Genetyka dla (trochę) zaawansowanych I

Genetyka dla (trochę)
zaawansowanych I
Podstawowe pojęcia, mutacje, komplementacja
Podręcznik
 
“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome”
RS Hawley, M Walker
Czym jest genetyka?
 
Badanie mechanizmów dziedziczenia i powstawania
dziedzicznej zmienności
 
 
 
 
Mechanizmy dziedziczenia i kodowania cech fenotypowych
Molekularne mechanizmy działania genów
Współdziałanie genów w tworzeniu fenotypu (interakcje
genetyczne)
Naturalna i sztuczna zmienność genetyczna
Czym jest genetyka?
 
Genetyka “klasyczna” i “molekularna”
 
 
Badanie dziedziczenia określonych cech i ich zestawów
(klasyczne)
Biologia molekularna genu
We współczesnej genetyce podział ten uległ zatarciu –
istotne są stawiane pytania, a nie stosowane metody.
Dwa oblicza genetyki
 
Pytania o mechanizmy dziedziczenia i funkcjonowania
genów
 
 
Wykorzystanie wiedzy o funkcjonowaniu genów do
badania wszelkich procesów biologicznych (biologia
molekularna)
 
 
 
Genetyka sensu stricto
Ogromna część biochemii, biologii komórki
Znaczna część neurobiologii, fizjologii
Genetyka jako narzędzie to też np.
 
 
Medycyna
Ekologia
Czy to wciąż genetyka?
 
 
 
Użycie genu dla wyprodukowania białka do badań
enzymologicznych
Porównywanie genów dla ustalenia filogenezy
itp.
Trudno obecnie znaleźć dział biologii, w którym nie sięga sie
do poziomu genu.
Genetyka jest to sztuka izolowania, identyfikowania i badania
mutantów.
Podstawowe koncepcje genetyki
 
 
 
 
 
Mutacja
Komplementacja
Interakcje genetyczne
Rekombinacja
Regulacja
Genomika, biologia systemów
 
 
Genomika – badanie na skale całych genomów zjawisk,
którymi na poziomie pojedynczych genów i procesów
zajmuje się genetyka i biologia molekularna
Biologia systemów – m. in. badanie interakcji (w tym
genetycznych) na skalę całych systemów biologicznych
Podstawowe pojęcia
 
Informacja genetyczna
Przekazywana z podziałem komórki informacja umożliwiająca
odtworzenie całej struktury komórkowej.
 
Materiał genetyczny
Nośnik fizyczny informacji genetycznej. W komórkach jest nim
DNA.
 
Kod genetyczny
Mechanizm przełożenia informacji genetycznej zapisanej w
sekwencjach DNA i RNA na sekwencję aminokwasową białka.
Zasadniczo taki sam u wszystkich organizmów żywych.
Mylenie pojęć
10
Czy genetyka klasyczna ma dziś znaczenie?
 
Wciąż aktualne metody:
 
 
 
 
 
 
Izolacja i charakterystyka mutantów
Test komplementacji
Interakcje genetyczne! – jedna z podstaw biologii systemów
Konstrukcje organizmów (głównie mikroorganizmy) przez
odpowiednio dobrane krzyżówki
Dziedziczenie mendlowskie w medycynie – poradnictwo
genetyczne. Metody probabilistyczne
Metody częściowo historyczne
 
Mapowanie genów przez rekombinację
 
 
Wyjątkiem genetyka człowieka, gdzie wciąż stosowane do
zlokalizowania mutacji odpowiadającej za fenotyp na chromosomie
Znaczenie historyczne
 
 
Krzyżówki wewnątrzgenowe dla mapowania miejsc mutacji
Mapowanie genetyczne u mikroorganizmów
Mutacje
12
Mutacja
 
Trwała, przekazywana przy replikacji zmiana sekwencji
nukleotydowej w materiale genetycznym
 
13
Nie każde uszkodzenie DNA jest mutacją – staje się nią
dopiero po utrwaleniu i przekazaniu do cząsteczki (lub
cząsteczek) potomnych
Mutacje jako źródło nowych alleli
 
“Dziki” allel – najczęściej spotykany w populacji
fenotyp
 
 
Dawniej uważano, że naturalne popoulacje są jednorodne
genetycznie, obecnie raczej kwestia umowy
Notacja:
 
 
14
mutacja recesywna a, allel dziki a+ (albo +a),
  genotypy a+/a+ ; a+/a; a/a
mutacja dominująca A, allel dziki (recesywny) A+
  genotypy A+/ A+; A+/A; A/A
Przykłady mutantów Drosophila
w/w
w+/w+ albo w+/w
15
16
Mutacje rozwojowe
 
Antennapedia
17
Mutacje rozwojowe
 
Ultrabithorax
18
Mutacje Drosophila
19
Powstawanie mutacji
 
Losowe (spontaniczne)
 
 
powstają przypadkowo, środowisko może wpływać na
częstość (np. mutageny) mutacji, ale nie na to, w którym
genie zachodzą
Adaptacyjne (indukowane)
 
20
powstają w odpowiedzi na czynnik selekcyjny
Test fluktuacyjny
 
Luria i Delbrück 1943
indukowane
21
spontaniczne
• Pojawianie się mutantów E. coli opornych na faga
T1
• Jeżeli pojawiają się w odpowiedzi na kontakt z
fagiem, to fluktuacje liczby opornych kolonii z każdej
hodowli będą niewielkie
• Jeżeli pojawiają się spontanicznie, to liczba
opornych kolonii będzie zmienna, zależnie od tego,
kiedy w hodowli pojawił się mutant
• Założenie – w nieobecności faga mutacja jest
obojętna (neutralna)
Mutacje
Poziom molekularny DNA
 
Podstawienia (punktowe)
 
Tranzycje
 
 
Transwersje
 
 
 
zmiana puryny w purynę, pirymidyny w pirymidynę
zmiana puryny w pirymidynę i vice versa
Delecje i insercje
Rearanżacje na dużą skalę
23
Mutacje – poziom kodu genetycznego
 
Podstawienia
 
Niesynonimiczne
 
 
 
 
Synonimiczne (ciche)
Zmiany fazy odczytu
 
 
Zmiany sensu (missense)
Nonsens (nonsense)
zmienia sekwencję i/lub długość kodowanego białka poniżej
miejsca wystąpienia
Delecje lub insercje w białku
 
 
 
24
delecje lub insercje wielokrotności 3 nukleotydów
delecje lub insercje eksonów
Deficjencja – rozległa delecja, np. obejmująca cały gen
Mutacje – efekty fenotypowe
 
Klasyfikacja Mullera
 
 
 
 
 
25
nullomorfy
hipomorfy
hipermorfy
antymorfy
neomorfy
Nullomorfy
 
 
 
Brak jakiejkolwiek funkcji genu
Tzw. allele null, inna nazwa: amorfy
Nullomorfy:
 
 
 
 
 
transkrypcyjne (brak transkryptu)
translacyjne (brak białka wykrywalnego przeciwciałem)
inaktywacyjne (obecne białko, ale całkowicie nieaktywne)
najpewniejszy sposób na uzyskanie nullomorfa – deficjencja
(pełna delecja)
Często recesywne
 
26
Dominacja (lub kodominacja) w przypadku efektu ilości
białka - haploinsuficjencja
Haploinsuficjencja
 
 
Efekt ilościowy
Zbyt mała ilość produktu genu w heterozygocie, pojedynczy
dziki allel nie wystarcza
 
 
całkowita: mutacja dominująca
częściowa: kodominacja
Heterozygota wytwarza czerwony barwnik, ale w mniejszej ilości
27
Hipomorfy
 
 
Obniżona aktywność produktu, niewystarczająca do
uzyskania dzikiego fenotypu homozygoty
Obniżenie ilości produktu lub produkt o obniżonej
aktywności
 
Np.
 
 
 
obniżona transkrypcja, splicing, stabilność, translacja
obniżona aktywność katalityczna
Często recesywne
28
Hipomorfy vs. nullomorfy
 
 
 
 
 
 
Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana
mutacja
Deficjencja jest zawsze nullomorfem
Jeżeli genotyp m/Df daje cięższy fenotyp niż m/m, to m
jest hipomorfem, jeżeli taki sam, to nullomorfem
Wprowadzenie kolejnych kopii allelu m daje fenotyp
coraz lżejszy, przy nullomorfach – bez różnicy
Uzyskanie hipomorfa zamiast nullomorfa może utrudnić
analizę fenotypu, ale...
Hipomorfy mogą być jedynym sposobem na badanie
ważnych genów
29
Hipermorfy
 
Fenotyp wynika z:
 
 
 
 
 
nadmiaru produktu genu (np. nadekspresja)
nadmiernie wysokiej aktywności produktu
Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana
mutacja
Fenotyp m/+ cięższy niż m/Df; zwykle też m/m cięższy
od m/+
Prosty sposób uzyskania – gen na plazmidzie w wielu
kopiach (np. drożdże)
30
Antymorfy
 
 
 
 
 
Zmutowany produkt ma działanie antagonistyczne
wobec dzikiego
Fenotyp podobny do fenotypu nullomorfa lub
hipomorfa, ale z definicji dominujący
Zwiększenie dawki allelu dzikiego może osłabić
(odwrócić) fenotyp
Możliwe odwrócenie (pseudorewersja) przez kolejną
mutację znoszącą ekspresję zmutowanego allelu
Inny termin – mutacje dominujące negatywne
(dominant negative)
31
Antymorfy
 
Mutacje w genach podjednostek tubuliny blokujące
polimeryzację
“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003
32
Antymorf – zespół Marfana
 
 
 
 
Dominująca mutacja w genie FBN1 kodującym
fibrylinę – białko tkanki łącznej
Zmutowane białko blokuje polimeryzację białka
prawidłowego
Defekty tkanki łącznej, aorty i zastawek serca, wysoki
wzrost, arachnodaktylia
Ok. 1:5 000 osób
33
Neomorfy
 
Aktywność genu w niewłaściwym miejscu lub czasie
 
 
 
np. mutacje heterochroniczne (ekspresja w niewłaściwym
czasie)
Przykład: chłoniak Burkitta: translokacja fragmentu
chromosomu 8 na 14 przenosi gen c-myc pod kontrolę
silnego promotora IGHα aktywnego w limfocytach
Niewłaściwa aktywność, ale nie toksyczna dla
produktu dzikiego
 
 
34
Wiele mutantów regulatorowych
Np. białko pozbawione domeny odpowiadającej za regulację
aktywności, konstytutywnie aktywne
Neomorf
 
 
 
Antennapedia (Antp73b)
Sekwencja genu Antp przeniesiona w pobliże
promotora genu ulegającego ekspresji w głowie
Rozwój odnóży na segmencie głowowym
35
Inne terminologie
 
Mutacje utraty funkcji (loss-of-function)
 
 
Mutacje nabycia funkcji (gain-of-function)
 
 
neomorfy i hipermorfy w klasyfikacji Mullera
Mutacje dominujące negatywne
 
 
 
nullomorfy i hipomorfy w klasyfikacji Mullera
antymorfy
niekiedy zaliczane do “nabycia funkcji” albo “utraty funkcji”
– częste niejednoznaczności
Mutacje letalne – mogą należeć do którejkolwiek z
powyższych klas, definiowane przez fenotyp
36
Mutacje utraty funkcji
 
 
 
Null – całkowita utrata funkcji. Np. deficjencja.
Częściowa utrata funkcji (hipomorf). Dotyczy poziomu
produktu lub jego aktywności.
Warunkowe
 
 
37
np. temperaturo-wrażliwe – utrata aktywności tylko w
warunkach restrykcyjnych - np. podwyższona (ts) lub
obniżona (cs) temperatura.
Ważne narzędzie do badania genów, w których mutacje null
są letalne
Mutacje letalne
 
Badane za pomocą alleli warunkowych
 
 
uzyskiwanych naturalnie (poszukiwanie mutantów np. ts)
konstruowanych, przykłady dla drożdży:
 
 
 
38
reprymowalne promotory (np. tet-off)
fuzje z sekwencją peptydową powodującą degradację białka w
podwyższonej temperaturze (degron)
uszkodzenia w sekwencji 3’ UTR mRNA: DAmP (decreased
abundance by mRNA perturbation)
Allele letalne
wt (agouti)
agouti × agouti 
AA × AA  AA
 
same agouti
agouti × yellow 
mutant yellow
½ yellow i ½ agouti
AA × AAY  A AY; AA
yellow × yellow 
2/3 yellow i 1/3 agouti
YAY; 2 A AY; 1 AA
AAY × AAY  1 AX
Allel AY – dominujący pod względem koloru, recesywny letalny
Dominacja i recesywność
 
Dominację i recesywność należy rozpatrywać pod
kątem
 
konkretnego fenotypu
 
 
np. u myszy allel AY – dominujący pod względem koloru,
recesywny letalny
poziomu organizacji (komórka vs. organizm)
 
np. supresory nowotworów (p53, Rb)
Na poziomie komórkowym recesywne – komórka z jednym allelem
dzikim funkcjonuje prawidłowo
  Na poziomie organizmu (rodowody) dominujące – u heterozygot rozwija
się zespół chorobowy częstego występowania rzadkich nowotworów
(zespół Li-Fraumeni, retinoblastoma)
 
 
40
u heterozygot prawdopodobieństwo zmutowania jedynej pozostającej kopii w
jednej z bardzo wielu komórek i rozwinięcia się nowotworu jest wysokie
Dominacja i recesywność
 
Mutacje nullomorficzne i hipomorficzne (utraty funkcji) z
reguły są recesywne
 
 
 
Jeden allel pozostaje aktywny i wytwarza produkt. Ilość produktu
(enzymu) nie jest limitująca (limituje zwykle substrat)
Ponieważ są to najczęstsze mutacje, to większość izolowanych
mutacji jest recesywna
Wyjątek: haploinsuficjencja
 
 
 
 
 
41
Jedna kopia (allel) nie wystarcza do zapewnienia odpowiedniej
ilości produktu
Np. białka rybosomalne
Mutant Minute u Drosophila: heterozygota – opóźniony rozwój,
anomalie rozwojowe; homozygota – letalna
U drożdży stwierdzono dla około 3% (~200) genów
Zdarza się haploinsuficjencja warunkowa – heterozygota objawia
fenotyp tylko w konkretnych warunkach środowiska
Haploinsuficjencja
 
 
 
Rodzinna hipercholesterolemia
Mutacje w genach LDLR (receptor LDL – low density
lipoprotein) i ApoB (apolipoproteina B – część
kompleksu LDL odpowiedzialna za oddziaływanie z
receptorem)
Heterozygoty: podwyższony poziom LDL we krwi,
miażdżyca, choroby serca ok. 40 r. życia
 
 
leczenie: statyny, dieta
Homozygoty: ciężkie schorzenia serca i naczyń już w
dzieciństwie
 
42
leczenie: trudne, wysokie dawki statyn, przeszczep wątroby
Haploinsuficjencja warunkowa
 
Anemia sierpowata
 
 
 
43
Mutacje w genie β-globiny
Choroba recesywna, ale w warunkach niskiego ciśnienia
(wysoko w górach) heterozygoty chorują – warunkowa
haploinsuficjencja
Dodatkowy fenotyp – oporność na malarię, fenotyp
dominujący
Mutacje dominujące
 
 
 
 
Haploinsuficjencja nullomorfów i hipomorfów
Hipermorfy
Antymorfy – więcej kopii allelu dzikiego może odwrócić
fenotyp
Neomorfy
44
Rewersja i pseudorewersja
 
 
Rewersja: mutacja powrotna, w tej samej pozycji
przywraca dziki allel
Pseudorewersja: mutacja w innej pozycji tego samego
genu przywraca dziki fenotyp
 
45
Np. mutacja blokująca (całkowicie lub częściowo) ekspresję
dominującego allelu antymorficznego lub neomorficznego
może przywrócić dziki fenotyp heterozgoty
Rewersja
UAU -> UAA -> UAC
tyr
stop
tyr
UGG -> UGA -> CGA
trp
stop
arg
 
 
Dotyczy tego samego kodonu, ale nie musi przywracać
tego samego aminokwasu, może dotyczyć tego samego
lub innego nukleotydu
Podstawienia często rewertują, ale rozległe delecje nigdy
46
Pseudorewersja
 
 
“Supresja wewnątrzgenowa”
Specyficzna względem allelu
 
 
Narzędzie do badania oddziaływań między aminokwasami
wewnątrz białka
Np. w syntazie tryptofanu:
mutacja
pseudorewersja
backcross
Gly210 -------> Glu210 ---------> Glu210 Cys174 ---------> Gly210 Cys174
aktywna
 
aktywna
nieaktywna
Niespecyficzna względem allelu
 
 
nieaktywna
Zmienia ogólne własności białka niwelując efekt pierwszej mutacji
(np. silniejsze wiązanie substratu, większa stabilność itp.)
Pseudorewersja mutacji antymorficznych – generuje allel
null (recesywny), przywraca dziki fenotyp heterozygocie
47
Komplementacja
Komplementacja
 
 
Wiele mutacji dających taki sam, lub podobny fenotyp
Czy są to mutacje w tym samym genie, czy w różnych
Komplementacja
trans
a
cis
b+
a+
b+
=====
======
a+ b
a
b
Test komplementacji zwany też testem cis-trans:
Tylko w układzie trans da odpowiedź – w układzie cis
zawsze fenotyp dziki
Komplementacja
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Komplementacja
 
 
 
white i cherry to allele tego samego genu
white i garnet to allele w różnych genach
Ile jest genów w tym doświadczeniu? Który gen ma wiele alleli?
Test komplementacji
 
 
Dotyczy alleli recesywnych
Jeżeli heterozygota trans ma fenotyp bliższy
fenotypowi recesywnemu niż hetrozygota cis, to
mutacje są w tym samym cistronie
m1 + m1 m2
>
Silniejszy fenotyp mutanta
+ m2
+
+
 
 
Fenotyp bliższy dzikiemu
Porównanie cis i trans pozwala wykluczyć efekt podwójnej haploinsuficjencji
€ ilości produktów dwóch genów może dać fenotyp, którego nie da
(zmniejszenie
zmniejszenie ilości produktu pojedynczego genu)
Test komplementacji dotyczy funkcji genu, nie daje informacji o pozycji mutacji.
  Stwierdzenie, czy dwie mutacje, ktore nie komplementują są w różnych
miejscach – krzyżówka wewnątrzgenowa
Cistron
 
Eksperymenty Benzera na bakteriofagach
Łysinki fagowe
Cistron
 
Mutacje w obrębie tego samego cistronu nie komplementują
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Mapowanie struktury genu
Delecje w mapowaniu
Mapa obszaru rII faga T4
Odkrycie liniowej struktury genu
Komplementacja wewnątrzgenowa
 
Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans
komplementują
 
 
Mutacje w dwóch niezależnych domenach białka
Transwekcja – jedna z mutacji w elemencie regulatorowym,
który może działać w układzie cis (np. enhancer)
 
Wymaga parowania chromosomów homologicznych w komórkach
somatycznych w interfazie – nie u wszystkich organizmów.
Obserwowane głównie u Drosophila
“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003
59