Nośniki chemiczne plazmidowego DNA
advertisement
Wykład III Nośniki chemiczne plazmidowego DNA Metody transfekcji Fizyczne 1. Mikroiniekcja 2. Ekektroporacja 3. Biolistyczne (strzelba genowa) Chemiczne 1. DEAE-dextran 2. Ca2+ 3. Liposomy - wiriosomy 4. Polipleksy Wirusowe 1. Adenowirusowe 2. AAV 3. Retrowirusy 4. Lentiwirusy 5. Inne Rodzaje chemicznego wspomagania 1. 2. 3. 4. Czynniki chroniące DNA przed nukleazami Czynniki nakierowujące wektory na konkretne komórki Czynniki zwiększające dostarczania DNA do cytozolu lub jądra Czynniki umożliwiające długotrwałe lub kontorlowane uwalnianie DNA Wektory Plazmidowe „nagi” DNA Kompleksy ze związkami kationowymi Wirusowe RNA Retrowirusy (w tym lentiwirusy) Kompleksy z białkami osłonek wirusowych DNA Adenowirusy AAV Wirus Herpes Nośniki chemiczne plazmidowego DNA Jony Ca2+ DEAE-dekstran Lipidy i lipsomy Związki wielkocząsteczkowe Polipeptydy Polimery dendrymery Warunki udanego transferu genów do komórek 1. 2. 3. 4. 5. 6. Dotarcie DNA do powierzchni komórki Związanie się kompleksu zawierającego DNA do błony komórkowej Przejście kompleksu przez błonę Przejście DNA przez cytoplazmę Wejście DNA do jądra komórkowego Umiejscowienie się DNA w odpowiednim miejscu w jądrze komórkowym Chemiczne metody transfekcji in vitro DEAE-dextran diethylaminoethyl dextran 1. DEAE-dekstran jest polimerem kationowym, 2. Używany do transfekcji przejściowych 3. Działa dobrze z pewnymi typami komórek 4.. Pozwala na użycie mniejszych ilości DNA niż transfekcja przy pomocy Ca2+ 5. Metoda mało wydajna, zmienna, ale bardziej powtarzalna niż transfekcja ‘ za pomocą jonów wapnia Transfekcja za pomocą fosforanu wapnia 1. Zmieszanie DNA z chlorkiem wapnia 2. Dodanie w kontrolowany sposób (wkroplenie) do zbuforowanego roztworu soli fosforanowej 3. Inkubacja mieszaniny w temperaturze pokojowej – utworzenie precyptitatów (strątów) 4. Pobranie precypitatu przez komórki na drodze endocytozy lub fagocytozy Warunki ułatwiające transfekcję za pomocą fosoforanu wapnia 1. Metoda działa skutecznie w wąskim zakresie warunków 2. Tworzenie dużych kryształów ogranicza transfekcję, najlepiej jest, gdy powstają bardzo drobne cząstki a) stężenie DNA b) temperatura – rozpuszczalność fosforanu jest wyższa w niższej temperaturze c) czas tworzenie precypitatu przed dodaniem do komórek d) pH – powyżej 6,9 nie tworzą się kompleksy, w pH 7,0 – bardzo delikatne i drobne; powyżej – duże kompleksy ale ... Różne opinie e) DNA musi być rozpuszczone w wodzie! Bufor Tris zmienia pH i obniża wydajność transfekcji Zwiększenie wydajności transfekcji DEAE-dekstranem lub fosforanem wapnia - glicerol DMSO chloroquine sodium butyrate Etapy rozwoju syntetycznych metod transferu genów 1958 – Alexander et al. Oczyszczony RNA poliowirusa zakaża komórki 1962 – Szybalski &Szybalska – transfer DNA komórkowego – jony wapnia i spermina 1965 – Vaheri & Pagano – DEAE dextran 1973 – Graham & van der Eb – fosforan wapnia 1979 – Mulligan – transfekcja plazmidu z genem króliczej β-globiny do komórek nerki małpiej 1982 – Souther & Berg – selekcja komórek opornych na neomycynę 1983 – wektory retrowirusowe pozbawione wirusów pomocniczych 1987 – Felgner – lipsomy kationowe 1987 – Wu & Wu – transfekcja z wykorzystaniem receptorów (polilizyna) 1988 – Johnson – strzelba genowa 1995 – Boussif et al.poliethylenoimina 1996 – Tang i wsp. dendrymery Cationic liposomes DOTMA General structure of synthetic cationic lipid TfxTM DOPE (L-dioleoyl phosphatidylethanolamine) obojętny fosfolipid - ułatwia fuzję z błoną komórkową - ułatwia uwalnianie z endosomu Lipotransfekcja – warunki in vitro 1. 2. 3. 4. 5. 6. Jakość wyizolowanego DNA – wolny od białek, RNA i zanieczyszczeń chemicznych Rodzaj komórek Rodzaj liposomu Faza wzrostu komórek Odpowiednie proporcje ilości DNA i liposomu Warunki hodowli – obecność/brak surowicy Optymalizacja warunków transfekcji Lipotransfekcja – procedura in vitro Wydajność transfekcji za pomocą jonów Ca2+ oraz liposomów Ca2+ - transfection Lipotransfection wyższa wydajność transfekcji Wydajność transfekcji a rodzaj liposomu Wydajność transfekcji a ilość liposomu i DNA Ta sama ilość DNA, zmienna ilość liposomu Ta sama ilość liposomu, zmienna ilość DNA Wydajność transfekcji a czas inkubacji lipopleksów z komórkami Wydajność transfekcji a % pokrycia szalki przez komórki Ekspresja genu a czas po transfekcji Wydajność transfekcji przy pomocy liposomów kationowych 100% 30% 1, 000,000 plasmids/cell transfected 300,000 plasmid/cell in pellet 5% 50,000 plasmids/cell intracellular 0,3-0,1% 1,000 plasmids/cell intranuclear Bariery ograniczające skuteczność transfekcji in vivo I. Bariery pozakomórkowe 1. Opsoniny 2. Komórki fagocytujące 3. Macierz pozakomórkowa 4. Enzymy trawienne II. Bariery wewnątrzkomórkowe 1. Błona komórkowa 2. Endosomy/lizosomy 3. Błona jądrowa Lipotransfekcja lokalna systemowa Lipsomy ochrona przed degradacją w endosomach i działaniem cytozolu 1. Chloroquine - podnosi pH w endosomach 2. Ominięcie przedziału endosomalnego: podjednostki toksyn Diphteria i Pseudomonas 3. PEG - stabilizuje plazmidowe DNA i chroni przed degradacją przez nukleazy - ogranicza rozpoznanie przez układ immunologiczny 4. Nuclear targeting a) bierne przechodzenie plazmidu do jądra – podczas podziału komórki b) PEI - syntetyczny polimer - chroni DNA w cytoplazmie, ułatwia wchodzenie do jądra komórkowego c) wirusowe sygnały lokalizacji jądrowej (viral nuclear localization signal, NLS) Lipopleksy - problemy ze skutecznością in vivo 1. Brak stabilności 2. Stosunkowo niska wydajność transfekcji 3. Krótkotrwała ekspresja 4. Niespecyficzne interakcje 5. Indukcja procesów zapalnych składniki liposomów - niezmetylowane CpG dwunukleotydy Liposomy - optymalizacja 1. Poprawa właściwości elektrostatycznych a) odpowiedni dobór lipidów (np. DOPE - ułatwia opuszczanie liposomów) b) zróżnicowanie struktury chemicznej lipidów c) wybór i ilość lipidów obojętnych d) ostateczny ładunek i proporcja do kwasu nukleinowego Np. dodanie wzmacniaczy – Effectene Ligandy zwiększające wydajność transfekcji 1. Peptydy, dla których istnieją specyficzne receptory komórkowe, np. RGD – oddziaływanie z receptorami integrynowymi 2. Jądrowe sygnały lokalizacyjne 3. Ligandy wrażliwe na pH, które umożliwiają opuszczenie endosomów 4. Sferyczne stabilizujące czynniki 5. Wprowadzenie cząstek wirusowych - wiriosomy HVJ (wirus Sendai) Zastosowanie liposomów w eksperymentalnej terapii genowej 1. Choroby płuc - mukowiscydoza a) łatwość dostarczania - aerozol b) po wstrzyknięciu dożylnym lipopleksy gromadzą się w płucach 2. Nowotwory 3. Hemofilia 4. Choroby układu krążenia – transfer do ściany tętnic, transfer do mięśni nóg Nośniki chemiczne plazmidowego DNA Jony Ca2+ DEAE-dekstran Lipidy i lipsomy Związki wielkocząsteczkowe Polipeptydy dendrymery Polimery kationowe Nośniki polipeptydowe - poli-L-lizyna - poli-L-ornityna - białka (protamina) Nośniki złożone Gal4-invasin - tworzy kompleksy z PLL i DNA Zawiera domenę czynnika drożdżowego GAL-4 oraz domenę inwazyny, białka Yersinia pseudotuberculosis PEI - polyetyleneimine 1. Syntetyczny polikation, masa ok. 22 kDa 2. W niskim pH endosomów ulega pęcznieniu, co powoduje rozpad endosomu 3. Zachowuje się jak gąbka protonowa – wzrasta stężenie jonów w w endosomie, napływ wody do endosomu, liza endosomu, uwolnienie kompleksu z DNA do cytoplazmy Inne zastosowania PEI 1. Transfekcja zależna od receptorów – kompleksy PEI/DNA z inaktywowanym adenowirusem Zalety niewirusowego sposobu transferu genu 1. Ograniczenie ryzyka mutagenezy insercyjnej 2. Brak ryzyka zakażenia wirusowego 3. Ograniczenie odpowiedzi obronnej (immunologicznej i zapalnej) organizmu 4. Niższe koszty i czas oczekiwania Porównanie sposobów transfekcji AAV Adenovirus Broad Broad Broad Established Difficult Established Established High Low Low Moderate High Transduction efficiency Very low Low Low Moderate High Capacity for transgene Unlimited 4-5 kb 9 kb 4-5 kb 7-10 kb Low Low Low Non-viral Retrovirus Broad Restricted Construction system Simple Yield (titre) Host tropism Cytotoxic response Duration of expression Low Days Long term Lentivirus Long term Long term High weeks-months Wang Y. & Huang S. 2000. DDT 5: 10. Rodzaje wektorów/nośników stosowanych w terapii genowej Retrowirusowe - 63% Adenowirusowe - 16% Lipotransfekcja - 16% AAV - 6% Inne - 2%
