zastosowanie metody real-time pcr i systemu lightcycler® do

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 93 - 98
Tomasz Dzieciątkowski1,2, Maciej Przybylski1,2, Dariusz Kawecki1, Anna MidakSiewirska1, Małgorzata Gieryńska3, Mirosław Łuczak2, Grażyna Młynarczyk1
ZASTOSOWANIE METODY REAL-TIME PCR I SYSTEMU
LIGHTCYCLER® DO WYKRYWANIA DNA LUDZKIEGO
HERPESWIRUSA TYPU 7 (HHV-7)*
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk
2
Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny
Kierownik: prof. dr hab. M. Łuczak
3
Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna
Gospodarstwa Wiejskiego
Kierownik: prof. dr hab. M. Niemiałtowski
1
Celem pracy było zaprojektowanie, optymalizacja warunków reakcji oraz
zbadanie użyteczności metody real-time PCR z wykorzystaniem sond typu
TaqMan do diagnostyki zakażeń ludzkim herpeswirusem typu 7, zwłaszcza
u pacjentów z oddziałów onko-hematologicznych.
Ludzki herpeswirus typu 7 (human herpesvirus type 7; HHV-7) zaliczany jest do podrodziny β-herpesvirinae, rodzaju Roseolovirus i wykazuje niezwykle bliskie pokrewieństwo
genetyczne z ludzkim herpeswirusem typu 6 (HHV-6) (3). Wyizolowano go po raz pierwszy
w 1989 roku z limfocytów T CD4+ z krwi obwodowej zdrowej osoby dorosłej (4). Zakażenia
HHV-7, podobnie jak powodowane przez HHV-6, są powszechne na całym świecie, jednak
w przeciwieństwie do herpeswirusa typu 6, pierwotne zakażenie HHV-7 ma miejsce zazwyczaj po ukończeniu 1 roku życia (14). Głównym miejscem replikacji wirusa są komórki
ślinianiek, a wirus wydzielany jest do środowiska wraz ze śliną (9). DNA herpeswirusa typu
7 zostało także wykryte w wymazach z dróg rodnych, należy więc także brać pod uwagę
możliwość transmisji wertykalnej oraz poprzez kontakty seksualne (5).
Związek HHV-7 z chorobami człowieka nie został jednoznacznie wyjaśniony - obecnie przyjmuje się go za jeden z etiologicznych czynników rumienia nagłego (exanthem
subitum) u dzieci (13). Nieliczne prace kazuistyczne sugerują rolę pierwotnego zakażenia
herpeswirusem typu 7 w zapaleniu wątroby oraz infekcjach górnych dróg oddechowych
(6). HHV-7 znaleziono także u pacjentów wszystkich grup wiekowych z objawami łupieżu
różowego (pityriasis rosea) w surowicy i leukocytach, a także bioptatach ze zmian skórnych
(2). Związek pomiędzy pityriasis rosea a zakażeniami herpeswirusami pozostaje wciąż
niejednoznaczny, ze względu na niski poziom wykrywalnego DNA HHV-7, jak i dlatego iż
obecność tego patogenu stwierdzano również w osoczu zdrowych osób. Sugerowany jest
94
T. Dzieciątkowski i inni
Nr 1
także udział HHV-7 jako czynnika ułatwiającego reaktywację latentnego cytomegalowirusa
u pacjentów po zabiegach przeszczepienia komórek krwiotwórczych (1,15). Podobne obserwacje uzyskano także u biorców przeszczepów narządowych, zwłaszcza po transplantacji
nerki lub wątroby (8). Ze względu na upośledzenie funkcjonowania układu odpornościowego
w grupach pacjentów opisanych powyżej oraz bliskie pokrewieństwo antygenowe pomiędzy
HHV-6 i HHV-7, serologiczna diagnostyka zakażeń herpeswirusem typu 7 wypierana jest
przez testy biologii molekularnej, a zwłaszcza metodę PCR (10, 15).
Celem pracy było opracowanie i optymalizacja testu PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA ludzkiego herpeswirusa typu 7 w materiale klinicznym, ze
szczególnym uwzględnieniem surowicy krwi.
MATERIAŁ I METODY
Do jakościowych badań techniką real-time PCR (określenie swoistości reakcji) użyto
całogenomowego DNA wyizolowanego ze szczepu RK HHV-7, uzyskanego dzięki uprzejmości dr Dharama Ablashi (HHV-6 Foundation - Santa Barbara, CA, USA). Jako kontrolę
ujemną wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii komórkowej HFFF-2,
zaś za kontrole specyficzności reakcji posłużył DNA izolowany z: wirusa opryszczki typu
1 (HSV-1), herpeswirusa typu 6 (HHV-6) oraz wirusa Epsteina-Barr (EBV).
W celu opracowania starterów i sondy do metody real-time PCR wykorzystano sekwencję DNA kodującego specyficzne dla HHV-7 główne białko kapsydu, dostępną w internetowej
bazie danych GenBank (U43400). Zaprojektowane do niej startery amplifikują fragment
genomu o długości 122 par zasad (Tabela I). Dodatkowo celem zwiększenia specyficzności
reakcji zastosowano zaprojektowaną sondę fluorescencyjną typu TaqMan wyznakowaną na
końcu 5’ fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym JOE oraz wygaszaczem Tamra na
końcu 3’(Oligo®).
Badania techniką real-time PCR wykonywano w aparacie LightCycler 2.0 z użyciem
zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics®). Mieszanina
reakcyjna zawierała 5 µl DNA; 2,25 µM startera HHV7-p1; 3,25 µM startera HHV7-p2
oraz 1,5 µM sondy HHV7-JOE w końcowej objętości 20 µl. PCR rozpoczynał się etapem
aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w 950C, po którym
następowało 45 cykli składających się z denaturacji 15 s w 950C, przyłączania starterów
przez 15 s w 600C oraz wydłużania nici w temperaturze 720C przez 15 s. Reakcję kończyło
schłodzenie próbek do 400C na 30 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości
fali 560 nm, typowej dla fluoroforu JOE. Wzrost poziomu fluorescencji był proporcjonalny
do ilości produktu w mieszaninie.
Materiał do badań stanowiły 64 próbki surowicy krwi, pochodzące od 28 pacjentów
Kliniki Hematologii i Onkologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego z lat 2006Tabela I. Sekwencje użytych starterów i sondy
Nazwa
Sekwencja (5’ – 3’)
HHV7-p1
CCC AAC TAT TTA CAG TAC GGT TGG T
HHV7-p2
TTT AGT TCC AGC ACT GCA ATC
HHV7-JOE
JOE – CTA TTT TCG GTC TTT CCA ATG CAC GCA – Tamra
Nr 1
Metoda real-time PCR do wykrywania Herpes wirusa typu 7
95
2007. Próbki surowic zostały pobrane w trakcie trwania potwierdzonego zakażenia CMV
(38 próbek) lub gorączki neutropenicznej o niewyjaśnionej etiologii (26 próbek). Izolację
DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics®), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, zawieszając wyizolowane
DNA w końcowej objętości 50 ml buforu elucyjnego.
Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w dwukrotnych niezależnych powtórzeniach.
WYNIKI
Przy użyciu jakościowej metody real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto w próbce zawierającej
DNA ludzkiego herpeswirusa typu 7. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne
DNA niezakażonej linii HFFF-2, wirusa opryszczki typu 1, herpeswirusa typu 6 oraz wirusa
Epsteina-Barr, nie zaobserwowano fluorescencji przy badanej długości fali świetlnej 560
nm, co wskazuje na brak w nich swoistej amplifikacji kwasu nukleinowego. Obserwacja
taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy
o wysokiej specyficzności reakcji (Ryc.1).
Opisane powyżej próbki kliniczne (n= 64) poddano opracowanej reakcji real-time PCR.
W 40 materiałach klinicznych - 25 próbkach uzyskanych w czasie wykrywalnej wiremii
Ryc.1 Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego herpeswirusa typu 7.
Krzywa oznaczona HHV-7 oznacza amplifikację DNA szczepu wzorcowego. Wykres K (-)
to kontrola ujemna (DNA izolowane z niezakażonej linii HFFF-2), zaś wykresy: HSV-1,
HHV-6 oraz EBV oznaczają kontrole specyficzności reakcji.
96
T. Dzieciątkowski i inni
Nr 1
CMV oraz w 15 próbkach pobranych w trakcie gorączki neutropenicznej - odnotowano
wzrost poziomu fluorescencji barwnika reporterowego JOE, co jest następstwem wzrostu
ilości produktu w mieszaninie oraz degradacji odpowiednio modyfikowanej sondy TaqMan.
Pozostałe 24 próbki nie zawierały sekwencji DNA HHV-7, o czym świadczy brak wzrostu
poziomu fluorescencji. Dodatnie wyniki badań stwierdzono więc w przypadku 62,5% badanych próbek (Tabela II).
Tabela II. Porównanie wyników badań uzyskanych techniką real-time PCR w kierunku wykrywania
DNA herpeswirusa typu 7 w materiałach klinicznych.
Liczba badanych
Wyniki testu
materiałów klinicznych Próbki pobrane w trakcie wiremii Próbki pobrane w trakcie gorączki
CMV
neutropenicznej
dodatnie (+)
ujemne (-)
dodatnie (+)
ujemne (-)
n= 64
25
13
15
11
%
(39,1%)
(20,3%)
(23,4%)
(17,2%)
DYSKUSJA
Z powodu swego rozpowszechnienia w środowisku zakażenia spowodowane przez βherpeswirusy stały się jedną z najważniejszych przyczyn chorób u osób z immunosupresją
(7). Infekcje o etiologii HHV-7 w tej grupie chorych zostały powiązane z ostrym odrzucaniem
przeszczepu, zaburzeniami neurologicznymi (7), wysypką oraz gorączką neutropeniczną (7,
12). Pomimo braku jednoznacznych powiązań ludzkiego herpeswirusa typu 7 z opisanymi
powyżej objawami klinicznymi, powinien być on brany pod uwagę u osób z niedoborami
immunologicznymi, zwłaszcza gdy rutynowe badania w kierunku CMV i EBV dają wyniki
negatywne.
Ograniczona specyficzność i dostępność testów serologiczych w kierunku HHV-7 skłania
do szerszego rozpowszechnienia w poprzeszczepowej diagnostyce wirusologicznej metod
biologii molekularnej (10, 11, 15). Wielokrotnie opisywana i podkreślana czułość wariantu
real-time PCR, gwarantuje wykrycie zakażenia pierwotnych lub reaktywacji wirusa przy
niskim poziomie wiremii, przydatna jest także do monitorowania poziomu DNA w przebiegu
terapii antywirusowej (7, 11). Zalecana obecnie przy zakażeniach β-herpeswirusami terapia
z użyciem foskarnetu lub cidofowiru, niesie za sobą znaczne ryzyko nefrotoksyczności (7)
- istotne jest więc ograniczanie podawanej dawki w miarę spadku liczby wykrywanych
kopii wirusa.
Dostępność specyficznej metody wykrywania wiremii HHV-7 techniką real-time PCR
może znacząco ułatwić szybką diagnostykę zakażenia i umożliwić prawidłowe postępowanie
terapeutyczne.
Nr 1
Metoda real-time PCR do wykrywania Herpes wirusa typu 7
97
T. D z ie c ią tk o w ski , M. Prz ybyl ski , D. Ka wecki, A . M idak-S iew irs ka,
M . G ie r y ń s k a , M.Ł uc z a k, G. Mł yna rc z yk
APPLICATION OF REAL-TIME PCR AND LIGHTCYCLER® SYSTEM FOR INVESTIGATING
THE PRESENCE OF HUMAN HERPESVIRUS 7 DNA
SUMMARY
Human herpesvirus 7 (HHV-7) is a β-herpesvirus widely spread within a population and has
been recognized as a potential pathogen in immunocompromised hosts. The goal of the study was
development of real-time PCR assay for detection of human herpesvirus 7 DNA in clinical samples,
using primers targeting a conserved region of the viral DNA major capside proteine gene and a specific TaqMan hydrolyzing probe. Sixty four plasma samples taken from a group of adult recipients of
allogeneic HSCT, during detectable CMV viremia or neutropenic fever, were tested for the presence
of viral DNA in the LightCycler® system with method described above. HHV-7 DNA was detected
in 40 specimens (62,5%). The conclusion is that developed TaqMan-based probes real-time PCR test
is very reliable and valuable tool for detection of HHV-7 viremia in plasma samples. The high level
of sensitivity and accuracy provided by the LightCycler® instrument is favorable for the use of this
method in the detection of human herpesvirus 7 DNA in clinical specimens.
PIŚMIENNICTWO
1. Chan PKS, Peiris JSM, Yuen KY i inni. Human herpesvirus-6 and human herpesvirus-7 infection
in bone marrow transplant recipients. J Med Virol 1997; 53: 295-305.
2. Chuh AA, Chan H, Zawar V. Is human herpesvirus 7 infection the causative agent of pityriasis
rosea? - a critical review. Int J Dermatol 2004; 43: 870-5. 3. Davison A, Eberle R, Hayward GS i inni. Herpesviruses. W: Virus taxonomy - classification and
nomenclature of viruses. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.
Red. C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff i inni, Elsevier Academic Press, San Diego 2005,
193-212.
4. Frenkel N, Schirmer EC, Wyatt LS i inni. Isolation of a new herpesvirus from human CD4+ T
cells. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 748-52.
5. Hall CB, Caserta MT, Schnabel KC i inni. Congenital infections with human herpesvirus 6 (HHV6)
and human herpesvirus 7 (HHV7). J Pediatr 2004; 145: 472-7.
6. Kosuge H. HHV-6, 7 and their related diseases. J Dermatol Sci 2000; 22: 205-12.
7. Ljungman P. β-Herpesvirus challenges in the transplant recipient. J Infect Dis 2002; 186: S99109.
8. Osman HKE, Peiris JSM, Taylor CE i inni. Correlation between the detection of viral DNA by
the polymerase chain reaction in peripheral blood leukocytes and serological response to human
herpesvirus 6, human herpesvirus 7, and cytomegalovirus in renal allograft recipients. J Med
Virol 1997; 53: 288-94.
9. Sada E, Yasukawa M, Ito C i inni. Detection of human herpesvirus 6 and human herpesvirus 7 in
the submandibular gland, parotid gland, and lip salivary gland by PCR. J Clin Microbiol; 1996;
34: 2320-1.
10. Safronetz D, Humar A, Tipples GA. Differentiation and quantitation of human herpesviruses 6A,
6B and 7 by real-time PCR. J Virol Methods; 2003; 112: 99-105.
11. Sassenscheidt J, Rohayem J, Illmer T i inni. Detection of beta-herpesviruses in allogenic stem
cell recipients by quantitative real-time PCR. J Virol Methods 2006; 138: 40-8.
98
T. Dzieciątkowski i inni
Nr 1
12. Savolainen H, Lautenschlager I, Piiparinen H i inni. Human herpesvirus-6 and -7 in pediatric
stem cell transplantation. Pediatr Blood Cancer 2005; 45: 820-5.
13. Tanaka K, Kondo T, Torigoe S i inni. Human herpesvirus 7: another causal agent for roseola
(exanthem subitum). J Pediatr 1994; 125: 1-5.
14. Yamanishi K: Human Herpesvirus 6 and Human Herpesvirus 7. W: Clinical virology. Red. D.D.
Richman., R.J. Whitley., F.G. Hayden, ASM Press, Washington 2002, 463-78.
15. Zawilińska B, Kosz-Vnenchak M, Piątkowska-Jakubas B i inni. Mieszane zakażenia herpeswirusowe u biorców alloprzeszczepów komórek hemopoetycznych (allo-HSCT). Przegl Epidemiol
2008; 62: 39-46.
Otrzymano: 1 XII 2008 r.
Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej,
Warszawski Uniwersytet Medyczny
e-mail: [email protected]