SEC - ang. Size Exclusion Chromatography

Zastosowanie chromatografii do analizy białek
i kwasów nukleinowych
γράφειν
dr inż. Marek Orłowski
χρῶμα
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Wydziałowy Zakład Biochemii
Każdy żywy organizm składa się z trzech podstawowych cząsteczek „życia”
DNA
kwas deoksyrybonukleinowy
(ang. DeoxyriboNucleic Acid)
BIAŁKA (proteiny)
(ang. proteins; gr. Πρωτεΐνη [proteini]
st.gr. πρῶτος [protos])
{pierwszy, najważniejszy}
Struktura DNA (1953)
James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin oraz Maurice Wilkins przedstawili światu model
cząsteczki DNA (1953)
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007
Organizacja materiału genetycznego wewnątrz komórki
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007
GENOMIKA
TRANSKRYPTOMIKA
PROTEOMIKA
Figure 1.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
PROTEOMIKA
NAUKA ZAJMUJACA SIĘ BADANIEM BIAŁEK
I ZALEŻNOŚCI: STRUKTURA-FUNKCJA
SEC - ang. Size Exclusion Chromatography
(chromatografia żelowa/sito molekularne/chromatografia wykluczenia)
Podstawa rozdziału: wielkość i kształt cząsteczki białka
SEC - ang. Size Exclusion Chromatography
SEC - ang. Size Exclusion Chromatography
•
•
•
•
•
•
•
PREPARACJA BIAŁKA
FRAKCJONOWANIE MIESZANINY BIAŁEK
SZACOWANIE MASY BIAŁKA
OKREŚLENIE WŁAŚCIWOŚCI HYDRODYNAMICZNYCH BIAŁKA (Rs, VH)
ANALIZA OLIGOMERYZACJI
WPŁYW „PTM” NA WŁASCIWOŚCI HYDRODYNAMICZNE BIAŁKA
WPŁYW LIGANDÓW NA WŁAŚCIWOŚCI HYDRODYNAMICZNE BIAŁKA
SEC - ang. Size Exclusion Chromatography
SEC - ang. Size Exclusion Chromatography
Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii - Ćwiczenie G - Chromatografia żelowa , Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska 2014.
Gel filtration , Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Manual.
SEC - ang. Size Exclusion Chromatography
SEC - ang. Size Exclusion Chromatography
Jakość preparacji białka i jego analizy zależy często od stanu zużycia złoża
SEC umożliwia badanie oligomeryzacji białek i frakcjonowanie oligomerów
SEC umożliwia badanie oligomeryzacji białek
RODZAJE ELEKTROFOREZ W ŻELACH POLIAKRYLAMIDOWYCH
WYKORZYSTYWANYCH W BIOCHEMII DO ROZDZIAŁU BIAŁEK:
PAGE – ang. PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
• ELEKTROFOREZA NATYWNA (PAGE)
• ELEKTROFOREZA W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH
(SDS-PAGE)
• ELEKTROFOREZA NIECIĄGŁA (układ Laemmlie’go)
TECHNIKI ELEKTROFOREZY ŻELOWEJ (GE) ZALICZANE SĄ
DO METOD CHROMATOGRAFICZNYCH
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.
Zestaw do elektroforez PAGE
Pory w żelu powstają w wyniku sieciowania
łańcuchów poliakrylamidu bisakrylamidem
nadsiarczan amonu (APS)
N,N,N,N- tetrametyloetylenodiamina (TEMED)
Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.
PARAMETRY ŻELU
2,67% C
Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii - Ćwiczenie O – Elektroforetyczny rozdział białek w żelu poliakrylamidowym, Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika
Wrocławska 2015.
EMSA – ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay
• ELEKTROFOREZA NATYWNA (PAGE)
• BADANIE ODDZIAŁYWAŃ : BIAŁKO – DNA
• BADANIE ODDZIAŁYWAŃ: BIAŁKO /LIGAND – DNA
• BADANIE ODDZIAŁYWAŃ : KOMPLEKSY BIAŁKOWE – DNA
Fried, M. & Crothers, D.M. (1981) Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.
Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525.
EMSA – ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay
5’-AGCGACAAGGGTTCAATGCACTTGTCCAATGAA-3’
UspDBD
EcRDBD
3’-TCGCTGTTCCCAAGTTACGTGAACAGGTTACTT-5’
5’
3’
hsp27pal
Niedziela-Majka A. et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, 507-519
Orłowski M. et al., (2004) Molecular Endocrinology 18 (9): 2166-84
EMSA – ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay
5’-AGCGACAAGGGTTCAATGCACTTGTCCAATGAA-3’
EcRDBD
EcRDBD
3’-TCGCTGTTCCCAAGTTACGTGAACAGGTTACTT-5’
5’
3’
hsp27pal
Niedziela-Majka A. et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, 507-519
Orłowski M. et al., (2004) Molecular Endocrinology 18 (9): 2166-84
EMSA – ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay
Orłowski M. et al., (2004) Molecular Endocrinology 18 (9): 2166-84
Elektroforeza SDS-PAGE
Elektroforeza SDS-PAGE
natywne białko
polianion
Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.
Elektroforeza SDS-PAGE w układzie nieciągłym
(wg Laemmli’ego)
Gly
pI = 6,07
Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z biochemii I Ćwiczenie O – Chromatografia żelowa , Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska 2015
Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriofage T4. Nature 227:680-685.
Elektroforeza SDS-PAGE i wizualizacja białek
przy użyciu barwnika – błękitu CBB
(ang. Coomassie Brillant Blue)
Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.
Analiza DNA – elektroforeza agarozowa
https://i.stack.imgur.com/0Hz5X.jpg
http://www1.biologie.uni-hamburg.de/b-online/ge26/13.gif
Cząsteczka dsDNA ma formę podwójnej helisy
i jest polianionem
Figure 1.8a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
ANALIZA DNA
•
•
•
•
Analityka medyczna
Kryminalistyka
Archeologia
Antropologia
Podstawowe techniki wykorzystywane w badaniach DNA:
•
Trawienie restrykcyjne DNA
•
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
•
Sekwencjonowanie DNA
A
C
G
Analiza wyników – elektroforeza agarozowa lub poliakrylamidowa
T
Trawienie DNA z wykorzystaniem endonukleaz restrykcyjnych
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007
Elektroforeza i wizualizacja DNA
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
(ang. Polymerase Chain Reaction)
Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L., Biochemia, PWN 2009
Elektroforeza i wizualizacja DNA
przy użyciu barwnika – bromku etydyny
https://www.thermofisher.com/
Analiza zmian kształtu plazmidowego DNA
w elektroforezie agarozowej przy różnych stężeniach
bromku etydyny
Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.
SYBR GREEN – umożliwia wizualizację DNA w żelach
https://www.thermofisher.com/
ACRIDINE ORANGE - umożliwia wizualizację DNA w żelach
i w żywych komórkach
https://vectorlabs.com/vectacell-acridine-orange.html
Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie DNA
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007
Podstawowa literatura/źródła:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Size Exclusion Chromatography, Principles and Methods, GE Healthcare Life Sciences.
Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L., Biochemia, PWN 2009.
Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriofage T4. Nature 227:680-685, 1970.
Pieprzyk J., Zbela, A., Jakób, M., Ożyhar, A., Orłowski, M., Homodimerization propensity of the intrinsically disordered Nterminal domain of Ultraspiracle from Aedes aegypti. Biochim Biophys Acta 1844:1153–1166, 2014.
Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii I - Ćwiczenie O - Elektroforetyczny rozdział białek w żelu poliakrylamidowym,
Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska 2015.
Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii I - Ćwiczenie G - Chromatografia żelowa , Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział
Chemiczny, Politechnika Wrocławska 2014.
A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection, BIO-RAD Manual.
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007.
Walkowiak, B., Techniki chromatografii cieczowej - przykłady zastosowań”, Amersham Pharmacia Biotech, Lublin, Morpol, 2000.
Walkowiak, B., Kochmańska, V., Elektroforeza - przykłady zastosowań, praca zbiorowa, Amersham Biosciences, 2002.
Electrophoresis, Acrylamide Polymerization - A Practical Approach, BIO-RAD Manual.
Fried, M. & Crothers, D.M. (1981), Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel
electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525.
Gel filtration , Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Manual.
DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ
dr inż. Marek Orłowski
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Wydziałowy Zakład Biochemii