Metody detekcji i identyfikacji
bakterii
Dorota Żabicka
Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej
Narodowy Instytut Leków Warszawa
Budowa komórki bakteryjnej
Badanie mikrobiologiczne

Cel:
identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia
i oznaczenie wrażliwości na antybiotyki

Tok badania mikrobiologicznego


Pobranie materiału
Badanie materiału:


Metody klasyczne
 Badanie mikroskopowe
 Hodowla i identyfikacja drobnoustroju
 Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki
 Metody immunologiczne
Metody molekularne
Pobieranie i przesyłanie
materiału
Rodzaj podłoża transportowego
i rodzaj pojemników są
dostosowywane do rodzaju
materiału i kierunku badania
(bakterie, wirusy, obecność
przeciwciał)
Badanie mikroskopowe
Mikroskop świetlny
 Preparaty barwione
 metoda Grama
 metody specjalne np.
barwienie na obecność
zarodników

Laseczka tężca
Clostridium tetani,
zarodniki na końcu
komórki bakteryjnej
nadające kształt
pałeczki dobosza
Ściana komórkowa bakterii
Bakterie Gram-dodatnie
Bakterie Gram-ujemne
Badanie mikroskopowe
Neisseria meningitidis
Preparat z osadu płynu mózgowordzeniowego barwiony metodą Grama
Cryptococcus neoformans
Preparat tuszowy z osadu płynu
mózgowo-rdzeniowego
Badanie mikroskopowe

Preparat z ciemnym
polem widzenia
(Treponema pallidum)
 Mikroskop
fluorescencyjny
Badanie mikroskopowe
Mikroskop kontrastowo-fazowy
grzyby z rodzaju Candida
Badanie mikroskopowe
Mikroskop elektronowy
Hodowla bakterii

Stosowane podłoża bakteriologiczne płynne i
stałe

Hodowla prowadzona w warunkach
najbardziej odpowiednich dla poszukiwanych
drobnoustrojów

Czas hodowli od kilku godzin (np. pałeczki
okrężnicy czyli Escherichia coli) do kilkunastu
dni (np. prątki gruźlicy czyli Mycobacterium
tuberculosis)
Wymagania wzrostowe bakterii

Zapotrzebowanie na tlen




Źródło węgla



Tlenowe – O2
Beztlenowe – mniej niż 1-0,5% O2
Mikroaerofilne – mieszanina 5% O2, 10% CO2,
85% N2
Autotroficzne – CO2
Heterotroficzne – aminokwasy, peptydy, cukry,
lipidy
Pozostałe związki niezbędne do wzrostu


Sole nieorganiczne
Witaminy
Czynniki fizykochemiczne

Temperatura




pH


Psychrofile – optimum 0-10C
Mezofile – optimum 20-40C
Termofile – optimum 50-60C
Większość bakterii preferuje neutralne wartości
pH ~ 7.0
Ciśnienie osmotyczne

Wiekszość preferuje aw ~ 0,99
Wzrost hodowli bakterii w podłożu
płynnym
Hodowla i identyfikacja
drobnoustrojów
Podłoże agarowe wzbogacone krwią – widoczna strefa
hemolizy dookoła kolonii
Hodowla i wstępna identyfikacja
drobnoustrojów
CPS
Podłoża wybiórcze,
wybórczo-różnicujące
chromogenne i specjalne
MacConkey agar
Oznaczanie mechanizmów oporności na
antybiotyki – podłoża chromogenne
MRSA
ESBL
VRE
Hodowla i identyfikacja
drobnoustrojów
Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem testów
wykonywanych na płytkach
wrażliwość na bacytracynę
test CAMP
Hodowla i identyfikacja
drobnoustrojów
Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem
zestawów probówkowych
gotowych testów
identyfikacyjnych
Systemy automatyczne
Systemy automatyczne stosowane są
do hodowli drobnoustrojów
(np. Bactec do posiewów krwi) lub
do identyfikacji i oznaczenia
lekowrażliwości wyhodowanych
wcześniej na podłożach stałych
drobnoustrojów
VITEK 2 Compact BioMerieux
Phoenix BD Diagnostic Systems
System VITEK 2 Compact
System automatyczny do identyfikacji i oznaczenia
lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych wcześniej
na podłożach stałych
Oznaczenie lekowrażliwości
drobnoustrojów

Oznaczanie metodą
rozcieńczeniową
 Gotowe testy
diagnostyczne do
odczytu manualnego
 Oznaczanie za
pomocą systemów
automatycznych
Oznaczanie lekowrażliwości i mechanizmów
oporności na antybiotyki
Dyfuzja z
krążka
Podłoże z
antybiotykiem
Dyfuzja
z paska
Szczep gronkowca
złocistego
(Staphylococcus aureus)
oporny na wszystkie
antybiotyki -laktamowe
(MRSA)
Metody immunologiczne

Testy lateksowe, ELISA,
immunofluorescencyjne
wykrywające całe komórki lub
antygeny bakterii (białka
powierzchniowe, wielocukry
otoczkowe, toksyny)
 Pozwalają wykryć bakterie w
materiale pobranym od
chorego lub pomagają w
identyfikacji wyhodowanych
bakterii
 Stosowane gotowe testy
manualne lub automatyczne
Aglutynacja lateksowa
Metody immunologiczne - EIA
Metody immunologiczne – systemy
automatyczne
System VIDAS
Nowe metody oparte o metody
immunologiczne
Spektrometria MALDI-TOF
Spektrometria MALDI-TOF
Spektrometria MALDI-TOF
Metody molekularne
Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub
real-time PCR
 Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch
wariantach
 Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja
w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR
 Zestawy odczynników lub zamknięte systemy
diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie
określonej firmy
 Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis
jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii
np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych

Genom bakteryjny
Chromosom bakteryjny o różnej wielkości w zależności od
gatunku bakterii oraz obecności wbudowanych elementów
ruchomych (plazmidów, transpozonów, bakteriofagów)
Metoda PCR
DNA
Ruler 100
6018/99
6758/99
ATCC43300
ATCC 29213
Ruler100
Metoda PCR
mecA
ok. 550 kb
mecA gen występujący
u MRSA
Real-time PCR
Krzywe reakcji real-time PCR
Szybkie testy molekularne np.
GeneXpert
Sondy typu Scorpion
Dwa rodzaje sond typu Scorpion
stosowane w testach z serii GeneXpert
rysunki: źródło Cepheid
Zintegrowana kontrola wewnętrzna w
mieszaninie reakcyjnej
Mg
2+
target scorpion
Taq DNA Polymerase
IC scorpion
dCTP
dGTP
dUTP
Internal Control
(IC)
dATP
rysunki źródło Cepheid
Mikromacierze
Bakteriofagi – wirusy bakteryjne
Bakteriofagi - morfologia
Bakteriofagi – cykle życiowe
Bakteriofagi – zastosowanie w
diagnostyce

Typowanie bakterii w celu określenia
pokrewieństwa izolowanych szczepów
łysinka
Bakteriofagi – zastosowanie w
detekcji i identyfikacji bakterii
Bakteriofagi – zastosowanie w
detekcji i identyfikacji bakterii
Bakteriofagi – zastosowanie w
detekcji i identyfikacji bakterii
Dziękuję za uwagę
Download

Metody detekcji i identyfikacji bakterii