PL/EP 1917959 PL/EP 1917959 T3
advertisement
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 03.07.2007 07460015.6 (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 1917959 T3 Int.Cl. A61K 31/194 (2006.01) A61P 31/00 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 19.01.2011 Europejski Biuletyn Patentowy 2011/03 EP 1917959 B1 Tytuł wynalazku: Nowe medyczne zastosowanie alfa-ketoglutaranu (30) (43) Pierwszeństwo: 03.07.2006 PL 38010306 Zgłoszenie ogłoszono: 07.05.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/19 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.06.2011 Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/06 (73) Uprawniony z patentu: PL/EP 1917959 T3 Kruszewska, Danuta, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: DANUTA KRUSZEWSKA, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Malewska EWA MALEWSKA & PARTNERS skr. poczt. 613 00-950 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). EP 1 917 959 B1 Opis [0001] Wynalazek dotyczy nowego medycznego zastosowania alfa–ketoglutaranu do wytwarzania środków leczniczych i profilaktycznych do stosowania w medycynie ludzkiej oraz w weterynarii u zwierząt kręgowych w tym ssaków, ptaków, ryb i płazów. Stan techniki [0002] Alfa-ketoglutarany - sole kwasu alfa-ketoglutarowego [0003] Alfa-ketoglutaran występuje w organizmach żywych jako cząsteczka pochodzenia endogennego. [0004] Sole kwasu alfa-ketoglutarowego znane są od co najmniej 60 lat, czyli od czasu odkrycia cyklu Krebsa. Sole kwasu alfa-ketoglutarowego pochodzenia endogennego u ludzi i zwierząt odgrywają obok soli kwasu szczawiooctowego i pirogronowego podstawową rolę w cyklu kwasu cytrynowego. W wyniku odtwarzających się reakcji dochodzi do syntezy kwasów tłuszczowych, steroli, cholesterolu (z udziałem cytrynianu), porfiryn, hemu, chlorofilu (czynność bursztynylo-CoA), glutaminianu, aminokwasów, zasad nukleotydowych (aktywność soli kwasu alfa-ketoglutarowego). [0005] Anion kwasu alfa-ketoglutarowego odgrywa kluczową rolę w przemianie materii, głównie w organizmach oddychających tlenowo. Alfa-ketoglutaran produkowany jest w procesie oksydacyjnej dekarboksylacji przy udziale enzymu komórkowego dehydrogenazy izocytrynianowej, a także w innym szlaku metabolicznym, oksydacyjnej deaminacji glutaminianu, katalizowanej dehydrogenazą glutaminianu. [0006] Alfa-ketoglutaran - będąc związkiem pośrednim w podstawowym cyklu życiowym jakim jest cykl kwasów trikarboksylowych, czyli cykl Krebsa, stale ulega przemianom wewnątrzkomórkowym i jako anion występuje praktycznie w niewielkich stężeniach we krwi obwodowej, z uwagi na pełne metabolizowanie w ustroju. [0007] Równolegle, alfa-ketoglutaran pełni w organizmie rolę naturalnego scavangera, odtruwacza poprzez transport azotu, który następuje drogą transaminacji w wyniku przeniesienie grup aminowych pochodzących z katabolizowanych aminokwasów. Proces ma miejsce w wątrobie i nosi nazwę cyklu ornitynowego, czyli mocznikowego. 2 EP 1 917 959 B1 [0008] W związku z tym, że alfa-ketoglutaran może ulegać transaminacji wspólnie z glutaminą, formowany jest wówczas neurotransmiter o nazwie glutaminian. Glutaminian w obecności witaminy B6 może ulegać dekarboksylacji z wytworzeniem związku o nazwie GABA (kwas gamma-aminobutyrowy), który jest inhibitorem neurotransmitera (hamuje działanie). [0009] Wykazano również udział enzymów właściwych dla alfa-ketoglutaranu w usuwaniu z organizmu wolnych rodników, związków silnie toksycznych – niedopałów metabolizmu. [0010] Poza tym, jedna z oksygenaz zależna od alfa-ketoglutaranu jest sensorem tlenu cząsteczkowego, czyli indykatorem poziomu tlenu w otoczeniu. [0011] Alfa-ketoglutaran może też być wprowadzany do organizmu znanymi drogami podawania, przykładowo: doustnie, w postaci inhalacji, dożylnie, bądź innymi drogami. [0012] Codzienna dieta zarówno ludzi jak i zwierząt nie zawiera w swoim składzie alfa- ketoglutaranu. [0013] Na rynku, zwłaszcza amerykańskim, występują w powszechnej sprzedaży suplementy diety zawierające sole kwasu alfa-ketoglutarowego, głównie sole argininy, pirydoksyny, ornityny, kreatyny, histydyny, cytruliny, jako gotowe produkty dla ludzi i zwierząt domowych. Dostępne są również sole sodowa, potasowa i wapniowa kwasu alfaketoglutarowego. [0014] W wykazie suplementów diety sporządzonym przez National Nutritional Foods Association (NNFA) kwas alfa-ketoglutarowy oraz połączony z pirydoksyną (wit. B6) kwas alfa-ketoglutarowy znalazł się w grupie środków biochemicznych jeszcze przed 15 września 1994. Tak długa obecność na rynku skutkuje obfitością suplementów diety zawierających te związki chemiczne. Głównym powodem, dla którego we wszystkich dostępnych produktach z obecnymi w nich pochodnymi lub solami kwasu alfaketoglutarowego jest fakt, że alfa-ketoglutaran - jako związek pośredni w cyklu Krebsa, jest jednym ze związków warunkujących oddychanie komórkowe, a przez to ma wywierać określone działanie poprawiające komfort życia. [0015] Najbogatszy wachlarz omawianych produktów stanowią te, które posiadają L- argininę połączoną z alfa-ketoglutaranem. Produkty te według deklaracji producentów 3 EP 1 917 959 B1 pomagają głównie w zachowaniu energii podczas i po wykonanej aktywności fizycznej, wzmacniają syntezę tlenku azotu, dodatkowo w kompleksie z tlenkiem azotu zwiększają poziom tego tlenku w organizmie i wzmagają transport składników odżywczych oraz metabolizm w mięśniach. W połączeniu z innymi substancjami wzmagają poziom energii i metabolizm aminokwasów. [0016] Kolejna co do liczebności grupa produktów rynkowych zawiera ornitynę połączoną z kwasem alfa-ketoglutarowym. W takiej postaci alfa-ketoglutaran nie tylko wzmaga produkowanie energii, ale też i chroni mięśnie przed rozpadem rozgałęzionych aminokwasów, w celu generowania glutaminy, cząsteczki napędzającej energię. Poza tym, jest środkiem wzmagajacym wydzielanie hormonu wzrostu i optymalizującym metabolizm mięśni. Bezpiecznie dla zdrowia wzmaga aktywność insuliny i poliamin. Wzmaga również neurotransmisję utrzymującą dobry mentalny status organizmu, wspiera wytrzymałość mięśni maksymalizując działania atletyczne, wywiera wpływ na zdolność organizmu do spalania nadmiaru tluszczu, wzmaga libido, korzystnie działa na funkcje immunologiczne i redukuje tlenowy stres. [0017] Kolejna grupa preparatów spożywczych stosowanych jako suplementy diety zawiera pirydoksynę i pirydoksyl, które są połączone z alfa-ketoglutaranem. Składniki tych produktów wspomagają zachowanie aktywności matabolicznej wewnątrz komórki, bilansują nakłady na produkcję energii w organizmie oraz działają ochronnie na watrobę. [0018] Występują również na rynku środki zawierające kreatynę połączoną z alfa- ketoglutaranem. Działają one jako prekursory glutaminy i biorą udział w syntezie białka. [0019] Inne niespecyfikowane sole kwasu alfa-ketoglutarowego zwiększają spadek tłuszczu w organizmie i warunkują zachowanie integralności tkanki mięśniowej. [0020] Sam kwas alfa-ketoglutarowy jest natomiast składnikiem praparatu pełniącego naturalną funkcję detoksyfikującą. Zalecany jest w stanach chronicznego zmęczenia, w niedoborach metabolizmu często notowanych przy analizie aminokwasów. Przyjmowanie tego typu preparatu wzmacnia wytrzymałość i zwiększa energię. Ciekawym produktem z tej grupy jest sól wapniowa i magnezowa kwasu alfa-ketoglutarowego. Ze względu na to, że kwas alfa-ketoglutarowy należy do silnych kwasów organicznych, doustne podawanie drażni przełyk i żołądek. Włączenie wapnia i magnezu służy do produkcji buforowanego 4 EP 1 917 959 B1 dwuskładnikowego związku kwasu alfa-ketoglutarowego, który nie wywołuje niekorzystnego odczucia nadmiaru kwasowości. [0021] Liczne patenty i zgłoszenia patentowe wskazują, że alfa-ketoglutaran może być stosowany w niewydolności metabolicznej mózgu, w zaburzeniach układów nerwowego, krążenia, mięśniowo-szkieletowego, aby wzmocnić funkcje mitochodrium komórkowego. [0022] Dostępne są również napoje zawierające sole kwasu alfa-ketoglutarowego sporządzone w celu dostarczania organizmowi energii zwłaszcza przed, w czasie i po wysiłku fizycznym. Napój - jako źródło energii, podawany może być w stanach szybkiego i długotrwałego zapotrzebowania na energię u ludzi i innych ssaków. [0023] Inne zastosowanie znajduje alfa-ketoglutaran jako niesterydowy, anaboliczny produkt zwiększający masę mięśniową bez przerostu jej w tłuszcz. Efekt działania tego suplementu diety jest podobny do efektu uzyskiwanego przy stosowaniu syntetycznych anabolików sterydowych, jednak bez niepożądanych skutków ubocznych. [0024] Doustnie podawany jest również suplement zawierający rozpuszczalną w tłuszczach tiaminę, kwas lipoinowy, pochodne kreatyny i L-argininę z alfaketoglutaranem. Ten suplement diety przeznaczony jest do obniżenia poziomu glukozy we krwi i utrzymania obniżonego poziomu glukozy w leczeniu neuropatii cukrzycowych, jak również ma na celu poprawienie krążenia i poprawienie wydajności mięśniowej. [0025] Ciekawe wykorzystanie znalazły też sole kwasu alfa-ketoglutarowego jako środek mający na celu zredukowanie emisji azotu od ludzi i zwierząt oraz podtrzymanie syntezy białek, a także w mikrobiologii żywności. [0026] składnika Ujawniono zastosowanie kwasu alfa-ketoglutarowego oraz jego soli jako (składników) środka antyseptycznego przeznaczonego dla przemysłu spożywczego. Patrz: DATABASE WPI Sekcja Ch, Tydzień 1974, Derwent Publications Ltd., London, GB; Klasa D13, AN 1974-44619V XP002472373 “Antiseptic agent contg. a ketoglutaric acid – esp. useful in the food ind.” oraz JP 49 01 9855 B – (UENO PHARMACEUTICAL), 1974. Antybakteryjna aktywność kwasu alfa-ketoglutarowego oraz szeregu innych kwasów organicznych takich jak kwasy askorbinowy oraz propionowy albo ich soli – zilustrowana danymi doświadczalnymi dla Bacillus subtilis, polega raczej na zapobieganiu wzrostowi bakterii niż na zabijaniu tych mikroorganizmów. W tym kontekście należy jednakże zauważyć, że sama sól kuchenna (NaCl) – obecna w badanych 5 EP 1 917 959 B1 produktach żywnościowych, posiada taką samą aktywność antybakteryjną. Na koniec zaś, stężenie kwasu alfa-ketoglutarowego lub jego soli w produktach żywnościowych konserwowanych przy użyciu wskazanego środka, objęte badaniem w tych doświadczeniach zawiera się w zakresie od 0,05 do 1,0 %. Stężenie takie nie jest odpowiednie do zastosowania w organizmach żywych. [0027] W przemyśle spożywczym omawiane sole są stosowane jako środek poprawiający i wzmagający aromat i smak produktów fermentacji (np. octu winnego) oraz mleczarskich, między innymi serów. Sole kwasu alfa-ketoglutarowego wpływają na procesy fermentacji, zachodzące przy udziale bakterii kwasu mlekowego, wywołując zmiany metabolizmu aminokwasów, poziomu katabolitow, aktywności aminotransferaz. W praktyce prowadzi to do skrócenia czasu dojrzewania serów przez przyspieszenie wytwarzania tych związków, które gwarantują wysoką jakość handlową artykułów spożywczych. Patrz: Williams AG, Noble J, Banks JM., The effect of alpha-ketoglutaric acid on amino acid utilization by nonstarter Lactobacillus spp. isolated from Cheddar cheese. Lett. Appl. Microbiol. 2004;38:289-295. [0028] Liczne patenty i zgłoszenia patentowe dotyczą zastosowania alfa-ketoglutaranu jako preparatu farmaceutycznego lub składnika preparatu farmaceutycznego. [0029] Z publikacji WO 2007/058612 znane jest zastosowanie kwasu alfa- ketoglutarowego, glutaminy, kwas glutaminowego, ich soli, amidów, dwu- i trójpeptydówy jako środka farmaceutycznego do leczenia i profilaktyki stanów artrozy, reumatoidalnego zapalenia stawów, uszkodzenia chrząstki o podłożu zapalnym i niezapalnym. [0030] Publikacja WO 2005/123056 ujawnia zastosowanie kwasu alfa- ketoglutarowego, glutaminy, kwasu glutaminowego, ich farmaceutycznie akceptowanych soli, amidów, di- i tripeptydów, jako środka farmaceutycznego i dodatku do żywności oraz do pasz, do leczenia i profilaktyki zwiększonego poziomu w plazmie co najmniej jednego z parametrów takich jak cholesterol, LDL, glicerydy. Preparat służyć może również do podniesienia poziomu HDL . [0031] EP 0 922 459 ujawnia, że kwas alfa-ketoglutarowy razem z D-galaktozą i ornityną oraz sole kwasu alfa-ketoglutarowego takie jak sól sodowa, potasowa, magnezowa, cynkowa, wapniowa, w określonej dawce, w postaci tabletek, proszków, infuzji, syropów mogą służyć do podwyższenia profilu aminokwasów we krwi szczególnie 6 EP 1 917 959 B1 u pacjentów w sytuacjach metabolicznie stresowych. Ujawniony środek może być przeznaczony do stosowania w chorobach wątroby, do terapii i profilaktyki wątroby i chorób wątroby u alkoholików, dla zachowania funkcji i struktury wątroby, w celach regeneracji wątroby. [0032] W publikacji WO 2006/016143 podano, że środek w postaci alfa- ketoglutaranów i szeregu ich pochodnych, który stosowano wcześniej do aktywowania HIFa hydroksylazy, do zwiększania poziomu alfa-ketoglutaranu, aktualnie wykorzystuje się do leczenia raka i do leczenia angiogenezy. [0033] Zgodnie z publikacją WO 2006/062424 możliwe jest również zastosowanie 3- hydroksy-3metylobutyranu w połączeniu z alfa-ketoglutaranem i szeregiem pochodnych w procesach wzrostu i mineralizacji układu kostnego w stanach fizjologicznych i osteochondropatii u osób dorosłych i zwierząt. Ten sam produkt może stanowić składnik żywności funkcjonalnej i żywności o przeznaczeniu medycznym. [0034] Publikacja WO 2006/016828 wskazuje na zastosowanie alfa-ketoglutaranów i szeregu pochodnych jako preparatu farmaceutycznego i równocześnie jako dodatku do żywności i do pasz, poprawiającego funkcję komórek nerwowych i układu nerwowego, minimalizującego i chroniącego przed apoptozą komórek nerwowych oraz chroniącego przed rozwojem chorób układu nerwowego dorosłych i płodu. [0035] Alfa-ketoglutaran pirydoksyny znany jest jako środek stosowany w profilaktyce kwasicy w medycynie i w weterynarii, w profilaktyce wszystkich stanów prowadzących do kwasicy, jak też w stanach patologicznych, w których stosuje się leki obniżające poziom kwasu mlekowego we krwi. [0036] Alfa-ketoglutaran stosowany jest także w praktyce medycznej jako odtruwacz, w stanach zatrucia organizmu. Działanie odtruwające alfa-ketoglutaranu zostało wykorzystane do leczenia przykładowo zatruć cyjankami. Alfa-ketoglutaran, jako środek przeciwtoksyczny przeciwdziała pooperacyjnemu katabolizmowi mięśni, a także jest stosowany na oddziałach szpitalnych, u osób ze wskazaniem podawania żywienia pozajelitowego, gdzie jednym ze składników aplikowanego bolusa jest alfa-ketoglutaran. Alfa-ketoglutaran zaleca się podawać chorym z rozpoznaniem udaru mózgu, jak i osobom z ranami poparzeniowymi, w stanach hypoxii (niedotlenienia), po napromieniowaniu promieniowaniem X, w przypadku wystąpienia katarakty na tle zatrucia selenitem. 7 EP 1 917 959 B1 [0037] Alfa-ketoglutaran związany z ornityną chroni skutecznie organizm po transplantacji jelita przed translokacją bakterii, co badano w węzłach chłonnych krezkowych, wątrobie i śledzionie. Patrz: de Oca J, Bettonica C, Cuadrado S, Vallet J, Martin E, Garcia A, Montanes T, Jaurrieta E. Effect of oral supplementation of ornithinealpha-ketoglutarate on the intestinal barrier after orthotopic small bowel transplantation. Transplantation. 1997;63:636-639. [0038] U szczurów w stanie pourazowym, wywołanym doświadczalnie, podanie alfa- ketoglutaranu połączonego z ornityną ogranicza rozprzestrzenianie E. coli i niszczenie tkanek pod wpływem LPS. Przyjmuje się, że u ludzi po urazach podanie tego związku chronić może przed sepsą i jej następstwami. Patrz: Schlegel L, Coudray-Lucas C, Barbut F, Le Boucher J, Jardel A, Zarrabian S, Cynober L. Bacterial dissemination and metabolic changes in rats induced by endotoxemia following intestinal E. coli overgrowth are reduced by ornithine alpha-ketoglutarate administration. J Nutr. 2000;130:2897-2902. [0039] Alfa-ketoglutaran wykorzystuje się także w hodowli zwierząt dla usprawnienia wchłaniania aminokwasów. Znalazł zastosowanie u młodych świń do przyspieszenia wchłaniania jonów żelaza. Bakterie ureolityczne [0040] Wachlarz drobnoustrojów asymilujących azot jest szeroki: od niechorobotwórczych komensali takich jak na przykład bakterie kolonizujące skórę, poprzez niechorobotwórcze symbionty zasiedlające błonę śluzową przewodu pokarmowego, do bakterii patogennych, do których zalicza się Helicobacter pylori oraz bakterie wywołujące zakażenia układu moczowo-płciowego. [0041] Najpowszechniej występującym u ludzi zakażeniem wywoływanym przez bakterie ureolityczne jest zakażenie H. pylori. [0042] Cechą powszechną bakterii urolitycznych jest ich zdolność wykorzystywania, z udziałem ureazy, obecnego w otoczeniu mocznika - głównie jako źródła niezbędnego do życia azotu. Ureaza bakteryjna (aminohydrolaza mocznika E.C.3.5.1.5) jest enzymem niklo-zależnym, multimerem składającym się z 2 lub 3 podjednostek. Poznana została 3-D budowa krystalograficzna niektórych bakteryjnych ureaz (H. pylori, Klebsiella aerogenes, Bacillus pasteurii). Wysoki stopień podobieństwa sekwencji aminokwasowych wskazuje na to, że wszystkie warianty ureaz pochodzą od jednego rodzicielskiego białka, mają 8 EP 1 917 959 B1 prawdopodobnie podobną trzeciorzędową budowę i zachowują aktywność katalityczną hydrolizując mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla. [0043] W jamie ustnej przykładem bakterii asymilujących azot z udziałem własnej ureazy są powszechnie tam obecne i tworzące biofilm Streptococcus salivarius i Actinomyces naeslundii. [0044] Układ pokarmowy jest największym skupiskiem ureolitycznych bakterii. Mikroorganizmy, w tym ureolityczne, kolonizują trwale powierzchnię nabłonka co określane jest jako naturalna mikroflora jelitowa. Z tego wynika, że dostęp do mocznika jest jednym z czynników warunkujących ekologię mikroorganizmów układu pokarmowego to jest skład ilościowy i jakościowy bakterii w tym obszarze. Poprzez zachowanie integralności tkanki dostęp do mocznika jest jednym z czynników warunkujących zdrowie makroorganizmu. Na podobnej zasadzie utrzymania stanu równowagi występują drobnoustroje kolonizujące powłoki ciała. [0045] Mocznik pozostaje również istotny jako substrat dla ureazy patogenów w trakcie stabilizowania się procesu zapalnego podczas zakażenia H. pylori. [0046] Powszechną drogą wnikania patogenów do organizmu człowieka i zwierząt jest droga pokarmowa, niezależnie od miejsca dalszego rozwoju zakażenia. Zakażenia poprzez układ pokarmowy drobnoustrojami ureolitycznymi wskazują, że ureaza odgrywa rolę w patogenezie tych zakażeń. Wykazano, że szczepy bakteryjne przykładowo z rodzaju Brucella - produkujące ureazę, są oporne w środowisku mocznika na biobójcze działanie soku żołądkowego, w którym występują warunki silnie kwasowe. Ureazo-ujemne mutanty tych bakterii pozostają natomiast wrażliwe, co przekłada się na spadek liczby bakterii w trakcie pasażu przez żołądek. Z tego wynika, że w tych warunkach ureaza chroni brucelle przed działaniem soku żołądkowego, wówczas gdy dostają się one do organizmu per os . Po pokonaniu bariery żołądka bakterie mogą swobodnie przenikać np. do układu oddechowego i moczowo-płciowego oraz generować objawy typowe dla brucelozy. [0047] Bakterie ureolityczne mimo, że nie są podstawowym czynnikiem etiologicznym zakażeń dróg moczowych zdrowych osobników, często są związane z zakażeniami u ludzi, u których występują stany chorobowe w narządach moczowych. Następstwem zakażeń układu moczowego drobnoustrojami produkującymi ureazę jest kamica odlewowa z powstałym przesyceniem moczu solami fosforanowo-amonowo-magnezowymi (struwit) i 9 EP 1 917 959 B1 fosforanowo-wapniowymi, a także procesy patologiczne w obrębie nerki. W warunkach fizjologicznych mocz nie jest nasycony tymi solami. [0048] Innym ciekawym mechanizmem w patogenezie zakażeń układu moczowo- płciowego jest utrzymanie zakażeń wywoływanych przez ureazo-dodatnich bakterie takie jak Ureaplasma ureolyticum i inne alkalofilne np. B. pasteurii. W środowisku mocznika ma miejsce stałe rozmnażanie się w nim tych patogenów, które ureolizę wykorzystują do generowania własnego ATP. Mimo, że U. urealyticum i inne mykoplazmy to bakterie relatywnie nieczęsto występujące mogą one również wywoływać przebiegające groźnie i trudnoleczące się zakażenia układu oddechowego u ludzi i zwierząt, w tym u ryb. [0049] Stwierdzono również, że produkująca ureazę pałeczka Yersinia enterocolica – patogen przewodu pokarmowego, może u niektórych osób ze skłonnością genetyczną wywołać reaktywne zapalenie stawów, ta reaktywność powiązana jest z budową chemiczną enzymu - jego podjednostki UreB. [0050] Warto zauważyć, że wiele bakterii wykazujących ruch to organizmy ureolityczne, które biorą udział w formowaniu biofilmu i mineralizacji złogów na cewnikach i mechanicznych innych środkach medycznych. [0051] Metabolizm mocznika wiązany jest również z zakażeniami występującymi w obrębie błony śluzowej jamy ustnej, z chorobami przydziąśla z tworzeniem się próchnicy i kamienia nazębnego. [0052] Z powstawaniem kamieni zakaźnych łączone są zakażenia układu moczowego wywoływane przez bakterie z rodzaju Proteus, Ureaplasma, Klebsiella, Pseudomonas, Staphylococcus, Providencia, Corynebacterium. Najczęstszą przyczyną tworzenia się kamieni zakaźnych są bakterie P. mirabilis. W tworzeniu się kamieni również mają udział mykoplazmy wiązane zazwyczaj z zakażeniami dróg płciowych najczęściej ich dolnego odcinka (głównie pochwy). U mężczyzn izoluje się Mycoplasma hominis oraz U. urealyticum z cewki moczowej. Kolonizacja układu płciowego zarówno kobiet jak i mężczyzn przez te bakterie prowadzi do zakażeń dróg moczowych, którym towarzyszy tworzenie się kamieni zakaźnych w pęcherzu moczowym. Zakażenia Helicobacter pylori [0053] Pałeczki H. pylori zazwyczaj izolowane są od ludzi z żołądka i dwunastnicy. Te Gram-ujemne, ureolityczne bakterie o kształcie spiralnym, wcześniej znane jako 10 EP 1 917 959 B1 Campylobacter pylori, są jednym z czynników etiologicznych zapalenia żołądka i powstania wrzodów żołądkowo-dwunastniczych. W 1983 roku Warren i Marschall, uhonorowani w roku 2005 Nagrodą Nobla, wykazali zależność przyczynowo-skutkową między występowaniem w przewodzie pokarmowym bakterii H. pylori, a przetrwałym zapaleniem żołądka. Patrz: Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet. 1984;1:1311-1315. Z uwagi na to, że długotrwałe zakażenie wyraźnie podnosi ryzyko wystąpienia jelitowego typu raka żołądka, w ostatnich latach pałeczki H. pylori uznane zostały przez WHO za czynnik rakotwórczy (IARC. Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Lyon, 7-14 June 1994. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1994;61:1-241.). Stwierdzono ponadto związek zakażenia H. pylori z pojawieniem się zmian patologicznych obejmujących tkanki i narządy inne niż żołądek, na przykład serce. [0054] Przez długi czas uważano, że żołądek wolny jest od bakterii, ponieważ trwałą kolonizację jego błony śluzowej utrudnia odczyn treści o wartości niższej niż wartość odpowiednia dla wzrostu większości mikroorganizmów. Jednakże produkcja ureazy przez H. pylori pozwala temu mikroorganizmowi trwale kolonizować żołądek i jelito, a ureoliza jest głównym czynnikiem wywołującym patologie związane z zakażeniem H. pylori. Ureaza zdeponowana na zewnątrz komórki bakteryjnej stanowić może aż do 20 procent składu bakteryjnego białka. Enzym chroni bakterie przed kwaśnym środowiskiem i zapobiega letalnemu uszkodzeniu osłon bakteryjnych. Dodatkowo, w trakcie zakażenia H. pylori jony amonowe uwalniane przez ureazę podczas rozkładu mocznika wywierają cytotoksyczny efekt na komórki nabłonka żołądka. W obecności leukocytów i mocznika bakteryjna ureaza generuje monochloraminę, która indukować może mutagenezę DNA i jest jednym z czynników rozwijania się procesu nowotworzenia związanego z przetrwałym zakażeniem H. pylori. [0055] Od ludzi i zwierząt izoluje się nowe gatunki spiralnych bakterii ureolitycznych. Nie jest dotychczas dostatecznie zbadane jak inne gatunki Helicobacter występujące u ludzi należy łączyć z chorobami żołądka (na przykład H. heilmannii), jelit (na przykład H. cinaed, H. canadensis), wątroby (na przykład H. hepaticus, H. bilis) czy z zakażeniami systemowymi (na przykład H. pullorum, Helicobacter spp. flexispira takson 8 ”F. rappini”). 11 EP 1 917 959 B1 [0056] W ostatnich latach stwierdzono, ze układ pokarmowy (jelita, żołądek, wątroba, trzustka) zwierząt laboratoryjnych może w naturalny sposób ulegać skolonizowaniu bakteriami należącymi do rodzaju Helicobacter: H. bilis, H. ganmani, H. hepaticus, H. muridarum, H. mastomyrinus, H. rappini, H. rodentium, H. typhlonius. Zwierzęta trwale skolonizowane tymi mikroorganizmami, zarówno dzikie, jak i hodowlane, nie manifestują objawów zakażenia i nie stwierdza się u nich sekcyjnie procesów zapalnych w organach wewnętrznych. Wrażliwe na warunki otoczenia drobnoustroje utrzymują się jednak w środowisku, ze względu na stałe horyzontalne przenoszenie bakterii z jednego osobnika na następnego, przez odchody i ze śliną. [0057] Okazuje się, że u ludzi zakażenie H. pylori obejmuje około 50 % populacji i jak się wydaje związane jest głównie ze stanem ekonomicznym i wiekiem społeczności. Nasila się u osób dorosłych, obejmując powyżej 50-tego roku życia prawie całą populację krajów słabo rozwiniętych. H. pylori rozpoznawany jest w 90 % - 100 % przypadkach zapalenia żołądka. Stwierdza się często przejście zakażenia przewlekłego w stan zapalenia zanikowego. U 10 % zakażonych rozwijają się głębokie zmiany patologiczne. Zakażenie H. pylori powszechnie występuje zarówno u dzieci, jak i osób dorosłych. Do zakażenia bakteriami dochodzi najczęściej w wieku dziecięcym i praktycznie kolonizacja błony śluzowej żołądka pałeczkami H. pylori utrzymuje się przez całe życie. [0058] Wiadomo, że takie czynniki jak niedożywienie, niedobory witamin, palenie tytoniu sprzyjają zakażeniu. [0059] U 10 % przypadków chorych zastosowana terapia jest nieskuteczna, ponieważ występuje i narasta oporność bakterii na standardowo stosowane leki. U części chorych stwierdza się również reinfekcję lekoopornymi bakteriami. U pozostałych około 10 % pacjentów ma miejsce brak tolerancji na preparaty z grupy inhibitorów pompy protonowej. U tych osób manifestują się uciążliwe objawy uboczne. [0060] Z uwagi na systematycznie zmniejszającą się skuteczność leczenia i jego uciążliwość regionalne towarzystwa gastrologiczne w Europie, na podstawie zalecenia raportu „Maastricht 2-2000” rekomendują odpowiednie postępowanie diagnostyczne w kierunku H. pylori oraz wskazania do podjęcia leczenia tylko w przypadku wystąpienia u pacjentów określonych objawów chorobowych głównie takich jak: zapalenie żołądka, wrzód żołądka i dwunastnicy, choroba wrzodowa żołądka lub dwunastnicy stwierdzona w 12 EP 1 917 959 B1 wywiadach, przebyta operacja z powodu choroby wrzodowej, zmiany przedrakowe (zapalenie zanikowe, metaplazja, dysplazja), resekcja żołądka z powodu wczesnego raka, rak żołądka w rodzinie (do II stopnia pokrewieństwa), polipy gruczolakowate hiperplastyczne żołądka (po ich usunięciu), chłoniaki typu MALT, przewlekłe leczenie NLPZ. [0061] Zauważono u ludzi, że zakażeniu H. pylori towarzyszy występowanie niektórych chorób takich jak choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy, chłoniaki żołądka, przewlekłe zanikowe zapalenie żołądka z metaplazją jelitową oraz rak żołądka. [0062] U ludzi, w pierwotnym stadium zakażenia H. pylori rozwija się stan zapalny błony śluzowej żołądka i dwunastnicy, który u zakażonych pacjentów należy w pełni eradykować farmakologicznie. Leczenie zakażenia H. pylori nadal opiera się na wprowadzeniu środków zmniejszających wydzielanie kwasu żołądkowego i podwyższających pH w żołądku takich jak inhibitory pompy protonowej, a w leczeniu przeciwbakteryjnym – na obowiązkowym wprowadzeniu określonych antybiotyków klarytromycyna, amoksycylina i chemioterapeutyków - metronidazol (z grupy pochodnych nitroimidazolu). [0063] W Europie, wskazania zawarte, w formie wykazu, w raporcie uzgodnionym "Maastricht 2 - 2000" opublikowanym w 2002 roku nie uwzględniają prowadzenia terapii H. pylori bez środków antybakteryjnych takich jak antybiotyki, a wśród chemioterapeutyków - innych niż pochodne nitroimidazolu. Terapia jest złożona, kosztowna, bywa źle tolerowana i nie zawsze okazuje się skuteczna. Według wytycznych europejskich regionalnych Towarzystw Gastroenterologicznych leczenie może się opierać na podawaniu chorym antybiotyków i chemioterapeutyków (klarytromycyna (2 x 500) i amoksycylina (2 x 1 g) lub metronidazol (2 x 500 mg) oraz inhibitorów pompy protonowej. [0064] Przykładowo przedstawia się to następująco: Terapia pierwszego rzutu. Siedmiodniowy przebieg kuracji: 1. Lek zmniejszający wydzielanie soku żołądkowego środek z grupy inhibitorów pompy protonowej (IPP) w podwójnej dawce – na przykład omeprazol 2 x dziennie 20 mg 2. Antybiotyk I – na przykład amoksycylina w dawce 2 x dziennie 1 g 3. Antybiotyk II – na przykład klarytromycyna w dawce 2 x dziennie 0.5 g 13 EP 1 917 959 B1 Terapia drugiego rzutu. 1. Lek zmniejszający wydzielanie soku żołądkowego, środek z grupy inhibitorów pompy protonowej (IPP) w podwójnej dawce – na przykład lanzoprazol 2 x dziennie 30 mg 2. Antybiotyk I – utrzymanie amoksycyliny w dawce 2 x dziennie 1,0 g 3. Antybiotyk II - zastosowanie innego antybiotyku lub chemioterapeutyku – na przykład metronidazol w dawce 2 x dziennie 500 mg 4. Związki bizmutu (cytrynian). [0065] W związku z faktem epidemicznego rozprzestrzeniania się w różnych regionach świata zakażeń H. pylori, znalezienie środków ograniczających patologie wynikające z zakażenia jest ciągle aktualne i istnieje nacisk populacji ludzi zakażonych, jak i środowiska medycznego do ich identyfikacji. [0066] Głównym celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do leczenia i profilaktyki stanów chorobowych wywoływanych przez bakterie urolityczne, do stosowania w szczególności do regulacji ureolitycznej flory jelitowej, do regulacji ureolitycznej flory jamy ustnej, do hamowania pasażu patogennych bakterii ureolitycznych przez żołądek trawienny, do zapobiegania tworzeniu się w drogach moczowych złogów i kamieni zakaźnych – u ludzi i zwierząt, zwłaszcza psów i kotów oraz innych zwierząt udomowionych. [0067] Celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do kontroli niepożądanego rozwoju bakteri ureolitycznych w organizmach ludzi i zwierząt. [0068] Szczególnym celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do leczenia i profilaktyki stanów chorobowych wywołanych przez H. pylori. [0069] Celem wynalazku jest także zapewnienie nowego środka do hamowania wzrostu bakterii ureolitycznych, szczególnie Ureaplasma i innych mykoplazm, wywołujących zakażenia ryb, do stosowania w szczególności w profilaktyce zapalenia skrzeli u karpia i narybku karpia oraz innych ryb słodkowodnych i morskich, wywoływanego przez bakterie ureolityczne. [0070] Ponadto, celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do hamowania procesu formowania biofilmu i mineralizacji złogów na cewnikach, kateterach i innym sprzęcie medycznym. 14 EP 1 917 959 B1 [0071] Jest także celem wynalazku zapewnienie nowego środka do ograniczania tworzenie się kamienia nazębnego i rozwoju próchnicy. [0072] Ponadto, celem wynalazku jest także zapewnienie nowych, suplementów diety, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego oraz dodatków do żywności/paszy, przydatnych w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji organizmów kręgowców, w tym ludzi, ssaków ptaków płazów i ryb przez niepożądane bakterie ureolityczne, a zwłaszcza organizmów ludzi i zwierząt domowych przez H. pylori. [0073] Cele te zostały osiągnięte dzięki opracowaniu rozwiązania według obecnego wynalazku przedstawionego w załączonych zastrzeżeniach patentowych. [0074] Osiągnięcie wskazanych celów zapewnia zgodnie z wynalazkiem zastosowanie jako substancji aktywnej znanego alfa-ketoglutaran w skutecznej terapeutycznie bądź profilaktycznie dawce, do wytwarzania środka leczniczego, bądź profilaktycznego, bądź też środka stanowiącego suplement diety, środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego oraz dodatek do żywności/paszy, bądź środków higieny osobistej do codziennego stosowania. [0075] Terapeutycznie i/lub profilaktycznie skuteczna dawka wynosi od 0,001g do 0,2 g/kg masy ciała/dzień przy podawaniu dożołądkowym lub doustnym. [0076] Soli kwasu alfa-ketoglutarowego nigdy dotychczas nie stosowano u ludzi, ani u zwierząt w leczeniu zakażeń bakteryjnych, włącznie z zakażeniami wywoływanymi przez H. pylori. [0077] Zaletą obecnego wynalazku jest dostępność alfa-ketoglutaranu, jego dobrze zbadane działanie w obrębie organizmu, a także fakt, iż jest to środek dopuszczony do stosowania w innych wskazaniach medycznych i profilatycznych. [0078] Wynalazek bliżej objaśnia poniższy szczegółowy opis oraz załączone rysunki. [0079] Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia schemat doświadczalnego zakażania myszy bakteriami H. pylori w celu zbadania zależności stopnia kolonizacji H. pylori błony śluzowej żołądka myszy (n=28) od podania dożołądkowego soli kwasu alfaketoglutarowego. [0080] Fig. 2 przedstawia schemat doświadczalnego zakażania myszy bakteriami H. pylori w celu zbadania zależności stopnia kolonizacji błony śluzowej żołądka myszy 15 EP 1 917 959 B1 (n=48) bakteriami z rodzaju Helicobacter od dożołądkowego podania myszom soli kwasu alfa-ketoglutarowego. [0081] Fig. 3 ilustruje ruchliwość produktów PCR właściwych dla fragmentu 16S rDNA bakterii z rodzaju Helicobacter w polu elektrycznym, ocenianych techniką DGGE. [0082] Określenia stosowane powyżej i w dalszej części opisu oraz w załączonych zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie: [0083] Określenie „alfa-ketoglutaran” (dalej czasem AKG) oznacza związek uwalniający aktywny anion kwasu znanego jako kwas 2-oksopentanodiowy, 2oksoglutarowy, alfa-oksoglutarowy, alfa-oksopentanodiowy, 2-ketoglutarowy, 2-okso-1,5pentanodiowy, 2-oksopentanodiowy, bądź 2-okso-glutarowy. Przykładami takich związków są sole kwasu alfa-ketoglutarowego, sole addycyjne tego kwasu, estry, amidy, imidy i inne podobne związki prekursorowe. Alfa-ketoglutaran wywiera działanie hamujące kolonizację i zapobiega kolonizacji błon śluzowych organizmu kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby przez bakterie ureolityczne. [0084] Określenie „środek leczniczy” tu używane odnosi się do kompozycji zawierającej skuteczną terapeutycznie ilość alfa-ketoglutaranu do stosowania w nowych wskazaniach terapeutycznych lub profilaktycznych objętych obecnym wynalazkiem. [0085] Określenie „skuteczne terapeutycznie” odnosi się do takiej ilości pochodnej, zwłaszcza soli kwasu alfa-ketoglutarowego, która w warunkach in vivo przedstawionych w niniejszym opisie wywiera działanie lecznicze, czyli ogranicza i hamuje kolonizację błony śluzowej organizmu kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby przez ureolityczne bakterie. Skuteczność terapeutyczną lub profilaktyczną osiąga się wprowadzając wyżej wymieniony środek leczniczy w postaci stałej lub płynnej sam lub z nośnikiem, rozcieńczalnikiem, dodatkiem, bądź też jako składnik kompozycji farmaceutycznej do organizmu kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby. Środek podaje się w ilości wystarczającej do ograniczenia i zapobiegania zakażeniom bakteriami ureolitycznymi. Alternatywnie, skuteczna terapeutycznie ilość środka leczniczego powoduje ustąpienie zakażeń wywołanych przez bakterie ureolityczne. [0086] W zależności od oczekiwanych skutków działania, ilość użytego środka może być różnicowana w zależności od jego specyficznej aktywności w miejscu docelowego działania na bakterie ureolityczne. Odpowiednia dawka środka może zawierać określoną 16 EP 1 917 959 B1 ilość substancji tak wyliczoną, aby wywoływała oczekiwane działanie lecznicze. Dawkę podaje się w przeliczeniu na czystą substancję aktywną, uwzględniając jej budowę chemiczną oraz obecność substancji pomocniczych w środku leczniczym takich jak nośniki, rozcieńczalniki, adjuwanty i inne dopuszczalne farmaceutycznie dodatki. Pożądany efekt terapeutyczny, a w konsekwencji także i zalecana dawka mogą być określone znanymi metodami przez pracownika serwisu medycznego lub weterynaryjnego, głównie na podstawie takich parametrów jak wiek, waga, płeć pacjenta, towarzyszące inne zakażenia i choroby, z uwzględnieniem zasad sztuki lekarskiej. [0087] Określenie „podawanie środka leczniczego” odnosi się do profilaktycznego lub terapeutycznego przeciwdziałania wskazanym stanom chorobowym, przy doborze drogi podawania dostosowanej do miejsca zakażenia, rodzaju i nasilenia zakażenia, z uwzględnieniem drogi wnikania do organizmu niepożądanych bakterii ureolitycznych. [0088] Określenie „hamowanie kolonizacji” odnosi się do zmniejszenia zasięgu i/lub złagodzenia przebiegu zakażenia błon śluzowych lub innych tkanek wywołanego przez bakterie ureolityczne, bądź całkowitej eradykacji czynnika zakaźnego - prowadzące do ograniczania i/lub uniemożliwienia dalszego rozwijania się zakażenia w organizmie kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby. [0089] Określenie „zapobieganie kolonizacji” odnosi się do przeciwdziałania wzrostowi niepożądanych bakterii ureolitycznych w przypadku kontaktu tych bakterii z błoną śluzową organizmu kręgowca. Przy skutecznym zapobieganiu kolonizacji nie dochodzi w ogóle do zakażenia, bądź zakażenie błon śluzowych kręgowca - w tym czlowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby, następuje z dużą zwłoką w porównaniu ze stanem istniejącym przy braku zapobiegania kolonizacji. [0090] Określenie „suplement diety” oznacza skoncentrowane źródło składników odżywczych lub innych substancji o żywieniowym lub fizjologicznym efekcie działania, którego stosowanie sprzyja uzupełnieniu codziennej diety deficytowej w niektóre pożądane składniki. Suplementy diety są wytwarzane w wygodnej do stosowania postaci, np. w formie tabletek, kapsułek lub w postaci płynów odmierzonych w określonych dawkach. [0091] Określenie „środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego” oznacza produkt spożywczy o typowej dla danego środka postaci i recepturze, zawierający 17 EP 1 917 959 B1 jednakże dodatkowo składnik o zamierzonym działaniu terapeutycznym lub profilaktycznym. [0092] Określenie „dodatek do żywności/paszy” odnosi się do produktu zawierającego substancję aktywną jako taką lub w kompozycji, w postaci stałej lub płynnej, ewentualnie z dodatkiem nośników, buforów, detergentów, czynników zwiększających rozpuszczalność, przeciwutleniaczy, środków konserwujących i innych dodatków zgodnych z profilem działania substancji aktywnej i dopuszczonych do użytku spożywczego. Szczegółowy opis wynalazku [0093] Wynalazek dotyczy zastosowania alfa-ketoglutaranu w postaci pojedynczego związku lub mieszaniny różnych związków, do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce i/lub leczeniu stanów chorobowych wywołanych przez chorobotwórcze bakterie ureolityczne u kręgowców, w tym u ludzi, ssaków, ptaków, płazów i ryb. [0094] Skutek profilaktyczny lub terapeutyczny podawania środka wytwarzanego zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się stosując alfa-ketoglutaran w ilościach od 0,001 do 0,2 g/kg masy ciała/dzień. [0095] U podstaw obecnego wynalazku leży obserwacja, iż bakterie Helikobacter Helicobacter a najlepiej H. pylori zdolne są do przeżycia w silnie kwaśnym środowisku żołądka organizmów wyższych. [0096] Powszechnie znaną właściwością H. pylori jest ich zdolność przeżycia w niskim pH dzięki aktywności ureazy, która hydrolizuje mocznik obecny w błonie śluzowej żołądka i w soku żołądkowym (Saidijam M, Psakis G, Clough JL, Meuller J, Suzuki S, Hoyle CJ, Palmer SL, Morrison SM, Pos MK, Essenberg RC, Maiden MC, Abu-bakr A, Baumberg SG, Neyfakh AA, Griffith JK, Sachs G, Scott D, Weeks D, Melchers K. Gastric habitation by Helicobacter pylori: insights into acid adaptation. Trends Pharmacol Sci. 2000;21:413-416, Sachs G, Weeks DL, Melchers K, Scott DR. The gastric biology of Helicobacter pylori. Annu Rev Physiol. 2003;65:349-369, Sidebotham RL, Worku ML, Karim QN, Dhir NK, Baron JH. How Helicobacter pylori urease may affect external pH and influence growth and motility in the mucus environment: evidence from in-vitro studies. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003;15:395-401.). Schemat poszczególnych reakcji przebiega następująco: 18 EP 1 917 959 B1 [0097] (1) H2NCONH2 + H2O CO2 + 2 NH3 (2) CO2 +H2O H2CO3 (3) H2CO3 + 2NH3 NH4+ + HCO3- + NH3 (4) H+Cl- +NH3 NH4+ + Cl- Wynikiem procesu rozkładu mocznika jest wytworzenie amoniaku reagującego natychmiast z kwasem solnym tak, że w mikrośrodowisku tkankowym (błona śluzowa żołądka) drobnoustroju dochodzi do miejscowego podniesienia pH. Jak wiadomo, w naturalnych warunkach, błona śluzowa żołądka zachowuje odczyn kwaśny, z powodu produkowania HCl w komórkach okładzinowych. [0098] Mimo że pałeczki H. pylori są organizmami wrażliwymi, trudno hodującymi się in vitro, niskie pH żołądka - bójcze dla innych bakterii paradoksalnie sprzyjać może kolonizacji H. pylori. A to wynika głównie z obecności w otoczeniu endogennego mocznika, którego rozkład przez ureazę bakteryjną (enzym produkowany przez H. pylori) do amoniaku jest niezbędny do podniesienia pH w mikrośrodowisku tych bakterii. W ten sposób eliminowany zostaje letalny wpływ kwaśnego odczynu na wzrost H. pylori. Uważa się nawet (Nakazawa T. Growth cycle of Helicobacter pylori in gastric mucous layer. Keio J Med. 2002;51,S2:15-19.), że cykl rozwoju H. pylori w błonie śluzowej żołądka stymulują właściwości ureolityczne tych drobnoustrojów. Wykazano, że na poziomie komórki mRNA ureazy jest stabilizowany i destabilizowany w zależności od pH środowiska. Przyjęto, że bakterie do wzrostu wykorzystują substancje odżywcze pochodzące ze zdegradowanych komórek i kolonizują region o już zmienionym pH. Aktywacji ureazy towarzyszy otwarcie zależnego od pH kanału UreI w komórce bakteryjnej przez co łatwiej przebiega hydroliza mocznika (Weeks DL, Eskandari S, Scott DR, Sachs G. A H+-gated urea channel: the link between Helicobacter pylori urease and gastric colonization. Science. 2000;287:482-485, Weeks DL, Sachs G. Sites of pH regulation of the urea channel of Helicobacter pylori. Mol Microbiol. 2001;40:1249-1259.). Zauważono także zdolność H. pylori do przemieszczania się w kierunku mocznika zgodnie z gradientem stężenia, a chemotaksja przyspiesza sam proces hydrolizy mocznika. W ten sposób można tłumaczyć rozpoczęcie następnej rundy cyklu wzrostu, a w konsekwencji ustabilizowania się zakażenia w żołądku (Scott DR, Marcus EA, Weeks DL, Sachs G. Mechanisms of acid resistance due to the urease system of Helicobacter pylori. Gastroenterology. 2002;123:187-195, Scott DR, Marcus EA, Weeks DL, Lee A, Melchers K, Sachs G. 19 EP 1 917 959 B1 Expression of the Helicobacter pylori ureI gene is required for acidic pH activation of cytoplasmic urease. Infect Immun. 2000;68:470-477, Voland P, Weeks DL, Marcus EA, Prinz C, Sachs G, Scott D. Interactions among the seven Helicobacter pylori proteins encoded by the urease gene cluster. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003;284:96106.). [0099] Z drugiej strony wiadomo, że podczas degradacji aminokwasów - w wyniku oksydacyjnej deaminacji, grupy α-aminowe przenoszone są na α-ketokwasy czemu towarzyszy odłączenie jonu amonowego. Powstające w wyniku rozkładu aminokwasów jony amonowe częściowo biorą udział w biosyntezie związków azotowych, a ich nadmiar po przekształceniu w mocznik, zostaje usuwany poza organizm. W moczniku jeden z atomów azotu pochodzi bezpośrednio z jonu amonowego. [0100] W warunkach naturalnych, mocznik może swobodnie dyfundować z miejsca produkcji, czyli hepatocytów, do całego układu trzewnego, co wynika z niskiej masy cząsteczkowej (Mr 60) tego związku. Z uwagi na silne właściwości toksyczne jonu amonowego organizm broni się syntetyzując z niego związki niskotoksyczne takie jak mocznik (organizmy ureoteliczne - ssaki). Organizmy ureoteliczne nie mają zdolności magazynowania związków azotowych, co odnosi się do białek, aminokwasów i amoniaku. [0101] W ustroju, wolny amoniak występuje w śladowych ilościach, mimo stale przebiegającej deaminacji aminokwasów. Część jest wiązana natychmiast przez glutaminian i asparaginian. Część amoniaku zostaje wydalana przez nerki w postaci jonów amonowych. Przeważająca ilość toksycznego amoniaku ulega konwersji do mocznika w wątrobie, w cyklu ornitynowym. [0102] Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że po podaniu alfa-ketoglutaranu do środowiska żołądka następuje zmniejszenie populacji H. pylori. W warunkach doświadczenia in vivo poziom jonu amonowego jest stosunkowo niewielki i jego usunięcie przez alfa-ketoglutaran (wiązanie natychmiast w glutaminian i asparaginian), mimo ułatwionego transportu anionu do komórek błony śluzowej żołądka (dzięki DC transporterowi) prowadzi do śmierci bakterii ureolitycznych. Niezbędna – w przypadku H. pylori, ze względu na przetrwanie w środowisku żołądka, produkcja jonu amonowego z mocznika nie pokrywa zapotrzebowań bytowych pałeczek, ponieważ w tym czasie jon 20 EP 1 917 959 B1 amonowy jest utylizowany natychmiast z udziałem alfa-ketoglutaranu w syntezie glutaminianu i innych związków aminokwasowych. [0103] Ciągle nie do końca jest jasna przyczyna nadmiernej, w stosunku do substratu, produkcji ureazy przez H. pylori. Ureaza bakteryjna jest enzymem niklozależnym, w który dwuwartościowy kation niklu zostaje wbudowany potranslacyjnie. Przyjmuje się, że H. pylori dla utrzymania odpowiedniej ilości aktywnego enzymu, gromadzi go celem zabezpieczenia aktywności ureolitycznej potomnych komórek rosnących nawet w warunkach niedoboru niklu. Ze względu na intensywne wchłanianie soli kwasu alfaketoglutarowego w żołądku, H. pylori może również konkurować o dostęp do tych soli, co wymusza silną produkcję bakteryjnej ureazy w pierwotnej fazie zakażenia. [0104] W związku z faktem epidemicznego rozprzestrzeniania się zakażeń H. pylori, poszukiwanie środków ograniczających patologie wynikające z zakażenia jest tematem licznych doniesień. Patrz: El-Omar EM. Mechanisms of increased acid secretion after eradication of Helicobacter pylori infection. Gut. 2006;55:144-146., Wotherspoon AC, Ortiz-Hidalgo C, Falzon MR, Isaacson PG. Wotherspoon AC, Ortiz-Hidalgo C, Falzon MR, Isaacson PG. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 1991;338:1175-1176.). [0105] Alfa-ketoglutaran bierze udział wraz z jonami amonowymi w syntezie niektórych aminokwasów takich jak kwas glutaminowy, a następnie glutaminy, w reakcji o następującym przebiegu: O = C – COO- + NH4+ HCH HCH C=O OH H2N – CH – COOHCH HCH C=O OH alfa-ketoglutaran + jony amonowe [0106] glutaminian Właśnie ta zdolność alfa-ketoglutaranu do wiązania jonów amonowych, stanowiła przesłankę dla podjęcia badań nad obecnymi nowymi medycznymi zastosowaniami tego znanego związku. [0107] Założono, że powyższa przykładowa reakcja stanowi konkurencyjną ścieżkę wiązania jonów amonowych w stosunku do syntezy mocznika stanowiącego niezbędne 21 EP 1 917 959 B1 źródło azotu dla H. pylori, w środowisku żołądka, bądź innych bakterii ureolitycznych przykładowo w układzie moczowo-płciowym. [0108] Biorąc pod uwagę brak doniesień o szkodliwym działania alfa-ketoglutaranu na błonę śluzową żołądka i jelita cienkiego zdrowych ochotników, przeprowadzono obecnie szereg doświadczeń na zdrowych zwierzętach laboratoryjnych, mających na celu zbadanie wpływu alfa-ketoglutaranu na kolonizację żołądka i jelita cienkiego zdrowych zwierząt doświadczalnych przez bakterie H. pylori. [0109] Nieoczekiwanie, uzyskane wyniki potwierdziły przyjęte założenia i wykazały co następuje: 1. Nie zaobserwowano zmian w morfologii oraz grubości błony śluzowej żołądka zwierząt zakażanych H. pylori, a następnie otrzymujących alfa-ketoglutaran, ani też w grubości błony śluzowej jelita cienkiego oraz wysokości kosmków jelitowych i głębokości krypt u badanych zwierząt. 2. Nie zaobserwowano zmian w ilości bakterii kwasu mlekowego wyhodowanych z zeskrobin śluzu żołądka (część odźwiernikowa) u badanych zwierząt, w tym myszy zakażanych H. pylori, a następnie otrzymujących alfa-ketoglutaran. 3. Zaobserwowano zmniejszenie się ilości komórek produkujących gastrynę – hormon żołądkowy - zlokalizowanych w części odźwiernikowej gruczołów żołądkowych o 17 % (p < 0,01) u zwierząt zakażanych H. pylori i następnie otrzymujących alfaketoglutaran w stosunku do grupy kontrolnej (otrzymującej bufor fosforanowy PBS). U zwierząt zakażanych H. pylori i dodatkowo otrzymujących alfaketoglutaran występuje spadek poziomu gastryny we krwi (z 21,8 pM – 24,7 pM do 12,8 pM – 15,6 pM) (p < 0,05) co jest najprawdopodobniej wynikiem zmniejszenia ilości komórek produkujących gastrynę w błonie śluzowej żołądka. Fakt ten wskazuje na pośrednie (poprzez histaminę) hamujące oddziaływanie alfakeutoglutaranu na działanie pompy protonowej. Jej nadaktywność występuje w chorobie refluksowej. 4. Pewną tendencję do zmniejszenia ilości komórek produkujących cholecystokininę (CCK) – hormon tkankowy przewodu pokarmowego - stwierdzano w jelicie zwierząt laboratoryjnych otrzymujących alfa-ketoglutaran. Występuje spadek komórek CCK o 30% (bez różnicy statystycznej, p = 0,1) w porównaniu z tym samym segmentem jelita myszy nie zakażanych H. pylori, którym podano tylko 22 EP 1 917 959 B1 PBS. Nie stwierdzono w jelicie myszy istotnych różnic w liczbie komórek produkujących CCK w grupie zwierząt zakażanych H. pylori, a następnie otrzymujących alfa-ketoglutaran w porównaniu z myszami inokulowanymi tylko alfa-ketoglutaranem (p = 0,25). Niski poziom CCK we krwi (z 3,1 pM – 4,0 pM do 1,9 pM – 2,5 pM) (p < 0,05) u zwierząt zakażanych H. pylori i inokulowanych H. pylori, a następnie alfa-ketoglutaranem może być związany ze zmniejszeniem ilości komórek produkujących CCK w jelicie. W ten sposób niski poziom CCK stymulować może zwiększenie częstotliwości opróżniania żołądka, co uważane jest przez klinicystów za czynnik utrudniający dalszą kolonizację H. pylori i rozwijanie zakażenia. [0110] Bakteriobójcze działanie alfa-ketoglutaranu na pałeczki H. pylori [0111] Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że sól kwasu alfa-ketoglutarowego hamuje proces kolonizacji H. pylori w układzie pokarmowym ssaków. Z przeprowadzonych badań własnych wynika, że średnia liczba kolonii wyizolowanych ze śluzu części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H. pylori - w trzydziestym dniu od podania pierwszej porcji zawiesiny komórek tych bakterii wynosiła 7,8 x 102 ± 5,0 x 101. Natomiast w grupie zwierząt doświadczalnych, którym po 14 dniach od zakażenia przez 9 kolejnych dni podawano dożołądkowo sól kwasu alfaketoglutarowego, średnia liczba wyizolowanych kolonii wynosiła jedynie 3,8 x 102 ± 5,0 x 101. Dziewięciokrotne dożołądkowe podanie alfa-ketoglutaranu, utrzymywane przez 9 kolejnych dni, które rozpoczęto po 14 dniach przerwy od ostatniej dawki zakażającej myszy bakteriami H. pylori spowodowało więc spadek o 49 % stopnia kolonizacji błony śluzowej żołądka przez H. pylori. Wyniki te dowodzą hamującego działania soli kwasu alfa-ketoglutarowego w procesie kolonizacji żołądka przez baterie H. pylori. [0112] W innym doświadczeniu stwierdzono, że średnia liczba kolonii wyizolowanych ze śluzu części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H. pylori - w dwudziestym dniu od podania pierwszej porcji zawiesiny komórek tych bakterii, wynosiła 4,3 x 102 ± 5,0 x 101. Natomiast w grupie zwierząt doświadczalnych, którym po 8 dniach od zakażenia przez 3 kolejne dni podawano dożołądkowo alfa-ketoglutaranu nie wyhodowano żadnej kolonii H. pylori. Trzykrotne dożołądkowe podanie alfaketoglutaranu, utrzymywane przez 3 kolejne dni, które rozpoczęto po 8 dniach przerwy od 23 EP 1 917 959 B1 ostatniej dawki zakażającej myszy bakteriami H. pylori spowodowało pełne zahamowanie kolonizacji i całkowitą eradykację bakterii H. pylori z błony śluzowej żołądka. [0113] Podczas obserwacji, uległ zmianie skład mikroflory żołądka i zidentyfikowany został u myszy zakażanych H. pylori również DNA H. bilis, natomiast u myszy, które dodatkowo inokulowano alfa-ketoglutaranem – wyłącznie DNA H. rodentium, H. bilis, H. hepaticus, zaś u myszy kontrolnych, którym podawano sole kwasu alfa-ketoglutarowego zidentyfikowano DNA H. hepaticus i H. rodentium. U myszy traktowanych PBS nie stwierdzono w badanej tkance DNA bakterii z rodzaju Helicobacter. [0114] Te wyniki uzyskano stosując rutynowe metody diagnostyczne poparte klasycznymi technikami, które zakładają wyhodowanie żywego mikroorganizmu, w celu potwierdzenia obecności bakterii w tkance (spełnienie postulatów Kocha). Dodatkowo badania wsparto metodami detekcji DNA H. pylori a także DNA innych niechorobotwórczych bakterii z rodzaju Helicobacter. Przeprowadzenie PCR i rozdział produktów PCR w elektroforezie w gradiencie denaturacji (DGGE), a następnie sekwencjonowanie produktów, w celu stwierdzenia składu DNA jest sposobem uchwycenia zmian, które zostały obecnie wykazane. W praktyce, w wyniku sekwencjonowania nie stwierdzono DNA H. pylori (na poziomie czułości barwienia bromkiem etydyny) u traktowanych alfa-ketoglutaranem myszy. [0115] Alfa-ketoglutaran jest więc doskonałą substancją czynną dla dużej i zróżnicowanej grupy odbiorców, wymagających zabiegów profilaktycznych i leczniczych w przypadkach zakażeń H. pylorii oraz zakażeń dróg moczowo-płciowych wywoływanych bakteriami ureolityczynymi. [0116] Zupełnie odmienny od dotychczas poznanych, mechanizm bójczego działania alfa-ketoglutaranu na bakterie ureolityczne, pozwoli na bezpieczną eradykację tych drobnoustrojów z organizmu, bez obawy indukowania i narastania lekoodporności wśród bakterii ureolitycznych. W praktyce łączy się to z ograniczeniem nawrotów zakażeń, nadkażeń oraz utrudnionej antybiotykoterapii. [0117] Jak obecnie ustalono, alfa-ketoglutaran działa wspomagająco lub alternatywnie dla standardowego leczenia antybiotykami. Poza tym, w stanach wyniszczenia organizmu służyć może do balansowania naturalnej flory ureolitycznej. 24 EP 1 917 959 B1 [0118] Zgodnie z wynalazkiem wykorzystuje się alfa-ketoglutaran i/lub odpowiednie prekursory uwalniające w warunkach in vivo anion kwasu alfa-ketoglutarowego do wytwarzania środka medycznego do stosowania w profilaktyce i/lub leczeniu stanów chorobowych wywoływanych przez bakterie ureolityczne. [0119] Środek uzyskiwany zgodnie z wynalazkiem jest w szczególności przydatny do zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji H. pylori. [0120] Jako alfa-ketoglutaran, korzystnie stosuje się sole kwasu alfa-ketoglutarowego i metali alkalicznych i/lub soli ziem alkalicznych, i/lub chitozanu - jednopodstawione lub dwupodstawione. Korzystną solą jest sól sodowa i/lub sól wapniowa. [0121] Alfa-ketoglutaran można zgodnie z wynalazkiem stosować w stosunku do ludzi i zwierząt jako środek leczniczy, suplement diety, środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego i/lub dodatek do żywności/paszy, w zależności od warunków, do hamowania kolonizacji H. pylori u ludzi i zwierząt, w celu zabezpieczenia przed zakażeniem H. pylori i jego następstwami, bądź celem złagodzenia przebiegu zakażenia H. pylori i jego następstw. [0122] Alfa-ketoglutaran można podawać ze znanymi nośnikami i z dodatkami, które są dopuszczalne farmaceutycznie i współdziałają z wybranymi prekursorami alfaketoglutaranu. Odpowiednimi dodatkami są, na przykład, woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol, etanol lub podobne oraz ich kombinacje. Ponadto, jeśli jest to pożądane, środek może zawierać substancje pomocnicze takie jak na przykład czynniki zwilżające lub emulgujące, czynniki modulujące pH, czynniki buforujące i inne. [0123] Zgodnie z wynalazkiem środek zawierający alfa-ketoglutaran można przygotować w postaci stałej i/lub płynnej, dostosowanej do wybranej drogi podawania. [0124] Wynalazek dotyczy także zastosowania alfa-ketoglutaranu do wytwarzania preparatów do zwalczania i profilaktyki zakażeń innymi bakteriami ureolitycznymi. Przykłady dalszych medycznych zastosowań alfa-ketoglutaranu obejmują zastosowania do wytwarzania środka do hamowania pasażu patogennych bakterii ureolitycznych przez żołądek trawienny, środka zapobiegającego tworzeniu się w drogach moczowych złogów i kamieni zakaźnych, środka do ograniczenia procesu formowania biofilmu i mineralizacji złogów na cewnikach, kateterach i innym sprzęcie medycznym, jak również środkach do hamowania rozwoju patogennych bakterii ureolitycznych w układzie moczowo-płciowym, 25 EP 1 917 959 B1 do stosowania w postaci wlewów docewnikowych, globulek, płynów do irygacji, globulek dopochwowych. [0125] Zgodnie z obecnym wynalazkiem alfa-ketoglutaran nadaje się do stosowania także u psów, kotów i zwierząt udomowionych, w postaci wlewów dopęcherzowych w stanach zakażeń bakteryjnych wywoływanych przez bakterie ureolityczne. [0126] Dalszym przykładem nowego zastosowania alfa-ketoglutaranu jest jego wykorzystanie do wytwarzania środka do regulacji ureolitycznej flory jamy ustnej i ograniczającego tworzenie kamienia nazębnego oraz rozwój próchnicy. Środek ten może mieć postać gumy do żucia, bądź pasty do zębów. [0127] Alfa-ketoglutaran znajduje także nowe zastosowanie zgodnie z wynalazkiem do wytwarzania środka do hamowania wzrostu bakterii ureolitycznych, szczególnie Ureaplasma i innych mykoplazm wywołujących zakażenia ryb. W tym zakresie nowym zastosowaniem alfa-ketoglutaranu jest jego wykorzystanie do wytwarzania środka do stosowania w profilaktyce zapalenia skrzeli u karpia i narybku karpia oraz u innych ryb słodkowodnych i morskich wywoływanego przez wskazane bakterie ureolityczne. [0128] Wynalazek obejmuje także zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania suplementów diety, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego oraz dodatków do żywności/pasz przydanych w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji H. pylori. [0129] Poniższe przykłady bliżej objaśniają obecny wynalazek. Przykład 1. [0130] Zwierzęta doświadczalne sześciotygodniowe myszy rasy BALB/cA (samice) o wadze 23 ± 2 g. w liczbie 28 (fig. 1). Czternastu myszom sondą dożołądkową (zew. średnica = 1,3 mm) aplikowano trzykrotnie z odstępami jednodniowymi 0,2 ml zawiesiny komórek H. pylori szczepu 119/95 o gęstości 109 cfu/ml. Dwa tygodnie po ostatnim podaniu, siedem myszy inokulowano dożołądkowo przez dziewięć kolejnych dni w taki sam sposób roztworem soli wapniowej lub sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml, stężenie 30 mM) (grupa I A). Pozostałe 7 myszy otrzymywały 0,01 M buforu fosforanowego - PBS (grupa I B) tak samo jak zwierzęta z grupy I A. 26 EP 1 917 959 B1 [0131] Czternastu kolejnym myszom z grupy II A i II B podawano 0,2 ml PBS według schematu obowiązującego przy zakażaniu zwierząt H. pylori. Po dwutygodniowej przerwie siedem myszy nadal otrzymywało PBS (0,2 ml) przez kolejnych 9 dni (grupa II B). Pozostałym 7 myszom wprowadzano roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml, stężenie 30 mM) (grupa II A). [0132] W 30-ym dniu doświadczenia zwierzęta usypiano ditlenkiem węgla. Do dalszych badań pobierano próbki krwi i żołądka od myszy zakażanych H. pylori z lub bez następującej inokulacji solami kwasu alfa-ketoglutarowego lub otrzymujących wyłącznie sole kwasu alfa-ketoglutarowego. Schemat doświadczalnego zakażania myszy bakteriami H. pylori przedstawiono na rysunku fig. 1. W doświadczeniu tym badano zależność stopnia kolonizacji H. pylori błony śluzowej żołądka myszy (n=28) od dożołądkowego podania soli kwasu alfa-ketoglutarowego w opisanym wyżej reżimie czasowym. [0133] Na rysunku fig. 1 użyto następujących oznaczeń. Myszom z grup doświadczalnych (n=28) podawano dożołądkowo następujące preparaty: zawiesinę komórek H. pylori: #; roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego: ♦; roztwór PBS: ●. Nazwa szczepu, gęstość i objętość inoculum (H. pylori) oraz stężenia i dawki: soli kwasu alfaketoglutarowego i PBS odpowiadają informacjom podanym wyżej. Wytłuszczone liczby oznaczone literą S wskazują dzień sekcji zwierząt. Sekcje przeprowadzano z zachowaniem wymaganych powszechnie obowiązujących standardów. [0134] Próbki krwi od wszystkich zwierząt posiewano w podłoże GAB-CAMP, hodowano w temperaturze 37oC, w warunkach mikroaerofilnych przez 7 – 10 dni. Z połowy części odźwiernikowej żołądka zeskrobywano śluz, który następnie łączono z 500 µl jałowego PBS. Po zważeniu homogenatów stwierdzono, że ilość śluzu zeskrobanego z połowy części odźwiernikowej wahała się między 40 µg a 50 µg. W celu określenia liczby H. pylori w 100 µl homogenatu śluzu żołądkowego rozprowadzano na podłożu GABCAMP, które następnie inkubowano w 37oC przez 5-10 dni, w warunkach mikroaerofilnych. Homogenat uzyskany od każdej myszy badano w trzech powtórzeniach. W wynikach podana została wartość średnia ± SD. W celu identyfikacji wyizolowanych kolonii określano właściwości biochemiczne bakterii - testy na aktywność katalazy, oksydazy i ureazy oraz oceniano morfologię komórek w preparatach barwionych metodą Grama. 27 EP 1 917 959 B1 [0135] Od zwierząt otrzymujących dożołądkowo PBS i sole kwasu alfa- ketoglutarowego (Grupa II A na fig. 1), albo PBS (Grupa II B na fig. 1) nie wyizolowano H. pylori z badanych tkanek. [0136] Z próbek żołądka zwierząt otrzymujących H. pylori, którym następnie podano sole kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa I A na fig. 1) lub PBS (Grupa I B na fig. 1) wyhodowano bakterie między 5 i 10 tym dniem inkubacji. Średnia liczba kolonii wyizolowanych ze śluzu części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H. pylori wynosiła 7,8 x 102 ± 5,0 x 101 natomiast po dożołądkowym podaniu myszom soli kwasu alfa-ketoglutarowego zgodnie z podanym reżimem - średnia liczba wyizolowanych kolonii wynosiła 3,8 x 102 ± 5,0 x 101 (fig. 3). Dziewięciokrotne dożołądkowe podanie, utrzymywane przez 9 kolejnych dni, soli kwasu alfa-ketoglutarowego, które rozpoczęto po 14 dniach przerwy od ostatniej dawki zakażającej myszy bakteriami H. pylori spowodowało więc spadek o 49 % stopnia kolonizacji błony śluzowej żołądka przez H. pylori. Z tego wynika hamujące działanie soli kwasu alfa-ketoglutarowego na proces kolonizacji żołądka przez baterie H. pylori. [0137] Z próbek krwi pobranych od badanych myszy nie wyhodowano ani H. pylori ani innych bakterii. [0138] Uzyskane wyniki zebrano w poniższej Tablicy 1 Tablica 1. Bakterie H. pylori wyizolowane z homogenatów śluzu żołądka myszy niezakażanych i zakażanych H. pylori z lub bez następującej inokulacji soli kwasu alfa-ketoglutarowego Wyhodowane H. pylori** Liczba myszy Stosowane preparaty* inokulowanych w grupie Liczba bakterii (cfu)/mysz H. pylori + PBS (Grupa I B) 7/7 7,8 x 102 ± 5,0 x 101 PBS (Grupa II B) 0/7 0 H. pylori + AKG (Grupa I A) 7/7 3,8 x 102 ± 5,0 x 101 PBS + AKG (Grupa II A) 0/7 0 28 EP 1 917 959 B1 */ według schematu na fig. 1, **/ bakterie hodowano na podłożu stałym GAB-CAMP. Zwierzęta zakażane tylko H. pylori (H. pylori + PBS), zakażane H. pylori i otrzymujące sole kwasu alfa-ketoglutarowego (H. pylori + AKG) oraz grupy kontrolne zwierząt niezakażanych, inokulowanych samym PBS lub PBS i solami kwasu alfa-ketoglutarowego (PBS + AKG). Przykład 2. [0139] Zwierzęta doświadczalne sześciotygodniowe myszy rasy BALB/cA (samice) o wadze 23 ± 2 g. w liczbie 48 (fig. 2). Dwudziestu czterem myszom (fig. 2) z grupy III B i III aplikowano dożołądkowo, trzykrotnie z jednodniowymi odstępami po 0,2 ml zawiesiny H. pylori 119/95 o stężeniu 109 cfu/ml. Po ośmiu dniach, szesnastu myszom podawano sondą przez trzy kolejne dni 0,2 ml roztworu 30 mM soli kwasu alfa-ketoglutarowego (grupa III B). Kolejne 8 myszy otrzymywało wyłącznie po 0,2 ml 0,01 M PBS (grupa III) według schematu postępowania z grupą III B. [0140] Pozostałym 24 myszom (fig. 2) aplikowano dożołądkowo, trzykrotnie z jednodniowymi odstępami po 0,2 ml 0,01 M PBS. Po ośmiu dniach, szesnastu myszom podawano sondą przez trzy kolejne dni roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml, stężenie 30 mM) (grupa IV B). Kolejne 8 myszy otrzymywało po 0,2 ml 0,01 M PBS (grupa IV). [0141] W 20-ym dniu doświadczenia zwierzęta usypiano ditlenkiem węgla. Do dalszych badań pobierano od myszy próbki żołądka i krwi. [0142] Na rysunku fig. 2 użyto następujących oznaczeń. Myszom z grup doświadczalnych (n=76) podawano dożołądkowo następujące preparaty: zawiesinę komórek H . pylori: #; roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego: ♦; roztwór PBS: ●. Nazwa szczepu, gęstość i objętość inoculum (H. pylori) oraz stężenia i dawki: soli kwasu alfa-ketoglutarowego i PBS jak podano w przykładzie 1. Wytłuszczone liczby oznaczone literą S wskazują dzień sekcji zwierząt. Sekcje przeprowadzano z zachowaniem wymaganych powszechnie obowiązujących standardów. [0143] Z pobranych próbek, tak jak to przedstawiono w przykładzie 1, hodowano bakterie H. pylori na podłożu GAB-CAMP. Izolowano również DNA w celu przeprowadzenia PCR ze starterami (5`-CTATGACGGGTATCCGGC-3', N16S1R: 5'CTCACGACACGAGCTGAC-3') dla fragmentu 16S rDNA charakterystycznego dla DNA 29 EP 1 917 959 B1 bakterii z rodzaju Helicobacter. Następnie produkty PCR o wielkości 470 par zasad rozdzielano techniką elektroforezy w gradiencie denaturacji (DGGE) i sekwencjonowano. Analiza DGGE przeprowadzona została w 9% żelu poliakryloamidowym (akrylamid/bisakrylamid w proporcji 37,5:1). Elektroforezę przeprowadzono w 60°C w 125 V przez 16 godz. [0144] Uzyskane wyniki zebrano w poniższej Tablicy 2. Tablica 2. Bakterie z rodzaju Helicobacter, w tym H. pylori, w homogenatach śluzu żołądka (część odźwiernikowa) myszy zakażanych H. pylori z lub bez następującej inokulacji solami kwasu alfa-ketoglutarowego Wyhodowane H. pylori Stosowane preparaty * H. pylori + PBS (Grupa III) H. pylori + AKG (Grupa III B) PBS + AKG (Grupa IV B) PBS (Grupa IV) Liczba myszy zakażonych PCR 16S rDNA – Helicobacter spp. Liczba bakterii Liczba myszy z DNA H.pylori z DNA innym niż H.pylori w grupie (cfu)/mysz w grupie 8/8 4,3 x 102 ± 5,0 x 101 8/8 2/8 0/16 0 0/16 5/16 0/16 0 0/16 3/16 0/8 0 0/8 0/8 w grupie */ według schematu na fig. 2. Zwierzęta zakażane tylko H. pylori (H. pylori + PBS), zakażane H. pylori i otrzymujące sole kwasu alfa-ketoglutarowego (H. pylori + AKG) oraz grupy kontrolne zwierząt niezakażanych, inokulowanych samym PBS lub PBS i solami kwasu alfaketoglutarowego (PBS + AKG). [0145] Z żołądków ośmiu myszy zakażanych H. pylori + PBS (Grupa III na fig. 2) wyhodowano H. pylori (Tablica 2). W DNA wyizolowanym z tych samych próbek żołądka metodą PCR, zidentyfikowano fragment charakterystyczny dla 16S rDNA H. pylori. 30 EP 1 917 959 B1 [0146] Z próbek żołądków pozyskanych od 16 myszy zakażanych H. pylori i solami kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa III B na fig. 2) nie wyhodowano ani H. pylori, ani też w produktach PCR nie stwierdzono sekwencji właściwych dla H. pylori. (Tablica 2). [0147] Nie wyhodowano pałeczek H. pylori z próbek krwi pobranych od tych zwierząt. Z udziałem wybranych starterów reakcji, nie uległ powieleniu DNA izolowany z krwi ani też z żołądków 8 myszy, które otrzymywały PBS (Grupa IV na fig. 2). [0148] Na załączonym rysunku Fig. 3 zilustrowano ruchliwość produktów PCR właściwych dla fragmentu 16S rDNA bakterii z rodzaju Helicobacter w polu elektrycznym ocenianych techniką DGGE. Jako markery M użyto: A: H. muridorum, B: H. bilis, C: H. pullorum, D: H. pylori, E: Helicobacter spp. flexispira takson 8 ”F. rappini”, F: H. hepaticus, G: H. bizzozeronii. Strzałka wskazuje DNA H. bilis. Cyfry od 1 do 8 oznaczają ścieżki migrujących produktów PCR z obecnego przykładu 2. [0149] W 16 produktach PCR z DNA izolowanego z części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych H. pylori i traktowanych lub nie traktowanych następnie solami kwasu alfa-ketoglutarowego lub też myszy niezakażanych, wykryto 19 fragmentów DNA odpowiadających 470 parom zasad. Wyniki zilustrowano na rysunku Fig. 3, oraz w poniższej Tablicy 3. W wyniku sekwencjonowania tych 16 fragmentów DNA (rozdzielonych wcześniej DGGE) otrzymane sekwencje (n=19) odpowiadały H. pylori (n=8), a także H. rodentium (n=4), H. bilis (n=3) oraz H. hepaticus (n=4) (fig. 3). Tablica 3. Wyniki sekwencjonowania produktów PCR uzyskanych z powielenia DNA izolowanego z homogenatów zeskrobin błony śluzowej żołądka (część odźwiernikowa) Wykaz preparatów* Produkty PCR Helicobacter spp. H. pylori + PBS 1. H. pylori (Grupa III) 2. H. pylori 3. H. pylori 4. H. pylori 5. H. pylori, H. bilis 6. H. pylori 7. H. pylori, H. bilis 8. H. pylori 31 EP 1 917 959 B1 H. pylori + AKG 1. H. rodentium, H. bilis (Grupa III B) 2. H. hepaticus 3. H. rodentium 4. H. hepaticus 5. H. rodentium PBS + AKG 1. H. hepaticus (Grupa IV B) 2. H. hepaticus 3. H. rodentium */ według schematu na fig. 2. Zwierzęta zakażane tylko H. pylori (H. pylori + PBS), zakażane H. pylori i otrzymujące sole kwasu alfaketoglutarowego (H. pylori + AKG) oraz niezakażane, inokulowane PBS i solami kwasu alfa-ketoglutarowego (PBS + AKG). [0150] Jak wynika z powyższej Tablicy 3, DNA dwóch gatunków Helicobacter: H. pylori i H. bilis oraz H. rodentium i H. bilis wykryto u 3 różnych myszy. W próbkach żołądka 2 myszy z grupy III (H. pylori + PBS) wykryto H. pylori i H. bilis. W próbce żołądka myszy z grupy III B (H. pylori + sole kwasu alfa-ketoglutarowego) wykryto H. rodentium i H. bilis (Tablica 3). Poza tym DNA H. hepaticus zidentyfikowano u 4 zwierząt, to jest u dwóch myszy z grupy III B (H. pylori + sole kwasu alfaketoglutarowego), i dwóch, którym podawano PBS + sole kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa IV B) (Tablica 3). [0151] DNA H. bilis nie występował oddzielnie w żadnym z produktów PCR, natomiast DNA H. rodentium w 3 amplifikatach znajdował się bez innych towarzyszących sekwencji, a w jednej próbce wspólnie z DNA H. bilis (fig. 3, Tablica 3). [0152] W podsumowaniu, średnia liczba kolonii wyizolowanych ze śluzu części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H. pylori (Grupa III) wynosiła 4,3 x 102 ± 5,0 x 101 natomiast po dodatkowym wprowadzeniu dożołądkowym myszom soli kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa III B) nie wyhodowano żadnej kolonii H. pylori (Tablica 2). Trzykrotne dożołądkowe podanie, utrzymywane przez 3 kolejne dni, soli kwasu alfa-ketoglutarowego, które rozpoczęto po 8 dniach przerwy od ostatniej dawki zakażającej myszy bakteriami H. pylori spowodawało całkowite zahamowanie kolonizacji i pełną eradykację bakterii H. pylori z błony śluzowej żołądka. 32 EP 1 917 959 B1 [0153] Dodatkowo w tym czasie uległ zmianie skład mikroflory ureolitycznej żołądka i zidentyfikowany został u myszy zakażanych H. pylori (Grupa III) również DNA H. bilis, natomiast u myszy, które dodatkowo inokulowano solami kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa III B) wyłącznie DNA H. rodentium, H. bilis, H. hepaticus, a u myszy kontrolnych, którym podawano sole kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa IV B) zidentyfikowano DNA H. hepaticus i H. rodentium. U myszy traktowanych PBS (Grupa IV) nie stwierdzono w badanej tkance DNA bakterii z rodzaju Helicobacter. Przykład 3. [0154] Sporządzono wodny roztwór mieszaniny lub oddzielnie każdej z osobna soli wapniowej oraz sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego i zastosowano je jako dodatek do produktów mlecznych oraz napojów [0155] Sól kwasu alfa-ketoglutarowego 0,001g do 0,2 g Glukoza 20 g Woda do 100 g Terapeutycznie i/lub profilaktycznie skuteczna ilość wynosi od 0,001g do 0,2 g/kg masy ciała na dawkę dzienną. [0156] Przy użyciu zwierząt modelowych (mysz) oraz przy udziale ochotników wykazano aktywność profilaktyczną, łagodzącą przebieg zakażenia, a także ograniczającą kolonizację układu pokarmowego przez H. pylori w wyniku wprowadzenia soli sodowej lub/i wapniowej kwasu alfa-ketoglutarowego w formie wodnego roztworu, dożołądkowo lub doustnie. [0157] Przedstawione przykłady ilustrują konkurencję między ureolitycznymi bakteriami – w tym wypadku H. pylori, a komórkami organizmu gospodarza o dostęp do substratu czyli mocznika. Wprowadzenie dożołądkowe soli kwasu alfa-ketoglutarowego ułatwiło wykorzystanie rozłożonego przez bakterie urolityczne mocznika do amoniaku dla potrzeb makroorganizmu, czyli do syntezy glutaminianu przy udziale alfa-ketoglutaranu. Tak, że mimo aktywności ureazy bakteryjnej, nie nastąpiło miejscowo zniesienie kwasowego odczynu środowiska żołądka zapewniającego mikroniszę dla wzrostu komórek H. pylorii. W ten sposób utrudniona i uniemożliwiona została kolonizacja błony śluzowej makroorganizmu przez te ureolityczne bakterie. Stosowanie alfa-ketoglutaranu zapobiega również zakażeniom wywoływanym przez ureolityczne bakterie. 33 EP 1 917 959 B1 Zastrzeżenia 1. Zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania środka leczniczego do profilaktyki lub leczenia niepożądanych stanów medycznych związanych z obecnością i/lub aktywnością bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby, w formulacjach dostosowanych do podawania do miejsca występowania zwalczanych bakterii ureolitycznych. 2. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, w którym niepożądanym stanem medycznym jest stan związany z obecnością i/ lub aktywnością w układzie trawiennym, oddechowym i /lub moczowo-płciowym, bakterii ureolitycznych z grupy obejmującej Helicobacter pylori, szczepy bakteryjne z rodzaju Brucella, ureazododatnie bakterie takie jak Ureaplasma urealyticum i inne bakterie alkalifilne, takie jak przykładowo Bacillus pasteurii, produkujące ureazę pałeczki Yersinia enterocolica, bakterie ureolityczne, które biorą udział w formowaniu biofilmu i mineralizacji złogów na kateterach i innych sprzętach medycznych, bakterie ureolityczne wywołujące zakażenia błony śluzowej jamy ustnej, choroby przydziąśla, próchnicę zębów i powodujące tworzenie kamienia nazębnego, bakterie ureolityczne odpowiedzialne za powstawanie kamieni zakaźnych w przebiegu zakażeń układu moczowego z rodzaju Proteus, Ureaplasma, Klebsiella, Pseudomonas, Staphylococcus, Providencia, Corynebacterium, zwłaszcza P. mirabilis oraz mykoplazmy wywołujące zakażenia dróg płciowych – w szczególności infekcje ich dolnego odcinka, Mycoplasma hominis oraz U. urealyticum. 3. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek przeciwdziałający kolonizacji H. pylori oraz skutkom kolonizacji H. pylori, zwłaszcza chorobom takim jak choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy, chłoniaki żołądka, przewlekłe zanikowe zapalenie żołądka z metaplazją jelitową oraz rak żołądka. 4. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do regulacji ureolitycznej flory jelitowej, stabilizujący integralność układową i do stosowania dla zbalansowania flory jelitowej po przebytych chorobach zakaźnych i wyniszczających (kaheksyjnych). 34 EP 1 917 959 B1 5. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do regulacji ureolitycznej flory jamy ustnej, ograniczający tworzenie się kamienia nazębnego i hamujący próchnicę zębów, w postaci gumy do żucia lub pasty do zębów. 6. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do hamowania pasażu przez żołądek patogennych bakterii ureolitycznych. 7. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek zapobiegający tworzeniu się w układzie moczowym złogów i kamieni zakaźnych. 8. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do hamowania wzrostu bakterii ureolitycznych, szczególnie Ureaplasma i innych mykoplazm wywołujących zakażenia u ryb. 9. Zastosowanie według zastrzeżenia 8, w którym wytwarzany jest środek do stosowania w profilaktyce zapalenia skrzeli u karpia i narybku karpia oraz u innych ryb słodkowodnych i morskich, wywoływanego przez pewne bakterie ureolityczne. 10. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do ograniczania formowania biofilmu i mineralizacji złogów na kateterach i innych sprzętach medycznych. 11. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrzeżeń 1 do 10, w którym wytwarzany jest środek zawierający alfa-ketoglutaran w ilościach dostosowanych do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce, w szczególności w dawce od 0,001 do 0,2 g/kg masy ciała/dzień. 12. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrzeżenia 1 do 11, w którym wytwarzany jest środek do stosowania w postaci doustnej, w postaci wlewów, płynów do irygacji, globulek dopochwowych lub w innych formulacjach dostosowanych do drogi podawania. 13. Alfa-ketoglutaran do stosowania jako środek przeciwbakteryjny skuteczny przeciw bakteriom ureolitycznym, kiedy podawany jest do miejsca występowania zwalczanych bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby. 35 EP 1 917 959 B1 14. Środek leczniczy do stosowania w profilaktyce i leczeniu niepożądanych stanów medycznych związanych z obecnością i/lub aktywnością bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby w formulacjach dostosowanych do podawania do miejsca występowania zwalczanych bakterii ureolitycznych, wytworzony zgodnie z dowolnym spośród zastrzeżeń 1 do 12. 15. Zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania suplementu diety, zapobiegającego niepożądanym stanom medycznym, związanym z obecnością i/lub aktywnością bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby. 16. Zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego, zapobiegającego niepożądanym stanom medycznym związanym z obecnością i/lub aktywnością bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby. 17. Zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania dodatku do żywności/paszy, o działaniu profilaktycznym zapobiegający kolonizacji przez H. pylori kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby. 36 EP 1 917 959 B1 37 EP 1 917 959 B1 38 EP 1 917 959 B1 39 EP 1 917 959 B1 WCZEŚNIEJSZE PUBLIKACJE WYMIENIONE W OPISIE: Niniejsza lista publikacji przywołanych przez Zgłaszającego przygotowana jest wyłącznie dla wygody czytelników. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Chociaż dołożono wielkiej staranności przy układaniu listy przywołanych publikacji, nie można wykluczyć błędów lub pominięć, a Europejski Urząd Patentowy uchyla się od wszelkiej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe wymienione w opisie • • • • JP 49019855 B [0026] WO 2007058612 A [0029] WO 2005123056 A [0030] EP 0922459 A [0031] • WO 2006016143 A [0032] • WO 2006062424 A [0033] • WO 2006016828 A [0034] Literatura nie-patentowa wymieniona w opisie • DATABASE WPI. Week. Derwent Publica-tions Ltd, 1974 [0026] • UENO PHARMACEUTICAL, 1974 [0026] • Williams AG; Noble J; Banks JM. The effect of alpha-ketoglutaric acid on amino acid utilization by nonstarter Lactobacillus spp. isolated from Cheddar cheese. Lett. Appl. Microbiol., 2004, tom 38, 289-295 [0027] • Oca J; Bettonica C; Cuadrado S; Vallet J; Martin E; Garcia A; Montanes T; Jaurrieta E. Effect of oral supplementation of ornithinealpha-ketoglutarate on the intestinal barrier after orthotopic small bowel transplantation. Transplantation, 1997, tom 63, 636-639 [0037] • Schlegel L; Coudray-Lucas C; Barbut F; Le Boucher J; Jardel A; Zarrabian S; Cynober L. Bacterial dissemination and metabolic changes in rats induced by endotoxemia following intestinal E. coli overgrowth are reduced by ornithine alpha-ketoglutarate administration. J Nutr., 2000, tom 130, 28972902 [0038] • Marshall BJ; Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet, 1984, tom 1, 1311-1315 [0053] • IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Lyon. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum., 07 June 1994, tom 61, 1-241 [0053] • Saidijam M; Psakis G; Clough JL; Meuller J; Suzuki S; Hoyle CJ; Palmer SL; Morrison SM; Pos MK; Essenberg RC. Gastric habitation by Helicobacter pylori: insights into acid adaptation. Trends Pharmacol Sci., 2000, tom 21, 413-416 [0096] • Sachs G; Weeks DL; Melchers K; Scott DR. The gastric biology of Helicobacter pylori. Annu Rev Physiol., 2003, tom 65, 349-369 [0096] • Sidebotham RL; Worku ML; Karim QN; Dhir NK; Baron JH. How Helicobacter pylori urease may affect external pH and influence growth and motility in the mucus environment: evidence from in-vitro studies. Eur J Gastroente-rol Hepatol., 2003, tom 15, 395-401 [0096] • Nakazawa T. Growth cycle of Helicobacter pylori in gastric mucous layer. Keio J Med., 2002, tom 51 (S2), 15-19 [0098] • Weeks DL; Eskandari S; Scott DR; Sachs G. A H+-gated urea channel: the link between Helicobacter pylori urease and gastric colonization. Science, 2000, tom 287, 482-485 [0098] • Weeks DL; Sachs G. Sites of pH regulation of the urea channel of Helicobacter pylori. Mol Microbiol., 2001, tom 40, 1249-1259 [0098] • Scott DR; Marcus EA; Weeks DL; Sachs G. Mechanisms of acid resistance due to the urease system of Helicobacter pylori. Gastroenterology, 2002, tom 123, 187-195 [0098] • Scott DR; Marcus EA; Weeks DL; Lee A; Melchers K; Sachs G. Expression of the Helicobacter pylori ureI gene is required for acidic pH activation of cytoplasmic urease. Infect Immun., 2000, tom 68, 470-477 [0098] • Voland P; Weeks DL; Marcus EA; Prinz C; Sachs G; Scott D. Interactions among the seven Helicobacter pylori proteins encoded by the urease gene cluster. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 2003, tom 284, 96-106 [0098] • El-Omar EM. Mechanisms of increased acid secretion after eradication of Helicobacter pylori infection. Gut, 2006, tom 55, 144-146 [0104] • Wotherspoon AC; Ortiz-Hidalgo C; Falzon MR; Isaacson PG; Wotherspoon AC; Ortiz-Hidalgo C; Falzon MR; Isaacson PG. Helicobacter pyloriassociated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet, 1991, tom 338, 1175-1176 [0104] 40
