Ryc. 2) najczęściej jest przedstawiana w literaturze na przykładzie kolonii Coleusblumei L. (Lamiaceae) lub Anchusaofficinalis L. (Borangiaceae). Substratami wyjściowymi do jego syntezy są dwa aminokwasy: fenyloalanina i tyrozyna, powstające na 221 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak drodze przemiany kwasu szikimowego. Fenyloalanina przekształcana jest dalej dokumaroilo-koenzymu A (kumaroilo-CoA) na szlaku przemian fenylopropanoidów. Proces deaminacji L-fenyloalaniny katalizowany jest przez amoniakoliazęfenyloalaninową (PAL), a powstały w ten sposób kwas trans-cynamonowy jest związkiem wyjściowym do powstania kwasu 4-kumarowego, a następnie kumaroilo-CoA. Tyrozyna ulega z kolei przekształceniu przy udziale transaminazy tyrozynowej (TAT) do kwasu 4-hydroksyfenylopirogronianowego, który jest redukowany do kwasu 4-hydroksyfenylomlekowego.Kumaroilo-CoA oraz kwas 4-hydroksyfenylomlekowy stanowią bezpośrednie substraty do syntezy kwasu rozmarynowego. Enzymem zaangażowanym w tworzenie wiązania estrowego pomiędzy grupą karboksylową kwasu kumarowego, a grupą hydroksylową kwasu 4-hydroksyfenylomlekowego jest syntaza kwasu rozmarynowego (RAS, ang. rosmarinic acid synthase). Powstały ester jest następnie hydroksylowany w pozycjach 3 oraz 3' pierścienia aromatycznego, przy udziale dwóch odrębnych cytochromów P450, a produktem końcowym reakcji jest kwas rozmarynowy [14-16]. Poza naturalną zawartością kwasu rozmarynowego w roślinach, fenolokwas ten można otrzymywać na drodze układów biotechnologicznych. Jako pierwsze zastosowano do tego celu kultury komórek Coleus blumei. Dzięki ściśle kontrolowanym warunkomin vitro można otrzymać wysoką zawartość pożądanego surowca, którego synteza może być zwiększana przez zastosowanie aktywatorów indukujących syntezę wtórnych metabolitów roślinnych [18]. Aktywatorami syntezy kwasu rozmarynowego mogą być różnego typu elicytory lub regulatory wzrostu i rozwoju roślin – np. jasmonian metylu (MeJA, ang. methyl jasmonate) [14]. MeJA odgrywa ważną rolę w aktywacji ekspresji genów biosyntezy fenylopropanoidów – podawanie tego związku powoduje zwiększenie poziomu transkryptów genów ArPAL, ArC4H i Ar4CL, a dzięki temu wzmożone gromadzenie kwasu rozmarynowego. Jako wydajne w otrzymywaniu metabolitów wtórnych otrzymywania metabolitów wskazuje się także kultury korzeni włośnikowatych oraz kultury pędów [15]. Według jednej z najnowszych prac podsumowujących aktualny stan wiedzy na temat wydajności biotechnologicznych metod uzyskiwania kwasu rozmarynowego, jego synteza w kulturach zawiesinowych może wynosić 19% suchej masy (C. blumei w medium zawierającym 4% sacharozę), 12% (Mentha piperita L., przy zastosowaniu MeJA) lub 13% (Lavandula vera DC, przy zastosowaniu siarczanu wanadu jako elicycytora). W przypadku kultur korzeni włośnikowatych, akumulacja kwasu rozmarynowego może wynosić od 2,85 do 7,8% suchej masy dla różnych gatunków roślin, takich jak Salvia miltiorrhiza, C. blumei czy Dracocephalum moldavica L. (pszczelnik mołdawski) [16]. W kulturze korzeni włośnikowatych Nepeta 222 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? cataria L. (kocimiętka właściwa), wzbogacanej putrescyną (50 mg/l) uzyskano syntezę kwasu rozmarynowego na poziomie 18,4 mg/g suchej masy [19]. W porównaniu do wcześniej wymienionych [16], najwyższą efektywność syntezy omawianego związku odnotowano wkulturze zawiesinowej Glechoma hederacea L. (bluszczyk kurdybanek), prowadzonej w medium zawierającym 2% sacharozę. W opisywanych warunkach doświadczalnychzawartość kwasu rozmarynowego osiągała 25,9% suchej masy [20]. Ryc. 2. Synteza kwasu rozmarynowego, zmodyfikowano [17, 16]; PAL – amoniakoliazafenyloalaninowa, CH4 – 4-hydroksylaza kwasu cynamonowego, 4CL – ligaza kwas kumarynowy:koenzym A, TAT – aminotransferaza tyrozynowa, HPPR – reduktaza 4-hydroksyfenylopirogronianu, RAS – syntaza kwasu rozmarynowego 223 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 4. Biodostępność i metabolizm kwasu rozmarynowego Zarówno kwas rozmarynowy, jak i ekstrakty/preparaty z rozmarynu (R. officinalis), będącego jednym z głównych źródeł tego fenolokwasu, uważane są za bezpieczne. W przeprowadzonych badaniach nie zaobserwowano działania toksycznego w/w substancji [14, 21, 22]. Metabolizm kwasu rozmarynowego nie jest jeszcze w pełni poznany, ale dostępne są dane z badań farmakologicznych prowadzonych głównie w oparciu o modele zwierzęce. Z badań na zwierzętach pochodzą też w większości informacje na temat biodostępności tego fenolokwasu [23]. Z farmakologicznego punktu widzenia, potencjalne możliwości leczniczego zastosowania kwasu rozmarynowego są znacząco zwiększane poprzez fakt, że jest on dobrze absorbowany nie tylkow przypadku podania w formie iniekcji, czy drogą pokarmową, ale także przy zastosowaniuprzezskórnym. Naniesiony na skórę, wnika do głębszych jej warstw i naczyń krwionośnych, a następnie jest przenoszony do różnych tkanek, w tym mięśniowej i kostnej [24]. Badania farmakokinetyczne wykazały szybką dystrybucję oraz usuwanie tego związku z krążenia zarówno po podaniu dożylnym, jak i po jego spożyciu. Po podaniu szczurom drogą pokarmową kwasu rozmarynowego w ilości 100 µmol/kg masy ciała, jego obecność we krwi wykrywano już po 10 min, a stężenie maksymalne w surowicy krwi pobranej z żyły wrotnej wynosiło 1,36 µmol/l [25]. Dla kwasu rozmarynowego podanego w ekstrakcie z szałwii czerwonokorzeniowej (Salviae miltiorrhizae Bunge) dożylnie (80 mg/kg masy ciała), biologiczny czas półtrwania w fazie eliminacji (t 1/2) wynosił 56,45±0,67 min, natomiast po podaniu drogą pokarmową (800 mg/kg masy ciała) t1/2 wynosił 63,68±1,11 min. Średni czas przebywania w organizmie (MRT, ang. mean residence time) dla kwasu rozmarynowego podanego dożylnie wynosił 51,43±2,36 min, a dla dostarczonego drogą pokarmową były to 104,19±2,52 min [26]. W moczu szczurów, które jednorazowo, drogą pokarmową otrzymały kwas rozmarynowy w dawce 200 mg/kg, zidentyfikowano następujące metabolity: 4-O-siarczan kwasu trans-kawowego, kwas trans-kawowy, kwas trans-m-kumarowy, 3-O-siarczan kwasu transm-kumarowego, 4-O-siarczan kwasu trans-ferulowego, kwas m-hydroksyfenylopropionowy oraz związek podstawowy (kwas rozmarynowy). W żółci badanych zwierząt nie wykryto metabolitów ani związku wyjściowego, co sugeruje, że główną drogą wydalania kwasu rozmarynowego jest mocz. Pomiary poziomu kwasu rozmarynowego oraz wyżej wspomnianych metabolitów w moczu szczurów po 48 godzinach od podania drogą pokarmową wykazały obecność łącznie 31,8% podanej dawkifenolokwasu, natomiast nie stwierdzono ich obecności w żółci [27]. 224 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? W procesie absorpcji spożytych fenolokwasów, w tym kwasu rozmarynowego uczestniczą białka transportowe z rodziny MCT (ang. monocarboxylic acid transporter), umożliwiające wniknięcie do komórek jelita kwasom fenolowym i ich pochodnym wytworzonym przez mikroflorę jelitową [28]. Metabolizm kwasu rozmarynowego obejmuje jego hydrolizę w wyniku działania hydrolaz bakteryjnych (esteraz cynamonowych), glukuronidację przy udziale UDP-transferazy glukuronowej w komórkach nabłonka jelita i wątrobie oraz dalsze przemiany obejmujące metylację oraz sprzęganie z kwasem siarkowym. W badaniu obejmującym 10 osób przyjmujących ekstrakt z Perilla frutescens w ilości odpowiadającej 200 mg kwasu rozmarynowego dziennie, wykazano obecność kwasu rozmarynowego, jego metylowej pochodnej, kwasu kawowego, kwasu ferulowego oraz śladowych ilości kwasu m-kumarowego w moczu. Zarówno w osoczu krwi, jak i w moczu uczestników badania, większość z wymienionych związków występowała w formie glukuronidowanej lub sulfonowanej [29]. 5. Główne mechanizmy przeciwzapalnego działania kwasu rozmarynowego Kwas rozmarynowy charakteryzuje się szerokim zakresem działania biologicznego, obejmującego właściwości przeciwzapalne, przeciwutleniające, przeciwwirusowe, przeciwbakteryjne, przeciwalergiczne, przeciwmutagenne, antyproliferacyjne oraz antykancerogenne [18, 14, 30]. Wymienione aktywności farmakologiczne kwasu rozmarynowego, a przede wszystkim jego działanie przeciwzapalne, są wynikiem wielu uzupełniających się molekularnych mechanizmów działania, wpływających na aktywność układu dopełniacza i syntezę mediatorów prozapalnych, a także modulujących przebieg komórkowych szlaków przekazywania sygnałów. 5.1. Hamujące działanie kwasu rozmarynowego na układ dopełniacza Badania in vitro wykazały, że efekt hamowania aktywacji białek komplementu jest wynikiem obecności polihydroksylowych pierścieni fenolowych kwasu rozmarynowego. Fenolokwas ten za pośrednictwem wolnych grup hydroksylowych łączy się z grupą tioestrową łańcucha α czynnika białkowego C3b, zapobiegając jego dalszym przemianom w konwertazę C3, odgrywającą główną rolę w aktywacji dopełniacza. W badaniach z użyciem izolowanych białek dopełniacza, kwas rozmarynowy hamował kowalencyjne przyłączenie C3b do komórek, uniemożliwiając aktywację komplementu drogą alternatywną (IC 50=34 μM). Hamowanie aktywności konwertazy C5 wymagało 1500 μM stężenia kwasu rozmarynowego, natomiast inhibicję konwertazy C3 obserwowano 225 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak przy stężeniu 10 mM. W badaniach in vitro na surowicy ludzkiej wykazano, że kwas rozmarynowy hamuje aktywację układu dopełniacza zarówno drogą klasyczną (IC50=180 μM), jak i alternatywną (IC50=160 μM) [31, 6]. 5.2. Hamowanie kaskady przemian kwasu arachidonowego Produkty przemiany kwasu arachidonowego powstają na drodze dwóch głównych szlaków: przemian z udziałem cyklooksygenaz (konstytutywnej COX-1 oraz indukowalnej COX-2), prowadzących do wytworzenia prostanoidów (prostaglandyn, prostacykliny i tromboksanów) oraz reakcji katalizowanych przez lipooksygenazę, których końcowymi produktami są leukotrieny i lipoksyny [32]. Spośród prostanoidów najsilniejszą aktywność prozapalną wykazuje prostaglandyna E2(PGE2) [33]. Badania in vitro prowadzone na makrofagach linii RAW 264.7 wykazały hamowanie aktywności COX-2 oraz znaczne obniżenie poziomu PGE2, zarówno przez izolowany kwas rozmarynowy, jak etanolowy ekstrakt z Prunella vulgaris zawierający ten fenolokwas [34]. W doświadczeniu prowadzonym na zwierzęcym modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem, podawanie kwasu rozmarynowego (50 mg/kg masy ciała/dzień) obniżało poziom maziowych markerów zapalnych, w tym COX-2 [35]. 5.3. Hamowanie syntezy mediatorów stanu zapalnego Kwas rozmarynowy może również odgrywać istotną rolę w hamowaniu powstawania mediatorów prozapalnych oraz obniżaniu ich aktywności. Badania potwierdzające te założenia przeprowadzono m.in. na komórkach linii Caco-2 (nowotworu jelita grubego) inkubowanych z grupą czynników stymulujących proces zapalny (IL-1β – 25 ng/ml; TNF-α – 50 ng/ml; IFN-γ 50 – ng/ml; LPS – 1 µg/ml), powodujących ok. 80-krotny wzrost wydzielania interleukin: IL-6 oraz IL-8. Spośród kilku badanych związków fenolowych (kwas rozmarynowy, kwas chlorogenowy, skopoletyna, artemizynina, izokwercetyna) najsilniejszą inhibicję uwalniania IL-6 i IL-8 odnotowano dla kwasu rozmarynowego [36]. Stosując komórki śródbłonka jako model badawczy zaobserwowano, że kwas rozmarynowy (w zakresie stężeń 0,1-2 µM) hamuje proces fosforylacji kinaz aktywowanych przez mitogeny (MAP, ang. mitogen-activated kinases) należących do rodzin p38, ERK i JNK [37]. Silne zahamowanie przekazywania sygnału z udziałem kinaz MAP z grupy ERK przez kwas rozmarynowy potwierdzono również in vivo, badając myszy z ostrym uszkodzeniem płuc. Kwas rozmarynowy (w dawce 5 mg/kg) ograniczał wydzielanie cytokin: TNF-α i IL-6, jednak tylko najwyższa dawka (20 mg/kg) powodowała istotne statystycznie zahamowanie uwalniania IL-1β [38]. Podawanie ekstraktu z Perilla sp. (1,5 mg/mysz) zawierającego kwas rozmarynowy 226 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? powodowało redukcję liczby eozynofili, a także obniżenie poziomu IL-4 i IL-5 oraz eotaksyny(CCL11, ang. chemokine (C-C motif) ligand 11)) w płynie oskrzelowo-pęcherzykowym zwierząt z eozynofilowym zapaleniem płuc [39]. Przeciwzapalne działanie kwasu rozmarynowego może również obejmować inhibicję syntezy i aktywności biologicznej białka o wysokiej mobilności (ang. high mobility group box 1 protein, HMGB1), stanwiącego jedną z głównych cytokin biorących udział w procesach zapalnych o różnej etiologii. Stosując kwas rozmarynowy (1 i 2 µM), wyizolowany z liści Perillafrutescens, w 2013 roku zespół koreańskich badaczy [40] wykazał hamujący wpływ tego fenolokwasu na uwalnianie cytokiny HMGB1 z komórek śródbłonka, stymulowanych lipopolisacharydem. Wpływ kwasu rozmarynowego na odpowiedź zapalną z udziałem białka HMGB1 potwierdzono również w badaniach in vivo prowadzonych przez ten zespół. Podawany myszom dożylnie (w dawkach 0,7 i 1,4 µg/mysz), kwas rozmarynowy hamował uwalnianie białka HMGB1 w mysich makrofagach i ograniczał migrację leukocytów. Wśród badanych zwierząt stwierdzono także zmniejszenie śmiertelności na skutek występowania posocznicy. 5.4. Wpływ kwasu rozmarynowego na aktywację i aktywność czynnika NF-κB Rodzina białek określanych jako NF-κB obejmuje czynniki transkrypcyjne zaangażowane w regulację ekspresji genów kluczowych dla wystąpienia odpowiedzi zapalnej. Stała (konstytutywna) aktywacja NF-κB zachodzi jedynie w dojrzałych limfocytach B, natomiast w pozostałych typach komórek podlega ona ścisłej regulacji fizjologicznej [41], a także może być modulowana poprzez czynniki/substancje egzogenne.Badania in vitro na ludzkich fibroblastach skóry i komórkach NIH3T3 wykazały, że kwas rozmarynowy silnie hamuje ekspresję chemokinyCCL11 orazreceptora CCR3 (ang. CC chemokine receptor 3), indukowaną poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB. Mechanizm tego działania opiera się na zmniejszeniu aktywności kinazy inhibitora NF-κB, co blokuje fosforylację inhibitora i jego degradację – a w konsekwencji zapobiega translokacji kompleksu białek NF-κBdo jądra komórkowego [42]. Ponadto, stwierdzono działanie supresorowekwasu rozmarynowego wobec zwiększonej ekspresji MCP-1 (ang. monocyte chemoattractant protein-1) i MIP-1α (ang. macrophage inflammatory protein-1α), będące wynikiem hamowania fosforylacji kinaz MAP i blokowania szlaku sygnalizacyjnego indukowanego działaniem NF-κB [43]. Wpływ fenolokwasu na szlak odpowiedzi prozapalnej zależnej od aktywności czynnika NF-κB obejmuje także inhibicję aktywności kinazy białkowej C oraz spadek poziomu mediatorów zapalenia, w tym białek 227 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak adhezyjnych (ICAM-1 – ang. intercellular adhesion molecule 1, VCAM-1 – ang. vascular cell adhesion molecule 1) i chemokiny MIP-2 (ang. macrophage inflammatory protein 2) oraz spadek aktywności COX-2 [44]. Ostatnio, badania chorwackiego zespołu naukowców [45] dotyczące hamowania ekspresji czynnika NF-κB oraz syntezy TNF-α potwierdziły wyniki uzyskane przez innych badaczy. Wspomniani autorzy wykazali ponadto, że kwas rozmarynowy (1-5 mg/kg) redukuje in vivo ekspresję p53, kaspazy-3 oraz fosforylację białka p53 w nerkach myszy narażonych na toksyczne działanie cisplatyny 5.5. Wpływ przeciwzapalnej aktywności kwasu rozmarynowego na układ immunologiczny Kwas rozmarynowy wpływa na układ immunologiczny głównie poprzez selektywną indukcję apoptozy komórek T – limfocytów, biorących udział w procesach niszczenia komórek w przebiegu chorób autoimmunologicznych. Działa on jako antagonista w domenie SH2 jądrowego DNA limfocytów, hamując aktywność komórek T oraz ich zdolność do stymulacji syntezy i uwalniania prozapalnych interleukin. Ponadto, kwas rozmarynowy hamuje wydzielanie interferonu-γ (IFN-γ), który pobudzając komórki układu immunologicznego: komórki T, komórki NK i makrofagi stymuluje proces reakcji zapalnej [46]. Doświadczenia in vitro na modelu astmy alergicznej wykazały, że podawanie ekstraktu z Perilla sp. o 68% zawartości kwasu rozmarynowego spowodowało znaczne zahamowanie uwalniania histaminy zwiększającej przepuszczalność naczyń krwionośnych oraz alergeno-specyficznych przeciwciał IgE i IgG1 odpowiedzialnych za degranulację eozynofili oraz wywołanie objawów alergii [39]. Badania kliniczne z udziałem pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów także potwierdziły, że kwas rozmarynowy powoduje indukcję apoptozy w aktywowanych ludzkich komórkach T [47]. Opisywany fenolokwas hamuje również ekspresję IL-2, indukowaną za pośrednictwem receptora antygenu komórek T (TCR, ang. T-cellantigen receptor) i ogranicza proliferację komórek T in vitro. Mechanizm inhibicyjnego działania kwasu rozmarynowego na TCR polega na blokowaniu czynnika transkrypcyjnego NF-AT (ang. nuclear factor of activated T-cells) i w konsekwencji zahamowaniu szlaku sygnalizacyjnego TCR, zależnego od jonów Ca2+. Ponadto, kwas rozmarynowy hamuje aktywację NF-AT poprzez blokowanie fosforylacji Itk (ang. inducible T cells kinase) -enzymu należącego do grupy białkowych kinaz tyrozynowych (PTKs, ang. protein tyrosine kinases) oraz fosfolipazę PLC-γ1 (ang. phospholipase C-γ1), której fosforylacja zależy od PTKs [48]. 228 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? 5.6. Przeciwwirusowe i przeciwbakteryjne działanie kwasu rozmarynowego Podczas badań nad mechanizmami działania kwasu rozmarynowego stwierdzono jego silną aktywność przeciwwirusową i antybakteryjną. Zdolność neutralizacji patogenów oraz ich toksyn inicjujących proces zapalny w organizmie zwiększa leczniczy potencjał tego fenolokwasu jako silnego związku przeciwzapalnego. Kwas rozmarynowy hamuje replikację wirusa HIV-1 w ludzkich leukocytach MT-4 działając jako niespecyficzny inhibitor integrazy i odwrotnej transkryptazy [30]. Aktywność przeciwwirusową zaobserwowano również na modelu zwierzęcym japońskiego zapalenia mózgu, gdzie podawanie kwasu rozmarynowego (25 mg/kg) spowodowało zmniejszenie śmiertelności myszy zakażonych wirusem JEV (ang. Japanese encephalitis virus) do 20%, w porównaniu z grupą kontrolną [49]. Preparaty farmaceutyczne stosowane w leczeniu opryszczki czerwieni wargowej zawierają w swoim składzie m.in. wyciąg z melisy lekarskiej ze względu na wirusostatyczne działanie kwasu rozmarynowego skierowane przeciw wirusowi opryszczki typu 1 (HSV-1) [6]. W aspekcie działania przeciwbakteryjnego zaobserwowano, że kwas rozmarynowy (0,3-1,3 mg/ml) wykazuje aktywność bakteriostatyczną i bakteriobójczą wobec 8 patogennych szczepów bakterii: Staphylococcus epidermidis 5001, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus lugdunensis T26A3, Enterococcus faecalis C159-6, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27583, Corynebacterium T25-17, Mycobacterium smegmatis 5003 oraz Staphylococcus warneri T12A12 [50]. 6. Aktywność przeciwzapalna kwasu rozmarynowego w badaniach in vitro Przeciwzapalne właściwości kwasu rozmarynowego zostały potwierdzone w badaniach z wykorzystaniem różnego typu linii komórkowych jako modeli doświadczalnych. W badaniach na ludzkich monocytach wykazano hamowanie uwalniania TNF-α z monocytów stymulowanych 12-mirystynianem,13-octanem forbolu (PMA, ang. phorbol 12-myristate 13-acetate) traktowanych kwasem rozmarynowym w stężeniach od 0,01 do 1000 nM. Najsilniejsze zahamowanie odpowiedzi zapalnej (ok. 50%) obserwowano dla stężenia 10 i 100 nM. Zaobserwowano także zmniejszenie uwalniania IL-6 z komórek traktowanych 10, 100 i 1000 nM kwasem rozmarynowym, ale nie odnotowano istotnego statystycznie wpływu badanego fenolokwasu na poziom IL-10. Analizując mechanizmy obserwowanego działania przeciwzapalnego, stwierdzono, że kwas rozmarynowy w stężeniach 10-1000 nM hamuje translokację NFĸB do jądra komórkowego monocytów stymulowanych PMA [51]. Hamujący wpływ kwasu rozmarynowego (9 µM) na aktywację NFĸB 229 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak zaobserwowano również w badaniach na linii komórek neuronalnych (SHSY5Y) stymulowanych cytokiną TNF-α [52]. Przeprowadzono także badania na ludzkich liniach komórkowych HMC-1, w których wykazano, że kwas rozmarynowy w stężeniach 0,1-10 µM hamuje syntezę IL-13, IL-1β, IL-6 oraz TNF-α w komórkach poddanych prozapalnej stymulacji limfopoetyną zrębu grasicy (TSL, ang. thymic stromal lymphopoietin). W dalszych etapach prac badawczych – in vivo, wykazano, że kwas rozmarynowy podany dożylnie w dawce 4 mg/kg u myszy ze stanem zapalnym spojówek wpływa na zmniejszenie poziomu IL-4 oraz immunoglobulin klasy E (IgE) w supernatantach otrzymanych z tkanek spojówek [53]. W badaniach in vitro na szczurzym modelu zapaleniu trzustki wywołanym taurocholanem sodu wykazano, że wcześniejsze traktowanie komórek trzustki 80 µM stężeniem kwasu rozmarynowego hamowało produkcję TNF-α oraz translokację NFĸB do jądra komórkowego. Ponadto, w dalszych badaniach in vivo, podczas których szczurom podawano kwas rozmarynowy dootrzewnono w dawce 50 mg/kg, 2 godziny przed wywołaniem stanu zapalnego trzustki (taurocholanem sodu) potwierdzono, że kwas rozmarynowy działa przeciwzapalnie. Zarówno badanie histopatologiczne, jak i pomiary markerów stanu zapalnego (spadek aktywności amylazy i lipazy w surowicy krwi, obniżenie aktywności mieloperoksydazyw tkance organu oraz zmniejszenie poziomu IL-1β, IL-6 i TNF-α) wskazały na znaczne złagodzenie przebiegu procesu zapalnego trzustki [54]. Z kolei w badaniach in vitro na tkankach wyizolowanych z jelit myszy wykazano, że kwas rozmarynowy (300 µM) hamuje ekspresję genów dla IL-6 [55]. 7. Aktywność przeciwzapalna kwasu rozmarynowego w badaniach in vivo Aktywność przeciwzapalną i neuroprotekcyjną podawanego dożylnie kwasu rozmarynowego (12,5-200 mg/kg masy ciała) wykazano w doświadczeniach in vivo na szczurzym modelu niedokrwienia i reperfuzji. Zaobserwowano, że kwas rozmarynowy w dawkach powyżej 50 mg/kg wykazuje działanie neuroprotekcyjne zarówno po natychmiastowym, jak i opóźnionym podaniu go zwierzętom po wywołaniu niedokrwieniu/reperfuzji. W obrazie histopatologicznym stwierdzono wyraźne zmniejszenie obrzęku mózgu i uszkodzeń wywołanych niedokrwieniem i reperfuzją. Dalsze badania wykazały ponadto zahamowanie aktywacji NF-κB w tkance nerwowej [52]. Korzystny wpływ leczenia kwasem rozmarynowym w (150 mg/kg masy ciała) potwierdzono również badaniach dotyczących możliwości ograniczenia uszkodzeń wątroby wywołanych niedokrwieniem i reperfuzją (wywołaną zastosowaniem zacisku blokującego mikrokrążenie w wątrobie szczurów) [56]. Farmakologiczne efekty zastosowania kwasu rozmarynowego 230 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? obejmowały ograniczenie stresu oksydacyjnego (odnotowano spadek aktywności syntaz tlenku azotu: śródbłonkowej i indukowalnej) oraz osłabienie odpowiedzi zapalnej będące skutkiem hamowania aktywacji czynnika NF-κBw hepatocytach. Na zwierzęcym modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem, wykazano również, że kwas rozmarynowy znacząco przyczynia się do hamowania odczynu zapalnego. U zwierząt, którym podawano kwas rozmarynowy (50mg/kg/dzień) stwierdzono obniżenie poziomu maziowych markerów zapalnych, w tym aktywności COX-2 [35]. Efekt przeciwzapalny stwierdzono także stosując mysi model japońskiego zapalenia mózgu (JE, ang. japanese encephalitis) – u zwierząt leczonych kwasem rozmarynowym (25 mg/kg masy ciała) odnotowano bardzo wyraźny spadek poziomu prozapalnych cytokin: IL-12 (5-krotny), TNF-α (18-krotny), INF-γ (6-krotny), MPC-1 (100-krotny) i IL-6 (9-krotny), w porównaniu do grupy zainfekowanych zwierząt, którym nie podawano kwasu. Aby potwierdzić wyniki badań in vivo przeprowadzono dodatkowe doświadczenia na linii mysich komórek mikrogleju BV-2. W zainfekowanych komórkach BV-2 traktowanych kwasem rozmarynowym zaobserwowano znaczną redukcję poziomu cytokin IL-12 (13-krotny), TNF-α (14-krotny), INF-γ (12-krotny), MCP-1 (25-krotny), IL-6 (12,5-krotny) w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Stwierdzono ponadto, że kwas rozmarynowy nie wykazuje cytotoksyczności w stosunku do zdrowych komórek, dlatego też może być potencjalnym środkiem przydatnym w leczeniu powikłań neurologicznych, obserwowanych u pacjentów z japońskim zapaleniem mózgu [49]. Stosując model badawczy zwierząt z obrzękiem łapy wywołanym karagenem wykazano efekt terapeutyczny kwasu rozmarynowego uzyskanego z metanolowego ekstraktu z Cordia sinensis Lam. (cyprzyn) [57] oraz fenolokwasu wyizolowanego z liści Baccaurea ramiflora Lour. [58]. Wysoką efektywność przeciwzapalnego działania kwasu rozmarynowego potwierdzono także w badaniach na szczurzym modelu zapalenia opłucnej wywołanej karagenem [59]. Już przy jednorazowym, dootrzewnowym podaniu szczurom kwasu rozmarynowego w dawce 5 mg/kg odnotowano 66% redukcję migracji leukocytów, natomiast po podaniu zwierzętom kwasu w dawce 10 mg/kg masy ciała zahamowanie migracji leukocytów wynosiło 92,9%. Kwas rozmarynowy może ograniczać również rozwój reakcji zapalnej indukowanej lipopolisacharydem bakteryjnym (LPS). Podawany myszom w dawkach 5, 10, 20 mg/kg poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie hamował uwalnianie TNF-α, IL-6 i IL-1. W badaniach molekularnych mechanizmów obserwowanych zmian, stwierdzono, że stymulacja LPS prowadziła do fosforylacji i aktywacji kinaz MAP z rodzin p38, JNK oraz ERK w tkankach płuc myszy. Analiza obserwowanego efektu farmakologicznego wykazała, że podawanie kwasu 231 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak rozmarynowego hamuje fosforylację kinaz ERK, ale nie wpływa na p38 i JNK [38]. Hamujący wpływ kwasu rozmarynowego na szlaki przekazywania sygnałów z udziałem kinaz JNK oraz p38 opisali natomiast Govindaray i Pillani (2015). Badacze wykazali, że badany fenolokwas (100 mg/kg) podawany drogą pokarmową hamuje aktywację czynnika NF-κB, obniża poziom cytokin prozapalnych (TNF-α, IL-1β, IL-6) oraz zmniejsza generowanie tlenku azotu w osoczu i tkankach trzustki [60]. Wpływ kwasu rozmarynowego na rozwijający się proces zapalny badano również na komórkach śródbłonka aorty szczurów z cukrzycą [61]. Podawanie szczurom streptozocyny indukowało objawy cukrzycy takie jak hiperglikemia, zmniejszenie masy ciała, wzrost zapotrzebowania na wodę i zwiększenie dziennej ilości wydalanego moczu. Hiperglikemia powoduje uruchomienie szlaków przekazywania sygnałów prowadzących do rozwinięcia odczynu zapalnego. Za osłabienie rozkurczu aorty jest odpowiedzialne cukrzyco-zależne uszkodzenie śródbłonka, a nie osłabienie funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Uszkodzony śródbłonek jest przyczyną diapedezy leukocytów i makrofagów, może mieć również wpływ na transport lipidów podtrzymując w ten sposób zmiany struktury naczyń krwionośnych i rozwój procesów zapalnych. Zapalenie wywołane przez cukrzycę przejawiało się przede wszystkim dwukrotnie wyższym stężeniem cytokin prozapalnych IL-1 i TNF-α, hamujących wydzielanie tlenku azotu (odpowiedzialnego za działanie rozkurczowe) przez śródbłonek. Ponadto, IL-1 oraz IL-6 przyczyniały się do wzrostu poziomu preproendoteliny oraz enzymów przekształcających ją w endotelinę-1 (ET-1) – białko wykazujące silne działanie wazokonstrykcyjne. W grupie myszy karmionych kwasem rozmarynowym (50 mg/kg/dzień) nie wystąpiły żadne z typowych objawów cukrzycy, a stężenie cytokin prozapalnych: IL-1 i TNF-α spadło do poziomu prób kontrolnych. Pomimo, że cukrzyca nie powodowała wzrostu stężenia IL-6 w komórkach śródbłonka aorty, podawanie kwasu rozmarynowego prowadziło również do zmniejszenia uwalniania tej interleukiny. Ponadto, kwas rozmarynowy hamował ekspresję receptorów dla endoteliny: ETA, ETB, ECE-1, nie wpływając przy tym bezpośrednio na ekspresję ET-1, dzięki czemu przyczyniał się do znacznej poprawy funkcjonowania śródbłonka. Po podaniu kwasu rozmarynowego, zaobserwowano również poprawę wazorelaksacyjnej odpowiedzi ściany aorty na acetylocholinę. Ze względu na uzupełniające się właściwości kardioprotekcyjne kwasu rozmarynowego, jest on uważany za obiecujący środek pomocny w leczeniu chorób naczyniowych z odczynem zapalnym [61]. 232 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? 8. Aktywność przeciwzapalna ekstraktów roślinnych bogatych w kwas rozmarynowy w badaniach in vitro W przypadku ekstraktów roślinnych zawierających kwas rozmarynowy, ich właściwości przeciwzapalne są przypisywane głównie obecności tego związku. Jednocześnie wiadomo, że w badaniach preparatów o charakterze złożonym, obserwowanyefekt może być wynikiem aktywności jednej substancji czynnej lub synergistycznego działania wielu składników ekstraktu. Aby potwierdzić udział kwasu rozmarynowego w aktywności farmakologicznej takich preparatów, doświadczenia na ogół (choć nie zawsze) obejmują badania porównawcze działania ekstraktu bogatego w fenolokwas oraz samego kwasu rozmarynowego. Rozmaryn lekarski (R. officinalis) to jedno z głównych źródeł kwasu rozmarynowego. W ostatnich latach właściwości przeciwzapalne ekstraktów z tej rośliny potwierdziło kilka zespołów badawczych, m.in. Tsai i wsp. (2013) [62]. W doświadczeniach na linii monocytów (THP-1) stymulowanych Gram(+) pałeczką Propionibacterium acnes, naukowcy wykazali, że etanolowy ekstrakt z liści rozmarynu (50-200 µg/ml) jest inhibitorem aktywacji czynnika NF-ĸB, co powoduje zahamowanie tworzenia mRNA niezbędnego do syntezy czynników prozapalnych i sekrecji IL-8, IL-1β. W dalszych pracach badawczych in vivo (doświadczenia na myszach, u których stan zapalny wywołano poprzez zakażenie bakteriami P. acnes) zaobserwowano zahamowanie aktywacji NF-ĸB oraz ekspresji mRNA dla receptora Toll-like 2 (TLR 2) [62]. Właściwości przeciwzapalne stwierdzono także w badaniach innych ekstraktów roślinnych zawierających kwas rozmarynowy. Etanolowy ekstrakt z Glechoma hederacea odm. longituba (Labiatae), bogaty w kwas rozmarynowy i związki pokrewne, hamował działanie NFĸB w komórkach linii HepG2. Pomiary tworzenia TNF-α w badanych komórkach, traktowanych kwasem rozmarynowym lub innymi związkami izolowanymi z G. hederacea var. longituba (mleczan izofurylo-metylo-7-(3,4-dihydroksyfenylowy), rozmarynian metylu oraz rozmarynian etylu) w stężeniach 0,1-20 µM, wykazały wyraźny spadek poziomu tej cytokiny przy stężeniu 10 i 20 µM [63]. Z kolei w badaniach in vitro prowadzonych na komórkach białaczki (linia THP-1) wykazano, że zawierający kwas rozmarynowy metanolowy ekstrakt z liści macierzanki (Thymus longicaulis) hamuje ekspresję genów COX-2 [64]. Aktywność hamowania syntezy prozapalnej PGE 2 oraz uwalniania tlenku azotu przez preparaty roślinne zawierające kwas rozmarynowy wykazano także w badaniach na makrofagach linii RAW 264.7 stymulowanych LPS. Stosując m.in. ekstrakt etanolowy z Prunella vulgaris (głowienka pospolita), stwierdzono inhibicję aktywności COX-2 [34, 33] oraz syntazy tlenku azotu (iNOS) [34]. 233 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak W badaniach oceniających działanie przeciwzapalne ekstraktu z rozmarynu z użyciem prawidłowych ludzkich linii komórkowych pochodzących z wątroby oraz ludzkich linii komórkowych raka wątroby wykazano zależne od stężenia ekstraktu (0,5-5 µg/ml) hamowanie tworzenia TNF-α w komórkach nowotworowych. Ponadto, w stężeniach powyżej 1,56 µg/ml, ekstrakt hamował produkcję NO w komórkach makrofagów RAW 267.4 stymulowanych LPS-em [65]. Ekstrakt z nasion Mentha spicata zawierający kwas rozmarynowy (49,3µg/ml) hamował natomiast uwalnianie NO i PGE2 w badaniach prowadzonych na mikrosomach z wątroby szczurów stymulowanych lipopolisacharydem [66]. 9. Aktywność przeciwzapalna ekstraktów roślinnych bogatych w kwas rozmarynowy w badaniach in vivo Przeciwzapalne właściwości ekstraktu z liści P. frutescens (w dziennej dawce 100 mg/kg masy ciała) potwierdzono na mysim modelu zapalenia płuc wywołanego endotoksyną bakteryjną. W opisywanych badaniach monitorowano syntezę TNF-α, będącego jedną z głównych chemokin zaangażowanych w rozwój stanów zapalnych płuc i uważanego za biomarker schorzeń dolnych dróg oddechowych. Zaobserwowano, że ekstrakt etanolowy redukuje wytwarzanie TNF-α aż o 79,1%. Dla porównania – stosując w tym samym badaniu steroidowy lek przeciwzapalny, deksametazon w dawce 30 mg/kg, odnotowano spadek syntezy TNF-α o 88,2% [67].Dostępna literatura wskazuje również, że kwas rozmarynowy lub zawierające go ekstrakty mogą być także przydatne w hamowaniu odpowiedzi zapalnej o podłożu immunologicznym. Badania na myszach z alergicznym zapaleniem układu oddechowego wykazały, ekstrakt z liści Perilla sp. (w dawce 1,5 mg/mysz/dzień) powoduje zahamowanie uwalniania histaminy, a także wywołanej interleukiną 4 produkcji alergenospecyficznych swoistych przeciwciał IgE i IgG1, odpowiedzialnych za degranulację eozynofili (granulocytów kwasochłonnych) i wywołanie objawów alergii [39]. Przeciwzapalny efekt zaobserwowano także na mysim modelu astmy alergicznej w badaniach kwasu rozmarynowego (2-200 mg/kg, podawanego dootrzewnowo) i zawierających ten związek ekstraktów z bazylii eugenolowej (Ocimum gratissimum L.) w dawkach 25-100 mg/kg masy ciała (podawanego droga pokarmową) [68].Wykazano ponadto skuteczność działania kwasu rozmarynowego w leczeniu ostrych stanów zapalnych o charakterze miejscowym. Przeprowadzono badania, w których myszom z wywołanym dekstranem siarczanu sodu zapaleniem okrężnicy podawano przez 7 dni 0,54% ekstrakt z liści Perilla frutescens. Zaobserwowano osłabienie odpowiedzi prozapalnej, przejawiające się zmniejszeniem poziomu TNF-α, IL-17A i IL-10 oraz obniżenie ekspresji mRNA dla TNF-α i IL-17A [69]. Z kolei, w badaniach na szczurach, u których wywołano obrzęk łapy karagenem wykazano, że kwas rozma- 234 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? rynowy lub metanolowy ekstrakt z liści Rosmarinus officinalis w dawce 25 mg/kg powoduje zmniejszenie obrzęku łapy o około 60% [70]. Efekt przeciwzapalny stwierdzono także w innym badaniu, dotyczącym oceny miejscowego działania przeciwzapalnego etanolowego ekstraktu z liści Solanum corymbiflorum (Sendtn.) Bohs, wstrzykiwanego w dawkach 0,00001-1 mg do objętych procesem zapalnym uszu badanych zwierząt [71]. 10. Kwas rozmarynowy jako naturalny niesteroidowy lek przeciwzapalny – perspektywy Właściwości lecznicze kwasu rozmarynowego oraz efektywność jego działania farmakologicznego są intensywnie badane – w większości są to jednak prace badawcze na modelach zwierzęcych. Niewielka liczba badań klinicznych dotyczących tego związku utrudnia ocenę jego użyteczności w terapii różnych jednostek chorobowych. Co więcej, fenolokwas ten jest również bardzo słabo zbadany pod kątem zastosowania jego właściwości (w tym działania przeciwzapalnego) w ochronie układu sercowo-naczyniowego. Problem ten podkreślono nawet w jednej z ostatnich meta-analiz dostępnego piśmiennictwa, poświęconej właśnie tematyce potencjalnych leczniczych zastosowań tego związku [72]. Zaczynają się jednak pojawiać pojedyncze doniesienia, sugerujące możliwość wykorzystania kwasu rozmarynowego jako związku kardioprotekcyjnego [61]. Omawiając perspektywy zastosowania kwasu rozmarynowego w celach leczniczych, należy również zaznaczyć, że jego aktywność farmakologiczna może różnić się w zależności od gatunku badanego organizmu, a także wykazywać odmienną specyficzność tkankową i narządową [55]. Jako organ charakteryzujący się wyższą akumulacją tego fenolokwasu wskazuje się płuca, z tego też powodu uważa się, że kwas rozmarynowy stanowi obiecującą substancję leczniczą w terapii alergii oraz astmy [46]. W 2008 roku opublikowano wyniki badania klinicznego obejmującego pacjentów ze zdiagnozowanym atopowym zapaleniem skóry, wskazujące na skuteczność stosowania emulsji zawierającej 0,03% kwas rozmarynowy w leczeniu tego schorzenia [73]. Jak dotąd, badania właściwości farmakologicznych kwasu rozmarynowego nie zakończyły się jeszcze wprowadzeniem zarejestrowanego środka leczniczego, opartego na tym fenolokwasie. Prowadzone są jednak prace badawcze nad opracowaniem formulacji leków zawierających kwas rozmarynowy lub bogate w ten związek wyciągi roślinne, przeznaczonych do stosowania zewnętrznego, które mogą być przydatne w terapii przewlekłych stanów zapalnych skóry [74]. Na rynku suplementów diety obecne są natomiast różnorodne preparaty zawierające ten związek, najczęściej w postaci ekstraktów roślinnych otrzymywanych z liści rozmarynu lekarskiego, lebiodki pospolitej (oregano) lub pachnotki zwyczajnej. Ze względu na szeroki zakres aktywności biologicznej kwasu rozmarynowego, środki te są rekomendowane jako 235 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak naturalne uzupełnienie diety w przeciwutleniacze, profilaktyka przeciwstarzeniowa, wsparcie funkcji układu pokarmowego (ułatwienie trawienia) lub jako preparaty o działaniu przeciwalergicznym. 11. Podsumowanie Kwas rozmarynowy stanowi obiecującą alternatywę dla stosowanych syntetycznych substancji o działaniu przeciwzapalnym. Jego właściwości farmakologiczne (podobne do niesteroidowych leków przeciwzapalnych) są wynikiem uzupełniających się mechanizmów działania, zaobserwowanych zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo. Należy zwrócić uwagę na to, że kwas rozmarynowy to związek pochodzenia naturalnego, co wiąże się z większym bezpieczeństwem stosowania. Najnowsze dane sugerują, że również ekstrakty roślinne bogate w ten związek wykazują działanie przeciwzapalne, co może być wykorzystane w fitoterapii, niezbędne są jednak dalsze prace badawcze – zwłaszcza badania kliniczne. Praca finansowana ze środków Katedry Biochemii Ogólnej UŁ (506/1136). Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Reguła J., Wocial T., Kraszewska E., Butruk E. Stosowanie niesteroidowych leków przeciwzapalnych w Polsce – badanie ankietowe u 38 tysięcy chorych, Gastroenterologia Kliniczna, 3/2 (2011), s. 72-78 Kozłowski P., Cuch B., Kozłowska M., Kozłowska K., Jędrzejewska B. Analiza nawyków i zachowań związanych ze stosowaniem środków przeciwbólowych dostępnych bez recepty, Journal of Education, Health and Sport, 5/3 (2015), s. 174-182 Meek I. L., van de Laar M. A. F. J., Vonkeman H. E. Non-steroidal antiinflammatory drugs: an overview of cardiovascular risks, Pharmaceuticals, 3 (2010), s. 2146-2162 Glück J. Nadwrażliwość na niesteroidowe leki przeciwzapalne, Przegląd Medyczny Uniwersytetu Rzeszowskiego i Narodowego Instytutu Leków w Warszawie, Rzeszów, 2 (2012), s. 157-166 Danelich I. M., Wright S. S., Lose J. M., Tefft B. J., Cicci J. D., Reed B. N. Safety of nonsteroidal antiinflammatory drugs in patients with cardiovascular disease, Pharmacotherapy, 35/5 (2015), s. 520-535 Fecka I., Mazur A., Cisowski W. Kwas rozmarynowy, ważny składnik terapeutyczny niektórych surowców roślinnych, Postępy Fitoterapii, 1-2 (2002), s. 20-25 Park J. B. Identification and quantification of a major anti-oxidant and antiinflammatory phenolic compound found in basil, lemon thyme, mint, oregano, rosemary, sage, and thyme, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 62/6 (2011), s. 577-584 Gawlik-Dziki U. Fenolokwasy jako bioaktywne składniki żywności, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 4/41 (2004), s. 29-40 236 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Shekarchi M., Hajimehdipoor H., Saeidnia S., Gohari A. R., Hamedani M. P. Comparative study of rosmarinic acid content in some plants of Labiatae family, Pharmacognosy Magazine, 8 (2012), s. 37-41 Amoah S. K. S., Sandjo L. P., Kratz J. M., Biavatti M. W. Rosmarinic acid – pharmaceutical and clinical aspects, Planta Medica, (2015) http://dx.doi.org/10.1055/s-0035-1568274 Ly T. N., Shimoyamada M., Yamauchi R. Isolation and characterization of rosmarinic acid oligomers in celastrushindsiibenth leaves and their antioxidative activity, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (2006), s. 3786-3793 Zhou L. Y., Liu H. Y., Xie B. B., Liu Z. H., Chen C. X. Two new glycosides from sanicula lamelligera, Z. Naturforsch, 61b (2006), s. 607-610 Borrás-Linares I., Stojanović Z., Quirantes-Piné R., Arráez-Román D., ŃvarcGajić J., Fernández-Gutiérrez A., Segura-Carretero A. Rosmarinus officinalis leaves as a natural source of bioactive compounds, International Journal of Molecular Sciences, 15 (2014), s. 20585-20606 Petersen M., Simmonds M. S. J. Rosmarinic acid, Phytochemistry, 62 (2003), s. 121-125 Kim Y. B., Kim J. K., Uddin M. R., Xu H., Park W. T., TuanP. A., Li X., Chung E., Lee J. H., Park S. U. Metabolomics analysis and biosynthesis of rosmarinic acid in agastacherugosakuntze treated with methyl jasmonate, Plos One, 8/5 (2013), s. 1-8 Khojasteh A., Mirjalili M. H., Hidalgo D., Corchete P., Palazon J. New trends in biotechnologicalproduction of rosmarinic acid, Biotechnology Letters, 36/12 (2014), s. 2393-2406 Petersen M., Abdullah Y., Benner J., Eberle D., Gehlen K., Hücherig S., Janiak V., Kim K. H., Sander M., Weitzel C., Wolters S. Evolution of rosmarinic acid biosynthesis, Phytochemistry, 70 (2009), s. 1663-1679 Park S. U., Uddin M. R., Xu H., Kim Y. K., Lee S. Y. Biotechnological applications for rosmarinic acid production in plant, African Journal of Biotechnology, 7/25 (2008), s. 4959-4965 Yang Y. K., Lee S. Y., Park W. T., Park N. I., Park S. U. Exogenous auxins and polyamines enhance growth and rosmarinic acid production in hairy root cultures of Nepetacataria L, Plant Omics Journal, 3 (2010), s. 190-193 Döring A. S., Petersen M. Production of caffeic, chlorogenic and rosmarinic acids in plants and suspension cultures of Glechoma hederacea, Phytochemistry Letters, 10 (2014), s. 111-117 Ngo S. N., Williams D. B., Head R. J. Rosemary and cancer prevention: preclinical perspectives, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 51/10 (2011), s. 946-954 Rossi F., Jullian V., Pawlowiez R., Kumar-Roiné S., Haddad M., Darius H. T., Gaertner-Mazouni N., Chinain M., Laurent D. Protective effect of heliotropiumfoertherianum (Boraginaceae) folk remedy and its active compound, rosmarinic acid, against a pacific ciguatoxin, Journal of Ethnopharmacology, 143/1 (2012), s. 33-40 237 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 23. Nunes S., Madureira R., Campos D., Sarmento B., Gomes A. M., Pintado M. M., Reis F. Therapeutic and nutraceutical potential of rosmarinic acid – cytoprotective properties and pharmacokinetic profile, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, (2015) DOI: 10.1080/10408398.2015.1006768 24. Ritschel W. A., Starzacher A., Sabouni A., Hussain A. S., Koch H. P. Percutaneous absorption of rosmarinic acid in the rat, Methods and findings in experimental and clinical pharmacology, 11/5 (1989), s. 345-352 25. Konishi Y., Hitomi Y., Yoshida M., Yoshioka E. Pharmacokinetic study of caffeic and rosmarinic acids in rats after oral administration, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53/12 (2005), s. 4740-4746 26. Lai X. J., Zhang L., Li J. S., Liu H. Q., Liu X. H., Di L. Q., Cai B. C., Chen L.H. Comparative pharmacokinetic and bioavailability studies of three salvianolic acids after the administration of Salviaemiltiorrhizae alone or with syntheticalborneol in rats, Fitoterapia, 82/6 (2011), s. 883-888 27. Nakazawa T., Ohsawa K. Metabolism of rosmarinic acid in rats, Journal of Natural Products, 61 (1998), s. 993-996 28. Konishi Y., Kobayashi S. Transepithelial transport of chlorogenic acid, caffeic acid, and their colonic metabolites in intestinal Caco-2 cell monolayers, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52/9 (2004), s. 2518-2526 29. Baba S., Osakabe N., Natsume M., Yasuda A., Muto Y., Hiyoshi K., Takano H., Yoshikawa T., Terao J. Absorption, metabolism, degradation and urinary excretion of rosmarinic acid after intake of Perilla frutescens extract in humans, European Journal of Nutrition, 44/1 (2005), s. 1-9 30. Kim G. D., Park Y. S., Jin Y. H., Park C. S. Production and applications of rosmarinic acid and structurally related compounds, Applied Microbiology and Biotechnology, 99 (2015), s. 2083-2092 31. Sahu A., Rawal N., Pangburn M. K. Inhibition of complement by covalent attachment of rosmarinic acid to activated C3b, Biochemical Pharmacology, 57/12 (1999), s. 1439-1446 32. Całoksiński I., Dobrzyński M., Całoksińska M., Seweryn E., BronowickaSzydełko A., Dzierzba K., Ceremuga I., Gamian A. Charakterystyka odczynu zapalnego, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 63 (2009), s. 395-408 33. Kim M. The effects of Prunella on anti-inflammatory activity in RAW264.7 mouse macrophage cells, Food and Nutrition Sciences, 3 (2012), s. 1290-1295 34. Huang N., Hauck C., Yum M. Y., Rizshsky L., Widrlechner M. P., McCoy J. A., Murphy P. A., Dixon P. M., Nikolau B. J., Birt D. F. Rosmarinic acid in Prunella vulgaris ethanol extract inhibits lipopolysaccharide-induced prostaglandin E2 and nitric oxide in RAW 264.7 mouse macrophages, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57/22 (2009), s. 10579-10589 35. Youn J., Lee K. H., Won J., Huh S. J., Yun H. S., Cho W. G., Paik D. J. Beneficial effects of rosmarinic acid on suppression of collagen induced arthritis, The Journal of Rheumatology, 30/6 (2003), s. 1203-1207 36. Melillo de Magalhães P., Dupont I., Hendrickx A., Joly A., Raas T., Dessy S., Sergent T., Schneider Y. J. Anti-inflammatory effect and modulation of cytochrome P450 activities by Artemisia annua tea infusions in human intestinal Caco-2 cells, Food Chemistry, 134 (2012), s. 864-871 238 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? 37. Ku S. K., Yang E. J., Song K. S., Bae J. S. Rosmarinic acid down-regulates endothelial protein C receptor shedding in vitro and in vivo, Food and Chemical Toxicology, 59 (2013), s. 311-315 38. Chu X., Ci X., He J., Jiang L., Wei M., Cao Q., Guan M., Xie X., Deng X., He J. Effects of a natural prolyl oligopeptidase inhibitor, rosmarinic acid, on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice, Molecules, 17 (2012), s. 3586-3598 39. Sanbongi C., Takano H., Osakabe N., Sasa N., Natsume M., Yanagisawa R., Inoue K. I., Sadakane K., Ichinose T., Yoshikawa T. Rosmarinic acid in perilla extract inhibits allergic inflammation induced by mite allergen, in a mouse model, Clinical & Experimental Allergy, 34 (2004), s. 971-977 40. Yang E. J., Ku S. K., Lee W., Lee S., Lee T., Song K. S., Bae J. S. Barrier protective effects of rosmarinic acid on HMGB1-induced inflammatory responses in vitro and in vivo, Journal of Cellular Physiology, 228 (2013), s. 975-982 41. Piotrowska A., Iżykowska I., Podhorska-Okołów M., Zabel M., Dzięgiel P. Budowabiałek z rodziny NF-ĸBiichrola w procesie apoptozy, Postępy Higieny I Medycyny Doświadczalnej, 62 (2008), s. 64-74 42. Lee J., Jung E., Kim Y., Lee J., Park J., Hong S., Hyun C.-G., Park D., Kim Y. S. Rosmarinic acid as a downstream inhibitor of IKK-β in TNF-α-induced upregulation of CCL11 and CCR3, British Journal of Pharmacology, 148 (2006), s. 366-375 43. Kim H. K., Lee J. J., Lee J. S., Park Y. M., Yoon T. R. Rosmarinic acid downregulates the LPS-induced production of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and macrophage inflammatory protein-1 alpha (MIP-1 alpha) via the MAPK pathway in bonemarrow derived dendritic cells, Molecules and Cells., 26 (2008), s. 583-589 44. Osakabe N., Yasuda A., Natsume M., Yoshikawa T. Rosmarinic acid inhibits epidermal inflammatory responses: anticarcinogenic effect of Perillafrutescens extract in the murine two-stage skin model, Carcinogenesis, 25/4 (2004), s. 549-557 45. Domitrović R., Potočnjak I., Crnčević-Orlić Z., Ńkoda M. Nephroprotective activities of rosmarinic acid against cisplatin-induced kidney injury in mice, Food and Chemical Toxicology, 66 (2014), s. 321-328 46. Stansbury J. Rosmarinicacid as a novel agent in the treatment of allergies and asthma, Journal of Restorative Medicine, 3 (2014), s. 121-126 47. Stansbury J., Saunders P., Winston D., Zampieron E. R. Rosmarinic acid as a novel agent in the treatment of autoimmune disease, Journal of Restorative Medicine, 1 (2012), s. 112-116 48. Kang M. A., Yun S. Y., Won J. Rosmarinic acid inhibits Ca2+-dependent pathways of T-cell antigen receptor-mediated signaling by inhibiting the PLCγ1 and Itk activity, Blood Journal, 101/9 (2003), s. 3534-3542 49. Swarup V., Ghosh J., Ghosh S., Saxena A., Basu A. Antiviral and antiinflammatory effects of rosmarinic acid in an experimental murine model of japanese encephalitis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51/9 (2007), s. 3367-3370 239 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 50. Abedini A., Roumy V., Mahieux S., Biabiany M., Standaert-Vitse A., Rivière C., Sahpaz S., Bailleul F., Neut C., Hennebelle T. Rosmarinic acid and its methyl ester as antimicrobial components of the hydromethanolic extract of hyptisatrorubenspoit. (Lamiaceae), Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 604536 (2013) 51. Zeng H. W., Locatelli M., Bardelli C., Amoruso A., Coisson J. D., Travaglia F., Arlorio M., Brunelleschi S. Anti-inflammatory properties of clovamide and theobroma cacao phenolic extracts in human monocytes: evaluation of respiratory burst, cytokine release, NF-KB activation, and PPARγ modulation, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59 (2011), s. 5342-5350 52. Luan H., Kan Z., Xu Y., Lv C., Jiang W. Rosmarinic acid protects against experimental diabetes with cerebral ischemia: relation to inflammation response, Journal of Neuroinflammation, 10/28 (2013) 53. Yoou M. S., Park C. L., Kim M. H., Kim H. M., Jeong H. J., Inhibition of MDM2 expression by rosmarinic acid in TSLP-stimulated mast cell, European Journal of Pharmacology, 771 (2016), s. 191-198 54. Fan Y. T., Yin G. J., Xiao W. Q., Qiu L., Yu G., Hu Y. L., Xing M., Wu D. Q., Cang X. F., Wan R., Wang X. P., Hu G. Y. Rosmarinic Acid Attenuates Sodium Taurocholate-Induced Acute Pancreatitis in Rats by Inhibiting Nuclear Factor-κB Activation, American Journal of Chinese Medicine, 43/6 (2015), s. 1117-35 55. Iswandana R., Phama B. T., van Haaften W. T., Luangmonkong T., Oosterhuis D., Mutsaers H. A. M., Olinga P. Organ- and species-specific biological activity of rosmarinic acid, Toxicology in Vitro., 32 (2016), s. 261-268 56. Ramalho L. N. Z., Pasta A. A. C., Terra V. A., Augusto M. J., Sanches S. C., Souza-Neto F. P., Cecchini R., Gulin F., Ramalho F. S. Rosmarinic acid attenuates hepatic ischemia and reperfusion injury in rats, Food and Chemical Toxicology, 74 (2014), s. 270-278 57. Al-Musayeib N., Perveen S., Fatima I., Nasir M., Hussain A. Antioxidant, anti-glycation and anti-inflammatory activities of phenolic constituents from Cordia sinensis, Molecules, 16 (2011), s. 10214-10226 58. Usha T., Middha S. K., Bhattacharya M., Lokesh P., Goyal A. K. Rosmarinicacid, a new polyphenol fromBaccaurearamifloraLour. leaf: a probable compound for its anti-inflammatory activity, Antioxidants (Basel), 3/4 (2014), s. 830-842 59. Gamaro G. D., Suyenaga E., Borosi M., Lermen J., Pereira P., Ardenghi P. Effects of rosmarinic and caffeic acids on inflammatory and nociception process in rats, ISRN Pharmacology, (2011), s. 1-6 60. Govindaraj J., Pillai S.S. Rosmarinic acid modulates the antioxidant status and protects pancreatic tissues from glucolipotoxicity mediated oxidative stress in high-fat diet: streptozotocin-induced diabetic rats, Molecular and Cellular Biochemistry, 404 (2015), s. 143-159 61. Sotnikova R., Okruhlicova L., Vlkovicova J., Navarova J., Gajdacova B., Pivackova L., Fialova S., Krenek P. Rosmarinic acid administration attenuates diabetes-induced vascular dysfunction of the rat aorta, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 65 (2013), s. 713-723 240 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? 62. Tsai T. H., Chuang L. T., Lien T. J., Liing Y. R., Chen W. Y., Tsai P. J. Rosmarinus officinalis extract suppresses propionibacterium acnes – induced inflammatory responses, Journal of Medicinal Food, 4 (2013), s. 324-333 63. Kim J. P., Song S. B., Lee I. S., Kim Y. H., Yoo I. D., Ryoo I. J., Bae K. H. Anti-inflammatory activity of constituents from Glechoma hederacea var. longituba, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21 (2011), s.3483-3487 64. Galasso S., Pacifico S. Kretschmer N., Pan S-P., Marciano S., Piccolella S., Monaco P., Bauer R. Influence of seasonal variation on Thymus longicaulis C. Presl chemical composition and its antioxidant and anti-inflammatory properties, Phytochemistry, 107 (2014), s. 80-90 65. Peng C. H., Su J. D., Chyau C. C., Sung T. Y., Ho S. S., Peng C. C., Peng R. Y. supercritical fluid extracts of rosemary leaves exhibit potent antiinflammation and anti-tumor effects, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71/9 (2007), s. 2223-2232 66. Pearson W., Fletcher R. S., Kott L. S., Hurtig M. B. Perseoartcheacrtticileon against LPS-induced cartilage inflammation and degradation provided by a biological extract of Menthaspicata, Complementary and Alternative Medicine, 10/19 (2010), s. 1-11 67. Lim H. J., Woo K. W., Lee K. R., Lee S. K., Kim H. P. Inhibition of proinflammatory cytokine generation in lung inflammation by the leaves of Perillafrutescens and its constituents, Biomolecules Therapeutics, 22/1 (2014), s. 62-67 68. Costa R. S., Carneiro T. C., Cerqueira-Lima A. T., Queiroz N. V., AlcântaraNeves N. M., Pontes-de-Carvalho L. C., Velozo Eda S., Oliveira E. J., Figueiredo C. A. Ocimum gratissimum Linn. and rosmarinic acid, attenuate eosinophilic airway inflammation in an experimental model of respiratory allergy to Blomia tropicalis, International Immunopharmacology, 13(2012), s. 126-134 69. Urushima H., Nishimura J., Mizushima T., Hayashi N., Maeda K., Ito T. Perilla frutescens extract ameliorates DSS-induced colitis by suppressing proinflammatory cytokines and inducing anti-inflammatory cytokines, American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology, 308 (2015), s. G32-G41 70. Rocha J., Eduardo-Figueira M., Barateiro A., Fernandes A., Brites D., Bronze R., Duarte C. M. M., Serra A.T., Pinto R., Freitas M., Fernandes E., SilvaLima B., Mota-Filipe H., Sepodes B. Anti-inflammatory effect of rosmarinic acid and an extract of Rosmarinus officinalis in rat models of local and systemic inflammation, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 116 (2015), s. 398-413 71. Piana M., Camponogara C., Boligon A. A., Machado M. M., Brum T. F., Oliveira S. M., Bauermann L. F. Topical anti-inflammatory activity of Solanum corymbiflorum leaves, Journal of Ethnopharmacology, 179 (2016), s. 16-21 72. Ferreira L. G., Celotto A. C., Capellini V. K., Albuquerque A. A., Nadai T. R., Carvalho M. T., Evora P. R. Is rosmarinic acid underestimated as an 241 Małgorzata Sieradzka, Gabriela Stawieraj, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak experimental cardio vascular drug?, Acta Cirurgica Brasileira, 28 (2013), s. 83-87 73. Lee J., Jung E., Koh J., Kim Y. S., Park D. Effect of rosmarinic acid on atopic dermatitis, Journal of Dermatology,35 (2008), s. 768-771 74. Stelmakienė A., Ramanauskienė K., Briedis V. Release of rosmarinic acid from semisolid formulations and its penetration through human skin ex vivo, Acta Pharmaceutica, 65/2 (2015), s. 199-205 Kwas rozmarynowy – naturalny, niesteroidowy lek przeciwzapalny? Streszczenie W ostatnich latach obserwuje się wzrost częstości stosowania niesteroidowych syntetycznych leków przeciwbólowych i przeciwzapalnych, które mogą powodować działania niepożądane. Z tego powodu poszukuje się także nowych naturalnych związków pochodzenia roślinnego o aktywności przeciwzapalnej. Przedmiotem wielu badań in vitro i in vivo stał się m.in. kwas rozmarynowy. Aktualna literatura dostarcza wielu danych na temat przeciwzapalnych właściwości zarówno izolowanego kwasu rozmarynowego, jak i ekstraktów roślinnych bogatych w ten związek. Ponieważ mechanizmy działania kwasu rozmarynowego i jego efekty farmakologiczne są zbliżone do działania niesteroidowych leków przeciwzapalnych, związek ten może być przydatny w łagodzeniu procesów zapalnych o różnej etiologii. Słowa kluczowe: kwas rozmarynowy, przeciwzapalne Rosmarinic acid – a natural, non-steroidalanti-inflammatorydrug? Abstract In recent years there has been observed an increase frequency of synthetic non-steroidal antiinflammatory drugs application, that cause side effects. Therefore, new natural compounds of plant origins with anti-inflammatory properties have been also searched for. Rosmarinic acid has become the subject of numerous in vitro and in vivo biomedical investigations. Current literature provides manydata about anti-inflammatory activity of both isolated rosmarinic acid and plant extracts that are rich in this compound. Since the mechanisms of rosmarinic acid activity and its pharmacological effects are similar to actions of non-steroidal anti-inflammatory drugs, this compound may be helpful in mitigation of inflammatory processes of various etiology. Keywords: rosmarinic acid, anti-inflammatory 242 Paulina Panek1, Iga Hołyńska-Iwan2, Dorota Olszewska-Słonina2 Kapsaicyna i jej szerokie zastosowanie terapeutyczne 1. Wstęp Kapsaicyna (wzór strukturalny C18H27NO3), czyli (E)-N-[(4-hydroksy-3metoksyfenylo)metylo]-8-metylonon-6-enamid, jest organicznym związkiem chemicznym należącym do alkaloidów, rozpuszczalnym w tłuszczach i alkoholu, nierozpuszczalnym w wodzie. Występuje w owocach papryki rocznej i chili (łac. Capsicium), należących do rodziny psiankowatych, rzędu psiankowców. Rośliny te pochodzą z Ameryki, w Europie hodowane są od 400 lat. Po raz pierwszy kapsaicyna została wyizolowana w czystej postaci krystalicznej w 1876r. przez Johna Clough Tresh’a. Krystaliczna postać jest hydrofobowa, bezbarwna i pozbawiona zapachu [1]. Wilbur Scoville w 1912 r. wprowadził skalę (jednostki SHU – Scoville Heat Unit) w celu określenia i porównania stopnia ostrości papryczek chili. Ekstrakt z papryk chili był rozcieńczany do momentu zaniku czynników drażniących. Ilość jednostek w skali zostawała przypisana na podstawie krotności rozcieńczenia, która wynosi dla czystej kapsaicyny od 15 do 16 mln SHU [2]. Poznaniem jej struktury chemicznej w 1919 r. zajęli się naukowcy E. K. Nelson i L. E. Dawson. Później w 1961 r. Japońscy chemicy S. Kosuge i Y. Inagaki wyizolowali z papryki chili związki chemiczne o podobnej budowie i właściwościach chemicznych do kapsaicyny, które zostały nazwane w późniejszym okresie kapsaicynoidami [1]. W papryczce chili występują kapsaicynoidy, do których zaliczane sąkapsaicyna, dihydrokapsaicyna, nordihydrokapsaicyna, homodihydrokapsaicyna. Kapsaicyna i dihydrokapsaicyna stanowią około 90% kapsaicy- 1 [email protected], Katedra Patobiochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika w Toruniu 2 [email protected], Pracownia Elektrofizjologii Tkanki Nabłonkowej i Skóry, Katedra Patobiochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika w Toruniu 2 [email protected], Katedra Patobiochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika w Toruniu 243 Paulina Panek, Iga Hołyńska-Iwan, Dorota Olszewska-Słonina noidów w papryczce chili, należą do najsilniejszych związków, a ich cząsteczki różnią się między sobą nasyceniem grupy acylowej [3]. Kapsaicyna jest wykorzystywana szeroko w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym oraz kosmetycznym. Charakteryzuje się działaniem przeciwbólowym, bakteriobójczym, bakteriostatycznym, przeciwbakteryjnym i antyoksydacyjnym. Wywiera wpływ na termoregulację i metabolizm tkanki tłuszczowej. Wykazuje działanie przeciwzapalne. Kwestią niepoznaną jest wpływ kapsaicyny na rozwój nowotworów [4]. 2. Cel pracy Głównym celem niniejszej pracy jest przedstawienie terapeutycznych właściwości kapsaicyny. Wpływu kapsaicyny na kanały jonowe, zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, okres refrakcji, a także na wywołanie efektu całkowitego odczulenia. Ponadto podanie przykładów zastosowania kapsaicyny pod postacią maści, kremów, plastrów, tabletek w leczeniu wielu schorzeń. W pracy zastosowaną metodą badawczą jest analiza literatury naukowej. 3. Szerokie działanie terapeutyczne kapsaicyny 3.1. Działanie przeciwbólowe Kapsaicyna i jej analogi są stosowane w postaci maści i plastrów aplikowanych na powierzchnię skóry. Jej miejscowe stosowanie znalazło zasadność w uśmierzaniu bólu w przebiegu: reumatoidalnego zapalenia stawów, chorobie zwyrodnieniowej stawów, neuropatii cukrzycowej, łagodzenia bólu i świądu powstającego w następstwie zabiegów chirurgicznych, zranień czy guzów. Stosowana jest w celu złagodzenia bólu w przebiegu wysypki, łuszczycy orazpo mastektomii. Krem z kapsaicyny stosuje się w celu złagodzenia bólu neuropatycznego u pacjentów z cukrzycą typu 1 i 2 [5, 6].Rozdrobnione, zmikronizowane owoce (Pulvis Capsici), wyciągi (Extractum, Tinctura Capsici), sok (Succus Capsici), jak i czysta kapsaicyna (Capsaicinum) z owoców pieprzowca, są składnikiem wielu maści, kremów, emulsjii mazideł recepturowych oraz fabrycznych, zalecanych do miejscowego stosowania przy bólach stawów, nerwobólach i mięśniobólach [7]. 3.2. Działanie bakteriobójcze i bakteriostatyczne Na podstawie badań surowego mięsa wołowego stwierdzono, że ekstrakt z Capsicum annuum (pieprzowiec/papryka roczna) wywiera działanie przeciwdrobnoustrojowe. Hamuje rozwój gatunków bakterii takich jak Pseudomonas aeruginosa i Salmonella typhi. W zależności od 244 Kapsaicyna i jej szerokie zastosowanie terapeutyczne zastosowanego stężenia wykazuje działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne [8]. Mechanizm działania antybakteryjnego obejmuje wpływ kapsaicyny na wywołanie stresu osmotycznego, niszczenie struktury błony komórkowej, hamowanie ekspresji genów, komponentów rybosomalnych i inhibicję wzrostu komórek [9]. 3.3. Działanie antyoksydacyjne Działanie antyoksydacyjne kapsaicyny wynika z hamowania reakcji utleniania poprzez wydłużenie czasuinicjacji. Kapsaicyna hamuje tworzenie wolnych rodników tlenowych i anionów wodorotlenkowych. Posiada zdolność redukowania stresu oksydacyjnego [3]. 3.4. Działanie na metabolizm lipidów Przeprowadzone dotychczas badania potwierdzają wpływ kapsaicyny na zmniejszenie objętości komórek tkanki tłuszczowej u gryzoni, zmiany konformacji komórek poprzez wpływ na stężenie wapnia i jego oddziaływanie na białko macierzy zewnątrzkomórkowej: koneksynę 43 (ang. Cx43 – connexin 43)[10]. Dodatkowozwiązek ten wpływa na wzrost zużycia energii, przyśpieszenie metabolizmu lipidów w wątrobie i tkance tłuszczowej, zwiększenie wydzielania katecholamin przez korę nadnerczy oraz aktywację sympatycznego układu nerwowego [2]. Nieliczne badania przeprowadzone u ludzi potwierdzają skuteczność leczenia nadwagi i/lub otyłości przy suplementacji roztworem z kapaicynoidami [11]. 3.5. Działanie kokancerogenne Badania Hwang i wsp. [12], dotyczące zależności między stosowaniem zewnętrznym kapsaicyny na skórę, a występowaniem nowotworów skóry, potwierdzają kancerogenne oraz kokancerogenne działanie kapsaicyny, w szczególności na etapie promocji nowotworzenia. Kapsaicyna wywiera kokancerogenny efekt naTPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate), czynnik będący promotorem kancerogenezy w badaniach in vivo. Kapsaicyna stymuluje szlakkancerogenny, gdzie głównym elementem pośredniczącym jest receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (ang. EGFR – epithelial growth factor receptor), który aktywuje wzrost komórek guza [12]. 245 Paulina Panek, Iga Hołyńska-Iwan, Dorota Olszewska-Słonina 3.6. Działanie antykancerogenne W literaturze naukowej istnieje wiele opublikowanych wyników badano antykancerogennych właściwościach kapsaicyny. Większość badań podstawowych sugeruje, że kapsaicyna może indukować zatrzymanie cyklu komórkowego, proliferacji lub prowadzić do apoptozy, wykazując tym samym działanie zapobiegawcze na rozwój nowotworu [5]. Badanie przeprowadzone przez Min i wsp. potwierdzają, że kapsaicyna hamuje wzrost komórek śródbłonka naczyniowego, inicjowany rozwojem guza nowotworowego, wykazując działanie antyangiogenne, jest więc inhibitorem angiogenezy. Zapobiega tym samym procesowi przerzutowania. Kapsaicyna może znaleźć zastosowanie w leczeniu chorób zależnych od unaczynienia tkanek [13]. 4. Kapsaicyna jako selektywny agonista receptora waniloidowego Kapsaicyna jest silnie selektywnym agonistą receptora waniloidowego (ang. TRPV1 – transcient receptor vaniloid receptor 1) [12]. Jako nieselektywny ligand przyłącza się do receptora TRPV1, sterując przepływem kationów w kanale jonowym. Receptor ten występuje w tkance mózgowej, komórkach glejowych, pęcherzu moczowym, nerkach, wątrobie, jelicie, keratynocytach naskórka, komórkach tucznych i makrofagach. Kanał jonowy przepuszczalny dla kationów sodu i wapnia znajduje się w błonie komórkowej i retikulum endoplazmatycznym, w którym reguluje wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia. Kanały mogą być hamowane i aktywowane przez substancje endogenne i bodźce zewnętrzne, takie jak agoniści chemiczni receptora TRPV1, np. kapsaicyna. TRPV1 zawiera wrażliwą na ciepło podjednostkę, odpowiedzialną za uczucie pieczenia spowodowane kapsaicyną. Przyłączenie kapsaicyny do receptora TRPV1 powoduje wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego wapnia, uwalnianie neuropeptydów, takich jak substancja P i peptydu związanego z genem kalcytoniny (ang. CGRP – calcitonin gene related peptide) [3]. Na skutek napływu kationów wapnia do wnętrza neuronów czuciowych następuje wysłanie sygnału do mózgowia i odebranie przez receptory czuciowe uczucia gorąca [12]. Kapsaicyna jest naturalnie występującą w przyrodzie substancją drażniącą. Pobudza neurony, wywołuje następnie długotrwały okres refrakcji. Wcześniej pobudzone receptory nie są zdolne do reakcji na szeroki zakres pozornie niepowiązanych bodźców ze środowiska zewnętrznego. Po aplikacji kapsaicyny na powierzchnię skóry następuje jej zwiększona wrażliwość na szkodliwe bodźce dochodzące ze środowiska zewnętrznego, po czym następuje okres zmniejszonej wrażliwości i trwałego odczulenia [5]. 246 Kapsaicyna i jej szerokie zastosowanie terapeutyczne 5. Przegląd badań z zastosowaniem kapsaicyny Z zastosowaniem kapsaicyny wykonano szereg badań doświadczalnych na hodowlach komórkowych, zwierzętach oraz ludziach. Badanie przeprowadzone na myszach płci żeńskiej i męskiej przez Liang i wsp. w Center for Laboratory Animals, Sun Yat-Sen University (Guangzhou, China) dotyczyło wpływu kapsaicyny na swędzenie skóry wykazującej stan zapalny. Stan zapalny skóry u myszy został wyindukowany poprzez podskórne wstrzyknięcie kompletnego adiuwanta Freunda (ang. CFA – Complete Freund‟s adjuvant) w skórę szyi. CFA jest to emulsja oleju parafinowego lub mineralnego z zawieszonymi w niej prątkami gruźlicy, jej działanie polega na uwalnianiu antygenu w miejscu podania preparatu. Kompletny adiuwant Freunda indukuje zwiększone odczuwanie bólu przez zwierzęta. Po czterech dniach w ten sam obszar skóry u myszy wstrzyknięto kapsaicynę i mierzono w czasie 30 minut występowanie świądu skóry oraz związanego z nim drapania skóry przez mysz. Badanie udowodniło wpływ kapsaicyny na nasilenie drapania w skórze objętej stanem zapalnym. Nie zaobserwowano nasilenia drapania w skórze nieobjętej stanem zapalnym. Uzyskane wyniki badań sugerują, że bodziec bólowy wywołuje uczucie swędzenia skóry, podobnie jak w przebiegu atopowego zapalenia skóry. Drapanie skóry niwelowano przez zastosowanie naloksonu i kapsazepiny – selektywnego antagonisty dla receptora TRPV1. Nie zaobserwowano podobnego efektu w przypadku zastosowania morfiny i mepyraminy – selektywnych antagonistów receptora histaminy 1 (H1). Badania pokazują, że aktywacja TRPV1, która normalnie indukuje ból, wywołuje swędzenie w skórze objętej stanem zapalnym. Eksperymentmoże stanowić punkt wyjścia dla pozostałych badań w celu przeanalizowania mechanizmu bolesnego swędzenia obserwowanego w chorobach skóry [14]. Podczas pierwszego tygodnia leczenia stosowanie kapsaicyny wywołuje uczucie pieczenia bądź swędzenia, z powodu uwalniania substancji P i innych neuropeptydów z zakończeń nerwowych C i A. Po wyczerpaniu tych substancji dolegliwości ustępują. Regularne stosowanie kremu zapobiega gromadzeniu się neuropeptydów. Wstępne stosowanie 5% maści z lidokainy może zapobiegać lub zmniejszać dolegliwości występujące w pierwszym tygodniu leczenia. U pacjentów, u których występuje świąd nasilający się pod wpływem kontaktu z wodą, czasami będący powikłaniem w pęcherzycy zwykłej, leczenie miejscowe kremem kapsaicynowym 3 razy dziennie powoduje całkowite ustąpienie dolegliwości po 4 tygodniach [7]. Badanie przeprowadzone przez Kiani i wsp. na grupie 102 pacjentów, dotyczące wpływu kapsaicyny na łagodzenie bólu w przebiegu obwodowej neuropatii cukrzycowej potwierdza, że stosowanie kapsaicyny w postaci 0,75% kremu trzy razy w tygodniu, przez okres 12 tygodni, znacząco zmniejsza ból u osób z grupy badanej. Kapsaicyna w porównaniu z 2% 247 Paulina Panek, Iga Hołyńska-Iwan, Dorota Olszewska-Słonina amitryptyliną wykazuje częściej działania niepożądane, do których należy swędzenie i występowanie rumienia [15]. Niektóre badania potwierdzają skuteczność kremów zawierających w swoim składzie kapsaicynę w stężeniu 0,025%-0,075%. Wyższe stężenia kapsaicyny nie są polecane ponieważ powodują zmniejszenie czucia nocyceptywnych zakończeń nerwów czuciowych, co może zwiększać ryzyko uszkodzeń skóry u pacjentów z CND (ang. Chronic Neuroimmune Diseases – przewlekłe choroby neuroimmunologiczne). Działania niepożądane obejmują świąd, pieczenie, rumień, przemijające uczucie ciepła i pieczenia, wywołują początkowo ból w miejscu aplikacji, który zmniejsza się wskutek wielokrotnego użytkowania. Wielokrotne stosowanie kapsaicyny powoduje pozbawienie włókien nerwowych substancji P, na skutek powtarzalnej aktywacji zakończeń. Wyczerpanie włókna C i odczulenie, zmniejsza bolesne bodźce transmisji z nerwów obwodowych do ośrodkowego układu nerwowego [16, 17, 18, 19]. Kapsaicyna skutecznie wchłania się miejscowo w skórze. Potwierdza to badanie Pershing i wsp. z udziałem 12 osób stosujących miejscowo kapsaicynę w postaci 3% roztworu zawierającego 55% kapsaicyny, 35% dihydrokapsaicyny oraz 10% innych analogów w trzech różnych rodzajach podłoży: 70% alkoholu izopropylowym, oleju mineralnym i glikolu propylenowym. Kapsaicynoidy osiągają szybko maksymalne stężenie w warstwie rogowej skóry ludzkiej, jest to jednak zależne od ich stężenia i podłoża. W badaniu określono dla kapsaicyny okres półtrwania, który wynosi 24 godziny [20]. Przeprowadzono również badanie z podwójnie ślepą próbą na grupie 44 pacjentów z symetrycznie rozmieszczonymi zmianami łuszczycowymi po obu stronach ciała. Po jednej stronie ciała aplikowano kapsaicynę przez okres 6 tygodni. Po 3 i 6 tygodniach przeprowadzono ocenę stopnia zaczerwienienia zmian skórnych. W trakcie badania zaobserwowano ogólną poprawę zmian skórnych po stronie aplikowanej kapsaicyny. Pieczenie, kłucie, swędzenie i zaczerwienienie skóry odnotowano u prawie połowy pacjentów w momencie początkowego stosowania leku, a zmiany uległy zmniejszeniu lub zaniknęły przy dalszym stosowaniu. Wyniki sugerują zasadność stosowania kapsaicyny w łagodzeniu zmian łuszczycowych [21]. Badania przeprowadzone na szczurach, którym aplikowano kapsaicynę w dawce 50mg/kg podskórnie w ciągu 48 godzin po urodzeniu, wykazało powstanie stanu zapalnego skóry i jej zmiany patofizjologiczne, skutkiem czego było drapanie. Upośledzona funkcja bariery skóry, skłonność do kolonizacji bakteryjnej Staphylococcus aureus, wzrost liczby komórek tucznych, nadprodukcja IgE w surowicy-to zmiany klinicznie podobne do towarzyszących atopowemu zapaleniu skóry u ludzi. Wielokrotnie powtarzane wstrzyknięcia kapsaicyny powoduje nawracające uczucie świądu, analogicznie jak przy atopowym zapaleniu skóry. Zastosowany model szczura, przy indukcji zmian skórnych wywołanych kapsaicyną, może 248 Kapsaicyna i jej szerokie zastosowanie terapeutyczne służyć do badania skóry atopowej oraz opracowywania nowych środków terapeutycznych w leczeniu atopowego zapalenia skóry [22]. Notalgia paresthetica objawia się miejscowym świądem środkowej części pleców, zazwyczaj okolicy międzyłopatkowej. Pod wpływem przewlekłego świądu dochodzi do lichenizacjina skutek drapania skóry. Trzy pacjentki leczono przy użyciu 8% kapsaicyny w postaci plastrów, osiągając zadowalający efekt terapeutyczny. Leczenie u pacjentek było dobrze tolerowane [23]. Tabela 1. Zastosowanie kapsaicyny w wybranych schorzeniach Choroba/objaw Dawka Droga podania Łuszczyca 0,5-1,0% maść Przewlekła neuropatia czuciowa 0,7%, 8% kremy plastry 0,5-1,0% maść Reumatoidalne zapalenie stawów, choroba zwyrodnieniowa stawów Świąd (atopowe zapalenia skóry, mocznicowy, poopryszczkowy, pęcherzyca) 0,025% kremy maści Wysypka 0,025% kremy, maści Ból 0,5% 1,0% 5% kremy maści plastry Nadwaga 1,2 mg/dobę tabletki Źródło: Opracowanie własne [10, 24, 25] 249 Mechanizm działania odczula neurony czuciowe, zmniejsza wydzielanie substancji P odczula neurony czuciowe, zmniejsza wydzielanie substancji P odczula neurony czuciowe, zmniejsza wydzielanie substancji P selektywny agonista receptora waniloidowego, pobudza neurony wywołując długotrwały okres niewrażliwości odczula neurony czuciowe zmniejszając wydzielanie substancji P selektywny agonista receptora waniloidowego, pobudza neurony wywołując długotrwały okres niewrażliwości wzrost zużycia energii przez tkankę tłuszczową, zwiększenie wydzielania katecholamin przez korę nadnerczy, aktywacja układu sympatycznego układu Paulina Panek, Iga Hołyńska-Iwan, Dorota Olszewska-Słonina 6. Podsumowanie Kapsaicyna jako silnie selektywny agonista receptora waniloidowego powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia oraz uwolnienie neuropeptydów. Dzięki uwalnieniu neuropeptydów dochodzi do blokady przekaźnictwa nerwowego i wywołania efektu trwałego odczulenia. Poprzez takie działanie kapsaicyna wywołuje korzystny efekt terapeutyczny w leczeniu bólu oraz takich schorzeń jak łuszczyca, wysypka, reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekła neuropatia czuciowa oraz świąd w przebiegu atopowego zapalenia skóry, mocznicy, pęcherzycy. Obecnie stosowana jest w formie kremów, maści i plastrów. Nieprzerwanie trwają prace badawcze nad funkcjami neuropeptydów w procesie zapalnym. Poznanie tych właściwości pozwoli na wdrożenie skutecznych metod leczenia dermatoz skórnych. Z przeprowadzonej analizy piśmiennictwa wynika konieczność prowadzenia badań nad wpływem kapsaicyny na skórę oraz na jej parametry elektrofizjologiczne. Badania stworzyłyby możliwość wyjaśnienia patomechanizmów działania nowych, efektywnych nośników kapsaicyny, które skuteczniej przenikną przez powierzchnię skóry oraz będą wywierały bardziej trwały efekt na objawy towarzyszące schorzeniom dermatologicznym, takim jak atopowe zapalenie skóry i łuszczyca. Związki te mogłyby się okazać skuteczne w leczeniu bólu występującego przewlekle. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Szallasi A., Blumberg P. M. Vanilloid (capsaicin) receptors and mechanisms, Pharmacological Reviews, 51 (1999), s. 159-211 Hayman M., Kam P. C. S. Capsaicin: A review of its pharmacology and clinical applications, Current Anaesthesia & Critical Care, 19 (2008), s. 338-343 Reyes-Escogido M., Gonzalez-Mondragon E. G., Vazquez-Tzompantzi E. Chemical and Pharmacological Aspects of Capsaicin, Molecules, 16 (2011), s. 1253-1270 Pieńko T. Kapsaicyna-właściwości, zastosowania i perspektywy, Biuletyn Wydziału Farmaceutycznego Warszawski Uniwersytet Medyczny, 2 (2013), s. 11-17 Bode A. M., Dong Z. The Two Faces of Capsaicin, American Association for Cancer Research,71 (2011), s. 2809-2814 Deli G., Bosnyak E., Push G., Komoly S., Fehrer G. Diabetic neuropathies: diagnosis and management, Neuroendocrinology, 98 (2013), s. 267-280 Krajnik M., Żylicz Z. Świąd w zaawansowanych chorobach wewnętrznych. Patogeneza i leczenie, Polska Medycyna Paliatywna, 1 (2002), s. 71-83 Careaga M., Fernández E., Dorantes L., Mota L., Jaramillo M. E., HernandezSanchez H. Antibacterial activity of Capsicum extract against Salmonella typhimurium and Pseudomonas aeruginosa inoculated in raw beef meat, International Journal of Food Microbiology, 83(2003), s. 331-335 250 Kapsaicyna i jej szerokie zastosowanie terapeutyczne 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. Kurita S., Kitagawa E., Kin Ch. H., Momose Y., Iwahashi H. Antimicrobial Mechanisms of Capsaicin Using Yeast DNA Microarray, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 66 (2002), s. 532-536 Chen J., Li L., Li Y., Liang X., Sun Q., Yu H., Zhong J., Ni Y., Chen J., Zhao Z., Gao P., Wang B., Liu D., Zhu Z., Yan Z. Activation of TRPV1 channel by dietary capsaicin improves visceral fat remodeling through connexin 43-mediated Ca2+ Influx,Cardiovascular Diabetology, 14 (2015), s.1-14 Belza A., Frandsen E., Kondrup J. Body fat loss achieved by stimulation of thermogenesis by a combination of bioactive food ingredients: a placebocontrolled, double-blind 8-week intervention in obese subjects, International Journal of Obesity, 31(2015), s. 121-130 Hwang M. K., Bode A. M., Byun S., Song N. R., Lee H. J., Lee K. W., Dong Z. Cocarcinogenic effect of capsaicin involves activation of EGFR signaling but not TRPV1, Cancer Research, 70 (2010), s.6859-6869 Min J. K., Han K. Y., Kim E. C., Kim Y. M., Lee S. W., Kim O. H., Kim K. W., Gho Y. S., Kwon Y. G. Capsaicin inhibits in vitro and in vivo angiogenesis, Cancer Research, 64 (2004), s. 644-651 Liang J., Xiao G., Ji W. Capsaicin induces reflex scratching in inflamed skin, Pharmacology, 88 (2011), s. 82-87 Kiani J., Ahmad Nasrollahi S., Esna-Ashari F., Fallah P., Sajedi F. Amitriptyline 2% cream vs. capsaicin 0.75% cream in the treatment of painful diabetic neuropathy (Double blind, randomized clinical trial of efficacy and safety), Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 14 (2015), s. 1263-1268 Kulkantrakorn K., Lorsuwansiri C., Meesawatsom P. 0.025% capsaicin gel for the treatment of painful diabetic neuropathy: a randomized, double-blind, crossover, placebo-controlled trial, Pain Practice, 13 (2013), s. 497-503 Vinik A. I., Nevoret M. L., Casellini C., Parson H. Diabetic neuropathy, Endocrinology Metabolism Clinicsof North America, 42 (2013), s. 747-787 Groninger H., Schisler R. E. Topical capsaicin for neuropathic pain, Journal of Palliative Medicine, 15 (2012), s. 946-947 Schreiber A. K., Nones C. F. M., Reis R. C., Chichorro J. G., Cunha J. M. Diabetic neuropathic pain: Physiopathology and treatment, World Journal of Diabetes, 15 (2015), s. 432-444 Pershling L. K., Reilly C. A., Corlett J. L. Effects of vehicle on the uptake and elimination kinetics of capsaicinoids in human skin in vivo, Toxicology and Applied Pharmacology, 200 (2004), s. 73-81 Bernstein J. E., Parish L. C., Rapaport M., Rosenbaum M. M., Roenigk H. H. Jr. Effects of topically applied capsaicin on moderate and severe psoriasis vulgaris, Journal of the American Academy of Dermatology, 15(1986), s. 504-507 Back S. K., Jeong K. Y., Li C., Lee J., Lee S. B., Na H. S. Chronically relapsing pruritic dermatitis in the rats treated as neonate with capsaicin; a potential rat model of human atopic dermatitis, Journal of Dermatological Science, 67 (2012), s. 111-119 Andersen H. H., Sand C., Elberling J. Considerable variabiliity in the efficacy of 8% capsaicin topical patches in the treatment of chronic pruritus in 3 patients with notalgia paraesthetica, Annals of Dermatology, 28 (2016), s. 86-89 Diepvens K.,Westerterp K. R.,Westerterp-Plantenga M. S. Obesity and thermogenesis related to the consumption of caffeine, ephedrine, 251 Paulina Panek, Iga Hołyńska-Iwan, Dorota Olszewska-Słonina capsaicin, and green tea, American Journal of Physiology. Regulatory Integrative and Comparative Physiol, 292 (2006), s. R77-R85 25. Zsombok A. Vanilloid receptors – Do they have a role in whole body metabolism? Evidence from TRPV1, Journal of Diabetes and its Complications, 27 (2013), s. 287-292 Kapsaicyna i jej szerokie zastosowanie terapeutyczne Streszczenie W owocach papryki rocznej (Capsicum annuum) i chili (łac. Capsicium), należących do rodziny psiankowatych, rzędu psiankowców, występuje kapsaicyna. Jest to organiczny związek chemiczny należący do grupy alkaloidów. Substancja ta wykazuje szerokie działanie terapeutyczne: przeciwbólowe, bakteriobójcze, bakteriostatyczne, przeciwbakteryjne, przeciwzapalne i antyoksydacyjne. Wywiera również wpływ na teromoregulację i metabolizm tkanki tłuszczowej. Istnieją w literaturze naukowej badania udowadniające kancerogenny wpływ kapsaicyny na rozwój nowotworu skóry oraz działanie antykancerogenne poprzez oddziaływanie na białka cyklu komórkowego i białka związane z procesem apoptozy. Przyłączenie kapsaicyny do receptora TRPV1 (transient receptor potential cation channel subfamily V member 1, receptora waniloidowego) powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, uwalnianie neuropeptydów, takich jak substancja P oraz przepływ kationów w kanale wapniowym. Te procesy mają wpływ na powierzchnię skóry lub błon śluzowych, a ich skutkiem jest przekrwienie, uczucie ciepła, ból oraz nadwrażliwość na bodźce nocyceptywne. Kapsaicyna jako silny analgetyk, hamuje odczuwanie bólu, co jest szeroko wykorzystywane w medycynie. Celem niniejszej pracy jest analiza dostępnego piśmiennictwa medycznego odnośnie oddziaływania kapsaicyny na kanały jonowe, wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia, jej wpływ na powierzchnię skóry oraz parametry elektrofizjologiczne. Istnieje konieczność prowadzenia dalszych badań nad wpływem kapsaicyny na powierzchnię skóry w celu wprowadzenia bardziej efektywnych nośników tej substancji, które pogłębią dotychczasowy efekt terapeutyczny w leczeniu bólu, schorzeń dermatologicznych. Słowa kluczowe: kapsaicyna, TRPV1, skóra Capsaicin and its wide therapeutic use Abstract The fruits of paprika (Capsicum annuum) and chili (Lat. Capsicium), belonging to the nightshade family, there is capsaicin. This is a chemical compound belongs to the group of alkaloids. This substance has a broad therapeutic activity: analgetics, bactericidal, bacteriostatics, antibacterial, anti-inflammatory and antioxidant properties. Capsaicin also affects the thermoregulation and fat metabolism. There are the studies proving the carcinogenic effect of capsaicin on the development of skin cancer and anticarcinogenic effect by acting on the cell cycle proteins and proteins involved in apoptosis. Capsaicin compare to TRPV1 (transient receptor potential cation channel subfamily V, member 1, a vanilloid receptor) will increase intracellular calcium release neuropeptides such as substance P and the flow of cations in the calcium channel. These processes affect the surface of the skin or mucosa, and the effect of congestion, warmth, pain and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Capsaicin as a strong analgetic, inhibits the sensation of pain, and this property is widely used in medicine. The aim of this study is to analyze the available scientific literature on the effects of capsaicin on ion channels, intracellular calcium ion concentration, its influences on the surface of the skin and its electrophysiological parameters. The analysis of the literature shows the need for further research on the effects of capsaicin to the skin surface and its electrophysiological characteristics. There is a necessity for further research on the effects of capsaicin to the skin surface. This research will introducing more effective carriers of this substance, which will be more therapeutic effect in the treatment of pain and dermatological diseases. Keywords: capsaicin, TRPV1, skin 252 Paweł Śledziński1, Agnieszka Nowak2, Joanna Zeyland3, Ryszard Słomski4 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia 1. Wstęp Metabolity wtórne roślin od dawna skupiały na sobie uwagę badaczy ze względu na zdolność wielu z nich do wpływania na procesy biochemiczne zachodzące w komórkach organizmu ludzkiego, szczególne w kontekście potencjalnych zastosowań medycznych. W ostatnich dekadach nasiliło się zainteresowanie leczniczymi właściwościami konopi oraz zawartymi w nich substancjami biologicznie aktywnymi – kannabinoidami. Kannabinoidy są lipofilowymi związkami oddziałującymi z obecnymi w komórkach ssaków receptorami kannabinoidowymi. Ze względu na rozmieszczenie tych receptorów, substancje te wpływają szczególnie na centralny układ nerwowy oraz układ immunologiczny [1]. Najogólniejszy podział tych substancji wyróżnia trzy grupy – kannabinoidy roślinne występujące w roślinach z rodzaju Cannabis (fitokannabinoidy), kannabinoidy obecne w organizmach ssaków (endokannabinoidy) oraz kannabinoidy syntetyczne. Pierwszym opisanym fitokannabinoidem był odpowiadający za psychoaktywne właściwości marihuany oraz haszyszu Δ9- tetrahydrokannabinol (THC). Odkryto go w roku 1960, a w kolejnych latach scharakteryzowano jego strukturę chemiczną i dokonano jego syntezy [2, 4]. W ostatnich czasie coraz większą uwagę skupia się jednak na kannabidiolu (CBD) – izomerze THC. Jego zastosowanie w medycynie może być znacznie szersze ze względu na brak właściwości psychoaktywnych. W ostatnim czasie coraz więcej uwagi poświęca się możliwościom zastosowania konopi lub preparatów opartych na kannabinoidach w praktyce klinicznej. Tendencję tę można zauważyć zarówno w przypadku literatury naukowej, jak i popularnej. W mediach daje się zaobserwować nasilenie 1 [email protected], Katedra Biochemii i Biotechnologii, Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, www1.up.poznan.pl/kbib 2 [email protected], Katedra Biochemii i Biotechnologii, Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, www1.up.poznan.pl/kbib 3 [email protected], Katedra Biochemii i Biotechnologii, Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, www1.up.poznan.pl/kbib 4 [email protected], Katedra Biochemii i Biotechnologii, Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, www1.up.poznan.pl/kbib; Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu, www.igcz.poznan.pl 253 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski zainteresowania tematem tzw. medycznej marihuany, także w kontekście chorób onkologicznych. Jednocześnie niepokój może wzbudzać brak wiedzy na temat odpowiednich źródeł informacji wśród społeczeństwa, co prowadzi do powszechności błędnych wyobrażeń na temat medycznego potencjału konopi i kannabinoidów. Zjawisko to może okazać się potencjalnie niebezpieczne, ze względu na podsycanie skłonności do odrzucania medycyny konwencjonalnej i nadzoru lekarskiego na rzecz terapii alternatywnych. Ze względu na powyższe kwestie, istotnym wydaje się tworzenie publikacji, które byłyby odpowiedzią na zapotrzebowanie na teksty przekazujące wiedzę na temat medycznego potencjału konopi w sposób skondensowany, ale jednocześnie posiadające odpowiednio wysoki poziom merytoryczny. Celem niniejszej pracy jest przybliżenie czytelnikowi w sposób syntetyczny aktualnego stanu wiedzy na temat biochemicznych i farmakologicznych podstaw oddziaływania kannabinoidow na organizm człowieka, dotychczasowych prób zastosowania konopi i kannabinoidów w praktyce klinicznej a także ukazanie informacji płynących z badań przedklinicznych dotyczących mechanizmów antynowotworowego działania tych substancji. W celu ukazania czytelnikowi problematyki medycznych zastosowań konopi i kannabinoidów, dokonano przeglądu dostępnej literatury naukowej. Celem całościowego ujęcia problemu, uwzględniono zarówno pozycje najnowsze, odnoszące się do rezultatów aktualnych badań klinicznych, jak i pierwsze doniesienia dotyczące identyfikacji i charakterystyki kannabinoidów. 2. Konopie i marihuana Marihuana jest naturalnym produktem otrzymywanym z roślin z rodzaju Cannabis. Wytwarza się ją poprzez suszenie liści oraz kwiatów C. sativa oraz C. India [5]. Najwyższa koncentracja kannabinoidów występuje w kwiatach żeńskich. Z roślin z rodzaju Cannabis otrzymuje się także haszysz (sprasowana żywica konopi) oraz olej konopny [6]. Wymienione produkty mogą być zażywane poprzez inhalację (palenie, waporyzacja) lub podanie doustne (picie wywaru, jedzenie po zmieszaniu z żywnością) [6]. Najpopularniejszymi sposobami wprowadzania kannabinoidów do organizmu jest inhalacja oraz podanie doustne, choć opracowano również drogi podjęzykowe, transdermalne czy dożylne. Zawartość kannabinoidów w naturalnych produktach otrzymywanych z konopi może się znacznie wahać w zależności od stosowanej odmiany roślin, sposobu uprawy, typu produktu (olej haszyszowy, haszysz, marihuana). Zawartość THC w konopiach uprawianych w celach produkcji substancji narkotycznych zwiększa się z biegiem czasu ze względu na selekcję uprawianych odmian. 254 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia Dowiedziono, że zawartość THC w produktach otrzymywanych z konopi stosowanych w celach rekreacyjnych podwoiła się od roku 1980 [7, 8]. W dymie marihuany, oprócz kannabinoidów odpowiedzialnych za jej psychoaktywność, stwierdzono obecność także substancji toksycznych, takich jak amoniak, tlenek węgla czy cyjanowodór oraz substancji kancerogennych: np. benzen, 4-aminobifenyl, kadm, ołów, formaldehyd [9]. Wykazano, że palenie marihuany jest powiązane ze zwiększeniem poziomu karboksyhemoglobiny, wdychaniem oraz odkładaniem się smoły w płucach [6, 10]. Alternatywną do palenia metodą inhalacji marihuany jest waporyzacja, polegająca na podgrzaniu suszu do temperatury 180-200 ºC. Metoda ta powoduje odparowanie znacznych ilości kannabinoidów przy jednoczesnym uwalnianiu śladowych ilości innych substancji [11]. Zawartość THC w osoczu po waporyzacji jest podobna do zawartości po paleniu, jednak poziom tlenku węgla jest mniejszy [11]. W 1970 roku amerykańska agencja Drug Enforcement Administration (DEA) zajmująca się kontrolowaniem obrotu substancjami uzależniającymi umieściła marihuanę oraz kannabinoidy będące agonistami receptora CB1 w Grupie I (Schedule I) substancji wymienionych w Prawie o Kontrolowanych Substancjach (Controlled Substances Act). Oznacza to, że obrót nimi jest nielegalny na terenie USA. W latach 90. wiele stanów podjęło próby legalizacji medycznych preparatów opartych na kannabinoidach. Do roku 2011 szesnaście stanów zniosło lub ograniczyło restrykcje dotyczące zastosowań konopi w celach medycznych, jednak na poziomie federalnym są one nadal nielegalne [6, 12]. Powyższe fakty sprawiają, że badania medycznego potencjału konopi oraz kannabinoidów, szczególnie na etapie badań klinicznych, są znacznie utrudnione. 3. Kannabinoidy roślinne Opisano ponad 60 kannabinoidów występujących w roślinach Cannabis sativa. W największych stężeniach występują Δ9-tetrahydrokannabinol (THC; 0,1-25% s.m.) oraz kanabidiol (CBD; 0,1-2,9% s.m.) [13]. Δ9-tetrahydrokannabinol jest głównym psychoaktywnym składnikiem konopi. Jest substancją silnie lipofilową i nierozpuszczalną w wodzie. Jego absorpcja do krwi z wdychanego dymu jest bardzo szybka, staje się wykrywalny w osoczu krwi po kilku sekundach od zażycia, a maksymalne stężenie obserwuje się po 6-10 minutach [14]. Biodostępność THC zawartego we wdychaniem dymie jest uzależniona od głębokości wciągania powietrza oraz czasu wstrzymywania oddechu i przyjmuje się, że wynosi od 10 do 35%. Szczyt działania psychoaktywnego występuje po 255 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski ok. 20 minutach od zażycia [14]. W przypadku podania doustnego (dronabinol w postaci kapsułek) absorpcja THC jest wolna i nierówna, co skutkuje powolnym wzrostem stężenia w osoczu, które osiąga najwyższą wartość po 60-120 minutach [15]. Biodostępność THC podanego w tej formie wynosi około 6%, przy czym obserwuje się znaczne zróżnicowanie osobnicze. Maksymalne działanie psychoaktywne następuje w tym przypadku po 120-240 minutach [14]. THC może być również podany poprzez śluzówkę jamy ustnej, np. w postaci doustnego aerozolu (nabiximols). W przypadku tej metody, kannabinoid staje się wykrywalny w osoczu krwi po ok. 45 minutach od podania, a stężenie osiąga najwyższy poziom po 30-130 minutach [16]. Biodostępność jest nieznacznie wyższa niż w przypadku podania doustnego [17]. Po podaniu dożylnym, w czasie głównej fazy wystąpienia efektów zawiązanych z psychoaktywnymi właściwościami THC, tylko około 1% podanej dawki zidentyfikowano w mózgu [14]. THC jest metabolizowany głównie w wątrobie przez podrodzinę enzymów CYP2C. Jest w organizmie przekształcany do metabolitu aktywnego – 11-hydroksy-∆9-tetrahydrokannabinolu (11-OH-THC), którego maksymalne stężenie w przypadku inhalacji dymu marihuany obserwuje się po 9-23 minutach [14]. Jest wydalany przede wszystkim w kale, w mniejszym stopniu w moczu. THC jest wykrywalny w moczu do 12 dni po zażyciu ze względu na ekstensywne krążenie jelitowo-wątrobowe jego metabolitów [14]. THC, oprócz wywoływania euforii, wykazuje także właściwości przeciwbólowe, przeciwwymiotne, przeciwzapalne oraz antyoksydacyjne [18]. Kannabidiol (CBD) również jest substancją silnie lipofilową. Wykazuje niskie powinowactwo do receptorów CB1 oraz CB2, działa ponadto jako ich antagonista [19, 20]. Poziom absorpcji CBD z wdychanego dymu marihuany jest zbliżony do poziomu obserwowanego w przypadku THC. Biodostępność wynosi 11-45% [14]. Poziom biodostępności po podaniu doustnym wynosi 13-19% [21]. CBD wykazuje właściwości przeciwlękowe, przeciwpsychotyczne, przeciw-drgawkowe. Wykazano ponadto, że jest w stanie znosić psychoaktywne działanie THC, a więc redukować skutki uboczne jego stosowania [22, 23]. 4. Endokannabinoidy i układ endokannabinoidowy Układ endokannabinoidowy definiujemy jako system tworzony przez endokannabinoidy, ich receptory oraz białka zaangażowane w syntezę, transport i degradację endokannabinoidów [1]. Główną rolą odgrywaną przez poznane dotąd endokannabinoidy jest sygnalizacja wsteczna. Są one syntetyzowane przez komórki postsynaptyczne w odpowiedzi na wiązanie 256 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia neurotransmitera, po czym dyfundują poprzez szczelinę synaptyczną do błony presynaptycznej, gdzie oddziałując z receptorami CB1 powodują redukcję uwalniania neurotransmitera [24]. Dwoma najlepiej poznanymi endokannabinoidami są anandamid (AEA) oraz 2-arachidonoiloglicerol (2-AG). Cząsteczki te oddziałują z dwoma receptorami z nadrodziny receptorów sprzężonych z białkami G (ang. G Protein-Coupled Receptor, GPCR): CB1 oraz CB2. Mechanizm działania obu receptorów opiera się na aktywacji białek Gi/o wywołujących inhibicję cyklazyadenylanowej oraz na aktywacji szlaku MAPK oraz 3-kinazy fosfoinozytydu (PI3K). Receptor CB1 ponadto inhibuje kanały wapniowe sterowane potencjałem (ang. voltage-dependent calcium channel, VDCC) [1, 12, 20, 25]. Receptor CB1 występuje głównie w obrębie komórek centralnego układu nerwowego gdzie pośredniczy w uwalnianiu neurotransmiterów, natomiast CB2 – komórek układu odpornościowego, gdzie bierze udział w modyfikowaniu uwalniania cytokin [1, 20]. Oprócz receptorów CB, kannabinoidy egzogenne oddziałują także z kilkoma innymi typami receptorów: m.in. receptorami TRPV1 (ang. vanilloid transient receptor potential channel) należącymi do rodziny receptorów potencjału przejściowego TRP (ang. transient receptor potential) oraz receptorami GPR55 (ang. G-protein-coupled receptor 55) zaliczanymi do klasy A nadrodziny receptorów GPCR [1, 20]. Układ endokannabinoidowy pośredniczy w regulacji wielu procesów fizjologicznych, takich jak immunomodulacja, uczenie się, odczuwanie bólu czy stany zapalne [26, 27]. Sprawia to, że modulacja działania receptorów CB za pomocą ich naturalnych agonistów receptorów lub ich syntetycznych analogów jest coraz częściej rozpatrywana, jako potencjalna metoda wspomagająca leczenie wielu zespołów chorobowych. Dotychczasowe kierunki badań dotyczą głównie medycyny paliatywnej, jednak coraz większe zainteresowanie skupia na sobie określenie roli systemu endokannabinoidowego w rozwoju chorób nowotworowych. Wykazano, że w procesie rozwoju wielu nowotworów następuje wzrost produkcji endokannabinoidów oraz nasilenie ekspresji receptorów CB [28, 29]. Powyższe zjawiska zaobserwowano w przypadku glejaka wielopostaciowego, gwiaździaka, raka piersi, raka prostaty, raka jelita grubego, raka jajników, raka wątrobowokomórkowego czy gruczolaka przysadki [30-32, 33-35, 36, 37]. Interesującym zjawiskiem sugerującym powiązanie funkcjonowania układu endokannabinoidowego z procesem nowotworzenia jest zmniejszenia intensywności rozwoju nowotworu skóry indukowanego światłem UV w wyniku wyciszenia ekspresji receptorów CB [38]. Istnieje jednakże wiele badań sugerujących pełnienie przez opisywany układ funkcji supresorowej w procesie nowotworzenia. W badaniach na myszach wykazano, że zablokowanie ekspresji receptora CB1 w przypadku 257 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski raka jelita grubego powodowało przyspieszenie wzrostu nowotworu [39]. W pewnych typach nowotworów zaobserwowano zwiększony poziom ekspresji lipazy monoacyloglicerolu (MAGL), enzymu rozkładającego 2-arachidonoiloglicerol [40]. 5. Działanie przeciwnowotworowe W ciągu lat badań zgromadzono wiele danych dotyczących antynowotworowych właściwości kannabinoidów in vitro oraz w modelach zwierzęcych in vivo. Dotyczą one działania zarówno endokannabinoidów (anandamid, 2-AG), fitokannabinoidów (THC, CBD) oraz kannabinoidów syntetycznych (JWH-133, WIN 55,2121-2). Pierwsze badania dotyczące antynowotworowego działania kannabinoidów pochodzą z lat 70. Dotyczyły wpływu fitokannabinoidów (Δ9-THC, Δ8- THC, kannabinol (CBN), kannabidiol (CBD)) na gruczolakoraka płuc in vitro oraz in vivo (model mysi). Wykazano, że THC hamuje wzrost komórek nowotworu oraz zwiększa długość życia myszy [41, 42]. W kolejnych latach opisano spowolnienie wzrostu nowotworów in vivo oraz in vitro w przypadku glejaka wielopostaciowego, raka piersi, prostaty, tarczycy, okrężnicy, skóry, trzustki oraz białaczki i chłoniaka [43]. Jak dotąd wykazano, że w przypadkach wielu nowotworów kannabinoidy mogą hamować proliferację komórek nowotworowych, indukować apoptozę /autofagię, inhibować proces angiogenezy oraz tworzenia metastaz [44]. Z drugiej strony, istnieją także doniesienia o stymulowaniu rozwoju nowotworów przez kannabinoidy [45-48]. Mechanizm oddziaływania kannabinoidów na komórki nowotworowe jest niezwykle złożony, co sprawia, że wiele aspektów tych procesów ciągle nie jest w pełni wyjaśnionych. Ponadto, praktycznie wszystkie dotychczasowe badania dotyczące przeciwnowotworowych właściwości kannabinoidów były badaniami przedklinicznymi, a więc prowadzonymi w kulturach in vitro oraz na modelach zwierzęcych. W przypadku kannabinoidów będących agonistami receptorów CB (np. THC) mechanizm działania antynowotworowego opiera się na aktywacji syntazyceramidu, enzymu odpowiedzialnego za proces syntezy związków z grupy ceramidów. Akumulacja tych substancji w komórce powoduje stymulację kaskady kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (ang. mitogen activated protein kinases, MAPK). Długotrwała aktywacja tego szlaku metabolicznego powoduje aktywację inhibitora kinaz zależnych od cyklin (p27/KIP1), co z kolei prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy [49-51]. Akumulacja ceramidów ma także wpływ na czynniki pro- i antyapoptotyczne (wzrost poziomu Bax, obniżenie poziomu Bcl2), co prowadzi do aktywacji kaspaz i apoptozy 258 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia [51]. Kolejną konsekwencją akumulacji ceramidu w komórce jest stres retikulum endoplazmatycznego (ang. ER stress). Procesowi temu towarzyszy ekspresja białka p8 (Nupr1, ang. nuclear protein 1), prowadząca do aktywacji kinazy TRIB3, co wywołuje inhibicję szlaku pAkt/mTOR i ostatecznie uruchomienie procesów zaprogramowanej śmierci komórkowej [44, 52-55]. Mechanizm molekularny oddziaływania na komórki nowotworowe kannabinoidów niebędących agonistami receptorów CB (np. CBD) jest poznany w znacznie mniejszym stopniu. Dotychczasowe badania wskazują, że prawdopodobnym mechanizmem jest indukowanie przez CBD produkcji reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) [56-59]. Gdy stężenie ROS w komórce przekroczy pewien krytyczny poziom, komórka wkracza na szlak apoptozy. Wykazano, że reaktywne formy tlenu wpływają na wiele elementów szlaków metabolicznych związanych z procesem apoptozy, takich jak MAP3K5, JNK, białka p38, p53 [60, 61]. Jedyne badania mające na celu oszacowanie antynowotworowego działania kannabinoidów, jakie dotychczas przeprowadzono na ludziach, to niewielkie badanie pilotażowe z 2006 roku oraz dwa aktualnie trwające badania kliniczne pierwszej fazy [5]. W pierwszym eksperymencie badaniom poddano grupę dziewięciu pacjentów z nawrotem glejaka wielopostaciowego, opornego na standardową terapię.. Badanym kannabinoidem był THC, który podawano doczaszkowo, do masy guza. Metoda ta okazała się bezpieczna. U kilku pacjentów zaobserwowano czasowe spowolnienie wzrostu nowotworu. W bioptatach pobranych od dwóch pacjentów zaobserwowano ponadto aktywację mechanizmów komórkowych powiązanych z procesami autofagii i apoptozy [62]. Aktualnie trwające badania dotyczą bezpieczeństwa preparatu Sativex stosowanego u pacjentów z nawrotem glejaka wielopostaciowego [63, 64]. 6. Zastosowanie w medycynie paliatywnej Dane uzyskane w badaniach przedklinicznych wskazują, że preparaty oparte na kannabinoidach mogą znaleźć wiele zastosowań terapeutycznych, m.in. w przypadku chorób neurodegeneracyjnych, drgawek, zwalczaniu różnych rodzajów bólu, stymulowaniu apetytu czy przeciwdziałaniu nudnościom i wymiotom [65]. Określenie „medyczna marihuana” jest określeniem nieprecyzyjnym, nie istnieje jego ścisła definicja. Najczęściej odnosi się zarówno do konopi w postaci suszu, jak i do ekstraktów z konopi oraz preparatów opartych na kannabinoidach stosowanych w celach terapeutycznych [66]. Jak dotąd modulacja aktywności receptorów CB za pomocą naturalnych lub syntetycznych agonistów znalazła zastosowanie głównie w medycynie 259 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski paliatywnej. Kliniczne zastosowania preparatów kannabinoidowych obejmują m.in. łagodzenie nudności i wymiotów wywoływanych chemioterapią, zwalczanie bólu, stymulowanie apetytu [67-71]. Istnieje kilka zatwierdzonych preparatów stosowanych w tych celach: Marinol (dronabinol – syntetyczny izomer trans THC rozpuszczony w oleju sezamowym, zamknięty w żelatynowej kapsułce), Cesamet (nabilon – syntetyczny analog THC imitujący jego działanie, zamknięty w kapsułce), Sativex (nabiximols – standaryzowany ekstrakt z konopi w postaci doustnego aerozolu zawierający THC i CBD w proporcji 1,08:1) [17, 72, 73]. Marinol jest preparatem zatwierdzonym w USA do stosowania w przypadkach nudności i wymiotów indukowanych chemioterapią (ang. chemotherapyinduced nausea and vomiting, CINV) oraz anoreksji powiązanej z zespołen nabytego niedoboru odporności (ang. acquired immuno deficiency syndrome, AIDS) [72]. Cesamet dopuszczono w przypadku leczenia CINV [73]. Sativex jest przedmiotem trwających w USA badań klinicznych dotyczących leczenia bólu nowotworowego, natomiast w Kanadzie i w niektórych krajach Europy (w tym w Polsce) jest dopuszczony do stosowania w leczeniu spastyczności towarzyszącej stwardnieniu rozsianemu [74, 75]. Skuteczność tych terapii bywa jednak kwestionowana [68]. Jednym z najwcześniejszych wskazań do stosowania kannabinoidów było występowanie nudności i wymiotów indukowanych chemioterapią (ang. chemotherapy-induced nausea and vomiting, CINV). Badanie pilotażowe z 1988 roku wykazało, że marihuana przyjmowana w drodze inhalacji była skuteczna w redukowaniu objawów u 78% pacjentów, u których odpowiedź na klasyczne substancje przeciwwymiotne była niska [76]. Skuteczność marihuany stosowanej w przypadku tej dolegliwości jest jednak słabo udokumentowana. Efektywność preparatów opartych na kannabinoidach jest zbadana w znacznie szerszym zakresie. Przegląd literatury z 2001 roku wykazał, że preparaty kannabinoidowe (nabilon, dronabilon, levonantradol – syntetyczny analog dronabilonu) były skuteczniejsze od konwencjonalnych substancji przeciwwymiotnych stosowanych w tym czasie [77]. Nowsze wytyczne nie rekomendują jednak stosowania preparatów kannabinoidowych w przypadku występowania CINV ze względu na dostępność skuteczniejszych i bezpieczniejszych substancji farmakologicznych [78, 79]. W obszernej metaanalizie badań klinicznych z 2015 roku wykazano, że we wszystkich analizowanych przypadkach preparaty kannabinoidowe (nabilon, dronabilon, nabiximols, levonantradol, THC) wydawały się skuteczniejsze od placebo oraz aktywnych komparatorów, jednak nie we wszystkich badaniach wyniki osiągnęły istotność statystyczną [68]. Autorzy ocenili dowody na związek pomiędzy stosowaniem kannabinoidów a poprawą stanu pacjentów z CINV, jako dowody o niskiej jakości. 260 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia Istnieją badania kliniczne wykazujące, że preparaty kannabinoidowe (czysty THC, nabiximols) wykazują pewną skuteczność w zwalczaniu bólu nowotworowego [80-82]. Dane dotyczące łagodzenia innych typów bólu za pomocą kannabinoidów są niejasne. W przypadku bólów neuropatycznych, istnieją doniesienia o pewnej efektywności marihuany zażywanej w drodze inhalacji w zwalczaniu bólu [83-85], a także badania wykazujące brak skuteczności preparatu nabiximols [86]. W przypadku bólów o etiologii innej niż nowotworowa stosowanie kannabinoidów nie jest rekomendowane [66]. Dronabinol (syntetyczny izomer THC) jest zatwierdzony w USA do stosowania m.in. w przypadku pacjentów, u których występuje spadek wagi spowodowany AIDS, jednak jego skuteczność w porównaniu z innymi substancjami jest ograniczona. Istnieją doniesienia o stymulującym wpływie dronabinolu na apetyt pacjentów w porównaniu do placebo [87], jednak inne badania ich nie potwierdzają [88]. Dronabinol jest także mniej efektywny w stymulowaniu apetytu w porównaniu z megestrolem [89]. Wstępne badania sugerują, że kannabidiol może wykazywać pewna efektywność w łagodzeniu objawów dziecięcej padaczki lekoopornej [90, 91]. 7. Podsumowanie Pomimo danych zgromadzonych w wielu badaniach przedklinicznych, sugerujących, że konopie i kannabinoidy mają pewien potencjał leczniczy i mogłyby służyć jako uzupełnienie standardowych terapii wielu schorzeń, przeprowadzono względnie mało badań klinicznych. Jedną z przyczyn są niesprzyjające regulacje prawne, które w wielu miejscach na świecie istotnie utrudniają prowadzenie badań wpływu tego typu związków na ludzi. Jak dotąd wykazano, że kannabinoidy mogą znaleźć zastosowanie w medycynie paliatywnej, coraz więcej wiadomo także o ich antynowotworowych właściwościach, jednak szczegóły tego mechanizmu nie są do końca wyjaśnione i wymagają dalszych badań. Należy pamiętać, aby rozdzielić kwestie „marihuany medycznej” oraz marihuany stosowanej w celach rekreacyjnych. Zastosowania medyczne wymagają ścisłego nadzoru lekarskiego oraz stosowania preparatów o szczegółowo określonym składzie w celu uzyskania maksymalnego efektu terapeutycznego przy jednoczesnym zminimalizowaniu ryzyka wystąpienia efektów ubocznych oraz uniknięcia potencjalnie szkodliwych interakcji z innymi lekami. Pomimo wielu obiecujących wyników badań, ciągle jest zbyt wcześnie, aby uznać stosowanie kannabinoidów za skuteczną i bezpieczną metodę terapeutyczną i dopuścić ją do powszechnej praktyki klinicznej. Brak jest szczegółowych i rygorystycznych badań dotyczących bezpieczeństwa stosowania tych preparatów oraz ich interakcji z innymi substancjami. 261 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski Szczególnie w aspekcie działania antynowotworowego stoimy dopiero na początku drogi ku dogłębnemu zrozumieniu działania mechanizmów uruchamianych w komórkach przez kannabinoidy oraz ich konsekwencji w skali całego organizmu. Musimy pamiętać, że praktycznie cała dotychczasowa wiedza dotycząca tego aspektu opiera się na badaniach in vitro oraz na modelach zwierzęcych. Pomimo obiecujących rezultatów tych analiz, należy zaczekać na wyniki dokładnych badań na nieporównywalnie bardziej złożonym modelu, jakim jest organizm ludzki. Dopiero one pozwolą na rzeczywiste oszacowanie skuteczności kannabinoidów w zwalczaniu nowotworów. Ciągle istniejące luki w wiedzy uniemożliwiają pełne wykorzystanie medycznego potencjału konopi i kannabinoidów. Literatura 1. Hermanson D. J., Marnett L. J. Cannabinoids, endocannabinoids, and cancer, Cancer metastasis reviews, Dec. 2011, vol. 30, no. 3-4, s. 599-612 2. Gaoni Y., Mechoulam R. Isolation, Structure, and Partial Synthesis of an Active Constituent of Hashish, Journal of the American Chemical Society, Apr. 1964, vol. 86, no. 8, s. 1646-1647 3. Mechoulam R., Braun P., Gaoni Y. A stereospecific synthesis of (-)-delta 1- and (-)-delta 1(6)-tetrahydrocannabinols, Journal of the American Chemical Society, Aug. 1967, vol. 89, no. 17, s. 4552-4554 4. Mechoulam R., Gaoni Y. The absolute configuration of delta-1tetrahydrocannabinol, the major active constituent of hashish, Tetrahedron letters, Mar. 1967, vol. 12, s. 1109-1111 5. National Cancer Institute. [Online]. www.cancer.gov/aboutcancer/treatment/cam/hp/cannabis-pdq#section/_3. [Dostęp: 26.03.2016] 6. Kramer J. L. Medical Marijuana for Cancer, A Cancer Journal for Clinicians, 2015, vol. 65, no. 2, s. 109-122 7. McLaren J., Swift W., Dillon P., Allsop S. Cannabis potency and contamination: a review of the literature, Addiction (Abingdon, England), Jul. 2008, vol. 103, no. 7, s. 1100-1109 8. Pijlman F. T. A., Rigter S. M., Hoek J., Goldschmidt H. M. J., Niesink R. J. M. Strong increase in total delta-THC in cannabis preparations sold in Dutch coffee shops, Addiction biology, Jun. 2005, vol. 10, no. 2, s. 171-180 9. Moir D., Rickert W. S., Levasseur G., Larose Y., Maertens R., White P., Desjardins S. A comparison of mainstream and sidestream marijuana and tobacco cigarette smoke produced under two machine smoking conditions, Chemical research in toxicology, Feb. 2008, vol. 21, no. 2, s. 494-502 10. Wu T. C., Tashkin D. P., Djahed B., Rose J. E. Pulmonary hazards of smoking marijuana as compared with tobacco, The New England journal of medicine, Feb. 1988, vol. 318, no. 6, s. 347-351 11. Abrams D. I., Vizoso H. P., Shade S. B., Jay C., Kelly M. E., Benowitz N. L. Vaporization as a smokeless cannabis delivery system: a pilot study, Clinical pharmacology and therapeutics, Nov. 2007, vol. 82, no. 5, s. 572-5728 12. Bowles D. W., O’Bryant C. L., Camidge D. R., Jimeno A. The intersection between cannabis and cancer in the United States, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2012, vol. 83, no. 1, s. 1-10 262 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia 13. McPartland J. M., Russo E. B. Cannabis and Cannabis Extracts: Greater Than the Sum of Their Parts?, Cannabis Therapeutics in HIV/AIDS, 2001, vol. 1, no. 3, s. 103-132 14. Grotenhermen F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of cannabinoids, Clinical pharmacokinetics, Jan. 2003, vol. 42, no. 4, s. 327-360 15. Ohlsson A., Lindgren J. E., Wahlen A., Agurell S., Hollister L. E., Gillespie H. K. Plasma delta-9 tetrahydrocannabinol concentrations and clinical effects after oral and intravenous administration and smoking, Clinical pharmacology and therapeutics, Sep. 1980, vol. 28, no. 3, s. 409-416 16. Guy G. W., Flint M. E. A Single Centre, Placebo-Controlled, Four Period, Crossover, Tolerability Study Assessing, Pharmacodynamic Effects, Pharmacokinetic Characteristics and Cognitive Profiles of a Single Dose of Three Formulations of Cannabis Based Medicine Extracts (CBMEs), Journal of Cannabis Therapeutics, Jan. 2004, vol. 3, no. 3, s. 35-77 17. Karschner E. L., Darwin W. D., Goodwin R. S., Wright S., Huestis M. A. Plasma cannabinoid pharmacokinetics following controlled oral delta9tetrahydrocannabinol and oromucosal cannabis extract administration, Clinical chemistry, Jan. 2011, vol. 57, no. 1, s. 66-75 18. Brenneisen R. Chemistry and Analysis of Phytocannabinoids and Other Cannabis Constituents, in Marijuana and the Cannabinoids, M. A. ElSohly, Ed. Totowa, NJ: Humana Press, 2007, s. 17-49 19. Pertwee R. G. The diverse CB1 and CB2 receptor pharmacology of three plant cannabinoids: delta9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and delta 9tetrahydrocannabivarin, British journal of pharmacology, Jan. 2008, vol. 153, no. 2, s. 199-215 20. Pertwee R. G., Howlett a C., Abood M. E., Alexander S. P. H., Marzo V. Di, Elphick M. R., Greasley P. J., Hansen H. S., Kunos G. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXIX. Cannabinoid Receptors and Their Ligands: Beyond CB 1 and CB 2, Pharmacological reviews, 2010, vol. 62, no. 4, s. 588-631 21. Mechoulam R., Parker L. A., Gallily R. Cannabidiol: an overview of some pharmacological aspects, Journal of clinical pharmacology, Nov. 2002, vol. 42, no. 11 Suppl, s. 11S-19S 22. Niesink R. J. M., van Laar M. W. Does Cannabidiol Protect Against Adverse Psychological Effects of THC?, Frontiers in psychiatry, Jan. 2013, vol. 4, no. October, s. 130 23. Bhattacharyya S., Morrison P. D., Fusar-Poli P., Martin-Santos R., Borgwardt S., Winton-Brown T., Nosarti C., O’ Carroll C. M., Seal M., Allen P., Mehta M. A., Stone J. M., Tunstall N., Giampietro V., Kapur S., Murray R. M., Zuardi A. W., Crippa J. A., Atakan Z., McGuire P. K. Opposite effects of delta-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol on human brain function and psychopathology, Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology, Feb. 2010, vol. 35, no. 3, s. 764-774 24. Stella N., Schweitzer P., Piomelli D. A second endogenous cannabinoid that modulates long-term potentiation, Nature, Aug. 1997, vol. 388, no. 6644, s. 773-778 263 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski 25. Calandra B., Portier M., Kernéis A., Delpech M., Carillon C., Le Fur G., Ferrara P., Shire D. Dual intracellular signaling pathways mediated by the human cannabinoid CB1 receptor, European journal of pharmacology, Jun. 1999, vol. 374, no. 3, s. 445-455 26. Klein T. W. Cannabinoid-based drugs as anti-inflammatory therapeutics, Nature reviews. Immunology, May 2005, vol. 5, no. 5, s. 400-411 27. Wilson R. I., Nicoll R. A. Endocannabinoid signaling in the brain, Science (New York, N.Y.), Apr. 2002, vol. 296, no. 5568, s. 678-682 28. Guzmán M. Cannabinoids: potential anticancer agents, Nature reviews. Cancer, Oct. 2003, vol. 3, no. 10, s. 745-755 29. Malfitano A. M., Ciaglia E., Gangemi G., Gazzerro P., Laezza C., Bifulco M. Update on the endocannabinoid system as an anticancer target, Expert opinion on therapeutic targets, Mar. 2011, vol. 15, no. 3, s. 297-308 30. Pisanti S., Picardi P., D’Alessandro A., Laezza C., Bifulco M. The endocannabinoid signaling system in cancer, Trends in pharmacological sciences, May 2013, vol. 34, no. 5, s. 273-282 31. Endsley M. P., Thill R., Choudhry I., Williams C. L., Kajdacsy‐Balla A., Campbell W. B., Nithipatikom K. Expression and function of fatty acid amide hydrolase in prostate cancer, International Journal of Cancer, Sep. 2008, vol. 123, no. 6, s. 1318-1326 32. Nomura D. K., Lombardi D. P., Chang J. W., Niessen S., Ward A. M., Long J. Z., Hoover H. H., Cravatt B. F. Monoacylglycerol lipase exerts dual control over endocannabinoid and fatty acid pathways to support prostate cancer, Chemistry & biology, Jul. 2011, vol. 18, no. 7, s. 846-856 33. Mukhopadhyay B., Schuebel K., Mukhopadhyay P., Cinar R., Godlewski G., Xiong K., Mackie K., Lizak M., Yuan Q., Goldman D., Kunos G. Cannabinoid receptor 1 promotes hepatocellular carcinoma initiation and progression through multiple mechanisms, Hepatology (Baltimore, Md.), May 2015, vol. 61, no. 5, s. 1615-1626 34. Messalli E. M., Grauso F., Luise R., Angelini A., Rossiello R. Cannabinoid receptor type 1 immunoreactivity and disease severity in human epithelial ovarian tumors, American journal of obstetrics and gynecology, Sep. 2014, vol. 211, no. 3, s. 234.e1-6 35. Jung C. K., Kang W. K., Park J. M., Ahn H. J., Kim S. W., Taek Oh S., Choi K. Y. Expression of the cannabinoid type I receptor and prognosis following surgery in colorectal cancer, Oncology letters, Mar. 2013, vol. 5, no. 3, s. 870-876 36. Caffarel M. M., Sarrió D., Palacios J., Guzmán M., Sánchez C. Delta 9tetrahydrocannabinol inhibits cell cycle progression in human breast cancer cells through Cdc2 regulation, Cancer research, Jul. 2006, vol. 66, no. 13, s. 6615-6621 37. Sánchez C., de Ceballos M. L., Gomez del Pulgar T., Rueda D., Corbacho C., Velasco G., Galve-Roperh I., Huffman J. W., Ramón y Cajal S., Guzmán M. Inhibition of glioma growth in vivo by selective activation of the CB(2) cannabinoid receptor, Cancer research, Aug. 2001, vol. 61, no. 15, s. 5784-5789 38. Zheng D., Bode A. M., Zhao Q., Cho Y.-Y., Zhu F., Ma W.-Y., Dong Z. The cannabinoid receptors are required for ultraviolet-induced inflammation 264 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. and skin cancer development, Cancer research, May 2008, vol. 68, no. 10, s. 3992-3998 Wang D., Wang H., Ning W., Backlund M. G., Dey S. K., DuBois R. N. Loss of cannabinoid receptor 1 accelerates intestinal tumor growth, Cancer research, Aug. 2008, vol. 68, no. 15, s. 6468-6476 Nomura D. K., Long J. Z., Niessen S., Hoover H. S., Ng S.-W., Cravatt B. F. Monoacylglycerol lipase regulates a fatty acid network that promotes cancer pathogenesis, Cell, Jan. 2010, vol. 140, no. 1, s. 49-61 Carchman R. A., Harris L. S., Munson A. E. The inhibition of DNA synthesis by cannabinoids, Cancer research, Jan. 1976, vol. 36, no. 1, s. 95-100 Munson A. E., Harris L. S., Friedman M. A., Dewey W. L., Carchman R. A. Antineoplastic activity of cannabinoids, Journal of the National Cancer Institute, Sep. 1975, vol. 55, no. 3, s. 597-602 Pisanti S., Malfitano A. M., Grimaldi C., Santoro A., Gazzerro P., Laezza C., Bifulco M. Use of cannabinoid receptor agonists in cancer therapy as palliative and curative agents, Best practice & research. Clinical endocrinology & metabolism, Mar. 2009, vol. 23, no. 1, s. 117-131 Velasco G., Sánchez C., Guzmán M. Towards the use of cannabinoids as antitumour agents, Nature Reviews Cancer, 2012, vol. 12, no. 6, s. 436-444 Cudaback E., Marrs W., Moeller T., Stella N. The expression level of CB1 and CB2 receptors determines their efficacy at inducing apoptosis in astrocytomas, PloS one, Jan. 2010, vol. 5, no. 1, s. e8702 Hart S., Fischer O. M., Ullrich A. Cannabinoids induce cancer cell proliferation via tumor necrosis factor alpha-converting enzyme (TACE/ADAM17)-mediated transactivation of the epidermal growth factor receptor, Cancer research, Mar. 2004, vol. 64, no. 6, s. 1943-50 McKallip R. J., Nagarkatti M., Nagarkatti P. S. Delta-9-tetrahydrocannabinol enhances breast cancer growth and metastasis by suppression of the antitumor immune response, Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), Mar. 2005, vol. 174, no. 6, s. 3281-3289 Zhu L. X., Sharma S., Stolina M., Gardner B., Roth M. D., Tashkin D. P., Dubinett S. M. Delta-9-tetrahydrocannabinol inhibits antitumor immunity by a CB2 receptor-mediated, cytokine-dependent pathway, Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), Jul. 2000, vol. 165, no. 1, s. 373-380 Kogan N. Cannabinoids and Cancer, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, Oct. 2005, vol. 5, no. 10, s. 941-952 Sarfaraz S., Adhami V. M., Syed D. N., Afaq F., Mukhtar H. Cannabinoids for cancer treatment: progress and promise, Cancer research, Jan. 2008, vol. 68, no. 2, s. 339-342 Sarfaraz S., Afaq F., Adhami V. M., Malik A., Mukhtar H. Cannabinoid receptor agonist-induced apoptosis of human prostate cancer cells LNCaP proceeds through sustained activation of ERK1/2 leading to G1 cell cycle arrest, The Journal of biological chemistry, Dec. 2006, vol. 281, no. 51, s. 39480-39491 Salazar M., Carracedo A., Salanueva I. J., Hernández-Tiedra S., Lorente M., Egia A., Vázquez P., Blázquez C., Torres S., García S., Nowak J., Fimia G. M., Piacentini M., Cecconi F., Pandolfi P. P., González-Feria L., Iovanna J. L., Guzmán M., Boya P., Velasco G. Cannabinoid action induces autophagy- 265 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. mediated cell death through stimulation of ER stress in human glioma cells, The Journal of clinical investigation, May 2009, vol. 119, no. 5, s. 1359-1372 Salazar M., Lorente M., García-Taboada E., Hernández-Tiedra S., Davila D., Francis S. E., Guzmán M., Kiss-Toth E., Velasco G. The pseudokinasetribbles homologue-3 plays a crucial role in cannabinoid anticancer action, Biochimica et biophysicaacta, Oct. 2013, vol. 1831, no. 10, s. 1573-1578 Sui X., Chen R., Wang Z., Huang Z., Kong N., Zhang M., Han W., Lou F., Yang J., Zhang Q., Wang X., He C., Pan H. Autophagy and chemotherapy resistance: a promising therapeutic target for cancer treatment, Cell death & disease, Jan. 2013, vol. 4, s. e838 Encinar J. A., Mallo G. V., Mizyrycki C., Giono L., Gonzalez-Ros J. M., Rico M., Canepa E., Moreno S., Neira J. L., Iovanna J. L. Human p8 Is a HMG-I/Ylike Protein with DNA Binding Activity Enhanced by Phosphorylation, Journal of Biological Chemistry, Oct. 2000, vol. 276, no. 4, s. 2742-2751 De Petrocellis L., Ligresti A., SchianoMoriello A., Iappelli M., Verde R., Stott C. G., Cristino L., Orlando P., Di Marzo V. Non-THC cannabinoids inhibit prostate carcinoma growth in vitro and in vivo: pro-apoptotic effects and underlying mechanisms, British journal of pharmacology, 2013, vol. 168, no. 1, s. 79-102 Ligresti A., Moriello A. S., Starowicz K., Matias I., Pisanti S., De Petrocellis L., Laezza C., Portella G., Bifulco M., Di Marzo V. Antitumor activity of plant cannabinoids with emphasis on the effect of cannabidiol on human breast carcinoma, The Journal of pharmacology and experimental therapeutics, Sep. 2006, vol. 318, no. 3, s. 1375-1387 McAllister S. D., Murase R., Christian R. T., Lau D., Zielinski A. J., Allison J., Almanza C., Pakdel A., Lee J., Limbad C., Liu Y., Debs R. J., Moore D. H., Desprez P. Y. Pathways mediating the effects of cannabidiol on the reduction of breast cancer cell proliferation, invasion, and metastasis, Breast Cancer Research and Treatment, Sep. 2010, vol. 129, no. 1, s. 37-47 Shrivastava A., Kuzontkoski P. M., Groopman J. E., Prasad A. Cannabidiol Induces Programmed Cell Death in Breast Cancer Cells by Coordinating the Cross-talk between Apoptosis and Autophagy, Molecular Cancer Therapeutics, May 2011, vol. 10, no. 7, s. 1161-1172 Benhar M., Dalyot I., Engelberg D., Levitzki A. Enhanced ROS production in oncogenically transformed cells potentiates c-Jun N-terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase activation and sensitization to genotoxic stress, Molecular and cellular biology, Oct. 2001, vol. 21, no. 20, s. 6913-6926 Laurent A., Nicco C., Chéreau C., Goulvestre C., Alexandre J., Alves A., Lévy E., Goldwasser F., Panis Y., Soubrane O., Weill B., Batteux F. Controlling tumor growth by modulating endogenous production of reactive oxygen species, Cancer research, Feb. 2005, vol. 65, no. 3, s. 948-956 Guzmán M., Duarte M. J., Blázquez C., Ravina J., Rosa M. C., Galve-Roperh I., Sánchez C., Velasco G., González-Feria L. A pilot clinical study of Delta9tetrahydrocannabinol in patients with recurrent glioblastomamultiforme, British journal of cancer, 2006, vol. 95, no. 2, s. 197-203 Clinicaltrials.gov. [Online]. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01812603. [Accessed: 30.032016] 266 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia 64. Clinicaltrials.gov. [Online]. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01812616. [Accessed: 30.03.2016] 65. Pertwee R. G. Targeting the endocannabinoid system with cannabinoid receptor agonists: pharmacological strategies and therapeutic possibilities, Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biologicalsciences, Dec. 2012, vol. 367, no. 1607, s. 3353-3363 66. Murnion B. Medicinal cannabis, Australian Prescriber, 2015, vol. 38, no. 6, s. 212-215 67. Ben Amar M. Cannabinoids in medicine: A review of their therapeutic potential, Journal of Ethnopharmacology, 2006, vol. 105, no. 1-2, s. 1-25 68. Whiting P. F., Wolff R. F., Deshpande S., Di Nisio M., Duffy S., Hernandez A. V., Keurentjes J. C., Lang S., Misso K., Ryder S., Schmidlkofer S., Westwood M., Kleijnen J. Cannabinoids for Medical Use, Jama, 2015, vol. 313, no. 24, sp. 2456 69. Hill K. P. Medical Marijuana for Treatment of Chronic Pain and Other Medical and Psychiatric Problems, JAMA, Jun. 2015, vol. 313, no. 24, s. 2474 70. Guindon J., Hohmann A. G. The endocannabinoid system and pain, CNS & neurological disorders drug targets, 2009, vol. 8, no. 6, s. 403-421 71. Woolridge E., Barton S., Samuel J., Osorio J., Dougherty A., Holdcroft A. Cannabis use in HIV for pain and other medical symptoms, Journal of pain and symptom management, Apr. 2005, vol. 29, no. 4, s. 358-367 72. www.rxabbvie.com. [Online]. http://www.rxabbvie.com/pdf/marinol_PI.pdf. [Dostęp: 30.03.2016] 73. www.cesamet.com. [Online]. http://www.cesamet.com/patient-home.asp. [Dostęp: 30.03.2016] 74. www.gwpharm.com. [Online]. http://www.gwpharm.com/Sativex1.aspx. [Dostęp: 30.03.2016] 75. www.almirall.com. [Online]. http://www.almirall.com/pl/aboutalmirall/research-and-development/therapeutic-areas/pain. [Dostęp: 30.03.2016] 76. Vinciguerra V., Moore T., Brennan E. Inhalation marijuana as an antiemetic for cancer chemotherapy, New York state journal of medicine, Oct. 1988, vol. 88, no. 10, s. 525-527 77. Tramèr M. R., Carroll D., Campbell F. A., Reynolds D. J., Moore R. A., McQuay H. J. Cannabinoids for control of chemotherapy induced nausea and vomiting: quantitative systematic review, BMJ (Clinical research ed.), Jul. 2001, vol. 323, no. 7303, s. 16-21 78. Kris M. G., Hesketh P. J., Somerfield M. R., Feyer P., Clark-Snow R., Koeller J. M., Morrow G. R., Chinnery L. W., Chesney M. J., Gralla R. J., Grunberg S. M. American Society of Clinical Oncology guideline for antiemetics in oncology: update 2006, Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, Jun. 2006, vol. 24, no. 18, s. 2932-2947 79. Roila F., Herrstedt J., Aapro M., Gralla R. J., Einhorn L. H., Ballatori E., Bria E., Clark-Snow R. A., Espersen B. T., Feyer P., Grunberg S. M., Hesketh P. J., Jordan K., Kris M. G., Maranzano E., Molassiotis A., Morrow G., Olver I., Rapoport B. L., Rittenberg C., Saito M., Tonato M., Warr D. Guideline update for MASCC and ESMO in the prevention of chemotherapy- and radiotherapyinduced nausea and vomiting: results of the Perugia consensus conference, 267 Paweł Śledziński, Agnieszka Nowak, Joanna Zeyland, Ryszard Słomski 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO, May 2010, vol. 21 Suppl 5, s. 232-243 Noyes R., Brunk S. F., Baram D. A., Canter A. Analgesic effect of delta-9tetrahydrocannabinol, Journal of clinical pharmacology, Jan., vol. 15, no. 2-3, s. 139-143 Johnson J. R., Burnell-Nugent M., Lossignol D., Ganae-Motan E. D., Potts R., Fallon M. T. Multicenter, double-blind, randomized, placebo-controlled, parallel-group study of the efficacy, safety, and tolerability of THC:CBD extract and THC extract in patients with intractable cancer-related pain, Journal of pain and symptom management, Feb. 2010, vol. 39, no. 2, s. 167-179 Portenoy R. K., Ganae-Motan E. D., Allende S., Yanagihara R., Shaiova L., Weinstein S., McQuade R., Wright S., Fallon M. T. Nabiximols for opioidtreated cancer patients with poorly-controlled chronic pain: a randomized, placebo-controlled, graded-dose trial, The journal of pain : official journal of the American Pain Society, May 2012, vol. 13, no. 5, s. 438-449 Wilsey B., Marcotte T., Deutsch R., Gouaux B., Sakai S., Donaghe H. Lowdose vaporized cannabis significantly improves neuropathic pain, The journal of pain : official journal of the American Pain Society, Mar. 2013, vol. 14, no. 2, s. 136-148 Wilsey B., Marcotte T., Tsodikov A., Millman J., Bentley H., Gouaux B., Fishman S. A randomized, placebo-controlled, crossover trial of cannabis cigarettes in neuropathic pain, The journal of pain : official journal of the American Pain Society, Jun. 2008, vol. 9, no. 6, s. 506-521 Ellis R. J., Toperoff W., Vaida F., van den Brande G., Gonzales J., Gouaux B., Bentley H., Atkinson J. H. Smoked medicinal cannabis for neuropathic pain in HIV: a randomized, crossover clinical trial, Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology, Feb. 2009, vol. 34, no. 3, s. 672-680 Lynch M. E., Cesar-Rittenberg P., Hohmann A. G. A double-blind, placebocontrolled, crossover pilot trial with extension using an oral mucosal cannabinoid extract for treatment of chemotherapy-induced neuropathic pain, Journal of pain and symptom management, Jan. 2014, vol. 47, no. 1, s. 166-173 Brisbois T. D., de Kock I. H., Watanabe S. M., Mirhosseini M., Lamoureux D. C., Chasen M., MacDonald N., Baracos V. E., Wismer W. V,Delta-9tetrahydrocannabinol may palliate altered chemosensory perception in cancer patients: results of a randomized, double-blind, placebo-controlled pilot trial, Annals of oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO, Sep. 2011, vol. 22, no. 9, s. 2086-2093 Strasser F., Luftner D., Possinger K., Ernst G., Ruhstaller T., Meissner W., Ko Y. D., Schnelle M., Reif M., Cerny T., Comparison of orally administered cannabis extract and delta-9-tetrahydrocannabinol in treating patients with cancer-related anorexia-cachexia syndrome: a multicenter, phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial from the Cannabi, Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, Jul. 2006, vol. 24, no. 21, s. 3394-3400 Jatoi A., Windschitl H. E., Loprinzi C. L., Sloan J. A., Dakhil S. R., Mailliard J. A., Pundaleeka S., Kardinal C. G., Fitch T. R., Krook J. E., Novotny P. J., Christensen B. Dronabinol versus megestrol acetate versus combination 268 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia therapy for cancer-associated anorexia: a North Central Cancer Treatment Group study, Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, Jan. 2002, vol. 20, no. 2, s. 567-573 90. Devinsky O., Cilio M. R., Cross H., Fernandez-Ruiz J., French J., Hill C., Katz R., Di Marzo V., Jutras-Aswad D., Notcutt W. G., Martinez-Orgado J., Robson P. J., Rohrback B. G., Thiele E., Whalley B., Friedman D. Cannabidiol: pharmacology and potential therapeutic role in epilepsy and other neuropsychiatric disorders, Epilepsia, Jun. 2014, vol. 55, no. 6, s. 791-802 91. Devinsky O., Sullivan J., Friedman D., Thiele E., Marsh E., Laux L. Efficacy and safety of Epidiolex (cannabidiol) in children and young adults with treatmentresistant epilepsy: initial data from an expanded access program, Chicago (IL): American Epilepsy Society, 2014 Kannabinoidy w medycynie – przegląd zagadnienia Streszczenie Konopie oraz zawarte w nich substancje aktywne – kannabinoidy skupiają na sobie coraz większą uwagę badaczy ze względu na swój potencjał leczniczy. Kannabinoidy oddziałują na organizm człowieka za pośrednictwem receptorów endokannabinoidowych, będących elementem występującego w organizmach ssaków układu kannabinoidowego. Układ ten pełni wiele istotnych funkcji regulacyjnych, przez co modulowanie jego aktywności za pomocą roślinnych lub syntetycznych kannabinoidów może stać się interesująca strategia terapeutyczną. Jak dotąd preparaty oparte na kannabinoidach znalazły pewne zastosowanie w medycynie paliatywnej, jako substancje hamujące nudności i wymioty, działające przeciwbólowo czy w łagodzeniu objawów padaczki. Interesujący jest także ich potencjał antynowotworowy, który wykazano w wielu badaniach przedklinicznych, jednak szczegóły tego mechanizmu są poznane w niewielkim stopniu. Słowa kluczowe: konopie, marihuana, kannabinoidy, nowotwory, medycyna paliatywna Cannabinoids in medicine – review of an issue Abstract Cannabis and their active compounds – cannabinoids gain more and more attention of researchers because of their medical potential. Cannabinoids impact on human organism through cannabinoid receptors which are part of endocannabinoids system which occurs in mammal organisms. Endocannabinoid system has many regulatory functions so modulation of its activity can become interesting therapeutical strategy. To date cannabinoid formulations were applied in some ways in palliative medicine as antiemetics, analgesics and anticonvulsants. Also of interest is their anticancer potential which was indicated in many preclinical studies but details of that mechanism are still not well understood. Keywords: Cannabis, marijuana, cannabinoids, cancer, palliative medicine 269 Małgorzata Szabla1, Ewa Kędzierska2 Medyczna marihuana 1. Historia medycznego stosowania marihuany Preparaty z konopi takie jak marihuana znajdują zastosowanie w różnorakich dziedzinach życia już ponad 10 000 lat. Stosowane były między innymi do produkcji lin, lakieru, tkanin, kadzideł, czy też oleju opałowego. W 2740 r. p.n.e. chiński lekarz Shen Nung jako pierwszy udokumentował zastosowanie marihuany w lecznictwie. Wykorzystywano ją wówczas jako lek na reumatyzm, zaparcia, malarię, zaburzenia układu rozrodczego kobiet, a także w celu znoszenia bólów porodowych i operacyjnych [1-3]. W II wieku p.n.e Hua Tao, założyciel chińskiej chirurgii zalecał stosowanie konopi jako leku znieczulającego. W Indiach natomiast stosowano marihuanę jako środek przeciwbólowy (nerwobóle, bóle głowy, zębów), przeciwdrgawkowy (padaczka, tężec, wścieklizna), uspokajający (lęk, mania, histeria), moczopędny, znieczulający, a także przeciwzapalny (reumatyzm i inne choroby zapalne). Ponadto konopie wykorzystywano jako antybiotyk (gruźlica, miejscowo przy infekcjach skóry), lek rozkurczowy (kolka, biegunka), przeciwkaszlowy i wykrztuśny (zapalenie oskrzeli, astma), a także w celu zwalczania pasożytów wewnętrznych i zewnętrznych oraz poprawienia apetytu. Mahomet, wraz z zakazem spożywania alkoholu zalecił palenie marihuany. Początek naszej ery to czas poznania euforycznych właściwości rośliny oraz uznania jej za środek psychoaktywny [1]. W XIX wieku w całej Europie środki zawierające konopie stanowiły leki stosowane w bólach, drgawkach, wymiotach i stanach spastycznych [3]. W 1863 roku w USA odbyła się po raz pierwszy konferencja na temat zastosowania marihuany w medycynie [4]. Na początku lat 20. i 30. stopniowo narastała liczba przeciwników stosowania konopi. XX wiek to czas, w którym marihuana została uznana za narkotyk, a posiadanie jej i spożywanie było zakazane i surowo karane. Jednoczenie rok 1980 przyjmuje się za datę otwierającą renesans przetworów z marihuany. Świat medycyny skupił się na badaniach, dotyczących stosowania preparatów z konopi w terapii przeróżnych schorzeń [1-3, 5]. 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Zakładzie Farmakologii z Farmakodynamiką, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 2 [email protected], Katedra i Zakład Farmakologii z Farmakodynamiką, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 270 Medyczna marihuana 2. Medyczna marihuana Priorytetem jest wyznaczenie granicy pomiędzy marihuaną medyczną, a marihuaną – używką. Za stricte medyczną marihuanę uważa się wszystkie preparaty farmaceutyczne, pochodzące z wyselekcjonowanych odmian konopi, hodowanych w specjalnie przygotowanych halach. Mogą one występować w postaci suszu, ekstraktu, bądź oleju, wówczas bogate są w liczne związki chemiczne, wykazujące terapeutyczne właściwości, bądź w formie aerozolu, tabletek, kapsułek, zawierających występujące pojedynczo, lub w różnych kombinacjach kannabinoidy. Ekstrakty stosowane doustnie są zwykle standaryzowane. Preparaty te przepisywane są na receptę, z uwzględnieniem ściśle określonych wskazań, przez lekarza, który może stale kontrolować stan zdrowia pacjenta. Ponadto w niektórych krajach dopuszczalne jest medyczne używanie marihuany w formie palenia, czy wdychania par. Preparaty te nie są standaryzowane, dlatego też mogą znacznie różnić się ilością przyjmowanych składników czynnych [6]. 3. Konopie jako surowiec roślinny Konopie spotykamy w dwóch gatunkach – konopie siewne (Cannabis sativa) oraz konopie indyjskie (Cannabis indica). Cannabis sativa to roślina zielna, jednoroczna, niehalucynogenna, występuje w dwóch postaciach – męskiej i żeńskiej, rzadziej występują odmiany obupłciowe. Formę narkotyczną stanowi odmiana Cannabis indica, która jest rośliną dwupienną. Marihuana to suszone liście, kwiatostany i drobne łodygi tej odmiany, które zawierają spore ilości kannabinoidów (nawet do 8% THC), wykazujących działanie halucynogenne. Haszysz to żywica wydzielana przez kwiatostany żeńskiej odmiany konopi. Najwięcej psychoaktywnych kannabinoidów zawiera olej haszyszowy, który jest ciekłym ekstraktem, pochodzącym z rośliny lub z żywicy, otrzymywany za pomocą rozpuszczalników organicznych (alkohol, benzyna, eter naftowy) [7-8]. 4. Składniki czynne konopi Zawartość związków czynnych w przetworach z konopi nie jest jednorodna, zależy od rodzaju surowca roślinnego oraz metod jego obróbki. Konopie siewne zawierają około 400 substancji chemicznych, ponad 80 należy do grupy kannabinoidów. Najważniejszym i najlepiej poznanym jest Δ9- tetrahydrokannabinol (THC), który działa agonistycznie na receptory kannabinoidowe. Kolejnymi poznanymi kannabinoidami są: kannabidiol – niepsychoaktywny kannabinoid (CBD), Δ8-tetrahydrokannabinol (Δ8-THC), kannabidiwarin (CBDV), kannabinol (CBN), kwas kannabidionowy (CBDA), kwas kannabinolowy (CBNA), kannabigerol (CBG) i kannabichromen (CBC). Konopie – jako jedyne wykazują zdolność do wytwarzania tych unikatowych związków [6, 9-12] [Tabela 1]. 271 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska Tabela 1: Wzory strukturalne wybranych kannabinoidów Składnik czynny Wzór strukturalny Δ9 – tetrahydrokannabinol – Δ9THC Kannabidiol – CBD Δ8 – tetrahydrokannabinol – Δ8THC Kannabinol – CBN Kannabidiwarin – CBDV Kannabigerol – CBG Kannabichromen – CBC Źródło: Opracowanie własne 272 Medyczna marihuana Pozostałe składniki czynne konopi stanowią flawonoidy, terpeny, aminokwasy, białka, cukry, enzymy, kwasy tłuszczowe i estry, które wraz z kannabinoidami wykazują efekt chemicznej pracy zespołowej, tzw. synergizmu, dając tym samym lepsze rezultaty lecznicze [13]. 5. Receptory kannabinoidowe – lokalizacja i funkcje Odkrycie marihuany oraz zidentyfikowanie kannabinoidów spowodowało, iż badacze zaczęli poszukiwać celu molekularnego, na który mogłyby oddziaływać te związki. Tym samym udowodniono, iż w organizmie człowieka znajduje się endogenny układ kannabinoidowy (endogenous cannabinoid system, ECS) oraz receptory kannabinoidowe (CB), które zostały sklasyfikowane do dwóch grup. Receptory, należące do grupy CB1 znajdują się w różnych częściach ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a także na obwodzie (macica, jądra, nasieniowód, pęcherz moczowy, serce, płuca, grasica, trzustka, śledziona, tkanka tłuszczowa, układ pokarmowy, komórki układu immunologicznego, łożysko). Ekspresję tych receptorów odkryto również w oku, astrocytach, komórkach glejowych i w przednim płacie przysadki mózgowej [14-15]. Receptory CB2 znajdują się głównie w układzie immunologicznym (śledziona, migdałki, komórki układu odpornościowego – limfocyty T, komórki natural killers (NK), limfocyty B, monocyty, makrofagi, mastocyty oraz komórki mikrogleju) [16]. Receptory te należą do receptorów metabotropowych, sprzężonych z białkiem G [3, 17-19]; hamują one uwalnianie neurotransmiterów, cyklazę adenylanową, aktywują kanały potasowe, blokują zaś kanały wapniowe [16, 20]. Wiedza na temat biologicznej aktywności kannabinoidów została poszerzona w 1990 roku, kiedy po raz pierwszy zidentyfikowano i sklonowano receptor CB1 oraz 1993 roku – receptor CB2 [20-21]. Dotychczas odkryto 5 endogennych kannabinoidów. Pierwszym z nich jest anandamid (AEA) – pochodna kwasu arachidonowego, wykazujący większe powinowactwo do receptorów CB1 niż CB2. Jest to neuroprzekaźnik, który wydziela się podczas snu, a także relaksu. Następną endogenną substancję stanowi 2-arachidonologlicerol (2-AG), który ma niższe powinowactwo w stosunku do receptorów CB1 niż AEA, jest on pełnym agonistą. Endogennymi kannabinoidami są również eter noladyny (2-AGE) – eter arachidonylo-glicerolowy (agonista receptorów CB1 o małym powinowactwie, ale większej trwałości), N-arachidonoilodopamina (NADA) – agonista receptorów CB1, a także wirodhamina – ester kwasu arachidonowego z etanoloaminą, będąca antagonistą receptorów CB1 [3, 14-15, 23] [Tabela 2]. 273 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska Tabela 2: Wykaz powinowactwa endogennych kannabinoidów Powinowactwo do receptorów kannabinoidowych agonista receptorów CB1 > CB2 agonista receptora CB1 agonista receptora CB1 Nazwa endogennego kannabinoidu anandamid (AEA) 2-arachidonologlicerol (2-AG) eter noladyny – eter arachidonyloglicerolowy (2-AGE) N- arachidonoilodopamina (NADA) wirodhamina – ester kwasu arachidonowego z etanoloaminą agonista receptora CB1 antagonista receptora CB1 Źródło: Opracowanie własne 6. Preparaty farmaceutyczne Dotychczas na światowym rynku farmaceutycznym pojawiły się cztery preparaty, zawierające składniki czynne marihuany. Należą one do grupy nieselektywnych agonistów receptorów kannabinoidowych, dlatego też odpowiadają one za aktywację zarówno receptorów CB1, jak i CB2 [Tabela 3]. Tabela 3: Przegląd badań przedklinicznych i klinicznych, przeprowadzanych z użyciem najbardziej aktywnych kannabinoidów Skład/ Nazwa preparatu/ Nazwa handlowa/ Postać THC Nabilon Cesamet ® – kapsułki do podania doustnego Badania przedkliniczne/ Badania kliniczne Łagodzenie dystonii i dyskinez w modelach zwierzęcych PD [24]. Zwiększenie apetytu i poprawa zachowania u pacjentów z AD [25-26]. Brak efektu redukującego symptomy demencji [27]. Łagodzenie dyskinez i dystonii u pacjentów z PD [28-29]. Łagodzenie objawów przewlekłego bólu oraz bólu neuropatycznego przy spastyczności u pacjentów cierpiących na SM [30-31]. Zatwierdzony przez FDA jako lek na wymioty, nudności u pacjentów poddawanych chemioterapii, którzy nie odpowiadali na działanie tradycyjnych środków przeciwwymiotnych [6, 32-33]. 274 Medyczna marihuana THC Dronabinol Marinol ® – kapsułki do podania doustnego THC + CBD 1:1 Nabiximol Sativex ®- spray podawany na błony śluzowe, zawierający miareczkowany wyciąg z konopi indyjskich CBD Epidiolex ® – doustny płyn pochodzenia roślinnego, zawierający oczyszczony ekstrakt [49] Łagodzenie dystonii i dyskinez u pacjentów chorujących na SM [34]. Poprawa wagi i zachowania, zmienionego u pacjentów z AD [26]. Zmniejszenie nocnej aktywności ruchowej u dwóch pacjentów z demencją [35]. Zatwierdzony przez FDA jako lek na wymioty, nudności u pacjentów, poddawanych chemioterapii, którzy nie odpowiadali na działanie tradycyjnych środków przeciwwymiotnych oraz w zespole wyniszczenia u chorych na AIDS, a także w anoreksji [6, 32-33]. Łagodzenie zaburzeń związanych z używaniem heroiny w modelach zwierzęcych [36]. USA – 3 faza badań klinicznych nad zwalczaniem zaawansowanego bólu nowotworowego, neuropatycznego, związanego z SM [6, 37-40]. 2 faza badań klinicznych – środek przeciwwymiotny oraz nasilający działanie tradycyjnych środków przeciwwymiotnych u pacjentów, cierpiących na nowotwory [41]. Łagodzenia stanów spastycznych [42-44]. Łagodzenie zaburzeń związanych z używaniem morfiny w badaniach klinicznych [45]. Zarejestrowany w Europie, Kanadzie i Izraelu jako lek łagodzący dolegliwości bólowe – ból ośrodkowy, neuropatyczny (wywołany stanami spastycznymi), nowotworowy, nie poddający się leczeniu opioidami [33, 46-47]. Wielka Brytania, Hiszpania, Nowa Zelandia – dopuszczony do leczenia dolegliwości bólowych w SM [48]. W USA i Wielkiej Brytanii dopuszczony w umiarkowanej i ciężkiej spastyczności [4]. W Polsce dopuszczony od grudnia 2012 w łagodzeniu umiarkowanych i ciężkich spastyczności w SM [4]. Badania przeprowadzane przez GW Pharmaceuticals nad stosowaniem w zespole Dravet i Lennox-Gastaut’a [6, 33]. Redukcja średniej częstości występowania napadów padaczkowych w badaniach klinicznych u dzieci i młodych dorosłych [50-51]. Nasilenie działania leków przeciwpadaczkowych u większości pacjentów [52]. Badania nad zastosowaniem w leczeniu niedotlenienia noworodków i encefalopatii niedokrwiennej [49]. Poprawa objawów chorobowych u pacjentów cierpiących na PD [53]. 275 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska THC – oczyszczony ekstrakt Działanie neuroochronne w hodowlach ludzkich komórek [54]. Działanie neuroochronne w modelach zwierzęcych (szczury) [55]. Redukcja objawów bólowych, w tym bólów neuropatycznych w licznych modelach zwierzęcych [56-58]. Indukcja apoptozy, hamowanie wzrostu komórek nowotworowych, angiogenezy, proliferacji oraz przerzutów nowotworowych w hodowlach komórkowych i modelach zwierzęcych [59-62]. Zmniejszenie neurodegeneracji w warunkach in vivo [63]. Zwiększenie apetytu u zwierząt doświadczalnych [64]. Działanie przeciwdrgawkowe u gryzoni w teście z użyciem elektrowstrząsów (rozwój tolerancji na działanie przeciwdrgawkowe) [65-67]. Zmniejszenie drżenia i spastyczności w modelach zwierzęcych SM (myszy) [68]. Łagodzenie przewlekłych dolegliwości bólowych [69], bólów nowotworowych [70], bólów towarzyszących SM [71]. Nasilenie działania opioidów przy leczeniu nowotworów [72]. Pobudzenie apetytu, poprawa jakości snu, działanie relaksacyjne u pacjentów cierpiących na choroby nowotworowe [64]. Łagodzenie dolegliwości bólowych i częstości występowania skurczu (wraz z CBD) u pacjentów cierpiących na SM oraz duszności i lęku [73]. Zmniejszenie tempa proliferacji komórek glejaka wielopostaciowego [74-75]. Łagodzenie tików, objawów zespołu Tourette’a i zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych u ludzi [76-77]. CBD – oczyszczony ekstrakt Działanie przeciwnowotworowe w hodowlach komórkowych i modelach zwierzęcych [78-79]. Synergizm z THC w działaniu przeciwnowotworowym u zwierząt [80-81]. Synergizm z THC w działaniu przeciwdrgawkowym u zwierząt [82-83]. Działanie przeciwdrgawkowe w modelach zwierzęcych (gryzonie) [10, 84] oraz nasilenie działania leków przeciwpadaczkowych (fenytoina) [85]. Redukcja częstotliwości napadów padaczkowych (myszy i szczury) [86-87]. 276 Medyczna marihuana Palenie marihuany CBDV Podwyższenie progu drgawkowego (myszy) [88]. Działanie ochronne przed napadami padaczkowymi w hodowlach komórkowych oraz w badaniach z użyciem szczurów [89]. Redukcja procesów neurodegeneracyjnych w warunkach in vivo u zwierząt doświadczalnych [75, 90]. Działanie neuroochronne w badaniach na szczurach [55]. Opóźnienie pojawiania się objawów dystonii przez wysoką dawkę CBD (badania z użyciem chomików) [91]. Działanie przeciwdrgawkowe u dużej liczby pacjentów, w tym dzieci chorujących na padaczkę lekooporną (zmniejszenie częstotliwości napadów) oraz polepszenie nastroju i jakości snu [92-97]. Redukcja występowania objawów psychotycznych u pacjentów z PD [98]. Redukcja objawów psychotycznych i zaburzeń poznawczych, związanych z używaniem konopi [99]. Działanie przeciwbólowe w bólach neuropatycznych i nowotworowych u ludzi [71]. Łagodzenie objawów lęku [100] i stresu pourazowego u ludzi [101]. Sugerowane zastosowanie w leczeniu SM [102-108], schizofrenii i choroby afektywnej dwubiegunowej [109112], lęku społecznego [100, 113], anoreksji [114], choroby Huntingtona [115], bezsenności [116]. Brak badań klinicznych wykazujących działanie przeciwnowotworowe [78]. Działanie zwiększające apetyt, zmniejszające częstość występowania napadów padaczkowych, łagodzące objawy drżenia i spowolnienia ruchowego w licznych analizach badań epidemiologicznych [89, 117-125]. Działanie przeciwdrgawkowe w modelach zwierzęcych [126-129] i w warunkach in vitro [127]. Łagodzenie objawów bólowych, spastyczności u ludzi [130]. THC – Δ9–tetrahydokannabinol, CBD – kannabidiol, CBDV – kannabidiwarin, PD – choroba Parkinsona, AD – choroba Alzheimera, SM – stwardnienie rozsiane Źródło: Opracowanie własne Nabilon (Cesamet ®) oraz dronabinol (Marinol ®) występują w formie kapsułek podawanych doustnie, zaś w swoim składzie zawierają syntetyczny THC, który w każdym z nich otrzymywany jest na drodze odmiennej metody syntezy chemicznej. Obydwa preparaty zostały zatwierdzone przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) jako leki zwalczające nudności i wymioty towarzyszące chemio- 277 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska terapii u pacjentów, którzy nie odpowiadali na działanie tradycyjnych środków przeciwwymiotnych. Dronabinol stosowany jest w leczeniu anoreksji oraz zespole wyniszczenia u pacjentów, cierpiących na AIDS. Nabilon dostępny jest w USA, Kanadzie, Meksyku oraz Wielkiej Brytanii, zaś dronabinol w USA i Kanadzie [6, 32-33, 117, 131]. Kolejnym preparatem jest nabiximol (Sativex ®), który w swoim składzie zawiera miareczkowany wyciąg z wybranych odmian konopi, hodowanych w halach producenta. Do ekstrakcji używany jest dwutlenek węgla. W skład owego wyciągu wchodzą THC oraz CBD w stosunku 1:1, a także wiele innych składników roślinnych. Terapeutyk ten występuje w formie aerozolu, podawanego na błony śluzowe jamy ustnej. Dostępny jest w Kanadzie, Europie i Izraelu jako lek łagodzący dolegliwości bólowe, w tym bóle neuropatyczne, towarzyszące pacjentom chorującym na SM oraz bóle nowotworowe, wówczas gdy na przeciwbólowe działanie opioidów wytworzyła się tolerancja. W Wielkiej Brytanii, Nowej Zelandii i Hiszpanii dostępny jest w zwalczaniu dolegliwości bólowych, pojawiających się w przebiegu SM [48]. W USA, Wielkiej Brytanii i Polsce dopuszczony jest w leczeniu umiarkowanej i ciężkiej spastyczności [4, 33]. Preparatem, zawierającym płynny ekstrakt z CBD, który jeszcze nie pojawił się na rynku farmaceutycznym jest Epidiolex ®. Obecnie znajduje się on w III fazie badań klinicznych, przeprowadzanych przez GW Pharmaceuticals. Jego potencjalnym zastosowaniem ma być terapia padaczki [6, 49-51]. Preparatem działającym antagonistycznie na receptory CB1 jest rimonabant. Pojawił się na rynku farmaceutycznym w 25 krajach UE pod nazwą Acomplia ® w 2006 roku. Dzięki blokadzie receptorów CB1 znacznie znosi uczucie głodu, dlatego też wykorzystywany był w leczeniu otyłości. Po dwóch latach został wycofany z obrotu ze względu na liczne doniesienia o wywoływaniu zaburzeń lękowych i stanów depresyjnych, które nawet kończyły się próbami samobójczymi [72]. 7. Kontrowersje związane z medycznym użyciem przetworów konopi Używaniu marihuany oraz jej pochodnych towarzyszą liczne kontrowersje. W literaturze naukowej znajdujemy dwa zupełnie odmienne stanowiska dotyczące przetworów z konopi. Pierwsze z nich – zdecydowanie restrykcyjnie – opiera się na konsekwencjach wynikających ze stosowania tej rośliny jako narkotyku, drugie zaś wynika z szeregu jej właściwości leczniczych oraz prozdrowotnych. Obecnie zauważamy ogromną konkurencję między obydwoma wizerunkami, szczególnie podczas dyskusji dotyczących legalizacji tej rośliny [132]. Najważniejszym zarzutem dotyczącym stosowania marihuany jest możliwość wywołania uzależnienia. Wielu badaczy uważa, iż marihuana jest narkotykiem uzależniającym zarówno psychicznie, jak i fizycznie [132278 Medyczna marihuana 135]. Jednakże część naukowców uważa, iż ryzyko rozwoju uzależnienia jest niskie oraz dotyczy głównie osób predysponowanych, ze szczególną osobowością. Abstynencja natomiast powoduje nieznaczne objawy zespołu odstawienia, a konsekwencje nadmiernego stosowania marihuany są przemijające, dlatego też zerwanie z nałogiem jest stosunkowo bezbolesne [4]. Ponadto, marihuana istotnie zaburza funkcje mózgu, zwłaszcza u młodocianych użytkowników oraz podnosi ryzyko ujawnienia się psychoz (schizofrenii i zaburzeń psychotycznych), czyli spełnia rolę tzw. zapalnika (ang. trigger) indukującego istniejący już proces chorobowy, a także z całą pewnością pogarsza przebieg choroby [134]. Innym, psychologicznym następstwem długotrwałego i intensywnego stosowania marihuany, jest występowanie tzw. zespołu amotywacyjnego. Charakteryzuje się on m. in. zanikaniem chęci do wykonywania codzien-nych prostych, rutynowych czynności, pogłębiającą się pustką, nudą, apatią, spłyceniem doznań, spadkiem a nawet zanikiem zainteresowań, utratą ambicji, pogorszeniem się jakości wykonywanej pracy, czy mniejszą efektywnością w nauce [3]. Wiele źródeł donosi, iż marihuana może powodować bezpłodność, poprzez zaburzenia jajeczkowania u kobiet oraz zmniejszenie liczby plemników u mężczyzn, a także zwiększać ryzyko przedwczesnego porodu ze względu na łatwość przenikania bariery łożyskowej [6, 132, 135-137]. Z przeglądu danych literaturowych wynika również, że marihuana powoduje upośledzenie funkcji poznawczych. Badacze zauważyli, że po jej stosowaniu pojawiają się zaburzenia pamięci, głównie krótkotrwałej, a także problemy z koncentracją, selekcją oraz integracją informacji. Problemy te nasilają się wraz z wydłużaniem czasu stosowania marihuany, zwłaszcza u jej młodocianych użytkowników [132, 135]. Ponadto po długotrwałym używaniu preparatów, zawierających kannabinoidy zauważono znaczne zubożenie zasobów używanego słownictwa. Niektórzy badacze twierdzą, że zaburzenia w procesach kodowania, przechowywania i korzystania z informacji powodują utrzymujące się zaburzenia pamięci werbalnej. Dodatkowo udowodniono, że upośledzenie funkcji poznawczych jest silniejsze i trwalsze u użytkowników, znajdujących się w niższym przedziale wiekowym [132]. Badania przeprowadzane obecnie na całym świecie – zarówno w warunkach in vitro, na modelach zwierzęcych oraz u chorych wskazują na potencjalną rolę kannabinoidów w modyfikowaniu przebiegu wielu chorób [Tabela 3]. W porównaniu z innymi substancjami, kannabinoidy wyróżniają się dużym bezpieczeństwem stosowania, biorąc pod uwagę toksyczność ostrą tych związków. Do tej pory nie ma potwierdzonych doniesień naukowych, że używanie marihuany bez względu na ilość oraz siłę działania doprowadziło do śmiertelnego zatrucia [138]. Zgodnie z danymi American College of Phisicians skutki niepożądane leków na bazie konopi mieszczą się w zakresie efektów akceptowanych dla innych leków [139]. 279 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska Reasumując, czy marihuana naprawdę może mieć zastosowanie we współczesnej medycynie? Coraz częściej bada się środki syntetyczne, które są agonistami receptorów CB1 i CB2, ale również związki o działaniu antagonistycznym. Właściwości marihuany są zależne od postaci oraz dawki jaką spożywamy. Na ogół jest to uspokojenie, bądź też rozdrażnienie, euforia, działanie przeciwbólowe, pobudzające apetyt, przeciwwymiotne, rozkurczające mięśnie (miorelaksacja), indukujące sen, niszczące wolne rodniki, neuroprotekcyjne, immunosupresyjne, zmniejszające ciśnienie śródgałkowe, a także rozszerzające oskrzela. W wielu warunkach eksperymentalnych kannabinoidy wykazały właściwości korzystne podczas leczenia chorób takich jak nowotwory, czy AIDS. Ponadto ich działanie lecznicze może okazać się korzystne w leczeniu SM, PD oraz AD. Najnowsze doniesienia literaturowe wykazują, iż marihuanę można stosować w terapii padaczki, astmy, jaskry, miażdżycy, a także cukrzycy [132, 138, 140] [Rysunek 1]. Rysunek 1: Potencjalne wykorzystanie leczniczych właściwości marihuany w medycynie Źródło: Opracowanie własne 280 Medyczna marihuana 8. Nowotwory i AIDS Terapii nowotworowej u pacjentów poddawanych chemioterapii towarzyszą uciążliwe wymioty oraz nudności. Zatwierdzone przez FDA leki, zawierające syntetyczny THC okazują się efektywne w zwalczaniu tych dolegliwości, wówczas gdy tradycyjne środki, wykazujące działanie przeciwwymiotne są nieskuteczne [6, 32-33]. Najsilniejszym dowodem na poparcie stosowania konopi w medycynie jest używanie jej w bólach, przebiegających w terminalnym stadium choroby nowotworowej, zwłaszcza podczas wytworzenia się tolerancji na działanie przeciwbólowe opioidów. Właściwości przeciwbólowe konopi są związane głównie z zawartym w nich THC oraz CBD [6, 33, 37-40, 46-47]. Istnieją badania, opisujące skuteczność kannabinoidów w leczeniu glejaka wielopostaciowego, w przypadku gdy leczenie chirurgiczne i radioterapia okazały się nieskuteczne. Po wstrzyknięciu THC do guza mózgu, zauważono zahamowanie procesu wytwarzania naczyń krwionośnych, co w rezultacie spowodowało złagodzenie objawów guza [74]. Ponadto, w licznych modelach zwierzęcych, a także hodowlach komórkowych zauważono, iż THC indukuje apoptozę, hamuje wzrost komórek nowotworowych, angiogenezę, proliferację, a także zapobiega przerzutom nowotworów [59-61, 141]. CBD również wykazuje działanie przeciwnowotworowe w hodowlach komórkowych oraz w badaniach, przeprowadzonych z użyciem zwierząt [78-79]. Z przeglądu danych literaturowych wynika, iż składniki czynne marihuany mogą okazać się fenomenem w terapii m.in. gruczolaka płuc, nabłoniaka, chłoniaka, nerwiaka niedojrzałego, raka skóry, macicy, piersi, żołądka, jelita grubego, trzustki, czy też prostaty [79, 61]. Jednakże w dalszym ciągu potrzeba dużej ilości dobrze zaplanowanych badań, w tym badań klinicznych, aby potwierdzić korzyści wynikające z zastosowania marihuany w terapii nowotworów. U pacjentów chorujących na AIDS często występuje zespół wyniszczenia organizmu, związany z ograniczonym apetytem oraz utratą masy ciała, a także kłopoty z zasypianiem. Dzięki właściwościom relaksacyjnym, a także pobudzającym apetyt można zredukować do minimum niekorzystne objawy towarzyszące tej chorobie. U osób z zespołem wyniszczenia organizmu, którzy przyjmowali dronabinol, bądź palili marihuanę zauważono znaczną poprawę apetytu oraz przyrost masy ciała [117, 131]. Badania na zwierzętach wykazały również, iż THC oraz inne kannabinoidy działają pobudzająco na apetyt oraz zwiększają ilość spożywanej żywności. Naukowcy uważają, że właściwości te mogą wynikać z oddziaływania tych związków na receptory CB1, które obecne są w podwzgórzu oraz mezolimbicznym układzie nagrody, dlatego też mogą być zaangażowane w regulację kontroli spożywania pokarmu [72]. 281 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska 9. Stwardnienie rozsiane (sclerosis multiplex, SM) SM jest przewlekłą, zapalną, demielinizacyjną chorobą OUN. Chorzy na SM cierpią na całą gamę objawów, uniemożliwiających normalne funkcjonowanie. U pacjentów najczęściej występują bolesne kurcze mięśni, trudności z poruszaniem się oraz zaburzenia funkcji pęcherza moczowego. Uważa się, że podłożem SM są reakcje autoimmunologiczne, z towarzyszącym procesem zapalnym. W trakcie badań nad doświadczalnym modelem zwierzęcym SM, zaobserwowano zmniejszenie gęstości receptorów kannabinoidowych, stąd pogląd, że stosowanie preparatów z marihuany powinno zapobiegać deficytom w neurotransmisji w ECS [4]. Doświadczenia wykazują także, iż po doustnym podaniu THC dochodzi do nasilenia działania układu odpornościowego [138]. Wyniki przeprowadzonych doświadczeń z użyciem zwierząt donoszą, iż kannabinoidy (THC, CBD, CBDV) są w stanie kontrolować spastyczność [68], a THC hamuje reakcje zapalne [4]. Nabiximol w badaniach klinicznych łagodzi spastyczność, poprawia funkcje motoryczne, parametry neurologiczne i histologiczne [42, 142]. Stąd, w celu łagodzenia bólów związanych ze stanami spastycznymi dopuszczony jest do obrotu w Europie, Izraelu, Kanadzie, Wielkiej Brytanii, Hiszpanii i Nowej Zelandii [33, 46-48]. Kombinacja THC oraz CBD wydaje się być tak samo skuteczna jak inne leki, np. baklofen, stosowane w leczeniu spastyczności [73, 143]. Natomiast palenie marihuany wydaje się łagodzić spastyczność, jednak wyniki przeprowadzonych doświadczeń wskazują, że dochodzi wówczas do osłabienia równowagi i postawy ciała [144-145]. Nabiximol poprawia również funkcje kontroli pęcherza moczowego [40]. Niedostateczna ilość alternatywnych metod terapii SM oraz pozytywny profil działania kannabinoidów w zakresie tolerancji sugerują, iż terapeutyki, zawierające składniki czynne marihuany mogą stać się cenne w leczeniu tej choroby, a zwłaszcza w poprawieniu jakości codziennej egzystencji. Natomiast potencjalne zaburzenia poznawcze, czy związane z motoryką chorych powinny być uwzględnione w dłuższych, prospektywnych badaniach klinicznych [32]. 10. Choroba Parkinsona (Parkinson’s Disease, PD) PD jest powoli postępującą zwyrodnieniową chorobą OUN. Podczas rozwoju tego schorzenia zamierają komórki nerwowe znajdujące się w obszarze istoty czarnej (części zbitej), które są odpowiedzialne za produkcję neuroprzekaźnika – dopaminy. Dlatego też choroba ta prowadzi do niedoboru dopaminy w pewnych obszarach mózgu, tym samym prowadząc do zahamowania aktywności motorycznej w korze mózgowej. Do głównych objawów należą: sztywność mięśniowa, bradykinezja – spowolnienie i zubożenie ruchowe, tremor – drżenie spoczynkowe, 282 Medyczna marihuana zaburzenia postawy ciała, czy spowolniony przebieg procesów myślowych oraz zaburzenia psychiczne. Występują również zaburzenia wegetatywne takie jak ślinienie, pocenie, łzawienie, łojotok. Najistotniejszym lekiem stosowanym w leczeniu PD jest lewodopa, powodująca szereg działań niepożądanych, trudnych do leczenia [146]. Eksperymentalne modele zwierzęce PD pokazują zwiększoną aktywność ECS w zwojach podstawy mózgu, podwyższony poziom mRNA receptora CB1, zwiększoną aktywność receptorów CB1 oraz wzrost poziomu AEA, co może częściowo odpowiadać za powstawanie objawów choroby oraz dyskinez wywołanych lewodopą [147-148]. W badaniach przeprowadzonych z użyciem zwierząt kannabinoidy wykazały działanie neuroprotekcyjne w różnych modelach PD. Właściwości te związane są z oddziaływaniem na receptory kannabinoidowe oraz z niezależnymi od niego mechanizmami, w tym z efektami przeciwutleniającymi, a także z obniżeniem aktywności mikrogleju i modulacji interakcji glej – neuron [54, 63, 75, 149]. Z przeglądu danych literaturowych wynika, iż agoniści receptorów CB1 poprawiają zaburzenia motoryczne, poprzez oddziaływanie na receptor adenozynowy A2A, nie wykazując wpływu na mechanizmy dopaminergiczne [150-153]. Jednakże antagoniści CB1 wykazują lepsze rezultaty w poprawianiu funkcji motorycznych oraz łagodzą dyskinezy, wywołane lewodopą, co jest związane między innymi ze zwiększoną ilością uwalnianego glutaminianu z prążkowia [147, 154-155]. Wyniki badań obserwacyjnych sugerują, iż u większości pacjentów, przyjmujących kannabinoidy zauważono poprawę w zakresie objawów PD [98, 156-157]. Zaobserwowano zmniejszenie drżenia spoczynkowego, spowolnienia ruchowego oraz dyskinez, indukowanych lewodopą [98]. Ponadto wyniki innych badań wykazują, iż u pacjentów, którzy palili marihuanę doszło do zmniejszenia drżenia, spowolnienia ruchowego, sztywności i senności już po 30 minutach od zapalenia [157]. Inne badania z zastosowaniem nabilonu donoszą o redukowaniu występowania dyskinez, wywołanych lewodopą [28]. Jednakże wiele przeprowadzonych badań klinicznych z użyciem kannabinoidów nie przejawia pozytywnych efektów terapeutycznych, związanych z poprawą objawów ruchowych lub redukcją dyskinez, wywołanych lewodopą, często także wyniki badań są sprzeczne [28-29, 53, 158]. Mimo, że marihuana była rzadko używana przez pacjentów chorych na PD, a wyniki przeprowadzonych doświadczeń w dalszym ciągu są dość skąpe, a nawet sprzeczne, to jednak kannabinoidy wykazują potencjał w terapii tej choroby. Ponadto, pacjenci nie zgłaszali niekorzystnych objawów towarzyszących leczeniu z użyciem kannabinoidów. Dlatego też istnieją podstawy żeby twierdzić, iż terapia z użyciem medycznej marihuany podczas leczenia PD może być uzasadniona. Należy jednak czekać na pojawienie się doniesień o pozytywnych efektach leczenia. 283 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska 11. Choroba Alzheimera (Alzheimer’s Disease, AD) Czynnikiem decydującym o rozwoju AD są tzw. blaszki beta-amyloidowe oraz nasilona fosforylacja białka,,tau’’. Blaszki stanowią białko, które poprzez gromadzenie się w mózgu prowadzi do uszkodzenia tkanki mózgowej. Szybko narastającemu zespołowi otępiennemu towarzyszą zaburzenia emocjonalne i popędowe. Stwierdzono również zmniejszoną ilość receptorów CB1 oraz CB2. Odpowiadają one za neuroprotekcję, a także kontrolę procesów zapalnych [140]. Przeprowadzone badania wykazały właściwości neuroprotekcyjne związków zawartych w marihuanie. Niektóre kannabinoidy mogą chronić neurony przed szkodliwym działaniem beta-amyloidu poprzez nasilenie procesu neurogenezy oraz wzrost poziomu neurotrofin [159-160]. THC wykazuje właściwości hamujące aktywność acetylocholinoesterazy oraz ograniczające amyloidogenezę [161]. Tym samym dochodzi do poprawienia transmisji cholinergicznej, a także opóźnienia postępu choroby. THC poprawia również zaburzenia behawioralne i nocne krążenie. Działanie to utrzymuje się również w przerwach, występujących pomiędzy stosowaniem kannabinoidów [4]. Po zastosowaniu CBD w warunkach in vitro i in vivo z użyciem transgenicznych myszy, zauważono działanie neuroprotekcyjne, przeciwutleniające, przeciwzapalne, a także poprawę pamięci u chorych myszy [162]. Niektórzy naukowcy uważają, iż dronabinol i nabilon mogą przejawiać korzystne działanie terapeutyczne u pacjentów cierpiących na AD [25, 163]. Inni natomiast donoszą, iż dronabinol nie jest skuteczny w zmniejszaniu objawów demencji [27]. Lek ten powoduje przyrost masy ciała, natomiast zmniejsza zaburzenia zachowania [26] oraz nocną aktywność ruchową [35]. 12. Padaczka Padaczka należy do grupy przewlekłych zaburzeń neurologicznych. Charakteryzują ją napady, które polegają na nadmiernych, gwałtownych i samorzutnych wyładowaniach bioelektrycznych w komórkach nerwowych. Pomimo dostępności ponad 30 leków przeciwpadaczkowych, wciąż 1/3 pacjentów wykazuje oporność na leczenie [164]. Z przeglądu danych literaturowych wynika, iż zainteresowanie zastosowaniem marihuany w terapii padaczki wzrosło w 2013 roku, kiedy po użyciu preparatów wzbogaconych w CBD doszło do zmniejszenia częstości występowania napadów padaczkowych u dzieci, opornych na tradycyjne leczenie. Ponadto zauważono polepszenie nastroju oraz jakości snu [96]. Epidiolex ® (99% ekstrakt na bazie CBD) znajduje się w III fazie badań klinicznych, prowadzonych nad jego zastosowaniem w terapii padaczki, w tym zespole Dravet i Lennox-Gastaut’a [6, 10, 50], nasila on działanie leków przeciwpadaczkowych [52]. Wyniki badania trwającego pomiędzy 15 stycznia 2014, a 15 stycznia 2015 roku u 214 pacjentów, 284 Medyczna marihuana w tym 33 z zespołem Dravet, zaś 31 Lennox-Gastaut’a z użyciem CBD jako dodatku do tradycyjnych leków przeciwpadaczkowych donoszą, iż mediana spadku częstości występowania napadów wynosiła 36,5%. Dlatego też naukowcy uważają, iż CBD może zmniejszać częstotliwość występowania napadów padaczkowych, wykazując odpowiedni profil bezpieczeństwa u dzieci i młodych dorosłych, cierpiących na wysoce oporną na leczenie padaczkę [50]. Niektórzy badacze natomiast donoszą, iż nie ma żadnych wiarygodnych danych dotyczących stosowania marihuany w terapii padaczki [97]. W badaniach przeprowadzonych z użyciem gryzoni, CBD wykazuje działanie przeciwdrgawkowe [84, 127] oraz nasila działanie tradycyjnych leków przeciwpadaczkowych [85]. Mianowicie: redukuje częstotliwość występowania napadów padaczkowych [86-87] oraz podwyższa próg drgawkowy [88]. Ponadto wielu naukowców uważa, że CBD w połączeniu z THC wykazuje efekt synergizmu w zwalczaniu napadów padaczkowych [82-83]. W licznych modelach zwierzęcych działanie przeciwdrgawkowe wykazuje również THC [66, 82, 165] oraz CBDV [126-129]. Mimo iż wyniki badań doświadczalnych, przeprowadzonych na zwierzętach dostarczają nam nowych obiecujących możliwości leczenia padaczki lekoopornej, to niestety badania kliniczne dość często dają sprzeczne rezultaty. Przeciwdrgawkowy mechanizm CBD nadal pozostaje niejasny. CBD wykazuje niską aktywność w stosunku do receptorów CB1 oraz CB2, dlatego też uważa się, iż efekt przeciwpadaczkowy nie jest związany z ECS. Przeprowadzanie rygorystycznej oceny produktów z CBD jest konieczne do ustalenia skuteczności oraz profilu bezpieczeństwa ich stosowania w leczeniu padaczki [166]. 13. Astma Astma jest przewlekłą, zapalną chorobą dróg oddechowych. W czasie ataku dochodzi do skurczu dróg oddechowych, zwiększonej ilości śluzu oraz powstawania w nich stanu zapalnego, wynikiem czego jest utrudnione wydychanie powietrza z płuc. Badania, przeprowadzone z użyciem zwierząt wykazały, iż po podaniu CBD doszło do zmniejszenia całkowitego oporu i poprawy czynności płuc oraz działania przeciwzapalnego [167]. Jedno z badań polegało na uczulaniu szczurów szczepu Wistar duża liczbą antygenów. Podczas leczenia zwierząt przy pomocy CBD zauważono zmniejszony poziom cytokin, zaangażowanych w odpowiedź odpornościową na alergen, tj. interleukiny 4 i 5 (IL-4, IL-5), które są niezbędne w rozwoju reakcji zapalnej. CBD obniża również poziom IL-13, która uważana jest za podstawowy czynnik stymulujący wydzielanie nadmiernej ilości śluzu, 285 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska a także IL-6, której ilości są zwiększone w plwocinie i krążeniu ustrojowym u pacjentów chorujących na astmę [168]. Po dootrzewnowym podaniu THC lub CBN doszło do obniżenia poziomu IgE, IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, ekspresji mRNA oraz zmniejszenia wydzielania śluzu. Możliwe jest również, iż THC wpływa na inne komórki, takie jak limfocyty B oraz komórki dendrytyczne [169]. U ludzi zaobserwowano natomiast działanie bronchodilatacyjne marihuany oraz zwiększenie przelotowości dróg oddechowych podczas wdychania lub stosowania doustnie jej składników czynnych. Ponadto wykazano, iż THC stosowany w aerozolu jest równie skuteczny jak agonista receptora beta-adrenergicznego – salbutamol [4]. 14. Jaskra Jaskra jest chorobą prowadzącą do postępującego i nieodwracalnego uszkodzenia nerwu wzrokowego, co powoduje zwężenie pola widzenia lub całkowitą utratę wzroku. Decydującym czynnikiem prowadzącym do rozwoju tego schorzenia jest wzrost ciśnienia wewnątrz gałki ocznej (intraocular pressure, IOP). W wyniku tego dochodzi do utrudnienia krążenia siatkówkowego, niedotlenienia i degeneracji neuronów siatkówki. Na zachorowanie na tę chorobę narażone są głównie osoby starsze, dotyczy ona również dzieci, czy nawet niemowląt [170]. Wiele kannabinoidów powoduje obniżenie IOP, poprzez oddziaływanie na receptory kannabinoidowe, znajdujące się w ciele rzęskowym oraz osłabienie produkcji cieczy wodnistej [171-172]. Dlatego też są one uznawane jako potencjalne związki mogące mieć zastosowanie w terapii jaskry. Marihuana może być podawana doustnie, dożylnie, lub może być palona [173-174]. Stosowanie preparatów w postaci kropli do oczu nie jest optymalne, dlatego że powodują one wiele działań niepożądanych. Podawanie preparatów z konopi w postaci oleju do oczu powoduje podrażnienie oraz stymulację łez, tym samym utrudnienie wchłaniania poprzez wypłukiwanie płynu z oka [175-176]. Alternatywę może stanowić palenie marihuany przynajmniej w 6-8 dawkach dziennie, gdyż czas utrzymywania się obniżonego IOP to 3-4 godziny; efekt euforyczny trwa zdecydowanie krócej [177]. Obecnie nie ma konkretnych danych na temat uzależnienia oraz objawów odstawienia u pacjentów stosujących marihuanę w terapii jaskry. Jednakże ze względu na występowanie licznych niekorzystnych efektów, chorym zaleca się rozważanie alternatywnych metod leczenia, które oferują więcej korzyści terapeutycznych, zaś mniej działań niepożądanych [170]. 286 Medyczna marihuana 15. Miażdżyca Miażdżyca jest przewleką chorobą zapalną, która jest najczęstszą przyczyną chorób serca i udaru [178]. Ze względu na rosnące ryzyko występowania chorób sercowo-naczyniowych wielu naukowców prowadzi liczne badania, starając się tym samym zrozumieć molekularne mechanizmy, leżące u podstaw miażdżycy. Coraz więcej danych literaturowych wskazuje na ścisły związek pomiędzy otyłością/zespołem metabolicznym, a miażdżycą. Odkrycie, iż ECS ma wpływ na regulację pobierania pokarmu, sugerować może również jego udział w patogenezie miażdżycy. Blokowanie receptorów CB1 wpływa na zmniejszenie masy ciała, a także wykazuje efekty kardiometaboliczne. Natomiast aktywacja receptorów CB2 po doustnym podaniu THC hamuje progresję blaszek miażdżycowych w mysim modelu miażdżycy. Ponadto AEA blokuje ekspresję zapalnego genu w komórkach śródbłonka, a tym samym adhezję monocytów [179]. Komórki limfoidalne, które wyizolowano z organizmu gryzoni (po podaniu THC) wykazywały zmniejszoną zdolność proliferacji oraz obniżone wydzielanie interferonu- . Chemotaksja makrofagów, która jest kluczowym elementem w rozwoju miażdżycy również była hamowana przez THC w warunkach in vitro. Dlatego też naukowcy uważają, iż THC oraz kannabinoidy wykazujące aktywność względem receptora CB2 mogą okazać się cennym elementem leczenia miażdżycy [178, 180]. Jednakże dokładna rola ECS w przebiegu tej choroby nie jest jeszcze dokładnie poznana [179]. 16. Cukrzyca Z przeglądu danych literaturowych wynika, iż w przebiegu cukrzycy wzrasta poziom AEA i 2-AG oraz, że CBD łagodzi szereg objawów związanych z tą chorobą, między innymi poprzez poprawienie wazorelaksacji śródbłonka naczyń oraz działanie przeciwzapalne [181]. Ponadto po podaniu THC w mysim modelu cukrzycy zaobserwowano zmniejszenie hiperglikemii oraz znaczny spadek utraty insuliny, produkowanej przez trzustkę. Leczenie szczurów za pomocą CBD wykazało istotne zabezpieczanie przed rozwojem retinopatii cukrzycowej oraz łagodziło ból neuropatyczny, związany z cukrzycą [169]. Stres oksydacyjny i procesy zapalne odgrywają kluczową rolę w rozwoju cukrzycy i jej powikłań. Ostatnie badania dostarczyły przekonujących dowodów, iż ECS może znacząco wpływać na produkcję reaktywnych form tlenu, zapalenie i późniejsze uszkodzenie tkanek [182]. Wyniki przeprowadzonych doświadczeń donoszą, iż THC łagodzi odpowiedź autominnunologiczną: zmniejsza liczbę komórek limfocytarnych, zmniejsza poziom ekspresji interferonu- , IL-12 oraz czynnika martwicy nowotworowej (TNF-α). Dodatkowo 287 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska zmniejsza poziom glukozy we krwi. Mimo, iż THC wykazuje doskonałe zdolności do działania immunosupresyjnego, to jego psychoaktywne właściwości ograniczają możliwość stosowania go do celów terapeutycznych. CBD w mysich modelach również zmniejsza stężenie cytokin prozapalnych (interferon- , TNF-α), co prowadzi do złagodzenia objawów choroby. Jednakże mimo, iż ECS wydaje się odgrywać ważną rolę w rozwoju i kontroli przebiegu cukrzycy, dokładne mechanizmy oraz cele komórkowe nie są w pełni poznane. Kannabinoidy pochodzenia roślinnego, które nie wywołują efektów psychoaktywnych mogą stanowić nową, obiecującą drogę w terapii cukrzycy autoimmunologicznej oraz chronić komórki β-wysp trzustki przed oksydacyjnym uszkodzeniem [182]. 17. Przeciwwskazania do stosowania Preparatów z konopi nie można stosować u dzieci poniżej 18 roku życia, kobiet w wieku rozrodczym, które nie przyjmują środków antykoncepcyjnych, bądź zamierzają zajść w ciążę, a także u kobiet w ciąży lub karmiących oraz u mężczyzn pragnących założyć rodzinę. Nie powinni ich zażywać pacjenci z chorobami wątroby, nerek, układu krążenia (np. z chorobą niedokrwienną serca, zaburzeniami rytmu serca, nadciśnieniem tętniczym, niewydolnością serca). Terapeutyki te ponadto są przeciwwskazane u pacjentów uczulonych na kannabinoidy lub chorujących na schizofrenię, bądź też inne zaburzenia psychiczne [183]. 18. Podsumowanie Biorąc pod uwagę wyniki przytoczonych badań należy stwierdzić, że medyczna marihuana posiada ogromny potencjał leczniczy. Część korzystnych działań jest już wykorzystywana w lecznictwie. Na runku pojawiły się cztery preparaty farmaceutyczne zawierające składniki czynne marihuany. Dwa z nich – nabilon i dronbinol – są ztwierdzone przez FDA i zarejestrowane do zwalczania nudności i wymiotów u pacjentów, poddawanych chemioterapii, którzy nie odpowiadali na działanie tradycyjnych środków przeciwwymiotnych, w zespole wyniszczenia u chorych na AIDS, a także w anoreksji. Trzeci – nabiximol – zarejestrowano w kilku krajach, jako lek łagodzący dolegliwości bólowe, jest również w trakcie badań klinicznych, gdzie testowany jest jako środek przeciwwymiotny oraz nasilający działanie tradycyjnych środków przeciwwymiotnych. Zaawansowane są także badania kliniczne dotyczące przeciwdrgawkowego działania Epidiolexu®, zawierającego ekstrakt z CBD. Jednakże liczne badania przedkliniczne jak i kliniczne implikują zastosowanie preparatów medycznej marihuany w terapii wielu innych chorób, takich jak AD, PD, SM, padaczka, astma, jaskra, miażdżyca czy cukrzyca. Brakuje natomiast wystarczających dowodów, które uzasadniałyby użycie medycznej 288 Medyczna marihuana marihuany w leczeniu tych schorzeń. Potrzebna jest znaczna ilość rygorystycznych, dobrze zaplanowanych doświadczeń, aby ostatecznie ustalić wskazania do stosowania preparatów z konopi w medycynie. Priorytetem podczas przeprowadzania badań jest nie tylko zebranie dowodów na temat leczniczego działania marihuany, ale również porównanie bezpieczeństwa, tolerancji oraz możliwości wystąpienia działań niepożądanych. Rzeczą niezwykle ważną w przeprowadzanych doświadczeniach jest również porównanie działania marihuany z innymi środkami farmakologicznymi dostępnymi na rynku farmaceutycznym oraz oszacowanie przeciwwskazań do stosowania, co jest niezbędne dla każdego preparatu leczniczego. Literatura 1. Zuardi A. W. History of cannabis as a medicine: a review, Revista Brasileira de Psiquiatria, 2 (2006), s. 153-157 2. Di Marzo V. A brief history of cannabinoid and endocannabinoid pharmacology as inspired by the work of British scientists, Trends in Pharmacological Sciences, 3 (2006), s. 134-140 3. Rutkowska M., Jamontt J. Rola układu kannabinoidowego w fizjologii i patofizjologii ośrodkowego układu nerwowego, Advances in Clinical and Experimental Medicine, 14, 6, (2005), s. 1243-1252 4. Vetulani J. Lecznicze zastosowania marihuany, Wszechświat, t. 115, 1-3 (2014), s. 15-24 5. Russo E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet, Chemistry & Biodiversity, 8 (2007), s. 1614-1648 6. Fife T. D., Moawad H., Moschonas C., Shepard K., Hammond N. Clinical perspectives on medical marijuana (cannabis) for neurologic disorders, Neurology Clinical Practice, 5 (2015), s. 344-351 7. Kowalczuk A., Łozak A., Fijałek Z. E. Aktywność biologiczna surowców roślinnych objętych Ustawą o przeciwdziałaniu narkomanii, Przegląd Medyczny Uniwersytetu Rzeszowskiego i Narodowego Instytutu Leków w Warszawie Rzeszów, 3 (2012), s. 318-333 8. Szukalski B. Kannabis – biochemia, farmakologia i toksykologia, Alkoholizm i narkomania, (1997), s. 123-145 9. Mechoulam R., Hanus L. O., Pertwee R., Howlett A. C. Early phytocannabinoid chemistry to endocannabinoids and beyond, Nature Reviews Neuroscience, 15 (2014), s. 757-764 10. Devinsky O., Cilio M. R., Cross H., Fernandez-Ruiz J., French J., Hill C., Katz R., Di Marzo V., Jutras-Aswad D., Notcutt W. G., Martinez-Orgado J., Robson P. J., Rohrback B. G., Thiele E., Whalley B., Friedman D. Cannabidiol: pharmacology and potential therapeutic role in epilepsy and other neuropsychiatric disorders, Epilepsia, 6 (2014), s. 791-802 11. Borgelt L. M., Franson K. L., Nussbaum A. M., Wang G. S. The Pharmacologic and Clinical Effects of Medical Cannabis, Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, 33.2 (2013), s. 195-209 12. ElSohly M. A., Slade D. Chemical constituents of marijuana: The complex mixture of natural cannabinoids, Life Sciences, 78 (2005), s. 539-548 289 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska 13. McPartland, J. M., Russo E. B. Non-phytocannabinoid constituents of cannabis and herbal synergy, Oxford University Press, (2014), s. 280-295 14. Lovinger D. M. Presynaptic modulation by endocannabinoids, Handbook of Experimental Pharmacology, 184 (2008), s. 435-477 15. Vogel Z., Barg J., Levy R., Saya D., Heldman E., Mechoulam R. Anandamide, a brain endogenous compound, interacts specifically with cannabinoid receptors and inhibits adenylate cyclase, Journal of Neurochemistry, 61 (1993), s. 352-355 16. Pertwee R. G. The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands: an overview, International Journal of Obesity, 30 (2006), s. 13-18 17. Biała G. Działania kannabinoidów w zwierzęcych modelach uzależnień, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 62 (2008), s. 258-262 18. Mackie K. Signaling via CNS cannabinoid receptors, Molecular and Cellular Endocrinology, 286 (2008), s. 60-65 19. Pertwee R. G. The diverse CB1 and CB2 receptor pharmacology of three plant cannabinoids: delta9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and delta9tetrahydrocannabivari, British Journal of Pharmacology, 153 (2008), s. 199-215 20. Caballero A., Tseng K. Y. Association of Cannabis Use during Adolescence, Prefrontal CB1 Receptor Signaling, and Schizophrenia, Frontiers in Pharmacology, 3 (2012), 101 21. Matsuda L. A., Lolait S. J., Brownstein M. J., Young A. C., Bonner T. I. Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA, Nature, 346 (1990), s. 561-564 22. Munro S., Thomas K. L., Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids, Nature, 365 (1993), s. 61-65 23. Motyka M., Marcinkowski J. T. Używanie pochodnych konopi. Część II. Zastosowanie w medycynie vs. Konsekwencje zdrowotne, Problemy Higieny i Epidemiologii, 95 (2014), s. 21-27 24. Fox S. H., Kellett M., Moore A. P., Crossman A. R., Brotchie J. M. Randomised, double-blind, placebo-controlled trial to assess the potential of cannabinoid receptor stimulation in the treatment of dystonia, Movement Disorders, 17 (2002), s. 145-149 25. Gowran A., Noonan J., Campbell V. A. The multiplicity of action of cannabinoids: implications for treating neurodegeneration, CNS Neuroscience and Therapeutics, 17 (2011), s. 637-644 26. Volicer L., Stelly M., Morris J., McLaughlin J., Volicer B. J. Effects of dronabinol on anorexia and disturbed behavior in patients with Alzheimer's disease, International Journal of Geriatric Psychiatry, 12 (1997), s. 913-919 27. Krishnan S., Cairns R., Howard R. Cannabinoids for the treatment of dementia, Cochrane Database Systematic Reviews, 2 (2009) 28. Sieradzan K. A., Fox S. H., Hill M., Dick J. P., Crossman A. R., Brotchie J. M. Cannabinoids reduce levodopa-induced dyskinesia in Parkinson‟s disease: a pilot study, Neurology, 57 (2001), s. 2108-2111 29. Carroll C. B., Bain P. G., Teare L., Liu X., Joint C., Wroath C., Parkin S. G., Fox P., Wright D., Hobart J., Zajicek J. P. Cannabis for dyskinesia in Parkinson disease: a randomized double-blind crossover study, Neurology, 63 (2004), s. 1245-1250 290 Medyczna marihuana 30. Berlach D. M., Shir Y., Ware M. A. Experience with the synthetic cannabinoid in chronic noncancer pain. Pain Medicine, 7 (2006), s. 25-29 31. Wissel J., Haydn T., Muller J., Brenneis C., Berger T., Poewe W., Schelosky L. D. Low dose treatment with the synthetic cannabinoid nabilone significantly reduces spasticity-related pain. A double-blind placebocontrolled cross-over trial, Journal of Neurology, 20 (2006), s. 2218-2220 32. Chohan H., Greenfield L., Yadav V., Graves J. Use of Cannabinoids for Spasticity and Pain Management in MS, Current Treatment Options in Neurology, 18 (2016), 1 33. Detyniecki K., Hirsch L. Marijuana Use in Epilepsy: The Myth and the Reality, Current Neurology Neuroscience Reports, 15 (2015), 65 34. Deutsch S. I., Rosse R. B., Connor J. M., Burket J. A., Murphy M. E., Fox F. J. Current status of cannabis treatment of multiple sclerosis with an illustrative case presentation of a patient with MS, complex vocal tics, paroxysmal dystonia, and marijuana dependence treated with dronabinol, CNS Spectrums, 13(2008), s. 393-403 35. Walther S., Schüpbach B., Seifritz E., Homan P., Strik W. Randomized, controlled crossover trial of dronabinol, 2.5 mg, for agitation in 2 patients with dementi, Journal of Clinical Psychopharmacology, 31 (2011), s. 256-258 36. Ren Y., Whittard J., Higuera-Matas A., Morris C. V., Hurd Y. L. Cannabidiol, a nonpsychotropic component of cannabis, inhibits cue-induced heroin seeking and normalizes discrete mesolimbic neuronal disturbances, Journal of Neuroscience, 29 (2009), s. 14764-14769 37. Russo E. B. Cannabinoids in the management of difficult to treat pain, Therapeutics and Clinical Risk Management, 4 (2008), s. 245-259 38. Lynch M. E., Cesar-Rittenberg P., Hohmann A. G. A double-blind, placebocontrolled, cross-over pilot with extension using an oral mucosal cannabinoid-extract for treatment of chemotherapyinduced neuropathic pain, Journal of Pain and Symptom Management, 47 (2014), s. 166-173 39. Collin C., Davies P., Mutiboko I. K., Ratcliffe S. Randomized controlled trial of cannabis-based medicine in spasticity caused by multiple sclerosis, European Jorunal of Neurology, 14 (2007), s. 290-296 40. Koppel B. S., Brust J. C., Fife T., Bronstein J., Youssof S., Gronseth G., Gloss D. Systematic review: efficacy and safety of medical marijuana in selected neurologic disorders: report of the guideline development subcommittee of the American academy of neurology, Neurology, 82 (2014), s. 1556-1563 41. Duran M., Pérez E., Abanades S., Vidal X., Saura C., Majem M., Arriola E., Rabanal M., Pastor A., Farré M., Rams N., Laporte J. R., Capellà D. Preliminary efficacy and safety of an oromucosal standardized cannabis extract in chemotherapy induced nausea and vomiting, British Journal of Clinical Pharmacology, 70 (2010), s. 656-663 42. Russo M., Calabro R. S., Naro A., Sessa E., Rifici C., D'Aleo G., Leo A., De Luca R., Quartarone A., Bramanti P., Sativex in the management of multiple sclerosisrelated spasticity: role of the corticospinal modulation, Neural Plasticity, (2015) 43. Di Marzo V., Centonze D. Placebo effects in a multiple sclerosis spasticity enriched clinical trial with the oromucosal cannabinoid spray (THC/CBD): 291 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. dimension and possible causes, CNS Neuroscience Therapeutics, 21 (2015), s. 215-221 Flachenecker P., Henze T., Zettl U. K. Nabiximols (THC/CBD oromucosal spray, Sativex®) in clinical practice – results of a multicenter, noninterventional study (MOVE 2) in patients with multiple sclerosis spasticity, European Neurology, 71 (2014), s. 271-279 Katsidoni V., Anagnostou I., Panagis G. Cannabidiol inhibits the rewardfacilitating effect of morphine: involvement of 5-HT1A receptors in the dorsal raphe nucleus, Addiction Biology, 18 (2013), s. 286-296 Ablin J., Ste-Marie P. A., Schäfer M., Häuser W., Fitzcharles M. A. Medical use of cannabis products, Der Schmerz, 30 (2016), s. 3-13 Iskedjian M., Bereza B., Gordon A., Piwko C., Einarson T. R. Meta-analysis of cannabis based treatments for neuropathic and multiple sclerosis-related pain, Current Medical Research Opinion, 23 (2007), s. 17-24 Strouse T. B. Cannabinoids in Medical Practice, Alternative and complementary therapies, 2 (2016), s. 1-5 Volkow N. D. The Biology and Potential Therapeutic Effects of Cannabidiol, National Institute of Drug Abuse, (2015) Devinsky O., Marsh E., Friedman D., Thiele E., Laux L., Sullivan J., Miller I., Flamini R., Wilfong A., Filloux F., Wong M., Tilton N., Bruno P., Bluvstein J., Hedlund J., Kamens R., Maclean J., Nangia S., Singhal N. S., A Wilson C., Patel A., Cilio M. R. Cannabidiol in patients with treatment-resistant epilepsy: an open-label interventional trial, Lancet Neurology, 15 (2016), s. 270-278 Oldham M., Sullivan J., Singhal N., Tilton N., Cilio M. Long-term efficacy and tolerability of add-on cannabidiol for drug-resistant pediatric epilepsies, American Epilepsy Society Annual Meeting, 2 (2015), 296 Geffrey A. L., Pollack S. F., Bruno P. L., Thiele E. A. Drug-drug interaction between clobazam and cannabidiol in children with refractory epilepsy, Epilepsia, 56 (2015), s. 1246-1251 Chagas M. H. M., Zuardi A., Tumas V., Pena-Pereira M. A., Silvia Tavares Sobreira E., Bergamaschi M. M., Santos A. C., Teixeira A. L., Hallak J. E., Crippa J. A. Effects of cannabidiol in the treatment of patients with Parkinson's disease: an exploratory double-blind trial, Journal of Psychopharmacology, 28 (2014), s. 1088-1098 Carroll C. B., Zeissler M. L., Hanemann C. O., Zajicek J. P. Delta(9)tetrahydrocannabinol (Delta(9)-THC) exerts a direct neuroprotective effect in a human cell culture model of Parkinson‟s disease, Neuropathology and Applied Neurobiology, 38 (2012), s. 535-547 Garcia C., Palomo-Garo C., Garcia-Arencibia M., Ramos J., Pertwee R., Fernández-Ruiz J. Symptomrelieving and neuroprotective effects of the phytocannabinoid 9- THCV in animal models of Parkinson‟s disease, British Journal of Pharmacology, 163 (2011), s. 1495-1506 Burston J. J., Woodhams S. G. Endocannabinoid system and pain: an introduction, Proceedings of Nutrition Society, 73 (2014), s. 106-117 Rea K., Roche M., Finn D. P. Supraspinal modulation of pain by cannabinoids: the role of GABA and gluta mate, British Journal of Pharmacology, 152 (2007), s. 633-648 292 Medyczna marihuana 58. Sagar D. R., Burston J. J., Woodhams S. G., Chapman V. Dynamic changes to the endocannabinoid system in models of chronic pain, Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 367 (2012), s. 3300-3311 59. Guzman M. Cannabinoids: potential anticancer agents, Nature Reviews Cancer, 3 (2003), s. 745-755 60. Velasco G., Sanchez C., Guzman M. Towards the use of cannabinoids as antitumour agents, Nature Reviews Cancer, 12 (2012), s. 436-444 61. Bowles D. W., O’Bryant C. L., Camidge R., Jimeno A. The intersection between cannabis and cancer in the United States, Critical Reviews in Oncology/ Hematology, 83 (2012), s. 1-10 62. Galve-Roperh I., Sanchez C., Cortes M. L., Gomez del Pulgar T., Izquierdo M., Guzman M. Anti-tumoral action of cannabinoids: involvement of sustained ceramide accumulation and extracellular signal-regulated kinase activation, Nature Medicine, 6 (2000), s. 313-319 63. Lastres-Becker I., Molina-Holgado F., Ramos J. A., Mechoulam R., Fernandez-Ruiz J. Cannabinoids provide neuroprotection against 6hydroxydopamine toxicity in vivo and in vitro: relevance to Parkinson‟s disease, Neurobiology of Disease, 19 (2005), s. 96-107 64. Brisbois T. D., de Kock I. H., Watanabe S. M., Mirhosseini M., Lamoureux D. C., Chasen M., MacDonald N., Baracos V. E., Wismer W. V., Delta-9tetrahydrocannabinol may palliate altered chemosensory perception in cancer patients: results of a randomized, double-blind, placebo-controlled pilot trial, Annals of Oncology, 22 (2011), s. 2086-2093 65. Chesher G. B., Jackson D. M. Anticonvulsant effects of cannabinoids in mice: drug interactions within cannabinoids and cannabinoid interactions with phenytoin, Psychopharmacologia, 37 (1974), s. 255-264 66. Ten Ham M., Loskota W. J., Lomax P. Acute and chronic effects of D9tetrahydrocannabinol on seizures in the gerbil, European Journal of Pharmacology, 31 (1975), s. 148-152 67. Wallace M. J., Martin B. R., DeLorenzo R. J. Evidence for a physiological role of endocannabinoids in the modulation of seizure threshold and severity, European Journal of Pharmacology, 452 (2002), s. 295-301 68. Baker D., Pryce G., Croxford J. L., Brown P., Pertwee R. G., Huffman J. W., Layward L. Cannabinoids control spasticity and tremor in a multiple sclerosis model, Nature, 404 (2000), s. 84-87 69. Martín-Sánchez E., Furukawa T. A., Taylor J., Martin J. L. Systematic review and meta-analysis of cannabis treatment for chronic pain, Pain Medicine, 10 (2009), s. 1353-1368 70. Noyes R., Brunk S., Avery D., Canter A. The analgesic properties of delta-9 tertrahydrocannabinol and codeine, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 18 (1975)., s. 84-89 71. Rog D. J., Nurmikko T. J., Fride T., Young C. A. Randomized, controlled trial of cannabis-based medicine in central pain in multiple sclerosis, Neurology, 65 (2005), s. 812-819 72. Abrams D. I., Guzman M. Cannabis in Cancer Care, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 97 (2015), s. 575-586 293 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska 73. Zajicek J. P., Sanders H. P., Wright D. E., Vickery P. J., Ingram W. M., Reilly S. M., Nunn A. J., Teare L. J., Fox P. J., Thompson A. J. Cannabinoids in multiple sclerosis (CAMS) study: safety and efficacy data for 12 months follow up, Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 76 (2005), s. 1664-1669 74. Guzman M., Duarte M. J., Blazquez C., Ravina J., Rosa M. C., Galve-Roperh I., Sánchez C., Velasco G., González-Feria L. A pilot clinical study of Δ9tetrahydrocannabinol in patients with recurrent glioblastoma multiforme, British Journal of Cancer, 95 (2006), s. 197-203 75. Price D., Martinez A., Seillier A., Koek W., Acosta Y., Fernandez E., Strong R., Lutz B., Marsicano G., Roberts J. L., Giuffrida A. WIN55,212-2, a cannabinoid receptor agonist, protects against nigrostriatal cell loss in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson‟s disease, European Journal of Neuroscience, 29 (2009), s. 2177-2186 76. Müller-Vahl K. R., Schneider U., Koblenz A., Jöbges M., Kolbe H., Daldrup T., Emrich H. M.. Treatment of Tourette‟s syndrome with Δ9Tetrahydrocannabinol (THC): a randomized crossover trial. Pharmacopsychiatry, 35 (2002), s. 57-61 77. Müller-Vahl K. R., Schneider U., Prevedel H., Theloe K., Kolbe H., Daldrup T., Emrich H. M. Delta 9-tetrahydrocannabinol (THC) is effective in the treatment of tics in Tourette syndrome: a 6-week randomized trial, Journal of Clinical Psychiatry, 64 (2003), s. 459-465 78. McAllister S. D., Soroceanu L., Desprez P. Y. The Antitumor Activity of PlantDerived Non-Psychoactive Cannabinoids, Journal of Neuroimmune Pharmacology, 10 (2015), s. 255-267 79. Massi P., Solinas M., Cinquina V., Parolaro D. Cannabidiol as potential anticancer drug, British Journal of Clinical Pharmacology, 75 (2013), s. 303-312 80. Torres S, Lorente M., Rodríguez-Fornés F., Hernández-Tiedra S., Salazar M., García-Taboada E., Barcia J., Guzmán M., Velasco G. A combined preclinical therapy of cannabinoids and temozolomide against glioza, Molecular Cancer Therapeutics, 10 (2011), s. 90-103 81. Marcu J. P., Christian R. T., Lau D., Zielinski A. J., Horowitz M. P., Lee J., Pakdel A., Allison J., Limbad C., Moore D. H., Yount G. L., Desprez P. Y., McAllister S. D. Cannabidiol enhances the inhibitory effects of delta9tetrahydrocannabinol on human glioblastoma cell proliferation and survival, Molecular Cancer Therapeutics, 9 (2010), s. 180-189 82. Wallace M. J., Wiley J. L., Martin B. R., DeLorenzo R. J. Assessment of the role of CB1 receptors in cannabinoid anticonvulsant effects, European Journal of Pharmacology, 428 (2001), s. 51-57 83. Blair R. E., Deshpande L. S., DeLorenzo R. J. Cannabinoids: is there a potential treatment role in epilepsy?, Expert Opinion of Pharmacotherapy, 16 (2015), s. 1911-1914 84. Jones N., Hill T., Stott C., Wright S. Assessment of the anticonvulsant effects and tolerability of GW Pharmaceuticals‟ cannabidiol in the anticonvulsant screening program, in: Proceedings of the American Epilepsy Society Annual Meeting, American Epilepsy Society, 2015 85. Consroe P., Wolkin A. Cannabidiol – antiepileptic drug comparisons and interactions in experimentally induced seizures in rats, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics., 201 (1977), s. 26-32 294 Medyczna marihuana 86. Izquierdo I., Orsingher O. A., Berardi A. C. Effect of cannabidiol and of other Cannabis sativa compounds on hippocampal seizure discharges, Psychopharmacologia., 28 (1973), s. 95-102 87. Carlini E. A., Leite J. R., Tannhauser M., Berardi A. C. Cannabidiol and Cannabis sativa extract protect mice and rats against convulsive agents, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 25 (1973), s. 664-665 88. Shirazi-zand Z., Ahmad-Molaei L., Motamedi F., Naderi N. The role of potassium BK channels in anticonvulsant effect of cannabidiol in pentylenetetrazole and Maxima electroshock models of seizure in mice, Epilepsy and Behavior, 28 (2013), s. 1-7 89. Jones N. A., Hill A. J., Smith I., Bevan S. A., Williams C. M., Whalley B. J., Stephens G. J. Cannabidiol displays antiepileptiform and antiseizure properties in vitro and in vivo, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 332 (2010), s. 569-577 90. Lastres-Becker I., Molina-Holgado F., Ramos J. A., Mechoulam R., Fernandez-Ruiz J. Cannabinoids provide neuroprotection against 6hydroxydopamine toxicity in vivo and in vitro: relevance to Parkinson‟s disease, Neurobiology of Disease, 16 (2005), s. 96-107 91. Richter A., Loscher W. Effects of pharmacological manipulations of cannabinoid receptors on severity of dystonia in a genetic model of paroxysmal dyskinesia, European Journal of Pharmacology, 454 (2002), s. 145-151 92. Mechoulam R., Carlini E. A. Toward drugs derived from cannabis, Naturwissenschaften, 65 (1978), s. 174-179 93. Cunha J. M., Carlini E. A., Pereira A. E., Ramos O. L., Pimentel C., Gagliardi R., Sanvito W. L., Lander N., Mechoulam R. Chronic administration of cannabidiol to healthy volunteers and epileptic patients, Pharmacology, 21 (1980), s. 175-185 94. Ames F. R., Cridland S. Anticonvulsant effect of cannabidiol, South African Medical Journal, 69 (1986), s. 14 95. Trembly B., Sherman M. Double-blind clinical study of cannabidiol as a secondary anticonvulsant, presented at: Marijuana ‟90 International Conference on Cannabis and Cannabinoids, International Association for Cannabinoid Medicines, 1990 96. Porter B. E., Jacobson C. Repor of a parent survey of cannabidio-enriched cannabis use in pediatric treatment-resistant epilepsy, Epilepsy and Behavior, 29 (2013), s. 574-577 97. Gloss D., Vickrey B. Cannabinoids for epilepsy, Cochrane Database of Systematic Reviews, 3 (2014) 3:CD009270 98. Venderova K., Ruzicka E., Vorisek V., Visnovsky P. Survey on cannabis use in Parkinson's disease: subjective improvement of motor symptoms, Movement Disorders Journal, 19 (2004), s. 1102-1106 99. Iseger T. A., Bossong M. G. A systematic review of the antipsychotic properties of cannabidiol in humans, Schizophrenia Research, 162 (2015), s. 153-161 100. Bergamaschi M. M., Costa Queiroz R. H., Chagas M. H. N, Gomes de Oliveira D. C., Spinosa De Martinis B., Kapczinski F., Quevedo J., Roesler R., Schröder N., E Nardi A., Martín-Santos R., Cecílio Hallak J. E., Zuardi A. W., Crippa S. J. A. Cannabidiol reduces the anxiety induced by simulated public speaking 295 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska in treatment-naive social phobia patients, Neuropsychopharmacology, 36 (2011), s. 1219-1226 101. Das R. K., Kamboj S. K., Ramadas M., Yogan K., Gupta V., Redman E., Curran H. V., Morgan C. J. Cannabidiol enhances consolidation of explicit fear extinction in humans, Psychopharmacology, 226 (2013), s. 781-92 102. Killestein J., Hoogervorst E. L., Reif M., Kalkers N. F., van Loenen A. C., Staats P. G., Gorter R. W., Uitdehaag B. M., Polman C. H. Safety, tolerability, and efficacy of orally administered cannabinoids in MS, Neurology, 58 (2002), s. 1404-1407 103. Killestein J., Hoogervorst E. L., Reif M., Blauw B., Smits M., Uitdehaag B. M., Nagelkerken L., Polman C. H. Immunomodulatory effects of orally administered cannabinoids in multiple sclerosis, Journal of Neuroimmunology, 137 (2003), s. 140-143 104. Zajicek J., Fox P., Sanders H., Wright D., Vickery J., Nunn A., Thompson A. Cannabinoids for treatment of spasticity and other symptoms related to multiple sclerosis (CAMS study): Multicentre randomised placebo-controlled trial, Lancet, 362 (2003), s. 1517-1526 105. Freeman R. M., Adekanmi O., Waterfield M. R., Waterfield A. E., Wright D., Zajicek J. The effect of cannabis on urge incontinence in patients with multiple sclerosis: A multicentre, randomised placebo-controlled trial (CAMS-LUTS), Intetnational Urogynecology Journal Pelvic Floor Dysfunction, 17 (2006), s. 636-641 106. Brady C. M., DasGupta R., Dalton C., Wiseman O. J., Berkley K. J., Fowler C. J. An open-label pilot study of cannabis-based extracts for bladder dysfunction in advanced multiple sclerosis, Multiple Sclerosis Journal, 10 (2004), s. 425-433 107. Wade D. T., Robson P., House H., Makela P., Aram J. A preliminary controlled study to determine whether whole-plant cannabis extracts can improve intractable neurogenic symptoms, Clinical Rehabilitation, 17 (2003), s. 21-29 108. Notcutt W., Price M., Miller R., Newport S., Phillips C., Simmons S., Sansom C. Initial experiences with medicinal extracts of cannabis for chronic pain: Results from 34 'N of 1' studies, Anaesthesia, 59 (2004), s. 440-452 109. Leweke F. M., Koethe D., Pahlisch F., Schreiber D., Gerth C. W., Nolden B. M., Klosterkötter J., Hellmich M., Piomelli D. Antipsychotic effects of cannabidiol, European Psychiatry, 24 (2009), s. 207 110. Zuardi A. W., Hallak J. E., Dursun S. M., Morais S. L., Sanches R. F., Musty R. E., Crippa J. A. Cannabidiol monotherapy for treatment-resistant schizophrenia, Journal of Psychopharmacology, 20 (2006), s. 683-686 111. Zuardi A., Crippa J., Dursun S., Morais S., Vilela J., Sanches R., Hallak J. Cannabidiol was ineffective for manic episode of bipolar affective dis order, Journal of Psychopharmacology, 24 (2010), s. 135-137 112. Hallak J. E., Machado-de-Sousa J. P., Crippa J. A., Sanches R. F., Trzesniak C., Chaves C., Bernardo S. A., Regalo S. C., Zuardi A. W. Performance of schizophrenic patients in the Stroop Color Word Test and electrodermal responsiveness after acute administration of cannabidiol (CBD), Revista Brasileira de Psiquiatria, 32 (2010), s. 56-61 296 Medyczna marihuana 113. Crippa J. A., Derenusson G. N., Ferrari T. B., Wichert-Ana L., Duran F. L., Martin Santos R., Simões M. V., Bhattacharyya S., Fusar-Poli P., Atakan Z. Santos Filho A., Freitas-Ferrari M. C., McGuire P. K., Zuardi A. W., Busatto G. F., Hallak J. E. Neural basis of anxiolytic effects of cannabidiol (CBD) in generalized social anxiety disorder: A preliminary report, Journal of Psychopharmacology, 25 (2011), s. 121-130 114. Strasser F., Luftner D., Possinger K., Ernst G., Ruhstaller T., Meissner W., Ko Y. D., Schnelle, M., Reif M., Cerny T. Cannabis-In-Cachexia-Study-Group. Comparison of orally administered cannabis extract and delta-9tetrahydrocannabinol in treating patients with cancer-related anorexiacachexia syndrome: A multicenter, chase III, randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial from the Cannabis-In Cachexia-Study-Group, Journal of Clinical Oncology, 24 (2006), s. 3394-3400 115. Consroe P., Laguna J., Allender J., Snider S., Stern L., Sandyk R., Kennedy K., Schram K. Controlled clinical trial of cannabidiol in Huntington‟s disease, Pharmacology Biochemistry and Behavior, 40 (1991), s. 701-708 116. Carlini E. A., Masur J., Magalhaes C. C. P. B. Possvel efeito hipnotico do cannabidiol no ser humano. Estudo preliminar, Ciência e Cultura, 31 (1979), s. 315-322 117. Haney M., Gunderson E. W., Rabkin J., Hart C. L., Vosburg S. K., Comer S. D., Foltin R. W. Dronabinol and marijuana in HIV-positive marijuana smokers: caloric intake, mood, and Steep, Journal og Acquired Immune Deficiency Syndromes, 45 (2007), s. 545-54 118. Bedi G., Foltin R. W., Gunderson E. W., Rabkin J., Hart C. L., Comer S. D., Vosburg S. K., Haney M. Efficacy and tolerability of high-dose dronabinol maintenance in HIV-positive marijuana smokers: a controlled laboratory study, Psychopharmacology, 212 (2010), s. 675-86 119. Riggs P. K., Vaida F., Rossi S. S., Sorkin L. S., Gouaux B., Grant I., Ellis R. J. A pilot study of the effects of cannabis on appetite hormones in HIV-infected adult men, Brain Research, 1431 (2012), s. 46-52 120. Foltin R. W., Fischman M. W., Byrne M. F. Effects of smoked marijuana on food intake and body weight of humans living in a residential laboratory, Appetite, 11 (1988), s. 1-14 121. Wallace M. J., Blair R. E., Falenski K. W., Martin B. R., DeLorenzo R. J. The endogenous cannabinoid system regulates seizure frequency and duration in a model of temporal lobe epilepsy, Journal of Pharmacology Experimental Therapeutics, 307 (2003), s. 129-37 122. Gordon E., Devinsky O. Alcohol and Marijuana: Effects on Epilepsy and Use by Patients with Epilepsy, Epilepsia, 42 (2001), s. 1266-1272 123. Hamerle M., Ghaeni L., Kowski A., Weissinger F., Holtkamp M. Cannabis and other illicit drug use in epilepsy patients, European Journal of Neurology, 21 (2014), s. 167-170 124. Gross D. W., Hamm J., Ashworth N. L., Quigley D. Marijuana use and epilepsy: prevalence in patients of a tertiary care epilepsy center, Neurology, 62 (2004), s. 2095-2097 125. Dowie M. J., Howard M. L., Nicholson L. F. B., Faull R. L. M., Hannan A. J., Glass M. Behavioural and molecular consequences of chronic cannabinoid 297 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska treatment in Huntington‟s disease transgenic mice, Neuroscience, 170 (2010), s. 324-336 126. Iannotti F. A., Hill C. L., Leo A., Alhusaini A., Soubrane C., Mazzarella E., Russo E., Whalley B. J., Di Marzo V., Stephens G. J. Nonpsychotropic plant cannabinoids, cannabidivarin (CBDV) and cannabidiol (CBD), activate and desensitize transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) channels in vitro: potential for the treatment of neuron al hyperexcitability, ACS Chemical Neuroscience, 5 (2014), s. 1131-1141 127. Hill A. J., Mercier M. S., Hill T. D., Glyn S. E., Jones N. A., Yamasaki Y., Futamura T., Duncan M., Stott C. G., Stephens G. J., Williams C. M., Whalley B. J. Cannabidivarin is anticonvulsant in mouse and rat, British Journal of Pharmacology, 167 (2012), s. 1629-1642 128. Amada N., Yamasaki Y., Williams C. M., Whalley B. J. Cannabidivarin (CBDV) suppresses pentylenetetrazole (PTZ)-induced increases in epilepsyrelated gene expression, PeerJ, 1 (2013), s. 214 129. Hill T. D., Cascio M. G., Romano B., Duncan M., Pertwee R. G., Williams C. M., Whalley B. J., Hill A. J. Cannabidivarin-rich cannabis extracts are anticonvulsant in mouse and rat via a CB1 receptor-independent mechanizm, British Journal of Pharmacology, 170 (2013), s. 679-92 130. Vollner L., Bieniek D., Korte F. Hashish. XX. Cannabidivarin, a New hashish constituent, Tetrahedron Letters, 3 (1969), s. 145-147 131. Abrams D. I., Hilton J. F., Leiser R. J., Shade S. B., Elbeik T. A., Aweeka F. T., Benowitz N. L., Bredt B. M., Kosel B., Aberg J. A., Deeks S. G., Mitchell T. F., Mulligan K., Bacchetti P., McCune J. M., Schambelan M. Short-term effects of cannabinoids in patients with HIV-1 infection: a randomized, placebo-controlled clinical trial, Annals of Internal Medicine, 139 (2003), s. 258-66 132. Motyka M., Marcinkowski J. T. Używanie pochodnych konopi. Część II. Zastosowanie w medycynie vs. Konsekwencje zdrowotne. Problemy Higieny i Epidemiologii, 95 (2014), s. 21-27 133. Orlicz B. Narkotyki i używki w środowisku chorych na mukowiscydozę, Mukowiscydoza, 35 (2013), s. 9-12 134. Szulc M. Konsekwencje zdrowotne używania marihuany w świetle badań oraz propozycja ujednolicenia stanowiska psychologów wobec problemu legalizacji konopi, sformułowana w oparciu o Kodeks Etyczno-Zawodowy Psychologa, Alkohol i Narkomania, 4 (2013), s. 381-401 135. Jędrzejko M. Marihuana fakty. Marihuana mity, Wydanie Naukowe Atla 2, Wrocław 2011 136. Ashton J. C. Synthetic cannabinoids as drugs of abuse. Current Drug Abuse Reviews, 5 (2012), s. 158-68 137. Szpringer M. Medyczne, społeczne i profilaktyczne aspekty uzależnień narkotykowych dzieci i młodzieży, Studia Medyczne Akademii Świętokrzyskiej, 1 (2003), s. 159-175 138. Tkaczyk M., Florek E., Piekoszewski W. Marihuana i kanabinoidy jako leki. Przegląd lekarski, (2012), s. 1095-1097 139. American College of Physicians. Supporting Research into the Therapeutic Role of Marijuana, Philadelphia: American College of Physicians, 2008 298 Medyczna marihuana 140. Starzyńska Z., Białecka M., Borowiak K., Machoy-Mokrzyńska A. Nowe możliwości wykorzystania tetrahydrokanabinoli w lecznictwie i terapii wybranych chorób. Czasopismo aptekarskie nr 3 (183) 2009, s. 23-27 141. Galve-Roperh I., Sanchez C., Cortes M. L., Gomez del Pulgar T., Izquierdo M., Guzman M. Anti-tumoral action of cannabinoids: involvement of sustained ceramide accumulation and extracellular signal-regulated kinase activation, Nature Medicine, 6 (2000), s. 313-319 142. Feliu A., Moreno-Martet M., Mecha M., Carrillo-Salinas F. J., de Lago E., Fernandez-Ruiz J., Guaza C. A Sativex-like combination of phytocannabinoids as a diseasemodifying therapy in a viral model of multiple sclerosis, British Journal of Pharmacology, 172 (2015), s. 3579-3595 143. Hilliard A., Stott C., Wright S., Guy G., Pryce G., Al-Izki S., Bolton C., Giovannoni G. Evaluation of the effects of Sativex (THC BDS: CBD BDS) on inhibition of spasticity in a chronic relapsing experimental allergic autoimmune encephalomyelitis: a model of multiple sclerosis, ISRN Neurology, 2012, 802649 144. Corey-Bloom J., Wolfson T., Gamst A., Jin S., Marcotte T. D., Bentley H., Gouaux B. Smoked cannabis for spasticity in multiple sclerosis: a randomized, placebocontrolled trial, Canadian Medical Association Journal, 184 (2012), s. 1143-1150 145. Greenberg H. S., Werness S. A., Pugh J. E., Andrus R. O., Anderson D. J., Domino E. F. Short-term effects of smoking marijuana on balance in patients with multiple sclerosis and normal volunteers, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 55 (1994), s. 324-328 146. Kostowski W., Herman S. Z. Farmakologia. Podstawy farmakoterapii, Wydawnictwo lekarskie PZWL, Tom 2. (2010), s. 60-64 147. Di Marzo V., Hill M. P., Bisogno T., Crossman A. R., Brotchie J. M.. Enhanced levels of endogenous cannabinoids in the globus pallidus are associated with a reduction in movement in an Animals model of Parkinson‟s disease, Federation of American Societies for Experimental Biology Journal, 14 (2000), s. 1432-1438 148. Romero J., Berrendero F., Perez-Rosado A., Manzanares J., Rojo A., Fernández-Ruiz J. J., de Yebenes J. G., Ramos J. A. Unilateral 6hydroxydopamine lesions of nigrostriatal dopaminergic neurons increased CB1 receptor mRNA levels in the caudate-putamen, Life Sciences, 66 (2000), s. 485-494 149. de Lago E., Fernandez-Ruiz J., Ortega-Gutierrez S., Cabranes A., Pryce G., Baker D., López-Rodríguez M., Ramos J. A. UCM707, an inhibitor of the anandamide uptake, behaves as a symptom control agent in models of Huntington‟s disease and multiple sclerosis, but fails to delay/arrest the progression of different motorrelated disorders, European Neuropsychopharmacology, 16 (2006), s. 7-18 150. Fernandez-Espejo E., Caraballo I., Rodriguez de Fonseca F., Ferrer B., El Banoua F., Flores J. A., Galan-Rodriguez B. Experimental parkinsonism alters anandamide precursor synthesis, and functional deficits are improved by AM404: a modulator of endocannabinoid function, Neuropsychopharmacology, 29 (2004), s. 1134-1142 299 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska 151. Kreitzer A. C., Malenka R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson‟s disease models, Nature, 445 (2007), s. 643-647 152. Segovia G., Mora F., Crossman A. R., Brotchie J. M. Effects of CB1 cannabinoid receptor modulating compounds on the hyperkinesia induced by high-dose levodopa in the reserpine-treated rat model of Parkinson‟s disease, Movement Disorders, 18 (2003), s. 138-149 153. van Vliet S. A., Vanwersch R. A., Jongsma M. J., Olivier B., Philippens I. H. Therapeutic effects of Delta9-THC and modafinil in a marmozet Parkinson model, European Neuropsychopharmacology, 18 (2008), s. 383-389 154. Fernandez-Espejo E., Caraballo I., de Fonseca F. R., El Banoua F., Ferrer B., Flores J. A., Galan-Rodriguez B. Cannabinoid CB1 antagonists possess antiparkinsonian efficacy only in rats with very severe nigral lesion in experimental parkinsonizm, Neurobiology of Disease, 18 (2005), s. 591-601 155. Garcia-Arencibia M., Ferraro L., Tanganelli S., Fernandez-Ruiz J. Enhanced striatal glutamate release after the administration of rimonabant to 6hydroxydopamine-lesioned rats, Neuroscience Letters, 438 (2008), s. 10-13 156. Zuardi A. W., Crippa J. A., Hallak J. E., Pinto J. P., Chagas M. H., Rodrigues G. G., Dursun S. M., Tumas V. Cannabidiol for the treatment of psychosis in Parkinson‟s disease, Journal of Psychopharmacology, 23 (2009), s. 979-983 157. Lotan I., Treves T. A., Roditi Y., Djaldetti R. Cannabis (medical marijuana) treatment for motor and non-motor symptoms of Parkinson disease: an openlabel observational study, Clinical Neuropharmacology, 37 (2014), s. 41-44 158. Mesnage V., Houeto J. L., Bonnet A. M., Clavier I., Arnulf I., Cattelin F., Le Fur G., Damier P., Welter M. L., Agid Y. Neurokinin B, neurotensin, and cannabinoid receptor antagonists and Parkinson disease, Clinical Neuropharmacology, 27 (2004), s. 108-110 159. Grote H. E., Hannan A. J. Regulators of adult neurogenesis in the healthy and diseased brain, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 34 (2007), 533-545 160. Sonkusare S. K., Kaul C. L., Ramarao P. Dementia of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders – memantine, a new hope, Pharmacological Research, 51 (2005), s. 1-17 161. Eubanks L. M., Rogers C. J., Beuscher A. E., Koob G. F., Olson A. J., Dickerson T. J., Janda K. D. A molecular link between the active component of marijuana and Alzheimer's disease pathology, Molecular Pharmaceutics, 3 (2006), s. 773-777 162. Cheng D., Spiro A. S., Jenner A. M., Garner B., Karl T. Long-term cannabidiol treatment prevents the development of social recognition memory deficits in Alzheimer's disease transgenic mice, Journal of Alzheimer’s Disease, 42 (2014), s. 1383-1396 163. Aso E., Ferrer I. Cannabinoids for treatment of Alzheimer‟s disease: moving toward the clinic, Frontiers in Pharmacology, 5 (2014), s. 37 164. Detyniecki K., Hirsch L. J. Cannabidiol for epilepsy: trying to see through the haze, www.thelancet.com/neurology, 15 (2016), s. 235-237 165. Chesher G. B., Jackson D. M. Anticonvulsant effects of cannabinoids in mice: drug interactions within cannabinoids and cannabinoid interactions with phenytoin, Psychopharmacologia, 37 (1974), s. 255-264 300 Medyczna marihuana 166. Reddy D. S., Golub V. M. The Pharmacological Basis of Cannabis Therapy for Epilepsy, Journal of Pharmacolog Experimental Therapeutics, 357 (2016), s. 45-55 167. Ribeiro A., Almeida V. I., Costola-de-Souza C., Ferraz-de-Paula V., Pinheiro M. L., Vitoretti L. B., Gimenes-Junior J. A., Akamine A. T., Crippa J. A., Tavares-de-Lima W., Palermo-Neto J. Cannabidiol improves lung function and inflammation in mice submitted to LPS-induced acute lung injury, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 37 (2015), s. 35-41 168. Vuolo F., Petronilho F., Sonai B., Ritter C., Hallak J. E., Zuardi A. W., Crippa J. A., Dal-Pizzol F. Evaluation of Serum Cytokines Levels and the Role of Cannabidiol Treatment in Animal Model of Asthma, Mediators of Inflammation, 2015 (2015), 538670 169. Nagarkatti P., Pandey R, Rieder S. A., Hegde V. L., Nagarkatti M. Cannabinoids as novel anti-inflammatory drugs, Future Medicinal Chemistry, 1 (2009), s. 1333-49 170. Sun X., Xu C. S., Chadha N., Chen A., Liu J. Marijuana for Glaucoma: A Recipe for Disaster or Treatment?, Yale Journal of Biology and Medicine, 88 (2015), s. 265-269 171. Porcella A., Maxia C., Gessa G. L., Pani L. The synthetic cannabinoid WIN55212-2 decreases the intraocular pressure in human glaucoma resistant to conventional therapies, European Journal of Neuroscience, 13 (2001), s. 409-412 172. Chien F. Y., Wang R. F., Mittag T. W., Podos S. M. Effect of WIN 55212-2, a cannabinoid receptor agonist, on aqueous humor dynamics in monkeys, Archives of Ophthalmology, 121 (2003), s. 87-90 173. Flach A. J. Delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) in the treatment of end-stage open-angle glaukoma, Transations of the Americal Ophthalmological Society, 100 (2002), s. 215-222 174. Hepler R. S., Frank I. R. Marihuana smoking and intraocular pressure, JAMA, 217 (1971), s. 1392 175. Jay W. M., Green K. Multiple-drop study of topically applied 1% δ9tetrahydrocannabinol in human eyes. Archives of Ophthalmology, 101 (1983), s. 591-593 176. Green K., Roth M. Ocular effects of topical administration of delta 9tetrahydrocannabinol in Man, Archives of Ophthalmology, 100 (1982), s. 265-267 177. Green K. Marijuana smoking vs cannabinoids for glaukoma therapy, Archives of Ophthalmology, 116 (1998), s. 1433-1437 178. Steffens S., Veillard N. R., Arnaud C., Pelli G., Burger F., Staub C., Karsak M., Zimmer A., Frossard J. L., Mach F. Low dose oral cannabinoid therapy reduces progression of atherosclerosis in mice, Nature, 434 (2005), s. 782-786 179. Mach F., Steffens S. The role of the endocannabinoid system in atherosclerosis, Journal of Neuroendocrinology, 1 (2008), s. 53-57 180. Steffens S., Pacher P. Targeting cannabinoid receptor CB(2) in cardiovascular disorders: promises and controversies, British Journal of Pharmacology, 167 (2012), s. 313-323 301 Małgorzata Szabla, Ewa Kędzierska 181. Stanley C. P., Wheal A. J., Randall M. D., O’Sullivan S. E. Cannabinoids alter endothelial function in the Zucker rat model of type 2 diabetes, European Journal of Pharmacology, 720 (2013), s. 376-382 182. Horváth B., Mukhopadhyay P., Haskó G., Pacher P. The Endocannabinoid System and Plant-Derived Cannabinoids in Diabetes and Diabetic Complications, American Journal of Pathology, 180 (2012), s. 432-442 183. www.ukcia.org/research/SativexMonograph.pdf Medyczna marihuana Streszczenie Preparaty z konopi, takie jak marihuana są wykorzystywane na całym świecie w zwalczaniu przeróżnych dolegliwości od ponad 10 000 lat. Ze względu na to, iż mogą wywołać uzależnienie, nierzadko kojarzone były z problemem narkomani, dlatego też ich użytkowanie zostało zakazane. Obecnie w wielu krajach nastąpił renesans dotyczący stosowania marihuany, związany z docenieniem jej właściwości terapeutycznych i prozdrowotnych. Odpowiadają za to przede wszystkim kannabinoidy, które stanowią główne składniki czynne konopi. Punktem ich uchwytu są receptory kannabinoidowe CB1 znajdujące się w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym oraz receptory CB2 obecne w układzie immunologicznym. Coraz częściej wykonywane są badania nad środkami działającymi agonistycznie, bądź antagonistycznie na owe receptory. Wyniki przeprowadzonych doświadczeń ukierunkowują nas na możliwość wykorzystania tej rośliny w terapii nowotworów, AIDS, a także w leczeniu stwardnienia rozsianego, choroby Parkinsona, czy też choroby Alzheimera. Ponadto najnowsze dane literaturowe donoszą, iż leki zawierające składniki czynne konopi mogą być przydatne w leczeniu padaczki, astmy, jaskry, miażdżycy, a także cukrzycy. Współcześnie, używaniu marihuany oraz jej pochodnych towarzyszą liczne kontrowersje. Dlatego, priorytetem podczas urzeczywistniania zastosowania tej rośliny we współczesnej medycynie jest uwzględnienie jej skuteczności terapeutycznych, bezpieczeństwa, przeciwwskazań oraz działań niepożądanych. Słowa kluczowe: marihuana, kannabinoidy, choroby cywilizacyjne Medical marijuana Abstract Cannabis preparations, such as marijuana, are used throughout the world to combat various diseases by more than 10 000 years. Due to the fact that these preparations induce dependence, they are often connoted with the problem of drug addiction, therefore, their use have been prohibited. Currently in many countries there has been a renaissance on its implementation, related to the appreciation of its therapeutic and health-enhancing properties, which result from the action of cannabinoids – the main active ingredients of cannabis. Molecular target for these compounds constitute CB1 cannabinoid receptors, located in the central and peripheral nervous system and the CB2 receptors – present in the immune system. There are more and more studies regarding agonist and antagonists of these receptors. The results of the experiments indicate the potential use of this plant in the treatment of cancer, AIDS, multiple sclerosis, Parkinson's disease or Alzheimer's disease. Moreover, recent literature data reported that medicines containing active ingredients of cannabis may be useful in the treatment of epilepsy, asthma, glaucoma, atherosclerosis, and diabetes. Nowadays, the use of marijuana and its derivatives is accompanied by numerous controversies. Therefore, the priority during the introduction of this plant into the modern medicine is the consideration of its therapeutic efficacy, safety, contraindications and side effects. Keywords: marijuana, cannabinoids, man-made diseases 302 Jakub Potoczny1, Aleksandra Studnicka2, Magdalena Konieczna3, Piotr Czekaj4 ABC wpływu nikotyny na transportery leków 1. Wstęp Transportery leków są to białka transbłonowe, których główną funkcją jest wybiórczy transport związków endogennych i egzogennych przez błonę cytoplazmatyczną. Białka te odgrywają szczególną rolę w tworzeniu barier funkcjonalnych pomiędzy krwią i takimi narządami, jak: mózg, łożysko, gruczoł mlekowy, wątroba, czy ślinianki. W warunkach fizjologicznych chronią one organizm przed substancjami toksycznymi, jednak poprzez swoje działanie mogą też prowadzić do wytworzenia zjawiska lekooporności, a w konsekwencji do nieadekwatnej odpowiedzi organizmu na stosowaną terapię. Czynniki modulujące działanie transporterów wpływają na skuteczność farmakoterapii. Jednym z nich jest potencjalnie nikotyna, wciąż powszechnie dostępna, nie tylko w postaci tradycyjnych papierosów, ale także jako składnik dymu coraz bardziej popularnych e-papierosów oraz plastrów nikotynowych. Wpływ nikotyny na działanie transporterów leków nie jest w pełni poznany [1, 2]. 2. Transportery ABC Nadrodzina transporterów leków ABC stanowi grupę białek występujących w błonach komórkowych i wykorzystujących do działania energię z hydrolizy ATP. W komórkach ludzkich zidentyfikowano do tej pory 48 białek transporterów ABC, które zostały podzielone na siedem rodzin A-G (tabela 1) [1, 2]. Odgrywają one ważną rolę w przenoszeniu substratów, w tym ksenobiotyków do środowiska pozakomórkowego. Dzięki temu przyczyniają się do utrzymania homeostazy organizmu, a jednocześnie chronią komórki przed szkodliwym działaniem związków obcych [1-3]. 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny, http://histologia.sum.edu.pl. 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny, http://histologia.sum.edu.pl. 3 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny, http://histologia.sum.edu.pl. 4 [email protected], Zakład Cytofizjologii, Katedra Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny, http://histologia.sum.edu.pl. 303 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj Tab.1. Podział transporterów nadrodziny ABC (na podstawie [2]). Rodzina ABCA ABCB ABCC ABCD ABCE ABCF ABCG ABCB1 ABCB2 ABCB3 ABCB4 ABCB5 ABCB6 ABCB7 ABCB8 ABCB9 ABCB10 ABCB11 ABCC1 ABCC2 ABCC3 ABCC4 ABCC5 ABCC6 ABCC7 ABCC8 ABCC9 ABCC10 ABCC11 ABCC12 ABCD1 ABCD2 ABCD3 ABCD4 ABCE1 Transporter (symbol genu) ABCA1 ABCA2 ABCA3 ABCA4 ABCA5 ABCA6 ABCA7 ABCA8 ABCA9 ABCA10 ABCA12 ABCA13 ABCF1 ABCF2 ABCF3 ABCG1 ABCG2 ABCG4 ABCG5 ABCG8 W budowie większości transporterów ABC opisano dwie domeny przezbłonowe TMD oraz dwie domeny NBD przyłączające nukleotydy (rycina 1) [1, 2, 3]. Ryc.1. Budowa transportera ABC posiadającego dwie domeny przezbłonowe TMD oraz dwie domeny NBD(na podstawie [4]). Cechy wpływające na zaliczenie określonego białka transportowego do danej rodziny to podobieństwo w strukturze genowej, występowanie homologicznych sekwencji w domenach TMD i NBD oraz porządek domen TMD i NBD [4]. 304 ABC wpływu nikotyny na transportery leków 2.1. Glikoproteina P Najważniejszym białkiem z nadrodziny ABC jest glikoproteina P (P-gp), zwana także białkiem oporności wielolekowej MDR-1 (ang. Multidrug Resistance Protein). Gen ABCB1, kodujący to białko, znajduje się na długim ramieniu chromosomu 7. P-gp ma masę cząsteczkową 170 kD [2]. Jest zbudowana z dwóch domen TMD, z których każda składa się z sześciu segmentów i dwóch domen NBD, które wiążą ATP [4, 5]. Cząsteczka białka ma kształt cylindra zawierającego centralnie położony kanał, przez który substancje hydrofobowe, obojętne lub kationy są usuwane z komórki do środowiska zewnątrzkomórkowego. P-gp ma od 2 do 4 miejsc wiążących substraty. Ze względu na szeroką specyficzność substratową może ona rozpoznawać substancje o różnej budowie chemicznej, jednak nie transportuje anionów [2, 6]. P-gp występuje w wielu różnych tkankach, najczęściej w błonach komórkowych nabłonków wyspecjalizowanych w funkcji wydzielniczej. Stanowi integralną część bariery krew-mózg, krew-jądro oraz krewłożysko. W przewodzie pokarmowym znajduje się na powierzchni kanalikowej hepatocytów, w nabłonku wyścielającym jelito cienkie i okrężnicę, a także przewody wyprowadzające oraz pęcherzyki trzustki. W nerkach, P-gp jest obecna w komórkach kanalików krętych I rzędu i cewki grubej nefronu oraz mezangium. Ponadto, występuje w błonie rąbka szczoteczkowego syncytiotrofoblastu, komórkach pęcherzyków tarczycy, kory nadnerczy, tchawicy i oskrzeli. Jest obecna w śródbłonku naczyń krwionośnych [2]. Najważniejszą funkcją P-gp jest ochrona komórek przed substancjami toksycznymi. W jelitach zapobiega ich wchłanianiu, natomiast w nerkach i wątrobie wzmaga transport, odpowiednio do moczu i żółci. P-gp uczestniczy w transporcie błonowym leków takich, jak inhibitory proteazy HIV, antybiotyki, opioidy, leki cytostatyczne i przeciwwymiotne [4]. Kolejną ważną jej funkcją jest transport hormonów kortykosteroidowych (kortyzolu, kortykosteronu i aldosteronu), fosfolipidów i cytokin. P-gp obecna w limfocytach T i NK reguluje przepływIL-2, IL-4 i IFN-γ z komórki do ogniska zapalnego. Ponadto, wpływa na cykl życiowy komórek, proliferację komórek macierzystych, różnicowanie oraz apoptozę [2, 5]. 2.2. BCRP Białko oporności raka sutka BCRP (ang. Breast Cancer Resistant Protein) jest kodowane przez gen ABCG2, który znajduje się na dłuższym ramieniu chromosomu 4. Białko to jest nazywane także MXR (białko związane z opornością na mitoksantron) oraz ABCP (białko ABC specyficzne dla łożyska) [4]. 305 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj BCRP należy do rodziny G, pół-transporterów, które najprawdopodobniej mogą działać jako homodimery, heterodimerylub bardziej złożone – oligodimery. Charakteryzuje się obecnością jednej domeny NBD na końcu aminowym oraz jednej domeny TMD na końcu karboksylowym łańcucha aminokwasowego [7]. W strukturze białka BCRP wyróżnia się wiele miejsc wiążących substraty bądź inhibitory. Miejsca te różnią się lokalizacją oraz stopniem powinowactwa do substratu. Dana substancja może wiązać się tylko z miejscem swoistym dla niej. BCRP charakteryzuje się szeroką specyficenością substratową. Wśród związków transportowanych przez to białko znajdują się kationy, aniony, substancje hydrofobowe i koniugaty powstałe w drugiej fazie metabolizmu leków. Substratami dla BCRP są m.in. mitoksantron, topotekan i gliburyd, natomiast do inhibitorów należą m.in. fumitremorgin C oraz blokery kanałów wapniowych [7-9]. BCRP występuje w wielu tkankach ludzkich, np. w jelicie, syncytiotrofoblaście łożyska, śródbłonku naczyń płodowych, kosmówce, doczesnej, nabłonku owodni, gruczole mlekowym, kanalikach żółciowych, śródbłonku naczyń mózgowych, komórkach śródmiąższowych jądra, czy komórkach kanalika proksymalnego w nerce. Miejsce występowania transportera koreluje z jego funkcją ochrony organizmu przed toksycznym działaniem szkodliwych substancji. Ekspresja transportera wzrasta w okresie laktacji, dzięki czemu ulega intensyfikacji transport witaminy K i ryboflawiny do mleka, co paradoksalnie skutkuje akumulacją toksyn w mleku matki. BCRP często występuje w tym samym miejscu, gdzie P-gp; oba transportery mają wiele wspólnych substratów [4, 7, 10]. Wykazano, że estrogeny mogą znacząco obniżać aktywność transportera BCRP, co stwarza możliwości regulowania transportu leków poprzez barierę krew-tkanka. Dopasowanie odpowiedniej dawki i postaci hormonu może mieć więc zastosowanie kliniczne w wybranych terapiach [7, 11]. 2.3. MRP Grupa białek oporności wielolekowej MRP zaliczana jest do rodziny ABCC transporterów ABC, składającej się z 12 transporterów (tabela 1) [2, 12]. Białka MRP uczestniczą w transporcie szkodliwych substancji i ksenobiotyków w postaci koniugatów z glutationem lub kwasem glukuronowym. Ksenobiotyki są wydalane z moczem lub kałem, ale mogę być również usuwane przez płuca. Substratami dla MRP są aniony organiczne, a także cyklosporyna A, doksorubicyna, leukotrien C4 (LTC4) oraz analogi puryn [10, 12, 13]. Obecność transporterów MRP potwierdzono w wielu tkankach w ludzkim organizmie, m.in. w jelitach, nerkach, łożysku, żołądku oraz płucach, jednak ekspresja poszczególnych białek MRP w tkankach różni się. 306 ABC wpływu nikotyny na transportery leków Przykładowo, w żołądku obserwuje się znaczącą ekspresję MRP4, podczas gdy ekspresja MRP1, MRP3, MRP5 i MRP7 w tym narządzie jest niska [10]. 3. Transportery SLC Wśród białek transportujących leki wyróżnia się także nadrodzinę transporterów SLC (ang. Solute-carrier). Obecnie liczy ona 55 rodzin białek (tabela 2). U ludzi występuje 382 różnych transporterów SLC. Znajdują się one we wszystkich błonach komórek (oprócz błony jądrowej), gdzie przenoszą cząsteczki poprzez transport bierny, symport lub antyport. Wiążą takie substancje jak: aniony, kationy, aminokwasy, oligopeptydy, cukry, sole kwasów żółciowych, jony metali, neurotransmitery i witaminy [14]. Za transport aminokwasów odpowiedzialne są systemy transportowe (grupy białek transportujące określone aminokwasy) tworzone w zależności od doboru substratów: system A(SLC38A1, SLC38A2, SLC38A4), system X-AG(SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3), system Y+(SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3P, SLC7A4), system ASC(SLC7A10), system ASCT(SLC1A4, SLC1A5), B(0,+)AT(SLC7A9), system L(SLC7A5, SLC7A8, SLC43A1, SLC43A2), system Y+L(SLC7A7, SLC7A6) i system T(SLC16A10). Za transport alaniny odpowiada system A, glutaminy system N, fenyloalaniny i waliny system L, a argininy Y+[15]. Tab.2. Nadrodzina transporterów SLC (na podstawie [4, 14]). Rodzina Transportowane związki SLC22 Kationy i aniony organiczne, jony obojnacze SLC21 Aniony organiczne SLC6 Monoaminy SLC38, SLC43, SLC1, SLC7, SLC3,SLC32, SLC36 Aminokwasy SLC28, SLC29 Nukleozydy SLC14 Mocznik SLC27 Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe 4. Udział transporterów leków w tworzeniu barier krew-tkanka Największe znaczenie transporterów leków polega na tworzeniu barier krew-tkanka, gdzie stanowią jeden z głównych mechanizmów ochrony narządów. Ich funkcja polega na wyrzucie ksenobiotyków poza komórki. Negatywnym efektem tego zjawiska jest lekooporność spowodowana wzrostem aktywności transporterów, prowadząca do ograniczenia stężenia leku w komórce [4]. 307 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj 4.1. Łożysko W barierze łożyskowej występują zarówno białka nadrodziny ABC, jak i SLC. Odgrywają one ważną rolę w transporcie substancji odżywczych od matki do płodu, a poza tym stanowią jeden z mechanizmów ochronnych, ponieważ zapobiegają przedostawaniu się ksenobiotyków do płodu oraz uczestniczą w usuwaniu produktów przemiany materii. Łożyskowe transportery leków ABC lokują się głównie w części szczytowej i bazalnej błony komórkowej syncytiotrofoblastu (rycina2). Poza tym transportery mogą występować w śródbłonku naczyń włosowatych płodu. Białka SLC zaangażowane są m.in. w transport aminokwasów [4, 16]. Ryc.2. Rozmieszczenie transporterów w barierze krew-łożysko 4.2. Mózg Ścisłe połączenia typu strefy zamykającej (ang. tight junction; zonula occludens) komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgowia mają na celu ochronę ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przed substancjami toksycznymi, ograniczając przemieszczanie się związków chemicznych pochodzenia endo- i egzogennego w przestrzeniach międzykomórkowych. W związku z tym, do transportu niezbędnych cząsteczek, np. glukozy bądź aminokwasów przez śródbłonek, wymagane są specyficzne transportery. W komórkach śródbłonka ekspresji ulega szereg transporterów, uczestniczących zarówno w usuwaniu, jak i pobieraniu określonych związków, w tym także transportery leków. Są to m.in.: polipeptyd 1A2 (OATP1A2/ SLCO1A2) transportujący aniony organiczne, białko OAT3/SLC22A8 transportujące aniony organiczne, transporter monokarboksylowy MCT1 oraz P-gp, BCRP i MRP4 (rycina 3) [17]. 308 ABC wpływu nikotyny na transportery leków Ryc. 3. Transportery występujące w śródbłonku naczyniowym w barierze krew-mózg. Strzałkami oznaczono kierunek transportu. Z.O – strefa zamykająca (zonula occludens) (na podstawie [17]). 4.3. Gruczoł mlekowy Obecność i prawidłowe funkcjonowanie transporterów w gruczole mlekowym ma szczególnie znaczenie w okresie laktacji u kobiet, kiedy intensywnie transportowane są substancje odżywcze do mleka matki. Aktywność poszczególnych transporterów ma też wpływ na zawartość substancji egzogennych zmagazynowanych w mleku matki [18]. W tym czasie obserwuje się ekspresję MRP1, MRP2 oraz MRP5, nie wykazano natomiast ekspresji MRP3 i MRP4. Co więcej, w gruczole mlekowym nieaktywnym, ekspresji ulegają MRP8 i MRP9. W tkance gruczołu mlekowego wykryto obecność P-gp, jednak zauważono, że podczas laktacji ekspresja tego białka ulega obniżeniu [18, 19]. W okresie laktacji zauważa się natomiast dużą ekspresję BCRP. Białko oporności raka sutka transportuje witaminę B2 (ryboflawinę) [7, 20]. W tkance gruczołu mlekowego odnotowano także obecność transporterów takich, jak OCT1, OCT3, OCTN1 oraz OCTN2 [18]. Substratem dla OCTN2 jest L-karnityna, niezbędna w procesie β-oksydacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych i umożliwiająca ich przeniknięcie przez wewnętrzną błonę mitochondrialną do macierzy mitochondrialnej. Organizm noworodka nie jest w stanie sam syntetyzować karnityny. Z tego względu niezbędne jest jej dostarczenie ze środowiska zewnętrznego, którym jest mleko matki. Ekspresja OCTN2 paradoksalnie ulega zmniejszeniu podczas laktacji [7, 17, 21]. Układowy pierwotny niedobór karnityny (ang. systemic primary carnitined eficiency, SPCD) jest chorobą spowodowaną mutacją genu SLC22A5 kodującego transporter karnityny zależny od sodu (OCTN2), dziedziczoną w sposób autosomalny rece309 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj sywny. Skutkuje ona utratą kartnityny przez nerki i spadkiem stężenia tego związku w organizmie. SPCD objawia się osłabieniem mięśni, hipoglikemią i kardiomiopatią. W niektórych przypadkach może prowadzić do śmierci, jednak zdarza się również bezobjawowy jej przebieg [22]. 4.4. Wątroba Ważnymi funkcjami wątroby są: magazynowanie substancji odżywczych, uwalnianie substratów dla podstawowych szlaków metabolizmu komórkowego oraz metabolizm ksenobiotyków. Hepatocyty wychwytują aniony, kationy, prostaglandyny i sole kwasów żółciowych z krwi dzięki transporterom znajdującym się w biegunie naczyniowym komórek, np.: OATP-A (SLC21A3), OATP-B (SLC21A9), OATP-C (SLC21A6), OATP8 (SLC21A8), OCT1 (SLC22A1) i hPGT (SLC21A2). Produkty metabolizmu hepatocytarnego w dużej mierze są usuwane do żółci dzięki transporterom takim, jak: MRP1, MRP2, MRP3 i MRP6. Charakterystyczne jest, że MRP1 zwiększa swoją aktywność podczas regeneracji wątroby i w obecności endotoksyn, natomiast MRP3 znajduje się tylko w przewodach żółciowych. Skutkiem osłabienia działania transporterów poprzez ich inhibicję może być cholestaza. Zastój żółci nie oznacza, że ksenobiotyki nie zostaną usunięte z organizmu, ponieważ te znajdujące się we krwi zostaną usunięte wraz z moczem [23]. Transportery soli kwasów żółciowych są wykorzystywane do wprowadzania środków chemioterapeutycznych do komórek zmienionych nowotworowo. Ponadto, są także używane do ukierunkowania uwalniania tlenku azotu (NO) w wątrobie. NO zwiększa przepuszczalność ścian żyły wrotnej, jest czynnikiem ochronnym przy włóknieniu, a także wywiera działanie anty-apoptyczne w komórkach, co jest bardzo ważne podczas leczenia marskości wątroby [23]. 4.5. Gruczoły ślinowe Wydzielanie śliny odbywa się na dwóch etapach. W pierwszym etapie powstaje izotoniczna ślina zawierająca duże ilości NaCl, natomiast w drugimetapie jony Na+i Cl-są absorbowane przez wymianę z jonami K+ i HCO3-, przez co tworzy się hipotoniczna ślina ostateczna. Do transporterów leków znajdujących się w śliniankach zaliczamy: kotransporter Na+/K+-2Cl-, kotransporter K+-Cl- (SLC12A), wymieniacz jonowy Cl-/HCO3(SLC4A2), wymieniacz jonowy Na+/H+ (SLC9) i elektrogeniczny kotransporter Na+/HCO3- (SLC4A4). Kotransporter Na+/K+-2Cl- należy do rodziny SLC12A, a jego funkcja polega na przenoszeniu jonów Cl- przez błonę cytoplazmatyczną podstawno-boczną w komórce, które później zostaną wydzielone w jej części szczytowej. Lekooporność spowodowana zaburzeniami działania transporterów może przyczyniać się do braku odpo310 ABC wpływu nikotyny na transportery leków wiedzi na substancje lecznicze stosowane np. podczas chemioterapii złośliwych nowotworów ślinianek [24]. 5. Nikotyna-losy w ustroju i metabolizm Nikotyna jest zasadowym, heterocyklicznym związkiem organicznym pochodzenia roślinnego zawierającym azot [25-28]. Stanowi do 90% wszystkich alkaloidów zawartych w liściach tytoniu. Jest również składnikiem płynów używanych w kartridżach do e-papierosów. Według statystyk firmy British American Tobacco, aktualnie ok. 1,5 mln Polaków używa e-papierosów, sięgając po nie najczęściej spośród wszystkich mieszkańców Europy. W tej grupie jest coraz więcej młodzieży szkolnej, szczególnie podatnej na kampanie reklamowe. Z kolei, osoby starające się rzucić palenie, korzystają z plastrów i gum zawierających nikotynę [29- 32]. Nikotyna jest agonistą receptorów cholinergicznych typu N. Receptory typu N są receptorami jonotropowymi, charakteryzującymi się różnorodnością w zależności od miejsca występowania [33, 34]. Najbardziej rozpowszechniony receptor neuronalny charakteryzuje się 50-krotnie większą wrażliwością na nikotynę niż receptor mięśniowy, który wykazuje silniejsze powinowactwo do acetylocholiny oraz suberyldicholiny [33, 35]. Zróżnicowanie strukturalne i funkcjonalne receptorów N pozwala nikotynie na ich preferencyjną stymulację w OUN, c przy tym substancją wysoce psychoaktywną i uzależniającą, działającą bezpośrednio na obszary mózgowia zaangażowane w procesy poznawcze i emocje. Liczba receptorów u osób palących, a także zdolność wiązania przez nie nikotyny jest podwyższona [25, 27]. Palacze papierosów cierpią na zespoły nadpobudliwości nasilające się w kolejnych latach palenia [33, 34, 36]. Absorpcja nikotyny, będącej słabą zasadą, uzależniona jest od wartości pH. W środowiskach kwaśnych, na skutek występowania w formie zjonizowanej słabo przenika przez błony komórkowe, w związku z czym jest słabo wchłaniana w żołądku. Wraz ze wzrostem zasadowości środowiska nikotyna przekształca się w postać niezjonizowaną i jej absorpcja wzrasta. Nikotyna wchłania się doskonale przez ściany pęcherzyków płucnych, które to odpowiadają za 90% absorpcji związku z dymu tytoniowego. Ma na to wpływ kilka czynników, m.in. rozpuszczanie nikotyny w płynie o pH równym 7,4, co przyspiesza transport przezbłonowy [25, 27, 28, 37, 38]. W krwioobiegu, nikotyna występuje w 69% w postaci zjonizowanej i w 31% w postaci zdejonizowanej. W niewielkim stopniu (5%) wiąże się z białkami osocza. Nikotyna przenika przez barierę krew-mózg, barierę łożyskową i barierę krew-mleko matek karmiących [25, 27, 38]. U dzieci matek palących w trakcie ciąży stwierdza się nawet pięciokrotnie wyższe poziomy najważniejszego z metabolitów nikotyny – kotyniny [39]. Spośród innych wydzielin znaczne ilości nikotyny zawierają: ślina oraz sok żołądkowy. Badania sekcyjne zmarłych palaczy wykazały największą 311 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj zawartość nikotyny w wątrobie, nerkach, śledzionie i płucach, najmniejszą zaś w tkance tłuszczowej [25, 27]. Potencjalna kumulacja narządowa nikotyny, przy zdolności przenikania tego związku przez bariery tkankowe i gromadzenia w lipofilnym środowisku, mogłaby doprowadzić do powstania stężeń o jeden rząd wielkości większych niż w osoczu [33]. Mechanizmem chroniącym komórki ludzkie przed nagromadzeniem nikotyny jest jej wydajny katabolizm, odbywający się głównie w wątrobie. W metabolizmie nikotyny można wyróżnić dwie główne fazy: mikrosomalnego utleniania nikotyny, N- i O-glukoronidacji powstałych metabolitów oraz wydalania ich, głównie z moczem, ale też z kałem, żółcią, śliną i potem [26]. Niewielkie ilości nikotyny mogą być biotransformowane w innych narządach: płucach, nerkach, mózgu, czy błonie śluzowej nosa [25, 27]. Zidentyfikowano sześć głównych metabolitów nikotyny, spośród których najważniejszym jest kotynina, pochodna laktamu. Przekształcenie nikotyny do kotyniny odbywa się w dwóch etapach. Pierwszy z nich podlega kontroli wątrobowego cytochromu P450 CYP2A6, należącego do klasy oksydoreduktaz. Jego aktywność stanowi 10% wątrobowej aktywności cytochromu P450 (CYP). CYP2A6 natomiast odpowiada za 90% metabolizmu nikotyny, ale jest też zaangażowany w metabolizm kumaryny, halotanu, kwasu walproinowego oraz tegafuru [41, 42]. W efekcie oksydacji pierścienia pirolidynowego powstaje jon iminowy nikotyny, który pozostaje w równowadze z 5hydroksynikotyną. Ów produkt przejściowy ostatecznie zostaje przekształcony do kotyniny przy udziale cytoplazmatycznej oksydazy aldehydowej. U ludzi, przekształceniu do kotyniny ulega 70-80% nikotyny. Ok. 20 pochodnych transformacji biologicznej nikotyny powstaje z udziałem innych enzymów niż oksydaza aldehydowa, m.in. tlenek N-nikotyny, glukoronian nikotyny, jon izometioniowy nikotyny oraz nornikotyna, na drodze N-oksydacji, N-demetylacji oraz N-glukoronidacji [25, 27, 38]. Metabolizm kotyniny nie jest dobrze poznany. Oznaczono 6 głównych metabolitów kotyniny: 3-hydroksykotyninę, 5-hydroksykotyninę (allohydroksykotyninę), tlenek N-kotyniny, N-glukoroniankotyniny, jon metoniowykotyniny oraz norkotyninę. W metabolizmie kotyniny biorą udział m.in. izoformy cytochromu P450: CYP2A6 i CYP2A13 oraz UDP-glukoronozylotransferaza (rycina 4). 10-15% kotyniny wydalane jest z moczem w postaci nieprzekształconej [25, 27, 38]. Różne gatunki tytoniu, na skutek polimorfizmu genetycznego charakteryzują się odmienną zawartością powyższych alkaloidów w swoich liściach [28, 40]. Na metabolizm nikotyny mają wpływ liczne czynniki: dieta, wiek, płeć (kobiety szybciej metabolizują nikotynę), cykl dobowy, okres ciąży, a także induktory CYP, np. deksametazon i fenobarbital oraz jego inhibitory, np. metoksalen i tranylcypromina. Samo palenie papierosów spowalnia metabolizm nikotyny. Istnieją różnice w metabolizmie nikotyny w zależności od przynależności etnicznej i rasowej [25, 27, 42] oraz polimorfizmu geno- 312 ABC wpływu nikotyny na transportery leków wego [34, 41-44,]. U Afroamerykanów i Azjatów zidentyfikowano warianty cytochromu CYP2A6 odpowiadające za wolniejszy metabolizm nikotyny. Osobnicy wolniej metabolizujący nikotynę są bardziej skłonni do zerwania z nałogiem [25, 34, 45]. Ryc.4. Główne kierunki metabolizmu nikotyny i kotyniny (na podstawie [25] i [27]). 6. Wpływ nikotyny na transportery leków Wiedza na temat czynników wpływających na ekspresję i aktywność transporterów leków ma kluczowe znaczenie dla racjonalnego i skutecznego prowadzenia farmakoterapii. Swoiste substraty, induktory i inhibitory białek transporterów mogą wpływać na ich funkcje fizjologiczne. Nikotyna, ze względu na szerokie spektrum działania i dość powszechne wykorzystanie powinna być brana pod uwagę, także jako czynnik potencjalnie wpływający na procesy leczenia chorób na poziomie dostarczenia leków (i toksyn) do komórek narządów [46]. Dotychczasowe badania mechanizmu odpowiedzialnego za transport przezbłonowy nikotyny w komórkach ludzkich miały na celu wykazanie, czy nikotyna i jej metabolity są transportowane przez P-gp. Porównano m.in. działanie nikotyny, kotyniny i werapamilu, który jest swoistym inhibitorem P-gp i wykazano, że zarówno nikotyna, jak i kotynina nie są substratami dla tego transportera [46]. 313 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj Ponadto, badania wpływu nikotyny na transportery w obrębie bariery krew-mózg, wykazały że nikotyna przenika ową barierę szybko, kumulując się w obrębie mózgowia, a im szybsze jest przenikanie, tym potencjalnie większe narażenie na wystąpienie uzależnienia. Stwierdzono interakcję nikotyna-transportery kationów organicznych (OCT), jednak korzystając ze specyficznych inhibitorów transporterów wykazano, że P-gp, transportery OCT1-3, BCRP nie są w znaczącym stopniu zaangażowane w transport nikotyny w obrębie bariery krew-mózg. Okazało się, że za transport nikotyny w obrębie bariery krew-mózg, oprócz biernej dyfuzji, odpowiada specyficzny, znacznie przyspieszający wnikanie nikotyny do mózgowia transporter „protonowo-aminowy” działający na zasadzie antyportu, który odpowiedzialny jest również za przenoszenie leku przeciw bólowego tramadolu oraz leku antyhistaminowego diphenhydraminy. Zaobserwowano wpływ powyższych leków na zmniejszenie wydajności transportu nikotyny przez barierę krew-mózg. Natura molekularna tego antyportu nie została jeszcze poznana. W przyszłości nie można wykluczyć wykorzystania właściwych dla tego transportera inhibitorów w celu ograniczenia przedostawania się nikotyny do mózgowia i redukcji stopnia uzależnienia (tabela3) [47]. U osób nadużywających tramadol, stwierdzono zwiększenie stopnia uzależnienia od nikotyny. Prawdopodobnie lek ten, ograniczając wydajność transportu nikotyny przez barierę krew-mózg, prowokował do wypalania większej liczby papierosów, aby dostarczyć odpowiedniej ilości nikotyny celem zaspokojenia nałogu [48]. Tab.3. Wpływ wybranych leków na transport nikotyny w obrębie szczurzej bariery krew-mózg. Zaobserwować można hamujący wpływ tramadolu, diphenhydraminy oraz leku psychotropowego 3,4-metylenodioksymetamfetaminy (MDMA) (na podstawie [47]). Lek Kodeina Klonidyna Diphenhydramina MDMA Tramadol Stężenie (mM) 10 10 5 10 10 10 Względny współczynnik transportu (%) 71 ±5 69 ±5 41 ±6 30 ±2 35 ±7 39 ±8 Z kolei, wśród substratów i inhibitorów dla białek MRP należących do rodziny ABCC znajdują się substancje występujące w postaci koniugatów m.in. z glutationem lub kwasem glukuronowym. Nie zaobserwowano wpływu metabolitów nikotyny: N-glukoronianu nikotyny, N-glukoronianu kotyniny i O-glukoronianu trans-hydroksykotyniny na transportery MRP (MRP1, MRP2 i MRP3). Również obecność glutationunie miała wpływu na transport zależny od MRP [13]. Obecnie próbuje się określić wpływ nikotyny na mechanizm regulujący aktywność transporterów leków. Badania przeprowadzone na komórkach Caco-2, wywodzących się z nowotworów nabłonka jelita grubego, często 314 ABC wpływu nikotyny na transportery leków wykorzystywanych w przemyśle farmaceutycznym do badania wchłaniania leków, wykazały czterokrotny wzrost ekspresji P-gp i BCRP w komórkach poddanych działaniu nikotyny w porównaniu do kontroli. Jednocześnie zaobserwowano zależność między wzrostem ekspresji BCRP, a dawką nikotyny. Większą ekspresję BCRP zarejestrowano u nałogowych palaczy w porównaniu z osobami niepalącymi, bądź okazjonalnie sięgającymi po papierosa. Powyższe dane wskazują, że nikotyna może zmniejszać biodostępność leków poprzez zwiększoną aktywność transporterów, np. w terapii HAART (ang. highly active anti retroviral therapy) stosowanej w leczeniu HIV. Wpływ kompetencyjny nikotyny na transportery mógłby mieć szczególne znaczenie w przypadku terapii antyretrowirusowej, ponieważ wiele substancji w niej stosowanych (inhibitory proteazy, nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy, nienukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy) jest substratami bądź inhibitorami transporterów leków (np. lamiwudyna jest substratem P-gp, a abakawir jest substratem P-gp oraz BCRP) [49]. Badając wpływ nikotyny w połączeniu z kokainą, na transport aminokwasów zależny od transporterów SLC w łożysku ludzkim stwierdzono, że związki te wspólnie blokują transport alaniny, fenyloalaniny i waliny. Sama nikotyna hamuje transport argininy, natomiast nie ma wpływu na transport glutaminy. Hamowanie transportu aminokwasów dla rozwijającego się płodu, w konsekwencji może prowadzić do wystąpienia wewnątrzmacicznego zahamowania wzrostu (IUGR) [50]. 7. Podsumowanie Nikotyna jest wciąż ogólnie dostępna i stosowana przez znaczą część społeczeństwa. Jest substancją psychoaktywną i uzależniającą. Wpływa na wiele procesów zachodzących w ludzkim organizmie. Fakt jej destrukcyjnego oddziaływania na tkanki ludzkie, a także działanie prokancerogenne są dobrze poznane. Stosunkowo niewiele jest jednak badań prowadzonych celem ustalenia, czy istnieją oddziaływania pomiędzy nikotyną a białkami transportowymi leków oraz jaka jest ich natura. Uzyskano wiele informacji na temat budowy, mechanizmu działania i specyficznych substratów dla białek transportowych nadrodziny ABC i SLC występujących w kluczowych dla rozwoju i życia człowieka barierach, np. krewmózg oraz krew-łożysko. Transportery leków stanowią istotny czynnik odpowiedzialny za zjawisko lekooporności, ograniczającej w praktyce lekarskiej skuteczność terapii farmakologicznej. Przeprowadzone badania sugerują, że nikotyna nie jest aktywnie transportowana przez transportery leków, jednakże wpływa modulująco na ich ekspresję i aktywność. Nikotyna może przyczynić się do nasilenia tego zjawiska, modyfikując działanie terapeutyczne leków. W związku z tym, konieczne jest podjęcie dalszych badań pozwalających na analizę kolejnych potencjalnych interakcji między nią a białkami transportowymi leków. 315 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Linton K. J. Structure and Function of ABC Transporters, Physiology, 22 (2007), s. 122-130 Bamburowicz-Klimkowska M., Bogucka U., Szutowski M. Funkcje transporterów typu ABC, Biuletyn Wydziału Farmaceutycznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, 3 (2011), s. 34-40 Higgins C. F. ABC transporters: physiology, structure and mechanism – an overview, Research in Microbiology, 152 (2001), s. 205-210 Kozłowska-Rup D., Czekaj P. Barierowa rola białek nadrodziny ABC w łożysku ludzkim, Ginekologia Polska, 82 (2011), s. 52-63 Całka K., Balcerczak E., Sagłacka A., Mirowski M. Białka oporności wielolekowej w szpiczaku mnogim, Acta Haematologica Polonica, 39 (2008), s. 417-428 Sokołowska J., Urbańska K., Kłosińska D. Rola glikoproteiny P w warunkach fizjologicznych i w stanach patologicznych. Część I. budowa chemiczna i biologiczna glikoproteiny P, Życie Weterynaryjne, 89 (2014), s. 939-942 Jani M., Ambrus C., Magnan R., Jakab K. T ., Beéry E., Zolnerciks J. K., Krajcsi P. Structure and function of BCRP, a broad specificity transporter of xenobiotics and endobiotics, Archives of Toxicology, 88 (2014), s. 1205-1248 Rabindran S. K., Ross D. D., Doyle L. A., Yang W., Greenberger L. M. Fumitremorgin C Reverses Multidrug Resistance in Cells Transfected with the Breast Cancer Resistance Protein, Cancer research, 60 (2000), s. 47-50 Szafraniec M. J., Szczygieł M., Urbanska K., Fiedor L. Determinants of the activity and substrate recognition of breast cancer resistance protein (ABCG2), Drug Metabolism Reviews, 46 (2014), s. 459-474 Leitner H. M., Kachadourian R., Day B. J. Harnessing drug resistance: Using ABC transporter proteins to target cancer cells, Biochemical Pharmacology, 74 (2007), s. 1677-1685 Hartz A. M. S., Mahringer A., Miller D. S., Bauer B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity, Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism, 30 (2010), s. 1742-1755. Toyoda Y., Hagiya Y., Adachi T., Hoshijima K., Kuo M. T., Ishikawa T. MRP class of human ATP binding cassette (ABC) transporters: historical background and new research directions, Xenobiotica, 38 (2008), s. 833-862 Létourneau I., Bowersc R., Deeleyb R., Cole S. Limited modulation of the transport activity of the human multidrug resistance proteins MRP1, MRP2 and MRP3 by nicotine glucuronide metabolites, Toxicology Letters – Elsevier, 157 (2005), s. 9-19 Hel L., Vasiliou K., Nebert D. W. Analysis and update of the human solute carrier (SLC) gene superfamily, Human Genomics, 3 (2009), s. 195-206 Cleal J. K., Lewis R. M. The mechanisms and regulation of placental amino acid transport to the human foetus, The Journal of Neuroendocrinology, 20 (2008), s. 419-426 Vähäkangas K., Myllynen P. Drug transporters in the human blood-placental barrier, British Journal of Pharmacology. 158 (2009), s. 665-678 Urquhart B. L., Kim R. B. Blood−brain barrier transporters and response to CNS-active drugs, European Journal of Clinical Pharmacology, 65 (2009), s. 1063-70 316 ABC wpływu nikotyny na transportery leków 18. Ito S., Alcorn J. Xenobiotic transporter expression and function in the human mammary gland, Advanced Drug Delivery Reviews, 55 (2003), s. 653-665 19. Alcorn J., Lu X., Moscow J. A., McNamara P. J. Transporter Gene Expression in Lactating and Nonlactating Human Mammary Epithelial Cells Using RealTime Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 303 (2002), s. 487-496 20. Dean M. ABC transporters, drug resistance, and cancer stem cells, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia., 14 (2009), s. 3-9 21. Kwok B., Yamauchi A., Rajesan R., Chan L., Dhillon U., Gao W., Xu H., Wang B., Takahashi S., Semple J., Tamai I., Nezu J., Tsuji A., Harper P., Ito S. Carnitine/xenobiotics transporters in the human mammary gland epithelia, MCF12A., American Journal of Physiology – Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 290 (2006), s. 793-802 22. Fu L., Huang M., Chen S. Primary carnitine deficiency and cardiomyopathy, Korean Circulation Journal, 43 (2013), s. 785-792 23. Fabera K. M., Müllerb M., Jansen P. L. M. Drug transport proteins in the liver, Advanced Drug Delivery Reviews, 55 (2003), s. 107-124 24. Roussa E. Channels and transporters in salivary glands, Cell and Tissue Research, 343 (2011), s. 263-287 25. Benowitz N. L., Hukkanen J., Jacob P. Nicotine Chemistry, Metabolism, Kinetics and Biomarkers, Handbook of Experimental Pharmacology, 192 (2009), s. 29-60 26. Mishra A., Chaturvedi P., Datta S., Sinukumar S., Joshi P., Garg A. Harmful effects of nicotine, Indian Journal of Medical and Paediatrical Oncology, 36 (2015), s. 24-31 27. Nowak J. M., Żuryń A., Grzanka A. Kotynina – metabolizm, zastosowanie jako biomarker i wpływ na organizm człowieka, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 66 (2012), s. 996-1005 28. Gurusamy R., Natarajan S. Current Status on Biochemistry and Molecular Biology of Microbial Degradation of Nicotine, Scientific World Journal, 2013: 125385, 10.1155/2013/125385 29. La Torre G., Mipatrini D, Country-level correlates of e-cigarette use in the European Union, International Journal of Public Health, 13 (2016)., s1-7 30. Mc Donough M. Update on medicines for smoking cessation, Australian Prescriber, 38 (2015), s. 106-111 31. Wasowicz A., Feleszko W., Goniewicz M. L. E-Cigarette use among children and young people: the need for regulation, Expert Review of Respiratory Medicine, 2015 Oct;5, s.507-9 32. http://natemat.pl/163815,e-papierosy-stworzone-od-nowa-zamiast-plynukapsulki 33. Albuqerque E. X., Pereira E. F., Alkondon M., Rogers S. W. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function, Physiololgical Reviews, 89 (2009), s. 73-120 34. Benowitz N. L, Pharmacology of Nicotine: Addiction, Smoking-Induced Disease, and Therapeutics, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 49 (2009), s. 57-71 317 Jakub Potoczny, Aleksandra Studnicka, Magdalena Konieczna, Piotr Czekaj 35. Andreoli T. M., Brown A. M., Fambrough D. M., Hoffman J. F., Schultz S., Welsh M. J. Molecular Biology of Membrane Transport Disorders, Springer Science & Business Media, 2013, s. 152, ISBN:978-0-306-451645 36. Goriounova N. A., Mansvelder H. D. Short- and Long-Term Consequences of Nicotine Exposure during Adolescence for Prefrontal Cortex Neuronal Network Function, Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine, 12 (2012): a012120 37. Hukkanen J., Jacob P., Benowitz N. L. Metabolism and Disposition Kinetics of Nicotine, Pharmacological Reviews, 57 (2005), s. 79-115 38. Tutka P., Mosiewicz J., Wielosz M. Pharmacokinetics and metabolism of nicotine, Pharmacological Reports, 57 (2005), s.143-153 39. Stiby A. I., Macleod J., Hickman M., Yip V. L., Thompson N. J., Munafo M. R. Association of Maternal Smoking With Child Cotinine Levels, Nicotine Tobbaco Research, 12 (2013), s. 2029-2036 40. Sun B., Zhang F., Zhou G., Chu G., Huang F. Genetic variation in alkaloid accumulation in leaves of Nicotiana, Journal of Zhejiang University Science B, 12 (2013), s. 1100-1109 41. Cichocki M. Biochemiczne i molekularne podstawy biotransformacji ksenobiotyków, Wydawnictwo Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, 2015, s. 42. ISBN: 978-83-7597-256-6 42. Koudusi N. A., Hoffmann E. B., Assadzadeh A., Tyndale R. F. Hepatic CYP2A6 levels and nicotine metabolism: Impact of genetic, physiologic, environmental, and epigenetic factors, European Journal of Clinical Pharmacology, 66 (2010), s. 239-251 43. http://www.cypalleles.ki.se/cyp2a6.htm 44. Yalcin E., De la Monte S. Tobacco nitrosamines as culprits in disease: mechanisms reviewed, Journal of Physiology and Biochemistry, 1(2016), s. 107-120 45. Piliguian M., Zhu A. Z. X., Zhou Q., Benowitz N. L., Ahluwalia J. S. Novel CYP2A6 variants identified in African Americans are associated with slow nicotine metabolism in vitro and in vivo, Pharmacogenetic Genomics, 24 (2014), s. 118-128 46. Wang J., Markowitz J., Donovan J., Devane L. P-glycoprotein does not actively transport nicotine and cotinine, Addiction Biology, 10 (2005), s. 127-129 47. Cisternino S., Chapy H., Andre P., Smirnova M., Debray M., Schermann J. M. Coexistence of passive and proton antiporter-mediated processes in nicotinetransport at the mouse blood-brain barrier, American Association of Pharmaceutical Scientists Journal, 2(2013),s.299-307 48. Shalaby A. S., El-Hady Sweilum O. A., Ads M K. Does Tramadol Increase the Severity of Nicotine Dependence? A Study in an Egyptian Sample, Journal of Psychoactive Drugs, 47 (2015), s. 197-202 49. Pal D., Kwatra D., Minocha M., Paturi D., Budda B., Mitra A. Efflux transporters- and cytochrome P-450-mediated interactions between drugs of abuse and antiretrovirals, Life Sciences – Elsevier, 88 (2011), s. 959-971 50. Pastrakuljic A., Derewlany L., Knie B., Koren G. The Effects of Cocaine and Nicotine on Amino Acid Transport across the Human Placental Cotyledon Perfused In Vitro, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 294 (2000), s. 141-146 318 ABC wpływu nikotyny na transportery leków ABC wpływu nikotyny na transportery leków Streszczenie Transportery leków to białka zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej, odgrywające ważną rolę w utrzymaniu homeostazy oraz ochronie komórek przed szkodliwym działaniem ksenobiotyków. Ich głównym zadaniem jest przenoszenie szkodliwych substancji do środowiska zewnątrzkomórkowego. Nikotyna jest istotnym składnikiem tradycyjnych papierosów, e-papierosów oraz preparatów wspomagających zerwanie z nałogiem. Wykazano, że nie jest ona substratem dla transporterów, jednakże wywiera hamujący wpływ na niektóre z nich, np. OCTN1 i OCTN2. Ogranicza transport aminokwasów poprzez łożysko zależny od białek z nadrodziny SLC mający znaczenie dla prawidłowego rozwoju płodu. Z drugiej strony, poddanie komórek Caco-2 działaniu nikotyny wykazało wzrost ekspresji MDR1. Badania nad wpływem nikotyny na białko BCRP wskazują, że może ona powodować zwiększenie aktywność transportera. Prawdopodobnie mechanizm działania nikotyny na transportery leków jest pośredni, poprzez wpływ na syntezę białek transportowych. Skutkiem zwiększonej aktywności transporterów może być zmniejszona ekspozycja komórek na związki egzogenne, ale też zwiększona lekooporność. Tak więc, nikotyna może zakłócać fizjologiczne działanie transporterów modyfikując efekty terapeutyczne leków. Słowa kluczowe: nikotyna, transportery leków, biodostępność leków ABC of influence of nicotine on drug transporters Abstract Membrane drug transporters are proteins that are crucial for the homeostasis maintenance and protection of cells from toxic influence of xenobiotics. Their main role is the transport of potentially hazardous substances through the membrane to the extracellular space. Nicotine is an important ingredient of traditional cigarettes, e-cigarettes and substances used to help to quit nicotine addiction. It has been proven that it is not a substrate for the transporters. However, it has an inhibiting effect on some of them, for example OCTN1 and OCTN2. Nicotine significantly decreases transport of amino acids, which relies on proteins from SLC superfamilyand is responsible for the normal development of the foetus, through the placental barrier. On the other hand,Caco-2 cells under nicotine exposure show an increased MDR1 transporter protein expression. Results of the researches which main target was nicotine influence on BCRP drug transporter protein state that it can cause increased transporter’s activity. Probably a mechanism of nicotine interaction with drug transporter proteins is indirect- for example through an influence on their expression in the membrane. Higher drug transporter protein's activity leads to a lesser exposure to exogenous compounds as well as increased drug resistance. In conclusion, nicotine may interfere with physiological action of drug transporter proteins and modify the therapeutic effect of drugs on an organism. Key words: nicotine, drug transporters, drug bioavailability 319 Ewelina Cholewińska1, Katarzyna Ognik2, Anna Stępniowska3 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie 1. Wstęp Obyczaj zbierania w lesie grzybów jest głęboko zakorzeniony w kulturze europejskiej. Mimo, iż grzyby cechują się wysoką zawartością wody, a tym samym są niskokaloryczne i ubogie w makroskładniki, ze względu na swoje walory smakowe oraz zawartość znacznych ilości witamin (szczególnie witaminy C i witamin z grupy B) oraz mikroelementów (m.in. K, P, Mg, Zn, Cu, Mn, S i łatwo przyswajalnego Fe) do chwili obecnej stanowią ważny element jadłospisu człowieka [1]. Niestety z racji, iż niektóre gatunki grzybów mogą zawierać w swoim składzie różnorodne substancje czynne (m.in. cykopeptydy, orellanina czy gyromitryna) oddziałujące toksycznie na organizm człowieka, zbieranie i spożywanie ich przedstawicieli może przynieść więcej szkody niż pożytku. W samej tylko Polsce ilość zatruć grzybami szacuje się na ok. 100 przypadków rocznie. Do większości z nich dochodzi od maja do października, co spowodowane jest okresową wegetacją grzybów. Na częstość zatruć niewątpliwie wpływa także urodzaj grzybów w danym sezonie [2]. W zależności od rodzaju i ilości spożytych grzybów zarówno same objawy zatrucia jak również ich nasilenie mogą być bardzo zróżnicowane. Niezmiernie ważne jest zatem by możliwie jak najszybciej rozpoznać dane zatrucie oraz wprowadzić odpowiednie leczenie, zmniejszające tym samym ryzyko powikłań – niejednokrotnie dramatycznych w skutkach [3]. Celem pracy było więc przedstawienie wybranych grzybów trujących najczęściej mylonych z gatunkami jadalnymi oraz mechanizmów działania wybranych toksyn grzybowych. Omówiono także zagadnienia związane z diagnostyką i aktualnie stosowanymi procedurami leczenia zatruć spowodowanych spożyciem muchomora sromotnikowego. 1 [email protected], Katedra Biochemii i Toksykologii, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, http://www.up.lublin.pl 2 [email protected], Katedra Biochemii i Toksykologii, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, http://www.up.lublin.pl 3 [email protected], Katedra Biochemii i Toksykologii, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, http://www.up.lublin.pl 320 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie 2. Przegląd wybranych grzybów trujących oraz grzybów jadalnych, z którymi są one mylone Szacuje się, że na całym świecie istnieje ponad 5000 gatunków grzybów owocnikowych, jednak ze względu na obecność silnych toksyn, znaczna ich część nie nadaje się do spożycia. Na obszarze Polski spotkać można aż 35 gatunków wywołujących silne zatrucia pokarmowe, jednak spożycie tylko kilku z nich może doprowadzić do zgonu [4]. Osobom hobbystycznie zbierającym grzyby zdarza się mylić gatunki jadalne z grzybami o silnych właściwościach trujących [2]. Pomyłki te wynikają przede wszystkim z morfologicznego podobieństwa owocników poszczególnych gatunków, utrudniającego ich identyfikację, jak również zbliżonego okresu ich wegetacji [5, 6]. Do największej ilości zatruć na obszarze Polski dochodzi wskutek przypadkowego spożycia muchomora sromotnikowego (Amanita phalloides) spotykanego w okresie od lipca do września na terenie wilgotnych lasów liściastych i mieszanych. Pierwotnie dzwonkowato-wypukły kapelusz grzyba z wiekiem staje się coraz bardziej płaski i przyjmuje oliwkowozieloną barwę. Po jego spodniej stronie znajdują się gęste, białe blaszki. Początkowo pokrywa je błoniasta tkanka, która podczas uwolnienia zarodników ulega przerwaniu, a pozostałością po niej jest swoisty dla muchomorów błoniasty, nieprzesuwalny pierścień ulokowany w górnej części długiego i smukłego trzonu otoczonego u podstawy charakterystyczną pochewką. Muchomor sromotnikowy ze względu na znaczne podobieństwo wizualne najczęściej bywa mylony z jadalną gąską zielonką (Tricholoma equestre), czubajką kanią (Macrolepiota procera) czy gołąbkiem zielonawym (Russula virescens) [2, 7]. Niedoświadczeni grzybiarze podczas grzybobrania powinni zatem zwrócić szczególną uwagę na kilka charakterystycznych cech poszczególnych gatunków pozwalających na ich rozróżnienie. Tak więc za szczególną cechę gąski zielonki należy uznać przede wszystkim jaskrawożółte, cienkie i gęste blaszki, które w przypadku muchomora są białe i mniej zbite [8]. Z kolei zbierając młode okazy gołąbka zielonawego powinno się dokładnie obejrzeć ich trzony – muchomor sromotnikowy u nasady trzonu posiada bulwę z pochwą, której brak jest u gołąbka zielonawego. Czubajka kania natomiast mylona jest z muchomorem sromotnikowym co spowodowane jest tym, że oba gatunki posiadają charakterystyczny pierścień wokół trzonu. Nie mniej jednak fałdy te różnią się znacznie między sobą umożliwiając identyfikację obu grzybów – w przeciwieństwie do nieprzesuwalnego pierścienia muchomora sromotnikowego, pierścień czubajki kani jest ruchomy i daje się łatwo przesuwać wzdłuż trzonu [9]. 321 Ewelina Cholewińska, Katarzyna Ognik, Anna Stępniowska Kolejnym grzybem wywołującym liczne zatrucia jest piestrzenica kasztanowata (Gyromitra esculenta). W Polsce spotkać ją można od marca do maja w lasach sosnowych niżu i w niższych piętrach górskich. Gatunek ten charakteryzuje się brązowawą, nieregularną i mózgowatopofałdowaną główką osadzoną na krótkim, brudnobiałym i nieregularnym trzonie. Niedoświadczonym grzybiarzom najczęściej zdarza się mylić piestrzenicę ze smardzem jadalnym (Morchella esculenta) [8]. Nie mniej jednak i w tym przypadku istnieje kilka cech charakteryzujących oba grzyby i umożliwiających ich rozróżnienie – główka smardza posiada strukturę jamkowatą nie zaś mózgowatą jak w przypadku piestrzenicy, ponadto jest ona bardziej stożkowata i jaśniejsza (beż, ochra) [10]. Omawiając trujące gatunki grzybów nie należy zapominać o krowiaku podwiniętym (Paxilus involutus) powodującym szereg zatruć w okresie od lipca do października. Grzyb ten zwany potocznie olszówką, spotkać można w wilgotnych lasach zarówno liściastych jak i iglastych. Charakteryzuje się on okrągławym kapeluszem o silnie podwiniętych brzegach i zróżnicowanej barwie – od żółto-, beżowo-, czerwonobrązowej, oliwkowej do szarobrunatnej. Po jego spodniej stronie zlokalizowane są oliwkowe lub beżowo brązowe blaszki. Trzon zwykle przybiera barwę kapelusza (niekiedy nieco jaśniejszą) i jest stosunkowo krótki (3-5 cm), cylindryczny oraz zwężony u nasady. Krowiak podwinięty ze względu na podobną kolorystykę oraz charakterystycznie podwinięte brzegi kapelusza bywa często mylony z rydzem jadalnym (Lactarius deliciosus). Istotną różnicę pozwalającą na rozróżnienie obu gatunków stanowi jednak fakt, iż rydz wydziela pomarańczowe mleczko, zieleniejące wskutek uszkodzenia grzyba, z kolei u krowiaka podwiniętego nie obserwuje się tej cechy [11]. Pomimo braku prostych, ujednoliconych sposobów pozwalających na odróżnienie grzybów jadalnych od trujących, podczas grzybobrania warto kierować się pewną zasadą. Mianowicie większość gatunków trujących to grzyby blaszkowate. Jedyny wyjątek stanowią borowiki (np. borowik szatański) będące przedstawicielami grzybów rurkowych. Dlatego też celem zminimalizowania ryzyka wystąpienia zatrucia należy zbierać i spożywać przede wszystkim okazy posiadające po spodniej stronie kapelusza charakterystyczną gąbkę, nie zaś blaszki [12]. 3. Zatrucia grzybami Jak już wspomniano zatrucia grzybami spowodowane są obecnością w nich różnorodnych toksyn. W naszej szerokości geograficznej śmiertelnie trujące grzyby zawierają przede wszystkim anatoksyny. Najpowszechniej przytaczanym przykładem grzyba zawierającego znaczne ilości tej toksyny jest muchomor sromotnikowy, którego spożycie stanowi 322 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie przyczynę aż 90-95% wszystkich śmiertelnych zatruć grzybami. Według dostępnych danych statystycznych śmiertelność w tym przypadku wynosi ok. 30% [7, 13]. Bardzo często do zgonu dochodzi również wskutek zatrucia grzybami zawierającymi orellaninę i kortinaryny (do 15% pacjentów), wśród których jako przedstawicieli wymienić należy przede wszystkim zasłoniaka rudego (Cortinarius orellanus) oraz inne gatunki z tego rodzaju. Kolejnymi grzybami powodującymi śmiertelne zatrucia są okazy zawierające gyromitrynę (do 14% przypadków zgonów wśród zatrutych). Przedstawicielem tej grupy jest piestrzenica kasztanowata (Gyromitra esculenta) oraz niektóre gatunki jej pokrewne. Zatrucia mogą być wywoływane również przez muskarynę znajdującą się w grzybach z rodzaju lejkówka i strzępiak. Z kolei koprina – toksyna charakterystyczna dla czernidłaka atramentowego (Coprinus atramentarius), jedynie w skrajnych przypadkach – uzależnionych od dawki i indywidualnej odporności organizmu, powoduje zatrucia kończące się śmiercią [13]. Podstawowym kryterium podziału zatruć grzybami jest czas pojawienia się pierwszych objawów ich szkodliwego działania. Tak więc wyróżnia się: zatrucia o krótkim okresie utajenia – w których objawy kliniczne występują zwykle od 0,5 do 4 godzin od spożycia grzyba. Szybko pojawiające się zaburzenia żołądkowo-jelitowe świadczą przeważnie o zatruciu grzybami nie powodującymi uszkodzeń narządowych. Do grzybów wywołujących ten rodzaj zatruć należy m.in. strzępiak ceglasty, lejówka odbielona czy czernidłak pospolity. zatrucia o długim okresie utajenia – w których pierwsze objawy żołądkowo-jelitowe pojawiają się po ponad 6 godzinach od momentu spożycia grzybów i wskazują one zazwyczaj na duże prawdopodobieństwo uszkodzeń narządowych. Wśród grzybów powodujących zatrucia, o długim okresie utajnia wymienia się m.in. muchomora sromotnikowego, zasłoniaka rudego czy piestrzenicę kasztanowatą [12]. 4. Właściwości i działanie najważniejszych toksyn grzybowych Zróżnicowane objawy i skutki zatruć uzależnione są w dużej mierze od warunków wzrostu oraz cech genetycznych grzyba [5, 7], jednakże największy wpływ na te parametry zdaje się mieć toksyczność obecnych w nich substancji czynnych, takich jak: cyklopeptydy, orellanina, gyromitryna i koprina [14]. Obecność cyklopeptydów stwierdzono w 35 gatunkach grzybów – w tym w 10 gatunkach muchomorów, 9 gatunkach hełmówek i 16 gatunkach czubajeczek. Wśród cyklopeptydów wyróżnia się trzy grupy toksyn: termostabilne, odporne na gotowanie amatoksyny (m.in. α, β, γ, δ i ε amanityna, amanina i amaninamid) i fallotoksyny (m.in. falloidyna 323 Ewelina Cholewińska, Katarzyna Ognik, Anna Stępniowska i falloina) oraz wirotoksyny (m.in. wiroidyna i deoksywiroidyna), których toksyczności wobec ludzi jak dotąd nie udowodniono [7, 15, 16]. Największe znaczenie spośród wszystkich cyklopeptydów zdecydowanie mają amatoksyny, stanowiące ok. 60% substancji szkodliwych muchomora sromotnikowego [7]. Szacuje się, że toksyczna dla człowieka dawka amanityny wynosi około 0,1mg/kg m.c. [16, 17]. Związki tej grupy przyjęte drogą doustną szybko ulegają wchłonięciu i już po ok. 1,5 do 2 godzin przenikają do moczu, z którym w głównej mierze są wydalane z organizmu. Cyklopeptydy podlegając krążeniu jelitowo-wątrobowemu są także w niewielkim stopniu wydalane wraz z żółcią. Proces ten trwa ok. 2-3 dni [16, 17]. Głównym organem, w którym kumulują się amatoksyny jest wątroba. Alfa-amanityna uszkadza komórki różnych tkanek – w szczególności jądra hepatocytów, komórki kanalików nerkowych i przewodu pokarmowego oraz limfocyty. Toksyczność alfa-amanityny spowodowana jest przede wszystkim blokowaniem przez nią polimerazy II RNA, poprzez nieodwracalne połączenie skutkujące degradacją jej największą podjednostki RPB 1. Prowadzi to do zahamowania transkrypcji, a tym samym zablokowania syntezy zarówno białek strukturalnych jak i enzymatycznych, skutkując przyśpieszoną śmiercią komórek [18]. Alfa-amanityna hamuje także aktywność enzymu antyoksydacyjnego – katalazy, zwiększając tym samym syntezę wolnych rodników [7] oraz prawdopodobnie wykazuje synergistyczne działanie z endogennymi cytokinami (np. TNF) indukując apoptozę i uszkodzenie komórki. Ostatecznym skutkiem działania toksyny jest martwica wątroby [17]. Fallotoksyny cechuje natomiast szybsze i jednocześnie mniej szkodliwe działanie na organizm w porównaniu do anatoksyn. Nie mniej jednak mogą one spowodować śmierci w ciągu 2 do 5 godzin (LD50 wynosi 2-3mg/kg, ale tylko wtedy, gdy są wstrzykiwane). Fallotoksyny odpowiedzialne są za ostry nieżyt żołądkowo-jelitowy charakterystyczny dla zatrucia muchomorem sromotnikowym. Toksyny te słabo wchłaniają się z przewodu pokarmowego, dlatego też ich działanie w główniej mierze dotyczy nabłonka jelitowego. Fallotoksyny mogą także silnie uszkadzać wątrobę, jednak by do tego doszło muszą dostać się do niej drogą pozajelitową. Najsilniejsza spośród fallotoksyn – falloidyna może także uszkadzać nerki oraz błony komórek wątrobowych, wpływając na cykliczne procesy polimeryzacji i depolimeryzacji poprzez stabilizację aktyny F. Ze względu na silne powinowactwo do mikrosomów komórek wątrobowych falloityna może mieć związek z poszerzaniem siateczki śródplazmatycznej, obrzmieniem mitochondriów czy odkładaniem się kropel tłuszczu w wątrobie prowadząc do stłuszczenia tego narządu. Silnymi właściwościami toksycznymi cechują się także metabolity fallotoksyn [7]. 324 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie Kolejna toksyna – orellanina, została wykryta w niektórych gatunkach grzybów z rodzaju zasłoniak (Continarius). Główny przedstawiciel – zasłonak rudy zawiera około 14 mg toksyny w 1g suchej masy, przy czym dawka śmiertelna dla człowieka została oszacowana na 100-200 g świeżych grzybów. Zawartość orellaniny w owocnikach grzybów nie zmniejsza się nawet po poddaniu ich obróbce termicznej takiej jak gotowanie, mrożenie czy suszenie. Orellanina wchłonięta z przewodu pokarmowego szybko rozprzestrzenia się po organizmie i jest następnie wychwytywana przez nabłonek kanalików nerkowych, stanowiący docelowe miejsce toksycznego działania. Toksyna ta jest niewykrywalna we krwi i moczu już po 2 dniach od spożycia natomiast w nerkach potrafi utrzymywać się nawet powyżej 60 dni. Mechanizm jej toksycznego działania nie jest do końca poznany. Najprawdopodobniej jest on związany z nadmierną produkcją wolnych rodników tlenowych, która skutkuje obniżeniem stężenia naturalnych antyoksydantów, tj. glutationu i kwasu askorbinowego w organizmie człowieka. W trakcie przemiany orellaniny do orelliny powstają także anionorodniki chinonowe, które wiążąc się kowalencyjnie z elementami komórkowymi nerek, skutkują martwicą kanalików nerkowych, śródmiąższowym zapaleniem oraz włóknieniem tego narządu [16]. Gyromitryna (N-metylo-N-formylohydrazon aldehydu octowego) występuje natomiast w niektórych grzybach z rodziny krążkownicowatych m.in. piestrzenicy kasztanowatej (Gyromitra esculenta). Jest ona lotną, rozpuszczalną w wodzie substancją stąd też, jej zawartość w potrawie grzybowej można obniżyć poprzez kilkakrotne podgotowywanie połączone z podmianą wody. Tak więc prawidłowe przygotowanie tego grzyba nie powinno zagrażać zdrowiu. Nie mniej jednak zdarzały się przypadki zatruć zarówno w wyniku picia wody po gotowaniu grzybów, jak i podczas wdychania par z gotującej się potrawy grzybowej. Po przyjęciu doustnym gyromitryna jest najczęściej szybko hydrolizowana w żołądku do N-metyloN-formylohydrazyny (MFH), a następnie do monometylohydrazyny (MMH). Może także zostać zmetabolizowana w wątrobie przy udziale enzymów mikrosomalnych cytochromu P-450 prowadzących do wytworzenia wysoce reaktywnych nitrozoamidowych produktów pośrednich. Gyromitryna oddziałuje przede wszystkim na ośrodkowy układ nerwowy (OUN), w którym jej metabolit – MMH hamuje powstawanie kwasu aminomasłowego (GABA) prowadząc do wystąpienia drgawek [19]. Gyromitryna i MFH w wątrobie ulegają oksydacji podczas której powstają pochodne nitrozo amidowe. Końcowe produkty metabolizmu toksyny uszkadzają komórki wątrobowe i mogą prowadzić do martwicy i niewydolności narządu. Wzmożona produkcja wolnych rodników skutkuje także wystąpieniem stresu oksydacyjnego, który przewyższa 325 Ewelina Cholewińska, Katarzyna Ognik, Anna Stępniowska możliwości mechanizmów antyoksydacyjnych utrzymujących żelazo zawarte w hemoglobinie na +2 stopniu utleniania. Żelazo (Fe3+) ulega nadmiernym procesom utleniania i tworzy się methemoglobina, niezdolna do transportu tlenu [16]. MFH jest także odpowiedzialna za niekompetycyjnie blokowanie histaminazy czego skutkiem jest nadmiar histaminy i związane z tym objawy takie jak m.in. kurczowe bóle brzucha, nudności, biegunka, bóle głowy czy zaczerwienienie skóry [16, 19]. Koprina z kolei jest aminokwasem występującym u wielu gatunków czernidłaków (Coprinus) np. czernidłaku kołpakowatym. Niektóre z nich są uważane za gatunki jadalne, a objawy toksyczne w postaci reakcji disulfiramopodobnej występują tylko w koincydencji ze spożyciem alkoholu [16]. Gdy alkohol zostanie spożyty w czasie krótszym niż 30 min przed lub do 72 godzin po spożyciu czernidlaka, koprina prowadzi do zablokowania aktywności dehydrogenazy aldehydowej, uniemożliwiając tym samym utlenienie etanolu na etapie aldehydu octowego. Podobne objawy obserwowano po spożyciu innych gatunków grzybów, np. lejkówki buławotrzonowej czy smardza [13]. 5. Diagnostyka zatruć grzybami W przypadku podejrzenia u pacjenta zatrucia grzybami, pierwszym etapem diagnostycznym jest przeprowadzenie z nim szczegółowego wywiadu, a jeśli jest on nieprzytomny – z jego rodziną lub świadkami zdarzenia. Prawidłowo zebrany wywiad powinien uwzględniać zarówno opis objawów dotyczący zatrutego pacjenta, jak i sposobu przygotowywania spożytej potrawy [3]. Wśród informacji, jakie lekarz powinien uzyskać od pacjenta lub jego rodziny należy uwzględnić: rodzaj grzybów, jakie spożył pacjent wraz z możliwie najdokładniejszym ich opisem, środowisko, w którym grzyby zostały zebrane, sposób przygotowania i przechowywania grzybów przed spożyciem, ilość spożytej potrawy, czas, jaki upłynął od momentu spożycia potrawy do wystąpienia pierwszych objawów, oraz od wystąpienia objawów do chwili zgłoszenia się do lekarza [3]. Opisanie sposobu i czasu przechowywania potrawy grzybowej przed jej spożyciem może pozwolić na wykluczenie ewentualnego zatrucia toksynami bakterii rozwijających się na grzybach. Ważną informację stanowi także fakt – czy ktoś poza osobą zatrutą (np. wśród członków rodziny) spożywał grzyby, a nie wykazuje objawów zatrucia [20]. 326 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie Kolejnym krokiem w postępowaniu diagnostycznym jest przeprowadzenie badań mikologicznych oraz zabezpieczenie resztek potrawy, wymiocin i popłuczyn żołądkowych. [3, 15]. Bardzo ważne jest wykonanie badania moczu na obecność toksyn w przypadku podejrzenia zatrucia muchomorem sromotnikowym. W tym celu wykorzystuje się chromatografię cienkowarstwową oraz metody immunoenzymatyczne, np. test Amanitin_ELISA, pozwalający na stwierdzenie amanityn w płynach biologicznych już po kilkudziesięciu minutach od chwili zatrucia [12, 20]. Diagnostyka biochemiczna – m.in. oznaczenie stężenia elektrolitów, zawartości glukozy, cholesterolu, mocznika czy kreatyniny, jest przydatna w rozpoznawaniu i monitorowaniu zmian narządowych wywołanych zatruciem. Z racji, iż amanityna i niektóre inne toksyny wykazują powinowactwo do hepatocytów, powodując zmiany w mitochondriach i rybosomach tych komórek – niezwykle istotne jest określenie wskaźników wątrobowych – aktywności aminotransferaz (ASPAT, ALAT, GLDH) oraz wskaźnika protrombinowego Quicka (lub INR) [20]. Po upływie doby od zatrucia obserwuje się stopniowy wzrost poziomu biochemicznych wskaźników funkcji wątroby, m.in. aminotransferazy alaninowej (AlAT) i aminotransferazy asparaginianowej (AspAT) oraz poziomu bilirubiny, co sugeruje postępujące uszkodzenie wątroby. Pomimo, że zarówno AspAT i ALAT biorą udział w przemianach aminokwasów i odpowiadających im ketokwasów, wartości tych parametrów różnią się między sobą. Jest to spowodowane ich odmiennym rozmieszczeniem w komórkach wątroby – AspAT wykazuje aktywność głównie w mitochondriach, natomiast ALAT – w cytoplazmie [12, 20]. Kolejnym badaniem wykonywanym u pacjentów zatrutych grzybami jest określenie aktywności GGTP (gamma-glutamylotranspeptydaza) oraz GLDH (dehydrogenaza glutaminianowa). Enzymy te biorą udział w przemianach białek. Podobnie jak w przypadku AspAT i ALAT, ich poziom wzrasta w chorobach wątroby i dróg żółciowych [20]. Bardzo czułym i uważanym za najlepszy parametr monitorowania przebiegu zatrucia jest wskaźnik protrombinowy. Stanowi odsetek wartości czasu protrombinowego osocza badanego do wartości czasu protrombinowego osocza prawidłowego. Jest to wystandaryzowany współczynnik czasu protrombinowego umożliwiający porównywalność wyników. Objawem choroby jest wydłużenie czasu protrombinowego i wskaźnika INR. U chorych z umiarkowanym i ciężkim zatruciem jego najniższe wartości obserwuje się od 3-4 doby do momentu intoksykacji [21, 22, 23]. W niektórych zatruciach istotne są także badania wskaźników nerkowych – zawartość kreatyniny we krwi. Wzrost jej wartości następuje, gdy uszkodzone zostaje powyżej 50% czynnych nefronów w nerce, stąd też parametr ten nie jest czułym wskaźnikiem wczesnego rozpoznawania chorób nerek [2]. 327 Ewelina Cholewińska, Katarzyna Ognik, Anna Stępniowska 6. Objawy zatrucia grzybami na przykładzie muchomora sromotnikowego (Amanita phalloides) Rodzaj i nasilenie objawów zatrucia zależą przede wszystkim od cech indywidualnych pacjenta oraz od ilości spożytych grzybów. Najbardziej nasilone symptomy intoksykacji obserwowane są u dzieci – aż 50% takich przypadków kończy się śmiercią. Objawy działania toksycznego substancji zawartych w grzybach dotyczą najczęściej zaburzeń pracy przewodu pokarmowego, a w ciężkich przypadkach także uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego, wątroby i nerek [14]. Najbardziej nasilone i przykre objawy chorobowe spośród wszystkich zatruć grzybami wydaje się mieć intoksykacja muchomorem sromotnikowym. Wymaga ona wyjątkowo sprawnej diagnostyki i natychmiastowego leczenia. [22]. Po wielogodzinnym (8-24 h) okresie bezobjawowym, następuje faza jelitowa, charakteryzująca się objawami takimi jak: nudności, stale nawracające wymioty, bóle brzucha, wodnista i obfita biegunka. W konsekwencji już w krótkim czasie dochodzi do utraty znacznej ilości płynów, prowadzącej do odwodnienia oraz zaburzeń gospodarki elektrolitowej. W bardzo ciężkich przypadkach zatrucia nierzadkim objawem jest wstrząs hipowolemiczny z towarzyszącą tachykardią. Opisywane objawy żołądkowo-jelitowe utrzymują się przeważnie od jednego do trzech dni.. W 3-5 dobie zatrucia pojawia się faza poprawy stanu pacjenta. W tym okresie (zwłaszcza u pacjentów leczonych) występuje pozorna poprawa – ustępują bóle brzucha, nudności i wymioty. Dominują natomiast objawy wynikające z uszkodzenia hepatocytów i zaburzeń czynności wątroby – powiększona wątroba i stopniowo narastająca żółtaczka. Równocześnie stwierdza się biochemiczne cechy uszkodzenia wątroby – podwyższony poziom bilirubiny oraz wzrost aktywności aminotransferaz – szczególnie ALAT w surowicy krwi. Ostatnia faza – wątrobowa pojawia się w 5.-7. dobie zatrucia. W bardzo ciężkich przypadkach dochodzi do piorunującego zapalenia wątroby, a u ok. 15% pacjentów występuje śpiączka wątrobowa, którą poprzedza narastająca senność i apatia lub przeciwnie – silne pobudzenie psychoruchowe. W okresie przedśpiączkowym dochodzi do pogorszenia funkcji ośrodkowego układu nerwowego, pojawiają się nasilające w czasie zaburzenia świadomości. Śpiączce wątrobowej często towarzyszą zaburzenia termoregulacji (hipertermia) i krążeniowo- oddechowe. Dodatkowo pojawiająca się niewydolność nerek zdecydowanie obniża rokowania dotyczące stanu zatrutego pacjenta. W ciężkich przypadkach zatruć zgon następuje najczęściej między 6, a 16. dniem od intoksykacji. Zwykle spowodowany jest nieodwracalnymi zmianami wielonarządowymi oraz powikłaniami w postaci skazy krwotocznej i wykrzepienia wewnątrznaczyniowego [7, 24]. 328 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie 7. Leczenie zatruć grzybami na przykładzie muchomora sromotnikowego (Amanita phalloides) Leczenie zatrucia amatoksyną nastręcza trudności ze względu na kilkufazowy obraz kliniczny oraz zgłaszanie się pacjentów do lekarza w różnym czasie, często odległym, od spożycia grzyba. Ponadto nie jest znane specyficzne antidotum i stąd brak jest uznanych standardów terapeutycznych [24]. Leczenie zatrucia muchomorem sromotnikowym obejmuje szereg procedur, spośród których istotne znaczenie ma szybkie usunięcie toksyn, blokowanie wnikania amatoksyn do komórki wątrobowej, wyrównywanie ogólnoustrojowych zaburzeń metabolicznych, pozaustrojowe podtrzymywanie funkcji wątroby, a w określonych przypadkach przeszczepienie wątroby [7, 25]. W celu eliminacji toksyn i obniżenia ich stężenia w ustroju zastosowanie mają zarówno metody zachowawcze, jak i zabiegowe. Do metod zachowawczych należą przede wszystkim: prowokacja wymiotów, płukanie żołądka z węglem aktywowanym, wlewy czyszczące z dodatkiem laktulozy czy stosowanie środków przeczyszczających. W celu wtórnej detoksyfikacji stosuje się wymuszoną diurezę przy użyciu mannitolu i dwuwęglanu sodu, dzięki której można usunąć do 60-80% amanityny zawartej w moczu w ciągu pierwszych 2 godz. Do 4 doby od zatrucia zastosowanie znajduje sondowanie i odsysanie treści dwunastniczej skutkujące przerwaniem krążenia wątrobowojelitowego toksyny [7, 25]. Lekami powszechnie stosowanymi w zatruciu muchomorem sromotnikowym są benzylopenicylina (penicylina G), silimaryna i N-acetylocysteina [26]. Zatrucie muchomorem sromotnikowym powoduje ciężkie koagulopatie, w związku z czym konieczne jest jednocześnie zwalczanie zaburzeń hemostazy, poprzez stosowanie osocza świeżego, mrożonego i witaminy K podawanej dożylnie oraz intensywne wyrównywanie zaburzeń gospodarki wodno-elektrolitowej i równowagi kwasowo-zasadowej wywołanej utratą płynów przez przewód pokarmowy [7, 25]. W celu eliminacji toksyny z organizmu zastosowanie znajdują również metody zabiegowe. W Polsce dostępne są aktualnie dwa systemy pozaustrojowego podtrzymywania funkcji wątroby (Extracorporeal Liver Support – ELS): MARS (Molecular Adsorbents Recirculating System) oraz FPSA (Fractionated Plasma Separation and Adsorption) [27, 28]. MARS pozwala na wybiórczą eliminację toksyn z krwi chorych z niewydolnością wątroby. Zapewnia podtrzymanie i stabilizację funkcji wątroby. Proces ten umożliwia usuwanie zarówno toksyn związanych z albuminami (niewydolność wątroby), jak i rozpuszczonych w wodzie (niewydolność nerek). Zaletę MARS stanowi brak bezpośredniego kontaktu krwi pacjenta i adsorbentów. Metoda ta jest skuteczna w usuwaniu związków takich jak m.in.: bilirubina, kwasy żółciowe, aminokwasy 329 Ewelina Cholewińska, Katarzyna Ognik, Anna Stępniowska aromatyczne, kwasy tłuszczowe (za wyjątkiem długołańcuchowych kwasów tłuszczowych), amoniak, kreatynina czy mocznik. Dodatkową zaletą dializy albuminowej MARS jest, więc równoczesne wyrównywanie zaburzeń wodno-elektrolitowych i metabolicznych [27]. Do technik pozaustrojowej eliminacji trucizn wykorzystywanych w leczeniu zatrucia grzybami należy również wprowadzona w 1999 roku FPSA. W metodzie tej albuminy z krwi są filtrowane przez polisulfonową błonę filtracyjną do obwodu wtórnego. W nim bogate w albuminy osocze jest przepuszczane przez kolumny wymienników anionowych, na których zachodzi bezpośrednia absorpcja toksyn. FPSA nie może być jednak stosowany u dzieci, między innymi z powodu zbyt dużej objętości krwi niezbędnej do wypełnienia układu drenów [23, 28]. Połączenie FPSA z następczą konwencjonalną hemodializą, mające na celu usunięcie z krwi rozpuszczalnych w wodzie toksyn, doprowadziło do rozwoju metody zwanej systemem „Prometheus”. System ten skutecznie zmniejsza stężenie bilirubiny, kwasów żółciowych i aromatycznych aminokwasów, nie wpływając na stężenie fibrynogenu [28]. Liczba i czas trwania zabiegu uzależnione są od aktualnego stanu pacjenta oraz wyników badań dodatkowych [7, 23]. Przebieg i rokowanie w przypadku zatrucia grzybami uzależnione są przede wszystkim od ilości spożytej toksyny, wieku oraz ogólnego stanu zdrowia i odżywienia pacjenta, równowagi hormonalnej jak również czasu rozpoczęcia właściwego, kompleksowego leczenia. Najgorsze rokowania dotyczą zatruć późno objawowych, gdyż toksyny nie zostają wydalone w początkowej fazie zatrucia i krążąc w organizmie prowadzą do ciężkich uszkodzeń narządowych. Nie mniej jednak dzięki nowoczesnym i stosunkowo skutecznym metodom leczniczym wdrażanym w wyspecjalizowanych ośrodkach medycznych udaje się z wysokim powodzeniem leczyć zatrucia wieloma grzybami [23]. 8. Podsumowanie Zbieranie i spożywanie grzybów wymaga zachowania szczególnej ostrożności. Znaczne podobieństwo morfologiczne niektórych gatunków jadalnych i trujących może bowiem prowadzić do pomyłek skutkujących wystąpieniem ciężkiego zatrucia, a nawet śmierci. Diagnostyka zatruć grzybami opiera się na przeprowadzeniu wywiadu z poszkodowanym lub świadkiem zdarzenia, wykonaniu analiz mikologicznych resztek potrawy lub treści pokarmowej pobranej od pacjenta, a także oznaczeniu wybranych biochemicznych parametrów krwi mogących świadczyć o uszkodzeniu narządów wewnętrznych. Leczenie zatruć toksynami grzybowymi ze względu na często dość długi okres bezobjawowy oraz brak ujednoliconych 330 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie procedur diagnostycznych i uniwersalnego antidotum jest znacznie utrudnione. Wykorzystuje ono metody zachowawcze (m.in. prowokacja wymiotów i płukanie żołądka) jak również zabiegowe (MARS i FPSA). Podsumowując należy stwierdzić, iż niezbędne jest prowadzenia dalszych badań naukowych mających na celu udoskonalenie metod diagnostycznych i procedur leczniczych zatruć grzybami, pozwalających z jeszcze większą skutecznością ratować życie i zdrowie ludzi poszkodowanych w wyniku spożycia trujących owocników. Niezmiernie ważne jest także prowadzenie działań mających na celu zwiększenie świadomości odnośnie niebezpieczeństwa jakie niesie za sobą spożywanie nieznanych gatunków grzybów. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Rajewska J., Bałasińska B. Związki biologicznie aktywne zawarte w grzybach jadalnych i ich korzystny wpływ na zdrowie, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 58 (2004), s. 352-357 Prokopowicz D., Panasiuk B., Kranc R. H. Zatrucia grzybami – problem epidemiologiczny, Gabinet Prywatny, 6-7 (2006), s. 33-35 Szczepanek M., Bogdał J. Diagnostyka laboratoryjna w rozpoznawaniu, monitorowaniu przebiegu i rokowaniu zatruć grzybami, Badanie i Diagnoza, 9 (2003), s. 33-36 Głowacki S. Znaczenie gospodarcze i rekreacyjne dolnych warstw lasu, Leśne Prace Badawcze, 3 (2006), s. 99-114 Erden A., Esmeray K. Acute liver failure caused by mushroom poisoning: a case report and review of the literature, International Medical Case Reports Journal, 6 (2011), s. 85-90 Zuber A., Kowalczyk M. Methods used in species identification of hallucinogenic and other poisonous mushrooms in forensic investigations, Problems of Forensic Sciences, 86 (2011), s. 151-161 Ferenc T., Łukasiewicz B. Zatrucia muchomorem sromotnikowym (Amanita phalloides,. Medycyna Pracy, 60 (2009), s. 415-426 Gerhardt E. Przewodnik grzyby, Mulico, Warszawa 2004 Evans S., Kibby G. Kieszonkowy atlas grzybów, Dorling Kindersley, (2007) Flück M. Atlas grzybów oznaczania, zbiór, użytkowanie, Delta W-Z, Warszawa 2002 Panasiuk L. Zatrucia grzybami, Medycyna Rodzinna., 2 (1999), s. 41-48 Brandys J. Toksykologia wybrane zagadnienia, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków (1999), s. 145-153 Grzywnowicz K. Grzyby i ludzie czyli od etnomykologii do mykotechnologii, Wydawnictwo UMCS, Lublin (2012), s. 22-27 Wiąckowski S. Toksykologia środowiska człowieka, Oficyna Wydawnicza Branta, Bydgoszcz (2010), s. 166-172 Magdalan J. Wpływ leczenia daktynomycyną na przebieg zatrucia αamanityną wywołanego doświadczalnie u myszy i szczurów, Advances in Clinical and Experimental Medicine, 12 (2003), s. 601-606 331 Ewelina Cholewińska, Katarzyna Ognik, Anna Stępniowska 16. Pach J. Zarys toksykologii klinicznej, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków (2009), s. 545 17. Santi L., Maggioli C. Acute Liver Failure Caused by Amanita phalloides Poisoning, International Journal of Hepatology, 2012 (2012) 18. Magdalan J., Pieśniewska M., Gliniak H. Wpływ daktynomycyny na wątrobowy wychwyt α-amanityny w modelu pozaustrojowej perfuzji wątroby szczura, Advances in Clinical and Experimental Medicine, 12 (2003), s.33-36 19. Michelot D., Toth B. Poisoning by Gyromitra esculenta-a review, Journal of Applied Toxicology, 11 (1991), s. 235-243 20. Marciniak B., Ferenc T. Zatrucia wybranymi grzybami o działaniu neurotropowym i halucynogennym, Medycyna Pracy, 61 (2010), s. 583-595 21. Trabulus S., Altiparmak M. R. Clinical features and outcome of patients with amatoxin-containing mushroom poisoning, Clinical Toxicology, 49 (2011), s. 303-310 22. Pawłowska J., Pawlak J. Zatrucie muchomorem sromotnikowym jako wskazanie do transplantacji wątroby u trzech członków rodziny, Wiadomości lekarskie, 59 (2006), s. 1-2 23. Jankowska I., Liberek A. Diagnostyka i leczenie zatrucia muchomorem sromotnikowym, Postępy Nauk Medycznych, 1 (2010), s. 45-50 24. Poucheret P., Fons F. Amatoxin poisoning treatment decision-making: Pharmaco-therapeutic clinical strategy assessment using multidimensional multivariate statistic analysis, Toxicon, 55 (2010), s. 1338-1345 25. Kirchmair M., Carrilho P. Amanita poisonings resulting in acute, reversible renal failure: new cases, new toxic Amanita mushrooms, Nephrology Dialysis Transplantation, 27 (2012), s. 1380-1386 26. Magdalan J., Ostrowska A., Piotrowska A., Gomułkiewicz A., PodhorskaOkołów M, Patrzałek D., Szeląg A., Dzięgiel P. Benzylpenicillin, acetylcysteine and silibinin as antidotes in human hepatocytes intoxicated with α-amanitin, Experimental and Toxicologic Pathology, 62 (2010), s. 367-373 27. Węgrzyn D., Kutwin-Chojnacka A. Dializa albuminowa w systemie MARS – doświadczenia własne, Anestezjologia Intensywna Terapia, 1 (2005), s. 17-20 28. Bergis D., Friedrich-Rust M. Treatment of Amanita phalloides intoxication by fractionated plasma separation and adsorption (Prometheus®), Journal of Gastrointestin and Liver Diseases, 21 (2012), s. 171-176 332 Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie Zatrucia grzybami – objawy, diagnostyka, leczenie Streszczenie Osobom zbierającym grzyby zdarza się mylić gatunki jadalne z grzybami wykazującymi silnie toksyczne działanie. Toksyny grzybowe takie jak m.in. cyklopeptydy, orellanina czy muskaryna, w większości odporne są na obróbkę termiczną stąd liczne przypadki zatruć. Celem pracy było przedstawienie ich objawów, diagnostyki i leczenia. Objawy i skutki zatruć uzależnione są gównie od toksyczności obecnych w grzybach substancji czynnych, a także od indywidualnych cech pacjenta i ilości spożytych grzybów. Toksyny te mogą powodować szereg niekorzystnych zmian w organizmie, m.in. takich jak uszkodzenie narządów – szczególnie wątroby i nerek. Diagnostyka w tym przypadku polega na przeprowadzeniu wywiadu z pacjentem, zbadaniu treści pokarmowej, wykonaniu testów immunoenzymatycznych na obecność toksyny w materiale biologicznym oraz oznaczeniu biochemicznych parametrów krwi świadczących o stopniu uszkodzeniu narządów. Istotny wpływ na pomyślne rokowania w przypadku zatrucia grzybami ma niewątpliwie szybkie włączenie odpowiedniego leczenia, opierającego się na dwóch metodach – zachowawczej (m.in. płukanie żołądka) i zabiegowej (pozaustrojowe podtrzymywanie funkcji wątroby). Śmiertelność w zatruciach grzybami jest zróżnicowana – dla muchomora sromotnikowego wynosi obecnie około 15%. Wobec licznych przypadków zatruć wynikających z pomyłek grzybiarzy, niezwykle ważne jest więc prowadzenie działań mających na celu zwiększenie świadomości odnośnie niebezpieczeństwa jakie niesie za sobą spożywanie nieznanych grzybów. Słowa kluczowe: zatrucie, grzyb, toksyna The mushroom poisoning – symphtoms, diagnostic and treatment Abstract Persons, who collect mushrooms sometimes confuse with edible mushrooms of poisoning mushrooms. Fungal toxins such as cyclopeptids, orellanin or muscarine, most are resistant to heat treatment hence the numerous cases of poisoning. The aim of the study was the present the symptoms, diagnosis and treatment of mushroom’s poisonig. Poisoning symptoms and effects depend mainly on the toxicity of the active substances present in mushrooms, the individual characteristics of the patient and the amount consumed mushrooms These toxins can cause a number of adverse changes in the body, including such as organ damage – particularly the liver and kidneys. Diagnosis in this case involves interviewing the patient, examination of the gastric content, execution enzyme immunoassay for the presence of toxins in biological material and determine biochemical parameters of blond, providing the degree of damage to organs. A significant impact on the successful outcome in the case of mushroom poisoning is undoubtedly quick integration of appropriate treatment, based on two methods – conservative (eg gastric lavage) and surgical (extracorporeal support of liver function). Mortality in fungal poisoning is diverse – the Death Cap is currently about 15%. In view of the numerous cases of poisoning resulting from mistakes mushroom, it is extremely important therefore carrying out activities aimed at increasing awareness of the dangers posed to eating unfamiliar mushrooms. Keywords: poisoning, mushroom, toxin 333 Indeks autorów Bemowska-Kałabun O. ............ 148 Bohacz J. .................................. 111 Budnyk O. ............................ 56, 65 Budzeń M. .................................. 46 Cholewińska E. ........................ 322 Czekaj P. .................................. 305 Dąbrowska A................................ 9 Fabrowska J.............................. 196 Fujarowicz M. .......................... 100 Gębura J. .................................... 56 Gorzelany J................................. 89 Grabek-Lejko D. ...................... 100 Hołyńska-Iwan I. ...................... 245 Iwanowski Ł. ............................ 111 Kamińska K.............................. 125 Kapuścińska A. ........................ 162 Karwan A. ................................ 111 Kasprzak K. .............................. 187 Kędzierska E. ........................... 272 Kluz M. .................................... 100 Kłembokowski A. ..................... 111 Kołodziejczyk-Czepas J. .......... 221 Konieczna M. ........................... 305 Kręcisz M. ................................ 187 Kulik B. .................................... 177 Kupryaniuk K. .......................... 187 Liszewska N. ............................ 111 Łęska B..................................... 196 Magierowicz K. ........................ 136 Marciniec R. ............................... 28 Marczuk P. ............................... 212 Materska M. ............................. 177 Matłok N. ................................... 89 Migut D. ..................................... 89 Nawrocka K. ............................ 125 Nowak A. ................................. 255 Nowak I. ................................... 162 Nowak P. .................................. 221 Ognik K. ................................... 322 Olszak M. ................................... 19 Olszewska-Słonina D. .............. 245 Panek P..................................... 245 Parzymies M. ............................. 77 Poniewozik M. ........................... 77 Potoczny J. ............................... 305 Sieradzka M. ............................ 221 Skowronek M. .......................... 111 Słomski R. ................................ 255 Staszowska-Karkut M. ............. 177 Stawieraj G. .............................. 221 Stępniowska A. ........................ 322 Studnicka A. ............................. 305 Sugier P. ..................................... 65 Szabla M. ................................. 272 Śledziński P. ............................. 255 Śmigała M. ................................... 9 Tchórzewska D. ......................... 28 Waraczewski R. ....................... 177 Wierzbicka M........................... 148 Winiarczyk K. ........................ 9, 56 Wiśniewska A. ......................... 125 Włodarczyk E. .......................... 212 Zeyland J. ................................. 255 Zgórski D.................................. 111 334
