Morfologia bakterii
advertisement
ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW KOSMETOLOGII STUDIA LICENCJACKIE i MAGISTERSKIE POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź 2014 1 AUTORZY: Bożena Dudkiewicz Wioletta Kmieciak Anna Kwaszewska Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Jadwiga Szarapińska-Kwaszewska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk Piotr Wysocki ISBN: 978-83-64344-05-3 Wydanie drugie zmienione 2 Część I Przedmiot: MIKROBIOLOGIA Studia licencjackie Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów………………………………………………………..…………7 Rozdział 2 Pożywki i hodowla drobnoustrojów…………………………………………….………23 Rozdział 3 Techniki posiewu bakterii na podłoża. Otrzymywanie czystych hodowli...............................................................................................33 Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii……………………………………………………..……41 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich identyfikacji….……49 Rozdział 6 Dezynfekcja, antyseptyka, konserwacja………………………………………………59 Rozdział 7 Sterylizacja……………………………………………………………………………………….…75 Rozdział 8 Drobnoustroje bytujące na skórze………………………………………………….……83 Rozdział 9 Liczenie bakterii………………………………………………………………………………..…91 Rozdział 10 Czystość mikrobiologiczna gotowego produktu kosmetycznego……..…101 3 Część II Przedmiot: MIKROBIOLOGIA KLINICZNA Studia magisterskie Rozdział 1 Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych………………..…….……111 Rozdział 2 Bakterie w przewodzie pokarmowym…………………………….…….……..…127 Rozdział 3 Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka……………………….…… 147 Rozdział 4 Bakterie wywołujące choroby o swoistym przebiegu, trudne do hodowli lub identyfikacji…………….……………………………………….…….155 Rozdział 5 Mikologia ……………………………………………………………………….…….………..165 Rozdział 6 Podstawy wiedzy o antybiotykach i antybiotykoterapii …………….……177 4 CZĘŚĆ I PRZEDMIOT: MIKROBIOLOGIA STUDIA LICENCJACKIE 5 6 Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów Cześć teoretyczna Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne Do mikroorganizmów (drobnoustrojów), którymi zajmuje się mikrobiologia zaliczamy wirusy, bakterie, archeony, grzyby (bez kapeluszowych), niektóre glony i pierwotniaki. Organizmy te różnią się przynależnością taksonomiczną. Bakterie należą do domeny Bacteria, archeony do domeny Archaea, a grzyby, glony i pierwotniaki do domeny Eukarya. W zależności od budowy mikroorganizmy dzielimy na: prokariotyczne i eukariotyczne. Do organizmów prokariotycznych zaliczamy - bakterie i archeony, a do eukariotycznych - grzyby, glony i pierwotniaki. Te dwie grupy organizmów prezentują dwa odmienne typy budowy komórki. Wirusy nie mogą być zaliczone do żadnej z wymienionych grup, gdyż nie mają struktury ani organizacji komórkowej. Bakterie są mikroorganizmami. Jednak nie wszystkie mikroorganizmy są bakteriami. Choroby u ludzi wywołują zarówno drobnoustroje prokariotyczne (bakterie), jak i eukariotyczne (grzyby i pierwotniaki). Organizmy eukariotyczne mogą być zbudowane z jednej lub wielu komórek. Wszystkie drobnoustroje prokariotyczne są organizmami jednokomórkowymi. Cechą charakterystyczną ich komórek jest brak jądra otoczonego błoną jądrową i jąderka. Ich materiał genetyczny w formie nukleoidu, będącego podwójną nicią DNA styka się bezpośrednio z cytoplazmą. Nie mają one również dobrze wykształconych organelli komórkowych i systemu błon wewnętrznych, takich jak retikulum endoplazmatyczne, czy aparat Golgiego. W komórkach prokariotycznych brak mitochondriów i lizosomów. Prawie wszystkie komórki prokariotyczne (poza bakteriami z rodziny Mycoplasmataceae) mają ścianę komórkową, która zawiera peptydoglikan. Rybosomy prokariotów są mniejsze niż eukariotów. Wykazują mniejszą masę cząsteczkową 7 i niższą stałą sedymentacji. Podstawowe różnice w budowie komórki i replikacji materiału genetycznego pomiędzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi przedstawiono w tabeli. Tabela 1. Podstawowe różnice w strukturze komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Cecha Komórka prokariotyczna Komórka eukariotyczna DNA wolny zawieszony w zawarty w jądrze; cytoplazmie; stanowiący otoczonym błoną jądrową jeden chromosom Rozmnażanie tylko bezpłciowe przez podział komórek przez podział komórki mitozę; rozmnażanie płciowe z wytworzeniem gamet. Wymiana poprzez koniugację; w czasie rozmnażania materiału transdukcję i płciowego genetycznego transformację Rybosomy 70 S 80 S (cytoplazmatyczne), 70 S (mitochondrialne) Mitochondria brak obecne Układ błon brak retikulum wewnętrznych endoplazmatyczne; aparat Golgiego Ściana zawiera peptydoglikan u grzybów zawiera chitynę komórkowa mannany; glukany. Błona brak steroli (poza obecne sterole cytoplazmatyczna mikoplazmami) Wielkość i kształt komórek Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości komórek bakteryjnych wynosi od 1 do 10 µm. Rozmiar najmniejszych 8 wynosi od 0,15 do 0,2 µm, co jest na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego. Wymiar największych wynosi od 250 do 600 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5µm, a średnica od 1-2 µm. Komórki bakterii mogą przybierać różne kształty. Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe: dwoinki (Diplococcus) – komórki po podziale pozostają po dwie, ziarniaki czworacze (Tetracocus) – komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach, pakietowce (Sarcina) – komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do siebie prostopadłych tworząc sześcianki, paciorkowce (Streptococcus) – komórki układają się w krótsze lub dłuższe łańcuszki, gronkowce (Staphylococcus) – komórki mogą się dzielić w dwóch lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście winogron. Do bakterii cylindrycznych zaliczamy: pałeczki (Bacterium), laseczki (Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii cylindrycznych mogą także tworzyć charakterystyczne układy przestrzenne: dwoinki, łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Do bakterii spiralnych zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki (Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Niektóre gatunki bakterii wskazują tendencję do różnorodności morfologicznej i wielokształtności komórek. Ich komórki mogą różnić się wielkością i kształtem. Obok form kulistych mogą występować formy cylindryczne i odwrotnie. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem. Komórki grzybów są większe od komórek bakteryjnych (2-40 μm). Wielkość komórek drożdży i grzybów drożdżopodobnych waha się zależnie od gatunku i warunków hodowli, od 2-8 µm średnicy i od 1-8µm długości. 9 Komórki drożdży mogą mieć kształt: kulisty, elipsoidalny, jajowaty, mniej lub bardziej wydłużony. Kształt ich komórek nie może być uważany za element diagnostyczny, ponieważ zależy od wieku komórki i warunków hodowli. Drożdże mogą tworzyć skupiska w postaci łańcuszków powstałych poprzez podział komórek (pączkowanie). Komórki grzybów pleśniowych (nitkowatych) tworzą strzępki. W mikroskopie widoczne są one jako nitkowate, cylindryczne twory, proste lub rozgałęzione. U niektórych gatunków pleśni strzępki są jednokomórkowe, u innych zaś powstają w ich wnętrzu poprzeczne porowate przegrody, dzielące je na szereg komórek. Średnica strzępki waha się od 1 do 1,5 μm. Strzępki mogą być różnej długość, zarówno krótkie jak i dochodzące do kilku metrów. Struktury anatomiczne komórki bakteryjnej Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona (membrana) cytoplazmatyczna. Większość bakterii ma ścianę komórkową. Strukturami anatomicznymi spotykanymi u niektórych tylko bakterii są: plazmidy, rzęski, fimbrie, otoczka, glikokaliks, mogą także tworzyć przetrwalniki (endospory), gromadzić w cytoplazmie materiały zapasowe. Liczne bakterie potrafią żyć w formie osiadłych zbiorowisk, które określamy jako biofilm. Nukleoid bakteryjny styka się bezpośrednio z cytoplazmą i zbudowany jest z kolistej i spiralnie skręconej podwójnej nici DNA. Nie jest otoczony błoną jądrową; tworzy pojedynczy chromosom. Nukleoid jest funkcjonalnym odpowiednikiem jądra komórek eukariotycznych. W cytoplazmie wielu komórek występują elementy informacji genetycznej poza chromosomalne zwane plazmidami. Najczęściej są to koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, które mogą replikować samodzielnie. Wszystkie geny komórki tworzą jej genotyp. Wyznacza on pojawiające się cechy strukturalne i fizjologiczne komórki, czyli jej fenotyp. 10 Rybosomy bakterii są ośrodkami syntezy białek. W cytoplazmie komórki występują pojedynczo lub w skupiskach zwanych polirybosomami, w których powiązane są łańcuchem informacyjnego RNA (mRNA). Rybosomy zbudowane są w 60% z RNA i w 40% z białka i wykazują stałą sedymentacji 70S. Każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek 30S i 50S. Cytoplazma to wewnętrzna zawartość komórki bakteryjnej ograniczona błoną cytoplazmatyczną. Podstawowym jej składnikiem jest woda (80%), w której rozpuszczone są białka głównie enzymatyczne, węglowodany, lipidy, sole mineralne i inne niskocząsteczkowe związki organiczne i nieorganiczne. Całość ma charakter roztworu koloidalnego. Błona cytoplazmatyczna otacza cytoplazmę i odgradza ją od otaczającego środowiska. U bakterii, które mają ścianę komórkową, styka się z nią bezpośrednio. Wykazuje ona strukturę dwuwarstwową, zbudowaną z cząsteczek lipidów, w której zanurzone są cząsteczki białek. Pod względem chemicznym w 20-35% zbudowana jest z białek i w 50-70% z lipidów – głównie fosfolipidów. Każda cząsteczka fosfolipidu zawiera część polarną zbudowaną z grupy fosforanowej i glicerolu, wykazującą hydrofilowy charakter oraz część niepolarną zbudowaną z kwasów tłuszczowych, wykazującą hydrofobowy charakter. Na zewnątrz w stronę białek ułożone są końce hydrofilowe. Fosfolipidy i białka są ruchliwe względem siebie. Taki sposób organizacji błony cytoplazmatycznej określany jest jako model płynnej mozaiki. Ściana komórkowa bakterii zawiera peptydoglikan (mureina), który styka się bezpośrednio z błoną cytoplazmatyczną. Składa się on z łańcuchów wielocukrowych, które mają charakter polimeru i zbudowane są z powtarzających się jednostek utworzonych z N-acetyloglukozaminy oraz kwasu N-acetylomuraminowego połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym. Do reszt kwasu N-acetylomuraminowego dołączone są krótkie peptydy, które poprzecznie wiążą ze sobą sąsiednie łańcuchy. Tworzy się w ten sposób charakterystyczne usieciowanie peptydoglikanu. Peptydoglikanu występuje zarówno u bakterii gramdodatnich, jak i gramujemnych. 11 Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich jest stosunkowo gruba i względnie jednorodna. Zawiera kilkadziesiąt warstw peptydoglikanu. W ich ścianie występują ponadto kwasy tejchojowe, lipotejchojowe i białka. Ściana bakterii gramujemnych jest cienka i ma budowę wielowarstwową. Jedną do trzech warstw peptydoglikanu pokrywa błona zewnętrzna dominujący u nich element. Peptydoglikan oddzielony jest od błony zewnętrznej przestrzenią peryplazmatyczną. Błona zewnętrzna stanowi warstwę plastyczną ściany komórkowej; zbudowana jest z fosfolipidów, białek, lipoproteiny Brauna oraz lipopolisacharydu (LPS). Rzęski są elementami budowy niektórych bakterii, zwłaszcza cylindrycznych, które dzięki nim wykazują w środowisku płynnym lub półpłynnym, a nawet w cienkiej warstwie cieczy na podłożu stałym, zdolność poruszania się. Są to nitkowate wyrostki jednym końcem zaczepione w błonie cytoplazmatycznej i łączące się z cytoplazmą. Rzęski mają kształt lekko skręconej spirali i składają się z helikalnie zwiniętych cząsteczek białka zwanego flageliną. W komórkach bakterii występuje najczęściej jeden z trzech typów urzęsienia: monotrichalny – jedna rzęska na biegunie, lofotrichalny – pojedyncza rzęska lub ich pęczek na obu biegunach, perytrichalny – wiele rzęsek dookoła komórki. Ruch krętków warunkuje włókno osiowe, które składa się z pęczka włókienek przypominających budową rzęski. Wyrastają one z bieguna komórki i tworząc włókno osiowe spiralnie ją oplatają. Rzęski można oglądać w mikroskopie elektronowym lub po odpowiednim wybarwieniu w zwykłym mikroskopie świetlnym. Barwienie rzęsek jest jednak trudne i kłopotliwe. Fimbrie są włókienkowatymi powierzchniowymi strukturami niektórych komórek bakteryjnej. Spotykamy je przede wszystkim u bakterii gramujemnych. Są liczne i występują na całej powierzchni komórki. Są cieńsze i krótsze niż rzęski. Widoczne są tylko w mikroskopie elektronowym. Odmianą fimbrii są sztywne wyrostki zawierające kanał dla transportu DNA w procesie koniugacji – noszą one nazwę fimbrii płciowych (pili). Jedna komórka wytworzyć może tylko jeden pilus. 12 Przetrwalniki (endospory) tworzą tylko nieliczne bakterie. Do najważniejszych należą laseczki z rodzajów Bacillus i Clostridium. Powstają one w wyniku różnicowania się komórek wegetatywnych – jeden przetrwalnik z jednej komórki. Powstawanie przetrwalników nazywamy sporulacją. Cechą charakterystyczną przetrwalników jest stan uśpienia metabolizmu i znacznie większa niż u form wegetatywnych oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych. Przetrwalniki zawdzięczają oporność swojej unikatowej budowie: płaszczom zewnętrznemu i wewnętrznemu, z którymi wiąże się oporność na czynniki chemiczne oraz korze, która w dużym stopniu decyduje o oporności na wysoką temperaturę. Wytworzony przetrwalnik zachowuje żywotność, czyli zdolność do kiełkowania z wytworzeniem komórki wegetatywnej przez długi czas. Przetrwalnik może mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od wymiaru porzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje zniekształcenie komórki, nadając jej charakterystyczny kształt. Przetrwalniki nie barwią się zwykłymi metodami. Można je obserwować w komórkach nie zabarwionych, jako struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki bakteryjnej (mikroskop fazowo-kontrastowy). Można je również obserwować w preparatach barwionych np. metodą Grama. W zabarwionej komórce widać wtedy bezbarwny przetrwalnik. Ziarnistości zapasowe gromadzone w cytoplazmie niektórych bakterii, nazywamy też wtrętami cytoplazmatycznymi lub ciałami zapasowymi. Mają one charakter polimerów, które gromadzone są w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odżywczych, zużywane zaś w warunkach głodu - niedoboru związków pokarmowych. Do najczęściej występujących u bakterii ciał zapasowych należy kwas poli-βhydroksymasłowy. Częstym materiałem zapasowym są ziarnistości polimetafosforanowe, które zbudowane są z nieorganicznych fosforanów. Nazywamy je także wolutyną. Bakterie mogą także gromadzić polimery glukozy – skrobię, glikogen. Bakterie siarkowe gromadzą w cytoplazmie koloidalną siarkę. Niektóre ziarnistości zapasowe można wykryć w komórce stosując specjalne metody barwienia. 13 Otoczka lub warstwa śluzowa otaczać może pojedyncze komórki lub grupy niektórych bakterii. Mogą one syntetyzować i wydzielać zewnątrzkomórkowe substancje o charakterze polimerów. Jeśli polimer tworzy zbitą warstwę, ściśle otaczającą komórkę i jest mocno z nią związaną – nazywamy go otoczką. Polimer tworzący luźną warstwę, swobodnie przylegającą do powierzchni komórki, łatwo tracony i znajdowany w pożywce, w której wzrastają bakterie nazywamy śluzem. Otoczka może obejmować jedną lub dwie komórki. Warstwa śluzowa obejmuje zwykle wiele komórek bakteryjnych. Bakteryjne otoczki i śluzy najczęściej maja charakter polisacharydów. Otoczki niektórych bakterii mają strukturę polisacharydowo-peptydową lub peptydową. Polisacharydowe zewnątrzkomórkowe polimery bakteryjne niekiedy określane są jak glikokaliks. Otoczki trudno się wybarwiają. Można je obserwować w zwykłym mikroskopie świetlnym w preparatach zabarwionych metodą pozytywno-negatywną. Zewnątrzkomórkowy śluz umożliwia bakteriom wspólne bytowanie w naturze, tworzą dzięki niemu biofilm. Jest to zespół wzajemnie komunikujących się komórek osiadłych na określonym podłożu, przylegających do siebie i osłoniętych zewnątrzkomórkowymi polisacharydami. Bakterie mogą tworzyć biofilm w organizmie człowieka na powierzchni błon śluzowych układu oddechowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, na powierzchni implantów z metalu i polimerów oraz w środowisku - w naturalnych systemach wodnych, na skałach opłukiwanych wodą czy rurach kanalizacyjnych. Przekształcenie formy bytowania bakterii ze swobodnie żyjących do związanych z biofilmem daje im wiele korzyści, ale stwarza wiele problemów człowiekowi. Jednym z najważniejszych jest większa oporność bakterii w biofilmie, w porównaniu z komórkami z nim nie związanymi, na antybiotyki, chemioterapeutyki i środki dezynfekcyjne. Stwarza to ogromne problemy w leczeniu zakażeń wywoływanych przez bakterie tworzące biofilm. Utrudnia to także eliminację biofilmów bakteryjnych ze środowiska szpitalnego czy linii produkcyjnych, na których wytwarzane są leki czy kosmetyki. 14 Tabela 2. Podstawowe funkcje pełnione przez struktury komórki bakteryjnej. Struktura Pełniona funkcja komórkowa Nukleoid zapis wszystkich potencjalnych możliwości komórki Rybosomy synteza białek Błona transport substancji pokarmowych do komórki, cytoplazmatyczna wydzielanie związków na zewnątrz, udział w procesach fosforylacji oksydatywnej Ściana komórkowa nadaje kształt komórce, chroni komórkę przed uszkodzeniami mechanicznymi i lizą osmotyczną, bariera przepuszczalności dla substancji wielkocząsteczkowych; składniki ściany mogą być induktorami odpowiedzi imunologicznej Otoczka ochrona przed wysychaniem, ochrona przed fagocytozą, czynnik zjadliwości; udział w adhezji bakterii do powierzchni Rzęski ruch Fimbrie udział w adhezji bakterii do powierzchni Fimbrie płciowe udział w procesie koniugacji – przekazywania (pili) materiału genetycznego z komórki do komórki Przetrwalniki nadają gatunkom je wytwarzającym wyjątkową oporność na działanie czynników fizykochemicznych Metody Mikroskopowanie Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop z jasnym polem widzenia, którego zdolność rozdzielcza wynosi 0,2 µm. Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość między 15 dwoma punktami oglądanego obiektu, przy której widziane są one jako dwa oddzielne punkty. Preparaty trwałe barwione należy oglądać przy użyciu obiektywu immersyjnego dającego powiększenie 100 razy i okularów powiększających 5-10 razy przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 razy), jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i powiększenia obiektywu. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy go specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie ma także wpływ oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym - lusterko wklęsłe. Preparaty przyżyciowe tzw. „mokre” oglądamy najczęściej przy pomocy obiektywów powiększających 40x lub 60x przy obniżonym kondensorze. Preparat w kropli spłaszczonej jest najłatwiejszy do wykonania. Badany materiał zawiesza się w kropli wody umieszczonej na szkiełku podstawowym i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które należy opuścić na szkiełko podstawowe ukośnie tak, aby do kropli nie dostały się pęcherzyki powietrza. Jeśli badany materiał jest płynny, przenosi się kroplę wprost na szkiełko. Niekiedy stosuje się barwienie przyżyciowe, co ułatwia obserwację kształtu drobnoustrojów. Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli 16 stałej, na szkiełko należy najpierw nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Z hodowli płynnej nanosi się ezą na szkiełko 2-3 krople materiału. Każdą kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału. Barwienie preparatów trwałych Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, takie jak wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą – nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy – fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki bakteryjnej. W pH hodowli – zwykle obojętnym lub lekko zasadowym – białka bakteryjne mają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe, 17 z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła – otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się komórki, określamy barwieniem negatywnym. Metoda Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy – fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana); zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola); odbarwiacz - alkohol etylowy; barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10). Wykonanie barwienia - na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; - nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie – fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii 18 gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem, tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Gruba warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym. W przypadku bakterii gramujemnych kompleks ten wydostaje się na zewnątrz przez cienką warstwę peptydoglikanu. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. W preparatach, w których obok bakterii znajdują się grzyby chorobotwórcze (drożdżopodobne) barwią się one gramdodatnio, ale nie ma to związku z budową ich osłon. . Zadania do wykonania Zadanie 1 Przygotowanie i barwienie prapratów Otrzymujesz hodowlę stałą jednego z drobnoustrojów: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus lub Candida albicans w płytce Petriego. Drobnoustroje posiane zostały w sposób pasmowy. - Wykonaj preparat z hodowli jednego z drobnoustrojów i zabarw go metodą Grama. - Nastaw i obejrzy go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek. Zwróć uwagę na różnice w wielkości komórek bakteryjnych i komórek drożdży. Czy badany drobnoustrój okazał się gramdodatni czy gramujemny ? 19 Powiększenie....... gram............ 20 Wypełnienie poniższej tabeli pozwoli ci zapamiętać sposób reagowania bakterii na odczynniki wykorzystywane w metodzie Grama. Napisz, jaką barwę przyjmują komórki lub jakie zachodzą reakcje. Używane odczynniki Bakterie gramdodatnie Bakterie gramujemne Fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (Gencjana) Roztwór jodu w jodku potasu (płyn Lugola) Alkohol etylowy Alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (Fuksyna 1:10) 21 22 Rozdział 2 Pożywki i hodowla drobnoustrojów Cześć teoretyczna Czynniki warunkujące wzrost na podłożach Drobnoustroje mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu. Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą: węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Węgiel (C) jest budulcem wszystkich organicznych związków występujących w komórce. Źródłem węgła dla organizmów samożywnych (autotroficznych) może być dwutlenek węgla (CO2). Większość drobnoustrojów pozyskuje jednak ten pierwiastek z jego organicznych połączeń – są heterotrofami. Do łatwo przyswajalnych źródeł węgla należą węglowodany (glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, glikogen, celuloza). Do stosunkowo łatwo przyswajalnych źródeł węgla należą też kwasy organiczne i alkohole jedno- i wielowodorotlenowe (glicerol, mannitol). Niektóre bakterie wyspecjalizowały się w pozyskiwaniu węgla z jego bardzo specyficznych źródeł – metan, etanol, węglowodory aromatyczne czy lignina. Azot (N) wchodzi w skład bakteryjnych białek, aminocukrów, zasad purynowych i pirymidynowych, które tworzą nukleotydy i kwasy nukleinowe. Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych w postaci soli amonowych, azotynów, azotanów. Sole amonowe są najlepiej przyswajalnym źródłem azotu. Nieliczne grupy bakterii mogą pobierać azot atmosferyczny. Mikroorganizmy mogą także czerpać azot ze związków organicznych – aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe. 23 Fosfor (P) wchodzi w skład nukleotydów, tworzących kwasy nukleinowe, fosfolipidów i kwasów tejchojowych i lipotejchojowych. Powszechnym źródłem fosforu dla bakterii są nieorganiczne fosforany wykorzystywane przez komórkę do syntezy ATP. Siarka (S) jest składnikiem aminokwasów siarkowych (cystyna, cysteina, metionina), które są elementem składowym wielu białek. Siarka jest przyswajalna przez mikroorganizmy tylko w formie zredukowanej. Najczęściej wykorzystywanym źródłem siarki są siarczany. Niektóre bakterie wykorzystują siarkowodór. Najchętniej wykorzystywanym przez drobnoustroje organicznym źródłem tego pierwiastka jest – cysteina. Jego źródłem mogą być także pozostałe aminokwasy siarkowe. Tlen (O) i wodór (H) występują we wszystkich związkach organicznych komórki. Wchodzą także w skład wody, która jest podstawowym rozpuszczalnikiem substancji komórkowych. Pewne grupy bakterii nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie dostarczymy im gotowych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy, szczególnie z grupy B, zasady purynowe i pirymidynowe, a także niekiedy cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tłuszczowe. Drobnoustroje do wzrostu wymagają znacznych ilości wody. W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze. Woda jest także środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość mikroorganizmów nie wzrasta, jeśli zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost drobnoustrojów zależny jest także od obecności soli mineralnych. 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Jony Mg , Fe , Ca , Mn , Zn są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki. Podłoża do hodowli drobnoustrojów Pożywki (podłoża) służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża pozwala na przeniesienie ich z naturalnych środowisk (organizm człowieka, gleba, 24 woda) i namnożenie. Drobnoustroje hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach, a szczególnie bakterii pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Wiele drobnoustrojów wyrasta na sztucznych podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej ich wzrost. Pożywki stosowane do namnażania drobnoustrojów powinny: zawierać odpowiednie składniki pokarmowe, mieć odpowiednią wilgotność, mieć odpowiednie pH, mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne, być jałowe. Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe). Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na syntetycznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Pożywki złożone to podłoża zawierające dodatkowo surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Są to ekstrakty mięsne, hydrolizaty kwaśne i enzymatyczne białek i inne składniki. Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach odżywczych. Podstawową pożywką płynną dla bakterii jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie do bulionu odżywczego agaru w stężeniu 1,5-2% otrzymujemy podłoże stałe. Agar to wielocukier otrzymywany z glonów 25 morskich. Silnie chłonie wodę, upłynnia się w temperaturze 100°C, a zestala w temperaturze 45-48°C. W temperaturze 37°C, a więc optymalnej dla wzrostu większości bakterii ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek agarowych. Grzyby, zarówno drożdżopodobne, jak i nitkowate mają niewielkie wymagania pokarmowe i rosną dobrze na prostych podłożach zawierających pepton i węglowodany. Najczęściej stosowaną pożywką do izolacji lub hodowli grzybów chorobotwórczych jest podłoże Sabouraud (płynne lub stałe), zawierające pepton i 4% glukozy lub maltozy. Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe, zawierające dodatkowe składniki odżywcze. Elementami wzbogacającymi pożywki dla bakterii mogą być: węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew), hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym w badaniach bakteriologicznych podłożem wzbogaconym jest agar z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną „płytkę krwawą”. Innym, często wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa. Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają na rozwój hodowanych na nich bakterii. Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy podzielić na: namnażające lub namnażająco-wybiórcze, wybiórcze (selektywne), diagnostyczne (różnicujące), transportowe. Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących 26 w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki, w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych. Pożywki wybiórcze (selektywne), oprócz składników odżywczych, zawierają składniki wybiórcze, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikami decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego jest podłoże Loewensteina-Jensena do hodowli prątków gruźlicy. Wybiórcze podłoża są też stosowane do hodowli grzybów, ze względu na stosunkowo wolny ich wzrost, szczególne do hodowli grzybów nitkowatych. Hodowane są one na podłożach o kwaśnym pH i wysokim ciśnieniu osmotycznym (stężenie sacharozy nawet do 50%). Do podłoża dodaje się również antybiotyki przeciwbakteryjne. Zapobiega to wzrostowi szybciej rosnących bakterii. Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do identyfikacji, różnicowanie bakterii i niektórych tylko grzybów. Zawierają one substrat diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźnik, który na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od pH pożywki. Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe). Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi. Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella) służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże Chapmana służące do izolacji gronkowców. Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają składniki optymalne dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego. 27 Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać samodzielnie, korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających powtarzalność ich składu, pozwalającą na porównywanie wyników hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić, stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie Kocha. Optymalny czas hodowli W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Wzrost populacji bakterii odbywa się zgodnie z postępem geometrycznym (20 ,21 ,22 , 23…2n). Czas generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okres międzypodziałowy większości bakterii wynosi od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Hodowla grzybów chorobotwórczych wymaga dłuższego czasu. Czas potrzebny na wyhodowanie grzybów drożdżopodobnych wynosi 48-72 godzin, ale grzyby pleśniowe wymagają hodowli przez 1-2 tygodni. 28 Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w specjalnych bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Możliwe jest to na wskutek ciągłego dostarczania do bioreaktora świeżej pożywki z jednoczesnym odprowadzeniem takiej samej objętości pożywki zawierającej wyrosłe bakterie i produkty ich metabolizmu. Objętość płynu hodowlanego w trakcie prowadzenia hodowli utrzymuje się na stałym poziomie. Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli. Poszczególne fazy wzrostu różnią się częstością podziałów komórek i szybkością ich wymierania. Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowuj swój metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do podziału. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe. Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych. 29 lg liczby żywych komórek 4 5 5 6 3 1 2 czas hodowli Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 – faza przyspieszonego wzrostu, 3 – faza wzrostu logarytmicznego, 4 – faza zwolnionego wzrostu, 5 – faza stacjonarna, 6 – faza zamierania Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje. Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba komórek martwych. Częstość podziałów maleje. Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe. Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek spowodowane ich wymieraniem. Faza szósta – zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych. Wzrost na podłożach płynnych i stałych Wygląd wzrostu na podłożach może stanowić ważne kryterium przy identyfikacji bakterii i grzybów chorobotwórczych. 30 Na podłożach płynnych drobnoustroje wyrastają w postaci jednolitego zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie przy powierzchni, a na granicy faz (pożywka-powietrze) tworzy się przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu. Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii. Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności bakterii do wzrostu mgławicowego. Kolonię definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej jednostki wzrostowej (jtk – jednostka tworząca kolonie; cfu – ang. colony forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy jedną lub kilka komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ popodziałowy), a także przetrwalnik. Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli. W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami. W przypadku grzybów drożdżopodobnych tworzą się kolonie bardzo podobne do kolonii bakteryjnych, zaś grzyby pleśniowe tworzą kolonie puszyste, często kolorowe, o pomarszczonej strukturze. W przypadku tych ostatnich, zaczątek kolonii mogą stanowić znaczne, wielokomórkowe fragmenty grzybni, ale także zarodniki. Definicja kolonii bakteryjnej nie jest zatem w pełni do tych kolonii przystająca. Metody Opis kolonii Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na takich podłożach, które nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych. 31 Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo. W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy: wielkość - średnica (mm); kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna, .. ; brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany, ... ; powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, ... ; wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, grudkowata, wrastająca w podłoże, ... ; przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna, ... ; barwę - biała, kremowa, szara, czerwona, ... ; otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża. Zadania do wykonania Zadanie 1. Charakterystyka kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając cechy opisane wyżej. 32 Rozdział 3 Techniki posiewu bakterii na podłoża. Otrzymywanie czystych hodowli. Część teoretyczna Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju. Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami. W większości przypadków, przy badaniu bakteriologicznym wody, żywności, wymazów pobranych od pacjentów, zanieczyszczonych leków czy kosmetyków, spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Ocena drobnoustrojów występujących w badanym materiale może nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, choć jest to pewne uproszczenie, że każda z nich powstaje z jednej jednostki wzrostowej (często jednej komórki). A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z posiewu redukcyjnego prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej. Metody Posiew bakterii na podłoża Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy, płytka agarowa) lub płynne (bulion) ezą, pipetą lub wacikiem. Posiewając 33 ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po wykonaniu posiewu. Używamy też wyjałowionych, odpowiednio opakowanych pipet szklanych, końcówek do pipet automatycznych lub wacików. W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej. Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum. Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia (probówki lub kolbki). Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać pipetą wprowadzając np. 5 mL hodowli stanowiącej inokulum do 95 mL pożywki. Posiewu na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje w różny sposób – zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to, że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano materiał kliniczny – wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu. 34 Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci pasma różnej długości. Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana. Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 mL można także rozprowadzić głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą. Rycina 1. Posiew redukcyjny A C B D 35 Przy posiewie na podłoże stałe w postaci skosu agarowego w probówce należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na powierzchni skosu. Prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia. W zależności od rodzaju posiewanego materiału i wykorzystywanego podłoża spotykamy się z następującymi możliwościami przesiewania bakterii. Na pożywkę płynną (pipeta, eza) Z pożywki płynnej Na skos agarowy (eza) Na płytkę agarową (eza, wacik, pipeta) Na pożywkę płynną (eza) Z pożywki stałej (płytka agarowa, skos agarowy) Na skos (eza) Na płytkę agarową (eza) Otrzymywanie czystych hodowli Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych próbek sprowadza się do następujących kroków. 36 Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane podłoże. Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną. Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na oddzielne płytki. Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię. Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób) pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych, czy służących do określenia właściwości fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii. Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii w preparatach barwionych metodą Grama. Zadania do wykonania Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli - Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny). - Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii. - Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki. - Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę. Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny). 37 Kolonia: Preparat: Kolonia: Preparat: 38 Kolonia: Preparat: Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju, o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste hodowle tych bakterii – czyli hodowle jednego gatunku pochodzące z pojedynczej kolonii, a zatem – czyste hodowle poszczególnych szczepów bakteryjnych. 39 40 Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii Część teoretyczna Wymagania pokarmowe Bakterie podobnie jak inne organizmy żywe potrzebują dostępu do odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy wzrost i rozmnażanie. Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych aż do skrajnie niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO2. Wymagania pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa poszczególnych drobnoustrojów. Źródła węgla i azotu Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów żywych. W zależności od źródeł z jakich bakterie mogą go pozyskiwać podzielono je na: autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO2 i przekształcające go do związków organicznych heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych. Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku, co najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu a także bardziej złożonych związków jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały podzielone na: 41 prototrofy – drobnoustroje o małych wymaganiach pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek organiczny i sole mineralne, co świadczy o ich dużych, gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach enzymatycznych, auksotrofy – drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych, rosnące jedynie w obecności, co najmniej dwóch związków organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je od środowiska. Zarówno prototrofizm jak i auksotrofizm mogą być wykorzystywane dla celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju Haemophilus. Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny i pirymidyny lub witaminy. Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy wykorzystują organiczne źródła azotu. - Źródła energii oraz donatory elektronów Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych. Pozwala to wyróżnić wśród bakterii: fototrofy – które korzystają z energii słonecznej (bakterie fotosyntetyzujące), chemotrofy – korzystające z energii pochodzącej z rozkładu związków organicznych i nieorganicznych. W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na: litotrofy korzystające z donatorów nieorganicznych, organotrofy korzystające z donatorów organicznych. 42 Zatem zależnie od wykorzystywanych przez bakterie źródeł energii i donatorów elektronów możemy wyróżnić cztery typy pokarmowe: fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy. Bakterie stanowiące florę człowieka i te, które są dla niego chorobotwórcze są chemoorganotrofami pozyskującymi węgiel ze związków organicznych. Wymagania tlenowe bakterii Bakterie różnią się pomiędzy sobą zapotrzebowaniem na tlen. Bezwzględnie tlenowe rosną tylko w jego obecności, bezwzględne beztlenowe rosną przy jego braku a względnie beztlenowe rosnące zarówno przy dostępie jak i braku tlenu. Różnice te wynikają ze sposobu pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie tlenowe jest możliwe tylko u organizmów, w którym końcowym akceptorem przenoszonych przez łańcuch oddechowy elektronów jest tlen cząsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym są związki nieorganiczne: azotany, siarczany. Możliwe jest jeszcze pozyskiwanie energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronów jest związek organiczny. Bakteriom bezwzględnie tlenowym tlen jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i rozmnażania. W przypadku braku tlenu giną, gdyż przenoszenie elektronów łańcucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest magazynowana energia. Bakterie te mają enzymy, które chronią je przed toksycznym działaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wiąże wolne rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru, Jest on rozkładany przez dwa inne enzymy: katalazę i peroksydazę do wody i tlenu. Do bezwzględnie tlenowych, chorobotwórczych bakterii zaliczane są m.in.: Mycobacterium, Bacillus, Nocardia. Bakterie względnie beztlenowe mogą rosnąć zarówno w obecności tlenu jak i przy jego braku w środowisku o obniżonym potencjale oksydacyjnoredukcyjnym. Do tej grupy należy wiele bakterii, w tym też chorobotwórczych. Jeżeli tlen jest obecny w środowisku mogą korzystać 43 z energii pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mogą się przestawić metabolizm na fermentacyjny jak np.: Escherichia coli lub na oddychanie beztlenowe np.: Pseudomonas denitrificans. Bakterie bezwzględnie beztlenowe mogą się rozwijać tylko wyłącznie przy braku dostępu do tlenu. Jest on dla nich toksyczny, ponieważ nie mają żadnych mechanizmów redukujących jego szkodliwe działanie. Niektóre z nich, mogą rosnąć w obecności tlenu jednak pod warunkiem obniżenia potencjału oksydacyjo-redukcyjnego poprzez dodanie do hodowli glutationu, cystyny bądź tioglikolanu sodu. Do tej grupy należą liczne bakterie chorobotwórcze dla człowieka m.in. z rodzajów Clostridium, Bacteroides czy Fusobacterium. Grupa bakterii mikroaerofilnych (np. Helicobacter) rośnie dobrze przy dostępie niewielkich ilości tlenu (do 20%), ale czasem wyrasta także w warunkach beztlenowych (np. Propionibacterium). Wymagania temperaturowe bakterii Temperatura ma istotny wpływ na rozwój bakterii. Każdy ich rodzaj ma optymalną dla siebie temperaturę, w której wszelkie procesy metaboliczne prowadzone są najbardziej wydajnie. Temperatura minimalna wyznacza dolną granicę, poniżej której wzrost danego rodzaju zanika a maksymalna, jest temperaturą powyżej której bakterie już się nie dzielą. Preferencje dotyczące temperatury dzielą bakterie na grupy. Termofile (bakterie ciepłolubne) najlepiej rosną w temperaturze 40oC do o 70 C. Bakterie takie jak Geobacillus stearothermophilus czy Thermoactinomyces vulgaris żyją w kompoście, glebie, nawozach organicznych. Znane są także bakterie rosnące w wyższych temperaturach Np. Thermus aquaticus w 65oC. Znane są i takie, które mnożą się w temperaturze 90-110oC. Określane są one jako termofile ekstremalne. Zainteresowanie nimi wynika z możliwości jakie stwarzają ciepłoodporne enzymy tych bakterii np. dla biologii molekularnej. Mezofile to największa grupa drobnoustrojów, rosnąca w zakresie temperatur 25-45oC. Wśród nich są bakterie z optimum rozwoju w temperaturze 37oC , blisko związane za człowiekiem jako pasożyty i komensale (np. rodzaje Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella). 44 Niektóre mezofile mogą rosnąc w szerokim zakresie temperatur, jak na przykład dobrze mnożąca się w temperaturze lodówki Listeria – o spektrum od 1o do 45oC . Psychrofile to bakterie zimnolubne, których metabolizm najefektywniej funkcjonuje w niskich temperaturach. Są wśród nich psychrofile względne o optymalnej temperaturze 200C, ale mogące też rosnąć w 0oC, występujące w głębi oceanów oraz psychrofile bezwzględne o istotnym 0 znaczeniu dla człowieka. Rosną one dobrze w 0 C mnożąc się w żywności przechowywanej w chłodniach. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną zachorowań. Należą tu m.in. niektóre gatunki Flavobacterium, Aerobacter, a także Bacillus czy Lactobacillus. Metody Badanie zdolności korzystania z soli amonowych lub aminokwasów jako źródła azotu Bakterie posiane na stałe podłoże nie zawierające źródła azotu, na które punktowo (na bibułowych krążkach czy do metalowych cylinderków) naniesiono roztwory NH4(SO4)2 i aminokwasów wyrosną tylko w pobliżu tego źródła azotu, który mogą wykorzystywać. Metody hodowli bakterii tlenowych Tlen jest ważnym czynnikiem warunkującym wzrost bakterii tlenowych i względnie beztlenowych. Pobierają one tlen rozpuszczony w pożywce. Dostępność tlenu dla bakterii w hodowlach płynnych możemy zwiększyć przez ich napowietrzanie. Najprościej osiągnąć to przez energiczne wstrząsanie lub mieszanie hodowli na tzw. wytrząsarkach. W hodowlach płynnych prowadzonych na skalę przemysłową stężenie tlenu zwiększa się przepuszczając powietrze lub tlen przez pożywkę. 45 Metody hodowli bakterii beztlenowych Obecność tlenu może uniemożliwić wyhodowanie bakterii bezwzględnie beztlenowych. Jest wiele sposobów usunięcia tlenu z pożywki. W przypadku pożywki płynnej najprostszym sposobem jest jej zagotowanie, szybkie schłodzenie i pokrycie powierzchni podłoża płynną parafiną. Metoda ta jednak może być zawodna. Najczęściej bakterie beztlenowe hoduje się w specjalnych, szczelnych słojach, wewnątrz których atmosferę beztlenową uzyskuje się na drodze reakcji chemicznej zachodzącej w specjalnych saszetkach (nazwa zależy od jej wytwórcy). Saszetka zawiera zestaw substancji, z których po jej otwarciu wydzielany jest wodór. Ten reaguje z tlenem obecnym w słoju tworząc wodę. Reakcja ta zachodzi szybko i gwarantuje uzyskanie warunków beztlenowych. Efektywność tego procesu sprawdza się przy pomocą wskaźnika, błękitu metylenowego, który w warunkach beztlenowych jest bezbarwny. Odczynniki zawarte w niektórych rodzajach saszetek wymagają do swojej aktywności zetknięcia z wodą. Aby zwiększyć szybkość łączenia się wodoru z tlenem stosuje się wtedy katalizator palladowy umieszczany w specjalnym pojemniku przytwierdzonym do wieka słoja. W powietrzu atmosferycznym tlen stanowi 20%. Do namnażania bakterii mikroaerofilnych stosuje się saszetki, które pozwalają uzyskać środowisko o niewielkim stężeniu tlenu rzędu 7-10%. Niektóre bakterie wymagają do swojego optymalnego wzrostu zwiększonego stężenia CO2. Znajdują wtedy zastosowanie saszetki, które pozwalają na uzyskanie środowiska o podwyższonym stężeniu CO2 (średnio od 3 do 6%). Wiele bakterii beztlenowych można wyhodować na podłożach o obniżonym potencjale redukcyjno-oksydacyjnym, co jest osiągane poprzez dodanie odpowiednich związków chemicznych. W powszechnie używanych: podłożu Brewera jest to tioglikolan sodu. 46 Zadania do wykonania Zadanie 1. Typy pokarmowe bakterii Uzupełnij poniższą tabelę: Typ Źródło energii pokarmowy Chemoorganotrofy związki nieorganiczne światło Fotoorganotrofy Źródło węgla Donatory elektronów CO2 i inne związki nieorganiczne związki nieorganiczne związki nieorganiczne. związki nieorganiczne związki organiczne Zadanie 2. Wpływ warunków gazowych na rozwój bakterii w hodowli płynnej - Otrzymujesz hodowle bulionowe: Clostridium botulinum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Każdy drobnoustrój posiany był do dwóch probówek, z których jedna pokryta została płynną parafiną. - Wyniki hodowli (wzrost) zaznacz w tabeli. Określ wymagania tlenowe tych bakterii. 47 Clostridium botulinum Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Bulion Bulion pod parafiną Określenie wymagań tlenowych bakterii Zadanie 3. Wpływ temperatury na wzrost bakterii - Obejrzyj otrzymane hodowle. - Uzupełnij poniższą tabelę oceniając intensywność wzrostu w skali +, ++ lub – Wzrost w temp.4oC Wzrost w temp.37oC Wzrost w temp.45oC Psychrofil Mezofil Termofil 48 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich identyfikacji Część teoretyczna Metabolizm bakterii Podobnie jak w innych żywych komórkach metabolizm bakterii obejmuje anabolizm (reakcje syntezy) i katabolizm (reakcje rozkładu). Oba te procesy są ze sobą ściśle powiązane i zachodzą w komórce jednocześnie. Reakcje rozkładu związków wysokocząsteczkowych uwalniają energię, która następnie jest magazynowana w ATP. W pierwszym etapie duże cząsteczki węglowodanów, białek, tłuszczy, kwasów nukleinowych ulegają degradacji do mniejszych cząstek: heksoz i pentoz, aminokwasów, glicerolu i kwasów tłuszczowych, nukleotydów. W dalszych etapach procesów katabolicznych w wyniku licznych przemian powstają proste cząsteczki, które włączane są w cykl Krebsa będący końcowym etapem rozkładu. Ostatecznymi produktami są woda, dwutlenek węgla i energia. Umożliwia to przebieg procesów anabolicznych wymagających jej nakładu. Energia uzyskiwana jest przez bakterie w procesach katabolicznych polegających na utlenianiu biologicznym substratów oddechowych i przenoszeniu elektronów na odpowiednie akceptory. Najbardziej wydajnym energetycznie procesem jest, angażujące cykl Krebsa, oddychanie tlenowe, w którym protony i elektrony są przenoszone poprzez łańcuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolność bakterii do oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich identyfikacji, gdyż liczne próby biochemiczne pozwalają na wykrywanie metabolitów pośrednich cyklu Krebsa oraz obecność enzymów łańcucha oddechowego. Oddychanie beztlenowe ma podobny przebieg z tym, że ostatecznym akceptorem protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym są związki 49 nieorganiczne np.: azotany, azotyny, siarczany. Wykrywanie produktów ich rozkładu a także enzymów biorących udział w tych procesach także wykorzystywane jest w identyfikacji bakterii. Przykładem jest wykrywanie reduktazy azotanowej przekształcającej azotany do azotynów. Trzeci z energiodajnych procesów – fermentacja pozwala na metabolizowanie substratów bez udziału czynnika utleniającego, w którym utlenienie jednego związku jest równoważone redukcją innego. Ostatecznymi akceptorami protonów i elektronów są związki organiczne powstałe jako produkty pośrednie np.: etanol, mleczan, maślan, bursztynian, izopropanol. Od tych produktów tworzone są nazwy fermentacji np. fermentacja mlekowa, propionowy czy alkoholowa. Fermentacja mlekowa jest prowadzona przez bakterie mlekowe (Lactobacillus), ale także inne bakterie np. gronkowce. Bakterie mlekowe stanowią florę fizjologiczną przewodu pokarmowego niemowląt, są wykorzystywane jako probiotyki. Stanowią też normalną florę pochwy u kobiet. Fermentacja propionowa prowadzona jest przez beztlenowe pałeczki z rodzaju Propionibacterium bytujące w przewodzie pokarmowym przeżuwaczy, a także na skórze człowieka. Jako produkt podstawowy tej fermentacji powstaje kwas propionowy. Jako substrat energetyczny bakterie mogą wykorzystywać cukry proste, oligocukry i cukry złożone. Te ostatnie muszą ulec strawieniu zewnątrzkomórkowemu przy udziale odpowiednich, produkowanych przez bakterie enzymów. Dotyczy to m.in.. skrobi, glikogenu czy celulozy. Do komórki transportowane są cukry proste, które wykorzystywane są jako główne substraty oddechowe. Jeżeli w podłożu znajduje się wiele substratów zwykle pierwszym rozkładanym są cukry proste. W przypadku większości bakterii jest to glukoza. Także białka i lipidy są zbyt dużymi cząsteczkami, aby w stanie nie zmienionym mogły być przyswajane przez bakterie. Muszą one ulec degradacji w środowisku przy udziale odpowiednich enzymów proteolitycznych czy lipolitycznych. W rozkładzie białek biorą udział endopeptydazy rozkładające je do oligopeptydów i egzopeptydazy odłączające aminokwasy, które podlegają dalszym przemianom. Lipidy są 50 zwykle degradowane przez esterazy , o szerokiej swoistości substratowej. Niektóre bakterie wytwarzają lipazy o wąskiej specyficzności – na przykład lecytynazę. Cechy wykorzystywane do identyfikacji bakterii W identyfikacji bakterii przeprowadzanej metodami fenotypowymi próby oparte na wykrywaniu cech metabolicznych bakterii odgrywają bardzo ważną rolę. Bada się źródła węgla i azotu wykorzystywane przez bakterie, poszukuje enzymów biorących udział w procesach katabolicznych, oznacza charakterystyczne końcowe produkty metabolizmu. Zwykle diagnostykę prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilka lub kilkanaście prób dobranych specjalnie pod kątem identyfikacji określonych bakterii. Tworzone są w ten sposób schematy diagnostyczne. Istotne miejsce mogą w nich mieć także takie cechy jak morfologia mikroskopowa bakterii i morfologia kolonii. Dla wielu rodzajów bakterii określa się także właściwości biologiczne. Wśród nich ważną rolę odgrywa oznaczanie często występujących u bakterii hemolizyn (typ hemolizy na agarze z krwią), wytwarzanie enzymów np. katalazy, oksydazy, czy też charakterystyczne dla mniejszej liczby lub wręcz dla pojedynczych gatunków próby, takie jak wytwarzanie koagulazy, toksyn i inne. Istotną pomoc w identyfikacji niektórych bakterii (pałeczki jelitowe, paciorkowce) stanowią cechy antygenowe wykrywane badaniami serologicznymi. Metody Próby biochemiczne wykonywane w celu identyfikacji bakterii W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne: związane z metabolizmem azotowym, związane z metabolizmem węglowodanów, związane z metabolizmem lipidów, związane z procesami oddechowymi (enzymy red-ox). 51 Podłoża, na których określa się właściwości biochemiczne należą do grupy pożywek diagnostycznych. Niektóre próby biochemiczne wykrywające obecność tych samych enzymów lub produktów często możemy wykonać w różny sposób. Poniżej przedstawiono kilkanaście podstawowych prób w najczęściej stosowanych wariantach. Metabolizm azotowy Właściwości proteolityczne - rozkład żelatyny (metoda probówkowa) o Pożywka z żelatyną w temperaturze pokojowej (ok. 22 C) ma konsystencję o stałą, ale w cieplarce (37 C) jest płynna. Posiana bakteriami, które mają enzym – żelatynazę, po długim zazwyczaj okresie inkubacji, ulega stałemu upłynnieniu i nie daje się zestalić przez obniżenie temperatury. Wytwarzanie H2S – na podłożu Kliglera Podłoże Kliglera wykorzystywane jest głównie w diagnostyce Enterobacteriaceae. Służy ono do oceny wytwarzania przez bakterie H2S ale także zdolności rozkładu glukozy i laktozy. Ma ono postać półskosu o barwie łososiowej. Bakterie należy posiać do słupka i na skos. Wynik 0 odczytuje się po 24 godzinnej inkubacji w 37 C. Wytwarzany siarkowodór reaguje z jonami żelaza, a powstający siarczek żelaza powoduje zaczernienie podłoża. Wytwarzanie indolu z tryptofanu Badane bakterie posiewa się na wodę peptonową zawierającą DL0 tryptofan. Po 24 godzinnej inkubacji w 37 C na podłoże należy nawarstwić zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha. Zawiera on p-dimetyloaminobenzaldehyd, alkohol amylowy i stężony HCl. Jeżeli bakterie rozłożyły tryptofan pojawia się ciemnoróżowa obrączka w górnej warstwie pożywki. Rozkład mocznika Zdolność bakterii do wytwarzania ureazy – enzymu rozkładającego mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla bada się na podłożu Christensena z mocznikiem. W podłożu zawarty jest wskaźnik pH czerwień krezolowa. Powstający amoniak alkalizuje podłoże, co powoduje zmianę jego zabarwienia z żółtego na różowe. 52 Metabolizm węglowodanów Wykrywanie zdolności rozkładu cukrów przez bakterie o małych wymaganiach Bakterie posiewa się do probówek zawierających wodę peptonową z dodatkiem 1% cukru oraz wskaźnik pH: purpurę bromokrezolową (fioletowa w pH obojętnym; żółta w kwaśnym) lub błękit bromotymolowy (zielony w pH obojętnym; żółty w kwaśnym). Dodatkowo do probówek wkładane są dnem do góry tzw. rurki Durhama, w których niekiedy w wyniku rozkładu cukru może zbierać się gaz. Po 24 godzinnej inkubacji w 370C rozkład cukru prowadzi do zakwaszenia środowiska i zmiany zabarwienia podłoża. Zestaw prób dla kilku cukrów nazywa się zwykłym szeregiem cukrowym. Wykrywanie drogi rozkładu cukru: fermentacja czy utlenianie, na podłożu Hugh-Leifsona. Bakterie posiewa się do dwóch probówek ze świeżo przygotowanym, wygotowanym bezpośrednio przed użyciem podłożem. Powierzchnia, jednego z nich pokrywana jest płynną parafiną. Podłoże jako wskaźnik pH zawiera błękit bromotymolowy. W przypadku bakterii nie rozkładających cukru barwa podłoża się nie zmienia. Natomiast jeśli bakterie rozkładają cukier tylko w warunkach tlenowych zmienia się barwa pożywki w probówce bez parafiny. Zmiana barwy w obu probówkach świadczy o wykorzystywaniu cukru na drodze fermentacji. Wykorzystanie podłoża stałego dla oceny rozkładu laktozy - podłoże MacConkeya Podłoże MacConkeya służy do izolacji pałeczek gramujemnych. Jest to podłoże diagnostyczne, ale zawiera też takie składniki jak sole żółciowe i fiolet krystaliczny, które decydują o jego słabej wybiórczości i hamują wzrost bakterii gramdodatnich. Zawarta w podłożu laktoza, jeśli jest rozkładana (bakterie laktozododatnie), zakwasza środowisko co manifestuje się różowym zabarwieniem kolonii zależnym od wskaźnika – czerwieni obojętnej. Bakterie laktozoujemne rosną w postaci kolonii w kolorze nie posianej pożywki. 53 Metabolizm lipidowy Wytwarzanie lipaz (esteraz) na podłożu z Tween 80 W celu sprawdzenia zdolności bakterii do wytwarzania lipaz posiewa się je na płytkę z podłożem agarowym z dodatkiem Tween 80 (polietylenosorbitol jednooleinowy) i chlorku wapniowego. Wynik ocenia się po 48 godzinach inkubacji. Wokół kolonii bakterii wytwarzających lipazy pojawia się strefa zmętnienia. Jest ona wynikiem reakcji uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych z obecnymi w pożywce jonami wapnia powodującej powstanie nierozpuszczalnych mydeł wapniowych. Wytwarzanie enzymów utleniająco-redukujących Wytwarzanie katalazy Katalaza rozkłada H2O2 do H2O i O2. Jej wytwarzanie sprawdza się poprzez zawieszenie badanych bakterii w kropli 3% wody utlenionej umieszczonej na szkiełku podstawowym. Można także dodać wodę utlenioną bezpośrednio do hodowli. Pojawiające się pęcherzyki tlenu świadczą o obecności katalazy. Badanie zdolności hemolitycznych bakterii Hemolizyny bakterii mają zdolność niszczenia krwinek czerwonych ludzi i zwierząt. Ich wytwarzanie sprawdza się na podłożu agarowym zawierającym 5% krwi baraniej. Po odpowiedniej dla danych bakterii inkubacji ocenia się czy nastąpił rozpad krwinek. Wyróżnia się dwa typy hemolizy: α hemoliza – widoczna jest na płytce krwawej w postaci zielonej strefy wokół kolonii, co jest wynikiem częściowego rozpadu krwinek (przekształcenie hemoglobiny do methemoglobiny) β hemoliza – widoczna na płytce krwawej jako pełne przejaśnienie wokół kolonii, powstałe wskutek całkowitej lizy krwinek i wyługowania barwnika. 54 Wielkość stref hemolizy może być różna dla różnych gatunków czy szczepów. Zestawy prób biochemicznych do identyfikacji bakterii W laboratoriach zajmujących się rutynową diagnostyką mikrobiologiczną do identyfikacji drobnoustrojów stosowane są gotowe, standaryzowane zestawy testów biochemicznych. Najczęściej mają one postać płytek pleksiglasowych z dołkami lub galeryjek z pojemniczkami wypełnionymi substratami dostosowanymi do identyfikacji danej grupy bakterii. Zmiany barwy zawartości studzienek po dodaniu badanego szczepu, inkubacji i jeśli trzeba, odpowiednich odczynników, umożliwiają odczytanie wyników i przy użyciu książki kodowej zidentyfikowanie zwykle do gatunku. Zadania do wykonania Zadanie 1. Badanie niektórych cech biochemiczne bakterii wykorzystywanych do ich identyfikacji Opisz wszystkie przedstawione na ćwiczeniach demonstracje w poniższej tabeli: Metabolizm azotowy 55 Metabolizm węglowodanów 56 Metabolizm lipidowy Enzymy utleniająco-redukujące 57 Właściwości biologiczne Szybkie testy biochemiczne 58 Rozdział 6 Dezynfekcja, antyseptyka, konserwacja Część teoretyczna Ważnymi czynnikami kształtującymi skład ekosystemów są czynniki fizyczne, takie jak: temperatura, pH, wilgotność, ciśnienie osmotyczne, potencjał oksydacyjno-redukcyjny, a także promieniowanie. Związki chemiczne zawarte w środowisku mają także istotne znaczenie dla różnorodności i liczebności populacji żyjących w nim mikroorganizmów. Znajomość stopnia indywidualnej wrażliwości poszczególnych gatunków bakterii na te czynniki pozwala je namnażać w warunkach laboratoryjnych, ale także ograniczać ich rozprzestrzenianie, sprawować nad nimi kontrolę. Temperatura jest jednym z czynników najsilniej oddziałujących na drobnoustroje. Dla większości bakterii temperatura nieco poniżej 0oC jest bójcza, gdyż tworzące się kryształki lodu niszczą struktury komórki. Nagłe o obniżenie temperatury do kilkudziesięciu stopni poniżej zera (–70 C), szczególnie w obecności glicerolu, nie uszkadza komórek i pozwala zachować żywotność przez długie okresy czasu. Podwyższenie temperatury otoczenia powyżej maksymalnej temperatury kardynalnej powoduje śmierć drobnoustrojów. Drobnoustroje różnią się wrażliwością na podwyższoną temperaturę, większość z nich ginie po o 30 minutach ogrzewania w temperaturze około 60 C, jednak niektóre z nich, a także zarodniki grzybów czy przetrwalniki bakterii, znoszą nawet bardzo wysokie temperatury. Inne warunki środowiskowe mogą wpływać na skutek działania wysokiej temperatury na drobnoustroje. W środowisku wodnym są one bardziej wrażliwe na wysoką temperaturę niż w stanie wysuszenia. Obecność węglowodanów, białek i tłuszczów chroni je przed działaniem ciepła, zaś sole obecne w środowisku mogą podwyższać lub obniżać ciepłooporność, zależy to od rodzaju soli i drobnoustroju. 59 Kwasowość środowiska może stymulować lub hamować rozwój drobnoustrojów. Optymalne dla rozwoju większości drobnoustrojów pH mieści się w granicach 6,5-7,5. Bakterie chorobotwórcze rozwijają się najlepiej w pH obojętnym lub lekko alkalicznym, grzyby preferują środowisko lekko kwaśne, a wirusy zachowują zakaźność w pH 5 do 8. Niekorzystny dla bakterii odczyn środowiska jest często czynnikiem wspomagającym procesy dekontaminacji np. pod wpływem temperatury. Woda to podstawowy składnik i warunek rozwoju drobnoustrojów, ale niektóre z nich mogą w stanie wysuszenia przetrwać wiele lat (np. prątki gruźlicy). Oporność drobnoustrojów na wysychanie zwiększa obecność w środowisku materii organicznej (materiał kliniczny, żywność, kosmetyki).Obecność wody sprzyja procesom dekontaminacji. Dla ciśnienia osmotycznego drobnoustroje wykazują dużą tolerancję, ale tylko nieliczne bakterie mogą przeżywać i rozwijać się w środowisku hipertonicznym, i fakt ten wykorzystuje się w praktyce do konserwacji produktów spożywczych. Wysokie ciśnienie osmotyczne może stanowić o wybiórczości podłoży np. do hodowli grzybów. Promieniowanie ultrafioletowe (UV) i jonizujące działa na drobnoustroje w zależności od dawki i czasu ekspozycji mutagennie lub letalnie. Promieniowanie ultrafioletowe (dł. fali 230 - 270 nm) działa najsilniej przy długości fali 260 nm. Jest ono wybiórczo pochłaniane przez zasady purynowe i pirymidynowe kwasów nukleinowych i powoduje ich uszkodzenie. Największą, chociaż zróżnicowaną, wrażliwość na działanie promieniowania UV wykazują formy wegetatywne bakterii, znacznie bardziej oporne są wirusy i przetrwalniki bakterii, a najbardziej oporne są zarodniki pleśni. Drobnoustroje w otoczeniu człowieka mogą stanowić zagrożenie, które minimalizuje się stosując następujące zabiegi określane wspólnym mianem dekontaminacji. Dezynfekcja to proces usuwania drobnoustrojów ze środowiska i powierzchni przedmiotów. Zakłada się, że w procesie dezynfekcji giną formy wegetatywne bakterii i grzybów chorobotwórczych, a ilość pozostałych drobnoustrojów ulega maksymalnemu zmniejszeniu. Zatem dezynfekcja nie eliminuje wszystkich drobnoustrojów, w tym 60 przetrwalników czy niektórych wirusów. Procesem prowadzącym do usunięcia wszystkich form życia (a zatem, wszystkich drobnoustrojów i ich form) z określonego materiału jest omówiona w rozdziale 7 sterylizacja. Dezynfekcję, powinna poprzedzać, jeśli to możliwe, sanityzacja. Polega ona na zmniejszeniu liczby drobnoustrojów na przedmiotach i skórze za pomocą środków myjących i czyszczących. Antyseptyka to eliminacja lub hamowanie rozwoju drobnoustrojów na żywych tkankach – skórze i błonach śluzowych. Aseptyka to zgodne z określonymi procedurami postępowanie, które ma na celu zapobieganie zakażeniu. Takie postępowanie obowiązuje w laboratoriach mikrobiologicznych, w medycynie zabiegowej, aptekach, zakładach farmaceutycznych, oraz produkujących kosmetyki i żywność, także w gabinetach kosmetycznych. W pracy aseptycznej wykorzystuje się procesy sanityzacji, dezynfekcji i sterylizacji. Konserwacja ma na celu zapobieganie rozwojowi drobnoustrojów i zabezpieczenie produktu przed wtórnym (w czasie użytkowania) skażeniem. Konserwuje się m.in. żywność, leki, preparaty biologiczne, produkty stosowane w kosmetologii. Środki dezynfekcyjne, antyseptyczne i konserwujące to związki chemiczne mające zdolność niszczenia lub hamowania rozwoju drobnoustrojów. Metody Dezynfekcję można przeprowadzać metodami z zastosowaniem czynników fizycznych (temperatury, promieniowania, filtracji) i przy użyciu związków chemicznych. o W czasie gotowania w temperaturze wrzenia wody (100 C) – dekoktacji w ciągu 10 minut ginie większość form wegetatywnych drobnoustrojów, ale przeżywają przetrwalniki i niektóre wirusy. 61 o Pasteryzacja – ogrzewanie w temperaturze 62 C przez 30 minut o lub gwałtowne podniesienie temperatury na 15 sekund do 72 C powoduje zabicie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych, maleje także ogólna liczba drobnoustrojów. Dezynfekcja za pomocą promieniowania UV niszczy przede wszystkim formy wegetatywne drobnoustrojów, wirusy i przetrwalniki są bardziej oporne. Ze względu na nieprzenikliwość promieniowania UV, skuteczność tej metody jest ograniczona. Działanie ultradźwiękami pozwala na dokładne oczyszczenie sprzętu (sanityzacja), ale usuwane są także drobnoustroje, z których znaczna część ginie w wyniku zniszczenia osłon komórkowych. Ta metoda czasem poprzedza sterylizację w autoklawie. Znaczne ograniczenie liczby drobnoustrojów w płynach lub gazach można osiągnąć przez filtrację. Stopień oczyszczenia zależy od wielkości porów zastosowanego filtra. Większość bakterii zatrzymywana jest przez filtry o średnicy porów 0,45 m. Znanych jest wiele grup związków chemicznych o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Większość z nich wykorzystywanych jest w dezynfekcji. Niektóre środki dezynfekcyjne mogą być również antyseptykami. Dotyczy to jednak tylko nielicznych, gdyż zastosowane na żywe tkanki, nie mogą działać drażniąco czy uczulająco. Związki chemiczne, zwane konserwantami, stosowane są w celu przedłużenia trwałości produktów, przede wszystkim tych, zawierających w składzie wodę. Ważną ich cechą musi być zdolność długotrwałego utrzymywania czystości mikrobiologicznej produktu i brak działania drażniącego. Środki takie są składnikiem większości kosmetyków. Tylko nieliczne środki chemiczne mają działanie sterylizujące. Alkohole działają bakteriobójczo powodując denaturację białek, a ta zachodzi lepiej w obecności wody. Najczęściej stosuje się 70% roztwory wodne. Powszechnie stosowane alkohole to etanol i izopropanol. Oba wykorzystywane są zarówno do dezynfekcji jak i antyseptyki. Używane są 62 także jako środki konserwujące w kosmetologii. Służą również jako rozpuszczalniki innych środków dezynfekcyjnych, wzmagając ich aktywność przeciwdrobnoustrojową. Aldehydy to najskuteczniej działające bójczo związki chemiczne, które mogą być wykorzystywane także do sterylizacji. Ich działanie polega na alkilowaniu białek i kwasów nukleinowych. Do dezynfekcji i sterylizacji narzędzi medycznych stosowany jest aldehyd glutarowy. Aldehyd ortoftalowy – nowy związek tej grupy, ma podobne spektrum do aldehydu glutarowego, ale nie działa drażniąco na oczy i śluzówki nosa i jest stabilny w szerokim zakresie pH. Stosując go uzyskuje się wysoki poziom dezynfekcji endoskopów i innych narzędzi stosowanych w medycynie czy kosmetyce. Aldehyd mrówkowy (formaldehyd) m.in. ze względu na przykry zapach ma ograniczone zastosowanie, ale użyteczne okazały się jego kondensaty z innymi związkami. Zachowują one aktywność formaldehydu przy zredukowanym działaniu drażniącym. Jako konserwanty w produktach kosmetycznych stosuje się pochodne formaldehydu: urotropinę i aminoform – związki o działaniu przeciwbakteryjnym i przeciwwirusowym. Popularnym konserwantem stosowanym w wielu kosmetykach jest też Germall 115, który jest złożonym heterocyklicznym związkiem powoli uwalniającym formaldehyd. Jako środki antyseptyczne stosuje się też kwasy organiczne i ich pochodne np. kwas salicylowy, borowy czy działający przeciwgrzybowo kwas undecylenowy. W produktach kosmetycznych stosuje się je także jako konserwanty. Wysoko cenione są tu estry kwasu sorbowego. Mało toksyczny kwas benzoesowy używany jest do konserwacji żywności. Jego hydroksypochodne (estry: parabeny, nipaginy) są skuteczne przeciw grzybom i bakteriom i są powszechnie stosowane jako konserwanty w kosmetykach. Niestety mają one często działanie alergizujące. Pochodne biguanidyny – chlorheksydyna i aleksydyna to środki, które znalazły zastosowanie głównie jako antyseptyki. Działają bójczo uszkadzając błonę cytoplazmatyczną komórek. Działają przeciwbakteryjnie, ale są nieaktywne w stosunku do prątków gruźlicy i przetrwalników oraz mają ograniczoną aktywność w stosunku do 63 grzybów. Spektrum aktywności chlorheksydyny poszerza się w roztworach alkoholowych lub w połączeniu z czwartorzędowymi związkami amoniowymi. Aleksydyna znalazła zastosowanie jako składnik preparatów do pielęgnacji jamy ustnej i stosowanych w okulistyce np. płynów do soczewek kontaktowych. Chlorowce, głównie chlor, jod i ich związki działają skutecznie i szerokowidmowo na bakterie, grzyby i wirusy. Chlor jako gaz lub składnik wielu dostępnych komercyjnie związków (jako kwas podchlorawy) jest szeroko stosowany jako środek dezynfekcyjny. Skroplony chlor jest używany do dezynfekcji wody i ścieków, a jego nieorganiczne (np. podchloryn sodu) i organiczne (np. chloraminy, halazon) połączenia są skutecznymi środkami dezynfekcyjnymi. Jod to jeden z najaktywniejszych antyseptyków; w postaci J2 działa utleniająco inaktywując białka i enzymy komórki. Stosowany jest w postaci roztworów alkoholowo-wodnych (jodyna) lub jodoforów. Jodyna ma szerokie spektrum działania. Jodofory to połączenia jodu z nośnikami. Mogą nimi być organiczne polimery zdolne do kompleksowania jodu i jego jonów lub związki powierzchniowo czynne. Jod jest powoli uwalniany z tych połączeń. Jodofory zachowują aktywność przeciwdrobnoustrojową, eliminują zaś niekorzystne cechy preparatów jodu: przykry zapach, barwienie skóry, reakcje uczuleniowe czy małą stabilność roztworów. Związki fenolu są stosowane jako środki dezynfekcyjne. Sam fenol nie jest używany, gdyż jest toksyczny. Dostępnych jest jednak wiele produktów zawierających jego pochodne: krezole i dwufenole. Są one zwykle przeznaczone do dezynfekcji podłóg w placówkach służby zdrowia. Zsyntetyzowano też wiele nowych pochodnych o znacznie korzystniejszych właściwościach. Najczęściej wykorzystywane to chlorowcoalkilofenole: chlorokrezol (PCMC) – używany jako środek konserwujący i para-chlorometa-ksylenol (PCMX) – stosowany do dezynfekcji skóry. Trzy inne: 1-benzyl-4-chlorofenol, 2-fenylofenol i para-amylofenol stanowią substancje czynne wielu środków dezynfekcyjnych. Dwufenol – triklosan jest stosowany do dezynfekcji skóry, jest też często składnikiem mydeł i płynów dezynfekcyjnych. 64 Związki utleniające: nadtlenek wodoru i kwas nadoctowy to silnie działające środki dezynfekcyjne, które zawdzięczają swą aktywność tworzeniu wysoce reaktywnych rodników hydroksylowych. Ważną ich zaletą jest nietoksyczność i zdolność ulegania biodegradacji. Nadtlenek wodoru (woda utleniona) w stężeniu 3% stosowany jest jako słaby antyseptyk. Stabilizowane roztwory w stężeniach od 3% do 6% działają skutecznie jako środki dezynfekcyjne. W wysokich stężeniach (do 35%) i w podwyższonej temperaturze nadtlenek wodoru działa bójczo, nawet na przetrwalniki. Kwas nadoctowy ma szersze spektrum działania. Szybko działa bójczo na bakterie, także prątki oraz grzyby, wirusy i przetrwalniki. Działa w obecności materii organicznej. Jest zaliczany do chemicznych środków sterylizujących. Stosowany jest do sterylizacji np. endoskopów, a w połączeniu z nadtlenkiem wodoru - do zimnej sterylizacji urządzeń do dializ. Niestety powoduje korozję niektórych metali i działa drażniąco. Związki powierzchniowo czynne można podzielić na kilka grup. Aktywność przeciwdrobnoustrojową wykazują związki o charakterze amfoterycznym, działające także jako detergenty. Są bardzo często wykorzystywane w chirurgii do higienicznego i chirurgicznego mycia rąk, do dezynfekcji instrumentów medycznych i odkażania podłóg w szpitalach. Najważniejszą z punktu widzenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej grupą są związki kationowe. Działają one bójczo na bakterie, grzyby i wirusy osłonkowe. Niestety, obecność materii organicznej zmniejsza ich aktywność. Do najczęściej stosowanych do dezynfekcji, antyseptyki, a także jako środki konserwujące należą: chlorek i bromek benzalkoniowy i cetrimid (bromek cetylotrimetyloamoniowy). Wśród innych związków o działaniu przeciwdrobnoustrojowym na uwagę zasługują organiczne związki azotu: dichlorowodorek oktenidyny (anilid) i izotiocyjanoguanidyna (poliamina). Dichlorowodorek oktenidyny wchodzi w skład preparatów antyseptycznych o silnym działaniu przeciwdrobnoustrojowym, a izotiocyjanoguanidyna należy do nielicznych związków inaktywujących priony. Popularnym konserwantem stosowanym szeroko w kosmetyce jest Katon CG – heterocykliczny związek o szerokim spektrum przeciwdrobnoustrojowymi dobrze działający w różnym pH. 65 Na rynku dostępnych jest wiele środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych, zwykle są to połączenia kilku substancji czynnych. Antyseptyki najczęściej są różnymi połączeniami alkoholi, chlorheksydyny, bromku lub chlorku benzalkoniowego, w ich skład wchodzą też związki jodu czy chlorowodorek oktenidyny. Środki dezynfekcyjne zawierają często związki chloru, a także aldehydy czy fenole. Wiele produktów zawiera te same substancje czynne, choć składniki towarzyszące mogą wyraźnie podnosić ich skuteczność i nadawać im szczególne cechy. Związki stosowane jako środki konserwujące zawsze stosuje się w mieszaninie kilku preparatów. Zwiększa to zakres ich działania, co jest szczególnie ważne wobec oczekiwanej skuteczności w stosunku do bakterii, ale także pleśni i grzybów chorobotwórczych, i niekiedy pozwala na zmniejszenie stosowanych stężeń, a tym samym ograniczenie szkodliwego działania. Badanie środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych Działanie tych środków ocenia się metodami mikrobiologicznymi, uwzględniając różne czynniki wywierające wpływ na działanie tych środków. Trzeba wziąć pod uwagę: naturalną oporność drobnoustrojów, spodziewaną ich liczbę, warunki (temperatura, pH), w jakich związek będzie stosowany, obecność zanieczyszczeń (szczególnie organicznych) oraz określić stężenie stosowanego środka i czas ekspozycji. Badania takie przeprowadza się w laboratoriach przed wprowadzeniem nowych środków do obrotu. Aktywność tych związków określa się wyznaczając ich najniższe stężenia hamujące wzrost drobnoustrojów – MIC (ang. minimum inhibitory concentration) i najniższe stężenie powodujące śmierć drobnoustrojów – MBC (ang. minimum bactericidal concentration) w mg/L lub g/mL. W przypadku środków dezynfekcyjnych rozpuszczalnych w wodzie stosuje się metodę oceny skuteczności ich działania bakteriobójczego znaną jako „metoda zawiesinowa”. Polega ona na sporządzeniu standaryzowanej zawiesiny testowych drobnoustrojów i wystawieniu jej na działanie 66 odpowiednich rozcieńczeń badanego związku w określonym czasie i temperaturze. W kolejnym etapie badań nowych preparatów wykonuje się symulację działania środka w stosunku do drobnoustrojów, którymi skażone są powierzchnie drobnych przedmiotów (np. metalowych płytek) w „metodzie nośnikowej”. Po określonym czasie ekspozycji na różne stężenia badanego środka określa się stopień redukcji liczby komórek naniesionych na powierzchnię nośnika. Można w ten sposób wyznaczyć stężenie użytkowe, czyli takie, które pozwoli osiągać odpowiedni poziom odkażenia w żądanym czasie. Środki antyseptyczne badane są w podobny sposób przy czym, w metodzie zawiesinowej przewiduje się inne wielkości redukcji inokulum drobnoustrojów oraz inny czas kontaktu drobnoustrojów z antyseptykiem, a stężenie użytkowe wyznacza się w teście sztucznego skażenia skóry ochotników. W praktyce, na przykład w szpitalach czy w laboratoriach, gdy stosowane są określone procedury dezynfekcji znanymi środkami, istotne znaczenie ma ocena skuteczności tych zabiegów. Stosuje się badanie pośrednie, przez określenie zmniejszenia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza czy powierzchni po zastosowaniu odpowiednich środków. Najczęściej stosuje się metodę sedymentacji (przy ocenie skuteczności odkażenia powietrza) i metodę odcisków (przy badaniu powierzchni). Badanie działania środków konserwujących Środki konserwujące są stosowane w preparatach farmaceutycznych i kosmetykach, szczególnie wtedy, gdy produkt jest konfekcjonowany do opakowań wielodawkowych, co w przypadku kosmetyków jest powszechne. W badaniu skuteczności działania konserwantów, potencjalną możliwość skażenia produktu (np. kremu) z zewnątrz symuluje się przez dodanie odpowiedniej dawki (inokulum) znanych drobnoustrojów. Właściwości konserwujące preparatu są zadowalające, jeżeli w zakażonym pojemniku w określonych odstępach czasu następuje znaczący spadek lub nie dochodzi do wzrostu liczby żywych komórek 67 drobnoustrojów testowych. W badaniu wykorzystywane są wrażliwe szczepy bakterii Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i grzybów Candida albicans, Aspergillus niger. Zadania do wykonania Zadanie 1. Badanie bakteryjnego zanieczyszczenia powietrza metodą sedymentacji - Ustaw otwartą płytkę agarową w wybranym miejscu i pozostaw przez 30 minut. - Zamknij płytkę i umieść w cieplarce o temperaturze 37oC na 24 do 48 godzin. - Po inkubacji policz wyrosłe na płytce kolonie i określ liczbę drobnoustrojów w 1 m3 powietrza podstawiając dane do wzoru: Liczba drobnoustrojów w 1 m3 powietrza = x · 100 · 100/ Πr2 · t · 1/5 x – liczba kolonii na płytce (średnia z 3 płytek) 2 Πr – powierzchnia płytki t – czas ekspozycji 68 Zadanie 2. Kontrola bakteryjnego zanieczyszczenia powierzchni metodą odcisków - Płytkę odciskową przyłóż agarem do suchej kontrolowanej powierzchni na czas 10 sekund (nacisk 500 g). - Zamkniętą płytkę umieść w cieplarce o temperaturze 30oC lub 25oC i inkubuj 72 godziny, gdy chcesz wyhodować grzyby przedłuż inkubację do 7 dni. - Po inkubacji policz kolonie wyrosłe na płytce (powierzchnia płytki wynosi 25 cm2). Porównaj wyniki z normami dla różnych powierzchni. Zadanie 3. Określanie skuteczności działania środka antyseptycznego w stosunku do flory bakteryjnej skóry dłoni Badanie działania środka antyseptycznego i kontrola liczby bakterii na skórze nie odkażanej musi być wykonane przez jedną osobę (ilość bakterii na skórze jest cechą osobniczą zależną od wielu czynników i może wahać się w znacznym stopniu). Zatem jedna osoba bada kolejno lewą i prawą rękę. Ocena liczby bakterii na skórze nie odkażanej: - Wlej 10 mL bulionu do jałowej płytki Petriego, płucz w nim opuszki palców jednej ręki przez 1 minutę. - Policz żywe bakterie uwolnione ze skóry do bulionu metodą posiewu powierzchniowego przenosząc 0,1 mL bulionu na płytkę krwawą i równomiernie rozprowadź zagiętą ezą. 69 Ocena liczby bakterii na skórze dłoni po zastosowaniu środka antyseptycznego (np. 0,5% Abacilu w etanolu, 2% chloraminy lub Skinmanu i mydła). - Wlej 10 mL środka antyseptycznego do jałowej płytki Petriego. - Wlej 10 mL bulionu do drugiej płytki. - Płucz w środku antyseptycznym opuszki palców nie badanej wcześniej ręki przez 1 minutę. - Opłucz palce polewając je jałową wodą i wysusz w jałowym powietrzu (w pobliżu zapalonego palnika). - Zanurz opuszki palców w płytce z bulionem i płucz je przez 1 minutę. - Policz żywe bakterie uwolnione do tego bulionu metodą posiewu powierzchniowego tak jak poprzednio. - Opróżnij płytki z płynów a pożywki z posiewami umieść w cieplarce o (37 C, ok. 20 godzin). - Po inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na obu płytkach - Porównaj liczbę bakterii przed i po działaniu środka antyseptycznego. - Oceń jego skuteczność: 70 Zadanie 4. Wpływ materii organicznej na aktywność przeciwbakteryjną środków dezynfekcyjnych W tym doświadczeniu materię organiczną reprezentować będą inaktywowane komórki drożdży. W zależności od rodzaju badań zadanie to spełniać może także albumina, mleko lub wyciąg drożdżowy. - Dostajesz dwie płytki agarowe, na które odsiejesz zawiesiny po kontakcie ze środkiem dezynfekcyjnym trwającym 1, 5, 10 i 20 minut (dla mieszaniny testowej i dla kontroli) – każdą z nich opisz dzieląc na 4 sektory. - Dostajesz dwie probówki zawierające po 0,5 mL hodowli bulionowej S. aureus: - do tej, w której będziesz badać same bakterie dodaj 0,5 mL roztworu NaCl - kontrola, - do tej, w której będą one chronione przez materię organiczną dodaj 0,5 mL zawiesiny inaktywowanych drożdży - mieszanina testowa. - Do probówki z mieszaniną testową i do kontroli dodaj po 0,5 mL środka dezynfekcyjnego. Wymieszaj delikatnie zawartość probówek. Po 1, 5, 10 i 20 minutach odsiej materiał na odpowiednie sektory płytek. Używaj ezy o oczku tej samej wielkości i dbaj o pobranie pełnego oczka materiału. - Płytki wstaw do cieplarki 37oC na ok. 20 godzin. - Oceń wyniki i wpisz je do tabeli używając następujących symboli: 1 - 15 lub mniej kolonii w sektorze 2 - więcej niż 15 kolonii, ale mniej niż wzrost zlewny 3 - wzrost zlewny lub niepoliczalna liczba kolonii 1 minuta 5 minut 10 minut 20 minut Mieszanina testowa: bakterie + materia organiczna + środek dezynfekcyjny 71 Kontrola: bakterie + środek dezynfekcyjny Zadanie 5. Wpływ promieniowania UV na bakterie W tym doświadczeniu bakterie (Escherichia coli) będą eksponowane na działanie promieniowania UV przez okres 1 minuty i przez 30 minut. - Opisz dwie płytki agarowe (nazwa bakterii, 1 min., 30 min. (czas naświetlania) - Zanurz waciki w hodowli płynnej Escherichia coli, odciśnij nadmiar płynu o ścianki probówki i zasiej nimi gęsto całą powierzchnię płytek agarowych. - Przykryj część posianej powierzchni płytki układając na niej jałową pęsetą papierowy szablon. - Naświetlaj pod lampą UV powierzchnię otwartych płytek: jednej przez 1 minutę, drugiej przez 30 minut. - Po naświetlaniu zdejmij jałową pęsetą szablony i wrzuć je do słoja z chloraminą. - Umieść płytki w cieplarce (37oC na ok. 20 godzin). - Po inkubacji oceń działanie promieniowania UV na Escherichia coli po różnym czasie ekspozycji. Jaki czas naświetlania jest konieczny do zabicia bakterii? 72 Jakie są jego zalety i wady tego promieniowania? 73 74 Rozdział 7 Sterylizacja Część teoretyczna Wyjaławianie (sterylizacja) to proces, którego celem jest uwolnienie wyjaławianego materiału od form życia w każdej postaci. Oznacza zatem dekontaminację obejmującą wszystkie drobnoustroje i ich formy. Wyjaławianie ma podstawowe znaczenie w medycynie, farmacji, i kosmetologii. W medycynie sterylizacji podlegają wszystkie przedmioty tzw. wysokiego i średniego ryzyka przeniesienia zakażenia: narzędzia chirurgiczne, cewniki, wszczepy, oraz sprzęt diagnostyczny mający kontakt z błonami śluzowymi i uszkodzonymi powłokami. Zabiegi sterylizacji wymagają często odpowiedniego wstępnego przygotowania materiałów. Ważny jest też wybór właściwej metody, stosowanie jej zgodne z procedurami oraz systematyczna kontrola sprawności urządzeń. Sterylizowane przedmioty muszą być odpowiednio zabezpieczone (zapakowane), aby po zakończeniu procesu można je było bezpiecznie przenieść i przechować do chwili użycia. Metody Sterylizację wykonuje się stosując metody z wykorzystaniem wysokiej temperatury (wysokotemperaturowe). Sterylizacja bieżąca parą wodną – tyndalizacja Do sterylizacji płynów zawierających termolabilne składniki stosuje się wyjaławianie parą wodną w ciśnieniu atmosferycznym. Przeprowadza się je w aparacie Kocha, w którym, w bieżącej parze wodnej osiąga się temperaturę 100oC. W tej temperaturze w ciągu 60 minut giną wszystkie formy wegetatywne drobnoustrojów, a przetrwalniki ulegają termicznej aktywacji i następnie, pozostawione w temperaturze pokojowej, kiełkują. Po upływie doby już jako formy wegetatywne zostają zabite w kolejnym cyklu sterylizacyjnym. Aby uzyskać pewność, że materiał jest jałowy 75 ogrzewamy go po raz trzeci. Metoda ta jest stosowana prawie wyłącznie do wyjaławiania pożywek mikrobiologicznych. Sterylizacja parą wodną w nadciśnieniu Jest to najczęściej stosowana metoda sterylizacji przeprowadzanej w specjalnych urządzeniach – autoklawach. Skuteczność sterylizacji zależy w nich od całkowitego usunięcia powietrza z komory i od jakości pary wodnej (wody). Zastosowanie nasyconej pary wodnej w nadciśnieniu o 1 Atm. pozwala osiągnąć temperaturę 121 C. Czas sterylizacji w tych warunkach wynosi 15 - 20 minut. W ten sposób sterylizuje się wiele pożywek a także przedmioty z gumy i tworzyw sztucznych. Przy nadciśnieniu 2 Atm. temperatura pary osiąga 134oC, a czas potrzebny na wysterylizowanie materiałów wynosi od 3,5 do 7 minut. W tych warunkach jałowi się narzędzia chirurgiczne, bieliznę operacyjną, szkło i materiały opatrunkowe oraz niektóre pożywki do hodowli drobnoustrojów. W autoklawie można wyjaławiać wszystkie termostabilne materiały, do których ma szansę przeniknąć para wodna. Ma ona właściwości głęboko penetrujące i w krótkim czasie prowadzi do zabicia drobnoustrojów, w tym najbardziej opornych na temperaturę wirusów (HBV) oraz zarodników grzybów i przetrwalników bakterii. Sterylizacja gorącem suchym Wyjaławianie gorącym suchym powietrzem przeprowadza się w suszarkach z wymuszonym obiegiem powietrza. Suche powietrze jest złym przewodnikiem ciepła, sterylizację należy prowadzić w wyższej niż w autoklawie temperaturze i w dłuższym czasie. Zwykle stosuje się temperaturę w granicach 160-180oC w czasie do dwóch godzin. o Najczęściej stosuje się temperaturę 170 C przez 2 godziny. W takich warunkach giną wszystkie drobnoustroje i ich przetrwalniki. Metoda ta służy do wyjaławiania szkła, termostabilnych substancji sypkich oraz olejów i podstaw maściowych. Sterylizacja suchym powietrzem ma ograniczone zastosowanie i jest kosztowna. Uważana jest za przestarzałą i w wielu krajach Unii Europejskiej jest już prawie całkowicie wycofana. Może być z powodzeniem zastąpiona przez inne metody. 76 Skutecznym sposobem sterylizacji jest spalanie w płomieniu, ale ma ono wąskie zastosowanie (np. do wyjaławiania ezy, czy niszczenia materiału zakaźnego). Sterylizacja promieniowaniem podczerwonym Jest to sposób sterylizacji o zastosowaniu przemysłowym, ale konstruowane są nowe urządzenia, które pozwolą na wykorzystanie tego promieniowania w mniejszej skali. Sterylizacja promieniowaniem podczerwonym o długości fali 700 nm do 1 mm (ang. infrared sterilization) wykazuje bardzo dużą skuteczność w stosunku do wszystkich drobnoustrojów w tym wirusów zapalenia wątroby, najbardziej opornych przetrwalników (tężca, jadu kiełbasianego, Geobacillus stearothermophilus), grzybów i ich zarodników oraz prionów. Sterylizowane przedmioty umieszczane są w specjalnych metalowych pojemnikach. Cykl sterylizacyjny nie przekracza kilku minut o w temperaturze ok. 190 C. Sterylizowane mogą być praktycznie wszystkie materiały. Procesy sterylizacji mogą być przeprowadzane także w niskich temperaturach (metody niskotemperaturowe) Sterylizacja gazowa W przemyśle medycznym sterylizacja gazowa jest stosowana do wyjaławiania różnego sprzętu medycznego, w tym jednorazowego użytku wykonanego z materiałów termolabilnych. Przy zastosowaniu tlenku etylenu w przeszłości stosowano mieszaninę tego gazu z nośnikiem (np. CO2) Obecnie urządzenia wykorzystują czysty (100%) tlenek etylenu a proces zachodzi w podciśnieniu co zwiększa jego bezpieczeństwo. Wadą procesu jest bowiem toksyczność gazu i stosunkowo długi czas trwania procesu. Zaletą metody jest dobra penetracja gazu zapewniająca dużą skuteczność oraz trwałość tworzyw sztucznych w warunkach sterylizacji. Sterylizację można także przeprowadzać formaldehydem. Stosuje się jego mieszaninę z parą wodną. Zwykle stosuje się 2-5% formaldehydu oraz parę wodną do wilgotności przekraczającej 70%. W urządzeniach nowej generacji proces zachodzi w temperaturze około 45oC w czasie 2-4 godzin. 77 Metoda ta wykorzystywana jest w warunkach szpitalnych do sterylizacji giętkich endoskopów. Formaldehyd ma jednak słabe właściwości penetrujące i niszczy niektóre materiały np. gumę. Sterylizacja radiacyjna Źródłem wykorzystywanego w tej metodzie promieniowania gamma są zazwyczaj izotopy promieniotwórcze. Promieniowanie stosowane w dużych dawkach nieodwracalnie niszczy DNA i błony komórkowe drobnoustrojów. Proces zachodzi w temperaturze pokojowej, ale dla preparatów labilnych można temperaturę znacznie obniżyć. Metoda jest kosztowna, ale często stosowana w przemysłowej sterylizacji sprzętu medycznego, materiałów opatrunkowych, materiałów implantacyjnych. Sterylizacja plazmowa Wytwarzana w warunkach próżni w polu magnetycznym plazma jest zjonizowanym gazem otrzymywanym z nadtlenku wodoru. Proces odbywa o się w temperaturze 40-60 C co pozwala na sterylizację sprzętu medycznego wrażliwego na wysokie temperatury a więc trudnego do wysterylizowania innymi metodami. Penetracja plazmy do wnętrza urządzeń nie jest jednak najlepsza i na przykład dla sterylizacji endoskopu trzeba wprowadzać porcje plazmy bezpośrednio do światła przewodu. Po około godzinie sprzęt jest gotowy do użycia co jest ważną zaletą tej metody. Filtracja Filtracja to przepuszczanie płynów lub gazów przez filtry o porach na tyle małych, aby zatrzymać drobnoustroje. Metoda ta jest powszechnie stosowana, a szczególnie przydatna do wyjaławiania ciepłochwiejnych płynów. Jej zaletą jest usuwanie żywych i martwych drobnoustrojów i ich przetrwalników, a także zanieczyszczeń mechanicznych. Najczęściej wykorzystywane są sączki membranowe. Najbardziej popularne filtry o średnicy porów od 0,22 μm i 0,45 μm zatrzymują tylko grzyby i bakterie, ale są i filtry o porach mniejszych (aż do 0,01 μm), które mogą także zatrzymywać wirusy dając gwarancję pełnej sterylności. Filtry membranowe znalazły zastosowanie w aptekach, zakładach 78 farmaceutycznych, szpitalach, także do filtracji powietrza w salach operacyjnych, gabinetach zabiegowych czy boksach do pracy aseptycznej. Metody kontroli urządzeń sterylizujących Niesterylność wyjaławianych materiałów może wynikać z niewłaściwie przeprowadzonego procesu ich sterylizacji, wadliwie działających urządzeń sterylizujących lub być wynikiem późniejszego zakażenia w wyniku nieprzestrzegania zasad aseptyki w trakcie ich przechowywania lub wykonywania posiewów. Urządzenia sterylizujące muszą podlegać okresowej kontroli. Skuteczność procesu sterylizacji bada się za pomocą wskaźników fizycznych, chemicznych i biologicznych. Wskaźniki fizyczne - termometry, manometry, zegary, mierniki wilgotności, mierniki zawartości gazu i inne przyrządy wmontowane do urządzenia sterylizującego informują tylko o jego stanie technicznym. Mierzą punktowo dany parametr. Oprócz obserwacji wskazań tych przyrządów coraz częściej stosuje się system rejestracji podstawowych parametrów fizycznych w postaci wydruków, wykresów lub raportów. Wskaźniki chemiczne zawierają substancje chemiczną, która trwale zmienia swoje zabarwienie, kiedy zostaną osiągnięte właściwe parametry sterylizacji. Testy te maja postać rurek, pasków czy taśm. Wskaźniki chemiczne informują jedynie czy w danym cyklu pracy zostały osiągnięte warunki sterylizacji, nie dają one gwarancji, że poddany sterylizacji materiał został wyjałowiony. W tak zwanych wskaźnikach jednoparametrowych zmiana barwy następuje pod wpływem osiągnięcia jednego z parametrów sterylizacji, najczęściej temperatury. Nie wykazują one jednak jak długo ta temperatura się utrzymywała. Chemiczne wskaźniki wieloparametrowe wykazują, że w trakcie sterylizacji zostały osiągnięte wartości wszystkich lub kilku (przynajmniej dwóch) parametrów sterylizacji. Informują one zatem o prawidłowości przebiegu procesu sterylizacji. 79 Wskaźniki biologiczne - zawierają określoną liczbę żywych, zdolnych do przejścia w formy wegetatywne, wysoce opornych na działanie temperatury przetrwalników bakteryjnych. Wykorzystywane są przetrwalniki Geobacillus stearothermophilus lub Bacillus subtilis zawarte, odpowiednio, w zestawach testowych Sporal A (kontrola autoklawów) i Sporal S (kontrola suszarek). Wskaźniki te informują o fakcie zabicia przetrwalników. Wskaźniki biologiczne dają gwarancję jałowości - jeżeli użyte w teście przetrwalniki zostały zabite oznacza to, iż zostały zabite wszystkie bardziej wrażliwe drobnoustroje zanieczyszczające sterylizowany materiał. Dla uzyskania pełnej informacji o urządzeniu niezbędne jest monitorowanie procesu sterylizacji za pomocą wszystkich trzech metod. Skuteczność urządzeń sterylizujących powinna być kontrolowana przy użyciu wskaźników fizycznych i chemicznych w czasie każdego procesu sterylizacji. Ponadto okresowo należy je kontrolować przy użyciu wskaźników biologicznych. Zdania do wykonania Zadanie 1. Kontrola skuteczności sterylizacji w autoklawie za pomocą testu chemicznego - Włóż test do probówki i umieść ją w małym autoklawie. Warunki sterylizacji: 121oC, 30 minut, nadciśnienie 1Atm. - Po zakończonej sterylizacji wyjmij wskaźnik. - Oceń sprawność urządzenia. 80 Zadanie 2 Kontrola skuteczności chemicznego sterylizacji w suszarce za pomocą testu - Sprawdź temperaturę suszarki (180oC) i umieść w niej probówkę z testem. Zanotuj czas. - Po 30 minutach sterylizacji wyjmij probówkę z suszarki. - Oceń sprawność urządzenia 81 82 Rozdział 8 Drobnoustroje bytujące na skórze Część teoretyczna Zdrowa skóra, podobnie jak wiele innych miejsc organizmu człowieka, jest skolonizowana przez drobnoustroje. Stanowią one naturalną (fizjologiczną) mikroflorę odgrywającą ważną pozytywna rolę. Te z nich, które bytują tam stale, nazywamy stałymi rezydentami. Na 1cm2 powierzchni skóry żyje 10-100 tysięcy komórek bakteryjnych. Wśród nich dominują gramdodatnie bakterie: ziarenkowce z rodzaju Staphylococcus (gronkowce), pałeczki rodzajów Corynebacterium (maczugowce), Propionibacterium oraz Brevibacterium (skóra stóp). Na zdrowej skórze bytują także drożdżopodobne grzyby z rodzaju Candida, a w mieszkach włosowych można znaleźć lipofilne Pityrosporum ovale (Malassezia furfur). Skład flory skóry jest warunkowany panującymi tam warunkami, małą wilgotnością, niskim pH, dużym stężeniem soli i obecnością licznych kwasów tłuszczowych. Bakterie i grzyby bytujące na skórze wykorzystują jako źródło pokarmu związki znajdujące się w wydzielinach gruczołów potowych (m.in. aminokwasy, mocznik, kwas moczowy i mlekowy), łojowych (glicerydy, fosfolipidy, kwasy tłuszczowe, cholesterol) oraz keratynę pochodzącą ze złuszczonej warstwy rogowej naskórka. Uszkodzenie skóry, naruszenie równowagi bytujących tam organizmów lub też obniżenie odporności gospodarza może doprowadzić do jej kolonizacji gatunkami potencjalnie chorobotwórczymi albo spowodować nadmierne namnożenie się pojedynczych gatunków, które wchodzą w skład flory fizjologicznej. Może to doprowadzić do rozwinięcia się infekcji oportunistycznych. Drobnoustroje je wywołujące nazywamy patogenami oportunistycznymi. Infekcje skóry mogą być także spowodowane grzybami – dermatofitami. Niekiedy, niektóre gatunki chorobotwórczych bakterii mogą skolonizować skórę i przedsionek nosa osób zdrowych, nie powodując żadnych konsekwencji – stan ten nazywamy nosicielstwem. 83 Rezydentna flora skóry Na zdrowej skórze dominują gronkowce, przede wszystkim gatunki określane nazwą: gronkowce koagulazoujemne. Bardzo liczne są też mikroaerofilne Propionibacterium spp. Maczugowce, a wśród nich maczugowce lipofilne, stanowią mniej liczny, ale stały składnik tej populacji. Grzyby jako składnik fizjologicznej mikroflory są spotykane znacznie rzadziej. Skład ilościowy naturalnej flory jest jednak, w pewnych granicach, cechą osobniczą i może się różnić u różnych osób. Dodatkowo, skład mikroflory skóry ściśle zależy od rozmieszczenia na niej poszczególnych gruczołów. Miejsca suche są zasiedlane głównie przez Staphylococcus spp. W miejscach z licznymi gruczołami potowymi występują przede wszystkim Corynebacterium spp., a także nieliczne bakterie gramujemne, zaś miejsca bogate w gruczoły łojowe zasiedlają Propionibacterium spp. Bakterie Rodzaj Staphylococcus – gronkowce S. epidermidis (gronkowiec naskórkowy) – komensal; składnik fizjologicznej mikroflory skóry i błon śluzowych, patogen oportunistyczny S. saprophyticus (gronkowiec saprofityczny) – występuje w środowisku nieożywionym i na skórze, patogen oportunistyczny. S. aureus (gronkowiec złocisty) – chorobotwórczy; może znajdować się u nosicieli na skórze (głównie przedsionek nosa) i śluzówkach; w środowisku nieożywionym (żywność, kurz). Liczne inne gatunki to komensale i saprofity; mogą być patogenami oportunistycznymi Komórki gronkowców są formami kulistymi, tworzącymi nieregularne układy przypominające grona. Są gramdodatnie. 84 Gronkowce namnażają się dobrze na prostych pożywkach (np. bulion, agar odżywczy), w warunkach normalnej atmosfery. Są względnymi beztlenowcami i wytwarzają katalazę. Kolonie S. aureus mają często barwę żółtą do pomarańczowej, kolonie pozostałych gatunków są białe lub szarawe. Na agarze z krwią kolonie S. aureus otoczone są strefą hemolizy typu β, pozostałe gatunki przeważnie nie hemolizują krwinek. Gronkowce mogą długo przeżywać w środowisku i są oporne na wysychanie. Gronkowiec złocisty wytwarza koagulazę. Wykrywanie koagulazy jest najważniejszą cechą odróżniającą S.aureus od innych gatunków rodzaju, których znaczna większość nie wytwarza tego enzymu i nazywane są zwyczajowo gronkowcami koagulazoujemnymi CNS (ang. coagulasenegative staphylococci). Staphylococcus aureus wywołuje: ropne zapalenia skóry i tkanki podskórnej (liszajec zakaźny, zapalenie mieszków włosowych, figówkę, czyraki, ropnie), infekcje głębokie (sepsa, zapalenie płuc, zapalenie szpiku kostnego) oraz choroby o charakterystycznym obrazie wynikającym z działania odpowiednich toksyn immunomodulujących. Gronkowce złociste występujące u nosicieli mogą być przyczyną zakażeń endogennych, a także przenosić się na inne osoby lub przedostawać do żywności, kosmetyków bądź preparatów farmaceutycznych podczas ich produkcji. Staphylococcus epidermidis może być przyczyną, najczęściej szpitalnych, infekcji oportunistycznych (zapalenie wsierdzia i sepsa), szczególnie u osób z implantami z tworzyw sztucznych (np. sztuczne zastawki serca). Staphylococcus saprophyticus może powodować infekcje układu moczowego, przeważnie u kobiet w wieku rozrodczym. Rodzaj Corynebacterium – maczugowce C. jeikeium – gatunek lipofilny zasiedlający skórę (flora fizjologiczna), może być przyczyną różnych zakażeń oportunistycznych (także szpitalnych). 85 C. minutissimum – występuje na skórze, patogen oportunistyczny; wywołuje łupież rumieniowy – powierzchowne zmiany zapalne skóry. C. diphtheriae (maczugowiec błonicy) – chorobotwórczy, może występować u nosicieli na skórze i na śluzówkach nosa i gardła. C. pseudodiphtheriticum (maczugowiec rzekomobłoniczy) – komensal bytujący na błonach śluzowych układu oddechowego (flora fizjologiczna), może być oportunistycznym patogenem. Komórki maczugowców mają postać pałeczek zgrubiałych na jednym końcu. Są gramdodatnie. Tworzą układy przypominające litery X,V,Y lub palisady (komórki ułożone równolegle). Charakterystyczna jest obecność w komórkach metachromatycznych ziaren polifosforanowych (wolutyna), które można obserwować barwiąc preparat metodą Neissera. Maczugowce wymagają do wzrostu pożywek wzbogaconych. Najlepiej namnażają się na podłożu Loefflera. Większość gatunków to względne beztlenowce. Wszystkie wytwarzają katalazę. Corynebacterium diphtheriae wywołuje błonicę (dyfteryt) układu oddechowego lub skóry. Najczęściej miejscowe zmiany zapalne (szare naloty – błony rzekome) dotyczą błony śluzowej gardła, migdałków, czasem krtani. Błonica skóry może mieć różne postacie kliniczne. W postaci wrzodziejącej błony rzekome pojawiają się na dnie owrzodzeń. Corynebacterium minutissimum wywołuje powierzchowne zmiany zapalne skóry w postaci łupieżu rumieniowego, głównie u osób o niskim poziomie higieny osobistej i zakażenia oportunistyczne o różnym umiejscowieniu. Rodzaj Propionibacterium P. acnes – komensal, składnik fizjologicznej mikroflory skóry, szczególnie okolic bogatych w gruczoły łojowe. Patogen oportunistyczny. 86 Polimorficzne pałeczkowate komórki Propionibacterium acnes tworzą układy przypominające litery X,V,Y, podobne do maczugowców. Są gramdodatnie. Pałeczki Propionibacterium wymagają do wzrostu pożywek wzbogaconych (np. agar z krwią). Są mikroaerofilami, lecz najlepiej namnażają się w warunkach beztlenowych. Większość szczepów wytwarza katalazę. P. acnes wywołuje zapalenie mieszków włosowych oraz trądzik pospolity, może też być przyczyną zakażeń oportunistycznych w obrębie układu krążenia (np. zapalenie wsierdzia). Grzyby Candida albicans – grzyby drożdżopodobne; w niewielkich ilościach normalna flora przewodu pokarmowego i skóry. Mogą wywołać kandydozy – skóry i błon śluzowych lub uogólnione oportunistyczne infekcje u osób z obniżoną odpornością. Malassezia furfur – lipofilne grzyby drożdżopodobne stanowiące normalną florę skóry. Może wywoływać łupież pstry – łagodną powierzchowną infekcję skóry oraz zapalenie mieszków włosowych. Zwykle wzrost grzybów na pożywkach jest hamowany przez występujące na skórze bakterie. Podłożem na którym te grzyby wyrastają w ciągu 2-4 dni jest agar Sabouraud. Dodatek antybiotyku stanowi element wybiórczy, hamujący wzrost bakterii. Metody Wytwarzanie czynnika skupiania (CF – ang. clumping factor) S.aureus wytwarza tzw. czynnik skupiania, którego wykrycie stanowi jedną z metod identyfikacji tego gatunku. Jest to związany z powierzchnią 87 komórki receptor dla fibrynogenu osocza. Ten przekształcając się w fibrynę tworzy nici zlepiające komórki w widoczne makroskopowo agregaty. Wykonanie próby Na szkiełko podstawowe należy nanieść dwie krople wody lub fizjologicznego roztworu NaCl. W obu kroplach należy zawiesić pobrane ezą z hodowli stałej gronkowce (zawiesina powinna wyglądać jak kropla mleka) Do jednej z kropli dodać uszko ezy nierozcieńczonego osocza króliczego i zamieszać ezą Wynik odczytać po 10 – 15 sekundach i następnie po 3 minutach. Wynik: pojawienie się agregatów komórek w zawiesinie z dodatkiem osocza – próba dodatnia (obecność czynnika skupiania); brak zlepiania komórek – próba ujemna. Zawiesina w kropli roztworu NaCl na szkiełku powinna zostać homogenna – jest to kontrola zawieszalności szczepu. Niektóre gronkowce zlepiają się samoistnie w roztworze NaCl lub wodzie (tworzenie agregatów w kropli kontrolnej) i u takich szczepów nie bada się wytwarzania CF. Zadania do wykonania Zadanie 1. Wykonanie wymazu z przedsionka nosa - Jałowy wacik (wymazówkę) zwilż w jałowym roztworze NaCl i wykonaj wymaz pocierając watką o ściany przedsionka nosa. - Posiej pobrany materiał z wacika na agar z krwią metodą redukcyjną. o - Płytkę inkubuj w cieplarce w 37 C przez około 20 godzin. - Po inkubacji opisz w poniższej tabeli wygląd płytki z posiewem. Zadanie 2. Identyfikacja kolonii należących do rodzaju Staphylococcus 88 - Wykonaj dwa preparaty barwione metodą Grama z własnego posiewu wybierając dwie kolonie o morfologii sugerującej przynależność do rodzaju Staphylococcus. Jeśli w posiewie są takie, wybierz kolonie o cechach, które mogą sugerować przynależność do gatunki S.aureus (zabarwienie, hemoliza). Pobierz minimalną ilość materiału, żeby go starczyło na kolejne próby. - Wykonaj próbę na katalazę z tych samych kolonii, z których przygotowujesz preparaty - Oceń preparaty i wynik prób na katalazę. Wyniki zapisz w poniższej tabeli. Zadanie 3. Identyfikacja kolonii S.aureus na podstawie próby na CF - Wykonaj próbę na CF tych samych kolonii - Wynik wpisz do zamieszczonej poniżej tabeli - Opisz wygląd płytki w własnym posiewem - Opisz dwie wybrane przez siebie kolonie uwzględniając ich istotne dla gronkowców cechy (kształt, zabarwienie, hemoliza, morfologia komóreknarysuj preparat): Kolonia 1. 89 Kolonia 2. - Wynik próby na katalazę: Kolonia 1. Kolonia 2. Wynik próby na CF: Kolonia 1. Kolonia 2. Czy jesteś nosicielem gronkowców złocistych? 90 Rozdział 9 Liczenie bakterii Część teoretyczna Oznaczenie liczby bakterii ma zastosowanie w wielu dziedzinach mikrobiologii. Jest ono przydatne między innymi w ocenie czystości mikrobiologicznej leków, kosmetyków i żywności, w badaniu bakteriologicznym wody, ścieków, powierzchni produkcyjnych i powietrza, przy produkcji szczepionek, w kontroli skuteczności działania środków myjących i dezynfekujących, a w diagnostyce laboratoryjnej – w ocenie liczby bakterii w moczu. Oznaczać można całkowitą liczbę bakterii, to znaczy łącznie komórki żywe i martwe lub tylko liczbę żywych komórek. Obliczanie całkowitej liczby komórek można wykonać mikroskopowo przez bezpośrednią obserwację i liczenie komórek bakteryjnych: w preparacie barwionym, w hemacytometrach, np. kamerze Thoma, na sączku membranowym, przez który uprzednio przesączono badaną próbkę o określonej objętości. Bakterie obecne na sączku barwi się najczęściej błękitem metylenowym lub roztworem erytrozyny. Metoda stosowana jest na przykład przy badaniu wody i ścieków. Można też posłużyć się metodami turbidymetrycznymi - porównując zmętnienie badanych zawiesin z odpowiednimi wzorcami o znanej liczbie komórek - wzrokowo lub za pomocą fotometru. Przy stosowaniu tych metod potrzebne są krzywe wzorcowe odnoszące liczbę komórek (policzonych innymi metodami) do gęstości optycznej zawiesiny. Całkowitą liczbę bakterii można też określić metodami chemicznymi – przez oznaczenie całkowitego azotu, fosforu, białek lub kwasów nukleinowych. Metoda ma zastosowanie głównie w pracach badawczych. Liczbę żywych, to znaczy zdolnych do podziału, komórek bakteryjnych oznacza się wymienionymi poniżej metodami hodowlanymi. 91 Metoda posiewu na podłoże stałe (metoda płytkowa) – polega na liczeniu kolonii po swobodnym (pod wpływem sił grawitacyjnych metoda Kocha) lub wymuszonym (metoda aspiracyjna, uderzeniowo-zderzeniowa) osiadaniu bakterii na powierzchni podłoża. Metoda ta stosowana jest przy badaniu czystości mikrobiologicznej powietrza. Metoda płytek odciskowych – wykorzystuje podłoże agarowe, tworzące w płytce Petriego menisk wypukły, który przykłada się na kilka sekund do badanej powierzchni. Po inkubacji liczy się wyrosłe kolonie, a wynik ocenia w zależności od przyjętych kryteriów. Metoda służy do monitorowania mikrobiologicznego skażenia powierzchni szpitalnych i przemysłowych (ściany, podłogi, sprzęt). Metoda posiewu powierzchniowego lub głębinowego (płytki lane) jest najczęściej stosowana w praktyce laboratoryjnej. Dotyczy przede wszystkim preparatów o spodziewanej dużej liczbie drobnoustrojów, dlatego konieczne jest wstępne wielokrotne rozcieńczenie badanej próbki. Metoda posiewu na podłoże płynne (metoda probówkowa) jest oznaczeniem najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL). Metoda filtrów membranowych - polega na przesączeniu określonej objętości badanego płynnego preparatu przez odpowiedni filtr. Filtr ten nakłada się następnie na powierzchnię podłoża stałego. Po inkubacji liczy się wyrosłe na sączku kolonie. Żywe bakterie można zliczyć także innymi metodami. Jedna z nich jest metodą mikroskopową (bezpośrednia epifluorescencja), w której barwi się barwnikiem fluorescencyjnym żywe bakterie na sączku membranowym, przez który uprzednio przesączono badaną próbkę o określonej objętości. Metoda ta stosowana jest w przemyśle mleczarskim do oceny bakteriologicznej surowego mleka. 92 Można także zastosować metody pośrednie. Są to metody szybkie, ponieważ skracają zwykle 24-48-godzinny (lub dłuższy) okres inkubacji typowy dla metod hodowlanych, ale wymagają drogiej aparatury i odczynników. Jedną z nich jest luminometria - pomiar chemiluminescencji lub bioluminescencji, będącej efektem hydrolizy adenozynotrójfosforanu ATP, obecnego w każdej żywej komórce. Metoda stosowana jest w kontroli czystości mikrobiologicznej powierzchni produkcyjnych, urządzeń i rękawic na rękach pracowników w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, farmaceutycznym, przy badaniu żywności, czystości wody pitnej, a także kontroli skuteczności działania środków myjących i dezynfekujących. Można także zastosować metody manometryczne – dokonując pomiaru zużycia O2 lub wytwarzania CO2 przez rosnące drobnoustroje. Metoda hodowlana z użyciem pożywki o zmienionych parametrach elektrycznych pozwala na szybkie wykrycie drobnoustrojów, które namnażając się, wytwarzają silnie zjonizowane metabolity. Znajduje ona zastosowanie między innymi w biodetektorach służących do oceny skażenia mikrobiologicznego środowiska. Każda z tych metod wymaga odpowiedniej standaryzacji, aby pomiar mógł być ilościowy. Metody Standaryzacja zawiesin bakteryjnych Badania mikrobiologiczne wymagają niekiedy zastosowania standaryzacji gęstości zawiesin czy hodowli tak, aby do badań używać próbek o powtarzalnej liczbie bakterii. Najczęściej stosuje się standaryzację według powszechnie przyjętego wzorca zmętnienia - skali opracowanej przez McFarlanda. W skład zestawu tej skali wchodzi kilka probówek zawierających mieszaniny 1% roztworu chlorku baru i 1% roztworu kwasu siarkowego. Zmętnienie powstałe w wyniku wytrącenia się osadu siarczanu baru optycznie przypomina bardzo zmętnienie, jakie tworzy w 93 wodzie zawiesina bakterii. Odpowiednia standaryzacja uzyskana poprzez liczenie bakterii różnymi metodami pozwoliła przypisać odpowiedniemu określonemu numerem zmętnieniu wzorca, odpowiednią gęstość zawiesiny bakterii. Porównania zmętnienia badanej zawiesiny bakteryjnej ze zmętnieniem w probówkach skali McFarlanda dokonuje się wzrokowo lub przy użyciu prostego, przenośnego nefelometru. Pozwala ono na oszacowanie liczby bakterii w 1 mL zawiesiny. Ważnym czynnikiem decydującym o dokładności odczytu jest przygotowanie badanej zawiesiny w probówce z takiego samego szkła i o takiej samej średnicy, jak probówki ze wzorcem skali McFarlanda. Ta metoda określania całkowitej liczby bakterii martwych i żywych jest wykorzystywana przy standaryzacji zawiesin bakteryjnych przed wykonaniem antybiogramu czy testów identyfikacyjnych. Laboratoria korzystają zazwyczaj z gotowych wzorców skali McFarlanda oferowanych przez różnych producentów. Tabela 1. Przygotowanie skali McFarlanda Numer wzorca Liczba bakterii CFU/mL 0,5 1 2 1,5 x 108 8 3 x 10 8 6 x 10 Rozcieńczanie hodowli bakterii dla potrzeb liczenia bakterii żywych Płyny zawierające dużą liczbę bakterii należy przed posiewem rozcieńczyć metodą seryjnych rozcieńczeń tak, aby zawierały zawiesiny komórek policzalnych metodą posiewu. Stopień rozcieńczenia musi być znaczny, gdyż na płytkę o średnicy ok. 9 cm posiewa się 0,1 mL zawiesiny, 2 a jako osobne (policzalne) może się na niej utworzyć najwyżej 300 (3x10 ) kolonii. Tymczasem hodowla płynna większości bakterii zawiera 7 12 przeciętnie 10 -10 komórek bakterii w mililitrze. Najczęściej wykonuje się szereg kolejnych 10-krotnych rozcieńczeń w postępie geometrycznym. Rozcieńczenia wykonuje się następująco: 94 do szeregu, najczęściej 7 do12 probówek, nalewa się po 9 mL fizjologicznego roztworu NaCl; do pierwszej dodaje się 1 mL rozcieńczanej zawiesiny; następnie przenosi się po 1 mL zawiesiny z probówki do probówki tak jak pokazuje to schemat na poniższej rycinie; z ostatniej probówki, po wymieszaniu, 1 mL wylewa się do słoja ze środkiem dezynfekcyjnym. Rozcieńczenia wykonuje się przy użyciu szklanych jałowych pipet lub pipet automatycznych z jałowymi końcówkami. Trzeba pamiętać, aby po wymieszaniu zawartości każdej probówki i przeniesieniu 1 mL do następnej, zmienić pipetę lub końcówkę pipety automatycznej. Unika się w ten sposób błędu wynikającego z przylegania bakterii do szkła czy plastiku. W niektórych sytuacjach wykonuje się szereg 100-krotnych rozcieńczeń. Wtedy przenosi się po 0,1 mL hodowli do kolejnych probówek zawierających po 9,9 mL fizjologicznego roztworu NaCl. Ten sposób, choć wymaga użycia mniejszej liczby probówek, obarczony jest jednak większym błędem. Rycina 1. Schemat wykonywania 10-krotnych rozcieńczeń 1 mL hodowli 9 mL roztworu NaCl wielokrotność rozcieńczenia 101 102 103 104 105 106 107 108 109 95 Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże stałe Liczenie żywych bakterii metodą posiewu na podłoże stałe polega na liczeniu powstających z nich kolonii. Liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek lub dokładniej - liczbie jednostek tworzących kolonie (jtk; CFU – ang. colony forming units). Liczenia bakterii żywych dokonuje się metodą posiewu powierzchniowego lub głębinowego (płytki lane). Posiew powierzchniowy polega na rozprowadzeniu zagiętą ezą lub głaszczką na powierzchni płytek z podłożem po 0,1 mL wybranych rozcieńczeń badanego materiału. Na płytki o średnicy większej niż 10 cm można nanieść odpowiednio więcej zawiesiny. W wyniku takiego posiewu uzyskuje się wzrost w postaci kolonii na powierzchni agaru. Posiew głębinowy polega na wlaniu do jałowych płytek Petriego po 1 mL zawiesiny z poszczególnych rozcieńczeń, zalaniu roztopionym i przestudzonym agarem i wymieszaniu. W wyniku takiego posiewu uzyskuje się wzrost w postaci kolonii, zarówno na powierzchni, jak i w głębi agaru. Kolonie w głębi agaru są znacznie mniejsze i różnią się też kształtem (często są soczewkowate). Najczęściej przygotowuje się płytki z trzech ostatnich rozcieńczeń. Aby zmniejszyć błąd, którym obarczone są obie metody, z każdego rozcieńczenia sporządza się po trzy płytki, z których wylicza się średnią liczbę wyrosłych kolonii. Na płytce łatwo odróżnić jako pojedyncze około 300 kolonii, które można policzyć korzystając z licznika kolonii. Gdy na płytce wyrosło więcej kolonii, należy wyliczyć średnią liczbę kolonii przypadającą na 1 cm2 (zliczając kolonie z 10 cm2). Liczbę kolonii na całej płytce oblicza się uwzględniając pole jej powierzchni (P = Пr2). Liczba kolonii wyrosłych na płytce pomnożona przez rozcieńczenie i przeliczona na 1 mL materiału wyjściowego, daje nam liczbę żywych komórek bakteryjnych w badanej zawiesinie. 96 Bakterie w zawiesinie można też policzyć metodą Milesa i Misry’ego. Jest ona modyfikacją posiewu powierzchniowego zalecaną do badania próbek zawierających około 100 CFU/mL. Przy spodziewanej większej liczbie bakterii wymagane jest wstępne rozcieńczenie. Z każdego rozcieńczenia badanego materiału pobiera się małą jego objętość (np. 5-50 L) i nakrapla w oznaczonym miejscu powierzchni płytki z odpowiednim stałym podłożem. Po inkubacji ocenia się wzrost bakterii w miejscu nakroplenia. W przypadku dużej liczby bakterii będzie to wzrost w postaci „murawy”. Wraz z kolejnymi rozcieńczeniami uzyskuje się wzrost pojedynczych kolonii. Znając liczbę kolonii, objętość kropli i współczynnik rozcieńczenia można obliczyć liczbę żywych bakterii w badanym materiale. We wszystkich tych metodach liczbę żywych bakterii w dodanej do podłoża próbce można obliczyć ze wzoru: Liczba żywych bakterii = liczba kolonii x rozcieńczenie/objętość próbki [mL] Liczenie bakterii żywych metodą sączenia przez filtry membranowe Metoda ta służy do określania liczby żywych bakterii w płynach zawierających niewielką ich ilość. Znalazła ona zastosowanie w oznaczaniu liczby bakterii w wodzie pitnej, płynnych artykułach spożywczych, kosmetykach czy lekach zawierających substancje przeciwbakteryjne. Metodą sączenia przez filtry membranowe możemy oznaczać całkowitą liczbę bakterii lub, gdy zastosujemy odpowiednie podłoża diagnostycznowybiórcze, określone ich grupy – rodzaje, a nawet gatunki. Przez filtr membranowy sączona jest próbka o określonej objętości. Filtr następnie przenosi się na powierzchnię podłoża w płytce Petriego. Składniki podłoża, dyfundując przez pory sączka, umożliwiają wzrost w postaci kolonii. Po policzeniu wyrosłych kolonii przelicza się otrzymaną wartość na jednostkę objętości (np. mL) próbki lub określa liczbę bakterii w całej objętości sączonego płynu. 97 W celu zatrzymania na sączku wszystkich bakterii obecnych w badanym materiale należy zastosować filtr membranowy o wielkości porów 0,22 µm. Na filtrze o wielkości porów 0,45 µm zatrzyma się tylko część bakterii, ale wszystkie komórki i zarodniki grzybów. Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże płynne W metodzie tej, zwanej probówkową, liczbę bakterii ocenia się na podstawie występowania lub braku wzrostu na pożywkach płynnych, do których uprzednio wprowadzono odpowiednie objętości rozcieńczeń badanej próbki. Jest to badanie określające najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) (ang. most probable number, MPN) bakterii obecnych w preparacie. Odczytywanie wyników oparte jest na statystycznym obliczeniu prawdopodobieństwa występowania wzrostu drobnoustrojów w zależności od ich liczby w próbce. Dokładność metody NPL jest mniejsza niż innych metod hodowlanych. Metoda NPL jest zalecana tylko w sytuacji, gdy nie może być zastosowana inna metoda. Badanie polega na przygotowaniu kolejnych w postępie geometrycznym, 10-krotnych rozcieńczeń badanego preparatu. Następnie próbki każdego z nich posiewa się, w trzech powtórzeniach, na podłoża płynne. Na podstawie wzrostu lub jego braku w próbkach z odpowiednich rozcieńczeń wnioskuje się o ilości bakterii w preparacie. Służą do tego tablice statystyczne, z których oblicza się najbardziej prawdopodobną liczbę bakterii (lub grzybów) występującą w jednostce wagowej lub objętościowej preparatu. Metoda NPL może być zastosowana zarówno do oceny ogólnej zanieczyszczeń mikrobiologicznych badanego materiału, jak i w badaniach ukierunkowanych, zmierzających do oznaczenia wybranych bakterii. Metodę probówkową stosuje się do określenia prawdopodobnej liczby bakterii grupy coli i/lub Escherichia coli w wodzie. Metoda NPL wymieniona jest także w Farmakopei Polskiej IX przy badaniu czystości mikrobiologicznej leków i surowców farmaceutycznych. Stosowana jest także przy badaniu żywności. 98 Zadania do wykonania Zadanie 1. Liczenie bakterii metodą posiewu powierzchniowego i głębinowego Hodowlę płynną Staphylococcus epidermidis rozcieńczono 108 raza. W metodzie posiewu powierzchniowego posiano zawiesinę z trzech ostatnich rozcieńczeń (po 0,1 mL). W metodzie posiewu głębinowego z trzech kolejnych rozcieńczeń pobrano po 1 mL i wykonano płytki lane. Posiewy inkubowano 24 godziny w temperaturze 37°C. Policz kolonie wyrosłe na każdej płytce. Zwróć uwagę, że w posiewie głębinowym kolonie wyrastają w całej objętości podłoża. - Wpisz swoje dane do tabeli. - Uwzględniając rozcieńczenie i ilość posiewanego materiału, oblicz liczbę bakterii w 1 mL nierozcieńczonej hodowli. Liczba kolonii na płytce Rozcieńczenie hodowli w probówce, z której posiewano Liczba żywych bakterii w 1 mL hodowli Posiew Posiew Posiew Posiew Posiew Posiew powierzchniowy głębinowy powierzchniowy głębinowy powierzchniowy głębinowy 1 2 3 Śr . - Otrzymane wyniki powinny być zbliżone, wylicz z nich średnią. 99 100 Rozdział 10 Czystość mikrobiologiczna gotowego produktu kosmetycznego Część teoretyczna Producent wyrobu kosmetycznego musi zagwarantować bezpieczeństwo produktu w zwykłych oraz możliwych do przewidzenia warunkach użytkowania. Technologia produkcji powinna być stale monitorowana pod kątem obecności substancji szkodliwych oraz skażenia mikrobiologicznego. Takim badaniom powinien być poddawany także gotowy produkt kosmetyczny. Czystość mikrobiologiczna jest jednym z najważniejszych aspektów kontroli przemysłu kosmetycznego. Podstawowym niebezpieczeństwem wynikającym z zanieczyszczenia mikrobiologicznego kosmetyku jest prawdopodobieństwo zakażenia osoby użytkującej. Znajdujące się w produkcie drobnoustroje mogą doprowadzić do zmiany jego właściwości, w tym pojawienia się szkodliwych produktów ich metabolizmu, a wreszcie zmiany właściwości organoleptycznych – rozdzielenia faz, zmiany konsystencji, zapachu, barwy, pojawienia się osadu itp. Głównym źródłem zanieczyszczenia kosmetyku mogą być surowce kosmetyczne czy woda. W ostatnich czasach szczególną uwagę producenci zwracają na zastosowanie surowców pochodzenia naturalnego np. roślinnego. Są one jednak zazwyczaj zanieczyszczone drobnoustrojami. Ważnym źródłem skażenia mikrobiologicznego może być personel, ale również brak przestrzegania odpowiedniej czystości produkcji. Większość kosmetyków stanowi doskonałe podłoże do namnażania się drobnoustrojów. Dlatego w czasie produkcji niezbędne jest zachowanie higieny w zakładzie i procesie produkcyjnym, odpowiednie zabezpieczenie wyrobu przed namnażaniem się drobnoustrojów, a także stałe monitorowanie czystości mikrobiologicznej i restrykcyjne przestrzeganie norm. 101 Zabezpieczanie kosmetyku przed rozwojem drobnoustrojów najczęściej polega na dodawaniu środków konserwujących (rozdział 6) – substancji działających bakterio-, grzybobójczo lub bakterio-, grzybostatycznie. Ważne jest aby substancje konserwujące zabezpieczały kosmetyk nie tylko w czasie produkcji i pakowania, ale również w całym okresie jego stosowania. Należy jednak pamiętać, że zastosowanie środków konserwujących nie zwalnia z obowiązku przestrzegania zasad higieny w procesie technologicznym. Ze względu na działanie uczulające niektórych substancji konserwujących, ważne jest ograniczanie ich zastosowania. Działanie konserwantów wspomagają niektóre składniki kosmetyku, które obok podstawowych właściwości mają pewne działanie przeciwdrobnoustrojowe (np. olejki eteryczne). Wymagania czystości mikrobiologicznej gotowego produktu kosmetycznego regulowane są Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 23 grudnia 2002 roku w sprawie określenia procedur pobierania próbek kosmetyków oraz procedur przeprowadzania badań laboratoryjnych. Podczas badania czystości mikrobiologicznej kosmetyku należy nie dopuścić do skażenia produktu drobnoustrojami, gdyż może to prowadzić do fałszywie dodatnich wyników, bez uzasadnienia eliminujących kosmetyk ze sprzedaży. W czasie badania należy znieść działanie zawartych w kosmetyku substancji hamujących lub bójczych w stosunku do poszukiwanych drobnoustrojów. Osiąga się to poprzez rozcieńczenie próbek, ich filtrację lub zobojętnienie. Ocena mikrobiologiczna powinna być przeprowadzona na próbkach o objętości nie mniejszej niż 1mL lub 1g. Dla produktów o wadze mniejszej niż 1g lub 1 mL należy połączyć przed badaniem zawartość kilku opakowań. Badaną próbkę rozcieńcza się 10-cio lub 100-krotnie w odpowiednim rozcieńczalniku np. neutralizującym (dla produktów zawierających substancje o charakterze bakteriobójczym lub bakteriostatycznym), lub zawierającym związek powierzchniowo czynny (w przypadku substancji tłustych). 102 Normy W badaniu czystości mikrobiologicznej kosmetyku wymagania dotyczące dopuszczalnej ilości drobnoustrojów (badanie ilościowe) i ich rodzaju (badanie identyfikacyjne) zależą od kategorii badanego kosmetyku. Obok norm ilościowych dla poszczególnych kategorii kosmetyków ważne są ograniczenia dotyczące określonych drobnoustrojów. Obecność bakterii Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa oraz grzybów drożdżopodobnych Candida albicans w produkcie dyskwalifikuje go z zastosowania, niezależnie od całkowitej liczby drobnoustrojów mezofilnych. Tabela 1. Normy czystości mikrobiologicznej kosmetyków Kategoria Wymagania ilościowe Wymagania jakościowe I Kosmetyki Całkowita liczba Nie mogą być przeznaczone drobnoustrojów nie może obecne dla dzieci przekraczać 102 CFU*/1 g lub w 0,1 g produktu: i w okolicę oczu 1 mL badanej próbki – Pseudomonas maksymalny limit akceptacji aeruginosa 5x102 Staphylococcus aureus II Inne kosmetyki Całkowita liczba Candida albicans drobnoustrojów nie może przekraczać 103 CFU/1 g lub 1 mL badanej próbki – maksymalny limit akceptacji 5x103 * CFU – colony forming units – jednostki tworzące kolonie Staphylococcus aureus (patrz rozdział 8) Pseudomonas aeruginosa – są gramujemnymi pałeczkami. Ich skrajnie małe wymagania pokarmowe sprawiają, że są one niezwykle rozpowszechnione w środowisku. Zdolność wykorzystywania niekonwencjonalnych źródeł węgla powoduje zdolność namnażania w warunkach niekorzystnych dla innych drobnoustrojów np. roztworach 103 leków czy środków dezynfekcyjnych. Opisywano również rozprzestrzenianie się tych pałeczek w środowisku szpitalnym, a ich rezerwuarem były kremy do rąk i mydła. Pałeczki te powodują ropne zakażenia ran, szczególnie pooparzeniowych i pooperacyjnych. Wywołują również owrzodzenia rogówki, które może przekształcić się w zapalenie gałki ocznej i doprowadzić do ślepoty. Candida albicans – jest grzybem drożdżopodobnym, którego blastospory mogą znajdować się w organizmie człowieka (na skórze, w jamie ustnej i dalszych odcinkach przewodu pokarmowego). Jest patogenem oportunistycznym odpowiedzialnym za szereg infekcji obejmujących zarówno skórę, jak i narządy wewnętrzne. Metody Metody liczenia bakterii szczegółowo opisano w rozdziale 9. W kosmetykach liczbę żywych, tlenowych i względnie beztlenowych drobnoustrojów mezofilnych określa się jedną z dwóch metod: metodą posiewu bezpośredniego – powierzchniowego lub głębinowego (kosmetyki, które mogą być rozpuszczone lub zawieszone w wodzie) – techniką płytkową na podłożu stałym (najczęściej stosowana w analizie rutynowej). metodą filtracji (kosmetyki wymagające homogenizacji, zawierające składniki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym) Badanie ilościowe Metoda posiewu bezpośredniego Przygotowanie rozcieńczeń próbek do posiewu Do 2 probówek, nalewa się po 9 mL rozcieńczalnika (buforowany roztwór NaCl z dodatkiem 0,1% peptonu) Do pierwszej dodaje się 1 mL lub 1g badanego produktu i dokładnie miesza – rozcieńczenie 10-cio krotne 104 Następnie przenosi się 1 mL otrzymanego roztworu z pierwszej probówki do następnej i miesza – rozcieńczenie 100-krotne Rozcieńczenia najczęściej wykonuje się przy użyciu szklanych jałowych pipet, choć można również wykorzystać pipety automatyczne z jałowymi końcówkami. Zawsze jednak trzeba pamiętać, aby po wymieszaniu zawartości pierwszej probówki i przeniesieniu 1 mL do następnej, zmienić pipetę lub końcówkę pipety automatycznej. Także do wymieszania zawartości w drugiej probówce należy użyć czystej pipety lub końcówki. Unika się w ten sposób błędu wynikającego z przylegania bakterii do szkła lub plastiku, z których są one wykonane. Posiew powierzchniowy Po 0,1mL rozcieńczonych próbek wysiewa się na odpowiednie podłoża rozprowadzając materiał równomiernie po powierzchni płytek używając głaszczki lub zagiętej ezy. Po inkubacji w temperaturze 37ºC w przypadku bakterii i 20-25ºC w przypadku grzybów, zlicza się wyrosłe kolonie i przelicza na 1g lub 1mL próbki. Posiew głębinowy Na płytkę Petriego o średnicy 9-10 cm, wylewa się 1mL rozcieńczonej próbki, zalewa się rozpuszczonym podłożem agarowym, o temperaturze nie przekraczającej 45ºC, miesza i odstawia na wypoziomowanej powierzchni do zastygnięcia. Po inkubacji w 37ºC w przypadku bakterii i 20-25ºC w przypadku grzybów, zlicza się wyrosłe kolonie i przelicza na 1 g lub 1 mL próbki. Metoda filtracji Przez dwa filtry membranowe sączone są próbki odpowiadające 0,1 g badanego produktu. Filtry przenosi się na powierzchnie odpowiednich podłoży w płytce Petriego. Składniki podłoża dyfundując przez pory sączka umożliwiają bakteriom lub grzybom wzrost w postaci kolonii. Po inkubacji w 37ºC w przypadku bakterii i 20-25ºC w przypadku grzybów, zlicza się wyrosłe kolonie i przelicza na 1g lub 1mL próbki. Do oznaczania liczby bakterii używa się agaru z hydrolizatem kazeinowosojowym a do określania liczby grzybów podłoże Sabouraud. 105 Badanie identyfikacyjne (poszukiwanie drobnoustrojów dyskwalifikujących produkt) Należy prowadzić identyfikację w kierunku P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans przy użyciu selektywnych podłoży hodowlanych. W tabeli 2 przedstawiono podstawowe testy i metody identyfikacyjne. Tabela 2. Identyfikacja drobnoustrojów dyskwalifikujących produkt Drobnoustrój Izolacja Dodatkowe próby Wynik Pseudomonas aeruginosa podłoże z cetrimidem: barwienie metodą Grama pałeczka gramujemna próba na oksydazę + kolonie płaskie, cytochromową przejrzyste, żółtozielonkawe próba na ruchliwość + do niebieskich, zabarwiające podloże. wzrost + w temperaturze 42ºC Staphylococcus aureus Candida albicans podłoże BairdParkera: barwienie metodą Grama próba na katalazę ziarenkowiec gramdodatni + kolonie czarne, błyszczące, wypukłe, próba na koagulazę + otoczone przejrzystym obszarem, mogące opalizować. podłoże Sabouraud: Badanie mikroskopowe kolonie białe do beżowych, kremowe, wypukłe. próba tworzenia nibystrzępek tworzenie chlamydospor + + 106 W razie wątpliwości badania muszą być potwierdzone dodatkowymi próbami przewidzianymi w uniwersalnych schematach diagnostycznych dla poszczególnych drobnoustrojów. Zadania do wykonania Na ćwiczeniach należy dbać o warunki aseptyczne wykonując wszystkie zadania w bezpośrednim sąsiedztwie palnika. Zadanie 1. Określenie liczby drobnoustrojów w kosmetykach (tonik) metodą bezpośredniego posiewu, techniką płytkową Do badania należy pobierać taką objętość próbki, która zawiera 1 g lub 1 mL kosmetyku. Należy wykonać dwa wzrastające dziesięciokrotne rozcieńczenia próbki. - Z przygotowanych rozcieńczeń kosmetyku pobieraj jałowo po 0,1 mL i wylewaj na powierzchnie płytek z agarem kazeinowo-sojowym i Sabouraud (po jednej płytce każdego podłoża dla odpowiedniego rozcieńczenia) - Rozprowadź materiał po powierzchni płytek i inkubuj w cieplarce w temperaturze odpowiedniej dla bakterii i grzybów - Policz wyrosłe kolonie i oblicz ile bakterii i grzybów było w 1 g lub 1 mL badanego kosmetyku. 107 108 CZĘŚĆ II PRZEDMIOT: MIKROBIOLOGIA KLINICZNA uzupełniające studia magisterskie 109 110 Rozdział 1 Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych Część teoretyczna Skóra, błony śluzowe jamy ustnej, górnych dróg oddechowych (nos, gardło, krtań) oraz układu moczowo-płciowego (cewka moczowa, pochwa) zasiedlane są przez liczne gatunki bakterii, które stanowią 2 pierwszą linię obrony przed patogenami. Na 1 cm powierzchni skóry żyje od 10 tysięcy do 100 tysięcy komórek bakteryjnych. W 1 mL śliny znajduje 8 się około 10 bakterii zdolnych utworzyć kolonie i tyle samo w 1 mL wydzieliny z pochwy. Na powierzchni skóry dominują bakterie gramdodatnie – ziarenkowce (rodzaj Staphylococcus) i pałeczki (rodzaje Corynebacterium i Propionibacterium). Skład mikroflory skóry ściśle zależy od rozmieszczenia na niej poszczególnych gruczołów. Miejsca suche są zasiedlane głównie przez Staphylococcus spp. W miejscach z licznymi gruczołami potowymi występują przede wszystkim Corynebacterium spp., a także nieliczne bakterie gramujemne, zaś miejsca bogate w gruczoły łojowe zasiedlają Propionibacterium spp. Na błonach śluzowych wymienionych układów można znaleźć bakterie gramdodatnie i gramujemne. Na przykład w drogach oddechowych są to przede wszystkim gramdodatnie ziarenkowce (rodzaje Staphylococcus i Streptococcus) i pałeczki Corynebacterium spp., a także gramujemne: ziarenkowce (rodzaje Neisseria i Moraxella) i pałeczki (rodzaje Haemophilus i Bordetella) oraz inne. Większość gatunków bytujących na zdrowej skórze i błonach śluzowych stanowi florę fizjologiczną, lecz mogą tam się znaleźć również rodzaje lub gatunki chorobotwórcze, które odpowiedzialne są za choroby. Występowanie ich u osób zdrowych nazywamy nosicielstwem. W przebiegu infekcji powodowanych przez bakterie może dojść do bakteriemii – przedostania się bakterii do krwi. Może to być sytuacja przejściowa i bezobjawowa, ale może również doprowadzić do niebezpiecznej dla życia posocznicy (sepsy). Jest to ogólnoustrojowa reakcja zapalna organizmu na zakażenie, która może prowadzić do 111 wstrząsu septycznego, czyli zespołu niewydolności wielonarządowej (niewydolność krążenia, oddychania, czynności wątroby i nerek). Rodzaj Staphylococcus – gronkowce S. aureus (gronkowiec złocisty) – chorobotwórczy, występuje u nosicieli na skórze (głównie przedsionek nosa) i śluzówkach, w środowisku nieożywionym (żywność, kurz). S. epidermidis (gronkowiec naskórkowy) – komensal, składnik fizjologicznej mikroflory skóry i błon śluzowych, patogen oportunistyczny. S. saprophyticus (gronkowiec saprofityczny) – występuje w środowisku nieożywionym i na skórze, patogen oportunistyczny. Staphylococcus sp. – liczne gatunki – komensale i saprofity, mogą być patogenami oportunistycznymi. Komórki gronkowców są formami kulistymi, tworzącymi nieregularne układy przypominające grona. Są gramdodatnie. Gronkowce namnażają się dobrze na prostych pożywkach (np. bulion, agar odżywczy) w warunkach normalnej atmosfery. Są względnymi beztlenowcami i wytwarzają katalazę. Kolonie S. aureus mają często barwę żółtą do pomarańczowej, kolonie pozostałych gatunków są białe lub szarawe. Na agarze z krwią kolonie S. aureus otoczone są strefą hemolizy typu β, pozostałe gatunki przeważnie nie hemolizują krwinek. Gronkowce tolerują obecność dużych stężeń NaCl w pożywce (halotoleranty), co wykorzystuje się do ich izolacji z materiałów klinicznych, próbek żywności i preparatów farmaceutycznych. Pożywki stosowane w tym celu to podłoża: Chapmana i Baird-Parkera. Gronkowce mogą długo przeżywać w środowisku, są oporne na wysychanie. Gronkowiec złocisty wytwarza koagulazę – enzym powodujący krzepnięcie osocza „cytrynianowego”, w którym normalny proces krzepnięcia jest zahamowany związaniem jonów wapnia przez cytrynian. Wykrywanie koagulazy jest najważniejszą cechą odróżniającą S.aureus od innych 112 gatunków tego rodzaju, które nazywane są gronkowcami koagulazoujemnymi CNS (ang. coagulase-negative staphylococci). Staphylococcus aureus wytwarza liczne czynniki chorobotwórczości związane ze strukturą komórki (np. białko A) oraz zewnątrzkomórkowe enzymy pełniące rolę inwazyn (np. koagulaza, leukocydyna, hemolizyny) i toksyny immunomodulujące (enterotoksyny, toksynę epidermolityczne, toksynę zespołu wstrząsu toksycznego TSST-1). szczepy mogą różnić się zdolnością wytwarzania czynników chorobotwórczości lub stopniem ich ekspresji. S.aureus wywołuje: ropne Poszczególne zapalenia skóry i tkanki podskórnej (liszajec zakaźny, zapalenie mieszków włosowych, figówkę, czyraki, ropnie), infekcje głębokie (sepsa, zapalenie płuc, zapalenie szpiku kostnego) oraz choroby o charakterystycznym obrazie wynikającym z działania odpowiednich toksyn immunomodulujących. Enterotoksyny gronkowcowe są przyczyną zatruć pokarmowych objawiających się wymiotami i biegunką (rzadziej), już w kilka godzin po spożyciu pokarmu zawierającego jedną lub kilka tych toksyn. Są one ciepłostabilne i niewrażliwe na działanie enzymów żołądka i jelit. Toksyna epidermolityczna (eksfoliatyna) powoduje zespół skóry oparzonej noworodków SSS (ang. scalded skin syndrome). Są to rozległe zapalne zmiany na skórze objawiające się rumieniami, pękającymi pęcherzami i nadmiernym złuszczaniem naskórka. U starszych dzieci i osób dorosłych występują na skórze zmiany martwicze lub inne – wysypka rumieniowa, liszajec pęcherzowy. Toksyna TSST-1 wywołuje zespół wstrząsu toksycznego TSS (ang. toxic shock syndrome) objawiający się gorączką, wymiotami, biegunką, spadkiem ciśnienia tętniczego i wysypką. Gronkowce złociste występujące u nosicieli mogą wywoływać zakażenia endogenne, a także przenosić się na inne osoby lub przedostawać do żywności, kosmetyków bądź preparatów farmaceutycznych podczas ich produkcji. Staphylococcus epidermidis może być przyczyną, najczęściej szpitalnych, infekcji oportunistycznych (zapalenie wsierdzia i sepsa) 113 szczególnie u osób z implantami z tworzyw sztucznych (np. sztuczne zastawki serca). Staphylococcus saprophyticus może być czynnikiem etiologicznym infekcji układu moczowego, przeważnie u kobiet w wieku rozrodczym. Rodzaj Streptococcus – paciorkowce S. pyogenes (paciorkowiec ropotwórczy) chorobotwórczy; może występować u nosicieli na błonach śluzowych jamy nosowo-gardłowej. S. pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc, pneumokok); chorobotwórczy; występuje u nosicieli na błonach śluzowych układu oddechowego. Paciorkowce jamy ustnej (np. S. mitis) – szereg gatunków bytujących jako komensale na śluzówce jamy ustnej i układu oddechowego; patogeny oportunistyczne. Komórki paciorkowców są okrągłe lub owalne, tworzą układy w postaci łańcuszków lub dwoinek. Są gramdodatnie. S. pneumoniae tworzy w organizmie zakażonym wielocukrową otoczkę obejmującą dwie komórki. Paciorkowce wymagają do wzrostu pożywek wzbogaconych (np. agar z krwią). Są względnymi beztlenowcami, nie wytwarzają katalazy, co odróżnia je od gronkowców. Na agarze z krwią kolonie S. pyogenes otoczone są strefą hemolizy typu β, natomiast S. pneumoniae i większość paciorkowców jamy ustnej powoduje hemolizę typu α. Te ostatnie popularnie nazywane są z tego względu „paciorkowcami zieleniącymi”. Na podstawie budowy antygenowej składników ściany komórkowej został stworzony podział paciorkowców na oznaczone literami alfabetu grupy serologiczne (schemat wg. Lancefield), bardzo pomocny w identyfikacji tych bakterii. Streptococcus pyogenes (grupa A) wytwarza szereg czynników warunkujących chorobotwórczość: główny czynnik zjadliwości – 114 związane z komórką białko M, hialuronową otoczkę, zewnątrzkomórkowe enzymy: streptokinazę, hialuronidazę, deoksyrybonukleazę i toksyny – hemolizyny (streptolizyna O i streptolizyna S) oraz toksyny immunomodulujące – pirogenne (erytrogenne) SPE (ang. streptococcal pyrogenic exotoxin). Streptococcus pyogenes powoduje różnorodne choroby. Są to ropne zapalenia skóry i tkanki podskórnej (liszajec zakaźny, niesztowica, róża, martwicze zapalenie powięzi), zapalenie gardła i migdałków (angina), ucha środkowego, płuc, sepsa, gorączka połogowa (zakażenie macicy po porodzie), płonica (szkarlatyna). Jest także przyczyną chorób wtórnych, nieropnych, będących następstwem pierwotnych infekcji paciorkowcowych. Są to: gorączka reumatyczna (zapalenie mięśnia i zastawek serca, zapalenie stawów), ostre kłębuszkowe zapalenie nerek oraz rumień guzowaty (bolesne guzkowate zmiany podskórne na podudziach). Pierwsze dwie z wymienionych chorób są efektem reakcji immunologicznych organizmu na antygeny paciorkowcowe. Ich konsekwencją mogą być m.in. wady zastawkowe serca i niewydolność nerek. Liszajec zakaźny objawia się jako ropne pęcherzyki przekształcające się w miodowożółte strupy na powierzchni skóry, najczęściej twarzy, karku i rąk. Często jest to, podobnie jak niesztowica, infekcja mieszana powodowana jednocześnie przez S.pyogenes i S.aureus. Róża objawia się żywoczerwonym rumieniem i obrzękiem skóry i tkanki podskórnej umiejscowionym najczęściej na kończynach dolnych lub twarzy. Towarzyszy temu bardzo wysoka gorączka. Martwicze zapalenie powięzi to groźne dla życia ropne zapalenie tkanki łącznej podskórnej obejmujące powięź, ścięgna i czasem mięśnie, powodowane przez szczepy S.pyogenes wytwarzające toksynę erytrogenną B (SPE B). Płonica (szkarlatyna) jest zakaźną chorobą wieku dziecięcego, przenosząca się podobnie, jak angina, drogą kropelkową lub pokarmową. Oprócz objawów zapalenia gardła występuje tu drobnoplamista wysypka, za którą odpowiedzialna jest toksyna erytrogenna A (SPE A). Ta sama toksyna powoduje objawy wstrząsu toksycznego, podobne do objawów TSS wywołanego przez S.aureus. 115 Streptococcus pneumoniae – głównym czynnikiem chorobotwórczości jest wielocukrowa otoczka. Inne ważne czynniki to: hemolizyna (pneumolizyna) oraz enzymy pełniące funkcje inwazyn. Choroby wywoływane przez pneumokoki to: płatowe zapalenie płuc, zapalenie oskrzeli, zatok, ucha środkowego, zapalenie opon mózgowordzeniowych i sepsa. Według najnowszych danych infekcje powodowane przez S.pneumoniae są odpowiedzialne za najwięcej zgonów na świecie (spośród chorób infekcyjnych). U dorosłych jest to zapalenie płuc, a u dzieci poniżej drugiego roku życia ropne zapalenie opon mózgowordzeniowych i sepsa. Paciorkowce jamy ustnej mogą wywoływać oportunistyczne zakażenia, najczęściej sepsę i zapalenie wsierdzia u osób z obniżoną odpornością, zwykle po inwazyjnych zabiegach w obrębie jamy ustnej (usunięcie zęba, migdałków). Rodzaj Corynebacterium – maczugowce C. diphtheriae (maczugowiec błonicy); chorobotwórczy, może występować u nosicieli na skórze i na śluzówkach nosa i gardła. C. pseudodiphtheriticum (maczugowiec rzekomobłoniczy); komensal bytujący na błonach śluzowych układu oddechowego (flora fizjologiczna), może być oportunistycznym patogenem. C. minutissimum – występuje na skórze, patogen oportunistyczny wywołujący łupież rumieniowy. Corynebacterium spp. – liczne gatunki zasiedlające skórę, układ moczowo-płciowy i układ oddechowy (flora fizjologiczna); zakażenia oportunistyczne, zakażenia szpitalne. Komórki maczugowców mają postać pałeczek zgrubiałych na jednym końcu. Są gramdodatnie. Tworzą układy przypominające litery X,V,Y lub palisady (komórki ułożone równolegle). Charakterystyczna jest obecność 116 w komórkach metachromatycznych ziaren polifosforanowych (wolutyna), które można obserwować barwiąc preparat metodą Neissera. Maczugowce wymagają do wzrostu pożywek wzbogaconych. Najlepiej namnażają się na podłożu Loefflera. Większość gatunków to względne beztlenowce. Wszystkie wytwarzają katalazę. Corynebacterium diphtheriae wytwarza zewnątrzkomórkową cytotoksynę (toksynę błoniczą) uszkadzającą mięsień sercowy, nerki i nerwy obwodowe. C. diphtheriae wywołuje błonicę (dyfteryt) układu oddechowego lub skóry. Najczęściej zmiany zapalne (szare naloty – błony rzekome) dotyczą błony śluzowej gardła, migdałków, czasem krtani. W postaci wrzodziejącej błonicy skóry, błony rzekome występują na dnie owrzodzeń. Maczugowce namnażają się w miejscu wtargnięcia, a toksyna przenika do krwiobiegu uszkadzając funkcje narządów wewnętrznych. Do zakażenia dochodzi drogą kropelkową od osób chorych lub nosicieli. W Polsce obecnie błonica występuje rzadko. Corynebacterium pseudodiphtheriticum jest składnikiem fizjologicznej flory błon śluzowych nosa i gardła, może być przyczyną zakażeń oportunistycznych układu oddechowego i układu krążenia. Corynebacterium minutissimum wywołuje łupież rumieniowy – powierzchowne zmiany zapalne zlokalizowane najczęściej w fałdach skórnych. Mogą one współistnieć z dziobatą keratolizą i trichobakteriozą włosów w dole pachowym wywołanymi przez inne gatunki z rodzaju Corynebacterium. Schorzenia te dotyczą głównie pacjentów i niskim poziomie higieny. 117 Rodzaj Propionibacterium P. acnes – komensal, składnik fizjologicznej mikroflory skóry, szczególnie okolic bogatych w gruczoły łojowe. Patogen oportunistyczny. Polimorficzne, pałeczkowate komórki P. acnes tworzą układy przypominające litery X,V,Y, podobne do maczugowców. Są gramdodatnie. Pałeczki Propionibacterium wymagają do wzrostu pożywek wzbogaconych (np. agar z krwią). Są mikroaerofilami, lecz najlepiej namnażają się w warunkach beztlenowych. Większość szczepów wytwarza katalazę. Propionibacterium acnes wytwarza szereg zewnątrzkomórkowych enzymów (np. lipaza) odpowiedzialnych za zmiany chorobowe. P. acnes wywołuje zapalenie mieszków włosowych oraz trądzik pospolity, może też być przyczyną zakażeń oportunistycznych w obrębie układu krążenia (np. zapalenie wsierdzia). Rodzaj Neisseria N. gonorrhoeae (dwoinka rzeżączki, gonokok) – chorobotwórcza. N. meningitidis (dwoinka nagminnego zapalenia opon mózgowordzeniowych, meningokok) – chorobotwórcza; występuje u nosicieli na śluzówkach gardła. Neisseria spp. – gatunki bytujące na błonach śluzowych dróg oddechowych i układu moczowo-płciowego w składzie normalnej flory. Komórki rodzaju Neisseria są owalne (fasolkowate), ułożone równolegle tworzą pary (dwoinki) lub układy nieregularne. Są gramujemne. Preparaty mikroskopowe z materiałów klinicznych (np. wydzielina ropna z cewki moczowej, płyn mózgowo-rdzeniowy) mają charakterystyczny wygląd: liczne dwoinki wewnątrz granulocytów. 118 Gonokoki i meningokoki mają duże wymagania pokarmowe. Hoduje się je na specjalnych pożywkach bogatych w białko (podłoże Roiron – gonokoki) lub agarze z krwią, agarze czekoladowym – meningokoki w atmosferze tlenowej wzbogaconej dodatkiem CO2. Są tlenowcami, wytwarzają katalazę i oksydazę. Są bardzo wrażliwe na wysychanie. Chorobotwórczość Neisseria gonorrhoeae determinują: fimbrie, białka błonowe, otoczka, lipooligosacharyd LOS i enzymy (proteaza IgA1). N. gonorrhoeae wywołuje rzeżączkę – chorobę szerzącą się głównie drogą płciową. U noworodków może występować rzeżączkowe zapalenie gałki ocznej (choroba przeniesiona od matki podczas porodu). Rzeżączka ostra jest ropnym zapaleniem błony śluzowej narządów moczowo-płciowych, któremu towarzyszy ropna wydzielina. Rzeżączka u mężczyzn wywołuje znaczne dolegliwości bólowe, u kobiet natomiast przebieg choroby może być bezobjawowy. Rzeżączka nieleczona przechodzi w postać przewlekłą. Zakażenie szerzy się na inne narządy miednicy małej i może doprowadzić do bezpłodności. Bardzo rzadko dochodzi do rzeżączkowego ropnego zapalenia stawów i uogólnionej infekcji organizmu. Chorobotwórczość Neisseria meningitidis warunkują również składniki strukturalne komórki: fimbrie, białka błony zewnętrznej, LOS oraz proteaza IgA1, a także ujemny ładunek powierzchniowy. N. meningitidis przenosi się drogą kropelkową od osób chorych i nosicieli. Wywołuje ropne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, często z uogólnionym zakażeniem organizmu – sepsą meningokokową i wstrząsem septycznym. Choroba ta może szerzyć się epidemicznie i cechuje się bardzo dużą śmiertelnością. Sepsę meningokokową charakteryzuje krwotoczna wysypka (z wybroczynami); mogą również wystąpić zmiany martwicze w skórze. W Polsce w zakażeniach meningokokami dominują serotypy B i C. 119 Rodzaj Moraxella M. catarrhalis – komensal, składnik fizjologicznej mikroflory śluzówek górnych dróg oddechowych i układu moczowo-płciowego – patogen oportunistyczny. Komórki Moraxella spp. mają postać owalnych ziarenek lub krótkich pałeczek. Są gramujemne. Układają się w pary podobne do Neisseria spp. Mogą się mnożyć na prostych podłożach w warunkach tlenowych. Są tlenowcami, wytwarzają katalazę i oksydazę. Podobnie jak u Neisseria, chorobotwórczość Moraxella determinują elementy struktury komórki (fimbrie, otoczka, białka błonowe, LOS). M. catarrhalis może wywoływać zapalenie górnych dróg oddechowych i oskrzeli, najczęściej jako infekcje wtórne po chorobach wirusowych, rzadziej inne oportunistyczne infekcje. Rodzaj Haemophilus H. influenzae (pałeczka grypy) – komensal, składnik normalnej mikroflory śluzówek górnych dróg oddechowych (szczepy bezotoczkowe); chorobotwórczy (szczepy otoczkowe, głównie serotyp b). H. parainfluenzae – komensal, składnik normalnej mikroflory śluzówek górnych dróg oddechowych, rzadko oportunistyczny patogen. Haemophilus to polimorficzne pałeczki (od form ziarenkowatych do nitkowatych). Są gramujemne Niektóre szczepy H. influenzae mają otoczkę polisacharydową; wyróżnia się 6 głównych serotypów otoczkowych. Pałeczki Haemophilus wymagają do wzrostu specjalnych pożywek zawierających czynniki wzrostowe: X (hemina lub hematyna) i V (nukleotyd difosfopirydynowy NAD), np. agar czekoladowy. 120 H.influenzae wymaga obu czynników, a H. parainfluenzae tylko V. Pałeczki Haemophilus są względnymi beztlenowcami. Chorobotwórczość Haemophilus influenzae jest uwarunkowana głównie obecnością otoczki, fimbrii, lipooligosacharydu ściany (LOS) oraz proteaz IgA. Szczepy otoczkowe, przede wszystkim serotyp b, wywołują ciężkie w przebiegu choroby, przeważnie u małych dzieci. Są to: ropne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych z sepsą, zapalenie nagłośni, zapalenie stawów, kości i szpiku. Zapalenie nagłośni jest szczególnie niebezpieczne dla małych dzieci (poniżej 7 roku życia), ponieważ grozi uduszeniem. Szczepy bezotoczkowe bywają przyczyną zapaleń oskrzeli i płuc oraz ucha i zatok. Na ogół są to powikłania po przebytych wcześniej infekcjach wirusowych, np. po grypie. Rodzaj Bordetella B. pertussis (pałeczka krztuśca) – chorobotwórcza. B. parapertussis (pałeczka rzekomokrztuścowa) – chorobotwórcza. B. bronchiseptica (pałeczka oskrzelowa) – chorobotwórcza. Pałeczki Bordetella są bardzo drobne, prawie ziarenkowate. Są gramujemne. Świeżo wyizolowane od chorego mają otoczkę. Bordetella pertussis wymaga do wzrostu podłoży wzbogaconych dodatkiem krwi (np. podłoże Bordet-Gengou – 30% krwi). Pozostałe gatunki można hodować na podłożach prostych. Są tlenowcami. Są bardzo wrażliwe na wysychanie. Chorobotwórczość Bordetella pertussis jest głównie uwarunkowana białkową toksyną krztuścową (pertussigen). Bakterie te wytwarzają także czynnik warunkujący kolonizację śluzówek oskrzeli - pertaktynę oraz inne toksyny odpowiedzialne za obraz kliniczny choroby. B.pertussis wywołuje krztusiec (koklusz). Pozostałe gatunki są przyczyną krztuścopodobnego zapalenia oskrzeli o łagodniejszym przebiegu. Krztusiec jest zakaźną chorobą wieku dziecięcego. Przenosi się drogą 121 kropelkową. Choroba charakteryzuje się gwałtownymi napadami kaszlu, prowadzącymi często do wymiotów. Metody Podłoża do izolacji gronkowców Podłoże Baird–Parkera - zawiera chlorek litu i telluryn sodu powodujące częściowe zahamowanie wzrostu większości bakterii gramujemnych i gramdodatnich poza gronkowcami. Redukcja tellurynu sodowego powoduje czarne zabarwienie kolonii S. aureus w odróżnieniu od innych gatunków tego rodzaju, których kolonie mają barwę szarą. Dodatek zemulgowanego żółtka jaja kurzego pozwala na wykrycie zdolności do wytwarzania przez szczepy gronkowców enzymów takich, jak lipaza i fosfolipaza (zmętnienie pożywki wokół kolonii) i proteazy (strefa przejaśnienia wokół kolonii). Podłoże to stosowane jest głównie do wykrywania gronkowców w żywności, preparatach farmaceutycznych i kosmetykach. Próba na koagulazę Identyfikacja gatunków gronkowców sprowadza się najczęściej do ich różnicowania na koagulazododatnie (wytwarzające koagulazę) gronkowce złociste (S. aureus) i gronkowce koagulazoujemne (np. S.epidermidis, S. saprophyticus). Koagulaza to enzym przekształcający fibrynogen osocza krwi w fibrynę. Wykonanie próby Pełne oczko ezy badanych gronkowców należy zawiesić w niewielkiej ilości (np. 0,5 mL) rozcieńczonego 1:5 w roztworze NaCl osocza króliczego znajdującego się w wąskiej probówce. Inkubować w cieplarce 37˚C. Odczytywać wynik (powstanie skrzepu) po 1, 2 , 3 i 24 godzinach. Wynik dodatni próby: postępujące w czasie wykrzepianie osocza. Próbę tę można również wykonać przez zmieszanie 0,25mL hodowli płynnej gronkowca z 0,25mL nierozcieńczonego osocza. Próby kontrolne 122 ze znanym szczepem koagulazododatnim i koagulazoujemnym należy wykonać dla każdej nowej partii osocza. Wytwarzanie czynnika skupiania (CF – ang. clumping factor) S.aureus wytwarza tzw. czynnik skupiania – związany z powierzchnią komórki receptor dla fibrynogenu osocza. Ten przekształcając się w fibrynę tworzy nici zlepiające komórki w widoczne makroskopowo agregaty. Wykonanie próby Na szkiełko podstawowe należy nanieść dwie krople wody lub roztworu NaCl. W obu kroplach należy zawiesić pobrane ezą z hodowli stałej gronkowce (zawiesina powinna wyglądać jak kropla mleka) Do jednej z kropli dodać uszko ezy nie rozcieńczonego osocza króliczego i zamieszać ezą Wynik odczytać po 10 – 15 sekundach i następnie po 3 minutach. Wynik: pojawienie się agregatów komórek w zawiesinie z dodatkiem osocza – próba dodatnia (obecność czynnika skupiania); brak zlepiania komórek – próba ujemna. Zawiesina w kropli roztworu NaCl na szkiełku powinna zostać homogenna – jest to kontrola zawieszalności szczepu. Niektóre gronkowce zlepiają się samoistnie w roztworze NaCl lub wodzie (tworzenie agregatów w kropli kontrolnej) i u takich szczepów nie bada się wytwarzania CF. Zadania do wykonania Zadanie 1. Wykonanie i badanie wymazu z nosa - Jałowy wacik (wymazówkę) zwilż w jałowym roztworze NaCl. - Wykonaj wymaz pocierając watką o ściany przedsionka nosa. - Posiej pobrany materiał z wacika na agar z krwią metodą redukcyjną. - Płytkę inkubuj w cieplarce w 37oC przez około 20 godzin. 123 - Opisz kolonie wyrosłe na płytce: - Jaki rodzaj hemolizy wytwarzają (α, β). Które z nich wytwarzają katalazę? Zadanie 2. Wykonanie i badanie wymazu z jamy ustnej (badanie śliny) - Jałową wymazówkę zwilż obficie w ślinie, dokonaj też wymazu z powierzchni języka, dziąseł i błony śluzowej policzków. - Posiej pobrany materiał z wacika na agar z krwią metodą redukcyjną. Płytkę inkubuj w cieplarce w 37oC przez około 20 godzin. 124 - Opisz kolonie wyrosłe na płytce. - Jaki rodzaj hemolizy wytwarzają (α, β). - Które z nich wytwarzają katalazę? Zadanie 3. Morfologia mikroskopowa bakterii izolowanych z nosa i śliny - Wykonaj preparaty barwione metodą Grama z pierwszej strefy posiewu (ślina) - Wykonaj preparaty barwione metodą Grama z wybranych kolonii (wymaz z nosa). - Oceń bogactwo flory bakteryjnej i jej zróżnicowanie w badanych materiałach. 125 Preparat z bakterii wyhodowanych ze śliny: Preparat z bakterii wyhodowanych z wymazu z nosa: 126 Rozdział 2 Bakterie w przewodzie pokarmowym Część teoretyczna Przewód pokarmowy człowieka w warunkach zdrowia jest zasiedlany przez ponad 300 gatunków bakterii stanowiących florę fizjologiczną. Właściwy skład tej flory warunkuje prawidłowe funkcjonowanie organizmu, ponieważ bakterie te wydzielają liczne metabolity hamujące rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych oraz zapobiegają ich kolonizacji w jelicie, wspomagają też trawienie pokarmów wydzielając różne enzymy, a także mają udział w syntezie niektórych witamin z grupy B (B2, B6, B12), witaminy K, kwasu foliowego oraz niektórych aminokwasów. Przełyk, żołądek i dwunastnica, a także początkowy odcinek jelita cienkiego nie mają stałej flory bakteryjnej. W przełyku i żołądku bakterie pojawiają się przejściowo i pochodzą z jamy ustnej, gardła i spożywanych pokarmów, ale nie stanowią one flory fizjologicznej. W dwunastnicy i jelicie czczym występują tylko nieliczne bakterie ze względu na kwaśny odczyn środowiska i szybką perystaltykę. Liczne bakterie pojawiają się w jelicie krętym i przede wszystkim w jelicie grubym. W 1 gramie kału znajduje się 1010-1011 komórek bakterii. Układ pokarmowy noworodka wkrótce po porodzie zasiedlany jest przez gramdodatnie bakterie beztlenowe i mikroaerofilne (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp.) pochodzące z dróg rodnych matki. U dzieci karmionych naturalnie flora ta dominuje przez kilka miesięcy. Skład mikroflory jelitowej ustala się w wieku 7-10 lat i pozostaje prawie niezmienny u danej osoby do starości. W jelicie grubym bytują liczne drobnoustroje, z których około 90% to bakterie bezwzględnie beztlenowe. Dominują: pałeczki gramujemne: rodzaj Bacteroides, ziarenkowce gramdodatnie: Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., pałeczki gramdodatnie: Bifidobacterium spp., laseczki: Clostridium spp. Pozostały odsetek stanowią bakterie względnie beztlenowe: 127 pałeczki Enterobacteriaceae – rodzaje Escherichia (występuje u 100% zdrowych ludzi), Proteus, Enterobacter, Klebsiella i inne, paciorkowce kałowe (enterokoki) – rodzaj Enterococcus. Oprócz tych drobnoustrojów, które wchodzą w skład naturalnej flory przewodu pokarmowego, mogą znaleźć się tam patogeny takie, jak: pałeczki Enterobacteriaceae z rodzajów Salmonella, Shigella, Yersinia, inne bakterie chorobotwórcze z rodzajów Campylobacter, Helicobacter, Vibrio oraz wirusy i pasożyty. Do zakażenia nimi dochodzi drogą fekalno-oralną (pokarmową). Mogą one występować u osób chorych, a także u nosicieli po przebytych infekcjach objawowych lub bezobjawowych. Pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae Jest to licząca wiele rodzajów i ponad 200 gatunków grupa pałeczek gramujemnych, charakteryzujących się szeregiem podobieństw i wspólnych cech dotyczących morfologii komórek i kolonii oraz cech metabolicznych. Komórki ich są dość duże, często urzęsione (liczne rodzaje), niektóre rodzaje mają otoczki. Większość rodzajów (np. Escherichia, Enterobacter, Klebsiella) zasiedla jelita zdrowych ludzi i zwierząt. Inne zaś (Salmonella, Shigella, Yersinia) obejmują gatunki bezwzględnie chorobotwórcze. Pałeczki te mają małe wymagania pokarmowe (prototrofy), są względnymi beztlenowcami. Można je hodować na prostych podłożach, w warunkach normalnej atmosfery. Wszystkie rodzaje tej rodziny fermentują glukozę, nie wytwarzają oksydazy cytochromowej i redukują azotany do azotynów. Identyfikacja opiera się na badaniu właściwości metabolicznych (różnicowanie rodzajów i gatunków) i określaniu cech antygenowych lipopolisacharydu (antygen O), rzęsek (antygen H) i otoczki (antygen K). Różnice w budowie tych antygenów pozwalają identyfikować gatunki, serotypy lub serowary. Najważniejsze cechy metaboliczne bada się posiewając na tzw. szereg izolacyjny – szereg pożywek pozwalających wykryć: fermentację laktozy (laktoza pod parafiną), wytwarzanie indolu z tryptofanu, rozkład mocznika (ureaza), wytwarzanie siarkowodoru i dodatkowo fermentację laktozy i glukozy na podłożu Kliglera 128 (powtórzenie próby na rozkład laktozy na różnych podłożach pozwala ocenić tę cechę w warunkach zróżnicowanego dostępu do tlenu). Do izolacji pałeczek jelitowych wykorzystuje się pożywki stałe zawierające najczęściej laktozę. Zdolność fermentacji tego cukru jest najważniejszą cechą różnicującą między sobą rodzaje należące do rodziny Enterobacteriaceae. Rodzaj Escherichia E. coli (pałeczka okrężnicy) – jest komensalem, czyli stałym, choć nie najliczniejszym składnikiem flory jelitowej u ludzi i zwierząt. Z powodu występowania E. coli w każdej próbce kału pałeczka ta jest uznawana m.in. za drobnoustrój wskaźnikowy w mikrobiologii sanitarnej, badaniach żywności i w mikrobiologii farmaceutycznej (badanie czystości mikrobiologicznej leków). E. coli rozkłada laktozę i wytwarza indol, co ułatwia jej wykrywanie i identyfikację. Szczepy E. coli zasiedlające jelito mogą wywoływać zakażenia oportunistyczne, gdy znajdą się w organizmie poza naturalnym miejscem bytowania. Najczęściej powodują infekcje w obrębie układu moczowego (szczepy uropatogenne) oraz, rzadziej, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, zapalenie pęcherzyka żółciowego, ucha środkowego i płuc. Szczepy uropatogenne – UPEC (ang. uropathogenic E. coli) mają szczególną zdolność przylegania do nabłonka dróg moczowych (fimbrie P). Dysponują też cytolizyną (hemolizyna). O zakażeniu układu moczowego świadczy tzw. bakteriuria znamienna, tzn. taka liczba żywych bakterii w 1 mL moczu, którą przyjmuje się jako kryterium trwającej infekcji. W obrębie gatunku E. coli występują serotypy chorobotwórcze, wywołujące różne postacie biegunek, zależne od wytwarzanych przez poszczególne serotypy toksyn i innych czynników chorobotwórczości. 129 Chorobotwórcze serotypy Escherichia coli to: ETEC (enterotoksynogenne) – wytwarzają ciepłochwiejne (LT-I i LT-II) i ciepłostałe (ST-I i ST-II) enterotoksyny oraz adhezyny (CFA/I, CFA/II i adhezyjna „tworząca wiązki”), kolonizują jelito cienkie, wywołują tzw. biegunki podróżnych i biegunki u dzieci (tzw. cholerę dzieci) – wodnista biegunka, wymioty; EIEC (enteroinwazyjne) – wnikają do komórek nabłonka jelita grubego i mnożąc się w nich, nie wytwarzają toksyny, wywołują biegunki czerwonko-podobne – biegunka wodnista z krwią, wymioty, gorączka; EPEC (enteropatogenne) – wnikają do komórek nabłonka jelita cienkiego, uszkadzając ich strukturę; są odpowiedzialne za biegunki niemowląt – biegunka śluzowo-wodnista, gorączka; VTEK/STEK, dawniej EHEC (werotoksynogenne, dawniej enterokrwotoczne) – wytwarzają ciepłostałą cytolizynę VT (werotoksynę), podobną do toksyny pałeczki czerwonki; kolonizują jelito grube; powodują krwotoczne zapalenie jelita grubego (krew w kale), zespół mocznicowo-hemolityczny (choroba groźna dla życia, zwłaszcza u dzieci) , niewydolność nerek, zaburzenia neurologiczne, EAEC, EAggEC (enteroagregacyjne) – wytwarzają toksynę podobną do ST, ulegają autoagregacji, kolonizują jelito cienkie i pobudzają je do wytwarzania znacznych ilości śluzu; wywołują przewlekłe biegunki u dzieci i dorosłych w krajach o niskim stopniu rozwoju. Rodzaj Shigella S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei (pałeczki czerwonki); chorobotwórcze, mogą występować w jelicie grubym u nosicieli. Nie rozkładają laktozy. Mają zdolność przeżywania przez wiele godzin w pH 2,5. W identyfikacji gatunków wykorzystuje się testy serologiczne oparte o różnice w budowie antygenu somatycznego O. 130 Chorobotwórczość pałeczek czerwonki jest związana z ich zdolnością wnikania i niszczenia komórek nabłonka jelita grubego, co prowadzi do powstawania owrzodzeń i biegunki. Kał zawiera krew (stąd nazwa choroby – czerwonka), śluz i ropę. Biegunce towarzyszą silne bóle brzucha i gorączka. S. dysenteriae wytwarza toksynę, podobną w działaniu do toksyny E. coli VTEC i toksyny Vibrio cholerae. W Polsce czerwonkę wywołuje najczęściej S. sonnei. Pałeczki Shigella atakują wyłącznie ludzi, przenosząc się drogą fekalno-oralną („choroba brudnych rąk”). Rodzaj Salmonella Spośród dwóch wyodrębnionych na podstawie badań genetycznych gatunków choroby u ludzi wywołują szczepy należące do S. enterica subsp. enterica, który obejmuje ponad 2500 odmian serologicznych zwanych serowarami. Tradycyjnie serowary te często noszą nazwy dawnych gatunków, lecz inaczej się je zapisuje: Salmonella Typhi (pałeczka duru brzusznego), Salmonella Typhimurium (pałeczka duru mysiego), Salmonella Enteritidis (pałeczka salmonelozy). Pałeczki te są chorobotwórcze, mogą występować też w przewodzie pokarmowym u nosicieli. Nosicielstwo może trwać wiele lat. Pałeczki Salmonella są urzęsione, nie rozkładają laktozy, wytwarzają siarkowodór. Identyfikacja serowarów wymaga zastosowania testów serologicznych. Głównym czynnikiem chorobotwórczości pałeczek Salmonella jest LPS; ważną rolę spełniają cechy metaboliczne umożliwiające przeżycie w kwaśnym środowisku żołądka i w komórkach makrofagów oraz inwazyny warunkujące kolonizację i penetrację nabłonka jelita cienkiego. Do zakażenia dochodzi drogą fekalno-oralną od osoby chorej lub nosiciela, a także poprzez zakażoną fekaliami wodę albo żywność produkowaną 131 w niehigienicznych warunkach. Źródłem pałeczek Salmonella mogą być też skażone produkty spożywcze (mięso, jaja, produkty mleczne) pochodzące od zwierząt hodowlanych, u których bakterie te bytują w przewodzie pokarmowym. S. Typhi wywołuje dur brzuszny – chorobę uogólnioną, o specyficznej patogenezie i przebiegu klinicznym, występującą tylko u ludzi. Pozostałe serowary wywołują salmonelozy – zapalenia błony śluzowej jelita cienkiego i grubego tzw. toksykoinfekcje - inwazyjne zatrucia pokarmowe. Objawiają się one śluzowo-krwawą biegunką, której towarzyszy wysoka gorączka, często znaczne odwodnienie oraz zaburzenia elektrolitowe. Niekiedy może dojść do sepsy (u dzieci), zapalenia płuc, opon mózgowo-rdzeniowych i kości. Pałeczki Salmonella są najczęstszym czynnikiem etiologicznym zatruć pokarmowych w Polsce, dur brzuszny natomiast występuje rzadko. Rodzaj Yersinia Y. pestis (pałeczka dżumy) – chorobotwórcza. Y. enterocolitica subsp. enterocolitica (pałeczka jersiniozy); chorobotwórcza Yersinia to najmniejsze pałeczki spośród rodziny Enterobacteriaceae, często mają postać ziarenek. Nie rozkładają laktozy. Mają zdolność mnożenia się w żywności przechowywanej w lodówce. Czynnikami chorobotwórczości u obu gatunków są adhezyny Yad oraz toksyczne i transportowe białka ściany komórkowej (YOP). Yersinia pestis wytwarza ponadto pestycynę, aktywator plazminogenu i koagulazę odpowiedzialne za dramatyczny przebieg choroby – dżumy, która jest śmiertelną chorobą („czarna śmierć”). Pałeczka dżumy jest zaliczana do czynników biologicznych największego zagrożenia (kategoria A). Była w przeszłości i może być wykorzystana jako broń biologiczna. Dżuma obecnie nie występuje w Europie. Yersinia enterocolitica wytwarza enterotoksynę ST i inwazyny. Y. enterocolitica wywołuje biegunki, którym towarzyszy gorączka 132 i zapalenie węzłów chłonnych jamy brzusznej. Choroba ta częściej występuje u niemowląt i małych dzieci. Choroby wywoływane przez pałeczki Yersinia są zoonozami. Dżuma jest przenoszona na ludzi przez pchły od gryzoni (głównie szczury), a od osób chorych drogą kropelkową. Y. enterocolitica może występować w produktach spożywczych pochodzenia zwierzęcego (mleko) i zakażenie nią dokonuje się drogą pokarmową. Rodzaj Klebsiella K. pneumoniae subsp. pneumoniae (pałeczka zapalenia płuc) i K. oxytoca – oba gatunki występują w składzie normalnej flory jelita grubego; bywają przyczyną zakażeń oportunistycznych. Pałeczki Klebsiella charakteryzuje obecność grubej wielocukrowej otoczki (pałeczki otoczkowe), wytwarzanej również w hodowli na pożywkach. Można ją wykryć barwiąc preparat metodą pozytywno-negatywną. Pałeczki Klebsiella rozkładają laktozę. Czynniki chorobotwórczości tych pałeczek to otoczka, LPS, białkowe adhezyny. Bakterie te wywołują zakażenia oportunistyczne: odoskrzelowe zapalenie płuc, infekcje dróg moczowych. Szczególnie groźne są zakażenia szpitalne noworodków przebiegające pod postacią sepsy. Rodzaj Enterobacter Pałeczki te rozkładają laktozę. Bakterie tego rodzaju występują w środowisku nieożywionym, rzadziej w przewodzie pokarmowym u ludzi. Są oportunistycznymi patogenami, będącymi jednym z częstych czynników etiologicznych zakażeń szpitalnych (szczególnie Enterobacter cloacae), takich jak sepsa, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zakażenia ran, ponieważ często są oporne na środki dezynfekcyjne. 133 Rodzaj Serratia S. marcescens (pałeczka cudowna) – bytuje głównie w środowisku jako saprofit, lecz może być również składnikiem flory jelitowej ludzi i zwierząt (komensal). Wywołuje oportunistyczne zakażenia szpitalne. Serratia marcescens nie rozkłada laktozy. Hodowana w temperaturze pokojowej wytwarza czerwony barwnik – prodigiozynę, zabarwiający kolonie. Pałeczki z rodzaju Serratia są urzęsione. Przyczyną infekcji tymi pałeczkami (sepsa, infekcje dróg moczowych, zapalenie wsierdzia) może być skażenie sprzętu szpitalnego (np. cewników), środków dezynfekcyjnych i płynów do mycia rąk. Rodzaj Proteus – pałeczki odmieńca P. mirabilis, P. vulgaris – komensale zasiedlające przewód pokarmowy zdrowych ludzi i zwierząt; występują też w środowisku (woda, gleba). Są oportunistycznymi patogenami. Pałeczki te charakteryzują się, dzięki obecności licznych rzęsek, aktywnym ruchem. Na pożywkach stałych wzrost pałeczek odmieńca jest rozpełzliwy (mgławicowy), zasnuwający całą powierzchnię płytki. Pałeczki te nie rozkładają laktozy, wytwarzają siarkowodór i ureazę (hydrolizują mocznik). Ureaza jest jednym z głównych czynników chorobotwórczości. Wytwarzają też hemolizyny i proteazy rozkładające przeciwciała IgA i IgG oraz składniki dopełniacza. Charakteryzują się również bardzo szybkim namnażaniem. Najczęstszą przyczyną zakażeń klinicznych, głównie dróg moczowych, jest P. mirabilis. Pałeczki odmieńca powodują także zakażenia ran pooperacyjnych i pooparzeniowych. Infekcje wywoływane przez te bakterie są przeważnie nabywane w szpitalu. 134 Inne rodzaje bakterii związanych z przewodem pokarmowym Rodzaj Vibrio – przecinkowce V. cholerae (przecinkowiec cholery) – chorobotwórczy, może występować u nosicieli. V. parahaemolyticus – chorobotwórczy. Naturalnym środowiskiem przecinkowców są zbiorniki wód słodkich i słonych oraz organizmy w nich żyjące (ryby, skorupiaki itp.) Przecinkowce są gramujemnymi, ruchliwymi pałeczkami o małych wymaganiach pokarmowych. Do hodowli stosuje się pożywki proste o alkalicznym pH, które przecinkowce preferują. Są również halotolerantami (V.cholerae) lub halofilami (V.parahaemolyticus). Wytwarzają oksydazę w odróżnieniu od pałeczek Enterobacteriaceae. Najważniejszym czynnikiem chorobotwórczości V. cholerae jest enterotoksyna (choleragen) odpowiedzialna za obraz choroby – cholery. Choroba ta jest ostrym zapaleniem błony śluzowej jelita cienkiego manifestującym się wodnisto-śluzową („ryżowe stolce”) biegunką, prowadzącą do odwodnienia i zaburzeń elektrolitowych w organizmie. Do zakażenia dochodzi drogą pokarmową (woda, skażona żywność). Cholera charakteryzuje się dużą śmiertelnością. Chorobę tę wywołują szczepy V. cholerae należące do serogrupy O1, wytwarzające enterotoksynę. Cholera występuje tylko u ludzi. Pojawia się endemicznie w niektórych krajach Afryki, południowej Azji i Ameryki. Vibrio parahaemolyticus wytwarza m. in. termostabilną hemolizynę (hemolizyna Kanagawy). Powoduje wodnistą biegunkę, której towarzyszą wymioty, bóle brzucha i gorączka. Przecinkowiec ten może być także przyczyną zakażenia ran. Do biegunki dochodzi najczęściej po spożyciu surowych skażonych „owoców morza” (ryby, kraby, ostrygi). 135 Rodzaj Campylobacter Campylobacter jejuni (pałeczka kampylobakteriozy) – chorobotwórcza dla człowieka. Naturalnym miejscem jej bytowania jest przewód pokarmowy zwierząt hodowlanych (bydło, drób) i dzikich. Zdarza się nosicielstwo u dzieci (epidemie w przedszkolach). Campylobacter spp. są esowato zakrzywionymi, gramujemnymi pałeczkami. Tworzą układy dwóch komórek przypominające wyglądem skrzydło mewy. Pałeczki te hoduje się na pożywkach zawierających krew (np. agar czekoladowy) w warunkach mikroaerofilnych i optymalnej temperaturze 43˚C. Chorobotwórczość Campylobacter jejuni jest determinowana znaczną ruchliwością, oraz wytwarzaniem enterotoksyny i cytotoksyny. C. jejuni wywołuje kampylobakteriozę – ostre zapalenie żołądka i jelit, manifestujące się krwawą biegunką, bólami brzucha i gorączką. Rzadziej bywa przyczyną sepsy. Kampylobakterioza jest zoonozą. Źródłem zakażenia jest najczęściej żywność pochodzenia zwierzęcego. Gatunki tego rodzaju Campylobacter spp. mogą też przenosić się z człowieka (nosiciela lub chorego) na człowieka drogą fekalno-oralną. Rodzaj Helicobacter H. pylori – może występować na błonach śluzowych żołądka i dwunastnicy u zdrowych ludzi; jest odpowiedzialny za chorobę wrzodową żołądka i dwunastnicy. Są to zakrzywione gramujemne pałeczki, trudne do hodowli – wymagają warunków mikroaerofilnych i pożywek wzbogaconych krwią oraz temperatury 43oC. 136 Chorobotwórczość Helicobacter pylori jest związana m.in. z ich ruchliwością, adhezynami, wytwarzaniem ureazy i mucynazy oraz działających cytotoksycznie: antygenem Cag (onkoproteina) i toksyną wakuolizującą VacA. H.pylori jest uznany za czynnik etiologiczny nieżytów i choroby wrzodowej żołądka oraz dwunastnicy, w następstwie których może dojść do powstania nowotworów (np. raka żołądka). Rodzaj Bacteroides B. fragilis stanowi główny składnik (około 90%) fizjologicznej flory jelita grubego. Jest patogenem oportunistycznym. Bacteroides fragilis jest drobną, gramujemną pałeczką, ma otoczkę. Jest beztlenowcem, wymaga do hodowli wzbogaconych pożywek specjalnych i warunków beztlenowych. Chorobotwórczość B. fragilis jest uwarunkowana m.in. enzymami (np. kolagenaza, hialuronidaza) i toksynami (hemolizyny, enterotoksyna – fragilizyna). B. fragilis wywołuje ropne i zgorzelinowe stany zapalne, gdy przedostanie się z jelita grubego do innych narządów (zapalenie wyrostka robaczkowego, otrzewnej, ropnie płuc, jajników, wątroby), a także sepsę. Są to zakażenia endogenne. Szczepy wytwarzające enterotoksynę powodują zatrucia pokarmowe. Rodzaje Bifidobacterium mlekowego) i Lactobacillus (pałeczki kwasu L. acidophilus, L. casei; Bifidobacterium spp. – komensale, składniki flory fizjologicznej przewodu pokarmowego (głównie u niemowląt) i pochwy dorosłych kobiet. 137 Oba rodzaje to gramdodatnie polimorficzne pałeczki. Bifidobacterium spp. to bakterie beztlenowe, Lactobacillus spp. są względnymi beztlenowcami lub mikroaerofilami. Oba rodzaje preferują środowisko kwaśne. Metabolity tych pałeczek (kwasy organiczne) zakwaszają środowisko przewodu pokarmowego oraz pochwy, zapobiegając namnażaniu się bakterii i grzybów chorobotwórczych. Wytwarzany w przewodzie pokarmowym kwas mlekowy sprzyja wchłanianiu wapnia. Pałeczki Bifidobacterium syntetyzują witaminy B1, B2 i K oraz uwalniają kwas mlekowy w wyniku rozkładu glikogenu ze złuszczonego nabłonka pochwy. Gatunki rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium, bytujące w pochwie, tradycyjnie nazywane są pałeczkami Doederleina. U zdrowej kobiety pałeczki te występują wyłącznie lub dominują wśród mikroflory. Na podstawie obrazu mikroskopowego preparatu barwionego metodą Grama, wykonanego z wydzieliny pochwy, ocenia się tzw. stopień czystości pochwy. Ma to znaczenie w diagnostyce stanów zapalnych pochwy. U zdrowej kobiety występują wyłącznie lub dominują pałeczki Doederleina (stopień I i II). Obecne są też nieliczne komórki nabłonka płaskiego. W zakażeniach pochwy pałeczki Doederleina znikają, a ich miejsce zajmują inne bakterie gramdodatnie i gramujemne lub grzyby (drożdże). Pojawiają się też granulocyty obojętnochłonne, co świadczy o toczącym się procesie zapalnym (stopień III-IV). U dziewczynek przed okresem pokwitania, kobiet w okresie pomenopauzalnym, a także po leczeniu antybiotykami w pochwie może nie być bakterii (stopień czystości 0) bądź występować mieszana flora bakteryjna. Pałeczki obu rodzajów wchodzą w skład różnych probiotyków (np. Lakcid) stosowanych w leczeniu i profilaktyce biegunek o różnej etiologii (m.in. po terapii antybiotykami) oraz zakażeń pochwy. Probiotyczne szczepy pałeczek Lactobacillus wykazują działanie antagonistyczne wobec innych (chorobotwórczych) drobnoustrojów. Mają też udział w regulacji mechanizmów odpornościowych, zarówno działających miejscowo w jelicie, jak i ogólnoustrojowych. W leczeniu zakażeń pochwy preparaty probiotyczne przywracają prawidłowy skład mikroflory. Preparaty Lakcid i Lactovaginal zawierają pałeczki z rodzaju Lactobacillus. 138 Rodzaj Clostridium – laseczki beztlenowe Wśród licznych gatunków laseczek z rodzaju Clostridium są saprofity bytujące w środowisku (gleba, woda, ścieki), komensale – składniki fizjologicznej flory jelitowej ludzi i zwierząt oraz patogeny człowieka i zwierząt. C. botulinum (laseczka jadu kiełbasianego) C. tetani (laseczka tężca) C. difficile (laseczka rzekomobłoniastego, poantybiotykowego zapalenia jelit) C. perfringens (laseczka zgorzeli gazowej) Są to wytwarzające przetrwalniki pałeczki gramdodatnie. W preparatach mikroskopowych mają często charakterystyczny wygląd powodowany przez obecność okrągłych lub owalnych przetrwalników. W zależności od umiejscowienia nadają one komórkom kształt „rakiety tenisowej”, „pałeczki dobosza” lub „osełki”. Laseczki Clostridium hoduje się na pożywkach specjalnych w warunkach beztlenowych. Clostridium botulinum wytwarza w warunkach beztlenowych (np. w konserwach) białkowe toksyny (jad kiełbasiany), które są neurotoksynami powodującymi wiotkie porażenia mięśni. Toksyna botulinowa jest ciepłochwiejna (ulega inaktywacji w temperaturze 80ºC w ciągu 20 minut). Choroba: botulizm jest najczęściej skutkiem zatrucia pokarmowego toksyną obecną w produktach spożywczych, w których mnożyły się laseczki (botulizm klasyczny). Wyróżnia się też botulizm niemowląt, botulizm przyranny i botulizm aerogenny (po inhalacji aerozolu toksyny). Jad kiełbasiany jest jedną z najsilniejszych trucizn, które mogą mieć zastosowanie jako broń biologiczna. Doustna dawka śmiertelna to 1 µg/kg masy ciała. Toksyna ta (w bardzo małych dawkach) jest stosowana również jako pomocniczy środek leczniczy w medycynie oraz w kosmetologii. Podaje się ją m.in. w celu zmniejszenia przykurczy mięśni w 139 porażeniu mózgowym i kręczu karku. W medycynie kosmetycznej toksyna ta ma zastosowanie w likwidacji zmarszczek, a także nadmiernej potliwości. Clostridium tetani wytwarza dwie toksyny: hemolizynę (tetanolizynę) i neurotoksynę (tetanospazminę), która jest głównym czynnikiem chorobotwórczości tej laseczki i powoduje porażenia spastyczne mięśni szkieletowych. Tężec jest chorobą o bardzo dużej śmiertelności. Rozwija się w wyniku namnożenia się laseczek w ranie pourazowej zanieczyszczonej glebą, w której znajdowały się ich przetrwalniki. Toksyna z rany przenika do centralnego układu nerwowego i powoduje niekontrolowane, bolesne skurcze mięśni szkieletowych całego ciała, które mogą prowadzić do uduszenia. Clostridium difficile bytuje w jelicie grubym u zdrowych ludzi jako składnik normalnej flory (w niewielkiej ilości). U chorych poddawanych długotrwałej antybiotykoterapii może dojść do namnożenia toksynotwórczych szczepów C. difficile i choroby – poantybiotykowego rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego. Clostridium perfringens jest gatunkiem najczęściej izolowanym spośród grupy laseczek wywołujących zgorzel gazową. Dochodzi do niej w wyniku przedostania się przetrwalników do rozległych ran pourazowych. Zgorzel gazowa polega na rozpływnej martwicy mięśni i/lub tkanki łącznej z tworzeniem gazu i ogólną toksemią. Główną toksyną C. perfringens jest α-toksyna (lecytynaza – fosfolipaza C). C. perfringens wytwarza też toksynę immunomodulującą – enterotoksynę powodującą zatrucia pokarmowe. Wiele innych gatunków rodzaju Clostridium wchodzi w skład flory fizjologicznej jelita grubego u ludzi i zwierząt. Obecność laseczek Clostridium spp. w wodzie może świadczyć o skażeniu jej ściekami. 140 Rodzaj Enterococcus – paciorkowce kałowe (enterokoki) E. faecalis, E. faecium – najczęściej izolowane od człowieka enterokoki. Są one komensalami bytującymi w jelicie grubym człowieka i zwierząt. Bywają często oportunistycznymi patogenami. Komórki enterokoków to gramdodatnie, duże, owalne ziarenkowce. Mają małe wymagania pokarmowe. Są względnymi beztlenowcami. Nie wytwarzają katalazy (podobnie jak inne paciorkowce). W schemacie wg Lancefield są zaliczane do grupy serologicznej D. Enterokoki hydrolizują eskulinę i wyrastają w obecności 40% żółci, co wykorzystuje się do ich izolacji i identyfikacji. Są halotolerantami. Mogą wyrastać w szerokim zakresie temperatur (10 - 45˚C) i przeżywają ogrzewanie w temperaturze 60˚C przez 30 minut. Enterokoki bywają przyczyną infekcji oportunistycznych układu moczowego, układu krążenia (sepsa), dróg żółciowych, zakażają też rany oparzeniowe. Są to zwykle zakażenia szpitalne. Obecność enterokoków w wodzie świadczy o jej skażeniu kałem ludzi lub zwierząt. Metody Badanie bakteriologiczne kału Materiałem klinicznym, w którym poszukujemy patogenów jelitowych jest kał. Oglądanie barwionych metodą Grama preparatów mikroskopowych wykonanych bezpośrednio z badanego materiału ma niewielkie znaczenie w diagnostyce. Ocena bezpośrednich preparatów jest ważna w chorobach pasożytniczych. Rutynowe badanie bakteriologiczne kału osób chorych i nosicieli najczęściej polega na serii posiewów zmierzających do wykrycia w nim obecności chorobotwórczych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, głównie z rodzaju Shigella, Salmonella, Yersinia. Badania w kierunku 141 nosicielstwa Shigella spp. i Salmonella spp. są obowiązkowe przy podejmowaniu i w trakcie pracy w różnych zawodach. W celu eliminacji bakterii flory fizjologicznej (dominujących w materiale) próbkę kału posiewa się na pożywki diagnostyczno–wybiórcze i inkubuje w obecności tlenu atmosferycznego (brak wzrostu beztlenowców). Podłoże MacConkeya używane jest, kiedy wystarczy niska selektywność pożywki. Podłoże to umożliwia wzrost wszystkich pałeczek gramujemnych tlenowych i względnie beztlenowych (Enterobacteriaceae) o małych wymaganiach pokarmowych (prototrofy); obecność w pożywce fioletu krystalicznego i soli kwasów żółciowych hamuje całkowicie wzrost bakterii gramdodatnich i tylko tych gramujemnych, które mają duże wymagania odżywcze. Zawarta w pożywce laktoza umożliwia różnicowanie pałeczek na rozkładające laktozę: laktozododatnie (kolonie różowe) i laktozoujemne (kolonie w kolorze podłoża). Podłoże SS (Salmonella–Shigella) jest pożywką o silnej wybiórczości i służy do wykrywania i izolacji pałeczek rodzajów Salmonella i Shigella. Zawarte w pożywce cytryniany i wysokie stężenie soli kwasów żółciowych hamują wzrost bakterii gramdodatnich i Escherichia coli oraz innych fizjologicznie występujących w jelicie pałeczek. Pożywka zawiera laktozę; kolonie pałeczek rozkładających laktozę (laktozododatnie) są różowe, nie rozkładających laktozy (laktozoujemne), m. in. pałeczek Salmonella, Shigella i Yersinia są bezbarwne. Podłoże SS zawiera też sole żelaza, które pozwalają na ujawnienie wytwarzania siarkowodoru – kolonie są wtedy czarne lub bezbarwne z czarnym środkiem. Metody badania bakteriologicznego moczu Czynnikiem etiologicznym zakażeń dróg moczowych są najczęściej pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae, głównie Escherichia coli. W moczu oddawanym w sposób naturalny zawsze znajduje się pewna ilość bakterii wypłukanych z cewki moczowej, dlatego diagnostyka opiera się nie tylko na stwierdzeniu obecności bakterii w moczu, ale także określeniu ich ilości w 1 mL odpowiednio pobranej próbki materiału. 142 Sposób pobrania próbki moczu do badania bakteriologicznego Należy dokładnie umyć wodą z mydłem okolice cewki moczowej. Pierwszą porcję moczu oddać do toalety. Nie przerywając mikcji (oddawania moczu) zebrać kilka mililitrów do jałowego pojemniczka (tzw. mocz ze środkowego strumienia). Pozostałą zawartość pęcherza oddać do toalety. Tak pobrany mocz powinien zostać zbadany w ciągu 2 godzin. Liczbę żywych komórek bakteryjnych w 1 mL moczu określa się stosując metodę rozcieńczeń i posiew powierzchniowy na płytki z odpowiednią pożywką np. MacConkeya lub agar z krwią. Zliczenie kolonii i uwzględnienie rozcieńczenia próbki pozwala na obliczenie liczby bakterii zdolnych do tworzenia kolonii w moczu (rozdział 9). Inną metodą oznaczania liczby bakterii w moczu, lecz mającą mniejszą wartość diagnostyczną (orientacyjną), jest stosowana ostatnio dość często technika zanurzeniowa. W metodzie tej stosuje się dostępne w aptece gotowe zestawy transportowo–wzrostowe typu Uromedium, Uricult lub inne. Zestaw zawiera plastikową płytkę pokrytą z dwóch stron warstwą pożywek: MacConkeya i CLED (bezelektrolitowe, nieselektywne podłoże zapobiegające rozpełzliwemu wzrostowi pałeczek Proteus), umocowaną w nakrętce wewnątrz jałowego pojemnika. Płytkę tę zanurza się na kilka sekund w badanym moczu lub zwilża środkowym strumieniem moczu podczas mikcji i ponownie umieszcza w pojemniku. Po inkubacji w cieplarce ocenia się wzrost bakterii ilościowo przez porównanie z dołączonymi do zestawu wzorcami. 3 Interpretacja wyników. Obecnie uważa się, że wartość równa 10 lub więcej komórek/mL już można uznać za znamienną bakteriurię w zależności od rodzaju czynnika etiologicznego i objawów klinicznych – np. E. coli u kobiety z objawami stanu zapalnego układu moczowego. Po stwierdzeniu bakteriurii znamiennej należy zidentyfikować wyhodowane bakterie i określić ich wrażliwość na antybiotyki. 143 Badanie bakteriologiczne wody pitnej W wodzie mogą się znaleźć właściwe bakterie wodne i glebowe (psychrofile – niechorobotwórcze dla człowieka) i drobnoustroje ściekowe: bakterie, wirusy, pasożyty (cysty i jaja), które są potencjalnie chorobotwórcze dla człowieka. Sanitarno–epidemiologiczna ocena wody obejmuje oznaczenie: ogólnej liczby żywych bakterii psychrofilnych (nie więcej niż 102/mL), 1 ogólnej liczby bakterii mezofilnych (nie więcej niż 5x 10 /mL), wykluczenie obecności żywych bakterii wskaźnikowych, wykluczenie obecności beztlenowych laseczek Clostridium perfringens (formy wegetatywne i przetrwalniki). Bakterie wskaźnikowe to te mikroorganizmy, które stanowią stały składnik flory jelitowej człowieka i zwierząt. Do środowiska zewnętrznego dostają się wraz z odchodami, a więc obecność ich w wodzie wskazuje na zanieczyszczenie jej ściekami komunalnymi lub bezpośrednio fekaliami. W wodzie tak zanieczyszczonej mogą potencjalnie znaleźć się drobnoustroje chorobotwórcze (bakterie, wirusy, pierwotniaki) oraz jaja pasożytów, wydalane z organizmu wraz z kałem. Do bakterii wskaźnikowych zaliczamy pałeczkę okrężnicy (E. coli), która występuje w dużych ilościach w jelicie grubym (ok. 108 komórek/g kału) oraz paciorkowce kałowe (enterokoki). Badania prowadzi się też w kierunku obecności w wodzie bakterii tzw. grupy coli (fermentujące laktozę do kwasu i gazu pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae – E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp.). W 100 cm3 wody pitnej nie powinno być ani jednej komórki bakterii wskaźnikowych (Escherichia coli, bakterie grupy coli, ziarenkowce z rodzaju Enterococcus). Badanie wody w kierunku obecności bakterii wskaźnikowych wykonuje się najczęściej techniką filtrów membranowych, które po przesączeniu przez nie próbki wody układa się na odpowiedniej pożywce. Dla grupy coli może to być np. podłoże Endo – diagnostyczno-wybiórcza pożywka zawierająca laktozę oraz siarczyn sodu i fuksynę, które hamują wzrost bakterii gramdodatnich. Kolonie bakterii laktozododatnich mają barwę od różowej po intensywnie czerwoną, ale kolor kolonii E. coli jest 144 wyjątkowo intensywny - ciemnoczerwony z charakterystycznym zielonkawym, metalicznym połyskiem. Dla grupy coli jest to np. podłoże Endo – diagnostyczno-wybiórcza pożywka zawierająca laktozę oraz siarczyn sodu i fuksynę, które hamują wzrost bakterii gramdodatnich. Kolonie bakterii laktozododatnich mają barwę od różowej po intensywnie czerwoną, ale kolor kolonii E. coli jest wyjątkowo intensywny ciemnoczerwony z charakterystycznym zielonkawym, metalicznym połyskiem. Kolonie jasnoróżowe, dla potwierdzenia fermentacji laktozy, posiewa się np. na płynną pożywkę z tym cukrem, wskaźnikiem barwnym i rurką Durhama (podłoże Andrade) i inkubuje równolegle w temperaturze o 37 C (24-48 godzin) i 44°C (24 godziny). Dla kolonii laktozododatnich należy wykonać próbę na obecność oksydazy cytochromowej oraz zdolność wytwarzania tryptofanazy w temperaturze 44°C (inkubacja 24 godziny). Najważniejszą próbą potwierdzającą obecność E.coli jest test na wytwarzanie β-D-glukuronidazy. Zadania do wykonania Zadanie 1. Ocena mikroskopowa próbki kału - Nanieś na szkiełko podstawowe kroplę wody. - Zawieś w tej kropli niewielką ilość kału pobranego ezą z pojemnika. - Wykonaj rozmaz na szkiełku. - Wysusz preparat i utrwal w płomieniu palnika. - Zabarw preparat metodą Grama. - Obejrzyj i oceń wartość diagnostyczną takiego preparatu. 145 Zadanie 2. Wykonanie posiewu próbki kału - Pobierz jałową ezą próbkę kału z pojemnika transportowego. - Posiej techniką redukcyjną na: - płytkę MacConkeya, - płytkę z podłożem SS. o - Inkubuj w cieplarce 37 C przez około 20 godzin. - Oceń wygląd wyrosłych kolonii. Zadanie 3. Bakterie w przewodzie pokarmowym - Uzupełnij tabelę wpisując z pamięci nazwy przynajmniej 10 rodzajów bakterii, których gatunki bytując w przewodzie pokarmowym pasują do opisu. Bakterie (rodzaje) stanowiące florę fizjologiczną przewodu pokarmowego Bakterie chorobotwórcze (spotykane tylko u chorych lub nosicieli) Bakterie spotykane u nosicieli Bakterie wytwarzające zewnątrzkomórkowe toksyny odpowiedzialne za obraz kliniczny choroby 146 Rozdział 3 Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka Część teoretyczna Środowisko przyrodnicze jest miejscem bytowania licznych rodzajów bakterii saprofitycznych i chorobotwórczych. Naturalnym siedliskiem bakterii saprofitycznych są woda, gleba i ścieki. Bakterie te mogą unosić się w powietrzu na cząstkach kurzu i w formie aerozoli. Mogą przedostawać się na powierzchnie przedmiotów, do żywności, leków, a przez to do organizmu ludzkiego stając się niekiedy przyczyną różnych infekcji oportunistycznych. Bakterie chorobotwórcze dostają się do środowiska najczęściej wraz z wydzielinami i wydalinami ludzi chorych i nosicieli oraz chorych i zdrowych zwierząt, u których są składnikami flory fizjologicznej. Rodzaj Listeria L. monocytogenes (pałeczka listeriozy) Fakultatywny pasożyt wewnątrzkomórkowy. Głównym siedliskiem pałeczek Listeria jest gleba i gnijące rośliny oraz zbiorniki wodne i ścieki. Stąd bakterie te dostają się do organizmów różnych zwierząt. Wszystkie produkty żywnościowe są potencjalnie zakażone tymi pałeczkami. Komórki Listeria spp. to krótkie, gramdodatnie pałeczki, często układające się w łańcuszki. Są ruchliwe, rosną na prostych podłożach, są względnymi beztlenowcami, wytwarzają katalazę. Hydrolizują eskulinę, co wykorzystuje się w ich identyfikacji. Pałeczki Listeria mogą rosnąć w obecności nawet 10% soli i namnażać się w temperaturze 4˚C, a więc mnożą się w żywności przechowywanej w chłodni. 147 Pałeczki te są oporne na działanie niskiego pH soku żołądkowego, enzymów proteolitycznych i kwasów żółciowych co ułatwia im kolonizacje organizmu. Listeria monocytogenes jest fakultatywnym pasożytem wewnątrzkomórkowym. Wytwarza adhezyny (internaliny), enzymy i toksynę (listeriolizynę O), które pozwalają na przeżycie bakterii w makrofagach i ich rozprzestrzenianie się w organizmie. L. monocytogenes wywołuje listeriozę, która może występować w trzech klinicznych postaciach: jako listerioza noworodków, listerioza starszych dzieci i dorosłych oraz listerioza pracowników laboratoriów i weterynarzy – ta zwykle w postaci infekcji skóry i oczu. Listerioza noworodków jest uogólnioną infekcją o bardzo dużej śmiertelności. Do zakażenia może dojść od matki lub ze środowiska szpitalnego. Listerioza dzieci starszych i osób dorosłych może przebiegać łagodnie, ale także jako groźne dla życia zapalenie mózgu i opon mózgowo-rdzeniowych z sepsą. Do zakażenia dochodzi drogą pokarmową. Rodzaj Bacillus – laseczki tlenowe B. anthracis (laseczka wąglika) – chorobotwórcza. B. cereus (laseczka woskowa) – komensal, patogen oportunistyczny, odpowiedzialna za zatrucia pokarmowe. B. subtilis (laseczka sienna) – saprofit, patogen oportunistyczny (rzadko). Laseczki Bacillus spp. występują powszechnie. Są wśród nich gatunki chorobotwórcze dla ludzi, innych ssaków, owadów i roślin, komensale bytujące w układzie pokarmowym ludzi i zwierząt oraz wolno żyjące saprofity. Powszechność występowania tych laseczek w przyrodzie jest związana m.in. z wytwarzaniem przez nie przetrwalników. Przetrwalniki B. subtilis subsp. subtilis i Geobacillus stearothermophilus (dawniej – Bacillus stearothermophilus), ze względu na wyjątkowo dużą ciepłooporność, są stosowane w testach biologicznych do kontroli działania aparatów sterylizujących. Niektóre gatunki tych laseczek 148 (B. brevis, B. licheniformis, B. polymyxa) wytwarzają antybiotyki, co wykorzystuje się w przemyśle farmaceutycznym. Komórki laseczek, o różnej wielkości, są cylindryczne (pałeczkowate), układają się często w łańcuszki. Są gramdodatnie. Przetrwalniki nie wpływają na kształt komórek. Laseczka wąglika w organizmie zakażonym wytwarza polipeptydową otoczkę. Laseczki dobrze namnażają się na prostych pożywkach, tolerują wysokie stężenie NaCl (do 10%), szeroki zakres pH i temperatury (5-75°C). Są tlenowcami lub względnymi beztlenowcami. Na agarze z krwią większość gatunków powoduje hemolizę typu β, zwykle bardzo dużą strefę wokół kolonii. Wytwarzają katalazę. Chorobotwórczość Bacillus anthracis jest związana z działaniem trójskładnikowej białkowej toksyny oraz obecnością otoczki. Wąglik jest śmiertelną chorobą o piorunującym przebiegu, występującą głównie u zwierząt trawożernych. Człowiek zakaża się przetrwalnikami znajdującymi się w produktach pochodzących od padłych zwierząt (skóry, futra, wełna, mączka kostna). Przetrwalniki B. anthracis mogą być użyte (już były) jako broń biologiczna. Laseczka wąglika człowieka mogą wystąpić trzy postacie choroby (zależnie od drogi wtargnięcia przetrwalników): postać skórna (tzw. czarna krosta) – najłagodniejsza, postać płucna („choroba sortowaczy wełny”) i rzadko postać jelitowa. Postać płucna i jelitowa, zbyt późno rozpoznane, przeważnie kończą się śmiercią. Choroba ta występuje głównie w Azji i Afryce, wśród zwierząt hodowlanych i dzikich. B. cereus wytwarza toksyny odpowiedzialne za objawy zatruć pokarmowych: termostabilną toksynę „wymiotną” (cereulid) i wrażliwą na wysoką temperaturę toksynę „biegunkową”- podobną do enterotoksyn LT przecinkowca cholery i pałeczki okrężnicy. Enterotoksyna „biegunkowa” wytwarzana jest w jelicie cienkim przez mnożące się laseczki, które dostały się tam wraz ze spożywanym pokarmem. Objawy zatrucia pojawiają się bardzo szybko. Wymioty występują w czasie od 15 minut do 4 godzin po spożyciu potrawy zawierającej toksynę „wymiotną”, a wodnista biegunka po 8-12 godzinach po zatruciu toksyną „biegunkową”. 149 Przetrwalniki B. cereus bardzo często są spotykane w różnych artykułach spożywczych (np. w ryżu). Laseczka ta może w niewielkich ilościach wchodzić w skład normalnej flory jelita grubego u ludzi. Wśród zakażeń oportunistycznych wywołanych przez laseczkę woskową, szczególnie niebezpieczne są zapalenia gałki ocznej (zwykle pourazowe), grożące nawet utratą wzroku. Rodzaje Pseudomonas, Stenotrophomonas i Acinetobacter P. aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej) – komensal, patogen oportunistyczny. S. maltophilia – patogen oportunistyczny, może występować w środowisku szpitalnym. Acinetobacter spp. – powszechne w środowisku (ścieki), kilka gatunków patogenów oportunistycznych, mogą się znaleźć wśród fizjologicznej mikroflory skóry człowieka. Pałeczki te charakteryzuje naturalna oporność na wiele antybiotyków, a ich wielooporne szczepy są częstą przyczyną zakażeń szpitalnych. Naturalnym siedliskiem tych pałeczek są gleba, woda i ścieki. P. aeruginosa może bytować jako komensal w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Pałeczki wymienionych rodzajów spotyka się często w szpitalach, gdzie zamieszkują w miejscach wilgotnych, jak np. syfony umywalek, natryski, zlewy itp. Te gramujemne pałeczki są podobne morfologicznie, wiele jest obdarzonych ruchem. Ich wymagania pokarmowe są bardzo małe. Mają zdolność wykorzystywania różnorodnych substratów energetycznych, nawet takich (tzw. niekonwencjonalnych), jak leki, środki dezynfekcyjne, środki czystości, produkty naftowe, w których mogą się namnażać. W laboratorium hoduje się te pałeczki na prostych pożywkach. Wszystkie są tlenowcami. Pałeczki Pseudomonas wytwarzają oksydazę cytochromową, pozostałe rodzaje są oksydazoujemne. Pałeczki te mogą namnażać się w szerokim zakresie temperatur (5-45˚C). 150 Ważną cechą identyfikacyjną Pseudomonas aeruginosa jest wytwarzanie rozpuszczalnych w wodzie barwników: np. niebieskiej piocjaniny, czy żółtozielonej fluoresceiny, które zabarwiają podłoża hodowlane. P. aeruginosa wytwarza szereg czynników determinujących jej chorobotwórczość – otoczkę, fimbrie i LPS oraz enzymy (proteazy, fosfolipaza C) i cytotoksyny (egzotoksyna A, egzoenzym S). Pałeczki te szczególnie często wywołują infekcje u pacjentów z obniżoną odpornością, u chorych z oparzeniami bądź poddawanych inwazyjnym zabiegom. P. aeruginosa są ważnymi czynnikami etiologicznymi zapalenia oskrzeli i płuc u chorych na mukowiscydozę. Mukowiscydoza jest chorobą genetyczną, w której zaburzone jest wydzielanie gruczołów egzokrynowych (potowych, śluzowych, trzustki). Wydzielina tych gruczołów jest skąpa, gęsta i lepka, co hamuje ruch rzęsek nabłonka i ułatwia inwazję przez drobnoustroje. Skażenie pałeczką ropy błękitnej leków ocznych lub kosmetyków stosowanych w okolicy oczy stanowi duże zagrożenie utratą wzroku wskutek uszkodzenia rogówki przez proteazy wytwarzane przez te bakterie. Rodzaj Legionella L. pneumophila subsp. pneumophila – wewnątrzkomórkowe patogeny wywołujące infekcje dróg oddechowych. Są to gramujemne pałeczki, których naturalnym siedliskiem jest gleba i woda otwartych zbiorników oraz domowych urządzeń wodociągowych (rury, natryski) i urządzeń klimatyzacyjnych. Bakterie te długo przeżywają w środowisku wilgotnym, nawet w temperaturze 60˚C. Są oporne na działanie chloru (np. zawartego w wodzie wodociągowej). Większość szczepów charakteryzuje się naturalną opornością na antybiotyki β-laktamowe. 151 Komórki Legionella są polimorficzne. Pałeczki te są trudnymi w hodowli laboratoryjnej auksotrofami. Są tlenowcami wytwarzającymi katalazę. Rosną wolno i są mało aktywne metabolicznie, co utrudnia identyfikację. Pałeczki Legionella mają zdolność przeżywania i mnożenia się wewnątrz makrofagów. Bakterie te hamują odpowiedź komórkową organizmu. Najczęściej przyczyną infekcji u ludzi jest L. pneumophila subsp. pneumophila. Do zakażenia dochodzi poprzez wdychanie aerozoli zawierających te bakterie. Wywołują legionelozę - chorobę legionistów, która jest ciężkim w przebiegu zapaleniem płuc lub gorączkę Pontiac – łagodniejszą, grypopodobną infekcję, nie zajmującą płuc. Zachorowaniom na legionelozy sprzyjają: obniżenie odporności organizmu, palenie tytoniu, przewlekłe choroby płuc, praca w środowisku, gdzie tworzą się aerozole wodno-powietrzne (SPA, myjnie samochodów, gabinety stomatologiczne, klimatyzowane pomieszczenia itp.). Obecnie w szpitalach obowiązuje badanie ciepłej wody w kierunku obecności tych pałeczek. Zadania do wykonania Zadanie 1 Cechy rodzajów Pseudomonas, Bacillus, Listeria, Legionella Uzupełnij tabelę wpisując samodzielnie z pamięci nazwę gatunku lub rodzaju bakterii obdarzonych danymi cechami 152 Cecha bakterii Wytwarza barwniki dyfundujące do podłoża Gatunek lub rodzaj Wywołuje wąglik Może namnażać się w żywności w lodówce Wytwarza toksynę „wymiotną” Może namnażać się w środkach dezynfekcyjnych Przetrwalniki stosowane są do kontroli aparatów do sterylizacji Bytuje w urządzeniach klimatyzacyjnych Obecna w preparatach kosmetycznych stanowi realne zagrożenie dla gałki ocznej Powoduje infekcje układu oddechowego u osób z mukowiscydozą Powoduje zakażenia szpitalne Potencjalna broń biologiczna 153 154 Rozdział 4 Bakterie wywołujące choroby o swoistym przebiegu, trudne do hodowli lub identyfikacji Część teoretyczna Rodzaj Mycobacterium – prątki M .tuberculosis subsp. tuberculosis (prątek gruźlicy ludzki) M. bovis subsp. bovis (prątek gruźlicy bydlęcy) M. bovis BCG (atenuowany/niezjadliwy prątek bydlęcy) M. avium (prątek ptasi) – MOTT M. intracellulare (prątek mikobakteriozy) – MOTT M. kansasii (prątek mikobakteriozy) – MOTT M. leprae (prątek trądu) Prątki to szczególna grupa różniąca się szeregiem cech od innych bakterii. Są wśród nich gatunki chorobotwórcze dla ludzi i zwierząt, ale także saprofity bytujące w glebie i wodzie. Ściana komórkowa prątków zawiera bardzo dużo lipidów (około 60% suchej masy). Są to kwasy mikolowe, woski, glikolipidy. Z obecnością tych związków wiąże się kwaso-alkoholo-oporność, hydrofobowość, oporność na detergenty i barwniki anilinowe, niewrażliwość na wysychanie oraz cechy chorobotwórczości. Prątki dzielą się na dwie grupy: wolno rosnące – wzrost staje się widoczny makroskopowo po czasie dłuższym niż 7 dni (przeważnie po 2–6 tygodniach); do tej grupy należą prątki wywołujące gruźlicę u ludzi (M. tuberculosis i M. bovis), niechorobotwórczy prątek BCG oraz prątek ptasi i wymienione tu gatunki prątków wywołujących mikobakteriozy; szybko rosnące – wzrost pojawia się przed upływem 7 dni (w ciągu 2–3 dni); prątki saprofityczne. 155 Prątki wywołujące mikobakteriozy i prątki saprofityczne nazywane są (ze względów praktycznych) grupą MOTT (ang. Mycobacterium other than tuberculosis – „prątki inne, niż gruźlicze”). Prątki są bakteriami gramdodatnimi, lecz źle się barwią metodą Grama. Do ich barwienia stosuje się metodę Ziehla-Neelsena, w której wykorzystuje się cechę kwaso-alkoholo-oporności prątków. Komórki prątków są cienkimi pałeczkami, czasem układającymi się równolegle. Prątki hoduje się najczęściej na podłożu Loewensteina-Jensena zawierającym, oprócz składników odżywczych (jaja kurze, glicerol, asparagina, mąka ziemniaczana), zieleń malachitową, której zadaniem jest hamowanie wzrostu innych, szybko rosnących bakterii, mogących trafić przypadkowo do podłoża. Kolonie prątków gruźlicy na tym podłożu są suche, kalafiorowate. Prątki MOTT często wytwarzają barwniki karotenoidowe zabarwiające kolonie na żółto lub pomarańczowo. W nowoczesnych, automatycznych metodach hodowli prątków stosuje się płynne pożywki syntetyczne. Prątki są tlenowcami, wytwarzają katalazę. Są oporne na penicylinę. Mycobacterium leprae nie rośnie na pożywkach. Jest obligatoryjnym (bezwzględnym) pasożytem wewnątrzkomórkowym. Można go namnożyć zakażając materiałem od chorego jedyne zwierzę wrażliwe na te prątki pancernika. Chorobotwórczość prątków wynika z ich zdolności do przeżywania i namnażania się w makrofagach oraz wyzwalania w organizmie gospodarza reakcji nadwrażliwości typu opóźnionego. Efektem tego jest tworzenie w zakażonych tkankach (najczęściej w płucach) ziarniniaków gruźliczych (gruzełków). Za przeżywanie prątków w makrofagach i tworzenie zmian patologicznych odpowiedzialne są zewnątrzkomórkowe enzymy (katalaza, peroksydaza) oraz składniki ściany komórkowej – glikolipidy – m.in. 6’, 6’–dimikolan α-trehalozy (tzw. czynnik sznurowy). M. tuberculosis i M. bovis wywołują gruźlicę u ludzi. Najczęściej choroba dotyczy płuc, lecz może atakować także inne narządy (gruźlica pozapłucna). Prątki MOTT wywołują mikobakteriozy, które również przeważnie dotyczą układu oddechowego i są klinicznie podobne do 156 gruźlicy. Mikobakteriozy występują głównie u osób z predyspozycjami (inne przewlekłe choroby płuc, praca w zawodzie rolnika, hodowcy drobiu). Prątki przenoszą się drogą kropelkową od chorego lub pyłową ze środowiska. Niektóre gatunki MOTT mogą być przyczyną infekcji skóry i tkanki podskórnej. Drogą zakażenia są wówczas rany kłute i drobne skaleczenia. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette–Guerin) jest atenuowanym, niezjadliwym prątkiem bydlęcym stosowanym powszechnie do szczepień profilaktycznych przeciw gruźlicy u ludzi i bydła. Prątek ten może wywoływać oportunistyczne infekcje u osób z niedoborami immunologicznymi, np. u chorych na AIDS. Stan nadwrażliwości późnej u osób, w których organizmie znajdują się żywe prątki gruźlicy (po szczepieniu, w czasie i po chorobie) można wykryć próbą tuberkulinową Mantoux. Mycobacterium leprae (prątek trądu) dysponuje czynnikami chorobotwórczości podobnymi jak prątki gruźlicy. Wywołuje trąd – przewlekłą chorobę, występującą głównie w krajach strefy tropikalnej Afryki i Azji. Zmiany chorobowe obejmują przede wszystkim skórę i nerwy czuciowe. Rodzaj Borrelia B. burgdorferi (krętek boreliozy z Lyme) – wywołuje chorobę z Lyme; wektorem przenoszącym są kleszcze z rodzaju Ixodes. B. recurrentis (krętek duru powrotnego) – wywołuje dur powrotny epidemiczny; wektorem przenoszącym jest wesz ludzka. Krętki Borrelia są gramujemnymi bakteriami spiralnymi, o nieregularnych skrętach. Hoduje się je na specjalnych pożywkach zawierających m.in. surowicę. Są mikroaerofilami. Rosną bardzo wolno (od 2 do 6 tygodni). Postępowanie diagnostyczne opiera się na testach serologicznych. 157 Czynnikami chorobotwórczości tych krętków są: toksyczny LPS i peptydoglikan, mające działanie immunomodulujące. Borelioza z Lyme (miasto w USA) występuje u ludzi po ukąszeniu przez kleszcza zakażonego krętkiem Borrelia burgdorferi. Naturalnym miejscem bytowania tych krętków są organizmy kleszczy, gryzoni i jeleni. Krętki, mnożąc się w organizmie, powodują uogólnioną infekcję z zapaleniem stawów, zaburzeniami neurologicznymi (zapalenie opon mózgowordzeniowych) oraz kardiologicznymi. Często, ale nie zawsze, pierwszym objawem choroby jest rumień w miejscu ukąszenia - tzw. „rumień wędrujący” (szerzący się koncentrycznie od punktu ukąszenia). Borrelia recurrentis wywołuje przenoszony przez wesz dur powrotny epidemiczny. Rezerwuarem krętków jest człowiek. Choroba charakteryzuje się nawrotami wysokiej gorączki i występującym przy tym odurzeniem. Rodzaj Treponema T. pallidum subsp. pallidum (krętek blady) występuje tylko w organizmie ludzi chorych na kiłę (syfilis). Komórki mają postać sprężynek o regularnych skrętach. Krętki te są gramujemne, lecz słabo barwią się barwnikami anilinowymi („blady”). Do barwienia preparatów używa się metody negatywnej lub ogląda żywe, poruszające się krętki w mikroskopie z ciemnym polem widzenia albo kontrastowo-fazowym. Krętek blady nie daje się hodować na pożywkach. Do celów doświadczalnych namnaża się krętki wprowadzając badany materiał do jąder królika. Czynniki chorobotwórczości krętka bladego są słabo poznane. Są to białka odpowiedzialne za adhezję do komórek gospodarza (głównie śródbłonka naczyniowego) oraz hialuronidaza warunkująca rozprzestrzenianie w organizmie. Kiła jest przewlekłą chorobą, przenoszoną głównie drogą płciową. Nieleczona przebiega w czterech etapach. Objawy kiły pierwotnej 158 pojawiają się po upływie 3-4 tygodni od zakażenia i mają postać niebolesnego owrzodzenia w miejscu wtargnięcia krętków do organizmu oraz powiększenia okolicznych węzłów chłonnych. Owrzodzenie goi się bez pozostawienia blizny. Kiła II okresu (wtórna) charakteryzuje się uogólnionym powiększeniem węzłów chłonnych, wysypką plamistogrudkową, obejmującą również dłonie i podeszwy stóp. Występują też objawy przypominające grypę. To stadium choroby trwa do około 6 miesięcy od chwili zakażenia. W tym czasie krętki mnożą się i rozsiewają drogą krwi po całym organizmie. W kile III (po 2-5 latach) i IV okresu (po 10-20 latach od zakażenia) są już trwałe zmiany w licznych narządach i leczenie jest nieskuteczne. Wskutek zaatakowania układu nerwowego, pojawiają się liczne objawy neurologiczne (porażenia, zaburzenia czucia)oraz zaburzenia psychiczne. U dzieci urodzonych przez matki chore na kiłę występuje kiła wrodzona. Rodzaj Brucella – pałeczki brucelozy Bakterie te występują w organizmach przewlekle chorych zwierząt hodowlanych (kozy, owce, bydło, świnie). Są to gramujemne, bardzo drobne (ziarenkowate) pałeczki. Hoduje się je na pożywkach wzbogaconych. Są tlenowcami; niektóre gatunki wymagają do hodowli zwiększonej ilości dwutlenku węgla (10%). Wytwarzają oksydazę cytochromową, katalazę i ureazę. Pałeczki Brucella spp. mają zdolność przeżywania i mnożenia się w makrofagach – są fakultatywnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi. U zwierząt hodowlanych powodują zakaźne poronienia. U ludzi wywołują przewlekłą chorobę – brucelozę, atakującą głównie układ kostno-stawowy i narządy wewnętrzne (śledziona, wątroba, węzły chłonne). Bruceloza jest zoonozą. Człowiek zakaża się przez kontakt z chorymi zwierzętami (weterynarze, hodowcy) bądź przez spożywanie surowych produktów spożywczych (mleko, mięso). 159 Rodzaje Mycoplasma i Ureaplasma – mikoplazmy M. pneumoniae – wywołuje „atypowe” zapalenia płuc. M. hominis, U. urealyticum – odpowiedzialne są za oportunistyczne infekcje dróg moczowo-płciowych. Mikoplazmy są bakteriami charakteryzującymi się brakiem ściany komórkowej. Są polimorficzne, od bardzo drobnych ziarenek do długich nitek. Do wzrostu wymagają wzbogaconych pożywek, zawierających cholesterol. Rosną wolno w warunkach tlenowych lub mikroaerofilnych. Kolonie mikoplazm przypominają wyglądem sadzone jaja. Są bardzo drobne, ogląda się je przy użyciu lupy. Największą rolę w chorobotwórczości mikoplazm odgrywa adhezja do komórek błon śluzowych układu oddechowego (M. pneumoniae) układu moczowo-płciowego (M. hominis, U. urealyticum). Pewne znaczenie mają też enzymy: ureaza, proteazy – proteaza IgA1. Mycoplasma pneumoniae wywołuje „atypowe” śródmiąższowe zapalenie płuc, które może być powikłane zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych, zapaleniem mięśnia sercowego, zapaleniem stawów. Po przebytych chorobach może pozostawiać nosicielstwo. Mycoplasma hominis i Ureaplasma urealyticum kolonizują często układ moczowo-płciowy osób aktywnych seksualnie. Mogą wywoływać oportunistyczne infekcje układu moczowo-płciowego: odmiedniczkowe zapalenie nerek, zapalenie jajników i jajowodów, najądrzy i gruczołu krokowego, nierzeżączkowe zapalenie cewki moczowej u mężczyzn. Mogą również być przyczyną gorączki połogowej i poronień. Mikoplazmy te przenoszą się drogą płciową. 160 Rodzaj Chlamydia i Chlamydophila – chlamydie Chlamydia trachomatis - wywołuje jaglicę i choroby przenoszone drogą płciową. Chlamydophila pneumoniae – powoduje zakażenia układu oddechowego. Chlamydie są obligatoryjnymi (bezwzględnymi) pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Mogą namnażać się tylko wewnątrz komórek gospodarza. Są nazywane pasożytami „energetycznymi”, ponieważ nie mogą syntetyzować ATP i czerpią ten związek z zakażonej komórki. Ściana komórkowa chlamydii zawiera lipopolisacharyd, lecz brak w niej peptydoglikanu. Chlamydie charakteryzuje specyficzny cykl życiowy, w którym występują w dwóch podstawowych postaciach: ciałko elementarne – zewnątrzkomórkowa forma zakaźna, która wnika do komórki docelowej; ciałko siateczkowate – wewnątrzkomórkowa, niezakaźna forma replikacyjna, która powstaje w komórce po kilku godzinach od wniknięcia ciałka elementarnego. Z ciałek siateczkowatych, przez ich skupienie, tworzy się ciałko pośrednie. Ciałka siateczkowate dzielą się i powstają z nich ciałka elementarne. Wypełniony nimi fagosom nazywany jest ciałkiem wtrętowym, które można zobaczyć pod mikroskopem. Ciałka elementarne opuszczają komórkę, która ulega zniszczeniu (działanie cytotoksyczne) i zakażają kolejne komórki organizmu lub nowego gospodarza. Gatunek Chlamydia trachomatis dzieli się na dwa biotypy. Szczepy należące do biotypu TRACHOMA wywołują ciężką chorobę oczu – jaglicę, wtrętowe zapalenie spojówek, a także zapalenie płuc i spojówek u noworodków (zakażonych podczas porodu). Powodują także choroby przenoszone drogą płciową: nierzeżączkowe i porzeżączkowe zapalenie cewki moczowej oraz inne stany zapalne narządów płciowych wewnętrznych u kobiet i mężczyzn. Szczepy biotypu LGV wywołują również chorobę przenoszoną przez kontakt płciowy – ziarniniak weneryczny. 161 Chlamydophila pneumoniae jest czynnikiem etiologicznym zapalenia oskrzeli i płuc oraz gardła i zatok o atypowym przebiegu. Częste infekcje tymi bakteriami mogą przyczyniać się do rozwoju astmy i nowotworów płuc. Ostatnio przypisuje się temu gatunkowi udział w powstawaniu chorób układu krążenia (miażdżyca, choroba wieńcowa) i układu nerwowego (choroba Alzheimera, stwardnienie rozsiane). C. pneumoniae przenosi się drogą kropelkową. Rodzaj Rickettsia – riketsje Grupa duru wysypkowego: R. prowazekii – wywołuje dur wysypkowy/plamisty epidemiczny, R. typhi – wywołuje dur wysypkowy/plamisty endemiczny (szczurzy). Grupa gorączek plamistych: wiele gatunków Riketsje są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Powodują choroby ludzi i zwierząt (ssaki i stawonogi). Są to bardzo drobne, polimorficzne, gramujemne pałeczki. Źle barwią się metodą Grama, stosuje się do ich barwienia metodę Giemsy lub Gimeneza. Riketsje nie rosną na pożywkach bakteriologicznych. Można je jedynie namnażać w zarodkach kurzych albo w hodowlach komórek (np. kurze fibroblasty). Riketsje działają cytotoksycznie na komórki, szczególnie na śródbłonek naczyń krwionośnych. Riketsje są przenoszone na człowieka od chorych ludzi lub zwierząt przez wszy, pchły, kleszcze i roztocza, które także mogą być rezerwuarem tych bakterii. Do zakażenia dochodzi wskutek ukąszenia lub wtarcia w uszkodzoną skórę wydalin zakażonych stawonogów. Choroby wywoływane przez rodzaj Rickettsia dzielą się na dwie grupy: grupę duru wysypkowego i grupę gorączek plamistych. 162 Dury wysypkowe to: dur plamisty epidemiczny (R. prowazekii) przenoszony przez wszy odzieżowe (rezerwuarem zarazka jest człowiek) i dur plamisty endemiczny/szczurzy (R. typhi), przenoszony przez pchły szczurze (rezerwuarem są szczury i inne gryzonie). Choroby te występują na całym świecie. Gorączki plamiste, przenoszone przez kleszcze lub roztocza, przypisane są zwykle do określonych regionów geograficznych, np. gorączka plamista Gór Skalistych. W Polsce pojawiła się ostatnio przenoszona przez kleszcze gorączka plamista wywoływana przez R. helvetica. Metody Metoda barwienia preparatów bakteryjnych Ziehla-Neelsena Barwienie metodą Ziehla-Neelsena umożliwia wykrycie bakterii kwasoalkoholo-opornych (Mycobacterium, Nocardia). Jedynie one przyjmują i utrzymują w toku barwienia barwnik podstawowy. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy - fenolowy roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna karbolowa) odbarwiacz - alkohol etylowy z dodatkiem 3% HCl (alkohol zakwaszony) barwnik kontrastowy- alkoholowo-wodny roztwór błękitu metylenowego (błękit metylenowy) Zadania do wykonania Zadanie 1. Cechy bakterii z rodzajów opisanych w tym rozdziale. Uzupełnij tabelę wpisując samodzielnie, z pamięci, nazwy gatunków lub rodzajów bakterii 163 Cecha Nie hodują się na podłożach bakteriologicznych Gatunek lub rodzaj Kwasoodporne Przenoszone drogą płciową Namnażać się tylko w komórkach żywego organizmu Wywołuje gruźlicę Wywołuje kiłę Wywołuje zoonozę, w której źródłem zakażenia jest mleko i mięso Charakteryzuje się specyficznym cyklem rozwojowym Nie ma ściany komórkowej Przenoszone przez kleszcze Przenoszone przez wszy 164 Rozdział 5 Mikologia Część teoretyczna Budowa grzybów Grzyby są organizmami eukariotycznymi. Unikatowa ściana komórkowa grzybów zawiera m. in. chitynę, mannany i glukany. W błonie cytoplazmatycznej grzybów obecne są sterole (ergosterol). Substancje zapasowe gromadzone w komórce grzybów to głównie tłuszcze i glikogen. Komórki grzybów są większe od komórek bakteryjnych (2-40 μm). Na podstawie budowy oraz ze względów praktycznych i klinicznych grzyby dzieli się na cztery grupy: drożdże i grzyby drożdżopodobne, pleśniowe (nitkowate), dermatofity oraz grzyby dimorficzne. Grzyby występują w postaci strzępek, pseudostrzępek, lub luźno ułożonych komórek wegetatywnych. Rozgałęzione strzępki tworzą plechę (grzybnię). Jej górną warstwę stanowi grzybnia rozrodcza (reprodukcyjna), na której powstają zarodniki płciowe lub bezpłciowe. Wzrastające w formie mycelialnej (tworzące grzybnię) grzyby mające udział w patogenezie chorób u człowieka, na podłożach sztucznych dają puszyste kolonie. Grzyby rosnące w postaci wolnych pojedynczych komórek wegetatywnych należą głównie do drożdży lub grzybów drożdżopodobnych (drożdżaków). W hodowlach na podłożach stałych dają one płaskie kolonie, podobne do bakteryjnych. Niektóre drożdżaki (np. Candida albicans) w zakażonym organizmie mogą wytwarzać pseudostrzępki, które ułatwiają penetrację zajętych tkanek. Niektóre grzyby mogą wykazywać zróżnicowany wzrost, w zależności od warunków środowiska. Grzyby dimorficzne (dwupostaciowe, dwufazowe) występują często w postaci grzybni w środowisku, a w zakażonych tkankach przyjmują formę drożdżaków. 165 Rozmnażanie grzybów Stadium rozmnażania płciowego u grzybów nazywane jest stadium teleomorficznym (doskonałe). Rozmnażanie płciowe polega na tworzeniu zygoty z dwóch komórek wegetatywnych (somatogamia), bądź gamet znajdujących się wewnątrz gametangiów, które mogą być morfologicznie nierozróżnialne (izogamety), bądź być zróżnicowane na gametangium męskie i żeńskie. Większość grzybów chorobotwórczych w zakażonym organizmie, występuje jedynie w formie anamorficznej (niedoskonałej). Rozmnażanie bezpłciowe grzybów obejmuje tworzenie zarodników lub fragmentację grzybni. Zarodniki mogą mieć charakter endogeniczny, a powstające w workopodobnej zarodni (sporangium) umieszczonej na strzępkach zarodnionośnych (sporangiofory) noszą nazwę zarodników sporangialnych (sporangiospory). Zarodniki egzogenicznie tworzone są na strzępkach (aleurospory), pseudostrzępkach i komórkach wegetatywnych (blastospory) czy specjalnych strukturach - konidioforach (fialospory). Przez fragmentację grzybni uwalniane są artrospory (konidia plechowe). Konidia przetrwalne (chlamydospory) mają grubą ścianę oporną na działanie czynników zewnętrznych i uwalniane są w warunkach niekorzystnych np. głodu, ale mogą wchodzić również w cykl rozwojowy niektórych rodzajów. Klasyfikacja grzybów i ich znaczenie kliniczne W systematyce grzyby stanowią odrębne królestwo. Ich klasyfikacja ulega ciągłej zmianie i opiera się zarówno na ich rzeczywistym pokrewieństwie genetycznym, jak i na cechach fenotypowych. Tylko niewielka część opisanych gatunków grzybów jest chorobotwórcza dla człowieka. Grzyby wywołujące zakażenia u ludzi należą do następujących, niżej wymienionych klas. Ascomycetes (workowce) stanowią największą grupę grzybów, obejmującą 80% gatunków chorobotwórczych i oportunistycznych. Klasa 166 ta obejmuje pleśnie (Penicillum, Aspergillus), dermatofity (Trichophyton, Epidermophyton i Microsporum), grzyby dimorficzne (Histoplasma, Coccidioides, Sporothrix) oraz Pneumocystis Jirovenci (daw. P. carinii – przez długi czas zaliczane do pierwotniaków). Wśród klasy Basidiomycetes (podstawczaki) najważniejszymi rodzajami są drożdżopodobne grzyby Cryptococcus (oportunistyczny patogen układu oddechowego i ośrodkowego układu nerwowego), Malassezia (Pityrosporum) i Trichosporon (głównie odpowiedzialne za typowe grzybice powierzchniowe). Klasa Zygomycetes obejmują gatunki występujące w żywności, glebie i powietrzu. Najważniejsze z medycznego punktu widzenia są rodzaje Rhizopus, Mucor i Absidia. Są one typowymi patogenami oportunistycznymi. Wywołują zygomikozę (mukormikozę) nosowomózgową oraz innych narządów i tkanek. Infekcje te występują przede wszystkim u pacjentów chorujących na cukrzycę, a także choroby upośledzające mechanizmy odporności immunologicznej. Deuteromycetes (grzyby niedoskonałe; Fungi imperfecti) są sztuczną jednostką taksonomiczną obejmującą grzyby występujące jedynie w formie anamorficznej. Szeroko zakrojone badania taksonomiczne pozwoliły również na odnalezienie w środowisku teleomorficznych form większości chorobotwórczych gatunków pierwotnie przynależnych do grzybów niedoskonałych Hodowla grzybów chorobotwórczych Grzyby są organizmami heterotroficznymi i do swojego wzrostu wymagają związków organicznych. Wytwarzają zewnątrzkomórkowe enzymy (sacharolityczne, proteolityczne, lipolityczne) rozkładające związki wielkocząsteczkowe do prostych, łatwo przyswajalnych. Mają niewielkie wymagania pokarmowe i rosną dobrze na podłożach zawierających pepton i węglowodan. Są mezofilami, ale rosną w szerokim zakresie temperatur (10-48oC) co związane jest z miejscem ich naturalnego bytowania. Grzyby izolowane ze skóry osiągną optimum wzrostu w temperaturze 25-35oC, podczas gdy te, izolowane z zakażeń narządów wewnętrznych będą lepiej rosły w temperaturze 37oC. 167 Organizmy te są tlenowcami lub względnymi beztlenowcami. Optymalna wartość pH podłoża wynosi 5,0-6,0, jednak wiele gatunków może rosnąć w bardzo szerokim zakresie pH. Ze względu na stosunkowo wolny wzrost grzybów (szczególne nitkowatych), hodowane są one na podłożach wybiórczych względem bakterii np. zawierających wysokie stężenia sacharozy (nawet 50%) lub antybiotyki przeciwbakteryjne. Klasyczną pożywką do izolacji lub hodowli grzybów jest podłoże Sabouraud (płynne lub stałe), zawierające pepton i 4% glukozy lub maltozy. Chorobotwórczość grzybów Zakażenia grzybicze mogą mieć charakter endogenny, bądź egzogenny. Niektóre grzyby np. Candida wchodzą w skład naturalnej flory organizmu ludzkiego i mogą one stanowić źródło zakażeń endogennych. Infekcje egzogenne mogą być nabywane drogą wziewną (aspergiloza, kryptokokoza), kontakt bezpośredni z zakażoną osobą, zwierzęciem, przedmiotem czy glebą (dermatofitozy). Ze względu na drogi wnikania, powinowactwo do tkanek oraz na obraz kliniczny grzybice dzieli się na następujące omówione poniżej kategorie. Grzybice powierzchowne Wywołujące je grzyby nie wnikają pod powierzchowne, martwe warstwy naskórka, włosów i paznokci. Zmianom nie towarzyszy też na ogół odpowiedź zapalna lub jest ona niewielka. Grzybicą powierzchowną, występującą często na całym świecie, jest łupież pstry wywoływany przez lipofilny grzyb drożdżopodobny Malassezia furfur. Łupież pstry manifestuje się złuszczającymi wykwitami w kolorze od białego do brązowego, zajmującymi głównie skórę klatki piersiowej, szyi i ramion. Innym przykładem grzybicy powierzchownej jest biała piedra (łupież biały) wywoływana przez Trichosporon beigelli (syn T.cutaneum). Schorzenie cechuje tworzenie białych złogów na włosach, głównie twarzy, pachowych i łonowych. 168 Gatunki te opisywane były również jako czynniki etiologiczne rozsianych zakażeń oportunistycznych u pacjentów z zaburzoną odpowiedzią immunologiczną. Wywoływane przez nie fungemie związane są z wysoką śmiertelnością. Grzybice skóry i błon śluzowych Grzybice skóry i jej przydatków wywoływane są przez dermatofity, ale również grzyby drożdżopodobne oraz pleśnie. Dermatofity są grzybami mającymi zdolność atakowania zrogowaciałych tkanek gospodarza. Grzyby te dysponują zespołem enzymów keratynolitycznych, dzięki czemu penetrują te tkanki. Do dermatofitów należą trzy rodzaje: Trichophyton, Epidermophyton i Microsporum. Wykazują one podobieństwo morfologiczne, fizjologiczne oraz patogenne, a ich różnicowanie często oparte jest na klasyfikacji ekologicznej. Zakażenia wywoływane przez dermatofity (dermatofitozy) dotyczą skóry gładkiej, owłosionej oraz paznokci. Gatunkami najczęściej opisywanymi są T. rubrum i T. mentagrophytes. T. rubrum jest najczęstszym czynnikiem etiologicznym grzybicy stóp i paznokci. Rodzaj Trichophyton może wywoływać grzybice zlokalizowane w dowolnych miejscach skóry i na jej przydatkach. Grzybice stóp i paznokci a także pachwin i tułowia często wywoływane są przez Epidermophyton floccosum i spotykane są często w dużych skupiskach ludzi (akademiki, koszary, kąpieliska). Najczęściej opisywany gatunek Microsporum to M. canis. Atakuje on najczęściej skórę owłosioną, a do infekcji tych szczególnie predysponowane są dzieci. Pleśnice skóry są rzadziej opisywane i często towarzyszą one innym zakażeniom grzybiczym. Pleśnice paznokci stóp wywoływane są najczęściej przez Scopulariopsis brevicaulis. Grzybice wywoływane przez grzyby dotyczą skóry, paznokci a także błon śluzowych. Głównym czynnikiem etiologicznym tego rodzaju infekcji jest Candida albicans, ale również inne gatunki należące do tego rodzaju (C. tropicalis). Zmiany skórne pojawiają się najczęściej w miejscach wilgotnych jak pachwiny, pachy, fałdy skórne, krocze. Szczególnie narażone są osoby starsze, otyłe, obarczone dodatkowymi chorobami oraz pracujące w wilgoci. Drożdżakowe zakażenia błon śluzowych mogą rozwijać się w obrębie jamy ustnej, dalszych odcinków przewodu 169 pokarmowego, a także narządów płciowych. Czynnikami predysponującym są protezy zębowe, szerokowidmowa antybiotykoterapia, cukrzyca, ciąża. Infekcja pochwy u ciężarnej może doprowadzić do zakażenia wewnątrzmacicznego i kandydozy wrodzonej płodu. Do zakażenia tymi grzybami może dojść również w czasie porodu. Zmiany skórne mogą mieć również charakter wtórny, kiedy powstają na skutek rozsiewu grzybów drogą krwi w przebiegu grzybicy rozsianej (Aspergillus, Fusarium, Penicillium marneffei, Candida). Grzybice tkanki podskórnej Grzybice tkanki podskórnej spotykane są głównie w strefie tropikalnej i subtropikalnej. Grzyby wywołujące te schorzenia bytują w glebie i dostają się do organizmu przez uszkodzoną skórę. Początkowo powstaje niewielki guz, następnie obrzęk oraz przetoki, z których wypływa ropa zawierająca elementy grzyba. Choroba szerzy się na tkanki głębiej położone – powięzi, mięśnie a nawet kości. Przykładem jest sporotrichoza wywoływana przez Sporothtix schenkii. Grzybice układowe Grzybice układowe obejmują dwa typy schorzeń. Zakażenia patogenami układu oddechowego (histoplazmoza, blastomikoza). Wywoływane są one przez grzyby dimorficzne bytujące w glebie. Do zakażenia dochodzi przez wdychanie kurzu z zarodnikami grzybów. Obraz kliniczny jest wysoce zróżnicowany - od zakażeń bezobjawowych nie wymagających leczenia, przez objawy płucne przypominające gruźlicę aż do rozsianych zakażeń o wysokiej śmiertelności. Drugi typ to grzybice oportunistyczne (kandydoza, aspergiloza, zygomikoza, kryptokokoza), wywoływane przez grzyby o niewielkim potencjale chorobotwórczości, rozwijające się u pacjentów z upośledzoną odpornością immunologiczną. Najczęściej odnotowywane są kandydozy (przede wszystkim zakażenia C. albicans). Infekcje te mogą mieć charakter endogenny a źródłem jest głównie przewód pokarmowy. Stąd często rozpoczyna się zakażenie, które 170 następnie drogą krwi może objąć każdy narząd (nerki, wątrobę, serce, OUN). Aspergiloza najczęściej wywoływana jest przez A. fumigatus i A. flavus poprzez wdychanie ich zarodników. Dostają się one do płuc, ale również zatok, ośrodkowego układu nerwowego. W aspergilozie inwazyjnej może dojść do zajęcia większości narządów wewnętrznych. Zygomikoza (mukormikoza) wywoływana grzyby Mucor, Rhizopus, Absidia. Najczęściej dochodzi do zygomikozy układu oddechowego lub zygomikozy układu pokarmowego. Zygomikoza nosowo-mózgowa występuje najczęściej u pacjentów z cukrzycową kwasicą ketonową. Kryptokokoza wywoływana jest przez Cryptococcus neoformans – drożdże bytujące w odchodach kur i gołębi. Do zakażenia dochodzi drogą inhalacyjną i zakażenie najczęściej obejmuje płuca, w dalszej kolejności opony mózgowo-rdzeniowe i mózg, gdyż grzyb ten wykazuje silne powinowactwo do ośrodkowego układu nerwowego. Nadwrażliwość na antygeny grzybów Najczęściej opisywana jest alergia na zarodniki grzybów pleśniowych. Nadwrażliwość organizmu na antygeny grzybów może przybrać obraz kliniczny astmy oskrzelowej czy alergicznego nieżytu nosa i zatok. Również antygeny Candida czy Trichophyton mogą działać uczulająco, zmieniając przebieg toczącej się typowej dla nich infekcji grzybiczej. Mikotoksykozy Są to zatrucia mikotoksynami - wtórnymi metabolitami grzybów pleśniowych (Aspergillus, Penicillium) oraz tzw. czarnych grzybów. Nie towarzyszy im inwazja grzybów do organizmu człowieka. Do najważniejszych mikotoksyn należą aflatoksyny, ochratoksyna A. Mikotoksyny mogą znajdować się w produktach roślinnych (zielony groszek, kukurydza, orzeszki ziemne) a także mleku i mięsie zwierząt żywionych spleśniałą paszą. Ostre zatrucia najczęściej dotyczą zaburzeń funkcji wątroby, nerek oraz szpiku kostnego i mogą prowadzić nawet do śmierci. Mikotoksyny mogą również działać uczulająco, neurotoksycznie oraz karcynogennie i teratogenne. Długotrwałe spożywanie nawet małych 171 dawek mikotoksyn może prowadzić do zmian nowotworowych, głównie wątroby. Znaczenie grzybów dla człowieka Chorobotwórczość grzybów może dotyczyć również zwierząt i roślin. Patogeny te mogą powodować straty w rolnictwie i hodowli. Korzystne cechy grzybów zostały wykorzystane przez człowieka w biotechnologii żywności i medycyny. Zdolność prowadzenia wydajnej fermentacji alkoholowej przez Saccharomyces cerevisiae od wieków jest szeroko wykorzystywana w przemyśle piekarniczym i alkoholowym. Dzięki inżynierii genetycznej gatunek ten wykorzystywany jest również przy produkcji np. szczepionek. Aspergillus niger jest wykorzystywany jako producent kwasów organicznych. Wytwarzają kwas cytrynowy który stosowany również w przemyśle kosmetycznym. Liczne gatunki Penicillium są ważnymi producentami antybiotyków (np. P. griseofulvus jest producentem gryzeofulwiny; P. chrysogemum penicyliny G). Specjalne tzw. kultury grzybów wykorzystywane są w przemyśle mleczarskim. Identyfikacja grzybów chorobotwórczych W rozpoznawaniu grzybów nitkowatych istotnym elementem jest ocena mikroskopowa. Preparaty mogą być wykonywane z hodowli, lub z bezpośrednio pobranego materiału klinicznego. W przypadku materiału klinicznego wykonuje się tzw. preparat rozjaśniony, poddany działaniu KOH lub DMSO (dwumetylosulfotlenek), które rozpuszczają zanieczyszczenia m.in. złuszczony naskórek. Ocena mikroskopowa preparatów bezpośrednich bywa niewystarczająca i wtedy pomocne są mikrohodowle zakładane na szkiełkach podstawowych. Istotne znaczenie mają cechy morfologiczne hodowli grzybów nitkowatych takie jak wygląd grzybni, kształt, barwa, wielkość i wydzielany barwnik do podłoża, stopień puszystości. W przypadku grzybów drożdżopodobnych ocena makroskopowa hodowli i mikroskopowa ma znacznie mniejsze znaczenie. W identyfikacji wykorzystuje się różnicujące te grzyby cechy metaboliczne: zdolność 172 przyswajania węgla lub azotu z różnych źródeł. Dla zbadania tej cechy wykonuje się auksanogram. Na podłożu minimalnym nie zawierającym źródeł węgla lub azotu posiewa się badany szczep i umieszcza krążki nasączone związkami węglowodanowymi lub azotowymi. Wzrost wokół krążka świadczy o zdolności asymilacji węgla lub azotu z tego związku. Wykorzystuje się też zdolność grzybów drożdżopodobnych do fermentacji rożnych węglowodanów. Zestaw podłoży zawierających węglowodany i wskaźnik barwny stanowi zymogram pozwalający na ocenę tych zdolności. Zmiana barwy podłoża w wyniku zakwaszenia środowiska świadczy o fermentacji. W różnicowaniu dermatofitów wykorzystuje się preparat rozjaśniony i mikrohodowle. Zakłada się też hodowle na podłożach stałych. Dermatofity rosną wolno (do 6 tygodni), ale wygląd ich kolonii jest bardzo charakterystyczny. W różnicowaniu dermatofitów znaczenie ma również tzw. test perforacji włosa. Test polega na ocenie zdolności uszkadzania powierzchni włosa np. przez Trichophyton mentagrophytes. Różnicowanie grzybów dimorficznych opiera się także na cechach mikroskopowych oraz na hodowli i ocenie wyglądu makroskopowego grzybni. Zadania do wykonania Zadanie 1. Preparat w kropli spłaszczonej z hodowli drożdży -Umieść na szkiełku podstawowym kroplę wody. -Zawieś w tej kropli niewielką ilość drożdży pobranych ezą z hodowli na stałym podłożu Sabouraud. -Przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym. -Oglądaj preparat pod mikroskopem (powiększenie 200-400x). 173 Zadanie 2. Preparat w kropli spłaszczonej z hodowli grzybów nitkowatych -Z powierzchni hodowli na płynnym podłożu Sabouraud pobierz ezą grzybnię lub jej fragment i umieść w jałowej płytce Petriego. -Posługując się igłami preparacyjnymi delikatnie rozerwij grzybnię na małe fragmenty. -Przenieś kawałek grzybni na szkiełko podstawowe. -Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i oglądaj preparat pod mikroskopem (powiększenie 200-400x); staraj się odnaleźć fragmenty grzybni rozrodczej (konidiofory i konidia). Zadanie 3. Cechy morfologii grzybów Otrzymujesz hodowle na podłożu płynnym i stałym różnych grzybów. Przyporządkuj je do grup i wpisz do tabelki ich cechy. 174 Grzyby Hodowla na podłożu płynnym Hodowla na podłożu stałym Obraz Wywoływane mikroskopowy choroby/ wykorzystywanie przez człowieka Drożdże Nitkowate: Dermatofity 175 176 Rozdział 6 Podstawy wiedzy o antybiotykach i antybiotykoterapii Część teoretyczna Leki przeciwbakteryjne i ich stosowanie Leki przeciwbakteryjne to duża grupa antybiotyków (będących produktem naturalnym drobnoustrojów) i chemioterapeutyków (zsyntetyzowanych chemicznie). Najliczniejsze i najczęściej wykorzystywane w lecznictwie ich grupy to antybiotyki -laktamowe, aminoglikozydy, tetracykliny, makrolidy, fluorochinolony. Te preparaty, których znajomość jest niezbędna dla uczestnictwa w ćwiczeniach pokazano w tabeli. Leki przeciwbakteryjne stosowane są w monoterapii (leczenie jednym lekiem) lub w terapii skojarzonej (kilkoma lekami). Zaletami tej drugiej jest poszerzenie zakresu ich działania i wzmocnienie aktywności, jeśli skojarzone leki działają synergistycznie. Synergizm jest wzmożeniem działania leków, większym niż to, jakiego można się spodziewać jako sumy ich działań. Nie należy kojarzyć leków które charakteryzuje antagonizm – gdy ich mechanizm działania wzajemnie się znosi lub wyklucza. Zastosowanie terapii skojarzonej często zmniejsza potrzebne dawki, a tym samym toksyczność leków, a także w dużym stopniu zmniejsza niebezpieczeństwo selekcji szczepów o nabytej oporności. Leki przeciwdrobnoustrojowe wykazują różny zakres (spektrum) działania. Wynika to z ich zdolności do interferowania z określonymi elementami budowy lub metabolizmu, charakterystycznymi dla wielu lub tylko dla nielicznych bakterii. Stąd każdy gatunek bakterii charakteryzuje oporność naturalna na niektóre z tych leków, która jest genetycznie determinowana genami chromosomowymi. Jej mechanizm jest związany z występowaniem barier w przenikaniu antybiotyku przez 177 osłony bakterii, brakiem systemu aktywnego transportu lub nieobecnością struktur lub/i szlaków metabolicznych, będących celem działania tego antybiotyku. Grupa / klasa Nazwy antybiotykow Mechanizm działania penicylina G amoksycylina, ampicylina penicyliny cefalosporyny monobaktamy karbapenemy aminoglikozydy makrolidy tetracykliny fluorochinolony ko-amoksyklaw (amoksycylina + kwas klawulanowy) kloksacylina cefradyna, cefaklor (I)* cefuroksym (II)* ceftazydym (III)* ceftriakson (III*) aztreonam meropenem, imipenem gentamicyna tobramycyna netilmicyna amikacyna streptomycyna erytromycyna klaritromycyna azitromycyna tetracyklina doksycyklina ciprofloksacyna norfloksacyna hamowanie syntezy ściany komórkowej hamowanie syntezy białka hamowanie syntezy DNA *generacje grupy cefalosporyn Ta oporność decyduje o tym, czy antybiotyk lub chemioterapeutyk nazwiemy szerokowidmowym (działającym na wiele grup bakterii, w tym gramdodatnie i gramujemne) czy wąskowidmowym (działającym na wąską grupę, jak tylko na gramujemne pałeczki albo prątki). Spośród wymienionych tutaj, do ważnych terapeutycznie, szerokowidmowych 178 leków należą niektóre penicyliny półsyntetyczne (amoksycylina i ampicylina), cefalosporyny, tetracykliny i karbapenemy. Nieco węższe spektrum mają aminoglikozydy i makrolidy. Wąskowidmowe są penicyliny naturalne (penicylina G) i kloksacylina, a także monobaktamy. Obok oporności naturalnej, bakterie fenotypowo prezentują też oporność nabytą. Powstaje ona w wyniku pozyskania przez nie genów oporności na antybiotyki – poprzez transfer odpowiednich fragmentów DNA (np. na plazmidach) z komórek innych bakterii. Ponieważ nie sposób przewidzieć tych procesów, konieczne jest wykonywanie badań mikrobiologicznych określających działanie wytypowanych grup leków na szczep izolowany od pacjenta uznany za czynnik etiologiczny jego choroby. Wybierane są leki, które ze względu na naturalną wrażliwość tych bakterii powinny być skuteczne, ale oporność nabyta mogła zmienić ten stan rzeczy. Bada się wrażliwość wyizolowanych od pacjenta bakterii uzyskanych w postaci czystej hodowli. Najczęściej stosowanym sposobem określania zakresu (profilu) wrażliwości bakterii na antybiotyki in vitro jest metoda krążkowodyfuzyjna, zwana popularnie antybiogramem. W metodzie tej antybiotyk dyfunduje z krążka ułożonego na powierzchni posianego badanym szczepem agaru i hamuje jego wzrost. Wielkość strefy zahamowania jest wyznacznikiem wrażliwości. Metoda wymaga bardzo starannej standaryzacji, aby wyniki były porównywalne w obrębie danej pracowni i miedzy ośrodkami. Pełniejsze dane na temat poziomu wrażliwości badanych bakterii uzyskuje się ustalając in vitro stężenie antybiotyku, które zabija lub hamuje wzrost bakterii. Oznacza się najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii – MIC (ang. minimum inhibitory concentration) i/lub najmniejsze stężenie bakteriobójcze (zabijające 99,9% bakterii) – MBC (ang. minimum bactericidal concentration). Stężenie określa się w µg lub jednostkach leku na mL lub mg/L. Takie badania dają znacznie więcej informacji, które mogą przyczynić się do podjęcia właściwej terapii pacjenta. Oznaczenia te wykonuje się także przy ocenie nowych leków. Zazwyczaj testuje się wtedy wrażliwość wielu rodzajów izolowanych klinicznie drobnoustrojów, a wśród nich dużej grupy szczepów każdego z gatunków, określając 179 wartość MIC90. Wartość ta określa najmniejsze stężenie na które było wrażliwe 90% badanych szczepów. W badaniach antybiotykowrażliwości bakterii izolowanych z przypadków klinicznych w Polsce stosuje się procedury oparte o wytyczne Krajowego Ośrodka Referencyjnego d/s Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) oparte na danych z terenu Polski (np. dobór antybiotyków) zgodnych z określającą metodologię dla krajów europejskich normą EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptobility Testing). Metody Antybiogram Oznaczenie wykonuje się w ściśle standaryzowanych warunkach, używając atestowanych krążków bibułowych nasączonych antybiotykami pamiętając, że na wynik antybiogramu, obok wrażliwości bakterii, ma wpływ szereg czynników związanych z jego wykonaniem. Wykonanie: Zebrać 1-3 takich samych kolonii z płytki ze świeżą czystą hodowlą wcześniej zidentyfikowanego szczepu i przygotować zawiesinę w fizjologicznym roztworze NaCl o gęstości odpowiadającej wzorcowi nr 0,5 wg skali McFarlanda (tj. 1,5x 108 CFU/mL); posiać ją wacikiem na powierzchnię płytki z podłożem MuellerHintona; wybrać odpowiednie krążki z lekami (korzystając z instrukcji Ośrodka Referencyjnego) i ułożyć je na płytce, używając jałowej pęsety lub dyspensera (na płytce 90 mm nie więcej niż 5-6); płytki umieścić w ciągu 15 minut w cieplarce 37°C i inkubować przez 20 godzin; zmierzyć przezroczystą linijką strefy zahamowania wzrostu wokół krążków (mm); mierzy się poprzez krążek od jednej do drugiej krawędzi koła tej strefy; 180 sprawdzić w tabeli stopień wrażliwości, korzystając z odpowiednich tabel. 181 Oznaczanie MIC i MBC metodą rozcieńczeniową Oznaczenie to można przeprowadzić na podłożu płynnym lub stałym. Ta pierwsza metoda ma szersze zastosowanie i została tu opisana. Oznaczenie MIC. Przygotowuje się stanowiącą inokulum zawiesinę badanego szczepu bakterii w roztworze fizjologicznym NaCl o gęstości odpowiadającej nr 0,5 wg skali McFarlanda tj. 1,5x 108 CFU/mL i rozcieńcza się ją w pożywce 10-cio krotnie. Wykonanie: Przygotować szereg kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń antybiotyku w pożywce płynnej, ostatnia probówka szeregu stanowi kontrolę wzrostu i nie zawiera antybiotyku. Dodać 50 μl wcześniej przygotowanego inokulum bakterii do probówek z kolejnymi rozcieńczeniami antybiotyku i probówki kontrolnej (bez antybiotyku). Inkubować w cieplarce 37°C 20 godzin. Po tym czasie ocenić makroskopowo wzrost. Stężenie antybiotyku w ostatniej probówce w szeregu, w której brak jest wzrostu bakterii, określa wartość MIC. Oznaczenie MBC jest kontynuacją oznaczenia MIC. Po jego odczytaniu z probówek, w których brak widocznego wzrostu oraz probówki kontrolnej odsiewa się standaryzowaną ezą próbki punktowo na pożywkę stałą, odpowiednią dla badanych bakterii (np. podłoże MacConkeya dla pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae). Po inkubacji ocenia się wzrost na płytkach. Wzrost będzie niewidoczny tylko przy subkulturze z probówki z takim rozcieńczeniem antybiotyku, które jest bójcze dla tych bakterii. Jest ono wartością MBC. Oznaczenie MIC metodą E-testu E-test jest paskiem nasączonym antybiotykiem. W pasku tym utworzono gradient stężeń; ich wartości opisane są liczbowo na jego powierzchni (wartości MIC). Paski układa się na odpowiednim podłożu zasianym standaryzowaną zawiesiną badanego szczepu podobnie, jak krążki w antybiogramie. Podczas inkubacji w cieplarce (37°C 20 godzin) antybiotyk, dyfundując z paska do podłoża, spowoduje zahamowanie 182 wzrostu bakterii. Strefa zahamowania wzrostu maleje wraz ze zmniejszaniem się stężenia antybiotyku. Wartość najmniejszego stężenia hamującego – MIC wskazuje dotykająca paska krawędź strefy zahamowania. Zadania do wykonania Zadanie 1. Oznaczanie MIC i MBC antybiotyków Odczytaj wynik gotowego oznaczenia MIC, wykonanego wcześniej metodą rozcieńczeń w pożywce płynnej. - Zaznacz w poniższej tabeli, w których probówkach obserwujesz wzrost. - Czy wynik kontroli jest prawidłowy? - Wpisz w tabeli jakie było stężenie antybiotyków w kolejnych probówkach - Oblicz MIC gentamicyny i tetracykliny dla badanego szczepu E. coli. - Z probówek, w których brak widocznego wzrostu i probówki kontrolnej pobierz po 1 oczku ezy i posiej pasmowo na oznaczone sektory płytki z podłożem MacConkeya. - Inkubuj w cieplarce 37°C przez ok. 20 godzin. - Oblicz wartość MBC i zinterpretuj wynik. Nr probówki 1 2 3 4 5 Wzrost szczepu badanego Stężenie gentamicyny (μg/mL) MIC gentamicyny dla tego szczepu = MBC = Wzrost szczepu badanego Stężenie tetracykliny (μg/mL) MIC tetracykliny dla tego szczepu = MBC = 6 7 8 9 kontrola 183 Zadanie 2. Odczytanie i interpretacja antybiogramów demonstracyjnych. Ocena spektrum działania antybiotyków Przygotowano antybiogramy dla szczepów wzorcowych czyli takich które wykazują naturalną wrażliwość i nie zawierają genów oporności nabytej. - Zmierz średnice stref zahamowania wzrostu tych szczepów wokół ułożonych na płytce krążków. - Oceń działanie badanych antybiotyków względem naturalnie wrażliwych/opornych szczepów. Zapisz w tabeli: Antybiotyk S. aureus (strefa mm) E. coli (strefa mm) Wrażliwość tabeli wg 184 Antybiogramy wykonane dla szczepów wzorcowych pozwalają ocenić spektrum antybiotyków. Wąskowidmowe antybiotyki to: Szerokowidmowe antybiotyki to: Do badania wrażliwości gronkowców nie należało używać krążków z: gdyż bakterie te naturalnie są na nie oporne. Leczenie tymi antybiotykami zawsze będzie nieskuteczne. 185 Do badania wrażliwości pałeczki okrężnicy nie należy używać krążków z: gdyż bakterie te naturalnie są na nie oporne. Leczenie tymi antybiotykami zawsze będzie nieskuteczne. Zadanie 3. Wykonanie antybiogramu krążkowego dla bakterii wyhodowanych od chorego - Otrzymujesz czystą hodowlę bakterii na płytce. - Pobierz wacikiem materiał z kilku kolonii i przygotuj zawiesinę o właściwej gęstości. - Posiej bakterie na płytkę. - Ułóż przy pomocy pęsety krążki antybiotykowe odpowiednie dla badanego rodzaju bakterii dobrane wg zaleceń KORLD. - Po inkubacji w cieplarce odczytaj i zapisz wynik antybiogramu. Antybiotyk Strefa zahamowania Wrażliwość wg tabeli wzrostu 186 Zadanie 4. Działanie antybiotyków Wpisz w tabelę antybiotyki zastosowane w zadaniu 2 i 3. Zaklasyfikuj je do grup i podaj mechanizm i spektrum działania. Antybiotyk Grupa Mechanizm działania Spektrum antybiotyku 187
