MARKERY DNA
advertisement
MIKROSATELITY Stanowią 3% ludzkiego genomu – to dużo, czy mało? Występują stosunkowo rzadko w regionach kodujących białka. Tylko trój- i sześcionukleotydy występują częściej w egzonach - wynika to z negatywnej selekcji skierowane przeciwko przesunięciom ramki odczytu. - u ludzi powtórzenia trójnukleotydów powodują czasami choroby (np. choroba Huntingtona) najprawdopodobniej związane z obecnością długich ciągów tej samej reszty aminokwasowej w białku U wielu gatunków większość mikrosatelitów to dwunukleotydy (48-67%) - u pierwotniaków występują głównie ciągi mononukleotydowe - u ludzi najwięcej jest ciągów mononukleotydowych , ąle łącznie najliczniejsze są dwu-, cztero- i sześcionukleotydy - ciągi dwunukleotydowe występują w 5’ lub 3’ częściach genów, które nie ulegają transkrypcji 14% wszystkich białek zawiera sekwencje powtórzone, jest ich trzy razy więcej u organizmów eukariotycznych w porównaniu do prokariotycznych Wzory dystrybucji różnych typów mikrosatelitów (posiadających różną długość i różne motywy) w sekwencjach kodujących i niekodujących są filogenetycznie uwarunkowane. - mikrosatelitów jest więcej i są dłuższe u kręgowców niż u bezkręgowców. Lokalizacja sekwencji mikrosatelitarnych na chromosomach genomu człowieka Egzony Introny Regiony międzygenowe Odmienność chromosomów 19 i Y Najczęściej występujące mikrosatelity: A, AT, AC, AAT, AAC, AAG, AGC, AAAC, AAAT, AAAG, AAGG, AGAT Najrzadziej występujące mikrosatelity: C, CG, ACT, ACG, AACC, AACG, AACT, AAGC, AAGT, ACCC, ACCG, ACCT, CCCG, CCGG Pętle ułatwiające rozplatanie Lub rozpoznawane przez białka „hot spots”, dinukleotydy rozpoznawane przez enzymy Zatrzymanie replikacji, Gen CHK1i Mikrosatelity występują w genach enzymów tego systemu i są podatne na mutacje Struktury tworzone przez mikrosatelitarne trimery ułatwiające ich ekspansję w chorobach neurologicznych Zespół łamliwego chromosomu X Dystrofia miotoniczna Choroba Huntingtona Nić o sekwencji (GCC)n łatwo tworzy strukturę spinki do włosów Spinka może wydłużać się (SLIP) lub przesuwać się (SLIDE) Konsekwencje: 1. Ekspansja lub skracanie 2. Metylacja prowadząca do obniżenia lub zahamowania ekspresji genu FMR1 Mikrosatelita AATGG ludzkich centromerów (AATGG)32 – struktura lewoskrętnej helisy złożona z upakowanych motywów (AATGG)4 (AATGG)4 – podwójnie zgięta spinka G G T A A A A T G G G A A G T T G A G A Na 3’ końcach telomerów znajdują się jednoniciowe fragmenty, w których 30 do 100 razy jest powtórzony motyw TTAGGG tworzący kwartety G Rozpoznawane przez białka stabilizujące Rozróżnienie alleli zawierających różną liczbę powtórzeń sekwencji mikrosatelitarnych za pomocą reakcji PCR Główne obszary zastosowań polimorfizmów STR: • • • Ustalanie pokrewieństwa; Identyfikacja osób; Ustalanie pochodzenia śladów biologicznych (wykrywanie sprawców przestępstw); Zalety stosowania polimorfizmów STR: • • • • Mniej pracochłonna i mniej kosztowna technika; Krótszy czas oczekiwania na wynik; Mniejsza ilość DNA potrzebna do analizy; DNA może być gorszej jakości (możliwość użycia próbek DNA otrzymanych ze starego i zniszczonego materiału biologicznego a nawet z niezbyt starych próbek archeologicznych. Ewolucja analiz STR typu multiplex na przykładzie firmy zestawu PowerPlex™ firmy Genscript Promega® GenePrint® Ewolucja analiz STR typu multiplex na przykładzie firmy zestawu PowerPlex™ firmy Genscript Promega® PowerPlex® 1.2 System Ewolucja analiz STR typu multiplex na przykładzie firmy zestawu PowerPlex™ firmy Genscript Promega® PowerPlex® 2.1 System Ewolucja analiz STR typu multiplex na przykładzie firmy zestawu PowerPlex™ firmy Genscript Promega® PowerPlex® 16 Identyfikacja sprawcy gwałtu KP M P Podejrzani KP M P Podejrzani Podejrzani P M CSF1P0 F13A01 TPOX TH01 FESFPS vWA CODIS – działa w ramach FBI, umożliwia federalnym, stanowym i lokalnym laboratoriom medycyny sądowej elektroniczną wymianę i porównywanie profili DNA. • • • • • • Several Indexes Categorize the Profiles Entered into CODIS Convicted Offender contains profiles of individuals convicted of a crime Forensic contains DNA profiles developed from crime scene evidence such as semen stain or blood. Arrestees contains profiles of arrested persons (if state law permits the collection of arrestee samples). Missing Persons contains DNA reference profiles from missing persons. Unidentified Human Remains contains DNA profiles developed from unidentified human remains. Biological Relatives of Missing Persons contains DNA profiles voluntarily contributed from relatives of missing persons. Collected samples of: • Nuclear DNA mostly STR - 13 locus STR : CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11 • Mitochondrial DNA Mostly SNPs. Measuring Success The National DNA Index (NDIS) contains over 8,080,941 offender profiles and 311,560 forensic profiles as of March 2010. Ultimately, the success of the CODIS program will be measured by the crimes it helps to solve. CODIS's primary metric, the "Investigation Aided," tracks the number of criminal investigations where CODIS has added value to the investigative process. As of March 2010, CODIS has produced over 114,300 hits assisting in more than 112,300 investigations. Identyfikacja szczątków rodziny Romanowów Nowotwory oraz choroby genetyczne związane z mikrosatelitami 15% sporadycznych przypadków raka jelita grubego koreluje z niestabilnością powtórzeń mikrosatelitarnych Niestabilność mikrosatelitów przyczynia się również do wystąpienia nowotworów przewodu pokarmowego 14 typów zaburzeń neurologicznych wiąże się z ekspansją mikrosatelitów w sekwencjach kodujących lub niekodujących Ekspansja trójnukleotydu CTG powoduje dystrofię mięśniową, chorzy mają powyżej 50 kopii tego motywu Ekspansja trójnukleotydu CAG powoduje powstawanie białek z ciągami poliglutaminowymi – choroba Huntingtona oraz Machado Josepha Długość ciągu powtórzeń (CA)n w 5’ regionie niekodującym reduktazy aldozowej jest związana z retinopatią cukrzycową Długość (CA)n w pierwszym intronie genu γ- interferonu jest związana z występowaniem zwłóknienia płuc BPES, blepharophimosis, ptosis and epicanthus inversus CCD, cleidocranial dysplasia CCHS, congenital central hypoventilation syndrome DM, myotonic dystrophy DRPLA, dentatorubral–pallidoluysian atrophy EPM1, progressive myoclonic epilepsy 1 FRAXA, fragile X syndrome FRAXE, fragile X mental retardation associated with FRAXE site FRDA, Friedreich's ataxia FXTAS, fragile X tremor and ataxia syndrome HD, Huntington's disease HDL2, Huntington's-disease-like 2 HFG, hand–foot–genital syndrome HPE5, holoprosencephaly 5 ISSX, X-linked infantile spasm syndrome MRGH, mental retardation with isolated growth hormone deficiency OPMD, oculopharyngeal muscular dystrophy SBMA, spinal and bulbar muscular atrophy SCA, spinocerebellar ataxia SPD, synpolydactyly. Dystrofia miotoniczna - CTG • • • • • • • Obejmuje wiele układów, głównie wpływa na mięśnie Miotonia – mięśnie mogą się kurczyć, ale trudno je rozluźnić (trudności z otworzeniem zaciśniętej dłoni) - osłabienie mięśni (twarz, szyja,kończyny) Dotyka 1 na 20 000 osób Zaburzenie autosomalne dominujące Penetracja - wysoka Ekspresyjność – różnorodna nawet w obrębie rodziny Antycypacja – skłonność do przybierania coraz poważniejszego przebiegu w kolejnych pokoleniach Podłoże molekularne • Gen warunkujący (1992) – na 19 chromosomie - kinaza DM – ekspresja w mózgu, mięśniach, sercu i jądrach (narządy i tkanki uszkodzone) - domeny specyficzne dla kinaz białkowych, które fosforylują reszty serynowe i treoninowe - mutacja w pobliżu 3’ końca genu – ulega transkrypcji, ale nie translacji - prawdopodobna przyczyna fenotypu – obniżenie ekspresji enzymu Region kodujący CTG…CTG Transkrypcja Translacja CTG…CTG – najczęściej 5 – 27 powtórzeń - osoby chore 50 lub więcej Wzrost liczby powtórzeń niestabilność regionu dalszy wzrost antycypacja – cięższy przebieg choroby z wcześniejszymi objawami w kolejnych pokoleniach Wystąpienie antycypacji zależy od tego, od którego z rodziców dziedziczony jest wadliwy allel. Antycypacja DM następuje w dziedziczeniu mutacji od matki. Poważna dziecięca postać dystrofii miotonicznej – objawy rozpoczynają się w momencie narodzin – u 20% potomstwa chorej matki, które odziedziczyło mutację, prawdopodobieństwo rośnie wraz z nasileniem objawów u matki W dziedziczeniu od ojca – kontrakcja DIAGNOSTYKA Hybrydyzacja typu Southern PCR Choroba Huntingtona • Opisana w 1872 przez Huntingtona – pląsawica – niekontrolowane ruchy, gr. chorea • Występuje u 1 na 100 tys. osób • Pojawia się między 35 a 50 rokiem życia • Choroba ośrodkowego układu nerwowego, zwyrodnienie neuronów • Niszczy obszary mózgu odpowiedzialne za koordynacje ruchów, życie emocjonalne, funkcje intelektualne (myślenie, percepcja, pamięć) • Objawy – niewytłumaczalne zmiany nastroju: rozdrażnienie – apatia, złość – depresja - trudności w uczeniu się, przypominaniu niekontrolowane ruchy stóp, palców, twarzy - trudności z utrzymaniem równowagi i chodzeniem Z czasem objawy pogłębiają się, choroba trwa 10 – 30 lat Antycypacja w dziedziczeniu od ojca – niestabilność (CAG)n w spermatogenezie. Podłoże molekularne • 1993 – gen na chromosomie 4 - HD lub IT-15 • Mutacja – ekspansja powtórzenia CAG w eksonie 1: - Normalne allele – ≤ 26 CAG - nie powodują HD i nie wykazują ekspansji CAG u potomstwa - Normalne allele z tendencją do mutacji – 27 – 35 CAG (1.9% populacji) Nie powodują choroby u nosiciela, ale wykazują ekspansję CAG u potomstwa. Ryzyko ekspansji jest większe jeśli nosicielem jest mężczyzna. - Allele powodujące chorobę - ≥ 36 CAG – powodują HD, zwłaszcza ≥ 40. ≥ 55 – postać młodzieńcza • • • • Jedna z 9 chorób neurodegeneracyjnych spowodowanych przez powtórzenia CAG – każda z tych chorób związana z innym genem Ciągi CAG w genie – bloki poliglutaminowe w białku (ang. huntingtin) Formy białka z długimi blokami polyQ nie ulegają poprawnemu zwinięciu i tworzą wysokocząsteczkowe agregaty Choroba Huntingtona jest chorobą konformacyjną (ch. Alzheimera i Parkinsona, ch. prionowe) CAG x N 1 40 kopii 35 kopii 26 kopii 2 3 4 5 Polimorfizmy punktowe SNP (ang. single nucleotide polymorphism) 1.2%, które czyni człowieka i 0.1%, które czyni różnicę 1.2% 0.1% • • • • • • • • • 3 miliony SNP odróżnia dwie osoby, SNP co 1200 pz przypuszcza się, że w genomie człowieka jest 10 000 000 SNP, w 2005 roku w publicznych bazach danych było ich 9 000 000. 75% - obszary międzygenowe, 24% - introny, 1% - eksony Źródła SNP – delecje, insercje, duplikacje, substytucje SNP ma mniej możliwości wariantów niż markery mini- i mikrosatelitarne Substytucja – teoretycznie 4 warianty w jednym locus, praktycznie – 2 Różna częstość wariantów – niska heterozygotyczność W celach identyfikacyjnych należy oznaczyć nawet do 100 loci Zalety SNP – olbrzymia liczba, metody detekcji nie wymagające elektroforezy w żelu i łatwe w automatyzacji • Istnieją bazy danych SNP: HGBASE, dbSNP, SNP Consortium • SNP Consortium – powstało w 1999 roku aby stworzyć i udostępnić katalog 300 000 SNP, w 2001 dysponowało już 1 000 000 SNP • Celem działania baz danych SNP jest stworzenie mapy SNP w ludzkim genomie (high-density SNP map) w celu identyfikacji mutacji powodujących choroby, związanych z długością życia Mitochondrialne SNP i starzenie Farmakogenetyka (ang. Pharmacogenetics) – bada genetyczne podstawy indywidualnych różnic w odpowiedzi na leki, jej celem jest opracowanie leków dopasowanych do genotypu pacjenta 1959 – Vogel proponuje termin „farmakogenetyka” 1962 – pierwsza książka „Pharmacogenetics”Heredity and the Response to Drugs” Famakogenetyka a Farmakogenomika • Dziedziczność różnic w odpowiedzi pacjentów na lek i struktura populacji • Jeden lek – wiele genomów (pacjentów) • Badanie SNP i poziomu ekspresji • Studiuje genom różnice pomiędzy komórkami różnych tkanek • Jeden genom – wiele leków • Profile ekspresji genów Farmakokinetyka • Metabolizm leków – ich degradacja, aktywacja za pomocą enzymów • Wyróżniamy 2 fazy metabolizmu leków: I faza – reakcje funkcjonalizacji, np: hydroksylacja przez CYP450 II faza – reakcje sprzęgania, np: acetylacja przez NAT Bönicke i Reif – polimorfizm acetylacji izoniazydu (leku tuberkulostatycznego) izoniazyd objawy neuropatii wśród chorych leczonych lekiem tuberkulostatycznym - polimorfizm acetylacji przez N-acetylotransferazę NAT2 - w populacji kaukaskiej 40-60% ma fenotyp „wolno metabolizujący”, w populacji Japońskiej 10% Wolni acetylatorzy w populacjach kaukaskiej i orientalnej Populacja kaukaska • Włosi • Szwedzi • Ludność biała USA • Brytyjczycy • Norwegowie • Niemcy • Francuzi • Kanadyjczycy • Czesi i Słowacy • Finowie • Polacy % 49 51-58 52-57 53-62 56 57 59 59-70 60 61-64 48-62 Populacja orientalna • Eskimosi • Koreańczycy • Japończycy • Ajnowie • Chińczycy • Ludność Riukiu • Tajowie • Chińczycy z Singapuru • Chińczycy z Tajwanu • Filipińczycy • Chińczycy z Tajlandii % 5 11 7-12 13 13 15 18 22 22 28 34 Kalow – polimorfizm hydrolizy prokainy (anastetyk) i sukcynylocholiny (zwiotczanie mięśni) sukcynylocholina przedłużenie z kilku minut do 3 godzin blokady nerwowo-mięśniowej Przyczyna: polimorfizm hydrolizy Winna: pseudoesteraza cholinowa
