Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Karoliny Skorek Funkcja

Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Karoliny Skorek
Funkcja dwuskładnikowego systemu transdukcji sygnału EnvZ/OmpR w kontroli
ruchliwości oraz modulowaniu wirulencji Yersinia enterocolitica
Promotor rozprawy:
dr hab. Katarzyna Brzostek, prof. UW
Promotor pomocniczy:
dr Adrianna Raczkowska
Recenzenci:
prof. dr hab. Andrzej Gamian (Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Hirszfelda
PAN, Wrocław; Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Wydział Lekarski, Uniwersytet
Medyczny im. Piastów Śląskich, Wrocław)
prof. dr hab. Adam Jaworski (Społeczna Akademia Nauk, Wydział Nauk o Zdrowiu, Łódź)
Praca doktorska wykonana w Instytucie Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet
Warszawski.
Y. enterocolitica jest ludzkim enteropatogenem, czynnikiem etiologicznymi jersiniozy
– odzwierzęcej choroby zakaźnej, która może przybierać różne postaci kliniczne: jelitowe,
pseudowyrostkowe, posocznicowe, rumieniowe i stawowe. Jersinioza jest trzecią,
po kampylobakteriozie i salmonellozie, zoonozą pod względem częstości występowania
w Europie. Y. enterocolitica syntetyzuje wiele czynników wirulencji istotnych na różnych
etapach procesu patogenezy. Do czynników wirulencji aktywnych na wczesnych stadiach
infekcji należą białka błony zewnętrznej, z których najważniejsze to kodowana
chromosomowo: inwazyna Inv i adhezyna Ail oraz kodowana w plazmidzie wirulencji pYV
adhezyna YadA. Do pełnej zjadliwości patogenu wymagana jest ponadto aktywność systemu
sekrecji III typu Ysc-Yop, który umożliwia pałeczkom Y. enterocolitica wprowadzenie
do wnętrza komórek eukariotycznych toksycznych białek Yop. Ważną cechą Y. enterocolitica
jest również zdolność syntezy rzęsek, które służą do poruszania się w środowisku co ułatwia
rozprzestrzenianie i zasiedlanie nowych nisz ekologicznych.
Y. enterocolitica jest zdolna do kolonizacji różnych nisz ekologicznych, na zewnątrz jak
i wewnątrz organizmu gospodarza. Proces adaptacji bakterii do zmieniających się
parametrów fizykochemicznych środowiska możliwy jest dzięki funkcjonowaniu
różnorodnych mechanizmów regulacyjnych. Dostosowują one metabolizm bakterii, a także
regulują ekspresję czynników wirulencji co jest kluczowe dla przebiegu procesu patogenezy
i niezbędne dla uniknięcia odpowiedzi ze strony układu immunologicznego gospodarza
oraz kolonizacji organizmu. W efektywnym odbiorze i przekazywaniu sygnałów do wnętrza
komórki bakteryjnej uczestniczą dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału (TCSs,
ang. Two Component Systems), w tym szlak sygnałowy EnvZ/OmpR. W systemie tym
transbłonowe białko EnvZ pełni funkcję kinazy sensorowej, która odbierając bodziec
ze środowiska podlega autofosforylacji, a następnie grupa fosforanowa przenoszona jest
na regulator odpowiedzi, białko OmpR, które ufosforylowane (OmpR-P) wiąże się z DNA
i w sposób pozytywny lub negatywny reguluje transkrypcję docelowych genów. Wyniki
dotychczasowych badań sugerowały, że system EnvZ/OmpR u Y. enterocolitica, może pełnić
różnorodne i często odmienne funkcje od tych opisanych dla niepatogennej Escherichia coli
K-12 czy innych enteropatogenów.
Celem rozprawy doktorskiej było zbadanie udziału szlaku sygnałowego EnvZ/OmpR
w regulacji właściwości wirulentnych oraz zdolności adaptacyjnych Y. enterocolitica O:9.
Przeprowadzone analizy dotyczyły w szczególności: określenia roli białka OmpR w kontroli
ruchliwości Y. enterocolitica; zbadania zależności między aktywnością dwuskładnikowego
systemu EnvZ/OmpR, a zdolnością Y. enterocolitica do adhezji/inwazji oraz tworzenia
biofilmu; scharakteryzowania roli OmpR w regulacji wrażliwości komórek na bakteriobójcze
działanie surowicy ludzkiej (cytolityczne działanie układu dopełniacza).
W pierwszej części pracy analizowano rolę białka OmpR w kontroli ruchliwości
Y. enterocolitica. Eksperymenty wykonane z zastosowaniem metod genetycznych,
biochemicznych i fizjologicznych, w tym analizy ekspresji wybranych genów regulonu
rzęskowego z wykorzystaniem fuzji reporterowych oraz badania opóźnienia tempa migracji
kompleksów nukleoproteinowych przeprowadzone z oczyszczonym białkiem OmpR w fuzji
translacyjnej z domeną polihistydynową, wykazały, że OmpR w postaci ufosforylowanej jest
pozytywnym regulatorem ekspresji operonu flhDC, kodującego nadrzędny aktywator genów
regulonu rzęskowego. Ponadto udowodniono, że donorem reszt fosforanowych w procesie
fosforylacji regulatora OmpR może być, obok partnerskiej kinazy EnvZ, niskocząsteczkowy
acetylofosforan.
W kolejnym etapie prac badano wpływ systemu EnvZ/OmpR na procesy adhezji
i inwazji komórek eukariotycznych oraz tworzenie biofilmu. Hipoteza badawcza zakładała,
że OmpR-zależna regulacja ruchliwości oraz stwierdzona wcześniej negatywna regulacja
ekspresji inwazyny, a być może także inne pozostające pod kontrolą OmpR czynniki, mogą
mieć wpływ na oddziaływania komórek Y. enterocolitica z komórkami eukariotycznymi. Prace
na liniach komórkowych HEp-2 dowiodły znaczenia zdolności ruchu Y. enterocolitica
w ustaleniu kontaktu z komórką eukariotyczną, co może mieć niebagatelne znaczenie in vivo
podczas pierwszych etapów procesu patogenezy. Wyniki potwierdziły także, że inwazyna jest
czynnikiem odpowiedzialnym za inwazję komórek eukariotycznych oraz pozwoliły
na wysnucie hipotezy o roli niezidentyfikowanych dotąd OmpR-zależnych białek w procesie
adhezji. Ponadto, jakościowe i ilościowe analizy obrazu ze skaningowego mikroskopu
konfokalnego udokumentowały znaczenie EnvZ/OmpR w procesie tworzenia biofilmu.
Celem kolejnej części prezentowanej rozprawy doktorskiej było poznanie roli białka
OmpR w modulowaniu wrażliwości komórek Y. enterocolitica na bakteriobójcze działanie
surowicy ludzkiej (NHS, ang. Normal Human Serum). W celu wyjaśnienia tej kwestii
przeprowadzono kompleksowe badania, które polegały na: (i) analizie profilu białek błony
zewnętrznej metodą SDS-PAGE i Western blot oraz badaniu aktywności promotorów
wytypowanych genów w fuzji transkrypcyjnej z genem reporterowym, w celu ustalenia roli
OmpR w regulacji ekspresji białek błony zewnętrznej: YadA, Ail, OmpX, OmpC;
(ii) zastosowaniu mutantów Y. enterocolitica pozbawionych białek OmpR, YadA, Ail, OmpX,
OmpC, a także FlhDC (pozytywny regulator biogenezy rzęski), wraz z układami
eksperymentalnymi do badania efektu komplementacji, supresji mutacji, a także
nadekspresji OmpR, w celu określenia udziału analizowanych białek w oporności komórek
na NHS; (iii) izolacji oraz identyfikacji lipopolisacharydu (LPS) w celu ustalenia korelacji
między zawartością LPS w błonie zewnętrznej a aktywnością OmpR i FlhDC. Przeprowadzone
badania wykazały, że OmpR kontrolując poziom/aktywność białek błony zewnętrznej (YadA,
Ail, OmpC) moduluje wrażliwość Y. enterocolitica na bakteriobójcze działanie surowicy.
Wyniki przedstawione w pracy dowiodły też, że OmpR-zależne zmiany w składzie i strukturze
błony zewnętrznej warunkowane syntezą FlhDC oraz LPS mogą determinować wrażliwość
Y. enterocolitica na NHS.
Podsumowując, wyniki prezentowane w rozprawie doktorskiej znacząco rozszerzyły
wiedzę o roli szlaku sygnałowego EnvZ/OmpR w fizjologii Y. enterocolitica i dostarczyły
dowodów wskazujących na udział EnvZ/OmpR w regulacji właściwości wirulentnych
i zdolności adaptacyjnych patogenu.
W skład rozprawy doktorskiej wchodzą następujące publikacje:
1. Raczkowska A., Skorek K., Bielecki J., Brzostek K. (2011a) OmpR controls Yersinia
enterocolitica motility by positive regulation of flhDC expression. Antonie Van
Leeuwenhoek 99: 381-94.
2. Raczkowska A., Skorek K., Brzóstkowska M., Łasińska A., Brzostek K. (2011b)
Pleiotropic effects of a Yersinia enterocolitica ompR mutation on adherent-invasive
abilities and biofilm formation. FEMS Microbiol Lett 321: 43-49.
3. Brzostek K., Skorek K., Raczkowska A. (2012) OmpR, a central integrator of several
cellular responses in Yersinia enterocolitica. Adv Exp Med Biol 954: 325-34.
4. Skorek K., Raczkowska A., Dudek B., Miętka K., Guz-Regner K., Pawlak A., Klausa E.,
Bugla-Płoskońska G., Brzostek K. (2013) Regulatory protein OmpR influences
the serum resistance of Yersinia enterocolitica O:9 by modifying the structure
of the outer membrane. PLoS One 19;8: e79525.