diagnostyka wirusowych zakażeń ośrodkowego układu nerwowego

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 253 - 258
Joanna Siennicka, Agnieszka Trzcińska
DIAGNOSTYKA WIRUSOWYCH ZAKAŻEŃ OŚRODKOWEGO
UKŁADU NERWOWEGO – ANALIZA WYNIKÓW RUTYNOWYCH
BADAŃ LABORATORYJNYCH
Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie
Kierownik: doc. dr hab. B. Litwińska
Przedstawiono zestawienie wyników rutynowych badań laboratoryjnych
w kierunku neuroinfekcji o etiologii wirusowej, wykonanych w laboratorium
Zakładu Wirusologii NIZP-PZH w latach 2006 - 2007.
Wirusowe zakażenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przebiegają najczęściej
pod postacią ZOMR - zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis), ZM – zapalenia
mózgu (encephalitis), bądź ZRK - zapalenia rdzenia kręgowego (myelitis). Możliwe są
również inne zespoły kliniczne, wynikające z zajęcia różnych rejonów OUN (6). Spośród
patogenów wirusowych wykazujących neurotropizm należy wymienić przede wszystkim
herpeswirusy (HSV, CMV, VZV, EBV, HHV-6 i 7), wirusy odry, różyczki, nagminnego zapalenia przyusznic (nzp), odkleszczowego zapalenia mózgu (kzm), wścieklizny i HIV. W 2005
roku zarejestrowano w Polsce 2 806 przypadków ZM i ZOMR, które w większości (52,4%)
przypadków miały podłoże wirusowe (9). Szacuje się, że za około 1000-1600 stwierdzanych
rocznie przypadków ZOMR odpowiadają głównie enterowirusy, przede wszystkim ECHO
oraz Coxackie A i B, podczas gdy 600-700 przypadków ZM związanych jest głównie z kzm
i HSV (6). Potwierdzenie wirusowej etiologii zakażenia OUN i rozpoznanie czynnika patogennego może mieć zasadnicze znaczenie dla postępowania terapeutycznego, szczególnie
w obliczu dostępnej obecnie chemioterapii przeciwwirusowej.
Celem pracy była analiza wyników uzyskanych w ramach rutynowych badań próbek
materiału klinicznego dostarczanych do Zakładu Wirusologii NIZP-PZH w celu diagnostyki
zakażenia OUN.
MATERIAŁ I METODY
W okresie 24 miesięcy (od stycznia 2006 r. do grudnia 2007 r.) skierowano do Zakładu Wirusologii NIZP-PZH 729 zleceń na badania w kierunku neuroinfekcji u pacjentów
w wieku od 3 dni do 83 lat (średnia 34,64+/-20,89). Materiały, płyn mózgowo-rdzeniowy
(pmr) w liczbie n=277 oraz pmr łącznie z surowicą (n=452) nadesłano z 82 ośrodków
medycznych w Polsce. Zgodnie z profilem badań wykonywanych w laboratorium Zakładu
Wirusologii NIZP-PZH, w nadsyłanych materiałach prowadzono oznaczenia w kierunku
254
J. Siennicka, A. Trzcińska
Nr 3
11 zakażeń wirusowych: HSV, CMV, EBV, VZV, HHV-6, HHV-7, wirusem kzm, odry, nzp,
różyczki i enterowirusami.
Badania przeprowadzano metodą ELISA, PCR i metodą izolacji wirusa w hodowli komórkowej. Obecność przeciwciał w klasie IgM i IgG w surowicy oraz obecność przeciwciał
IgG w pmr oznaczano w przypadku HSV, CMV, EBV, VZV, enterowirusów, wirusa nzp,
kzm, odry i różyczki. Wykrywanie DNA patogenu w pmr prowadzono w przypadku HSV,
CMV, EBV, VZV, HHV-6 i HHV-7. Ponadto, w przypadku HSV oznaczano intratekalną
syntezę przeciwciał klasy IgG, określając stosunek wirusowo-swoistych do całkowitych
IgG w surowicy i pmr pacjenta (antibody index - AI). Zastosowane kryteria laboratoryjnego
potwierdzenia zakażenia to: pozytywny wynik badania pmr metodą PCR i/lub obecność
przeciwciał klasy IgM w surowicy; pozytywny wynik izolacji wirusa z pmr; wartość współczynnika AI>1,5. Rodzaj wykonywanych oznaczeń był ściśle uzależniony od informacji
zawartych w skierowaniu przesyłanym wraz z materiałami.
WYNIKI
Skierowania na badania laboratoryjne w większości analizowanych przypadków
(62,4%) nie zawierały rozpoznania klinicznego, lub jedynie informację, że celem badania
jest potwierdzenie neuroinfekcji. W pozostałych przypadkach badania wykonywano u osób,
u których rozpoznano ZM (13,4%), ZOMR (11,1%), ZOMR i ZM (4,4%), ZR (1,0%),
ZM i ZR (0,6%), oraz u pacjentów (7,1%), u których stwierdzono między innymi zespół
Guillain-Barre, otępienie, SSPE, SM, demencję, leukoencefalopatię, demielinizację OUN,
wrodzone CMV, wieloogniskową neuropatię, porażenie nerwu VII, zapalenie nerwu II,
obrzęk mózgu, ospę wrodzoną, padaczkę.
Tabela I . Wyniki badań laboratoryjnych potwierdzających zakażenie wirusowe u pacjentów
diagnozowanych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH w latach 2006 - 2007 w kierunku
neuroinfekcji.
Czynnik
Rozpoznanie kliniczne
Liczba przypadków
Kryterium potwierdzenia
patogenny
(jeśli podane)
48
kzm
IgM
48/48 ZOMR, ZM, ZOMR i ZM
AI>1,5
25/40 ZOMR, ZM, ZOMR i ZM,
40
HSV
PCR
12/40 demencja, PML, zmiany w mózgu
AI>1,5 i PCR
1/40
IgM
2/40
1
HSV/odra
IgM
1/1 Brak danych
1
HSV/VZV
AI>1,5, IgM
1/1 Brak danych
2
CMV
IgM
1/2 ZM, wrodzone CMV
PCR
1/2
3
EBV
PCR
3/3 Brak danych
2
enterowirusy Izolacja
1/2 ZM
IgM
1/2
1
nzp
IgM
1/1 ZM
1
odra
IgM
1/1 SSPE
5
VZV
IgM
3/5 ZOMR, ZM, ZR
PCR i IgM
2/5
Nr 3
Diagnostyka zakażeń wirusowych OUN
255
Tab ela I I . Metody potwierdzające zakażenie wirusowe u pacjentów diagnozowanych w Zakładzie
Wirusologii NIZP-PZH w latach 2006 - 2007 w kierunku neuroinfekcji.
Liczba wykonanych Liczba wyników
% wyników
metoda
oznaczeń
pozytywnych
pozytywnych
Oznaczanie miejscowej syntezy IgG
187
27
14,4
PCR w pmr
316
20
6,3
ELISA (obecność IgM w surowicy)
610
63
10,3
Izolacja wirusa w pmr
1
1
100
Spośród 729 skierowań z prośbą o potwierdzenie podejrzenia zakażenia wirusowego
większość dotyczyła diagnostyki w kierunku zakażenia HSV (59,7%) i kzm (35,8%), zlecanych jako pojedyncze badania lub łącznie z oznaczeniami dla innych patogenów. Znaczny
odsetek (13,9%) zleceń dotyczył badania w kierunku 3 i więcej patogenów wirusowych.
Potwierdzenie zakażenia wirusowego uzyskano u 104 (14,3%) spośród 729 badanych
pacjentów. Najwyższą liczbę potwierdzeń uzyskano w stosunku do zakażenia wirusem
odkleszczowego zapalenia mózgu (Tabela I), gdzie na 261 zleconych badań w 48 (18,4%)
przypadkach uzyskano pozytywny wynik oznaczeń IgM w surowicy pacjentów. Stosując
podane powyżej kryteria, zakażenie HSV rozpoznano u 40 (9,2%) spośród 435 pacjentów,
u których zlecono badania w tym kierunku.
Metody, przy użyciu których uzyskano najwyższą liczbę potwierdzeń (Tabela II) to
określanie miejscowej syntezy przeciwciał klasy IgG w OUN (14,4%) i obecności IgM
w surowicy (10,3%).
Mając do dyspozycji jedynie płyn mózgowo-rdzeniowy (n=277 przypadków), potwierdzenie wirusowej etiologii zakażenia uzyskano w 13 (4,7%) przypadkach: metodą PCR
w pmr dla HSV (n=9), CMV (n=1), EBV (n=1), VZV (n=1), oraz w jednym przypadku
metodą izolacji wirusa Coxackie B. Należy podkreślić, że w większości przypadków
(54,5%) jednostka przysyłająca do badania jedynie pmr, w skierowaniu zlecała oznaczenia
przeciwciał, najczęściej dla kzm (n=83), z reguły jako pojedyncze badanie (n=77). Spośród
452 przypadków, w których do badania przysłano zarówno pmr, jak i surowicę pacjenta,
potwierdzenie etiologii wirusowej uzyskano w 91(20,1%) przypadkach.
DYSKUSJA
„Zakażenia ośrodkowego układu nerwowego są trudnym problemem diagnostycznym
zarówno dla klinicystów jak i mikrobiologów” (2). Dlatego też wydaje się, że wypracowanie
zasad kompleksowej diagnostyki i współpracy między ośrodkami klinicznymi a laboratorium
może przyczynić się do zmniejszenia tych trudności.
Mając na względzie dane epidemiologiczne za rok 2005 (9), należy zwrócić uwagę,
że etiologiczny czynnik aseptycznego zapalenia OUN ustalono jedynie w 3% przypadków
ZOMR i 20% ZM. Przyjmując, że liczba rozpoznawanych przypadków w Polsce jest mniej
więcej stała, należy zaznaczyć, że w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH diagnozowana jest
ich znaczna część (około 25%). Z zebranych danych epidemiologicznych wynika, że za
większość rozpoznanych zakażeń odpowiedzialny jest wirus kzm i HSV (9), co pozostaje
w zgodzie z wynikami prezentowanej tu analizy, gdzie większość zlecanych i potwierdzonych przypadków dotyczyła tych dwóch patogenów.
256
J. Siennicka, A. Trzcińska
Nr 3
Jak wspomniano powyżej, znajomość możliwości diagnostycznych danego laboratorium
jest bardzo istotnym elementem procesu diagnostyki neuroinfekcji. Wiadomo jednocześnie,
że badanie metodą PCR staje się metodą z wyboru w diagnostyce wielu zakażeń wirusowych. W przypadku neuroinfekcji stwierdzenie to jest szczególnie prawdziwe w stosunku
do zakażeń herpeswirusami (1). Należy zauważyć, że zakres badań diagnostycznych wykonywanych w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH obejmuje wykonywanie oznaczeń metodą
PCR dla wszystkich herpeswirusów neurotropowych. Jednocześnie należy zauważyć,
że odsetek potwierdzeń uzyskiwanych w wyniku badania metodą PCR wyniósł jedynie
6,3%. Jednocześnie odsetek potwierdzeń etiologicznego udziału HSV w neuroinfekcji
uzyskanych na drodze oznaczania miejscowej syntezy wirusowo-swoistych przeciwciał
klasy IgG w OUN wyniósł 14,4%. Należy zaznaczyć, że diagnostyka oparta o wyznaczanie
wartości współczynnika AI, w świetle opracowanych pierwotnie przez Tourtellotte (10)
i rozwiniętych przez Reibera (7) zasad wymaga ilościowego wyznaczenia 2-3 parametrów
w 2 materiałach diagnostycznych – równoczasowo pobranej surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym. Taki sposób diagnostyki ma niewątpliwie duże znaczenie w przypadku
zakażeń herpeswirusowych, w których seroprewalencja jest bardzo wysoka, a ze względu
na zdolność tych wirusów do ustalania latencji, możliwe są częste zakażenia nawrotowe.
Natomiast w przypadku zakażeń takich jak kzm, przyjęto, że obecność przeciwciał klasy IgM
w surowicy pacjenta wykazującego zespół objawów neurologicznych jest wystarczającym
dowodem na udział tego patogenu w obserwowanym procesie patologicznym. Podobne
kryteria rozpoznania przyjęto w stosunku do zakażeń, dla których w momencie opracowywania niniejszej analizy niedostępne były wyniki badania metodą PCR. Doceniając zalety
metody PCR należy jednakże mieć na względzie również jej ograniczenia. I tak na przykład,
pozytywny wynik badania zarówno dla EBV, jak i HHV-6 należy interpretować ostrożnie,
ze względu na możliwość obecności materiału genetycznego tych patogenów w pmr bez
bezpośredniego związku przyczynowo-skutkowego zakażenia z obserwowanym stanem
patologicznym (1,2,3). Ponadto, przy zlecaniu a następnie interpretacji wyników (np. PCR
versus intratekalna synteza IgG) zawsze należy brać pod uwagę czas trwania zakażenia,
mając na względzie fakt, że oznaczanie syntezy wirusowo-swoistych przeciwciał w OUN ma
wartość retrospektywną. Niektórzy autorzy (4) zalecają równoległe wykonywanie oznaczeń
metodą PCR i określania intratekalnej syntezy w celu zwiększenia prawdopodobieństwa
określenia czynnika etiologicznego zakażenia.
Znamiennym wydaje się fakt znacznie wyższego odsetka rozpoznania wirusowego
czynnika etiologicznego w przypadku zlecenia badania w kierunku określonego patogenu niż
w sytuacji, kiedy zlecano wykonanie oznaczeń dla 3 i więcej wirusów (14,8% versus 10,9%),
podobnie jak w przypadku badania jedynie pmr w porównaniu do wyników uzyskiwanych
na podstawie oznaczeń prowadzonych w parze materiałów (4,7% versus 20,1%).Wpływ
na wyniki w tym ostatnim przypadku miał przede wszystkim zakres zlecanych badań. Jako
że obecność przeciwciał klasy IgG w pmr sama w sobie jest mało informatywna, zlecenie
oznaczenia obecności jedynie przeciwciał (co dotyczyło połowy przypadków, w których
badaniu podlegał tylko pmr) należy uznać za nieporozumienie.
Osobnego omówienia wymagają przypadki współistnienia zakażeń. W prezentowanej
analizie sytuacja ta dotyczyła 2 pacjentów. W surowicy pierwszego pacjenta, 21-letniej
osoby pochodzącej z Rzeszowa, stwierdzono obecność przeciwciał klasy IgM zarówno
dla HSV, jak i wirusa odry, przy równoczesnej obecności IgG w surowicy i nieobecności
Nr 3
Diagnostyka zakażeń wirusowych OUN
257
przeciwciał tej klasy dla obu wirusów w płynie mózgowo-rdzeniowym. Prawdopodobnym
wytłumaczeniem tego faktu, może być supresyjne działanie wirusa odry (5), co mogło być
przyczyną reaktywacji zakażenia HSV. W drugim przypadku, u pacjenta w wieku 38 lat
z Warszawy stwierdzono intratekalną syntezę przeciwciał anty-HSV (AI=1,69) oraz obecność przeciwciał klasy IgM anty-VZV w surowicy. Nie wykonywano oznaczeń metodą
PCR. Podobne przypadki były opisywane w literaturze. Schulze i wsp. (8), którzy poddali
retrospektywnej analizie wyniki badania 1155 par materiałów (pmr/surowica) stwierdzili,
że znaczny odsetek pacjentów, u których potwierdzono zakażenie VZV i/lub HSV (na
podstawie oznaczeń inratekalnej syntezy IgG) wykazuje pozytywny wynik syntezy dla obu
patogenów (11 z 55 pacjentów). Stwierdzona u omawianego pacjenta koinfekcja mogła być
wynikiem załamania odporności na skutek zakażenia VZV, lub stanem po przebyciu, nawet
w odległej przeszłości neuroinfekcji o etiologii HSV.
PODSUMOWANIE
1. Diagnostyka laboratoryjna neuroinfekcji z podejrzeniem etiologii wirusowej wymaga
ścisłej współpracy ośrodka klinicznego z laboratorium.
2. Przesłanie do badania pary materiałów (płyn mózgowo-rdzeniowy i równoczasowo
pobrana surowica) w znacznym stopniu zwiększa prawdopodobieństwo określenia
czynnika etiologicznego.
3. Zakres zlecanych oznaczeń (np. synteza przeciwciał w OUN versus PCR) powinien
uwzględniać dynamikę procesu chorobowego.
J. S ie n n ic k a , A . Trz c i ńska
CENTRAL NERVOUS SYSTEM VIRAL INFECTIONS – ANALYSIS OF ROUTINE
LABORATORY RESULTS
SUMMARY
The most of registered in Poland cases of encephalitis and meningitis have viral aetiology. Confirmation of viral central nervous system (CNS) infection and diagnosis of pathogenic agent is critical
for therapeutic treatment, especially if antiviral chemotherapy is available. The aim of this work was
analysis of routine laboratory results obtained in Laboratory of Department of Virology NIZP-PZH
by examination of materials obtained from 82 medical canters in Poland in aim of CNS infection
confirmation. Materials, cerebrospinal fluid (CSN) n=277, and CSN together with serum (n=452) were
obtained from patients aged from 3 days to 83 years. Accordingly with the range of tests performed
in Laboratory of Department of Virology NIZP-PZH, obtained samples were examinated for 11 viral
infections: HSV, CMV, EBV, VZV, HHV-6, HHV-7, TBE, measles, mumps, rubella and enteroviruses.
Confirmation of viral infection was obtained in 104 out of 729 tested patients (14,3%). The highest
number of confirmations was obtained in case of TBE infection (18,4%) and HSV (9,2%). The methods
gave the highest number of confirmations were testing of intrathecal IgG synthesis (14,4%) and presence of IgM in serum (10,3%). If test was conducted only with CSF, confirmation of viral infection
was obtained in 13 cases (4,7%). In conclusions it was ascertained that testing CSF and serum samples
together greatly increase possibility of etiological agent detection and a range of ordered tests (i.e.
intrathecal synthesis versus PCR) should account dynamics of pathological process.
258
J. Siennicka, A. Trzcińska
Nr 3
PIŚMIENNICTWO
1. Bovin G. Diagnosis of herpesvirus infections of central nervous system. HERPES.. 2004; 11(Suppl
2): 48-56.
2. Calvario A, Bozzi A, Scarasciulli M i inni. Herpes Consensus PCR test: a useful diagnostic approach to the screening of viral diseases of the central nervous system. J Clin Virol. 2002;25
(Suppl 1):71-8.
3. Davies NW, Brown LJ, Gonde J i inni. Factors influencing PCR detection of viruses in cerebrospinal
fluid of patients with suspected CNS infections. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2005;76(1):827.
4. Fomsgaard A, Kirkby N, Jensen IP, Vestergaard BF. Routine diagnosis of herpes simplex virus
(HSV) encephalitis by an internal DNA controlled HSV PCR and an IgG-capture assay for intrathecal synthesis of HSV antibodies. Clin Diagn Virol. 1998;9:45-56.
5. Kerdiles YM, Sellin CI, Druelle J, Horvat B. Immunosuppression caused by measles virus: role
of viral proteins. Rev Med Virol. 2006;16:49-63.
6. Lipkowski D. Wirusowe zakażenia ośrodkowego układu nerwowego. W: Choroby zakaźne
i pasożytnicze. Red. J. Cianciara, J. Juszczyk. Czelej sp. z o.o. 2007, str:212-221.
7. Reiber H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier
function and to dysfunction in neurological diseases. J Neurol Sci. 1994;122:189-203.
8. Schultze D, Weder B, Cassinotti P i inni. Diagnostic significance of intrathecally produced herpes
simplex and varizella-zoster virus-specific antibodies in central nervous system infections. Swiss
Med Wkly. 2004;134:700-4.
9. Stefanoff P, Rosińska M. Zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenia mózgu w 2005.
Przegl Epidemiol. 2007; 61:225-34.
10. Tourtellotte W. On cerebrospinal fluid immunoglobulin-G (IgG) quotients in multiple sclerosis
and other diseases. A review and a new formula to estimate the amount of IgG synthesized per
day by the central nervous system. J Neurol Sci. 1970;10:279-304.
Otrzymano: 21 VII 2008 r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24,
Zakład Wirusologii NIZP-PZH