Elektroforetyczna i immunologiczna analiza natywnych białek

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 245 - 254
Elektroforetyczna i immunologiczna analiza natywnych białek
wydzielniczych wytwarzanych in vitro w warunkach indukcji Ysa
(Yersinia secretion apparatus) przez izolaty Yersinia enterocolitica 1B/O8
wyosobnione od ludzi w Polsce
Electrophoretic and immunological analysis of native proteins secreted
in vitro under conditions inducing Ysa (Yersinia secretion apparatus)
by clinical isolates of Yersinia enterocolitica 1B/O8 in Poland
Natalia Rokosz-Chudziak, Waldemar Rastawicki, Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński
Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie
Przeprowadzono elektroforetyczną analizę profili białkowych wybranych
izolatów epidemicznego szczepu Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8
pochodzących od osób z jersiniozą zamieszkałych na terenie Polski. Badano
zdolność wybranych białek do reakcji z surowicą królika immunizowanego
referencyjnym szczepem Yersinia enterocolitica 1B/O8 WA-314 oraz próbkami surowicy uzyskanymi od osób z bakteriologicznie potwierdzonym
zakażeniem pałeczkami Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8. Analiza
uzyskanych elektroforegramów nie wykazała obecności białek Ysa i Ysp
mimo zastosowania warunków indukcji umożliwiających wytwarzanie tych
białek przez szczep referencyjny Yersinia enterocolitica 1B/O8 WA-314 oraz
szczepy Yersinia enterocolitica 1B/O8 pochodzące z Instytutu Pasteura. Wyniki badań serologicznych nie potwierdziły obecności swoistych przeciwciał
dla białek Ysa i Ysp zarówno w próbce surowicy immunizowanego królika,
jak i próbkach surowicy uzyskanych od osób z jersiniozą.
Słowa kluczowe: Yersinia enterocolitica 1B/O8, T3SS, białka Ysa, białka Ysp
ABSTRACT
Introduction: The high pathogenicity Yersinia enterocolitica 1B/O8 produce variety of virulence factors including chromosomal T3SS known as Ysa-Ysp system that is considered to
act at the early stage of infection. The aim of the study was to examine the ability to produce
Ysa-Ysp proteins in vitro by human clinical isolates of the epidemic Y. enterocolitica 1B/
246
N. Rokosz-Chudziak i inni
Nr 4
O8 strains in native conditions and immunological characterization of expressed proteins.
Methods: Seven Y. enterocolitica 1B/O8 isolates with known epidemiological link and
the reference high pathogenicity strain WA-314 and six strains from the Institute Pasteur
(France) were examined for production of Ysa-Ysp proteins according with procedure
described by Matsumoto and Young (Mol. Microbiol., 2006, 59:689-76). All the isolates
and strains were characterized by SDS-PAGE to determined Ysa-Ysp proteins profile. The
immunological characterization was performed by using western-immunobloting method
using sera from two immunized rabbits and from two patients with bacteriology confirmed
Y. enterocolitica 1B/O8 infection.
Results: The reference strain WA-314 yielded typical Ysa-Ysp proteins profile. In contrast
all the tested Y. enterocolitica 1B/O8 human isolates yielded the same SDS-PAGE profile that was apparently distinct from profile of Ysa-Ysp proteins of reference
strain WA-314.
Conclusions: The Y. enterocolitica 1B/O8 isolates of the epidemic strain circulating in Poland
were found to be unable to produce Ysa-Ysp proteins in vitro under conditions sufficient
to stimulate expression of the Ysa-Ysp proteins in the reference strain WA-314 and strains
from the Institute Pasteur (France). Our results may suggest that the ability to produce Ysa-Ysp proteins in concentrations sufficient to induce production of specific antibodies is not
indispensible for Y. enterocolitica 1B/O8 infection in humans. The western-immunoblotting
analysis of human serum samples showed that the antibodies were not induced by Ysa and
Ysp proteins during infection caused by the epidemic strain of Y. enterocolitica 1B/O8
circulating in Poland. Similar, negative result was found with serum of a rabbit immunized
intravenously by the reference strain WA-314. The project was funded by the National
Science Centre in Cracov, Poland, grant N N401 076039.
Key words: Yersinia enterocolitica 1B/O8, T3SS, Ysa proteins, Ysp proteins
WSTĘP
Pałeczki Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 należące do amerykańskiej linii
filogenetycznej odznaczają się wysoką zjadliwością w porównaniu do pałeczek z pozostałych
bioserotypów Y. enterocolitica występujących w Europie i na świecie (3, 8, 12, 16). Szczepy
bioserotypu 1B/O8, poza plazmidem zjadliwości pYV, posiadają również inne czynniki
zjadliwości, takie jak inwazyna (białko Inv), adhezyna Ail, enterotoksyna YstA, fimbrie
Myf i fosfolipaza A. Za dodatkowy czynnik chorobotwórczości tej grupy drobnoustrojów
uznawany jest też chromosomalny system sekrecji białek typu III zwany Ysa, który oprócz
wydzielania specyficznych białek zwanych Yersinia secreted proteins (Ysp) może też
zwiększać wydajność transportu niektórych białek efektorowych Yop kodowanych przez
plazmid pYV i tym samym prawdopodobnie przyczyniać się do intensyfikacji przebiegu
zakażenia pałeczkami Yersinia enterocolitica należącymi do bioserotypu 1B/O8 (3, 5, 13).
Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że szczepy pałeczek Yersinia enterocolitica 1B/O8
mają zdolność do ekspresji aparatu Ysa i syntezy białek efektorowych Ysp transportowanych
przez ten aparat (5 14, 15). Mając na uwadze fakt, iż od 2008 roku odnotowuje się coraz
Nr 4
Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8
247
częściej przypadki zakażenia pałeczkami Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 u ludzi
w Polsce (2, 8) podjęto próbę uzyskania natywnych białek Ysa i Ysp pałeczek Yersinia
enterocolitica 1B/O8 celem sprawdzenia, czy w surowicy osób, które przebyły zakażenie
tymi drobnoustrojami obecne są swoiste przeciwciała dla tych białek.
Celem prezentowanej pracy była elektroforetyczna i immunologiczna analiza natywnych białek Ysa i Ysp uzyskanych z wybranych izolatów Yersinia enterocolitica 1B/O8
pochodzących od osób z jersioniozą zamieszkałych na terenie Polski.
MATERIAŁ I METODY
Surowice ludzkie. W badaniach posłużono się próbkami surowicy uzyskanymi
od dwóch osób z bakteriologicznie potwierdzoną jersiniozą wywołaną przez pałeczki Y.
enterocolitica 1B/O8. W próbkach tych stwierdzono odczynem ELISA znamienny poziom
swoistych przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla białka Yop, jak i dla antygenu lipopolisacharydowego uzyskanego z pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 według zmodyfikowanej
metody Boivina (10).
Odpornościowe surowice królicze. W badaniach wykorzystano archiwalne
próbki surowicy uzyskane od dwóch królików immunizowanych dożylnie zawiesiną żywych
pałeczek Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 lub bioserotypu 4/O3. Surowice te uzyskano
we własnym zakresie w ramach wcześniej prowadzonych prac badawczych.
Szczepy i izolaty użyte w badaniach. Do uzyskania natywnych białek Ysa
wybrano siedem izolatów pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 oznaczonych jako: DM0099,
DM0102, DM0140, DM0147, DM0149, DM0209 i DM0249. Izolaty te pochodziły z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH i zostały wyizolowane w latach 2004-2009, od osób
z jersiniozą zamieszkałych na terenie Polski. W badaniach posłużono się również szczepami
Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 pochodzącymi z kolekcji Ośrodka Referencyjnego
WHO ds. Yersinia, Instytutu Pasteura we Francji, które oznaczono jako: DM0154, DM0155,
DM0157, DM0159, DM0160, DM0161, DM0162 i DM0163. Dodatkowo, w badaniach
użyto referencyjny szczep Y. enterocolitica WA-314 reprezentujący bioserotyp 1B/O8 oraz
szczep kontrolny Y. enterocolitica 4/O3 z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP – PZH. Szczep
WA‑314 otrzymano od Dr. Alexandra Rakina z Max von Pettenkofer Instiut w Monachium.
Uzyskanie białek natywnych Ysa i Ysp. Białka Ysa i Ysps zostały uzyskane
według metodyki opisanej przez Matsumoto i Young (5) z późniejszymi modyfikacjami (7,
13). Zgodnie z procedurą, izolaty i szczepy Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 namnażano przez całą noc w podłożu Luria-Bertani agar firmy Sigma-Aldrich (1% Trypton i 0,5%
ekstrakt drożdżowy) w temp. 26oC. Następnie 10 ml uzyskanej hodowli dodano do 200 ml
podłoża LB-290 wzbogaconego o NaCl w stężeniu 290 mM i inkubowano przy intensywnym
wytrząsaniu przez 7 godzin w temp. 26o C, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,1 przy
długości fali światła 600 nm. Po zwirowaniu hodowli przy 13000 x g przez 20 minut do
uzyskanego supernatantu dodawano 10% roztwór kwasu trichlorooctowego o temperaturze
4 oC w stosunku 1:8 i inkubowano w chłodni przez noc przy intensywnym wytrząsaniu
(rpm=100). Zawiesinę wytrąconych białek ponownie wirowano przy 13000 x g. Po usunięciu supernatantu osad przemywano jednokrotnie zimnym acetonem, ponownie poddawano
wirowaniu i osuszono w cieplarce w temperaturze 37o C w ciągu 30 minut.
248
N. Rokosz-Chudziak i inni
Nr 4
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. W celu wyznaczenia przybliżonej masy cząsteczkowej natywnych białek uzyskany osad zawieszono w równej objętości
w 2-krotnie stężonym roztworze Laemmli zawierającym 0,5 M Tris-HCl o pH 6,8, 10%
SDS, 3% 2-merkaptoetanol, 20 % glicerol oraz 0,05% błękit bromofenolowy i ogrzewano
we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Uzyskane próbki poddawano elektroforezie 3,5
godziny w 12,5% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (bufor: 1,5 M
Tris-HCl i 0,4% SDS) przy natężeniu prądu 65 mA, napięciu 300 V i mocy 20 W w buforze glicynowym (25 mM Tris-HCl o Ph=8,3, 250 mM glicyna, 0,1% SDS). Elektroforezę
prowadzono przy natężeniu prądu 60 mA przez 3,5 godziny, a następnie żele barwiono
barwnikiem Coomassie Brilliant Blue (Sigma-Aldrich). Szacunkową masę cząsteczkową
badanych białek określano porównując ich drogę migracji do drogi migracji markerów
preparatu firmy Thermo Scientific o nr kat. 26619.
Odczyn western-immunoblotting. Elektroforetyczne przeniesienie uzyskanych
białek Ysa i Ysp na membranę nitrocelulozową (typ PVDF) firmy AppliChem wykonywano
w aparacie (TE70X Semi-dry blotter) firmy Hoefer przy natężeniu prądu 300 mA przez 3
godziny. Następnie powierzchnię nitrocelulozy blokowano 5% roztworem odtłuszczonego
mleka, po czym arkusz membrany cięto na paski szerokości 4-5 mm i inkubowano przez 1,5
godziny w temp. pokojowej (20-22ºC) z ludzkimi surowicami lub surowicami immunizowanych królików w buforze PBS z dodatkiem 0,5% roztworu mleka w rozcieńczeniu 1/101.
Po trzykrotnym płukaniu buforem PBST (0,8% NaCl; 0,02% KH2PO4; 8,1 mM Na2HPO4;
0,02% KCl, 0,1% Tween 20) paski nitrocelulozy inkubowano w roztworze odpowiedniego
koniugatu dla surowic ludzkich lub króliczych. W badaniach posłużono się kozimi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową dla ludzkich immunoglobulin klasy G (firmy
Cappel) oraz kozimi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową dla króliczych
immunoglobulin klasy G (firmy Cappel). Użytkowe rozcieńczenie koniugatów wynosiło
1/1000. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, paski nitrocelulozy płukano roztworem PBST a następnie inkubowano w roztworze benzydyny (Sigma-Aldrich)
w buforze cytrynianowym o pH=5,0 z dodatkiem perhydrolu. Po upływie 10 minut reakcję
barwną zatrzymywano poprzez przepłukanie pasków nitrocelulozy wodą destylowaną.
WYNIKI
Porównanie profili elektroforetycznych preparatów białek uzyskanych z wybranych
izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 szczepu epidemicznego występującego w Polsce, z profilami białek ze szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 z Instytutu Pasteura, wykazało znaczne
różnice ich topologii i liczby prążków (Ryc. 1 i Ryc. 2).
W elektroforegramach białek ze szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 z Instytutu Pasteura
stwierdzono obecność prążków o masie cząsteczkowej: 112 kDa (białko YspL), 80-81 kDa
(białko YpkA/YopO), 68-58 kDa (białko YspA), 55-54 kDa (białko YspY), 51-50 kDa (białko
YopH), 46-45 kDa (białko YspE), 43-42 kDa (białko YspP), 41-40 kDa (białko YopM), 33
kDa (białko YopJ), 25 kDa (białko YopE), 24 kDa (białko YspJ/YspK). W nawiasach podano
jakim białkom systemu YSA odpowiadać mogą wyekstrahowane białka w poszczególnych
prążkach elektroforetycznych. W profilach preparatów białek wyosobnionych z izolatów
szczepu epidemicznego od osób z jersiniozą w Polsce nie stwierdzono obecności szeregu
Nr 4
Ryc. 1. Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8
249
Elektroforetyczny obraz białek poszczególnych szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 otrzymanych z Instytutu Pasteura oraz szczepu kontrolnego Y. enterocolitica 4/O3 rozdzielonych
w 12,5% żelu poliakrylamidowym (SDS- PAGE).
MW - marker białkowy firmy Thermo Scientific (nr kat. 26619),
1- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0157, 2 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0154,
3 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0155, 4 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0159,
5 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0160, 6 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0163,
7 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162, 8- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0161,
9 - Y. enterocolitica 4/O3.
białek o masie cząsteczkowej: 112 kDa (białko YspL), 81-80 kDa (białko YpkA/YopO),
70-68 kDa (białko YspB), 55-54 kDa (białko YspY), 33 kDa (białko YopJ), 29-28 kDa
(białko YspH/YopP) i 24 kDa (białko YspJ/YspK). W profilu białkowym szczepu referencyjnego Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 nie zaobserwowano natomiast prążków o masie
cząsteczkowej: 68-58, 43-42, 33, 29-28 kDa. Ostatecznie stwierdzono, iż przeprowadzona
analiza profili preparatów białek wybranych polskich izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 nie
wykazała obecności białek Ysa i Ysp, które były wykrywane w preparatach białek szczepu
referencyjnego WA-314 oraz szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 pochodzących z kolekcji
Instytutu Pasteura.
Obecność w badanych próbkach surowicy przeciwciał dla białek Ysa i Ysp oceniono
w odczynie western-immunoblotting. Do badania wybrano izolat Y. enterocolitica 1B/O8
DM0140 wyodrębniony na terenie kraju, szczep Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162 otrzymany
z Instytutu Pasteura oraz szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 (Ryc. 3).
Wyniki badań przeprowadzonych odczynem western-immunoblotting z surowicą uzyskaną od królika immunizowanego zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 wykazały
250
Ryc. 2.
N. Rokosz-Chudziak i inni
Nr 4
Elektroforetyczny obraz białek poszczególnych izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 wyosobnionych od chorych na terenie kraju oraz szczepów kontrolnych rozdzielonych w 12,5%
żelu poliakrylamidowym (SDS- PAGE).
MW – marker białkowy firmy Thermo Scientific (nr kat. 26619),
1 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162, 2- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0209,
3 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0249, 4 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0149,
5 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0102, 6 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0099,
7 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0147, 8- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0140,
9 – szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314.
obecność przeciwciał klasy IgG dla białek o masie cząsteczkowej 50, 80, 81 kDa obecnych
w preparacie białek szczepu Y. enterocolitica DM0162 oraz szczepu referencyjnego Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 (Ryc. 4A). W surowicy uzyskanej od królika immunizowanego
zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica 4/O3 wykazano obecność immunoglobulin klasy G dla
białek o masie cząsteczkowej: 81, 50 i 37 kDa (Ryc. 4 B).
Odczynem western-immunoblotting w próbkach surowicy uzyskanych od jednej z osób
z bakteriologicznie i serologicznie potwierdzonym zakażeniem pałeczkami Y. enterocolitica
1B/O8 stwierdzono obecność przeciwciał klasy IgG dla białek o masie cząsteczkowej 81 kDa
i 37 kDa szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162 oraz dla białka o masie cząsteczkowej
81 kDa szczepu referencyjnego Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 (Ryc. 5).
Analiza uzyskanych wyników nie wykazała natomiast obecności swoistych przeciwciał dla białek Ysa i Ysp zarówno w próbkach surowicy immunizowanych królików, jak
i w próbkach surowicy uzyskanych od osób z bakteriologicznie potwierdzonym zakażeniem
pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 (Ryc. 4).
Nr 4
Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8
251
Ryc. 3.
Elektroforetyczny obraz białek uzyskanych z trzech różnych szczepów pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 rozdzielonych w 12,5% żelu poliakrylamidowym barwionym Commasie
Brilliant Blue. Ścieżki: 1 – Y. enterocolitica 1B/O8 DM0140, 2- Y. enterocolitica 1B/O8
DM0162, 3 – Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314, 4 – marker wielkości białka firmy Thermo
Scientific nr kat. 26619.
Ryc. 4.
Wynik reakcji w odczynie western-immunoblotting białek Y. enterocolitica 1B/O8 z surowicami królików immunizowanych dożylnie zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8
(A) oraz pałeczek Y. enterocolitica 4/O3 (B). Ścieżki: 1 - szczep Y. enterocolitica 1B/O8
DM0162, 2 - szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314, 3 - izolat Y. enterocolitica 1B/O8 DM0140, 4- marker wielkości białka firmy Thermo Scientific nr kat. 26619.
252
Ryc. 5.
N. Rokosz-Chudziak i inni
Nr 4
Wynik reakcji w odczynie western-immunoblotting białek Y. enterocolitica 1B/O8 z
surowicami pacjentów z jersiniozą. Ścieżki: 1 - szczep Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162,
2 - szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314, 3 - izolat Y. enterocolitica 1B/
O8 DM0140, 4 - marker wielkości białka Thermo Scientific nr kat. 26619.
DYSKUSJA
Pałeczki Y. enterocolitica posiadają dwa systemy sekrecji białek typu III - pierwszy
to system Ysc (ang. Yersinia secretion system), kodowany na plazmidzie pYV, a drugi to
system Ysa (ang. Yersinia secretion apparatus) kodowany chromosomalnie (1, 6, 15, 17).
U pałeczek Y. enterocolitica biotypu 1B obszar skupiający geny związane z działaniem
chromosomalnego aparatu sekrecji Ysa tworzy wyspę patogenności YSA-PI znajdującą
się w strefie plastyczności genomu PZ (ang. plasticity zone). Rola aparatu Ysa w patogenezie zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica u ludzi nie została jeszcze dokładnie poznana.
Przypuszcza się, iż odgrywa on rolę we wczesnej fazie procesu kolonizacji przez pałeczki
Y. enterocolitica biotypu 1B komórek nabłonka jelitowego (1, 17). System Ysa uczestniczy
w transporcie białek kodowanych na chromosomie YspE, YspF, YspI, YspK, YSpL, YspP,
YspM oraz białek kodowanych na plazmidzie YopE (dawniej uznawane za YspJ), YopN
(YspG) i YopP (YspH). Do białek, których geny kodowane są w obrębie locus ysa zalicza
się białka aparatu sekrecyjnego (YsaC, YsaQ, YsaW, YsaV), białka YspB, YspC i YspD
budujące translokon tworzący kanał w błonie eukariotycznej, białko YspA wydzielane do
środowiska, białka opiekuńcze SycB, YspN, YspK oraz białka regulatorowe YsrR, YsrS
i YsaE (1, 5, 12, 17).
Wiadomo, iż u pałeczek Y. enterocolitica biotypu 1B system YSA w warunkach in vitro może być aktywowany przy zapewnieniu odpowiedniej temperatury hodowli, tj. temp.
26oC, wysokiej osmolarności (290 mM NaCl) oraz bogatej w składniki pożywce LB (6,
11, 14, 15, 17).
Nr 4
Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8
253
W związku z przedstawionymi wyżej danymi piśmiennictwa, zasadniczym założeniem
opisanych tu badań było wypreparowanie in vitro natywnych białek Ysa i Ysp z wybranych
izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 uzyskanych w 2009 roku od osób z jersiniozą zamieszkałych w Polsce. W następnym etapie badań, białka te miały posłużyć jako swoisty antygen
przydatny w poszukiwaniu w surowicy osób z przebytym zakażeniem pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 swoistych przeciwciał dla białek Ysa i Ysp. Obecność tych przeciwciał
u osób chorych było by pierwszym potwierdzeniem aktywności aparatu Ysa w przebiegu
zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 u ludzi.
Wyniki jakie autorzy tej pracy otrzymali po przeprowadzeniu badań wykazały jednak,
że stanowiące przedmiot badań izolaty epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8
w przeciwieństwie do referencyjnego szczepu WA-314, jak i szczepów Y. enterocolitica
1B/O8 pochodzących z kolekcji Instytutu Pasteura nie wytwarzały białek Ysa i Ysp w warunkach laboratoryjnych. Co ciekawe, mimo uzyskania in vitro natywnych białek Ysa
i Ysp ze szczepów referencyjnych badanie odczynem western-immunoblotting wykazało,
iż w próbkach surowicy uzyskanych od wybranych osób zakażonych pałeczkami Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 nie stwierdzono obecności przeciwciał klasy IgG swoistych dla
białek Ysa czy białek Ysp. Fakt ten może potwierdzać, że białka Ysa i Ysp nie są również
wytwarzane w przebiegu naturalnego zakażenia ludzi pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8
epidemicznego szczepu występującego w Polsce.
Jedynymi białkami, które reagowały w odczynie western-immunoblotting z przeciwciałami
klasy IgG obecnymi w próbce surowicy immunizowanego królika, jak i w próbce surowicy
osoby zakażonej szczepem Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 były białka: YpkA/YopO
(o masie cząsteczkowej 81 kDa), YopN (37 kDa) i YopH (50 kDa) związane z aktywnością
system Ysc kodowanego przez plazmid pYV. Dostępne publikacje wskazują, iż u ludzi w przebiegu zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 zostaje pobudzony układ
immunologiczny i dochodzi do syntezy immunoglobulin swoistych dla białek YopH, YopN
lub YpkA/YopO (4, 9). Występowanie przeciwciał swoistych dla tych trzech białek w próbkach
surowicy uzyskanych od osób z jersiniozą opisywane było już przez innych badaczy (4, 9).
Wyniki prowadzonych niezależnie badań dotyczących typowania metodą PFGE 64
izolatów Y. enterocolitica 1B/O8, wyosobnionych w 2009 roku w Polsce od ludzi (w tym
izolatów użytych w niniejszych badaniach) wykazały, że badane izolaty pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 wykazują tak wysoki stopień genetycznego podobieństwa, że można je
określić mianem klonu (17). Z tej przyczyny, opisane zjawisko braku zdolności do wytwarzania białek Ysa i Ysp izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 wyosobnionych w kraju wydaje
się być cechą epidemicznego szczepu tych drobnoustrojów występującego w Polsce i nie
powinno być utożsamiane z ogółem szczepów Y. enterocolitica 1B/O8, o czym świadczą
zgodne z danymi piśmiennictwa wyniki uzyskane dla badanych szczepów referencyjnych
tych drobnoustrojów wyizolowanych w innych krajach.
Wyjaśnienie przyczyny braku zdolności do wytwarzania białek Ysa i Ysp opisanej tu
dla izolatów epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 wymaga natomiast przeprowadzenia dalszych badań, w tym analizy sekwencji promotorowych, systemów regulatorowych
i poziomu ekspresji genów znajdujących się w wyspie patogenności Ysa.
Badania były finansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki przeznaczonych
na realizację projektu badawczego nr N N401 076039.
254
N. Rokosz-Chudziak i inni
Nr 4
PIŚMIENNICTWO
1. Fabrega A, Vila J. Yersinia enterocolitica: pathogenesis, virulence and antimicrobial resistance.
Enf Inf Med 2012; 30: 24-32.
2. Furman S, Napiórkowska A, Sadkowska-Todys M. Jersinioza w Polsce w 2009. Przegl Epidemiol
2011, 65: 235-8.
3. Gierczyński R. Filogeneza, chorobotwórczość i zróżnicowanie pałeczek Yersinia enterocolitica.
Med Dośw Mikrobiol 2012; 64:159-81.
4. Golkocheva-Markova E, Christova I, Stoilov R i inni. Cross-reaction between Yersinia outer membrane proteins and anti-Borrelia antibodies in sera of patients with Lyme disease. Clin Microbiol
Infec 2008;14: 873-5.
5. Matsumoto H, Young GM. Proteomic and functional analysis of the suite of Ysp proteins exported
by the Ysa type III secretion system of Yersinia enterocolitica Biovar 1B. Mol Micriobiol 2006;
59: 689-706.
6. Matsumoto H, Young GM. Translocated effectors of Yersinia. Curr Opin Microbiol 2009; 12:
94-100.
7. Mildiner-Earley S, Walker KA, Miller VL. Environmental stimuli expression of the Ysa type
three secretion locus. W: The genus Yersinia: from genomics to function. Red. RD Perry, JD
Fetherston., Springer Scince-Bussines Media, LLC. USA, 2007, 211-3.
8. Rastawicki W, Szych J, Rokosz N i inni. Seasonality of Yersinia enterocolitica bioserotype 1B/O:8
infections in Poland. Epidemiol Infect 2013; 2039-42.
9. Rawlins ML, Gertner C, Hill HR i inni. Evaluation of a western blot method for the detection of
Yersinia antibodies: evidence of serological cross-reactivity between Yersinia outer membrane
proteins and Borrelia burgdorferi. Clin Vacc Immunol 2005; 12: 1269-74.
10. Szych J. Rozprawa doktorska pt. „Ocena przydatności odczynów nowej generacji do wykrywania
przeciwciał dla wybranych O antygenów pałeczek Salmonella i Yersinia oraz antygenu wspólnego
pałeczkom jelitowym”. PZH, Warszawa, 1993r.
11. Walker KA, Miller VL. Regulation of the Ysa type III secration system of Yersinia enterocolitica
by YsaE/SycB and YsrS/YsrR. J Bacteriol 2004; 186: 4056-66.
12. Walker KA., Miller VL. Synchronous gene expression of the Yersinia enterocolitica Ysa type III
secretion system and its effectors. J Bacteriol 2008; 191: 1816-26.
13. Witkowski SE, Walker KA, Miller VL. YspM, a newly identified Ysa type III secrated protein of
Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 2008; 190: 7315-25.
14. Young BM, Young GM. Evidence for targeting of Yop effectors by the chromosomaly encoded
Ysa type III secretion system of Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 2002; 184: 5563-71.
15. Young BM, Young GM. YplA is exported by Ysc, Ysa, and flagellar type III secretion systems of
Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 2002:1324-34.
16. Zacharczuk K, Rokosz N, Rastawicki R i inni. The epidemic high pathogenicity strain of Yersinia enterocolitica 1B/O8 circulating in Poland is permanently defective for productions of the
chromosomal T3SS known as the Ysa-Ysp show by multiple serial passages. Presented at the
European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, 27-30 April, 2013.
17. Zacharczuk K. Rozprawa doktorska pt. „Molekularna charakterystyka pałeczek Yersinia enterocolitica 1B/O8 wyizolowanych od ludzi w Polsce w 2009 roku”, NIZP – PZH, Warszawa, 2013.
str. 17-18.
Otrzymano: 25 XI 2013 r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu
Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie