Warunki hodowli roślin in vitro

gibereliny
• naturalna : GA3 (kwas giberelowy)
Miejsce wytwarzania:
w dojrzewających nasionach, owocach, zielonych częściach rośliny,
w wierzchołkach wzrostu pędu, korzeniach i pręcikach.
Biosynteza w plastydach (chloroplastach).
Działanie:
 wydłużają łodygi roślin karłowatych,
 indukują kwitnienie,
 wpływają na płeć kwiatów,
 pobudzają zawiązywanie owoców,
 przyspieszają wychodzenie nasion ze stanu spoczynku,
 w kulturach in vitro wywołują efekt podobny do działania auksyn:
- indukcja formowania kalusa,
- hamują powstawanie pędów przybyszowych i korzeni.
1
Retardanty (antygibereliny)
• syntetyczne : ancymidol, chlorek chloromekwatu (CCC), daminozyd
(SADH), paklobutrazol
Działanie
 hamują wzrost komórek,
 zwiększają zawartość białek, chlorofilu i soli mineralnych,
 hamują wydłużanie się międzywęźli,
 pobudzają tworzenie kwiatów i owoców,
 opóźniają starzenie roślin,
 podnoszą odporność na stresy,
 zwiększa się pobieranie substancji pokarmowych i tempo wzrostu
asymilatów,
 blokują syntezę giberelin i etylenu,
 upośledzają transport auksyn, a zwiększają poziom cytokinin.
2
kwas abscysynowy (ABA)
Miejsce wytwarzania:
przez dojrzałe liście, nasiona, korzenie, pąki i owoce.
Działanie
 hamuje wzrost i kiełkowanie,
 przyspiesza dojrzewanie, tworzenie nasion i starzenie się - inhibitor
wzrostu i rozwoju,
 uruchamia mechanizmy obronne w warunkach stresu – hormon
stresu,
 hamuje formowanie i proliferację kalusa,
 inhibitor przedwczesnego kiełkowania.
3
etylen
• Etylen - postać gazowa
Miejsce wytwarzania:
we wszystkich komórkach.
Działanie
 stymuluje kiełkowanie,
 stymuluje starzenie się kwiatów i liści,
 przyspiesza dojrzewanie i starzenie się owoców, zrzucanie
liści, tworzenie korzeni przybyszowych,
 hamuje wydłużanie się łodyg, wzrost liści, pąków
wierzchołkowych i korzeni,
 in vitro nie jest dodawany, gromadzi się w naczyniu, efekt
podobny do działania auksyn.
4
Substancje organiczne – DODATKI POCHODZENIA NATURALNEGO
ekstrakty drożdżowe
ekstrakty z bulw ziemniaczanych z bananowca i pomidora
woda kokosowa
mleczko kokosowe i kukurydziane
wyciągi z siewek
źródło: aminokwasów, witamin, fitohormonów
5
Substancje zestalające
agar – naturalny ekstrakt z krasnorostów
agaroza
gerlit
phytagel
sporadycznie skrobia, żelatyna, karraginian
Dodane w odpowiednim stężeniu 0,8-1% umożliwiają dyfuzję składników
odżywczych zawartych w pożywce do komórek roślinnych.
• Zbyt duże stężenie utrudnia dyfuzję, a zatem zmniejsza dostępność
substancji odżywczych dla komórek.
• Zbyt małe stężenie, ułatwiające przemieszanie się substancji odżywczych
w pożywce, sprzyja występowaniu zjawiska szklistości eksplantatów.
Agar w pożywkach rozpuszcza się w czasie autoklawowania.
6
pH POŻYWKI
• Większość komórek toleruje odczyn w zakresie pH 4,0-7,2, ale znacznie lepiej
znosi środowisko lekko kwaśne.
• Najczęściej pH wynosi 5,5-5,8 – ułatwione utrzymanie fosforanów w formie
rozpuszczonej.
• Kwasowość pożywki wzrasta po autoklawowaniu oraz w miarę upływu czasu
trwania kultury, z uwagi na pobieranie jonów z pożywki przez komórki.
• Ustalenie odczynu pożywki na odpowiednim poziomie zapobiega zniszczeniu
błon biologicznych, umożliwia zbuforowanie odczynu cytoplazmy, wpływa na
różnicowanie i morfogenezę.
• Sterylizacja pożywek odbywa się w autoklawie lub poprzez filtrację.
7
Kultury roślinne bioreaktorowe
1. Niezróżnicowane - kultura zawiesinowa
(przypomina kulturę mikroorganizmów).
Kultura zawiesinowa – populacja komórek roślinnych rosnących
w formie wolno pływających, pojedynczych komórek i niewielkich
agregatów komórkowych.
8
• Większość linii komórkowych wykazuje tendencję do tworzenia
agregatów.
• Jest to cecha uwarunkowana genetycznie i zależy od obecności
polisacharydów i proteoglikanów budujących ściany komórkowe,
bądź ulegających sekrecji.
9
Aby ograniczyć agregację komórek stosuje się:
- szybsze mieszanie pożywki,
- dodaje się enzymy pektynolityczne i celulolityczne, sorbitol,
detergenty,
- zmniejsza się stężenie cytokinin.
Agregacja komórek zwiększa szybkość ich sedymentacji, co utrudnia
utrzymanie homogennych warunków kultury w bioreaktorze.
W celu poprawy sedymentacji stosuje się kultury o dużej gęstości,
wykazujące zwiększoną lepkość.
10
Kultury roślinne bioreaktorowe
2. Zróżnicowane
A. Kultury zarodków – służą do produkcji nasion
somatycznych (sztuczne nasiona).
Atutem jest możliwość otrzymania dowolnej ilości
zdrowego, wyrównanego materiału siewnego, niezależnie od
warunków pogodowych i w dowolnym terminie.
Embriogeneza somatyczna
11
Kultury roślinne bioreaktorowe
2. Zróżnicowane
B. Kultury korzeniowe – służą do produkcji
metabolitów komórkowych.
Można je otrzymać poprzez odcięcie stożków wzrostu
korzeni i przeniesienie, po dezynfekcji, do specjalnych
pożywek o zmniejszonej zawartości soli mineralnych
(uprawa w ciemności, bez intensywnego mieszania).
12
Kultury roślinne bioreaktorowe
sposoby prowadzenia kultury
Kultura okresowa – jednorazowe wprowadzenie pożywki do naczynia, inokulacja
i prowadzenie kultury do momentu uzyskania maksymalnej gęstości komórek lub
max stężenia metabolitu.
Kultura okresowo-dolewowa – uzupełnianie brakujących składników (dolewanie
pożywki).
Początek kultury odbywa się przy częściowo wypełnionym bioreaktorze, a porcja
dodatkowej pożywki jest wprowadzana w czasie spowolnienia wzrostu lub
zahamowania produkcji metabolitu.
Kultura ciągła – ciągła wymiana części zużytej pożywki wraz z komórkami na świeżą.
Dla komórek roślinnych (powolny wzrost) stosuje się bioreaktory, w których komórki są
zatrzymywane:
- system z zawracaniem komórek w bioreaktorach membranowych,
- kultury immobilizowane - unieruchomienie komórek poprzez ich związanie
z powierzchnią nośnika lub uwięzienie w jego wnętrzu.
13