kwas cytrynowy
advertisement
Kwas cytrynowy Kwas cytrynowy (2-hydroksyl,2,3-propanotrikarboksylowy) o Mcz=192 i temperaturze topnienia 153°C po raz pierwszy zostal wyizolowany z soku cytryn. Wystepuje w postaci bezwodnej lub jedno wodnej. Jednowodna forma kwasu cytrynowego otrzymywana jest przez krystalizacje w temperaturze ponizej 36,6°C, powyzej tej temperatury powstaje forma bezwodna. Kwas cytrynowy jest mocnym kwasem organicznym, o czym decyduja stale dysocjacji wynoszace w 18°C odpowiednio, K1=8,7x10-4, K2=1,77xl0-5,K3=1,0xl0-7. Rozpuszczalnosc w wodzie w temperaturze 20°C wynosi 73,3 g/100 cm3, w alkoholu w temperaturze 15°C 75,91 g/100 cm3. Kwas cytrynowy otrzymywany jest wylacznie na drodze biologicznej z substratów naturalnych odtwarzalnych (pochodzenia roslinnego), co miedzy innymi decyduje o oplacalnosci produkcji. Swiatowa produkcja kwasu cytrynowego przekracza 300 000 ton rocznie, jej rozmiary podyktowane sa duzym zapotrzebowaniem na ten kwas, glównie, bo az w 80%, przez przemysl spozywczy, lecz takze farmaceutyczny, chemiczny i metalurgiczny. Szerokie wykorzystanie kwasu cytrynowego w przemysle spozywczym wynika z jego dzialania konserwujacego na skutek obnizania wartosci pH srodowiska. Jest jednoczesnie zwiazkiem nietoksycznym, o dobrych cechach smakowych i zapachowych. Glównie z tych wzgledów kwas cytrynowy zostal dopuszczony przez FAO/WHO bez ograniczen do produkcji zywnosci. Kwas ten stosowany jest w przemysle owocowowarzywnym jako inaktywator enzymów (oksydaz), które odpowiedzialne sa za utlenianie zwiazków fenolowych, powodujacych ciemnienie owoców i warzyw. Wykorzystywany jest równiez do produkcji napojów, slodyczy, owoców kandyzowanych, a takze w produkcji win, jako preparat zakwaszajacy i stabilizujacy. Tworzenie przez kwas cytrynowy kompleksowych polaczen z jonami metali (Fe,Cu, Zn) zadecydowalo o jego szerokim zastosowaniu jako stabilizatora (antyoksydanta) olejów. Poprzez wiazanie metali katalizujacych proces jelczenia tluszczów, kwas cytrynowy przerywa reakcje tworzenia nadtlenków i innych produktów powstalych w wyniku utleniania nienasyconych kwasów tluszczowych w procesie autooksydacji olejów. Wlasciwosci tworzenia kompleksów z metalami ciezkimi wyznaczylo szeroki obszar wykorzystania kwasu cytrynowego do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem powlokami ochronnymi. W przemysle farmaceutycznym stosowany jest jako dodatek do tabletek, powodujac musujacy efekt podczas ich rozpuszczania w wodzie. Ponadto cytrynian trisodowy i tripotasowy uzywany jest w Stacjach Krwiodawstwa jako preparat zapobiegajacy krzepnieciu krwi. W technologiach chemicznych kwas cytrynowy, a zwlaszcza jego sole (np.cytrynian trisodowy), znalazly szerokie wykorzystanie w chemii gospodarczej wypierajac trudno biodegradowane fosforany ze skladu detergentów. Estry kwasu cytrynowego i alkoholi alifatycznych, np. ester trietylowy, tributylowy, znalazly zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w masach plastycznych, z których wytwarza sie cienkie powloki (filmy) ochraniajace zywnosc. Wodne 24% roztwory kwasu cytrynowego stosowane sa w mleczarstwie do usuwania z aparatury tzw. kamienia mlecznego, tj. osadu utworzonego z bialka, tluszczu i soli mineralnych mleka. Producentami kwasu cytrynowego sa wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, Aspergillus wentii oraz liczne drozdze z rodzaju Candida (Candida lipolytica, Candida tropicalis, Candida intermedia), które syntetyzuja kwas cytrynowy w srodowiskach zawierajacych n-alkany. Wsród szczepów z gatunku Candida lipolytica zostal wyselekcjonowany szczep, u którego stwierdzono cykl plciowy, co odróznialo go od innych. W 1972 roku Yarrow na podstawie szczególowych badan wskazujacych na wiele unikalnych cech dotyczacych morfologii askospor nadal mu nazwe Yarrowia lipolytica. Gatunek ten wyróznia sie szczególna wlasciwoscia syntetyzowania kwasu cytrynowego z n-parafin, co stawia go w szeregu cennych szczepów przemyslowych. W praktyce przemyslowej najwieksze znaczenie maja jednak szczepy Aspergillus niger. Proces produkcyjny jest prowadzony metoda powierzchniowa LFS (ang. Liquid Surface Fermentation), wglebna SmF (ang. Submerged Fermentation) oraz na pozywkach stalych, tzw. proces SSF (ang. Solid State Fermentation). Ta ostatnia metoda najpowszechniej rozwinela sie w Japonii, gdzie 20% ilosci kwasu cytrynowego wytwarzanego na drodze biologicznej pochodzi z procesu na podlozu stalym. W metodzie tej surowcem moga byc otreby, wytloki z trzciny cukrowej (o wilgotnosci nie mniejszej niz 40%), wadliwa melasa buraczana czy trzcinowa, która z uwagi na niewlasciwy sklad, w tym obecnosc zwiazków toksycznych, nie mogla byc wykorzystana w pozostalych metodach. Ze wzgledu na mozliwosc wykorzystania jako pozywek róznego rodzaju odpadowych surowców roslinnych oraz mniejsze obciazenie sciekami, technologia ta spelnia warunki ekologiczne i w ostatnich latach nabywa szczególnego znaczenia. Na podkreslenie zasluguje fakt, ze w tym procesie nie potwierdza sie wiele mechanizmów wystepujacych w tradycyjnych sposobach otrzymywania kwasu cytrynowego, np. wystepuje wyzsza tolerancja grzybni Aspergillus niger na stezenie w podlozu jonów metali i mikroelementów. Inna metoda, z która zwiazana jest przyszlosc produkcji kwasu cytrynowego, to hodowla ciagla i stosowanie immobilizowanych komórek grzybni Aspergillus niger. Obecnie w swiatowej produkcji kwasu cytrynowego metoda wglebna jest wiodaca i tylko okolo 30% kwasu otrzymywanego jest jeszcze metoda powierzchniowa. Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego Szczepy Aspergillus niger stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego otrzymane zostaly w wyniku mutagenizacji oraz skriningowych selekcji szczepów naturalnych. Techniki te, mimo iz naleza do najstarszych, wciaz przynosza dobre rezultaty. W charakterze mutagenów stosowane sa czynniki fizyczne, w tym glównie promieniowanie ultrafioletowe (o dlugosci fali λ=260 nm), chemiczne lub kombinacje obu tych grup. Selekcja szczepów po dzialaniach mutagennych prowadzona jest wedlug kryterium przyszlego zastosowania. Praktyka wykazala bowiem, ze szczepy zapewniajace wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego w procesie wglebnym na podlozu mineralnym nie sprawdzaja sie w procesie powierzchniowym na podlozu melasowym. Przyczyna tego jest zbyt bogata zawartosc w melasie buraczanej skladników mineralnych i stymulatorów wzrostu w postaci zwiazków azotowych i fosforowych, co powoduje nadmierny rozwój biomasy grzybni przy jednoczesnie oslabionej biosyntezie kwasu cytrynowego. Ulepszanie szczepów Aspergillus niger do produkcji kwasu cytrynowego mozliwe jest takze w oparciu o metody rekombinacji genetycznej, w których podstawowe znaczenie ma istnienie u plesni cyklu paraseksualnego, umozliwiajacego przeprowadzenie hybrydyzacji i selekcje rekombinantów. Doskonalenie szczepów do produkcji kwasu cytrynowego prowadzone jest na drodze fuzji protoplastów miedzy odmianami Aspergillus niger rózniacymi sie wydajnoscia kwasu cytrynowego, szybkoscia fermentacji czy tolerancja na skladniki podloza, celem otrzymania szczepów o korzystnych cechach technologicznych. Istnieje mozliwosc tworzenia miedzyrodzajowych fuzantów, np. pomiedzy Aspergillus niger i Trichoderma viride, wykazujacych opornosc na analog glukozy, 2-deoksy-D-glukoze (tworzacy sie w srodowisku hodowlanym i dzialajacy jako inhibitor enzymów glikolitycznych), przy zachowaniu wysokiej wydajnosci kwasu cytrynowego. W pracach ze szczepami przemyslowymi niezwykle waznym, a zarazem trudnym etapem, jest zastosowanie wlasciwej metody przechowywania zapewniajacej stabilnosc cech materialu biologicznego. Do przyjetych w praktyce metod nalezy liofilizacja, przechowywanie konidiów w mieszaninie z jalowym piaskiem, weglem aktywnym lub cytrynianem wapnia. Istotna sprawa jest równiez otrzymanie odpowiedniej ilosci i jakosci biochemicznej materialu szczepiennego, jakim sa konidia szczepu przemyslowego. Stosowane pozywki sporulacyjne (pobudzajace wytwarzanie konidiów) powinny indukowac w konidiach enzymy odpowiedzialne za synteze kwasu cytrynowego. Najczesciej stosowane sa pozywki, które w swoim skladzie zawieraja niski poziom wegla i azotu, natomiast wzbogacone sa w posredniki cyklu Krebsa. Praktyka wykazala, ze szczepy przeznaczone do procesu wglebnego z uzyciem podloza mineralnego, aktywowane na podlozu sporulacyjnym (ziemniaczano-glukozowo-agarowym o pH 6,0-7,0) zapewniaja wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego. Szczepy wykorzystywane w procesie powierzchniowym, w którym surowcem jest melasa buraczana, wymagaja podloza sporulacyjnego zestalonego agarem, w którym obok brzeczki slodowej w niewielkich ilosciach dodana jest melasa buraczana. Szczepy Aspergillus niger stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego, na skutek pewnych zmian srodowiska hodowlanego oraz sposobu przechowywania, moga swój dotychczasowy metabolizm, ukierunkowany na synteze kwasu cytrynowego, zmienic na oksydacyjny, wynikiem czego jest glównie produkcja biomasy. To czesto wystepujace zjawisko stwarza koniecznosc ciaglej selekcji odmian o pozadanych cechach. Najczesciej przyjeta metoda skriningowa jest ocena wlasciwosci kwaszacych poszczególnych osobników danej populacji i izolowanie najbardziej aktywnych. Testy te przeprowadza sie na pozywkach stalych z dodatkiem wskaznika wartosci pH. Dalsza selekcja szczepów odbywa sie na podstawie laboratoryjnych testów biologicznych w pozywkach stosowanych w produkcji kwasu cytrynowego. Biochemiczne uwarunkowania nadprodukcji kwasu cytrynowego u Aspergillus niger Nadprodukcja kwasu cytrynowego u niektórych odmian Aspergillus niger jest wynikiem zaklócen w cyklu Krebsa wywolanych brakiem lub niska aktywnoscia enzymów odpowiedzialnych za jego dalsza konwersje. Ten defekt biochemiczny jest uwarunkowany genotypowo, wiadomo jednak, ze poprzez odpowiednie warunki hodowli aktywnosc szczepów w procesie biosyntezy moze byc zintensyfikowana, zapewniajac wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego. Korzystnymi warunkami procesu sa: wysokie stezenie cukru (ok. 10% w hodowli wglebnej i 16% w hodowli powierzchniowej), niedobór jonów metali: Mn+2, Zn+2, Fe+2 (<0,1 mg/100 cm3), ograniczona ilosc zwiazków azotu i fosforu (limitacja wzrostu grzybni), niska wartosc pH, ok. 2,42,6, dobre natlenienie srodowiska. Dwa ostatnie warunki odnosza sie glównie do procesu wglebnego w pozywkach syntetycznych. Kwas cytrynowy powstaje w poczatkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku kondensacji acetylo-CoA i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntaze cytrynianowa (rys. 1). W procesie rozwoju grzybni (trofofaza), a nastepnie produkcji kwasu cytrynowego (idiofaza) heksozy asymilowane sa w dwóch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i pentozofosforanowym (HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia sie w fazie intensywnego rozwoju grzybni, po czym ustepuje glikolizie w fazie produkcji kwasu cytrynowego. Zatem glównym regulatorem szybkosci glikolizy jest fosfofruktokinaza, która staje sie jednoczesnie regulatorem biosyntezy kwasu cytrynowego. Enzym ten jest wrazliwy na obecnosc cytrynianu w srodowisku, ale u szczepów Aspergillus niger w procesie produkcji kwasu cytrynowego represja ta jest znoszona nadmiarem jonów NH4+ w komórkach, w wyniku zaklóconych przemian bialkowych spowodowanych niedoborem w podlozu jonów Mn2+. Mechanizmem regulujacym biosynteze kwasu cytrynowego jest takze ograniczenie syntezy ATP, który jest inhibitorem fosfofruktokinazy. Dowodzi to istnienia w grzybni alternatywnej tlenowej drogi oddechowej, jalowej energetycznie, a wiec nie blokujacej glikolizy. Ten typ oddychania tlenowego, czesto wystepujacy u roslin, nie zostal jeszcze dokladnie zbadany u szczepów Aspergillus niger. Wykazano natomiast jego istnienie w grzybni Neurospora crasa oraz u drozdzy z rodzajów Candida i Rhodotorula, najczesciej podczas przejscia z fazy logarytmicznego wzrostu do fazy stacjonarnej. Alternatywna droga oddechowa ujawnia sie w momencie oslabienia oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej, wtedy indukowana jest synteza oksydazy alternatywnej, ukladu enzymatycznego katalizujacego przenoszenie elektronów na tlen. Indukcje tej oksydazy w komórkach grzybni moze wywolac: - nagromadzenie sie NADH, - zmniejszenie zapotrzebowania na ATP, - niedobór ADP w mitochondriach, - niedobór jonów Cu+2 niezbednych do funkcjonowania oksydazy cytochromowej. Wymienione czynniki sprawiaja, ze cytoplazmatyczny koenzym NADH powstajacy w procesie glikolizy jest utleniany z udzialem oksydazy alternatywnej szlakiem, w którym energia nie wydziela sie w postaci ATP, lecz energii cieplnej. Mechanizm ten uruchamia sie przy rozkojarzeniu fosforylacji oksydatywnej. Oksydaza alternatywnego oddychania cechuje sie, w odróznieniu od oksydazy cytochromowej, niskim powinowactwem do tlenu. Oznacza to, ze dzialalnosc tego enzymu wymaga znacznie wyzszego stezenia tlenu w srodowisku niz droga cytochromowa. Badania wykazaly, ze dopiero stezenie tlenu powyzej 21% powoduje wzrost aktywnosci oddychania alternatywnego. We wglebnym procesie otrzymywania kwasu cytrynowego, w fazie produkcji przy intensywnym napowietrzaniu, moze byc wiec wzbudzana ta droga oddechowa. Zaklócenie procesu wynikajace z braku doplywu tlenu moze spowodowac utrate tej aktywnosci i przywrócenie oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej. Efektem tych zmian jest zahamowanie syntezy kwasu cytrynowego na korzysc produkcji biomasy. Takie zjawisko obserwuje sie podczas awarii systemu natleniania w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego metoda wglebna. Rys. 1. Szlaki metaboliczne przemiany glukozy do kwasu cytrynowego u Aspergillus niger: l - syntaza cytrynianowa, 2,3- hydrataza akonitanowa, 4 - dehydrogenaza izocytrynianowa, 5 - dehydrogenaza 2ketoglutaranowa, 6 - liaza izocytrynianowa; pogrubione linie oznaczaja miejsca oslabionej aktywnosci enzymatycznej Do poznanych innych mechanizmów regulujacych synteze kwasu cytrynowego nalezy oslabienie przemian enzymatycznych w cyklu Krebsa na etapach: - hydratazy akonitanowej (hamowanej deficytem jonów Mn2+ i Fe2+), - mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej (hamowanej cytrynianem), - dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (hamowanej wysokim stezeniem cukru i jonami NH4+). Biosynteza kwasu cytrynowego u Aspergillus niger zwiazana jest takze z cyklem kwasów dikarboksylowych - glioksalowym (rys. 1). Cykl ten przez reakcje anaplerotyczne (uzupelniajace) dostarcza kwasu szczawiowego, który jest prekursorem kwasu cytrynowego. Produkcja kwasu cytrynowego metoda powierzchniowa Powszechne uzywanie okreslenia metoda powierzchniowa i metoda wglebna otrzymywania kwasu cytrynowego wynika z odmiennych warunków hodowli, powodujacych rózna morfologie grzybni. W metodzie powierzchniowej w warunkach statycznych grzybnia Aspergillus niger rozwija sie na powierzchni pozywki, tworzac zwarta pleche zlozona z mocno rozgalezionych strzepek. W metodzie wglebnej grzybnia rosnie w calej objetosci pozywki, tworzac w wyniku ciaglego jej ruchu dosc zwarte fragmenty w formie grudek (pellets). Wspólna cecha obydwu metod otrzymywania kwasu cytrynowego jest ich dwufazowosc. W pierwszej zachodzi intensywny rozwój grzybni, trwa ona przewaznie do 72 godziny hodowli, po czym nastepuje druga faza, w której intensywnie wytwarzany jest kwas cytrynowy przy ograniczonym wzroscie grzybni. W hodowli powierzchniowej obydwie fazy przebiegaja w systemie jednostopniowym. W procesie wglebnym pierwsza faza odbywa sie w podlozu inokulacyjnym, o skladzie rózniacym sie od fermentacyjnego, glównie ze wzgledu na zmniejszona ilosc zródla wegla. Wegetatywny rozwój grzybni w obydwu metodach rozpoczyna sie uaktywnianiem i kielkowaniem konidiów, wytwarzaniem kielka, a nastepnie strzepki rostowej, która wydluzajac sie i rozgaleziajac, tworzy grzybnie o morfologii odpowiadajacej warunkom hodowli. W metodzie powierzchniowego procesu otrzymywania kwasu cytrynowego najczesciej stosowanym surowcem jest melasa buraczana. Melasa buraczana zakwalifikowana jako surowiec jest rozcienczona do zawartosci sacharozy ok. 16%, a nastepnie uzupelniona solami mineralnymi (KH2PO4 – 0,008%, ZnSO4 x 7H20 – 0,0008% oraz K4Fe(CN)6 ok. 0,08%); pH pozywki jest regulowane do wartosci 6,4-6,8. Dokladna ilosc K4Fe(CN)6 musi byc eksperymentalnie okreslona dla kazdej odmiany melasy buraczanej, poniewaz zelazocyjanek potasu wytraca ze srodowiska metale ciezkie - Fe, Zn, Pb, których pewne ilosci sa niezbedne dla procesu biosyntezy kwasu cytrynowego. Sterylna pozywke melasowa w objetosci 500-600 dm3 rozlewa sie za pomoca odpowiednich urzadzen do tac, o wymiarach 2 m dlugosci, 2,5 m szerokosci i 0,16 m glebokosci. Tace sa sporzadzone ze stali kwasoodpornej i sa zamontowane na specjalnych stelazach, umieszczanych w komorach z regulacja temperatury i napowietrzania. Kiedy temperatura pozywki obnizy sie do wartosci 40°C, szczepi sie ja konidiami plesni zmieszanymi z weglem aktywnym jako nosnikiem. Po 24 godzinnej inkubacji pojawia sie widoczna cienka grzybnia, której intensywny wzrost trwa do 48-72 godzin, po czym slabnie na korzysc produkcji kwasu cytrynowego. Dojrzala grzybnia osiaga grubosc 2-3 cm, jej warstwa dolna stykajaca sie z podlozem jest odpowiedzialna za synteze kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu wynosi 168-216 godz. w temp. 30°C, zapewniajac wydajnosc kwasu cytrynowego na poziomie 70-80% w stosunku do poczatkowej ilosci cukru w pozywce. W tym procesie obok kwasu cytrynowego, stanowiacego okolo 80% zawartosci wszystkich kwasów, do podloza wydzielany jest kwas szczawiowy i kwas glukonowy oraz w sladowych ilosciach kwasy z cyklu Krebsa. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne Zródlem zanieczyszczen mikrobiologicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu cytrynowego jest przede wszystkim melasa buraczana. W surowcu tym wystepuja glównie bakterie z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, a takze Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Zródlem tych ostatnich bakterii oprócz melasy moze byc takze woda stosowana w procesie technologicznym, jesli nie spelnia wymagan okreslonych norma. Wszystkie drobnoustroje wystepujace jako zanieczyszczenia sa zdolne do redukcji azotanów (V) do azotanów (III), które dzialaja hamujaco na rozwój grzybni. Badania wykazaly, ze w podlozu melasowym, po niewlasciwie przeprowadzonej sterylizacji, moga pozostac zywe bakterie z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, wywierajace antagonistyczny wplyw na rozwój grzybni Aspergillus niger. Sposród plesni najczestszym zanieczyszczeniem jest Penicillium purpurogenum i Penicillium rubrum. W procesie technologicznym konidia tych plesni dostaja sie z powietrzem stosowanym do przewietrzania komór, a takze wraz ze szczepionka konidiów Aspergillus niger podczas jej rozpylania na powierzchnie pozywki. Plesnie te sa bogate w enzymy hydrolityczne, dzieki którym rozwijaja sie na grzybni Aspergillus niger, powodujac jej lize. Aby uniknac skutków zanieczyszczen mikrobiologicznych, nalezy stosowac aktywna szczepionke grzybni Asperillus niger, szybko opanowujaca srodowisko i obnizajaca wartosc pH do poziomu hamujacego rozwój mikroflory bakteryjnej. Podobnie jak w kazdym procesie biotechnologicznym musi byc zapewniona wysoka czystosc aparatury i komór fermentacyjnych oraz powietrza do ich przewietrzania, poniewaz w przeciwnym razie te srodowiska stac sie moga zródlem zanieczyszczenia rózna mikroflora, zaklócajaca proces produkcji kwasu cytrynowego. Wydzielanie kwasu cytrynowego z podloza hodowlanego Wydzielanie kwasu cytrynowego odbywa sie tzw. metoda cytrynianowa. Polega ona na wytracaniu na goraco cytrynianu wapnia, traktujac roztwór pofermentacyjny wodorotlenkiem wapnia. Wytworzony osad cytrynianu wapnia [Ca3(C6H5O7)2] po oddzieleniu od masy reakcyjnej zadaje sie roztworem H2SO4, w celu otrzymania kwasu cytrynowego w postaci wolnej. Wytracony gips oddziela sie przez filtracje, roztwór zas zageszcza i wydziela czysty produkt przez krystalizacje. Handlowy kwas cytrynowy wyodrebniony ta metoda jest zwiazany z jedna czasteczka wody (C6H5O7xH2O). Metoda cytrynianowa jest bardzo uciazliwa dla przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego, z uwagi na duze zuzycie kwasu siarkowego, wodorotlenku wapnia, a takze wytwarzanie w tym procesie nadmiernych ilosci gipsu. W Instytucie Technologii Przemyslu Chemicznego i Spozywczego Akademii Ekonomicznej we Wroclawiu zostala opracowana metoda wydzielania i oczyszczania kwasu cytrynowego tzw. metoda bezcytrynianowa. Moze byc ona wykorzystana tylko w tych przypadkach, w których do biosyntezy kwasu cytrynowego stosowane sa substraty o wysokiej czystosci, tj.: glukoza, skrobia, maczki cukrowe, a wiec glównie we wglebnej hodowli Aspergillus niger. Metoda bezcytrynianowa polega na: - dezaktywacji grzybni w temp. 70°C i oddzieleniu od roztworu hodowlanego, - oczyszczeniu filtratu garbnikami i ziemia okrzemkowa, - odbarwieniu na kolumnie weglowej, - zatezeniu w wyparce prózniowej do 72% zawartosci kwasu cytrynowego, - krystalizacji kwasu cytrynowego w temp. 7°C. Wydajnosc krystalizacji kwasu cytrynowego wynosi okolo 50%. Odciek miedzykrystaliczny po odbarwieniu weglem aktywnym oczyszcza sie na jonitach (kationit i anionit). Proces oczyszczania jest tak prowadzony, aby oczyszczony odciek odpowiadal wymaganiom stawianym przez norme na spozywczy kwas cytrynowy w plynie. Powierzchniowa biosynteza kwasu cytrynowego z wykorzystaniem melasy jako surowca dostarcza duzych ilosci scieków o wysokim wskazniku BZT 5 Filtrat, po oddzieleniu cytrynianu wapnia, mozna po zageszczeniu stosowac jako dodatek do pasz lub poddawac beztlenowej fermentacji metanowej w oczyszczalniach scieków. Istnieje takze koncepcja wykorzystania filtratu do produkcji drozdzy paszowych. Powaznym problemem ekologicznym jest gips wytwarzany w procesie oczyszczania kwasu cytrynowego. Zagospodarowanie gipsu jako materialu budowlanego jest mozliwe dopiero po odpowiednim oczyszczeniu. Roztwór hodowlany po oddzieleniu grzybni zawiera obok glównego metabolitu, jakim jest kwas cytrynowy, wiele cennych enzymów, glównie enzymy pektynolityczne, proteolityczne, a takze glukanazy, co stwarza mozliwosc ich przemyslowego pozyskiwania. Ponadto zródlem wielu enzymów (proteinazy, amylazy, pektynazy, oksydaza glukozowa), które moga byc wydzielane dla celów handlowych, jest grzybnia Aspergillus niger. Wytwarzana w duzych ilosciach w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego moze byc takze wykorzystana na cele paszowe, poniewaz zawiera ponad 40% bialka w suchej masie, z czego polowa to bialko dobrze przyswajalne. Ponadto zawiera liczne mikroelementy. Dodatek suszu grzybowego w ilosci 10-15% do pasz dla zwierzat hodowlanych, dorównuje wartosci odzywczej preparatom drozdzy paszowych. Melasa buraczana jako surowiec do produkcji kwasu cytrynowego Melasa buraczana jest ubocznym produktem przemyslu cukrowniczego. Jej sklad chemiczny podano na rys. 4. Rys. 4. Sklad chemiczny melasy buraczanej W grupie niecukrów melasy (zwiazków rozpuszczalnych, nie bedacych sacharoza), stanowiacych okolo 30% zawartosci suchej masy, znajduja sie zwiazki, które sprzyjaja rozwojowi drobnoustrojów, w tym takze szczepów produkcyjnych oraz takie, których dzialanie jest dla mikroorganizmów szkodliwe. Do pierwszej grupy naleza aminokwasy, biotyna, kwas pantotenowy, mezoinozytol. W drugiej grupie znajduja sie zwiazki o charakterze nieorganicznym (aniony, kationy) oraz zwiazki organiczne, tj. kwasy organiczne, zwiazki bialkowe, zwiazki barwne oraz inne, o róznej strukturze chemicznej. Suma wszystkich zwiazków melasy wykorzystywanych przez drobnoustroje stanowi 51-58% suchej masy. Szkodliwe dla drobnoustrojów przemyslowych zwiazki melasy maja rózne pochodzenie. Niektóre z nich powstaja podczas gnicia buraków w czasie ich przechowywania w kopcach badz pochodza ze srodków chemicznych, które stosuje sie dla zahamowania szerzenia sie „kopcowej zgnilizny". Inne zródlo zwiazków szkodliwych, to preparaty uzywane w zabiegach agrotechnicznych (nawozy mineralne, preparaty chwasto- i owadobójcze). Nie bez znaczenia dla jakosci surowcowej melasy sa zwiazki powstale podczas przerobu buraków, tj. kwasy lotne, azotany (V), zwiazki barwne, które tworza sie juz w ekstraktorze i w dalszych etapach oczyszczania soku. Niezwykle wazna role w tworzeniu niekorzystnej frakcji melasy spelniaja pomocnicze srodki chemiczne stosowane w procesie otrzymywania cukru. Do powszechnie uzywanych preparatów w przemysle cukrowniczym naleza: flokulanty, emulgatory, dezynfektanty oraz srodki do gaszenia piany. W polskim cukrownictwie jako preparaty przeciwpianowe stosuje sie lój barani, Spumole BJ, K-3, Rokamix oraz inne, pochodzenia zagranicznego. Przecietnie na 100 ton buraków zuzycie srodka do gaszenia piany wynosi od 0,6 do 24 kg. Ten bardzo szeroki przedzial uzytej ilosci preparatów przeciwpianowych zalezy przede wszystkim od jakosci przerabianego surowca. Buraki niedojrzale, zbyt dlugo skladowane, zmarzniete powoduja, ze wychodzacy z ekstraktora sok bardzo sie pieni, co zmusza technologów do wiekszego zuzycia srodka przeciwpianowego Kumulowanie sie w melasie tego rodzaju preparatów o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych nie wplywa korzystnie na jej wartosc surowcowa. W procesie powierzchniowej fermentacji cytrynowej, w której melasa jest podstawowym surowcem, nadmiar preparatów przeciwpianowych, np. typu Spumol K-3, zaklóca proces rozwoju grzybni juz w stadium kielkowania konidiów, a utworzona grzybnia jest nieprawidlowa i latwo ulega zatopieniu. W grupie szczepów Aspergillus niger, cechujacych sie wysoka aktywnoscia biosyntezy kwasu cytrynowego, istnieja odmiany wykazujace zróznicowana wrazliwosc na obecne w melasie zwiazki zaklócajace rozwój grzybni i produkcje kwasu cytrynowego, z tego tez wzgledu przy selekcji szczepów przemyslowych uwzgledniana jest ich tolerancja na zmienny sklad melasy i zawarte w niej inhibitory wzrostu. Jednakze dobór materialu biologicznego i jego selekcja pod tym wzgledem jest utrudniona ze wzgledu na zlozonosc skladu chemicznego melasy i obecnosc róznych zwiazków, które moga byc odpowiedzialne za wadliwosc tego surowca. Klasyfikacja melas do fermentacji cytrynowej oparta jest na danych z analizy chemicznej objetych norma PN 76/R-64772 (Tab. 1). Jednakze zakres stosowanych analiz chemicznych nie obejmuje kontroli wszystkich skladników melas buraczanych, a zwlaszcza tych, które maja szkodliwy wplyw na rozwój grzybni Aspergillus niger. Z tego wzgledu niezbednym testem do oceny przydatnosci surowca melasowego jest wynik laboratoryjnych prób hodowli Aspergillus niger. Uzdatnianie melas do celów produkcji kwasu cytrynowego (a takze itakonowego) odbywa sie poprzez dodatek do podloza zelazocyjanku potasu w celu usuniecia nadmiaru jonów metali ciezkich, glównie zelaza. Inna metoda zalecana dla procesu wglebnego jest odsalanie melasy na wymieniaczach jonowych. Tab. 1. Klasyfikacja melas buraczanych wg PN-76/R-64772 Parametr °Bx pH Zawartosc sacharozy [%] Czystosc (Cz.)* [%] Melasy buraczane I klasa 75,0 7,0-8,5 =47,0 II klasa 75,0-73,0 7,0-9,0 =44,0 61,0-66,0 60,0-58,0 Cukier inwert. [%] <1,0 nie norm. Azot ogólny [%] Kwasy lotne (CH3COOH) Sole Ca i Mg (CaO) [%] <1,7 <1,4 <1,2 2,3 nie norm. <2.0 =0 - SO2 [%] Ogólna liczba 105 drobnoustrojów *Cz. - procentowa zawartosc sacharozy w suchej masie 106 Produkcja kwasu cytrynowego metoda wglebna Wglebna metoda biosyntezy kwasu cytrynowego w skali przemyslowej prowadzona jest w bioreaktorach o pojemnosci od 50 do 100 m3 z uzyciem surowców o wyzszym stopniu czystosci niz w metodzie powierzchniowej, tj. cukru handlowego (sacharoza), soków cukrowniczych, maczek cukrowych, hydrolizatów skrobiowych. Rzadziej do tego celu wykorzystywana jest melasa buraczana, poniewaz proces wglebny z jej uzyciem nie zapewnia odpowiedniej wydajnosci kwasu cytrynowego. W przypadku stosowania pozywki mineralnej, w której zródlem wegla jest handlowa sacharoza, wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego wynosi ponad 80%. Obok zródla wegla w ilosci 100-150 g/dm3, pozywka zawiera w swoim skladzie niezbedne sole mineralne, tj. (NH4)2SO4 - 2g/dm3, MgSO4x7H2O – 0,2g/dm3, KH2PO4 - 0,2 g/dm3, a pH regulowane jest do wartosci 2,53,0. W zaleznosci od specyfiki szczepu Aspergillus niger pozywke w bioreaktorze szczepi sie zawiesina konidiów w ilosci 105/cm3, po ich wczesniejszej 6-8 godzinnej inkubacji lub zawiesina grzybni inokulacyjnej otrzymanej po 24-36 godzinach hodowli, stosujac 10% w stosunku do objetosci pozywki w bioreaktorze. W metodzie hodowli wglebnej, w wyniku ciaglego mieszania, grzybnia rozwija sie w calej objetosci podloza. Po 48 godzinach rozpoczyna sie faza produkcji kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu biosyntezy, do momentu wyczerpania zródla wegla, wynosi od 120 do 168 godzin w temperaturze 30-32°C i przy napowietrzaniu jalowym powietrzem w ilosci 0,1-0,4 vvm (objetosc powietrza dostarczana do bioreaktora w stosunku do objetosci podloza, wciagu minuty). Zaleta tej metody w porównaniu z metoda powierzchniowa z uzyciem melasy, jest krótszy czas trwania procesu, mniejsze zagrozenie rozwojem obcej mikroflory z uwagi na niska wartosc pH i zamkniete bioreaktory oraz mozliwosc wydzielania kwasu cytrynowego z pozywki na drodze krystalizacji, a takze na mniejsze obciazenie sciekami. Otrzymywanie kwasu cytrynowego metoda hodowli wglebnej stwarza jednak wiele trudnosci natury bioinzynieryjnej, które wynikaja ze specyficznej morfologii grzybni w tych warunkach. Ciagly ruch cieczy wywolany mieszaniem i napowietrzaniem powoduje, ze grzybnia w bioreaktorze wystepuje w postaci klebków (pellets) o srednicy 0,2-3,0 mm badz strzepek grzybni o róznym stopniu rozgalezienia lub tez jako mieszanina obu form morfologicznych. Taki wzrost grzybni, a takze gestosc zawiesiny wynoszaca do 50 kg s.m./m3 powoduja, ze srodowisko hodowlane osiaga wysoka lepkosc. W tak niekorzystnych reologicznie warunkach utrudniona staje sie wymiana masy, a takze dyfuzja tlenu do podloza oraz do komórek grzybni. Znajomosc fizjologii i morfologii grzybów strzepkowych oraz parametrów reologicznych (lepkosc, gestosc) zmieniajacych sie wraz z rozwojem grzybni jest niezbedna do wlasciwego zaprojektowania bioreaktora z odpowiednim systemem doprowadzenia powietrza do srodowiska, mieszaniem masy reakcyjnej zapewniajacym dobre warunki wymiany masy i wymiany gazowej (CO2, O2). Znane podstawowe zasady wymiany masy i ciepla w biorektorach, dotyczace plynów newtonowskich, w przypadku hodowli grzybów strzepkowych sa nieprzydatne, poniewaz organizmy te tworza zawiesiny o wlasciwosciach nienewtonowskich. Stad tez bioreaktory stosowane do biosyntezy kwasu cytrynowego musza byc specjalnie konstruowane. Najczesciej stosuje sie bioreaktory z mieszadlem turbinowo-tarczowym, którego ruch powoduje silna dyspersje powietrza w cieczy. Najbardziej efektywna wymiane masy i dyfuzje powietrza zapewniaja bioreaktory bezmieszadlowe z naturalna cyrkulacja cieczy typu airlift, w których powietrze do wnetrza aparatu wprowadzane jest przez odpowiednie urzadzenia napowietrzajace. Bioreaktory wykonane sa ze stali kwasoodpornej i sa wyposazone w oprzyrzadowanie pomiarowe, tj. elektrode tlenowa, elektrode redox (do pomiaru potencjalu oksydoredukcyjnego), termometr polaczony z regulatorem temperatury, rotametr, pehametr, regulator obrotów walu mieszadla i odpieniacz mechaniczny. W procesach prowadzonych w bioreaktorach zjawisko pienienia sie nie zawsze skutecznie moze byc likwidowane mechanicznie, czesto istnieje koniecznosc stosowania srodków przeciwpianowych, ale w sposób kontrolowany, poniewaz nadmiar tego rodzaju preparatów o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych zaklóca rozwój grzybni i zmniejsza wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego.
