RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
03.07.2007 07460015.6
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
1917959
T3
Int.Cl.
A61K 31/194 (2006.01)
A61P 31/00 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
19.01.2011 Europejski Biuletyn Patentowy 2011/03
EP 1917959 B1
Tytuł wynalazku:
Nowe medyczne zastosowanie alfa-ketoglutaranu
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
03.07.2006 PL 38010306
Zgłoszenie ogłoszono:
07.05.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/19
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.06.2011 Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/06
(73)
Uprawniony z patentu:
PL/EP 1917959 T3
Kruszewska, Danuta, Warszawa, PL
(72)
Twórca(y) wynalazku:
DANUTA KRUSZEWSKA, Warszawa, PL
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Ewa Malewska
EWA MALEWSKA & PARTNERS
skr. poczt. 613
00-950 Warszawa
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 1 917 959 B1
Opis
[0001]
Wynalazek dotyczy nowego medycznego zastosowania alfa–ketoglutaranu do
wytwarzania środków leczniczych i profilaktycznych do stosowania w medycynie ludzkiej
oraz w weterynarii u zwierząt kręgowych w tym ssaków, ptaków, ryb i płazów.
Stan techniki
[0002]
Alfa-ketoglutarany - sole kwasu alfa-ketoglutarowego
[0003]
Alfa-ketoglutaran
występuje
w
organizmach
żywych
jako
cząsteczka
pochodzenia endogennego.
[0004]
Sole kwasu alfa-ketoglutarowego znane są od co najmniej 60 lat, czyli od czasu
odkrycia cyklu Krebsa. Sole kwasu alfa-ketoglutarowego pochodzenia endogennego u
ludzi i zwierząt odgrywają obok soli kwasu szczawiooctowego i pirogronowego
podstawową rolę w cyklu kwasu cytrynowego. W wyniku odtwarzających się reakcji
dochodzi do syntezy kwasów tłuszczowych, steroli, cholesterolu (z udziałem cytrynianu),
porfiryn, hemu, chlorofilu (czynność bursztynylo-CoA), glutaminianu, aminokwasów,
zasad nukleotydowych (aktywność soli kwasu alfa-ketoglutarowego).
[0005]
Anion kwasu alfa-ketoglutarowego odgrywa kluczową rolę w przemianie
materii, głównie w organizmach oddychających tlenowo. Alfa-ketoglutaran produkowany
jest w procesie oksydacyjnej dekarboksylacji przy udziale enzymu komórkowego
dehydrogenazy izocytrynianowej, a także w innym szlaku metabolicznym, oksydacyjnej
deaminacji glutaminianu, katalizowanej dehydrogenazą glutaminianu.
[0006]
Alfa-ketoglutaran - będąc związkiem pośrednim w podstawowym cyklu
życiowym jakim jest cykl kwasów trikarboksylowych, czyli cykl Krebsa, stale ulega
przemianom wewnątrzkomórkowym i jako anion występuje praktycznie w niewielkich
stężeniach we krwi obwodowej, z uwagi na pełne metabolizowanie w ustroju.
[0007]
Równolegle, alfa-ketoglutaran pełni w organizmie rolę naturalnego scavangera,
odtruwacza poprzez transport azotu, który następuje drogą transaminacji w wyniku
przeniesienie grup aminowych pochodzących z katabolizowanych aminokwasów. Proces
ma miejsce w wątrobie i nosi nazwę cyklu ornitynowego, czyli mocznikowego.
2
EP 1 917 959 B1
[0008]
W związku z tym, że alfa-ketoglutaran może ulegać transaminacji wspólnie z
glutaminą, formowany jest wówczas neurotransmiter o nazwie glutaminian. Glutaminian w
obecności witaminy B6 może ulegać dekarboksylacji z wytworzeniem związku o nazwie
GABA (kwas gamma-aminobutyrowy), który jest inhibitorem neurotransmitera (hamuje
działanie).
[0009]
Wykazano również udział enzymów właściwych dla alfa-ketoglutaranu w
usuwaniu z organizmu wolnych rodników, związków silnie toksycznych – niedopałów
metabolizmu.
[0010]
Poza tym, jedna z oksygenaz zależna od alfa-ketoglutaranu jest sensorem tlenu
cząsteczkowego, czyli indykatorem poziomu tlenu w otoczeniu.
[0011]
Alfa-ketoglutaran może też być wprowadzany do organizmu znanymi drogami
podawania, przykładowo: doustnie, w postaci inhalacji, dożylnie, bądź innymi drogami.
[0012]
Codzienna dieta zarówno ludzi jak i zwierząt nie zawiera w swoim składzie alfa-
ketoglutaranu.
[0013]
Na rynku, zwłaszcza amerykańskim, występują w powszechnej sprzedaży
suplementy diety zawierające sole kwasu alfa-ketoglutarowego, głównie sole argininy,
pirydoksyny, ornityny, kreatyny, histydyny, cytruliny, jako gotowe produkty dla ludzi i
zwierząt domowych. Dostępne są również sole sodowa, potasowa i wapniowa kwasu alfaketoglutarowego.
[0014]
W wykazie suplementów diety sporządzonym przez National Nutritional Foods
Association (NNFA) kwas alfa-ketoglutarowy oraz połączony z pirydoksyną (wit. B6)
kwas alfa-ketoglutarowy znalazł się w grupie środków biochemicznych jeszcze przed 15
września 1994. Tak długa obecność na rynku skutkuje obfitością suplementów diety
zawierających te związki chemiczne. Głównym powodem, dla którego we wszystkich
dostępnych produktach z obecnymi w nich pochodnymi lub solami kwasu alfaketoglutarowego jest fakt, że alfa-ketoglutaran - jako związek pośredni w cyklu Krebsa,
jest jednym ze związków warunkujących oddychanie komórkowe, a przez to ma wywierać
określone działanie poprawiające komfort życia.
[0015]
Najbogatszy wachlarz omawianych produktów stanowią te, które posiadają L-
argininę połączoną z alfa-ketoglutaranem. Produkty te według deklaracji producentów
3
EP 1 917 959 B1
pomagają głównie w zachowaniu energii podczas i po wykonanej aktywności fizycznej,
wzmacniają syntezę tlenku azotu, dodatkowo w kompleksie z tlenkiem azotu zwiększają
poziom tego tlenku w organizmie i wzmagają transport składników odżywczych oraz
metabolizm w mięśniach. W połączeniu z innymi substancjami wzmagają poziom energii i
metabolizm aminokwasów.
[0016]
Kolejna co do liczebności grupa produktów rynkowych zawiera ornitynę
połączoną z kwasem alfa-ketoglutarowym. W takiej postaci alfa-ketoglutaran nie tylko
wzmaga produkowanie energii, ale też i chroni mięśnie przed rozpadem rozgałęzionych
aminokwasów, w celu generowania glutaminy, cząsteczki napędzającej energię. Poza tym,
jest środkiem wzmagajacym wydzielanie hormonu wzrostu i optymalizującym metabolizm
mięśni. Bezpiecznie dla zdrowia wzmaga aktywność insuliny i poliamin. Wzmaga również
neurotransmisję utrzymującą dobry mentalny status organizmu, wspiera wytrzymałość
mięśni maksymalizując działania atletyczne, wywiera wpływ na zdolność organizmu do
spalania nadmiaru tluszczu, wzmaga libido, korzystnie działa na funkcje immunologiczne i
redukuje tlenowy stres.
[0017]
Kolejna grupa preparatów spożywczych stosowanych jako suplementy diety
zawiera pirydoksynę i pirydoksyl, które są połączone z alfa-ketoglutaranem. Składniki tych
produktów wspomagają zachowanie aktywności matabolicznej wewnątrz komórki,
bilansują nakłady na produkcję energii w organizmie oraz działają ochronnie na watrobę.
[0018]
Występują również na rynku środki zawierające kreatynę połączoną z alfa-
ketoglutaranem. Działają one jako prekursory glutaminy i biorą udział w syntezie białka.
[0019]
Inne niespecyfikowane sole kwasu alfa-ketoglutarowego zwiększają spadek
tłuszczu w organizmie i warunkują zachowanie integralności tkanki mięśniowej.
[0020]
Sam kwas alfa-ketoglutarowy jest natomiast składnikiem praparatu pełniącego
naturalną funkcję detoksyfikującą. Zalecany jest w stanach chronicznego zmęczenia, w
niedoborach metabolizmu często notowanych przy analizie aminokwasów. Przyjmowanie
tego typu preparatu wzmacnia wytrzymałość i zwiększa energię. Ciekawym produktem z
tej grupy jest sól wapniowa i magnezowa kwasu alfa-ketoglutarowego. Ze względu na to,
że kwas alfa-ketoglutarowy należy do silnych kwasów organicznych, doustne podawanie
drażni przełyk i żołądek. Włączenie wapnia i magnezu służy do produkcji buforowanego
4
EP 1 917 959 B1
dwuskładnikowego
związku
kwasu
alfa-ketoglutarowego,
który
nie
wywołuje
niekorzystnego odczucia nadmiaru kwasowości.
[0021]
Liczne patenty i zgłoszenia patentowe wskazują, że alfa-ketoglutaran może być
stosowany w niewydolności metabolicznej mózgu, w zaburzeniach układów nerwowego,
krążenia, mięśniowo-szkieletowego, aby wzmocnić funkcje mitochodrium komórkowego.
[0022]
Dostępne są również napoje zawierające sole kwasu alfa-ketoglutarowego
sporządzone w celu dostarczania organizmowi energii zwłaszcza przed, w czasie i po
wysiłku fizycznym. Napój - jako źródło energii, podawany może być w stanach szybkiego
i długotrwałego zapotrzebowania na energię u ludzi i innych ssaków.
[0023]
Inne zastosowanie znajduje alfa-ketoglutaran jako niesterydowy, anaboliczny
produkt zwiększający masę mięśniową bez przerostu jej w tłuszcz. Efekt działania tego
suplementu diety jest podobny do efektu uzyskiwanego przy stosowaniu syntetycznych
anabolików sterydowych, jednak bez niepożądanych skutków ubocznych.
[0024]
Doustnie podawany jest również suplement zawierający rozpuszczalną w
tłuszczach tiaminę, kwas lipoinowy, pochodne kreatyny i L-argininę z alfaketoglutaranem. Ten suplement diety przeznaczony jest do obniżenia poziomu glukozy we
krwi i utrzymania obniżonego poziomu glukozy w leczeniu neuropatii cukrzycowych, jak
również ma na celu poprawienie krążenia i poprawienie wydajności mięśniowej.
[0025]
Ciekawe wykorzystanie znalazły też sole kwasu alfa-ketoglutarowego jako
środek mający na celu zredukowanie emisji azotu od ludzi i zwierząt oraz podtrzymanie
syntezy białek, a także w mikrobiologii żywności.
[0026]
składnika
Ujawniono zastosowanie kwasu alfa-ketoglutarowego oraz jego soli jako
(składników)
środka
antyseptycznego
przeznaczonego
dla
przemysłu
spożywczego. Patrz: DATABASE WPI Sekcja Ch, Tydzień 1974, Derwent Publications
Ltd., London, GB; Klasa D13, AN 1974-44619V XP002472373 “Antiseptic agent contg. a
ketoglutaric acid – esp. useful in the food ind.” oraz JP 49 01 9855 B – (UENO
PHARMACEUTICAL), 1974. Antybakteryjna aktywność kwasu alfa-ketoglutarowego
oraz szeregu innych kwasów organicznych takich jak kwasy askorbinowy oraz propionowy
albo ich soli – zilustrowana danymi doświadczalnymi dla Bacillus subtilis, polega raczej
na zapobieganiu wzrostowi bakterii niż na zabijaniu tych mikroorganizmów. W tym
kontekście należy jednakże zauważyć, że sama sól kuchenna (NaCl) – obecna w badanych
5
EP 1 917 959 B1
produktach żywnościowych, posiada taką samą aktywność antybakteryjną. Na koniec zaś,
stężenie kwasu alfa-ketoglutarowego lub jego soli w produktach żywnościowych
konserwowanych
przy
użyciu
wskazanego
środka,
objęte
badaniem
w
tych
doświadczeniach zawiera się w zakresie od 0,05 do 1,0 %. Stężenie takie nie jest
odpowiednie do zastosowania w organizmach żywych.
[0027]
W przemyśle spożywczym omawiane sole są stosowane jako środek
poprawiający i wzmagający aromat i smak produktów fermentacji (np. octu winnego) oraz
mleczarskich, między innymi serów. Sole kwasu alfa-ketoglutarowego wpływają na
procesy fermentacji, zachodzące przy udziale bakterii kwasu mlekowego, wywołując
zmiany metabolizmu aminokwasów, poziomu katabolitow, aktywności aminotransferaz. W
praktyce prowadzi to do skrócenia czasu dojrzewania serów przez przyspieszenie
wytwarzania tych związków, które gwarantują wysoką jakość handlową artykułów
spożywczych. Patrz: Williams AG, Noble J, Banks JM., The effect of alpha-ketoglutaric
acid on amino acid utilization by nonstarter Lactobacillus spp. isolated from Cheddar
cheese. Lett. Appl. Microbiol. 2004;38:289-295.
[0028]
Liczne patenty i zgłoszenia patentowe dotyczą zastosowania alfa-ketoglutaranu
jako preparatu farmaceutycznego lub składnika preparatu farmaceutycznego.
[0029]
Z publikacji WO 2007/058612 znane jest zastosowanie kwasu alfa-
ketoglutarowego, glutaminy, kwas glutaminowego, ich soli, amidów, dwu- i trójpeptydówy
jako środka farmaceutycznego do leczenia i profilaktyki stanów artrozy, reumatoidalnego
zapalenia stawów, uszkodzenia chrząstki o podłożu zapalnym i niezapalnym.
[0030]
Publikacja
WO
2005/123056
ujawnia
zastosowanie
kwasu
alfa-
ketoglutarowego, glutaminy, kwasu glutaminowego, ich farmaceutycznie akceptowanych
soli, amidów, di- i tripeptydów, jako środka farmaceutycznego i dodatku do żywności oraz
do pasz, do leczenia i profilaktyki zwiększonego poziomu w plazmie co najmniej jednego
z parametrów takich jak cholesterol, LDL, glicerydy. Preparat służyć może również do
podniesienia poziomu HDL .
[0031]
EP 0 922 459 ujawnia, że kwas alfa-ketoglutarowy razem z D-galaktozą i
ornityną oraz sole kwasu alfa-ketoglutarowego takie jak sól sodowa, potasowa,
magnezowa, cynkowa, wapniowa, w określonej dawce, w postaci tabletek, proszków,
infuzji, syropów mogą służyć do podwyższenia profilu aminokwasów we krwi szczególnie
6
EP 1 917 959 B1
u pacjentów w sytuacjach metabolicznie stresowych. Ujawniony środek może być
przeznaczony do stosowania w chorobach wątroby, do terapii i profilaktyki wątroby i
chorób wątroby u alkoholików, dla zachowania funkcji i struktury wątroby, w celach
regeneracji wątroby.
[0032]
W publikacji WO 2006/016143 podano, że środek w postaci alfa-
ketoglutaranów i szeregu ich pochodnych, który stosowano wcześniej do aktywowania
HIFa hydroksylazy, do zwiększania poziomu alfa-ketoglutaranu, aktualnie wykorzystuje
się do leczenia raka i do leczenia angiogenezy.
[0033]
Zgodnie z publikacją WO 2006/062424 możliwe jest również zastosowanie 3-
hydroksy-3metylobutyranu w połączeniu z alfa-ketoglutaranem i szeregiem pochodnych w
procesach wzrostu i mineralizacji układu kostnego w stanach fizjologicznych i
osteochondropatii u osób dorosłych i zwierząt. Ten sam produkt może stanowić składnik
żywności funkcjonalnej i żywności o przeznaczeniu medycznym.
[0034]
Publikacja WO 2006/016828 wskazuje na zastosowanie alfa-ketoglutaranów i
szeregu pochodnych jako preparatu farmaceutycznego i równocześnie jako dodatku do
żywności i do pasz, poprawiającego funkcję komórek nerwowych i układu nerwowego,
minimalizującego i chroniącego przed apoptozą komórek nerwowych oraz chroniącego
przed rozwojem chorób układu nerwowego dorosłych i płodu.
[0035]
Alfa-ketoglutaran pirydoksyny znany jest jako środek stosowany w profilaktyce
kwasicy w medycynie i w weterynarii, w profilaktyce wszystkich stanów prowadzących do
kwasicy, jak też w stanach patologicznych, w których stosuje się leki obniżające poziom
kwasu mlekowego we krwi.
[0036]
Alfa-ketoglutaran stosowany jest także w praktyce medycznej jako odtruwacz, w
stanach
zatrucia
organizmu.
Działanie
odtruwające
alfa-ketoglutaranu
zostało
wykorzystane do leczenia przykładowo zatruć cyjankami. Alfa-ketoglutaran, jako środek
przeciwtoksyczny przeciwdziała pooperacyjnemu katabolizmowi mięśni, a także jest
stosowany na oddziałach szpitalnych, u osób ze wskazaniem podawania żywienia
pozajelitowego, gdzie jednym ze składników aplikowanego bolusa jest alfa-ketoglutaran.
Alfa-ketoglutaran zaleca się podawać chorym z rozpoznaniem udaru mózgu, jak i osobom
z ranami poparzeniowymi, w stanach hypoxii (niedotlenienia), po napromieniowaniu
promieniowaniem X, w przypadku wystąpienia katarakty na tle zatrucia selenitem.
7
EP 1 917 959 B1
[0037]
Alfa-ketoglutaran związany z ornityną chroni skutecznie organizm po
transplantacji jelita przed translokacją bakterii, co badano w węzłach chłonnych
krezkowych, wątrobie i śledzionie. Patrz: de Oca J, Bettonica C, Cuadrado S, Vallet J,
Martin E, Garcia A, Montanes T, Jaurrieta E. Effect of oral supplementation of ornithinealpha-ketoglutarate on the intestinal barrier after orthotopic small bowel transplantation.
Transplantation. 1997;63:636-639.
[0038]
U szczurów w stanie pourazowym, wywołanym doświadczalnie, podanie alfa-
ketoglutaranu połączonego z ornityną ogranicza rozprzestrzenianie E. coli i niszczenie
tkanek pod wpływem LPS. Przyjmuje się, że u ludzi po urazach podanie tego związku
chronić może przed sepsą i jej następstwami. Patrz: Schlegel L, Coudray-Lucas C, Barbut
F, Le Boucher J, Jardel A, Zarrabian S, Cynober L. Bacterial dissemination and metabolic
changes in rats induced by endotoxemia following intestinal E. coli overgrowth are
reduced by ornithine alpha-ketoglutarate administration. J Nutr. 2000;130:2897-2902.
[0039]
Alfa-ketoglutaran wykorzystuje się także w hodowli zwierząt dla usprawnienia
wchłaniania aminokwasów. Znalazł zastosowanie u młodych świń do przyspieszenia
wchłaniania jonów żelaza.
Bakterie ureolityczne
[0040]
Wachlarz
drobnoustrojów
asymilujących
azot
jest
szeroki:
od
niechorobotwórczych komensali takich jak na przykład bakterie kolonizujące skórę,
poprzez
niechorobotwórcze
symbionty
zasiedlające
błonę
śluzową
przewodu
pokarmowego, do bakterii patogennych, do których zalicza się Helicobacter pylori oraz
bakterie wywołujące zakażenia układu moczowo-płciowego.
[0041]
Najpowszechniej występującym u ludzi zakażeniem wywoływanym przez
bakterie ureolityczne jest zakażenie H. pylori.
[0042]
Cechą powszechną bakterii urolitycznych jest ich zdolność wykorzystywania, z
udziałem ureazy, obecnego w otoczeniu mocznika - głównie jako źródła niezbędnego do
życia azotu. Ureaza bakteryjna (aminohydrolaza mocznika E.C.3.5.1.5) jest enzymem
niklo-zależnym, multimerem składającym się z 2 lub 3 podjednostek. Poznana została 3-D
budowa krystalograficzna niektórych bakteryjnych ureaz (H. pylori, Klebsiella aerogenes,
Bacillus pasteurii). Wysoki stopień podobieństwa sekwencji aminokwasowych wskazuje
na to, że wszystkie warianty ureaz pochodzą od jednego rodzicielskiego białka, mają
8
EP 1 917 959 B1
prawdopodobnie podobną trzeciorzędową budowę i zachowują aktywność katalityczną
hydrolizując mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla.
[0043]
W jamie ustnej przykładem bakterii asymilujących azot z udziałem własnej
ureazy są powszechnie tam obecne i tworzące biofilm Streptococcus salivarius i
Actinomyces naeslundii.
[0044]
Układ pokarmowy jest największym skupiskiem ureolitycznych bakterii.
Mikroorganizmy, w tym ureolityczne, kolonizują trwale powierzchnię nabłonka co
określane jest jako naturalna mikroflora jelitowa. Z tego wynika, że dostęp do mocznika
jest jednym z czynników warunkujących ekologię mikroorganizmów układu pokarmowego
to jest skład ilościowy i jakościowy bakterii w tym obszarze. Poprzez zachowanie
integralności tkanki dostęp do mocznika jest jednym z czynników warunkujących zdrowie
makroorganizmu. Na podobnej zasadzie utrzymania stanu równowagi występują
drobnoustroje kolonizujące powłoki ciała.
[0045]
Mocznik pozostaje również istotny jako substrat dla ureazy patogenów w trakcie
stabilizowania się procesu zapalnego podczas zakażenia H. pylori.
[0046]
Powszechną drogą wnikania patogenów do organizmu człowieka i zwierząt jest
droga pokarmowa, niezależnie od miejsca dalszego rozwoju zakażenia. Zakażenia poprzez
układ pokarmowy drobnoustrojami ureolitycznymi wskazują, że ureaza odgrywa rolę w
patogenezie tych zakażeń. Wykazano, że szczepy bakteryjne przykładowo z rodzaju
Brucella - produkujące ureazę, są oporne w środowisku mocznika na biobójcze działanie
soku żołądkowego, w którym występują warunki silnie kwasowe. Ureazo-ujemne mutanty
tych bakterii pozostają natomiast wrażliwe, co przekłada się na spadek liczby bakterii w
trakcie pasażu przez żołądek. Z tego wynika, że w tych warunkach ureaza chroni brucelle
przed działaniem soku żołądkowego, wówczas gdy dostają się one do organizmu per os .
Po pokonaniu bariery żołądka bakterie mogą swobodnie przenikać np. do układu
oddechowego i moczowo-płciowego oraz generować objawy typowe dla brucelozy.
[0047]
Bakterie ureolityczne mimo, że nie są podstawowym czynnikiem etiologicznym
zakażeń dróg moczowych zdrowych osobników, często są związane z zakażeniami u ludzi,
u których występują stany chorobowe w narządach moczowych. Następstwem zakażeń
układu moczowego drobnoustrojami produkującymi ureazę jest kamica odlewowa z
powstałym przesyceniem moczu solami fosforanowo-amonowo-magnezowymi (struwit) i
9
EP 1 917 959 B1
fosforanowo-wapniowymi, a także procesy patologiczne w obrębie nerki. W warunkach
fizjologicznych mocz nie jest nasycony tymi solami.
[0048]
Innym ciekawym mechanizmem w patogenezie zakażeń układu moczowo-
płciowego jest utrzymanie zakażeń wywoływanych przez ureazo-dodatnich bakterie takie
jak Ureaplasma ureolyticum i inne alkalofilne np. B. pasteurii. W środowisku mocznika
ma miejsce stałe rozmnażanie się w nim tych patogenów, które ureolizę wykorzystują do
generowania własnego ATP. Mimo, że U. urealyticum i inne mykoplazmy to bakterie
relatywnie nieczęsto występujące mogą one również wywoływać przebiegające groźnie i
trudnoleczące się zakażenia układu oddechowego u ludzi i zwierząt, w tym u ryb.
[0049]
Stwierdzono również, że produkująca ureazę pałeczka Yersinia enterocolica –
patogen przewodu pokarmowego, może u niektórych osób ze skłonnością genetyczną
wywołać reaktywne zapalenie stawów, ta reaktywność powiązana jest z budową
chemiczną enzymu - jego podjednostki UreB.
[0050]
Warto zauważyć, że wiele bakterii wykazujących ruch to organizmy
ureolityczne, które biorą udział w formowaniu biofilmu i mineralizacji złogów na
cewnikach i mechanicznych innych środkach medycznych.
[0051]
Metabolizm mocznika wiązany jest również z zakażeniami występującymi w
obrębie błony śluzowej jamy ustnej, z chorobami przydziąśla z tworzeniem się próchnicy i
kamienia nazębnego.
[0052]
Z powstawaniem kamieni zakaźnych łączone są zakażenia układu moczowego
wywoływane przez bakterie z rodzaju Proteus, Ureaplasma, Klebsiella, Pseudomonas,
Staphylococcus, Providencia, Corynebacterium. Najczęstszą przyczyną tworzenia się
kamieni zakaźnych są bakterie P. mirabilis. W tworzeniu się kamieni również mają udział
mykoplazmy wiązane zazwyczaj z zakażeniami dróg płciowych najczęściej ich dolnego
odcinka (głównie pochwy). U mężczyzn izoluje się Mycoplasma hominis oraz U.
urealyticum z cewki moczowej. Kolonizacja układu płciowego zarówno kobiet jak i
mężczyzn przez te bakterie prowadzi do zakażeń dróg moczowych, którym towarzyszy
tworzenie się kamieni zakaźnych w pęcherzu moczowym.
Zakażenia Helicobacter pylori
[0053]
Pałeczki H. pylori zazwyczaj izolowane są od ludzi z żołądka i dwunastnicy. Te
Gram-ujemne, ureolityczne bakterie o kształcie spiralnym, wcześniej znane jako
10
EP 1 917 959 B1
Campylobacter pylori, są jednym z czynników etiologicznych zapalenia żołądka i
powstania wrzodów żołądkowo-dwunastniczych. W 1983 roku Warren i Marschall,
uhonorowani w roku 2005 Nagrodą Nobla, wykazali zależność przyczynowo-skutkową
między występowaniem w przewodzie pokarmowym bakterii H. pylori, a przetrwałym
zapaleniem żołądka. Patrz: Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the
stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet. 1984;1:1311-1315. Z
uwagi na to, że długotrwałe zakażenie wyraźnie podnosi ryzyko wystąpienia jelitowego
typu raka żołądka, w ostatnich latach pałeczki H. pylori uznane zostały przez WHO za
czynnik rakotwórczy (IARC. Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC
Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Lyon, 7-14 June
1994. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1994;61:1-241.). Stwierdzono ponadto
związek zakażenia H. pylori z pojawieniem się zmian patologicznych obejmujących tkanki
i narządy inne niż żołądek, na przykład serce.
[0054]
Przez długi czas uważano, że żołądek wolny jest od bakterii, ponieważ trwałą
kolonizację jego błony śluzowej utrudnia odczyn treści o wartości niższej niż wartość
odpowiednia dla wzrostu większości mikroorganizmów. Jednakże produkcja ureazy przez
H. pylori pozwala temu mikroorganizmowi trwale kolonizować żołądek i jelito, a ureoliza
jest głównym czynnikiem wywołującym patologie związane z zakażeniem H. pylori.
Ureaza zdeponowana na zewnątrz komórki bakteryjnej stanowić może aż do 20 procent
składu bakteryjnego białka. Enzym chroni bakterie przed kwaśnym środowiskiem i
zapobiega letalnemu uszkodzeniu osłon bakteryjnych. Dodatkowo, w trakcie zakażenia H.
pylori jony amonowe uwalniane przez ureazę podczas rozkładu mocznika wywierają
cytotoksyczny efekt na komórki nabłonka żołądka. W obecności leukocytów i mocznika
bakteryjna ureaza generuje monochloraminę, która indukować może mutagenezę DNA i
jest jednym z czynników rozwijania się procesu nowotworzenia związanego z przetrwałym
zakażeniem H. pylori.
[0055]
Od ludzi i zwierząt izoluje się nowe gatunki spiralnych bakterii ureolitycznych.
Nie jest dotychczas dostatecznie zbadane jak inne gatunki Helicobacter występujące u
ludzi należy łączyć z chorobami żołądka (na przykład H. heilmannii), jelit (na przykład H.
cinaed, H. canadensis), wątroby (na przykład H. hepaticus, H. bilis) czy z zakażeniami
systemowymi (na przykład H. pullorum, Helicobacter spp. flexispira takson 8 ”F.
rappini”).
11
EP 1 917 959 B1
[0056]
W ostatnich latach stwierdzono, ze układ pokarmowy (jelita, żołądek, wątroba,
trzustka) zwierząt laboratoryjnych może w naturalny sposób ulegać skolonizowaniu
bakteriami należącymi do rodzaju Helicobacter: H. bilis, H. ganmani, H. hepaticus, H.
muridarum, H. mastomyrinus, H. rappini, H. rodentium, H. typhlonius. Zwierzęta trwale
skolonizowane tymi mikroorganizmami, zarówno dzikie, jak i hodowlane, nie manifestują
objawów zakażenia i nie stwierdza się u nich sekcyjnie procesów zapalnych w organach
wewnętrznych. Wrażliwe na warunki otoczenia drobnoustroje utrzymują się jednak w
środowisku, ze względu na stałe horyzontalne przenoszenie bakterii z jednego osobnika na
następnego, przez odchody i ze śliną.
[0057]
Okazuje się, że u ludzi zakażenie H. pylori obejmuje około 50 % populacji i jak
się wydaje związane jest głównie ze stanem ekonomicznym i wiekiem społeczności. Nasila
się u osób dorosłych, obejmując powyżej 50-tego roku życia prawie całą populację krajów
słabo rozwiniętych. H. pylori rozpoznawany jest w 90 % - 100 % przypadkach zapalenia
żołądka. Stwierdza się często przejście zakażenia przewlekłego w stan zapalenia
zanikowego. U 10 % zakażonych rozwijają się głębokie zmiany patologiczne. Zakażenie
H. pylori powszechnie występuje zarówno u dzieci, jak i osób dorosłych. Do zakażenia
bakteriami dochodzi najczęściej w wieku dziecięcym i praktycznie kolonizacja błony
śluzowej żołądka pałeczkami H. pylori utrzymuje się przez całe życie.
[0058]
Wiadomo, że takie czynniki jak niedożywienie, niedobory witamin, palenie
tytoniu sprzyjają zakażeniu.
[0059]
U 10 % przypadków chorych zastosowana terapia jest nieskuteczna, ponieważ
występuje i narasta oporność bakterii na standardowo stosowane leki. U części chorych
stwierdza się również reinfekcję lekoopornymi bakteriami. U pozostałych około 10 %
pacjentów ma miejsce brak tolerancji na preparaty z grupy inhibitorów pompy protonowej.
U tych osób manifestują się uciążliwe objawy uboczne.
[0060]
Z uwagi na systematycznie zmniejszającą się skuteczność leczenia i jego
uciążliwość regionalne towarzystwa gastrologiczne w Europie, na podstawie zalecenia
raportu „Maastricht 2-2000” rekomendują odpowiednie postępowanie diagnostyczne w
kierunku H. pylori oraz wskazania do podjęcia leczenia tylko w przypadku wystąpienia u
pacjentów określonych objawów chorobowych głównie takich jak: zapalenie żołądka,
wrzód żołądka i dwunastnicy, choroba wrzodowa żołądka lub dwunastnicy stwierdzona w
12
EP 1 917 959 B1
wywiadach, przebyta operacja z powodu choroby wrzodowej, zmiany przedrakowe
(zapalenie zanikowe, metaplazja, dysplazja), resekcja żołądka z powodu wczesnego raka,
rak żołądka w rodzinie (do II stopnia pokrewieństwa), polipy gruczolakowate
hiperplastyczne żołądka (po ich usunięciu), chłoniaki typu MALT, przewlekłe leczenie
NLPZ.
[0061]
Zauważono u ludzi, że zakażeniu H. pylori towarzyszy występowanie niektórych
chorób takich jak choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy, chłoniaki żołądka, przewlekłe
zanikowe zapalenie żołądka z metaplazją jelitową oraz rak żołądka.
[0062]
U ludzi, w pierwotnym stadium zakażenia H. pylori rozwija się stan zapalny
błony śluzowej żołądka i dwunastnicy, który u zakażonych pacjentów należy w pełni
eradykować farmakologicznie. Leczenie zakażenia H. pylori nadal opiera się na
wprowadzeniu
środków
zmniejszających
wydzielanie
kwasu
żołądkowego
i
podwyższających pH w żołądku takich jak inhibitory pompy protonowej, a w leczeniu
przeciwbakteryjnym – na obowiązkowym wprowadzeniu określonych antybiotyków klarytromycyna, amoksycylina i chemioterapeutyków - metronidazol (z grupy pochodnych
nitroimidazolu).
[0063]
W Europie, wskazania zawarte, w formie wykazu, w raporcie uzgodnionym
"Maastricht 2 - 2000" opublikowanym w 2002 roku nie uwzględniają prowadzenia terapii
H.
pylori
bez
środków
antybakteryjnych
takich
jak
antybiotyki,
a
wśród
chemioterapeutyków - innych niż pochodne nitroimidazolu. Terapia jest złożona,
kosztowna, bywa źle tolerowana i nie zawsze okazuje się skuteczna. Według wytycznych
europejskich regionalnych Towarzystw Gastroenterologicznych leczenie może się opierać
na podawaniu chorym antybiotyków i chemioterapeutyków (klarytromycyna (2 x 500) i
amoksycylina (2 x 1 g) lub metronidazol (2 x 500 mg) oraz inhibitorów pompy
protonowej.
[0064]
Przykładowo przedstawia się to następująco:
Terapia pierwszego rzutu. Siedmiodniowy przebieg kuracji:
1. Lek zmniejszający wydzielanie soku żołądkowego środek z grupy inhibitorów pompy
protonowej (IPP) w podwójnej dawce – na przykład omeprazol 2 x dziennie 20 mg
2. Antybiotyk I – na przykład amoksycylina w dawce 2 x dziennie 1 g
3. Antybiotyk II – na przykład klarytromycyna w dawce 2 x dziennie 0.5 g
13
EP 1 917 959 B1
Terapia drugiego rzutu.
1. Lek zmniejszający wydzielanie soku żołądkowego, środek z grupy inhibitorów pompy
protonowej (IPP) w podwójnej dawce – na przykład lanzoprazol 2 x dziennie 30 mg
2. Antybiotyk I – utrzymanie amoksycyliny w dawce 2 x dziennie 1,0 g
3. Antybiotyk II - zastosowanie innego antybiotyku lub chemioterapeutyku – na przykład
metronidazol w dawce 2 x dziennie 500 mg
4. Związki bizmutu (cytrynian).
[0065]
W związku z faktem epidemicznego rozprzestrzeniania się w różnych regionach
świata zakażeń H. pylori, znalezienie środków ograniczających patologie wynikające z
zakażenia jest ciągle aktualne i istnieje nacisk populacji ludzi zakażonych, jak i środowiska
medycznego do ich identyfikacji.
[0066]
Głównym celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do leczenia i
profilaktyki stanów chorobowych wywoływanych przez bakterie urolityczne, do
stosowania w szczególności do regulacji ureolitycznej flory jelitowej, do regulacji
ureolitycznej flory jamy ustnej, do hamowania pasażu patogennych bakterii ureolitycznych
przez żołądek trawienny, do zapobiegania tworzeniu się w drogach moczowych złogów i
kamieni zakaźnych – u ludzi i zwierząt, zwłaszcza psów i kotów oraz innych zwierząt
udomowionych.
[0067]
Celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do kontroli niepożądanego
rozwoju bakteri ureolitycznych w organizmach ludzi i zwierząt.
[0068]
Szczególnym celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do leczenia i
profilaktyki stanów chorobowych wywołanych przez H. pylori.
[0069]
Celem wynalazku jest także zapewnienie nowego środka do hamowania wzrostu
bakterii ureolitycznych, szczególnie Ureaplasma i innych mykoplazm, wywołujących
zakażenia ryb, do stosowania w szczególności w profilaktyce zapalenia skrzeli u karpia i
narybku karpia oraz innych ryb słodkowodnych i morskich, wywoływanego przez bakterie
ureolityczne.
[0070]
Ponadto, celem wynalazku jest zapewnienie nowego środka do hamowania
procesu formowania biofilmu i mineralizacji złogów na cewnikach, kateterach i innym
sprzęcie medycznym.
14
EP 1 917 959 B1
[0071]
Jest także celem wynalazku zapewnienie nowego środka do ograniczania
tworzenie się kamienia nazębnego i rozwoju próchnicy.
[0072]
Ponadto, celem wynalazku jest także zapewnienie nowych, suplementów diety,
środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego oraz dodatków do
żywności/paszy, przydatnych w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji organizmów
kręgowców, w tym ludzi, ssaków ptaków płazów i ryb przez niepożądane bakterie
ureolityczne, a zwłaszcza organizmów ludzi i zwierząt domowych przez H. pylori.
[0073]
Cele te zostały osiągnięte dzięki opracowaniu rozwiązania według obecnego
wynalazku przedstawionego w załączonych zastrzeżeniach patentowych.
[0074]
Osiągnięcie wskazanych celów zapewnia zgodnie z wynalazkiem zastosowanie
jako substancji aktywnej znanego alfa-ketoglutaran w skutecznej terapeutycznie bądź
profilaktycznie dawce, do wytwarzania środka leczniczego, bądź profilaktycznego, bądź
też środka stanowiącego suplement diety, środek spożywczy specjalnego przeznaczenia
medycznego oraz dodatek do żywności/paszy, bądź środków higieny osobistej do
codziennego stosowania.
[0075]
Terapeutycznie i/lub profilaktycznie skuteczna dawka wynosi od 0,001g do 0,2
g/kg masy ciała/dzień przy podawaniu dożołądkowym lub doustnym.
[0076]
Soli kwasu alfa-ketoglutarowego nigdy dotychczas nie stosowano u ludzi, ani u
zwierząt w leczeniu zakażeń bakteryjnych, włącznie z zakażeniami wywoływanymi przez
H. pylori.
[0077]
Zaletą obecnego wynalazku jest dostępność alfa-ketoglutaranu, jego dobrze
zbadane działanie w obrębie organizmu, a także fakt, iż jest to środek dopuszczony do
stosowania w innych wskazaniach medycznych i profilatycznych.
[0078]
Wynalazek bliżej objaśnia poniższy szczegółowy opis oraz załączone rysunki.
[0079]
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia schemat doświadczalnego
zakażania myszy bakteriami H. pylori w celu zbadania zależności stopnia kolonizacji H.
pylori błony śluzowej żołądka myszy (n=28) od podania dożołądkowego soli kwasu alfaketoglutarowego.
[0080]
Fig. 2 przedstawia schemat doświadczalnego zakażania myszy bakteriami H.
pylori w celu zbadania zależności stopnia kolonizacji błony śluzowej żołądka myszy
15
EP 1 917 959 B1
(n=48) bakteriami z rodzaju Helicobacter od dożołądkowego podania myszom soli kwasu
alfa-ketoglutarowego.
[0081]
Fig. 3 ilustruje ruchliwość produktów PCR właściwych dla fragmentu 16S
rDNA bakterii z rodzaju Helicobacter w polu elektrycznym, ocenianych techniką DGGE.
[0082]
Określenia stosowane powyżej i w dalszej części opisu oraz w załączonych
zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
[0083]
Określenie
„alfa-ketoglutaran”
(dalej
czasem
AKG)
oznacza
związek
uwalniający aktywny anion kwasu znanego jako kwas 2-oksopentanodiowy, 2oksoglutarowy, alfa-oksoglutarowy, alfa-oksopentanodiowy, 2-ketoglutarowy, 2-okso-1,5pentanodiowy,
2-oksopentanodiowy,
bądź
2-okso-glutarowy.
Przykładami
takich
związków są sole kwasu alfa-ketoglutarowego, sole addycyjne tego kwasu, estry, amidy,
imidy i inne podobne związki prekursorowe. Alfa-ketoglutaran wywiera działanie
hamujące kolonizację i zapobiega kolonizacji błon śluzowych organizmu kręgowca, w tym
człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby przez bakterie ureolityczne.
[0084]
Określenie „środek leczniczy” tu używane odnosi się do kompozycji
zawierającej skuteczną terapeutycznie ilość alfa-ketoglutaranu do stosowania w nowych
wskazaniach terapeutycznych lub profilaktycznych objętych obecnym wynalazkiem.
[0085]
Określenie „skuteczne terapeutycznie” odnosi się do takiej ilości pochodnej,
zwłaszcza soli kwasu alfa-ketoglutarowego, która w warunkach in vivo przedstawionych w
niniejszym opisie wywiera działanie lecznicze, czyli ogranicza i hamuje kolonizację błony
śluzowej organizmu kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby przez
ureolityczne bakterie. Skuteczność terapeutyczną lub profilaktyczną osiąga się
wprowadzając wyżej wymieniony środek leczniczy w postaci stałej lub płynnej sam lub z
nośnikiem,
rozcieńczalnikiem,
dodatkiem,
bądź
też
jako
składnik
kompozycji
farmaceutycznej do organizmu kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby.
Środek podaje się w ilości wystarczającej do ograniczenia i zapobiegania zakażeniom
bakteriami ureolitycznymi. Alternatywnie, skuteczna terapeutycznie ilość środka
leczniczego powoduje ustąpienie zakażeń wywołanych przez bakterie ureolityczne.
[0086]
W zależności od oczekiwanych skutków działania, ilość użytego środka może
być różnicowana w zależności od jego specyficznej aktywności w miejscu docelowego
działania na bakterie ureolityczne. Odpowiednia dawka środka może zawierać określoną
16
EP 1 917 959 B1
ilość substancji tak wyliczoną, aby wywoływała oczekiwane działanie lecznicze. Dawkę
podaje się w przeliczeniu na czystą substancję aktywną, uwzględniając jej budowę
chemiczną oraz obecność substancji pomocniczych w środku leczniczym takich jak
nośniki, rozcieńczalniki, adjuwanty i inne dopuszczalne farmaceutycznie dodatki.
Pożądany efekt terapeutyczny, a w konsekwencji także i zalecana dawka mogą być
określone znanymi metodami przez pracownika serwisu medycznego lub weterynaryjnego,
głównie na podstawie takich parametrów jak wiek, waga, płeć pacjenta, towarzyszące inne
zakażenia i choroby, z uwzględnieniem zasad sztuki lekarskiej.
[0087]
Określenie „podawanie środka leczniczego” odnosi się do profilaktycznego lub
terapeutycznego przeciwdziałania wskazanym stanom chorobowym, przy doborze drogi
podawania dostosowanej do miejsca zakażenia, rodzaju i nasilenia zakażenia, z
uwzględnieniem drogi wnikania do organizmu niepożądanych bakterii ureolitycznych.
[0088]
Określenie „hamowanie kolonizacji” odnosi się do zmniejszenia zasięgu i/lub
złagodzenia przebiegu zakażenia błon śluzowych lub innych tkanek wywołanego przez
bakterie ureolityczne, bądź całkowitej eradykacji czynnika zakaźnego - prowadzące do
ograniczania i/lub uniemożliwienia dalszego rozwijania się zakażenia w organizmie
kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza, ryby.
[0089]
Określenie „zapobieganie kolonizacji” odnosi się do przeciwdziałania wzrostowi
niepożądanych bakterii ureolitycznych w przypadku kontaktu tych bakterii z błoną
śluzową organizmu kręgowca. Przy skutecznym zapobieganiu kolonizacji nie dochodzi w
ogóle do zakażenia, bądź zakażenie błon śluzowych kręgowca - w tym czlowieka, ssaka,
ptaka, płaza, ryby, następuje z dużą zwłoką w porównaniu ze stanem istniejącym przy
braku zapobiegania kolonizacji.
[0090]
Określenie „suplement diety” oznacza skoncentrowane źródło składników
odżywczych lub innych substancji o żywieniowym lub fizjologicznym efekcie działania,
którego stosowanie sprzyja uzupełnieniu codziennej diety deficytowej w niektóre
pożądane składniki. Suplementy diety są wytwarzane w wygodnej do stosowania postaci,
np. w formie tabletek, kapsułek lub w postaci płynów odmierzonych w określonych
dawkach.
[0091]
Określenie „środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego”
oznacza produkt spożywczy o typowej dla danego środka postaci i recepturze, zawierający
17
EP 1 917 959 B1
jednakże
dodatkowo
składnik
o
zamierzonym
działaniu
terapeutycznym
lub
profilaktycznym.
[0092]
Określenie „dodatek do żywności/paszy” odnosi się do produktu zawierającego
substancję aktywną jako taką lub w kompozycji, w postaci stałej lub płynnej, ewentualnie
z dodatkiem nośników, buforów, detergentów, czynników zwiększających rozpuszczalność, przeciwutleniaczy, środków konserwujących i innych dodatków zgodnych z
profilem działania substancji aktywnej i dopuszczonych do użytku spożywczego.
Szczegółowy opis wynalazku
[0093]
Wynalazek dotyczy zastosowania alfa-ketoglutaranu w postaci pojedynczego
związku lub mieszaniny różnych związków, do wytwarzania środka leczniczego do
stosowania w profilaktyce i/lub leczeniu stanów chorobowych wywołanych przez
chorobotwórcze bakterie ureolityczne u kręgowców, w tym u ludzi, ssaków, ptaków,
płazów i ryb.
[0094]
Skutek profilaktyczny lub terapeutyczny podawania środka wytwarzanego
zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się stosując alfa-ketoglutaran w ilościach od 0,001 do 0,2
g/kg masy ciała/dzień.
[0095]
U podstaw obecnego wynalazku leży obserwacja, iż bakterie Helikobacter
Helicobacter a najlepiej H. pylori zdolne są do przeżycia w silnie kwaśnym środowisku
żołądka organizmów wyższych.
[0096]
Powszechnie znaną właściwością H. pylori jest ich zdolność przeżycia w niskim
pH dzięki aktywności ureazy, która hydrolizuje mocznik obecny w błonie śluzowej
żołądka i w soku żołądkowym (Saidijam M, Psakis G, Clough JL, Meuller J, Suzuki S,
Hoyle CJ, Palmer SL, Morrison SM, Pos MK, Essenberg RC, Maiden MC, Abu-bakr A,
Baumberg SG, Neyfakh AA, Griffith JK, Sachs G, Scott D, Weeks D, Melchers K. Gastric
habitation by Helicobacter pylori: insights into acid adaptation. Trends Pharmacol Sci.
2000;21:413-416, Sachs G, Weeks DL, Melchers K, Scott DR. The gastric biology of
Helicobacter pylori. Annu Rev Physiol. 2003;65:349-369, Sidebotham RL, Worku ML,
Karim QN, Dhir NK, Baron JH. How Helicobacter pylori urease may affect external pH
and influence growth and motility in the mucus environment: evidence from in-vitro
studies. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003;15:395-401.). Schemat poszczególnych reakcji
przebiega następująco:
18
EP 1 917 959 B1
[0097]
(1) H2NCONH2 + H2O
CO2 + 2 NH3
(2) CO2 +H2O
H2CO3
(3) H2CO3 + 2NH3
NH4+ + HCO3- + NH3
(4) H+Cl- +NH3
NH4+ + Cl-
Wynikiem procesu rozkładu mocznika jest wytworzenie amoniaku reagującego
natychmiast z kwasem solnym tak, że w mikrośrodowisku tkankowym (błona śluzowa
żołądka) drobnoustroju dochodzi do miejscowego podniesienia pH. Jak wiadomo, w
naturalnych warunkach, błona śluzowa żołądka zachowuje odczyn kwaśny, z powodu
produkowania HCl w komórkach okładzinowych.
[0098]
Mimo że pałeczki H. pylori są organizmami wrażliwymi, trudno hodującymi się
in vitro, niskie pH żołądka - bójcze dla innych bakterii paradoksalnie sprzyjać może
kolonizacji H. pylori. A to wynika głównie z obecności w otoczeniu endogennego
mocznika, którego rozkład przez ureazę bakteryjną (enzym produkowany przez H. pylori)
do amoniaku jest niezbędny do podniesienia pH w mikrośrodowisku tych bakterii. W ten
sposób eliminowany zostaje letalny wpływ kwaśnego odczynu na wzrost H. pylori. Uważa
się nawet (Nakazawa T. Growth cycle of Helicobacter pylori in gastric mucous layer. Keio
J Med. 2002;51,S2:15-19.), że cykl rozwoju H. pylori w błonie śluzowej żołądka stymulują
właściwości ureolityczne tych drobnoustrojów. Wykazano, że na poziomie komórki
mRNA ureazy jest stabilizowany i destabilizowany w zależności od pH środowiska.
Przyjęto, że bakterie do wzrostu wykorzystują substancje odżywcze pochodzące ze
zdegradowanych komórek i kolonizują region o już zmienionym pH. Aktywacji ureazy
towarzyszy otwarcie zależnego od pH kanału UreI w komórce bakteryjnej przez co łatwiej
przebiega hydroliza mocznika (Weeks DL, Eskandari S, Scott DR, Sachs G. A H+-gated
urea channel: the link between Helicobacter pylori urease and gastric colonization.
Science. 2000;287:482-485, Weeks DL, Sachs G. Sites of pH regulation of the urea
channel of Helicobacter pylori. Mol Microbiol. 2001;40:1249-1259.). Zauważono także
zdolność H. pylori do przemieszczania się w kierunku mocznika zgodnie z gradientem
stężenia, a chemotaksja przyspiesza sam proces hydrolizy mocznika. W ten sposób można
tłumaczyć rozpoczęcie następnej rundy cyklu wzrostu, a w konsekwencji ustabilizowania
się zakażenia w żołądku (Scott DR, Marcus EA, Weeks DL, Sachs G. Mechanisms of acid
resistance due to the urease system of Helicobacter pylori. Gastroenterology.
2002;123:187-195, Scott DR, Marcus EA, Weeks DL, Lee A, Melchers K, Sachs G.
19
EP 1 917 959 B1
Expression of the Helicobacter pylori ureI gene is required for acidic pH activation of
cytoplasmic urease. Infect Immun. 2000;68:470-477, Voland P, Weeks DL, Marcus EA,
Prinz C, Sachs G, Scott D. Interactions among the seven Helicobacter pylori proteins
encoded by the urease gene cluster. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003;284:96106.).
[0099]
Z drugiej strony wiadomo, że podczas degradacji aminokwasów - w wyniku
oksydacyjnej deaminacji, grupy α-aminowe przenoszone są na α-ketokwasy czemu
towarzyszy odłączenie jonu amonowego. Powstające w wyniku rozkładu aminokwasów
jony amonowe częściowo biorą udział w biosyntezie związków azotowych, a ich nadmiar po przekształceniu w mocznik, zostaje usuwany poza organizm. W moczniku jeden z
atomów azotu pochodzi bezpośrednio z jonu amonowego.
[0100]
W warunkach naturalnych, mocznik może swobodnie dyfundować z miejsca
produkcji, czyli hepatocytów, do całego układu trzewnego, co wynika z niskiej masy
cząsteczkowej (Mr 60) tego związku. Z uwagi na silne właściwości toksyczne jonu
amonowego organizm broni się syntetyzując z niego związki niskotoksyczne takie jak
mocznik (organizmy ureoteliczne - ssaki). Organizmy ureoteliczne nie mają zdolności
magazynowania związków azotowych, co odnosi się do białek, aminokwasów i amoniaku.
[0101]
W ustroju, wolny amoniak występuje w śladowych ilościach, mimo stale
przebiegającej deaminacji aminokwasów. Część jest wiązana natychmiast przez
glutaminian i asparaginian. Część amoniaku zostaje wydalana przez nerki w postaci jonów
amonowych. Przeważająca ilość toksycznego amoniaku ulega konwersji do mocznika w
wątrobie, w cyklu ornitynowym.
[0102]
Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że po podaniu alfa-ketoglutaranu do
środowiska żołądka następuje zmniejszenie populacji
H. pylori. W warunkach
doświadczenia in vivo poziom jonu amonowego jest stosunkowo niewielki i jego usunięcie
przez alfa-ketoglutaran (wiązanie natychmiast w glutaminian i asparaginian), mimo
ułatwionego transportu anionu do komórek błony śluzowej żołądka (dzięki DC
transporterowi) prowadzi do śmierci bakterii ureolitycznych. Niezbędna – w przypadku H.
pylori, ze względu na przetrwanie w środowisku żołądka, produkcja jonu amonowego z
mocznika nie pokrywa zapotrzebowań bytowych pałeczek, ponieważ w tym czasie jon
20
EP 1 917 959 B1
amonowy jest utylizowany natychmiast z udziałem alfa-ketoglutaranu w syntezie
glutaminianu i innych związków aminokwasowych.
[0103]
Ciągle nie do końca jest jasna przyczyna nadmiernej, w stosunku do substratu,
produkcji ureazy przez H. pylori. Ureaza bakteryjna jest enzymem niklozależnym, w który
dwuwartościowy kation niklu zostaje wbudowany potranslacyjnie. Przyjmuje się, że H.
pylori dla utrzymania odpowiedniej ilości aktywnego enzymu, gromadzi go celem
zabezpieczenia aktywności ureolitycznej potomnych komórek rosnących nawet w
warunkach niedoboru niklu. Ze względu na intensywne wchłanianie soli kwasu alfaketoglutarowego w żołądku, H. pylori może również konkurować o dostęp do tych soli, co
wymusza silną produkcję bakteryjnej ureazy w pierwotnej fazie zakażenia.
[0104]
W związku z faktem epidemicznego rozprzestrzeniania się zakażeń H. pylori,
poszukiwanie środków ograniczających patologie wynikające z zakażenia jest tematem
licznych doniesień. Patrz: El-Omar EM. Mechanisms of increased acid secretion after
eradication of Helicobacter pylori infection. Gut. 2006;55:144-146., Wotherspoon AC,
Ortiz-Hidalgo C, Falzon MR, Isaacson PG. Wotherspoon AC, Ortiz-Hidalgo C, Falzon
MR, Isaacson PG. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric
lymphoma. Lancet. 1991;338:1175-1176.).
[0105]
Alfa-ketoglutaran bierze udział wraz z jonami amonowymi w syntezie
niektórych aminokwasów takich jak kwas glutaminowy, a następnie glutaminy, w reakcji o
następującym przebiegu:
O = C – COO- + NH4+
HCH
HCH
C=O
OH
H2N – CH – COOHCH
HCH
C=O
OH
alfa-ketoglutaran + jony amonowe
[0106]
glutaminian
Właśnie ta zdolność alfa-ketoglutaranu do wiązania jonów amonowych,
stanowiła przesłankę dla podjęcia badań nad obecnymi nowymi medycznymi
zastosowaniami tego znanego związku.
[0107]
Założono, że powyższa przykładowa reakcja stanowi konkurencyjną ścieżkę
wiązania jonów amonowych w stosunku do syntezy mocznika stanowiącego niezbędne
21
EP 1 917 959 B1
źródło azotu dla H. pylori, w środowisku żołądka, bądź innych bakterii ureolitycznych
przykładowo w układzie moczowo-płciowym.
[0108]
Biorąc pod uwagę brak doniesień o szkodliwym działania alfa-ketoglutaranu na
błonę śluzową żołądka i jelita cienkiego zdrowych ochotników, przeprowadzono obecnie
szereg doświadczeń na zdrowych zwierzętach laboratoryjnych, mających na celu zbadanie
wpływu alfa-ketoglutaranu na kolonizację żołądka i jelita cienkiego zdrowych zwierząt
doświadczalnych przez bakterie H. pylori.
[0109]
Nieoczekiwanie, uzyskane wyniki potwierdziły przyjęte założenia i wykazały co
następuje:
1. Nie zaobserwowano zmian w morfologii oraz grubości błony śluzowej żołądka
zwierząt zakażanych H. pylori, a następnie otrzymujących alfa-ketoglutaran, ani też
w grubości błony śluzowej jelita cienkiego oraz wysokości kosmków jelitowych i
głębokości krypt u badanych zwierząt.
2. Nie zaobserwowano zmian w ilości bakterii kwasu mlekowego wyhodowanych z
zeskrobin śluzu żołądka (część odźwiernikowa) u badanych zwierząt, w tym myszy
zakażanych H. pylori, a następnie otrzymujących alfa-ketoglutaran.
3. Zaobserwowano zmniejszenie się ilości komórek produkujących gastrynę – hormon
żołądkowy - zlokalizowanych w części odźwiernikowej gruczołów żołądkowych o
17 % (p < 0,01) u zwierząt zakażanych H. pylori i następnie otrzymujących alfaketoglutaran w stosunku do grupy kontrolnej (otrzymującej bufor fosforanowy PBS). U zwierząt zakażanych H. pylori i dodatkowo otrzymujących alfaketoglutaran występuje spadek poziomu gastryny we krwi (z 21,8 pM – 24,7 pM do
12,8 pM – 15,6 pM) (p < 0,05) co jest najprawdopodobniej wynikiem zmniejszenia
ilości komórek produkujących gastrynę w błonie śluzowej żołądka. Fakt ten
wskazuje na pośrednie (poprzez histaminę) hamujące oddziaływanie alfakeutoglutaranu na działanie pompy protonowej. Jej nadaktywność występuje w
chorobie refluksowej.
4. Pewną tendencję do zmniejszenia ilości komórek produkujących cholecystokininę
(CCK) – hormon tkankowy przewodu pokarmowego - stwierdzano w jelicie
zwierząt laboratoryjnych otrzymujących alfa-ketoglutaran. Występuje spadek
komórek CCK o 30% (bez różnicy statystycznej, p = 0,1) w porównaniu z tym
samym segmentem jelita myszy nie zakażanych H. pylori, którym podano tylko
22
EP 1 917 959 B1
PBS. Nie stwierdzono w jelicie myszy istotnych różnic w liczbie komórek
produkujących CCK w grupie zwierząt zakażanych H. pylori, a następnie
otrzymujących alfa-ketoglutaran w porównaniu z myszami inokulowanymi tylko
alfa-ketoglutaranem (p = 0,25). Niski poziom CCK we krwi (z 3,1 pM – 4,0 pM do
1,9 pM – 2,5 pM) (p < 0,05) u zwierząt zakażanych H. pylori i inokulowanych H.
pylori, a następnie alfa-ketoglutaranem może być związany ze zmniejszeniem ilości
komórek produkujących CCK w jelicie. W ten sposób niski poziom CCK
stymulować może zwiększenie częstotliwości opróżniania żołądka, co uważane jest
przez klinicystów za czynnik utrudniający dalszą kolonizację H. pylori i rozwijanie
zakażenia.
[0110]
Bakteriobójcze działanie alfa-ketoglutaranu na pałeczki H. pylori
[0111]
Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że sól kwasu alfa-ketoglutarowego
hamuje
proces
kolonizacji
H.
pylori
w
układzie
pokarmowym
ssaków.
Z
przeprowadzonych badań własnych wynika, że średnia liczba kolonii wyizolowanych ze
śluzu części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H. pylori - w
trzydziestym dniu od podania pierwszej porcji zawiesiny komórek tych bakterii wynosiła
7,8 x 102 ± 5,0 x 101. Natomiast w grupie zwierząt doświadczalnych, którym po 14 dniach
od zakażenia przez 9 kolejnych dni podawano dożołądkowo sól kwasu alfaketoglutarowego, średnia liczba wyizolowanych kolonii wynosiła jedynie 3,8 x 102 ± 5,0 x
101. Dziewięciokrotne dożołądkowe podanie alfa-ketoglutaranu, utrzymywane przez 9
kolejnych dni, które rozpoczęto po 14 dniach przerwy od ostatniej dawki zakażającej
myszy bakteriami H. pylori spowodowało więc spadek o 49 % stopnia kolonizacji błony
śluzowej żołądka przez H. pylori. Wyniki te dowodzą hamującego działania soli kwasu
alfa-ketoglutarowego w procesie kolonizacji żołądka przez baterie H. pylori.
[0112]
W innym doświadczeniu stwierdzono, że średnia liczba kolonii wyizolowanych
ze śluzu części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H. pylori - w
dwudziestym dniu od podania pierwszej porcji zawiesiny komórek tych bakterii, wynosiła
4,3 x 102 ± 5,0 x 101. Natomiast w grupie zwierząt doświadczalnych, którym po 8 dniach
od zakażenia przez 3 kolejne dni podawano dożołądkowo alfa-ketoglutaranu nie
wyhodowano żadnej kolonii H. pylori. Trzykrotne dożołądkowe podanie alfaketoglutaranu, utrzymywane przez 3 kolejne dni, które rozpoczęto po 8 dniach przerwy od
23
EP 1 917 959 B1
ostatniej dawki zakażającej myszy bakteriami H. pylori spowodowało pełne zahamowanie
kolonizacji i całkowitą eradykację bakterii H. pylori z błony śluzowej żołądka.
[0113]
Podczas obserwacji, uległ zmianie skład mikroflory żołądka i zidentyfikowany
został u myszy zakażanych H. pylori również DNA H. bilis, natomiast u myszy, które
dodatkowo inokulowano alfa-ketoglutaranem – wyłącznie DNA H. rodentium, H. bilis, H.
hepaticus, zaś u myszy kontrolnych, którym podawano sole kwasu alfa-ketoglutarowego
zidentyfikowano DNA H. hepaticus i H. rodentium. U myszy traktowanych PBS nie
stwierdzono w badanej tkance DNA bakterii z rodzaju Helicobacter.
[0114]
Te wyniki uzyskano stosując rutynowe metody diagnostyczne poparte
klasycznymi technikami, które zakładają wyhodowanie żywego mikroorganizmu, w celu
potwierdzenia obecności bakterii w tkance (spełnienie postulatów Kocha). Dodatkowo
badania
wsparto
metodami
detekcji
DNA
H.
pylori
a
także
DNA
innych
niechorobotwórczych bakterii z rodzaju Helicobacter. Przeprowadzenie PCR i rozdział
produktów PCR w elektroforezie w gradiencie denaturacji (DGGE), a następnie
sekwencjonowanie produktów, w celu stwierdzenia składu DNA jest sposobem
uchwycenia zmian, które zostały obecnie wykazane. W praktyce, w wyniku
sekwencjonowania nie stwierdzono DNA H. pylori (na poziomie czułości barwienia
bromkiem etydyny) u traktowanych alfa-ketoglutaranem myszy.
[0115]
Alfa-ketoglutaran jest więc doskonałą substancją czynną dla dużej i
zróżnicowanej grupy odbiorców, wymagających zabiegów profilaktycznych i leczniczych
w przypadkach zakażeń H. pylorii oraz zakażeń dróg moczowo-płciowych wywoływanych
bakteriami ureolityczynymi.
[0116]
Zupełnie odmienny od dotychczas poznanych, mechanizm bójczego działania
alfa-ketoglutaranu na bakterie ureolityczne, pozwoli na bezpieczną eradykację tych
drobnoustrojów z organizmu, bez obawy indukowania i narastania lekoodporności wśród
bakterii ureolitycznych. W praktyce łączy się to z ograniczeniem nawrotów zakażeń,
nadkażeń oraz utrudnionej antybiotykoterapii.
[0117]
Jak obecnie ustalono, alfa-ketoglutaran działa wspomagająco lub alternatywnie
dla standardowego leczenia antybiotykami. Poza tym, w stanach wyniszczenia organizmu
służyć może do balansowania naturalnej flory ureolitycznej.
24
EP 1 917 959 B1
[0118]
Zgodnie z wynalazkiem wykorzystuje się alfa-ketoglutaran i/lub odpowiednie
prekursory uwalniające w warunkach in vivo anion kwasu alfa-ketoglutarowego do
wytwarzania środka medycznego do stosowania w profilaktyce i/lub leczeniu stanów
chorobowych wywoływanych przez bakterie ureolityczne.
[0119]
Środek uzyskiwany zgodnie z wynalazkiem jest w szczególności przydatny do
zapobiegania i/lub hamowania kolonizacji H. pylori.
[0120]
Jako alfa-ketoglutaran, korzystnie stosuje się sole kwasu alfa-ketoglutarowego i
metali alkalicznych i/lub soli ziem alkalicznych, i/lub chitozanu - jednopodstawione lub
dwupodstawione. Korzystną solą jest sól sodowa i/lub sól wapniowa.
[0121]
Alfa-ketoglutaran można zgodnie z wynalazkiem stosować w stosunku do ludzi i
zwierząt jako środek leczniczy, suplement diety, środek spożywczy specjalnego
przeznaczenia medycznego i/lub dodatek do żywności/paszy, w zależności od warunków,
do hamowania kolonizacji H. pylori u ludzi i zwierząt, w celu zabezpieczenia przed
zakażeniem H. pylori i jego następstwami, bądź celem złagodzenia przebiegu zakażenia H.
pylori i jego następstw.
[0122]
Alfa-ketoglutaran można podawać ze znanymi nośnikami i z dodatkami, które są
dopuszczalne farmaceutycznie i współdziałają z wybranymi prekursorami alfaketoglutaranu. Odpowiednimi dodatkami są, na przykład, woda, sól fizjologiczna,
dekstroza, glicerol, etanol lub podobne oraz ich kombinacje. Ponadto, jeśli jest to
pożądane, środek może zawierać substancje pomocnicze takie jak na przykład czynniki
zwilżające lub emulgujące, czynniki modulujące pH, czynniki buforujące i inne.
[0123]
Zgodnie
z
wynalazkiem
środek
zawierający
alfa-ketoglutaran
można
przygotować w postaci stałej i/lub płynnej, dostosowanej do wybranej drogi podawania.
[0124]
Wynalazek dotyczy także zastosowania alfa-ketoglutaranu do wytwarzania
preparatów do zwalczania i profilaktyki zakażeń innymi bakteriami ureolitycznymi.
Przykłady dalszych medycznych zastosowań alfa-ketoglutaranu obejmują zastosowania do
wytwarzania środka do hamowania pasażu patogennych bakterii ureolitycznych przez
żołądek trawienny, środka zapobiegającego tworzeniu się w drogach moczowych złogów i
kamieni zakaźnych, środka do ograniczenia procesu formowania biofilmu i mineralizacji
złogów na cewnikach, kateterach i innym sprzęcie medycznym, jak również środkach do
hamowania rozwoju patogennych bakterii ureolitycznych w układzie moczowo-płciowym,
25
EP 1 917 959 B1
do stosowania w postaci wlewów docewnikowych, globulek, płynów do irygacji, globulek
dopochwowych.
[0125]
Zgodnie z obecnym wynalazkiem alfa-ketoglutaran nadaje się do stosowania
także u psów, kotów i zwierząt udomowionych, w postaci wlewów dopęcherzowych w
stanach zakażeń bakteryjnych wywoływanych przez bakterie ureolityczne.
[0126]
Dalszym przykładem nowego zastosowania alfa-ketoglutaranu jest jego
wykorzystanie do wytwarzania środka do regulacji ureolitycznej flory jamy ustnej i
ograniczającego tworzenie kamienia nazębnego oraz rozwój próchnicy. Środek ten może
mieć postać gumy do żucia, bądź pasty do zębów.
[0127]
Alfa-ketoglutaran znajduje także nowe zastosowanie zgodnie z wynalazkiem do
wytwarzania środka do hamowania wzrostu bakterii ureolitycznych, szczególnie
Ureaplasma i innych mykoplazm wywołujących zakażenia ryb. W tym zakresie nowym
zastosowaniem alfa-ketoglutaranu jest jego wykorzystanie do wytwarzania środka do
stosowania w profilaktyce zapalenia skrzeli u karpia i narybku karpia oraz u innych ryb
słodkowodnych i morskich wywoływanego przez wskazane bakterie ureolityczne.
[0128]
Wynalazek obejmuje także zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania
suplementów diety, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego oraz
dodatków do żywności/pasz przydanych w zapobieganiu i/lub hamowaniu kolonizacji H.
pylori.
[0129]
Poniższe przykłady bliżej objaśniają obecny wynalazek.
Przykład 1.
[0130]
Zwierzęta doświadczalne sześciotygodniowe myszy rasy BALB/cA (samice) o
wadze 23 ± 2 g. w liczbie 28 (fig. 1). Czternastu myszom sondą dożołądkową (zew.
średnica = 1,3 mm) aplikowano trzykrotnie z odstępami jednodniowymi 0,2 ml zawiesiny
komórek H. pylori szczepu 119/95 o gęstości 109 cfu/ml. Dwa tygodnie po ostatnim
podaniu, siedem myszy inokulowano dożołądkowo przez dziewięć kolejnych dni w taki
sam sposób roztworem soli wapniowej lub sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml,
stężenie 30 mM) (grupa I A). Pozostałe 7 myszy otrzymywały 0,01 M buforu
fosforanowego - PBS (grupa I B) tak samo jak zwierzęta z grupy I A.
26
EP 1 917 959 B1
[0131]
Czternastu kolejnym myszom z grupy II A i II B podawano 0,2 ml PBS według
schematu obowiązującego przy zakażaniu zwierząt H. pylori. Po dwutygodniowej przerwie
siedem myszy nadal otrzymywało PBS (0,2 ml) przez kolejnych 9 dni (grupa II B).
Pozostałym 7 myszom wprowadzano roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml,
stężenie 30 mM) (grupa II A).
[0132]
W 30-ym dniu doświadczenia zwierzęta usypiano ditlenkiem węgla. Do
dalszych badań pobierano próbki krwi i żołądka od myszy zakażanych H. pylori z lub bez
następującej inokulacji solami kwasu alfa-ketoglutarowego lub otrzymujących wyłącznie
sole kwasu alfa-ketoglutarowego. Schemat doświadczalnego zakażania myszy bakteriami
H. pylori przedstawiono na rysunku fig. 1. W doświadczeniu tym badano zależność stopnia
kolonizacji H. pylori błony śluzowej żołądka myszy (n=28) od dożołądkowego podania
soli kwasu alfa-ketoglutarowego w opisanym wyżej reżimie czasowym.
[0133]
Na rysunku fig. 1 użyto następujących oznaczeń. Myszom z grup
doświadczalnych (n=28) podawano dożołądkowo następujące preparaty: zawiesinę
komórek H. pylori: #; roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego: ♦; roztwór PBS: ●. Nazwa
szczepu, gęstość i objętość inoculum (H. pylori) oraz stężenia i dawki: soli kwasu alfaketoglutarowego i PBS odpowiadają informacjom podanym wyżej. Wytłuszczone liczby
oznaczone literą S wskazują dzień sekcji zwierząt. Sekcje przeprowadzano z zachowaniem
wymaganych powszechnie obowiązujących standardów.
[0134]
Próbki krwi od wszystkich zwierząt posiewano w podłoże GAB-CAMP,
hodowano w temperaturze 37oC, w warunkach mikroaerofilnych przez 7 – 10 dni. Z
połowy części odźwiernikowej żołądka zeskrobywano śluz, który następnie łączono z 500
µl jałowego PBS. Po zważeniu homogenatów stwierdzono, że ilość śluzu zeskrobanego z
połowy części odźwiernikowej wahała się między 40 µg a 50 µg. W celu określenia liczby
H. pylori w 100 µl homogenatu śluzu żołądkowego rozprowadzano na podłożu GABCAMP, które następnie inkubowano w 37oC przez 5-10 dni, w warunkach
mikroaerofilnych. Homogenat uzyskany od każdej myszy badano w trzech powtórzeniach.
W wynikach podana została wartość średnia ± SD. W celu identyfikacji wyizolowanych
kolonii określano właściwości biochemiczne bakterii - testy na aktywność katalazy,
oksydazy i ureazy oraz oceniano morfologię komórek w preparatach barwionych metodą
Grama.
27
EP 1 917 959 B1
[0135]
Od
zwierząt
otrzymujących
dożołądkowo
PBS
i
sole
kwasu
alfa-
ketoglutarowego (Grupa II A na fig. 1), albo PBS (Grupa II B na fig. 1) nie wyizolowano
H. pylori z badanych tkanek.
[0136]
Z próbek żołądka zwierząt otrzymujących H. pylori, którym następnie podano
sole kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa I A na fig. 1) lub PBS (Grupa I B na fig. 1)
wyhodowano bakterie między 5 i 10 tym dniem inkubacji. Średnia liczba kolonii
wyizolowanych ze śluzu części odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H.
pylori wynosiła 7,8 x 102 ± 5,0 x 101 natomiast po dożołądkowym podaniu myszom soli
kwasu alfa-ketoglutarowego zgodnie z podanym reżimem - średnia liczba wyizolowanych
kolonii wynosiła 3,8 x 102 ± 5,0 x 101 (fig. 3). Dziewięciokrotne dożołądkowe podanie,
utrzymywane przez 9 kolejnych dni, soli kwasu alfa-ketoglutarowego, które rozpoczęto po
14 dniach przerwy od ostatniej dawki zakażającej myszy bakteriami H. pylori
spowodowało więc spadek o 49 % stopnia kolonizacji błony śluzowej żołądka przez H.
pylori. Z tego wynika hamujące działanie soli kwasu alfa-ketoglutarowego na proces
kolonizacji żołądka przez baterie H. pylori.
[0137]
Z próbek krwi pobranych od badanych myszy nie wyhodowano ani H. pylori ani
innych bakterii.
[0138]
Uzyskane wyniki zebrano w poniższej Tablicy 1
Tablica 1. Bakterie H. pylori wyizolowane z homogenatów śluzu żołądka myszy
niezakażanych i zakażanych H. pylori z lub bez następującej inokulacji
soli kwasu alfa-ketoglutarowego
Wyhodowane H. pylori**
Liczba myszy
Stosowane preparaty*
inokulowanych
w grupie
Liczba
bakterii
(cfu)/mysz
H. pylori + PBS (Grupa I B)
7/7
7,8 x 102 ± 5,0 x 101
PBS (Grupa II B)
0/7
0
H. pylori + AKG (Grupa I A)
7/7
3,8 x 102 ± 5,0 x 101
PBS + AKG (Grupa II A)
0/7
0
28
EP 1 917 959 B1
*/ według schematu na fig. 1,
**/ bakterie hodowano na podłożu stałym GAB-CAMP.
Zwierzęta zakażane tylko H. pylori (H. pylori + PBS), zakażane H. pylori i
otrzymujące sole kwasu alfa-ketoglutarowego (H. pylori + AKG) oraz grupy
kontrolne zwierząt niezakażanych, inokulowanych samym PBS lub PBS i solami
kwasu alfa-ketoglutarowego (PBS + AKG).
Przykład 2.
[0139]
Zwierzęta doświadczalne sześciotygodniowe myszy rasy BALB/cA (samice) o
wadze 23 ± 2 g. w liczbie 48 (fig. 2). Dwudziestu czterem myszom (fig. 2) z grupy III B i
III aplikowano dożołądkowo, trzykrotnie z jednodniowymi odstępami po 0,2 ml zawiesiny
H. pylori 119/95 o stężeniu 109 cfu/ml. Po ośmiu dniach, szesnastu myszom podawano
sondą przez trzy kolejne dni 0,2 ml roztworu 30 mM soli kwasu alfa-ketoglutarowego
(grupa III B). Kolejne 8 myszy otrzymywało wyłącznie po 0,2 ml 0,01 M PBS (grupa III)
według schematu postępowania z grupą III B.
[0140]
Pozostałym 24 myszom (fig. 2) aplikowano dożołądkowo, trzykrotnie z
jednodniowymi odstępami po 0,2 ml 0,01 M PBS. Po ośmiu dniach, szesnastu myszom
podawano sondą przez trzy kolejne dni roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego (0,2 ml,
stężenie 30 mM) (grupa IV B). Kolejne 8 myszy otrzymywało po 0,2 ml 0,01 M PBS
(grupa IV).
[0141]
W 20-ym dniu doświadczenia zwierzęta usypiano ditlenkiem węgla.
Do
dalszych badań pobierano od myszy próbki żołądka i krwi.
[0142]
Na rysunku fig. 2 użyto następujących oznaczeń. Myszom z grup
doświadczalnych (n=76) podawano dożołądkowo następujące preparaty: zawiesinę
komórek H . pylori: #; roztwór soli kwasu alfa-ketoglutarowego: ♦; roztwór PBS: ●.
Nazwa szczepu, gęstość i objętość inoculum (H. pylori) oraz stężenia i dawki: soli kwasu
alfa-ketoglutarowego i PBS jak podano w przykładzie 1. Wytłuszczone liczby oznaczone
literą S wskazują dzień sekcji zwierząt. Sekcje przeprowadzano z zachowaniem
wymaganych powszechnie obowiązujących standardów.
[0143]
Z pobranych próbek, tak jak to przedstawiono w przykładzie 1, hodowano
bakterie H. pylori na podłożu GAB-CAMP. Izolowano również DNA w celu
przeprowadzenia PCR ze starterami (5`-CTATGACGGGTATCCGGC-3', N16S1R: 5'CTCACGACACGAGCTGAC-3') dla fragmentu 16S rDNA charakterystycznego dla DNA
29
EP 1 917 959 B1
bakterii z rodzaju Helicobacter. Następnie produkty PCR o wielkości 470 par zasad
rozdzielano techniką elektroforezy w gradiencie denaturacji (DGGE) i sekwencjonowano.
Analiza
DGGE
przeprowadzona
została
w
9%
żelu
poliakryloamidowym
(akrylamid/bisakrylamid w proporcji 37,5:1). Elektroforezę przeprowadzono w 60°C w
125 V przez 16 godz.
[0144]
Uzyskane wyniki zebrano w poniższej Tablicy 2.
Tablica 2. Bakterie z rodzaju Helicobacter, w tym H. pylori, w homogenatach
śluzu żołądka (część odźwiernikowa) myszy zakażanych H. pylori z lub
bez następującej inokulacji solami kwasu alfa-ketoglutarowego
Wyhodowane H. pylori
Stosowane
preparaty *
H. pylori + PBS
(Grupa III)
H. pylori + AKG
(Grupa III B)
PBS + AKG
(Grupa IV B)
PBS
(Grupa IV)
Liczba myszy
zakażonych
PCR 16S rDNA – Helicobacter spp.
Liczba
bakterii
Liczba myszy
z DNA H.pylori
z DNA innym niż H.pylori
w grupie
(cfu)/mysz
w grupie
8/8
4,3 x 102 ±
5,0 x 101
8/8
2/8
0/16
0
0/16
5/16
0/16
0
0/16
3/16
0/8
0
0/8
0/8
w grupie
*/ według schematu na fig. 2.
Zwierzęta zakażane tylko H. pylori (H. pylori + PBS), zakażane H. pylori i
otrzymujące sole kwasu alfa-ketoglutarowego (H. pylori + AKG) oraz grupy kontrolne
zwierząt niezakażanych, inokulowanych samym PBS lub PBS i solami kwasu alfaketoglutarowego (PBS + AKG).
[0145]
Z żołądków ośmiu myszy zakażanych H. pylori + PBS (Grupa III na fig. 2)
wyhodowano H. pylori (Tablica 2). W DNA wyizolowanym z tych samych próbek żołądka
metodą PCR, zidentyfikowano fragment charakterystyczny dla 16S rDNA H. pylori.
30
EP 1 917 959 B1
[0146]
Z próbek żołądków pozyskanych od 16 myszy zakażanych H. pylori i solami
kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa III B na fig. 2) nie wyhodowano ani H. pylori, ani też
w produktach PCR nie stwierdzono sekwencji właściwych dla H. pylori. (Tablica 2).
[0147]
Nie wyhodowano pałeczek H. pylori z próbek krwi pobranych od tych zwierząt.
Z udziałem wybranych starterów reakcji, nie uległ powieleniu DNA izolowany z krwi ani
też z żołądków 8 myszy, które otrzymywały PBS (Grupa IV na fig. 2).
[0148]
Na załączonym rysunku Fig. 3 zilustrowano ruchliwość produktów PCR
właściwych dla fragmentu 16S rDNA bakterii z rodzaju Helicobacter w polu elektrycznym
ocenianych techniką DGGE. Jako markery M użyto: A: H. muridorum, B: H. bilis, C: H.
pullorum, D: H. pylori, E: Helicobacter spp. flexispira takson 8 ”F. rappini”, F: H.
hepaticus, G: H. bizzozeronii. Strzałka wskazuje DNA H. bilis. Cyfry od 1 do 8 oznaczają
ścieżki migrujących produktów PCR z obecnego przykładu 2.
[0149]
W 16 produktach PCR z DNA izolowanego z części odźwiernikowej żołądka
myszy zakażanych H. pylori i traktowanych lub nie traktowanych następnie solami kwasu
alfa-ketoglutarowego lub też myszy niezakażanych, wykryto 19 fragmentów DNA
odpowiadających 470 parom zasad. Wyniki zilustrowano na rysunku Fig. 3, oraz w
poniższej Tablicy 3. W wyniku sekwencjonowania tych 16 fragmentów DNA
(rozdzielonych wcześniej DGGE) otrzymane sekwencje (n=19) odpowiadały H. pylori
(n=8), a także H. rodentium (n=4), H. bilis (n=3) oraz H. hepaticus (n=4) (fig. 3).
Tablica 3. Wyniki sekwencjonowania produktów PCR uzyskanych z powielenia
DNA izolowanego z homogenatów zeskrobin błony śluzowej żołądka
(część odźwiernikowa)
Wykaz preparatów*
Produkty PCR
Helicobacter spp.
H. pylori + PBS
1.
H. pylori
(Grupa III)
2.
H. pylori
3.
H. pylori
4.
H. pylori
5.
H. pylori, H. bilis
6.
H. pylori
7.
H. pylori, H. bilis
8.
H. pylori
31
EP 1 917 959 B1
H. pylori + AKG
1.
H. rodentium, H. bilis
(Grupa III B)
2.
H. hepaticus
3.
H. rodentium
4.
H. hepaticus
5.
H. rodentium
PBS + AKG
1.
H. hepaticus
(Grupa IV B)
2.
H. hepaticus
3.
H. rodentium
*/ według schematu na fig. 2.
Zwierzęta zakażane tylko H. pylori (H. pylori + PBS),
zakażane H. pylori i otrzymujące sole kwasu alfaketoglutarowego (H. pylori + AKG) oraz niezakażane,
inokulowane PBS i solami kwasu alfa-ketoglutarowego
(PBS + AKG).
[0150]
Jak wynika z powyższej Tablicy 3, DNA dwóch gatunków Helicobacter: H.
pylori i H. bilis oraz H. rodentium i H. bilis wykryto u 3 różnych myszy. W próbkach
żołądka 2 myszy z grupy III (H. pylori + PBS) wykryto H. pylori i H. bilis. W próbce
żołądka myszy z grupy III B (H. pylori + sole kwasu alfa-ketoglutarowego) wykryto H.
rodentium i H. bilis (Tablica 3). Poza tym DNA H. hepaticus zidentyfikowano u 4
zwierząt, to jest u dwóch myszy z grupy III B (H. pylori + sole kwasu alfaketoglutarowego), i dwóch, którym podawano PBS + sole kwasu alfa-ketoglutarowego
(Grupa IV B) (Tablica 3).
[0151]
DNA H. bilis nie występował oddzielnie w żadnym z produktów PCR, natomiast
DNA H. rodentium w 3 amplifikatach znajdował się bez innych towarzyszących
sekwencji, a w jednej próbce wspólnie z DNA H. bilis (fig. 3, Tablica 3).
[0152]
W podsumowaniu, średnia liczba kolonii wyizolowanych ze śluzu części
odźwiernikowej żołądka myszy zakażanych wyłącznie H. pylori (Grupa III) wynosiła 4,3 x
102 ± 5,0 x 101 natomiast po dodatkowym wprowadzeniu dożołądkowym myszom soli
kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa III B) nie wyhodowano żadnej kolonii H. pylori
(Tablica 2). Trzykrotne dożołądkowe podanie, utrzymywane przez 3 kolejne dni, soli
kwasu alfa-ketoglutarowego, które rozpoczęto po 8 dniach przerwy od ostatniej dawki
zakażającej myszy bakteriami H. pylori spowodawało całkowite zahamowanie kolonizacji
i pełną eradykację bakterii H. pylori z błony śluzowej żołądka.
32
EP 1 917 959 B1
[0153]
Dodatkowo w tym czasie uległ zmianie skład mikroflory ureolitycznej żołądka i
zidentyfikowany został u myszy zakażanych H. pylori (Grupa III) również DNA H. bilis,
natomiast u myszy, które dodatkowo inokulowano solami kwasu alfa-ketoglutarowego
(Grupa III B) wyłącznie DNA H. rodentium, H. bilis, H. hepaticus, a u myszy kontrolnych,
którym podawano sole kwasu alfa-ketoglutarowego (Grupa IV B) zidentyfikowano DNA
H. hepaticus i H. rodentium. U myszy traktowanych PBS (Grupa IV) nie stwierdzono w
badanej tkance DNA bakterii z rodzaju Helicobacter.
Przykład 3.
[0154]
Sporządzono wodny roztwór mieszaniny lub oddzielnie każdej z osobna soli
wapniowej oraz sodowej kwasu alfa-ketoglutarowego i zastosowano je jako dodatek do
produktów mlecznych oraz napojów
[0155]
Sól kwasu alfa-ketoglutarowego
0,001g do 0,2 g
Glukoza
20 g
Woda
do 100 g
Terapeutycznie i/lub profilaktycznie skuteczna ilość wynosi od 0,001g do 0,2
g/kg masy ciała na dawkę dzienną.
[0156]
Przy użyciu zwierząt modelowych (mysz) oraz przy udziale ochotników
wykazano aktywność profilaktyczną, łagodzącą przebieg zakażenia, a także ograniczającą
kolonizację układu pokarmowego przez H. pylori w wyniku wprowadzenia soli sodowej
lub/i wapniowej kwasu alfa-ketoglutarowego w formie wodnego roztworu, dożołądkowo
lub doustnie.
[0157]
Przedstawione
przykłady
ilustrują
konkurencję
między
ureolitycznymi
bakteriami – w tym wypadku H. pylori, a komórkami organizmu gospodarza o dostęp do
substratu czyli mocznika. Wprowadzenie dożołądkowe soli kwasu alfa-ketoglutarowego
ułatwiło wykorzystanie rozłożonego przez bakterie urolityczne mocznika do amoniaku dla
potrzeb makroorganizmu, czyli do syntezy glutaminianu przy udziale alfa-ketoglutaranu.
Tak, że mimo aktywności ureazy bakteryjnej, nie nastąpiło miejscowo zniesienie
kwasowego odczynu środowiska żołądka zapewniającego mikroniszę dla wzrostu komórek
H. pylorii. W ten sposób utrudniona i uniemożliwiona została kolonizacja błony śluzowej
makroorganizmu przez te ureolityczne bakterie. Stosowanie alfa-ketoglutaranu zapobiega
również zakażeniom wywoływanym przez ureolityczne bakterie.
33
EP 1 917 959 B1
Zastrzeżenia
1. Zastosowanie
alfa-ketoglutaranu
do
wytwarzania
środka
leczniczego
do
profilaktyki lub leczenia niepożądanych stanów medycznych związanych z
obecnością i/lub aktywnością bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym
człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby, w formulacjach dostosowanych do podawania
do miejsca występowania zwalczanych bakterii ureolitycznych.
2. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, w którym niepożądanym stanem medycznym
jest stan związany z obecnością i/ lub aktywnością w układzie trawiennym,
oddechowym i /lub moczowo-płciowym, bakterii ureolitycznych z grupy
obejmującej Helicobacter pylori, szczepy bakteryjne z rodzaju Brucella, ureazododatnie bakterie takie jak Ureaplasma urealyticum i inne bakterie alkalifilne, takie
jak przykładowo Bacillus pasteurii, produkujące ureazę pałeczki Yersinia
enterocolica, bakterie ureolityczne, które biorą udział w formowaniu biofilmu i
mineralizacji złogów na kateterach i innych sprzętach medycznych, bakterie
ureolityczne wywołujące zakażenia błony śluzowej jamy ustnej, choroby
przydziąśla, próchnicę zębów i powodujące tworzenie kamienia nazębnego,
bakterie ureolityczne odpowiedzialne za powstawanie kamieni zakaźnych w
przebiegu zakażeń układu moczowego z rodzaju Proteus, Ureaplasma, Klebsiella,
Pseudomonas, Staphylococcus, Providencia, Corynebacterium, zwłaszcza P.
mirabilis oraz mykoplazmy wywołujące zakażenia dróg płciowych – w
szczególności infekcje ich dolnego odcinka, Mycoplasma hominis oraz U.
urealyticum.
3. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek
przeciwdziałający kolonizacji H. pylori oraz skutkom kolonizacji H. pylori,
zwłaszcza chorobom takim jak choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy,
chłoniaki żołądka, przewlekłe zanikowe zapalenie żołądka z metaplazją jelitową
oraz rak żołądka.
4. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do
regulacji ureolitycznej flory jelitowej, stabilizujący integralność układową i do
stosowania dla zbalansowania flory jelitowej po przebytych chorobach zakaźnych i
wyniszczających (kaheksyjnych).
34
EP 1 917 959 B1
5. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do
regulacji ureolitycznej flory jamy ustnej, ograniczający tworzenie się kamienia
nazębnego i hamujący próchnicę zębów, w postaci gumy do żucia lub pasty do
zębów.
6. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do
hamowania pasażu przez żołądek patogennych bakterii ureolitycznych.
7. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek
zapobiegający tworzeniu się w układzie moczowym złogów i kamieni zakaźnych.
8. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do
hamowania wzrostu bakterii ureolitycznych, szczególnie Ureaplasma i innych
mykoplazm wywołujących zakażenia u ryb.
9. Zastosowanie według zastrzeżenia 8, w którym wytwarzany jest środek do
stosowania w profilaktyce zapalenia skrzeli u karpia i narybku karpia oraz u innych
ryb słodkowodnych i morskich, wywoływanego przez pewne bakterie ureolityczne.
10. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 2, w którym wytwarzany jest środek do
ograniczania formowania biofilmu i mineralizacji złogów na kateterach i innych
sprzętach medycznych.
11. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrzeżeń 1 do 10, w którym
wytwarzany jest środek zawierający alfa-ketoglutaran w ilościach dostosowanych
do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce, w szczególności w dawce od
0,001 do 0,2 g/kg masy ciała/dzień.
12. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrzeżenia 1 do 11, w którym
wytwarzany jest środek do stosowania w postaci doustnej, w postaci wlewów,
płynów do irygacji, globulek dopochwowych lub w innych formulacjach
dostosowanych do drogi podawania.
13. Alfa-ketoglutaran do stosowania jako środek przeciwbakteryjny skuteczny przeciw
bakteriom ureolitycznym, kiedy podawany jest do miejsca występowania
zwalczanych bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka,
płaza i ryby.
35
EP 1 917 959 B1
14. Środek leczniczy do stosowania w profilaktyce i leczeniu niepożądanych stanów
medycznych związanych z obecnością i/lub aktywnością bakterii ureolitycznych u
kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby w formulacjach
dostosowanych do podawania do miejsca występowania zwalczanych
bakterii
ureolitycznych, wytworzony zgodnie z dowolnym spośród zastrzeżeń 1 do 12.
15. Zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania suplementu diety, zapobiegającego niepożądanym stanom medycznym, związanym z obecnością i/lub
aktywnością bakterii ureolitycznych u kręgowca, w tym człowieka, ssaka, ptaka,
płaza i ryby.
16. Zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania środka spożywczego specjalnego
przeznaczenia medycznego, zapobiegającego niepożądanym stanom medycznym
związanym z obecnością i/lub aktywnością bakterii ureolitycznych u kręgowca, w
tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby.
17. Zastosowanie alfa-ketoglutaranu do wytwarzania dodatku do żywności/paszy, o
działaniu profilaktycznym zapobiegający kolonizacji przez H. pylori kręgowca, w
tym człowieka, ssaka, ptaka, płaza i ryby.
36
EP 1 917 959 B1
37
EP 1 917 959 B1
38
EP 1 917 959 B1
39
EP 1 917 959 B1
WCZEŚNIEJSZE PUBLIKACJE WYMIENIONE W OPISIE:
Niniejsza lista publikacji przywołanych przez Zgłaszającego przygotowana jest wyłącznie
dla wygody czytelników. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego.
Chociaż dołożono wielkiej staranności przy układaniu listy przywołanych publikacji, nie
można wykluczyć błędów lub pominięć, a Europejski Urząd Patentowy uchyla się od
wszelkiej odpowiedzialności w tym względzie.
Dokumenty patentowe wymienione w opisie
•
•
•
•
JP 49019855 B [0026]
WO 2007058612 A [0029]
WO 2005123056 A [0030]
EP 0922459 A [0031]
• WO 2006016143 A [0032]
• WO 2006062424 A [0033]
• WO 2006016828 A [0034]
Literatura nie-patentowa wymieniona w opisie
• DATABASE WPI. Week. Derwent Publica-tions
Ltd, 1974 [0026]
• UENO PHARMACEUTICAL, 1974 [0026]
• Williams AG; Noble J; Banks JM. The effect of
alpha-ketoglutaric acid on amino acid utilization
by nonstarter Lactobacillus spp. isolated from
Cheddar cheese. Lett. Appl. Microbiol., 2004, tom
38, 289-295 [0027]
• Oca J; Bettonica C; Cuadrado S; Vallet J;
Martin E; Garcia A; Montanes T; Jaurrieta
E. Effect of oral supplementation of ornithinealpha-ketoglutarate on the intestinal barrier after
orthotopic small bowel transplantation.
Transplantation, 1997, tom 63, 636-639 [0037]
• Schlegel L; Coudray-Lucas C; Barbut F; Le
Boucher J; Jardel A; Zarrabian S; Cynober
L. Bacterial dissemination and metabolic
changes in rats induced by endotoxemia
following intestinal E. coli overgrowth are
reduced by ornithine alpha-ketoglutarate
administration. J Nutr., 2000, tom 130, 28972902 [0038]
• Marshall BJ; Warren JR. Unidentified curved
bacilli in the stomach of patients with gastritis
and peptic ulceration. Lancet, 1984, tom 1,
1311-1315 [0053]
• IARC Working Group on the Evaluation of
Carcinogenic Risks to Humans. Lyon. IARC
Monogr Eval Carcinog Risks Hum., 07 June
1994, tom 61, 1-241 [0053]
• Saidijam M; Psakis G; Clough JL; Meuller J;
Suzuki S; Hoyle CJ; Palmer SL; Morrison
SM; Pos MK; Essenberg RC. Gastric
habitation by Helicobacter pylori: insights into
acid adaptation. Trends Pharmacol Sci., 2000,
tom 21, 413-416 [0096]
• Sachs G; Weeks DL; Melchers K; Scott DR.
The gastric biology of Helicobacter pylori. Annu
Rev Physiol., 2003, tom 65, 349-369 [0096]
• Sidebotham RL; Worku ML; Karim QN; Dhir
NK; Baron JH. How Helicobacter pylori urease
may affect external pH and influence growth and
motility in the mucus environment: evidence from
in-vitro studies. Eur J Gastroente-rol Hepatol.,
2003, tom 15, 395-401 [0096]
• Nakazawa T. Growth cycle of Helicobacter pylori in
gastric mucous layer. Keio J Med., 2002, tom 51
(S2), 15-19 [0098]
• Weeks DL; Eskandari S; Scott DR; Sachs G. A
H+-gated urea channel: the link between
Helicobacter pylori urease and gastric colonization. Science, 2000, tom 287, 482-485 [0098]
• Weeks DL; Sachs G. Sites of pH regulation of the
urea channel of Helicobacter pylori. Mol
Microbiol., 2001, tom 40, 1249-1259 [0098]
• Scott DR; Marcus EA; Weeks DL; Sachs G.
Mechanisms of acid resistance due to the urease
system of Helicobacter pylori. Gastroenterology,
2002, tom 123, 187-195 [0098]
• Scott DR; Marcus EA; Weeks DL; Lee A;
Melchers K; Sachs G. Expression of the
Helicobacter pylori ureI gene is required for acidic
pH activation of cytoplasmic urease. Infect Immun.,
2000, tom 68, 470-477 [0098]
• Voland P; Weeks DL; Marcus EA; Prinz C;
Sachs G; Scott D. Interactions among the seven
Helicobacter pylori proteins encoded by the urease
gene cluster. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol., 2003, tom 284, 96-106 [0098]
• El-Omar EM. Mechanisms of increased acid
secretion after eradication of Helicobacter pylori
infection. Gut, 2006, tom 55, 144-146 [0104]
• Wotherspoon AC; Ortiz-Hidalgo C; Falzon MR;
Isaacson PG; Wotherspoon AC; Ortiz-Hidalgo
C; Falzon MR; Isaacson PG. Helicobacter pyloriassociated gastritis and primary B-cell gastric
lymphoma. Lancet, 1991, tom 338, 1175-1176
[0104]
40
Download

PL/EP 1917959 PL/EP 1917959 T3