WSTĘP: Przygotowanie preparatu histologicznego jest wieloetapowym, złożonym procesem, którego celem jest uzyskanie trwałego, zabarwionego skrawka tkanki bą dź narzą du o grubości umożliwiającej analizę̨ jego struktury przy użyciu mikroskopu świetlnego. Standardowa grubość skrawka histologicznego wynosi 5-7 μm, niekiedy, zwłaszcza wówczas, gdy wskazane jest dobre zobrazowanie organelli komórkowych sporzą dzane są tzw. preparaty półcienkie o grubości nawet poniżej 1 μm. Pełna procedura wykonania preparatu od chwili pobrania wycinka Żywej struktury aż do momentu zamknię cia go szkiełkiem nakrywkowym trwa od kilku dni (w przypadku standardowych barwień przeglą dowych), aż do kilku miesię cy (m.in. barwienie tkanki kostnej, impregnacja tkanki nerwowej etc.). Wykonane lege artis i przechowywane w odpowiednich warunkach (miejsce ciemne, chłodne i suche) preparaty histologiczne mogą zachować barwny obraz komórek nawet po 100 latach. Metodyka tworzenia preparatów zarówno histologicznych jak i histopatologicznych opiera się zawsze na sekwencji scharakteryzowanych poniżej działań laboratoryjnych. 1. Pobieranie tkanek i utrwalanie Pierwszym etapem w procedurze tworzenia preparatu jest pobieranie materiału tkankowego. Ma to zwykle miejsce podczas sekcji prowadzonych w ramach realizowanych w Zakładzie Histologii prac doświadczalnych. Wszystkie działania eksperymentalne dokonywane są zgodnie ze standardami badań na zwierzę tach, w warunkach anestezji, zawsze po uzyskaniu zgody odpowiedniej komisji bioetycznej. Izolowane są zazwyczaj całe narzą dy małych zwierzą t, czasem konieczne jest pokrojenie pobranego wycinka na mniejsze fragmenty, celem lepszego i szybszego ich utrwalenia. Pewna liczba preparatów powstaje na bazie fragmentów narzą dów ludzkich pozyskiwanych śródoperacyjnie lub sekcyjnie. Natychmiast po pobraniu, wycinek narzą du trafia do płynu utrwalają cego, aby zapobiec wystą pieniu komórkowych zmian nekrotycznych i degeneracyjnych. Za uniwersalny utrwalacz uznawany jest powszechnie 10% wodny roztwór formaldehydu zoboję tnionego wę glanem wapnia. Istnieje jednak cały szereg innych, wieloskładnikowych utrwalaczy (zawierają cych m.in. chloroform, kwas octowy, sole rtę ci i chromu, czterotlenek osmu) szczególnie preferowanych dla określonych tkanek i narzą dów i odpowiednich dla specjalnych technik barwienia preparatów. Najczę ściej stosowane są płyny: Carnoya, Zenkera , „Suza”. Czas utrwalania zależy od rodzaju zastosowanego płynu, rodzaju tkanki oraz wielkości wycinka, zwykle jest nie krótszy niż 12 godzin. Przedłużone utrwalanie nie jest wskazane, może bowiem spowodować kruchość preparatu, konsekwencją zbyt krótkiego czasu jest natomiast nieprawidłowy obraz wielu struktur komórkowych. 2. Odwadnianie i zatapianie preparatu Niemal wszystkie narzą dy ludzkie i zwierzę ce są w przeciwieństwie do tkanek roślinnych obiektami niezwykle mię kkimi, nie istnieje zatem możliwość ich bezpośredniego pokrojenia na bardzo cienkie skrawki. Aby tego dokonać należy zatopić tkankę w twardszym, lecz łatwo skrawalnym i biochemicznie oboję tnym materiale, z których najpowszechniej stosowana jest parafina. W technice histologicznej wykorzystuje się również celoidynę , specjalne żywice organiczne oraz pewne zwią zki polimerowe. Warunkiem prawidłowego zatopienia tkanki w parafinie jest jej przepojenie tym wę glowodorem, które staje się możliwe jedynie po całkowitym usunię ciu wody. Alternatywnym rozwią zaniem umożliwiają cym szybkie krojenie tkanki jest jej zamrożenie przy użyciu kriostatu, wykorzystywane rutynowo do wykonywania preparatów histochemicznych. Ponieważ woda stanowi integralny składnik komórek, zatem gwałtowne odwodnienie tkanki może spowodować ich obkurczenie i uszkodzenie organelli a w konsekwencji zniszczenie preparatu. W tej sytuacji proces odwadniania prowadzony jest stopniowo poprzez umieszczanie tkanki w rozworach etanolu o wzrastają cym stę żeniu w tzw. szeregu odwadniają cym, począ wszy od alkoholu 50% poprzez 70%, 80%, 90%, 96% i bezwodny (absolutny 99,8%) do mieszaniny etanol-ksylen i czystego ksylenu. Kolejny etap zwany przepajaniem, odbywa się w temperaturze 52*C i polega na umieszczeniu tkanki w mieszaninie parafiny z ksylenem a nastę pnie w ciekłej parafinie, w której przebywa kilkanaście godzin. Przepojony skrawek jest nastę pnie zatapiany we wnę trzu bloczka parafinowego, który sporzą dza się , wlewają c porcję parafiny do metalowej formy i wprowadzają c doń fragment tkanki ustawiony w odpowiedniej orientacji przestrzennej. Proces ten może odbywać w sposób czę ściowo zautomatyzowany z wykorzystaniem urzą dzenia do zatapiania/chłodzenia, utrzymują cego stałą temperaturę ciekłej parafiny. 3. Wytwarzanie skrawków i ich naklejanie Zatopiony w bloczku parafinowym obiekt biologiczny jest wraz z nim samym krojony na skrawki ustalonej grubości przy użyciu urzą dzenia histologicznego zwanego mikrotomem rotacyjnym. Mikrotomy te, zarówno klasyczne - rę czne jak i nowoczesne – w pełni automatyczne (fot.2.), to specjalistyczne aparaty tną ce, których zasadniczym elementem jest niezwykle ostry nóż, precyzyjnie ścinają cy bloczek parafinowy, cyklicznie przesuwany przez układ mechaniczny o odcinek rzę du kilku mikrometrów. W wyniku pracy mikrotomu powstają cienkie listki parafiny zawierają ce wewną trz, widoczny makroskopowo skrawek tkanki. Tkanka zamrożona cię ta jest w kriostacie, bę dą cym zasadniczo mikrotomem rotacyjnym, w którym czę ść skrawają ca umieszczona jest wewną trz komory zamrażają cej (fot.2). Skrawki parafinowe są w kolejnym etapie naklejane na uprzednio przygotowane (silanizowane, rzadziej nabiałkowane) szkiełka podstawowe. W pierwszej fazie naklejania, skrawki umieszcza się na powierzchni ciepłej wody wypełniają cej wanienkę (fot.2. po lewej). Pod wpływem podwyższonej temperatury skrawki, począ tkowo pomarszczone rozprostowują się , nabierają c gładkości. W tym momencie delikatnie nacią ga się je na szkiełko podstawowe.Trwałe przyklejenie skrawków uzyskuje się ogrzewają c szkiełka w cieplarce w temperaturze 50*C w ciągu minimum kilku godzin. 4. Nawadnianie i barwienie skrawków Przyklejony do szkiełka podstawowego wycinek tkanki jest przepojony parafiną , zatem w pełni hydrofobowy. W tym stanie nie jest możliwe jego zabarwienie, bowiem wię kszość barwników funkcjonuje w postaci roztworów wodnych. Konieczne jest zatem całkowite usunię cie ze skrawków parafiny a nastę pnie ich nawodnienie. Odparafinowanie odbywa się poprzez umieszczenie szkiełek w 2 zmianach ksylenu, natomiast nawodnienie w szeregu alkoholowym, złożonym podobnie jak szereg odwadniają cy z roztworów etanolu, jednak ustawionych w odwrotnej kolejności, począ wszy od alkoholu absolutnego aż do 70%. Z etanolu skrawki trafiają do wody, ską d mogą być bezpośrednio przeniesione do roztworów barwników. Współczesna technika histologiczna dysponuje wielką liczbą różnorodnych metod barwienia tkanek i narzą dów, pozwalają cych na ukazanie tak ogólnej budowy komórkowej badanego obiektu jak i określonych elementów biostruktury. Własności selektywnego barwienia komórek wykazuje kilkaset naturalnych i syntetycznych substancji. Najważniejszą , rutynowo stosowaną od ponad 150 lat, standardową techniką obrazowania histologicznego jest barwienie hematoksyliną i eozyną (H+E). Jest to tzw. topograficzne barwienie przeglą dowe, pozwalają ce ocenić całość struktury tkanki, poprzez kontrastowe zabarwienie cytoplazmy i jader komórkowych. Hematoksylina jest barwnikiem pochodzenia roślinnego, pozyskiwanym z niebieskiej kory drzewa kampeszowego Hematoxylum campechianum, substancją zasadową , barwią cą ją dra komórkowe na kolor fioletowy do niebieskiego. Eozyna to zwią zek syntetyczny, kwaśna pochodna fluoresceiny, podbarwiają ca cytoplazmę na różowo do czerwonego. Do barwienia przeglą dowego stosowane są również metody: Mallorego, Massona, AZAN i inne. Istnieją też specyficzne techniki barwienia poszczególnych rodzajów tkanek i komórek, obok klasycznego barwienia stosowane są m.in. techniki impregnacji solami srebra, złota i chromu pozwalają ce na wizualizację włókien nerwowych, łą cznotkankowych, komórek glejowych i innych elementów niewidocznych w barwieniach przeglą dowych. Szczegółowe informacje na temat tych metod dostę pne są w wielu podrę cznikach techniki histologicznej. 5. Odwadnianie i zamykanie preparatów. Chcą c uczynić preparat trwałym, należy ponownie pozbawić go wody. Cel ten zostaje osią gnię ty drogą przeprowadzenia szkiełek z zabarwionym skrawkiem tkanki przez opisany poprzednio alkoholowy szereg odwadniają cy. W końcowym etapie preparaty trafiają do ksylenu a nastę pnie są zamykane. Proces ten polega na naniesieniu na powierzchnię skrawka kropli medium zamykają cego (obecnie stosowane są żywice syntetyczne Entellan i DPX, rzadziej naturalny balsam kanadyjski) i delikatnym umieszczeniu szkiełka nakrywkowego. Zamykanie należy przeprowadzić ostrożnie i wolno, w taki sposób, aby pod powierzchnią szkiełka nakrywkowego nie pozostały pę cherzyki powietrza, które znacznie utrudniają obserwację . Po godzinie, nastę puje polimeryzacja żywicy, preparat staje się trwały i gotowy do analizy mikroskopowej. CELE ĆWICZENIA: 1. Przeprowadzenie procedury odparafinowania skrawków tkankowych prawego przedsionka serca szczura. 2. Wykonanie procedury barwienia, używając hematoksyliny oraz eozyny. PRZEBIEG ĆWICZENIA: 1. Przygotowanie do procedury odparafinowania: Na początku 6 szkiełek laboratoryjnych ze skrawkiem parafinowym położonono na grzałce, która była ustawiona na 65ᵒC, do czasu aż parafina z mętnej nie zrobiła się przezroczysta. W międzyczasie do dziewięciu szklanych kominków zostały wlane następujące substancje: do pierwszego i drugiego został wlany ksylen. W następnych dwóch znajdował się alkohol etylowy o stężeniu 99,8 %. Później kolejne naczynia napełniano alkoholem etylowym o stężeniach równych odpowiednio 90%, 70%, 50% i 30%. Ostatni kominek był wypełniony PBS. Rys.1: Kominy wypełnione powyższymi roztworami. Z racji tego, że mieliśmy małą ilość alkoholu etylowego o stężeniu 70% musieliśmy dokonać rozcieńczenia alkoholu etylowego o stężeniu 96%. 96%𝑥 = 200 𝑚𝑙 ∗ 70% 𝑥= 200 𝑚𝑙 ∗ 70% = 145,83 𝑚𝑙 96% 200 𝑚𝑙 − 145,83 𝑚𝑙 = 54,17 𝑚𝑙 Należało na 54,17 ml alkoholu etylowego o stęż. 96% dolać 145,83 ml wody, aby otrzymać r-r o stęż. 70%. 2. Procedura odparafinowania: Kiedy parafina na szkiełkach była przezroczysta, skrawki zostały od razu włożone do pierwszej kąpieli w ksylenie, która trwała 15 minut (zarówno pierwsza, jak i druga kąpiel w ksylenie powinny trwać 30 minut, jednakże zostały skrócone ze względu na ograniczenia czasowe zajęć). Kolejne procedury przebiegały następująco: 1) Druga kąpiel w ksylenie przez 15 minut. 2) Kąpiel w alkoholu absolutnym o stęż. 99,8% przez 10 minut. Przy tej procedurze musieliśmy zrezygnować z jednego szkiełka, gdyż nie mieścił się w kominku. 3) Kąpiel w alkoholu absolutnym o stęż. 99,8% przez 10 minut. 4) Kąpiel w alkoholu 90% przez 5 minut. 5) Kąpiel w alkoholu 70% przez 1 minutę. 6) Kąpiel w alkoholu 50% przez 1 minutę. 7) Kąpiel w alkoholu 30% przez 1 minutę. 8) Kąpiel w PBS trwała 5 minut. Przy wkładaniu do każdej następnej kąpieli, szkiełko było lekko wycierane (poza obszarem tkanki) w celu usunięcia resztek roztworów z poprzedniej kąpieli. 3. Procedura barwienia H&E: W pierwszej kolejności zostało przygotowane miejsce na szkiełka. Na metalowej tacce został rozłożony papierowy ręcznik, na którym umieściliśmy preparaty. Odparafinowane skrawki zostały polane 200 µl hematoksyliny i inkubowane w ciemności w temperaturze pokojowej przez ok. 5 minut. Po upływie czasu barwnik był spłukiwany ze szkiełka pod bieżącą wodą (od strony gdzie nie znajdował się preparat), a następnie szkiełka zanurzano w kominku z PBS przez kolejne 5 minut. Następnie osuszano delikatnie szkiełko poza obszarem tkanki i wykonano powyższą procedurę z wykorzystaniem barwnika, jednakże użyto ok. 400 µl r-ru 0,5% eozyny. Preparaty były tym razem w ciemności przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po pierwszej kąpieli PBS był wylewany i zastępowano go nowym, niezanieczyszczonym barwnikiem. Po upływie czasu barwnik znów został spłukany i włożony do kąpieli w PBS przez 5 minut. Na końcu szkiełko zostało delikatne osuszone ręcznikiem papierowym, pamiętając o tym, aby nie uszkodzić skrawków. 4. Wynik przeprowadzonego ćwiczenia: Jako wynik końcowy otrzymaliśmy następujący obraz mikroskopowy: Rys.2: Obraz mikroskopowy prawego odparafinowania i barwienia H&E. przedsionka serca szczura po procesie Poniżej przedstawiono inne narządy (tym razem ludzkie), które zostały zabarwione barwnikami hematoksyliną i eozyną. Rys.3: Przekrój przez oskrzele. Zostały ukazane wszystkie charakterystyczne elementy budowy oskrzela: nabłonek wielorzędowy (n), z komórkami kubkowymi (k.k.), warstwa mięśniówki gładkiej (m) oraz chrząstka szklista (ch) i gruczoły śluzowo- surowicze (g) w błonie podśluzowej.[1] Rys.4: Język, brodawki nitkowate i grzybowate. Na górnej powierzchni języka występują liczne wyniosłości błony śluzowej zwane brodawkami. Na zdjęciu zamieszczone są brodawki grzybowate (bg) oraz nitkowate (bn).[1] [1] A. Myśliwski, P. Trzonkowski, M. Okrój, Z. Dobrzańska: „Atlas Histologiczny”, Wyd. OPERON. [2] http://histologia-old.sum.edu.pl/files/Histotechnika1.com
