Wykład III
Nośniki chemiczne plazmidowego DNA
Metody transfekcji
Fizyczne
1. Mikroiniekcja
2. Ekektroporacja
3. Biolistyczne (strzelba genowa)
Chemiczne
1. DEAE-dextran
2. Ca2+
3. Liposomy
- wiriosomy
4. Polipleksy
Wirusowe
1. Adenowirusowe
2. AAV
3. Retrowirusy
4. Lentiwirusy
5. Inne
Rodzaje chemicznego wspomagania
1.
2.
3.
4.
Czynniki chroniące DNA przed nukleazami
Czynniki nakierowujące wektory na konkretne komórki
Czynniki zwiększające dostarczania DNA do cytozolu lub jądra
Czynniki umożliwiające długotrwałe lub kontorlowane uwalnianie DNA
Wektory
Plazmidowe
„nagi” DNA
Kompleksy
ze związkami
kationowymi
Wirusowe
RNA
Retrowirusy
(w tym lentiwirusy)
Kompleksy
z białkami osłonek
wirusowych
DNA
Adenowirusy
AAV
Wirus Herpes
Nośniki chemiczne plazmidowego DNA
Jony Ca2+
DEAE-dekstran
Lipidy
i lipsomy
Związki wielkocząsteczkowe
Polipeptydy
Polimery
dendrymery
Warunki udanego transferu genów do komórek
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Dotarcie DNA do powierzchni komórki
Związanie się kompleksu zawierającego DNA do błony komórkowej
Przejście kompleksu przez błonę
Przejście DNA przez cytoplazmę
Wejście DNA do jądra komórkowego
Umiejscowienie się DNA w odpowiednim miejscu w
jądrze komórkowym
Chemiczne metody transfekcji in vitro
DEAE-dextran
diethylaminoethyl dextran
1. DEAE-dekstran jest polimerem kationowym,
2. Używany do transfekcji przejściowych
3. Działa dobrze z pewnymi typami komórek
4.. Pozwala na użycie mniejszych ilości DNA niż transfekcja przy pomocy Ca2+
5. Metoda mało wydajna, zmienna, ale bardziej powtarzalna niż transfekcja ‘
za pomocą jonów wapnia
Transfekcja za pomocą fosforanu wapnia
1. Zmieszanie DNA z chlorkiem wapnia
2. Dodanie w kontrolowany sposób (wkroplenie) do zbuforowanego
roztworu soli fosforanowej
3. Inkubacja mieszaniny w temperaturze pokojowej – utworzenie
precyptitatów (strątów)
4. Pobranie precypitatu przez komórki na drodze endocytozy
lub fagocytozy
Warunki ułatwiające transfekcję za pomocą fosoforanu wapnia
1. Metoda działa skutecznie w wąskim zakresie warunków
2. Tworzenie dużych kryształów ogranicza transfekcję, najlepiej jest,
gdy powstają bardzo drobne cząstki
a) stężenie DNA
b) temperatura – rozpuszczalność fosforanu jest wyższa w niższej
temperaturze
c) czas tworzenie precypitatu przed dodaniem do komórek
d) pH – powyżej 6,9 nie tworzą się kompleksy, w pH 7,0 – bardzo
delikatne i drobne; powyżej – duże kompleksy
ale ... Różne opinie
e) DNA musi być rozpuszczone w wodzie! Bufor Tris zmienia pH
i obniża wydajność transfekcji
Zwiększenie wydajności transfekcji DEAE-dekstranem
lub fosforanem wapnia
-
glicerol
DMSO
chloroquine
sodium butyrate
Etapy rozwoju syntetycznych metod transferu genów
1958 – Alexander et al. Oczyszczony RNA poliowirusa zakaża komórki
1962 – Szybalski &Szybalska – transfer DNA komórkowego – jony
wapnia i spermina
1965 – Vaheri & Pagano – DEAE dextran
1973 – Graham & van der Eb – fosforan wapnia
1979 – Mulligan – transfekcja plazmidu z genem króliczej β-globiny
do komórek nerki małpiej
1982 – Souther & Berg – selekcja komórek opornych na neomycynę
1983 – wektory retrowirusowe pozbawione wirusów pomocniczych
1987 – Felgner – lipsomy kationowe
1987 – Wu & Wu – transfekcja z wykorzystaniem receptorów
(polilizyna)
1988 – Johnson – strzelba genowa
1995 – Boussif et al.poliethylenoimina
1996 – Tang i wsp. dendrymery
Cationic liposomes
DOTMA
General structure of synthetic cationic lipid
TfxTM
DOPE (L-dioleoyl phosphatidylethanolamine)
obojętny fosfolipid
- ułatwia fuzję z błoną komórkową
- ułatwia uwalnianie z endosomu
Lipotransfekcja – warunki in vitro
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Jakość wyizolowanego DNA – wolny od białek, RNA i zanieczyszczeń
chemicznych
Rodzaj komórek
Rodzaj liposomu
Faza wzrostu komórek
Odpowiednie proporcje ilości DNA i liposomu
Warunki hodowli – obecność/brak surowicy
Optymalizacja warunków transfekcji
Lipotransfekcja – procedura in vitro
Wydajność transfekcji za pomocą jonów Ca2+ oraz liposomów
Ca2+ - transfection
Lipotransfection
wyższa wydajność transfekcji
Wydajność transfekcji a rodzaj liposomu
Wydajność transfekcji a ilość liposomu i DNA
Ta sama ilość DNA,
zmienna ilość liposomu
Ta sama ilość liposomu,
zmienna ilość DNA
Wydajność transfekcji a czas inkubacji lipopleksów z komórkami
Wydajność transfekcji a % pokrycia szalki przez komórki
Ekspresja genu a czas po transfekcji
Wydajność transfekcji przy pomocy liposomów kationowych
100%
30%
1, 000,000 plasmids/cell transfected
300,000 plasmid/cell in pellet
5%
50,000 plasmids/cell intracellular
0,3-0,1%
1,000 plasmids/cell intranuclear
Bariery ograniczające skuteczność transfekcji in vivo
I.
Bariery pozakomórkowe
1. Opsoniny
2. Komórki fagocytujące
3. Macierz pozakomórkowa
4. Enzymy trawienne
II. Bariery wewnątrzkomórkowe
1. Błona komórkowa
2. Endosomy/lizosomy
3. Błona jądrowa
Lipotransfekcja
lokalna
systemowa
Lipsomy
ochrona przed degradacją w endosomach i działaniem cytozolu
1. Chloroquine - podnosi pH w endosomach
2. Ominięcie przedziału endosomalnego: podjednostki toksyn Diphteria i Pseudomonas
3. PEG - stabilizuje plazmidowe DNA i chroni przed degradacją przez nukleazy
- ogranicza rozpoznanie przez układ immunologiczny
4. Nuclear targeting
a) bierne przechodzenie plazmidu do jądra – podczas podziału komórki
b) PEI - syntetyczny polimer - chroni DNA w cytoplazmie, ułatwia wchodzenie
do jądra komórkowego
c) wirusowe sygnały lokalizacji jądrowej (viral nuclear localization signal, NLS)
Lipopleksy - problemy ze skutecznością in vivo
1. Brak stabilności
2. Stosunkowo niska wydajność transfekcji
3. Krótkotrwała ekspresja
4. Niespecyficzne interakcje
5. Indukcja procesów zapalnych
składniki liposomów
- niezmetylowane CpG dwunukleotydy
Liposomy - optymalizacja
1. Poprawa właściwości elektrostatycznych
a) odpowiedni dobór lipidów
(np. DOPE - ułatwia opuszczanie liposomów)
b) zróżnicowanie struktury chemicznej lipidów
c) wybór i ilość lipidów obojętnych
d) ostateczny ładunek i proporcja do kwasu nukleinowego
Np. dodanie wzmacniaczy – Effectene
Ligandy zwiększające wydajność transfekcji
1. Peptydy, dla których istnieją specyficzne receptory
komórkowe, np. RGD – oddziaływanie z receptorami
integrynowymi
2. Jądrowe sygnały lokalizacyjne
3. Ligandy wrażliwe na pH, które umożliwiają
opuszczenie endosomów
4. Sferyczne stabilizujące czynniki
5. Wprowadzenie cząstek wirusowych - wiriosomy
HVJ (wirus Sendai)
Zastosowanie liposomów w eksperymentalnej terapii genowej
1. Choroby płuc - mukowiscydoza
a) łatwość dostarczania - aerozol
b) po wstrzyknięciu dożylnym lipopleksy gromadzą się w płucach
2. Nowotwory
3. Hemofilia
4. Choroby układu krążenia – transfer do ściany tętnic, transfer do
mięśni nóg
Nośniki chemiczne plazmidowego DNA
Jony Ca2+
DEAE-dekstran
Lipidy
i lipsomy
Związki wielkocząsteczkowe
Polipeptydy
dendrymery
Polimery
kationowe
Nośniki polipeptydowe
- poli-L-lizyna
- poli-L-ornityna
- białka (protamina)
Nośniki złożone
Gal4-invasin - tworzy kompleksy z PLL i DNA
Zawiera domenę czynnika drożdżowego GAL-4 oraz domenę inwazyny,
białka Yersinia pseudotuberculosis
PEI - polyetyleneimine
1. Syntetyczny polikation, masa ok. 22 kDa
2. W niskim pH endosomów ulega pęcznieniu, co powoduje rozpad
endosomu
3. Zachowuje się jak gąbka protonowa – wzrasta stężenie jonów w
w endosomie, napływ wody do endosomu, liza endosomu,
uwolnienie kompleksu z DNA do cytoplazmy
Inne zastosowania PEI
1. Transfekcja zależna od receptorów – kompleksy PEI/DNA z
inaktywowanym adenowirusem
Zalety niewirusowego sposobu transferu genu
1. Ograniczenie ryzyka mutagenezy insercyjnej
2. Brak ryzyka zakażenia wirusowego
3. Ograniczenie odpowiedzi obronnej (immunologicznej i zapalnej)
organizmu
4. Niższe koszty i czas oczekiwania
Porównanie sposobów transfekcji
AAV
Adenovirus
Broad
Broad
Broad
Established
Difficult
Established
Established
High
Low
Low
Moderate
High
Transduction efficiency
Very low
Low
Low
Moderate
High
Capacity for transgene
Unlimited
4-5 kb
9 kb
4-5 kb
7-10 kb
Low
Low
Low
Non-viral
Retrovirus
Broad
Restricted
Construction system
Simple
Yield (titre)
Host tropism
Cytotoxic response
Duration of expression
Low
Days
Long term
Lentivirus
Long term
Long term
High
weeks-months
Wang Y. & Huang S. 2000. DDT 5: 10.
Rodzaje wektorów/nośników stosowanych
w terapii genowej
Retrowirusowe - 63%
Adenowirusowe - 16%
Lipotransfekcja - 16%
AAV - 6%
Inne - 2%
Download

Nośniki chemiczne plazmidowego DNA